JPH09294590A

JPH09294590A - 組換えヒト内皮細胞成長因子

Info

Publication number: JPH09294590A
Application number: JP8177653A
Authority: JP
Inventors: Michael Jaye; ジエイマイケル; Wilson Burgess; バーガスウイルソン; Thomas Maciag; マーシアトーマス; William Drohan; ドロハンウイリアム
Original assignee: Rorer Biotechnology Inc
Current assignee: Rorer Biotechnology Inc
Priority date: 1986-03-03
Filing date: 1996-07-08
Publication date: 1997-11-18
Also published as: IE870535L; PH24857A; DK175807B1; DE3750451T2; UA13321A; RU1804480C; KR960002874B1; AU617086B2; EP0259475A1; JP3273354B2; FI874819A7; JPH09135690A; HK1002123A1; EP0259475B1; DK572487D0; AU7201287A; JPS63502725A; EP0259475A4; FI874819L; KR880700858A

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト起原の内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）に
組換えＤＮＡ技術を適用してヒト起原の他の蛋白を含ま
ないＥＣＧＦ蛋白を産生する方法の提供。【解決手段】ヒト内皮細胞成長因子をコードするＤＮ
Ａ配列を発現し得る複製可能な発現ベクターを適当な主
宿に提供し、該主宿を形質転換させて組換え宿主を得、
そして該内皮細胞成長因子をコードするｃＤＮＡ配列の
発現を可能にする条件下に該組換え宿主を維持して内皮
細胞成長因子を産生させることによりヒト内皮細胞成長
因子を産生する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はある蛋白の組換えＤ
ＮＡにより導かれる合成に関する。さらに詳しくは、本
発明は内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、その組換えＤＮ
Ａにより導かれる合成及び内皮細胞損傷及び／又は再生
の治療におけるＥＣＧＦの用途に関する。

【０００２】

【従来の技術とその課題】本明細書では「ＥＣＧＦ」と
呼ばれる内皮細胞成長因子は、生体外の内皮細胞に関す
るミトゲンである。内皮細胞の成長は、アンジオゲネシ
スの方法中の必要な工程である〔マシアグ（Ｍａｃｉａ
ｇ）「プログ・ヘモスタシス・アンド・トロンボ（Ｐｒ
ｏｇ．ＨｅｍｏｓｔａｓｉｓａｎｄＴｈｒｏｍ
ｂ。）」７：１６７〜１８２（１９８４）；マシアグ，
Ｔ．，フーバー（Ｈｏｏｖｅｒ），Ｇ．Ａ。及びワイン
シュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ），Ｒ。，「Ｊ．バイ
オロ．ケム．（Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｍ。）」２５７：５３
３３〜５３３６（１９８２）〕。ウシＥＣＧＦはマシア
グらにより単離された〔「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）」２２５：９３２〜９３５（１９８４）〕。それは
ストレプトマイシン硫酸塩沈澱、ゲル排除クロマトグラ
フィ、硫酸アンモニウム沈澱及びヘパリン・セファロー
ス・アフィニティクロマトグラフィを用いた。このやり
方で精製されたウシＥＣＧＦは、アニオン性等電点及び
２０，０００の見掛け上の分子量を有する１本鎖ポリペ
プチドを生ずる〔マシアグ同上；シュライバー（Ｓｃｈ
ｒｅｉｂｅｒ）ら「Ｊ．セル・バイオロ．（Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．）〕１０１：１６２３〜１６２６（１９８
５）；及びシュライバーら「プロシ．ナチル．アカデ．
サイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）」８
２：６１３８〜６１４２（１９８５）〕。さらに最近で
は、ヘパリン−セファロースカラムからのウシＥＣＧＦ
の塩化ナトリウム勾配溶離により、又は逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、複数の形のウシ
ＥＣＧＦがバージス（Ｂｕｒｇｅｓｓ）ら〔「Ｊ．バイ
オロ．ケム」２６０：１１３８９〜１１３９２（１９８
５）〕により単離された。

【０００３】アルファ−ＥＣＧＦ及びベータ−ＥＣＧＦ
と呼ばれる２種の単離されたポリペプチドは、それぞれ
１７，０００及び２０，０００の見掛け上の分子量を有
する。このやり方を用いて、８，５００ｍｌのウシ脳抽
出物（６．２５×１０⁷全単位）に含まれるウシＥＣＧ
Ｆは、合計６ｍｌのアルファ−ＥＣＧＦ（３．０×１０
⁶単位）及び３ｍｌのベータ−ＥＣＧＦ（５．２×１０
⁵単位）に濃縮される。これは、アルファ−ＥＣＧＦの
９，３００倍の精製及びベーターＥＣＧＦの１６，３０
０倍の精製である（バージス、同上）。最近、ウシＥＣ
ＧＦに対するネズミモノクローナル抗体が生成され（マ
シアグら、同上）、それは米国特許第４，３６１，５０
９号明細書にチンマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）及び
フルヒアー（Ｆｕｌｃｈｅｒ）により記載されたファク
ターVIIIＣのモノクローナル抗体精製に似た方法で、ウ
シＥＣＧＦを精製するのに有用であろう。

【０００４】一般に、組換えＤＮＡ技術は周知である。
「メソッズ・イン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」（アカデミック・プレ
ス、ニュー・ヨーク）、１５及び６８巻（１９７９）；
１００及び１０１巻（１９８３）及びそれらに引用され
た参考文献参照（これらのすべては本明細書において参
考文献として引用される）。最も普通に用いられる組換
えＤＮＡの方法論を具体化する広範囲の技術的な論説
は、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら「モレキュラー
・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ）」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（１９８２）に見い出されうる。種々のポリペプチドに
ついてコーディングする遺伝子は、組換えＤＮＡ媒体例
えば細菌性又はウイルス性のベクターにポリペプチドに
ついてコーディングするＤＮＡフラグメントを組み入
れ、そして適当な宿主を形質転換することによりクロー
ンされうる。この宿主は代表的にはエッシェリキア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）菌であるが所望の生成物に応じて真核宿主が用いら
れうる。組換えベクターを組み込むクローンは単離され
そして成長されさらに多量に所望のポリペプチドを生成
するのに用いられうる。

【０００５】三、四のグループの科学者は、真核細胞か
らメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の混合物を単離し
そして一連の酵素的反応を用いてこのｍＲＮＡに対して
相補的な二本鎖ＤＮＡコピーを合成した。第一の反応に
おいて、ｍＲＮＡはＲＮＡに向かうＤＮＡポリメラーゼ
（又逆転写酵素と呼ばれる）により一本鎖相補ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）へ転写される。逆転写酵素は５’−３’方
向にＤＮＡを合成し、プレカーサーとしてデオキシリボ
ヌクレオチド５’−トリホスフェートを用い、そして鋳
型及びプライマー鎖を必要とし、その後者は遊離の３’
−ヒドロキシル末端を有しなければならない。ｍＲＮＡ
の鋳型の部分的なコピー又は完全なコピーの何れにせ
よ、逆転写酵素生成物は、しばしばそれらの３’末端に
おいて短い部分的に二本鎖のヘアピン（「ループ」）を
有する。第二の反応において、これらの「ヘアピン・ル
ープ」は、ＤＮＡポリメラーゼに対するプライマーとし
て働く。予め形成されたＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼ
の作用において鋳型としてさらにプライマーとして要求
される。ＤＮＡポリメラーゼは、遊離の３’ヒドロキシ
ル基（それに新しいヌクレオチドが加えられて５’−
３’方向に鎖を延ばす）を有するＤＮＡ鎖の存在を必要
とする。このような連続逆転写酵素及びＤＮＡポリメラ
ーゼ反応の生成物は、なお一端でループを有する。その
ようにして生成された二本鎖ＤＮＡのループ又は「折り
重ね点」の頂点は、実質的に一本鎖セグメントである。
第三の反応において、この一本鎖セグメントは、一本鎖
特異的ヌクレアーゼＳ１により開裂されて「ブランドエ
ンド」二本鎖ＤＮＡセグメントを発生させる。この一般
的な方法は、すべてのｍＲＮＡ混合物に適用可能であ
り、そしてブエル（Ｂｕｅｌｌ）ら「Ｊ．バイオロ．ケ
ム．」２５３：２４８３（１９７８）に記載されてい
る。

【０００６】得られた二本鎖ｃＤＮＡ混合物（ｄｓ−ｃ
ＤＮＡ）は、少なくとも一部は用いられる特別な媒体に
応じて、多くの周知の技術の任意の一つによりクローン
する媒体に挿入される。種々の挿入法は、「メソッズ・
イン・エンチモロジー」６８：１６〜１８（１９８０）
及びその引用文献にかなり詳しく述べられている。

【０００７】一度ＤＮＡセグメントが挿入されると、ク
ローンする媒体が用いられて適当な宿主を形質転換す
る。これらのクローンする媒体は、通常、宿主に抗生物
質抵抗性の特徴を与える。このような宿主は、一般に原
核細胞である。この点において、形質転換又はトランス
フェクションされた宿主の二、三のみが所望のｃＤＮＡ
を含むに過ぎない。すべての形質転換又はトランスフェ
クションされた宿主のすべてが、遺伝子「ライブラリ
ー」を形成する。この方法により生成された全部のｄｓ
−ｃＤＡＮライブラリーが、原料として用いられるｍＲ
ＮＡ混合物に存在するコーディング情報の代表的なサン
プルを提供する。

【０００８】もし適当なオリゴヌクレオチド配列が利用
しうるならば、それは用いられて下記のやり方で問題の
クローンを同定する。個々の形質転換又はトランスフェ
クションされた細胞は、ニトロセルロース濾紙上でコロ
ニーとして成長する。これらのコロニーを溶解し；放出
されたＤＮＡを加熱により濾紙に固く結合する。濾紙
を、次に問題の構造遺伝子に相補的なラベルされたオリ
ゴヌクレオチドのプローブとともにインキュベートす
る。プローブは、それが相補的なｃＤＮＡと交雑し、そ
してオートラジオグラフィにより同定される。所望の蛋
白に関する構造上の情報のすべてを含むクローンの一つ
又は組合せを同定するために、相当するクローンの特徴
を求める。問題の蛋白についてコーディングする核酸配
列を単離し、そして発現ベクターに再挿入する。発現ベ
クターは、ｄｓ−ｃＤＮＡの有効な発現（転写及び翻
訳）を行わせる特定の原核又は真核のコントロール要素
の統制コントロールの下に、クローンされた遺伝子をお
く。従って、この一般的な技術は、少なくとも一部のそ
れらのアミノ酸又はＤＮＡ配列がオリゴヌクレオチドの
プローブが利用可能であることについて知られているこ
れらの蛋白に対してのみ利用可能である。一般にマニア
チスら、同上参照。

【０００９】さらに最近では、問題のエンコードされた
蛋白に対して特異的な抗体により細菌性コロニー又はフ
ァージ・プラークをプロービングすることにより、特定
のクローンを同定する方法が開発された。蛋白生成物の
合成が必要なので、この方法は「発現ベクター」クロー
ニング媒体についてのみ用いられる。構造遺伝子は、蛋
白の発現をコントロールする調節遺伝子配列に隣接した
ベクターに挿入される。細胞は、化学的方法又は宿主細
胞或いはベクターにより供給される機能の何れかによ
り、溶解され、そして蛋白は特定の抗体及び検出システ
ム例えば酵素イムノアッセイにより検出される。この一
つの例は、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）及びデービス（Ｄａｖ
ｉｓ）「プロシ・ナツル・アカデ．サイ．ＵＳＡ」８
０：１１９４〜１１９８（１９８３）並びにヤング及び
デービス「サイエンス」２２２：７７８（１９８３）に
より記載されたラムダｇｔ₁₁システムである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、容易に利用し
うる大量のＥＣＧＦ又はＥＣＧＦフラグメントを提供す
ることを可能にした。これは、そのデザインがウシＥＣ
ＧＦのアミノ酸配列の知識に基づきそしてＥＣＧＦｃ
ＤＮＡと特異的に反応するオリゴヌクレオチドにより達
成される。ＥＣＧＦの生成は、ＥＣＧＦ蛋白をエンコー
ディングするクローニング媒体の生成に対する組換えＤ
ＮＡ技術の適用並にヒト起源の他の蛋白が実質的にない
ＥＣＧＦ蛋白を回収する方法により達成される。

【００１１】従って、本発明はヒト起源の他の蛋白を実
質的に欠くＥＣＧＦ又はそのフラグメントを提供する。
ＥＣＧＦは、宿主細胞において組換えＤＮＡ技術により
生成され、そして本質的に純粋な形で提供される。本発
明は、さらにＥＣＧＦをエンコーディングするＤＮＡ配
列を組み込む複製可能な発現ベクター並にそれにより形
質転換又はトランスフェクションされる自己複製宿主細
胞システムを提供する。宿主システムは、通常、原核例
えばＥ．コリ又はＢ．ズブチリス又は真核細胞のもので
ある。

【００１２】ＥＣＧＦは、(a) 適当な宿主細胞システム
中にＥＣＧＦをエンコーディングするＤＮＡ配列を実現
しうる複製可能な発現ベクターを生成させ；(b) 該宿主
システムを形質転換して組換え宿主システムが得られ；
(c) 該ＥＣＧＦエンコーディングＤＮＡ配列の発現を生
じさせる条件下で該組換え宿主システムを維持してＥＣ
ＧＦ蛋白を生成させ；そして(d) 該ＥＣＧＦ蛋白を回収
することよりなる方法により生成される。好ましくは、
ＥＣＧＦエンコーディング複製可能発現ベクターは、Ｅ
ＣＧＦｍＲＮＡを代表するｄｓ−ｃＤＮＡ生成物を調
製しそしてｄｓ−ｃＤＮＡを複製可能な発現ベクターに
組み込むことにより製造される。ＥＣＧＦを回収する好
ましい態様は、組換え宿主システムにより発現された蛋
白と、ＥＣＧＦに関して特異的な少なくとも一つの結合
工程を含む試薬組成物とを反応させることを含む。ＥＣ
ＧＦは、損傷の治療又は血管及び他の内皮細胞系構造の
再生において治療剤として用いられうる。

【００１３】図１は、ｃＤＮＡクローンを生成する酵素
反応の一般的な方法を示す。

【００１４】図２は、ラムダｇｔ₁₁に挿入されるＤＮＡ
フラグメントを含むライブラリーの生成を示す。

【００１５】図３は、ウシのアルファ及びベータＥＣＧ
Ｆの部分的アミノ酸配列を示す。ラインａ：ウシのアルファＥＣＧＦのアミノ末端アミノ
酸配列。ラインｂ：ウシのベータＥＣＧＦのアミノ末端アミノ酸
配列。かっこ内の部分は、その配列が決定されなかった
ＮＨ₂末端セグメントに相当し；その代わりアミノ酸組
成が示される。ＰｈｅＡｓｎＬｅｕ・・・・・で始
まる配列は、トリプシン開裂ウシベータＥＣＧＦから決
定された。ラインｃ：臭化シアノゲン開裂ウシアルファＥＣＧＦの
アミノ酸配列。ラインｄ：臭化シアノゲン開裂ウシベータＥＣＧＦのア
ミノ酸配列。

【００１６】図４は、水素結合された塩基対を示す。

【００１７】図５は、ヒト内皮細胞成長因子のためのオ
リゴヌクレオチドのプローブのデザインを示す。

【００１８】図６は、ヒトＥＣＧＦｃＤＮＡクローン
１及び２９の概略図を示す。開いたリーディング・ボッ
クスは、ヒトベータＥＣＧＦをエンコーディングする開
いたリーディング・フレームを示す。ＥｃｏＲＩ部位
は、ｃＤＮＡライブラリーの構成に用いられる合成オリ
ゴヌクレオチドリンカーに相当する。クローン１の３’
末端のポリ（Ａ）テールは、Ａ₁₇により示される。

【００１９】図７は、ヒトＥＣＧＦｃＤＮＡ配列とオ
リゴヌクレオチドプローブとの間の同一性を示す。ラインａ：ウシのトリプシン−又は臭化シアノゲン開裂
ベータＥＣＧＦアミノ酸配列。ラインｂ：ユニークなオリゴヌクレオチドプローブ。ラインｃ：ヒトＥＣＧＦｃＤＮＡ配列（ラムダＥＣＧ
Ｆクローン１及び２９から決定）。ラインｄ：ｃＤＮＡ配列分析から導かれたヒトＥＣＧＦ
アミノ酸配列。

【００２０】図８は、ヒトＥＣＧＦの完全なｃＤＮＡ配
列を示す。ＥＣＧＦクローン１及び２９からのｃＤＮＡ
インサートはＭ１３ｍｐ１８にサブクローンされ、そし
てＥＣＧＦエンコーディング開放リーディング・フレー
ム及びその側面領域は、鎖成長停止法により配列され
た。ＥＣＧＦエンコーディング開放リーディングフレー
ムの５’及び３’末端の停止コドンは、フレームにおい
て、アンダーラインされた配列及びｔｒｍによりそれぞ
れ示されている。アミノ酸に関する一つの文字の表示が
用いられる：Ａ，ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；
Ｅ，Ｇｌｎ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ；Ｈ，Ｈｉｓ；
Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙｓ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；
Ｎ，Ａｓｎ；Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；
Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖａｌ；Ｗ，Ｔｒｐ；
Ｙ，Ｔｙｒ。

【００２１】図９は、ＥＣＧＦｍＲＮＡのノーザン・
ブロット分析を示す。ＲＮＡは２．２Ｍホルムアルデヒ
ド及び５０％ホルムアミド中で変性させられそして２．
２Ｍホルムアルデヒドを含む１．２５％アガロースゲル
中の電気泳動により分画された。これを１０ＸＳＳＰ
Ｅによってブロットすることによりジーンスクリーン・
プラス（ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓ）（ニュー
・イングランド・ニュークリア）に移した。ブロット
を、２ＸＳＳＰＥ、２０Ｘデンハルト（Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ）の溶液、イースト・トランスファＲＮＡ（２００
μｇ／ｍｌ）、０．２％ＳＤＳを含む混合物中で１６時
間６５℃でＥＣＧＦクローン１の³²ｐをラベルしたニッ
ク翻訳プローブへ交雑された。膜を６５℃で２ＸＳＳ
ＰＥ及び０．２％ＳＤＳにより２回、０．２ＸＳＳＰ
Ｅ及び０．２％ＳＤＳにより２回次々に洗い、風乾しそ
して増感スクリーンとともにコダックＸＡＲフィルムに
１晩露出した。２８Ｓ及び１８ＳＲＮＡの転位が示さ
れる。

【００２２】レーン１：１０μｇヒト脳ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ。レーン２：１０μｇヒト成人肝ポリ（Ａ）含有ＲＮＡ。

【００２３】本明細書で用いられるとき、「ＥＣＧＦ」
は、ヒトのアンジオゲニックなプロセスに固有なＥＣＧ
Ｆが有するように、生体外で細胞の成長、分化及び転位
に影響する能力を有する生活性的な形で、細胞又は無細
胞培養システムにより生成される内皮細胞成長因子又は
そのフラグメントを示す。

【００２４】ＥＣＧＦの異なるアレルは、自然に存在し
うる。これらの変異は、同一の生物学的機能の蛋白に対
してコーディングする構造遺伝子のヌクレオチド配列に
おける相違により特徴付けられよう。単一又は複数のア
ミノ酸の置換、欠損、付加又は転換を有するアナローグ
を生成することは可能である。自然のＥＣＧＦの生物学
上活性な性質を保つＥＣＧＦの誘導体をもたらすアナロ
ーグ並にすべてのこのようなアルレの変異、修飾は、本
発明の範囲内に含まれる。

【００２５】「発現ベクター」は、そのような配列がそ
れらの発現に影響しうる他の調節配列に結合するとき、
そこに含まれたＤＮＡ配列を転写及び翻訳しうるベクタ
ーを指す。これらの発現ベクターは、エピソーム、バク
テリオファージとして又は染色体ＤＮＡの拡大部分とし
ての何れかで、宿主生物又はシステム中で複製可能でな
ければならない。本発明で特に用いられるのに適した発
現ベクターの一つの形は、細菌中で通常生存し複製する
バクテリオファージ、ウイルスである。この目的に特に
望ましいファージは、ヤング及びデービス、同上により
記述されたラムダｇｔ₁₀及びｇｔ₁₁ファージである。ラ
ムダｇｔ₁₁は、挿入されたＤＮＡにより特定されるポリ
ペブチドを生成しうる一般的な組換えＤＮＡ発現ベクタ
ーである。

【００２６】劣化を最低にするために、ラクトースの合
成アナローグ（ＩＰＴＧ）による誘導のときに、異物蛋
白又はその部分は原核蛋白Ｂ−ガラクトシダーゼに合成
融合される。蛋白劣化径路に欠けた宿主細胞の使用は、
又誘導されたラムダｇｔ₁₁クローンから生成された新規
な蛋白の寿命を増大させる。ラムダｇｔ₁₁クローンにお
ける異物ＤＮＡの適当な発現は、Ｂ−ガラクトシダーゼ
プロモーター及び翻訳開始コドンに関する挿入されたＤ
ＮＡの適切な配向及びリーディング・フレームに依存す
るだろう。

【００２７】組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターの
他の形は、プラスミド即ち円形の組込まれていない（染
色体外）の二本鎖ＤＮＡループである。同等な機能を果
たす発現ベクターの任意の他の形は、本発明の方法に用
いられるのに適している。

【００２８】本明細書において開示された組換えベクタ
ー及び方法は、広範囲の原核及び真核の生物を含む宿主
細胞に用いられるのに適している。原核細胞が、ＤＮＡ
配列のクローン化及びベクターの構成に好ましい。例え
ば、Ｅ．コリＫ１２株ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ３３６９
４）が特に有用である。勿論、他の微生物の株も用いら
れうる。宿主細胞又はシステムと両立しうる種から誘導
された複製及びコントロール配列を含むベクターは、こ
れらの宿主とともに用いられる。ベクターは、形質転換
された細胞に表現型選択をもたらしうる特徴とともに、
元来複製の元を有している。例えば、Ｅ．コリは、ベク
ターｐＢＲ３２２を用いて形質転換され、それはアンピ
シリン及びテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を含む〔ボ
リバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら「ジーン（Ｇｅｎｅ）」
２：９５（１９７７）〕。

【００２９】これらの抗生物質抵抗性遺伝子は、形質転
換された細胞を同定する手段を提供する。発現ベクター
は、又目的の遺伝子の発現のために用いられうるコント
ロール要素を含む。Ｅ．コリ中の異物ＤＮＡ配列の発現
のために用いられる普通の原核コントロール要素は、バ
クテリオファージラムダのｐＲ及びｐＬプロモーターと
ともに、Ｅ．コリのＢ−ガラクトシダーゼ及びトリプト
ファン（ｔｒｐ）オペロンから誘導されたプロモーター
及び調節配列を含む。これらの要素の組合せは、又用い
られる（例えば、ｔｒｐプロモーターとラクトースオペ
レーターとの融合物であるＴＡＣ）。他のプロモーター
も又発見されそして利用され、そしてそれらのヌクレオ
チド配列に関する詳細は、発表されて当業者がそれらを
機能的に組み合わせそして利用することができる。

【００３０】原核生物に加えて、真核微生物例えばイー
スト培養も又用いられうる。サッカロミセス・セルビシ
エ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｖｉｓｉａ
ｅ）又は普通のベーカーズ・イーストは、真核微生物の
中で最も普通に用いられるが、多数の他の菌株も普通に
利用される。イースト中の異物ＤＮＡ配列の発現に適し
たイーストプロモーターは、３−ホスホグリセラートキ
ナーゼ又は他のグルコース分解酵素のためのプロモータ
ーを含む。好適な発現ベクターは、クローンされた遺伝
子のｍＲＮＡ転写のポリアデニル化及び停止をもたらす
停止シグナルを含む。イーストと両立しうるプロモータ
ー、複製の起源、適切な停止配列を含む任意のベクター
は、ＥＣＧＦの発現のために適している。

【００３１】多細胞生物から誘導された細胞系も又宿主
として用いられうる。原則として、脊椎動物又は無脊椎
動物の源からの何れでも、任意のこれら細胞培養は利用
可能である。しかし、関心は脊椎動物の細胞において最
大であり、そして培養（組織培養）中の脊椎動物の細胞
の増殖は、最近普通に行われている。このような有用な
宿主の例は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、マウスＣ１２７、
チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＷＩ３８、
ＢＨＫ、ＣＯＳ−７及びＭＤＣＫ細胞系である。このよ
うな細胞の発現ベクターは、元来、複製の起源、発現さ
れるべき遺伝子の前にあるプロモーター、ＲＮＡ切り継
ぎ部位（もし必要ならば）そして転写停止配列を含む。

【００３２】哺乳動物の細胞に用いられるため、発現ベ
クターのコントロール機能（プロモーター及びエンハン
サー）は、しばしばウイルス性物質により提供される。
例えば、普通に用いられるプロモーターは、ポリオー
マ、アデノウイルス２そして最もしばしばシミアン（Ｓ
ｉｍｉａｎ）ウイルス４０（ＳＶ４０）から誘導され
る。真核プロモーター例えばネズミメタロチオネイン遺
伝子のプロモーター〔パウラキス（Ｐａｕｌａｋｉｓ）
及びハマー（Ｈａｍｅｒ）「プロシ・ナツル・アカデ・
サイ．」８０：３９７〜４０１（１９８３）〕も又用い
られうる。その上、このようなコントロール配列が宿主
システムと両立しうるならば、所望の遺伝子配列と元々
結合しているプロモーター又はコントロール配列を利用
することが可能でありそしてしばしば望ましい。転写の
速度を高めるために、真核エンハンサー配列も構築に加
えられうる。これらの配列は、種々の動物細胞又は発が
ん性のレトロウイルス例えばマウス肉腫ウイルスから得
られうる。

【００３３】複製の起源は、外因性の起源例えばＳＶ４
０又は他のウイルス性の起源により提供されるものを含
むベクターの構築によりもたらされるか、又は宿主細胞
の染色体複製メカニズムによりもたらされるかの何れか
である。もしベクターが宿主細胞の染色体に組み入れら
れるならば、後者がしばしば十分である。

【００３４】宿主細胞は、種々の化学的組成を有するＥ
ＣＧＦを生成しうる。蛋白はその第一のアミノ酸として
メチオニンを有するものが生成される。このメチオニン
は、構造遺伝子の起源で元々存在するＡＴＧ開始コドン
により、又は構造遺伝子のセグメントの前に操作される
ことにより存在する。蛋白は、又細胞内又は細胞外で開
裂されて、蛋白のアミノ末端で元々見い出されるアミノ
酸を生ずる。蛋白は、それ自体又は異種シグナルペプチ
ドの何れかとともに生成され、シグナルポリペプチドは
細胞内又は細胞外の環境で特異的に開裂可能である。最
後に、ＥＣＧＦは、任意の外来のポリペプチドを開裂し
去る必要なしに成熟した形で直接発現により生成されう
る。

【００３５】組換え宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用
いて構築されたベクターにより形質転換された細胞に関
する。本明細書で規定された如く、ＥＣＧＦはこの形質
転換の結果として生成される。このような細胞により生
成されたＥＣＧＦ又はそのフラグメントは、「組換えＥ
ＣＧＦ」とされる。

【００３６】下記の方法は、本発明の方法で有用な特定
の試剤を生成する多数の充分に確立された方法の或るも
のに過ぎない。ｍＲＮＡ混合物を得るための一般的な方
法は、組織サンプルを得るか又は所望の蛋白を生成する
細胞を培養するかそしてチャーグウイン（Ｃｈｉｒｇｗ
ｉｎ）ら「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）」１８：５２９４（１９７９）により開示された
方法の如き方法によりＲＮＡを抽出することである。ｍ
ＲＮＡは、オリゴ（ｄＴ）セルロース又はポリ（Ｖ）セ
ファロースのクロマトグラフィ次いでポリ（Ａ）含有ｍ
ＲＮＡ画分の溶離により、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ含有物質
により増加される。

【００３７】上述のポリ（Ａ）含有ｍＲＮＡ増加画分を
用いて逆転写酵素を用いて一本鎖相補ｃＤＮＡ（ｓｓ−
ｃＤＮＡ）を合成する。ＤＮＡ合成の結果として、ヘア
ピン・ループは第二の鎖ＤＮＡ合成を開始するＤＮＡの
３′末端で形成される。適切な条件下、このヘアピン・
ループを用いてＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌ
クレオチドトリホスフェートの存在下ｄｓ−ｃＤＮＡの
合成を行なう。

【００３８】得られたｄｓ−ｃＤＮＡは、多くの周知の
技術の任意の一つにより発現ベクターにそう入される。
一般に、方法はマニアチスら、同上並に「メソッゾ・イ
ン・エンチモロジイ」６５及び６８巻（１９８０）及び
１００及び１０１巻（１９８３）に見い出される。一般
に、ベクターは少なくとも１種の制限エンドヌクレアー
ゼにより線状化され、それは少なくとも２個のブラント
又は結合端を生成するだろう。ｄｓ−ｃＤＮＡは、ベク
ターそう入部位とリゲート又は結合される。

【００３９】もし実質的な細胞壁物質を含む原核細胞又
は他の細胞が用いられるならば、発現ベクターによる形
質転換の最も普通の方法は、コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）、
Ｒ．Ｎ．ら「プロシ．ナツル．アカデ．サイ．ＵＳＡ」
６９：２１１０（１９７２）により記載された塩化カル
シウム予備処理である。もし細胞壁バリヤーなしの細胞
が宿主細胞として用いられるならば、トランスフェクシ
ョンはグラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びファン・デル・エ
ブ（ＶａｎｄｅｒＥｂ）「ウイロロジー（Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ）」５２：４５６（１９７３）により記載され
たりん酸カルシウム沈でん法により行われる。細胞にＤ
ＮＡを導入する他の方法例えば核注入、ウイルス感染又
はプロトプラスト融合が成功して用いられうる。細胞は
次に選択的媒体上に培養され、そして発現ベクターがエ
ンコードする蛋白が生成される。

【００４０】ＥＣＧＦに関する一部又は全部のｃＤＮＡ
を含むクローンは、ＥＣＧＦの部分的アミノ酸配列決定
から導かれた特定のオリゴヌクレオチドプローブにより
同定される。この同定法は、非同義性オリゴヌクレオチ
ドプローブがデザインされてそれが特異的にＥＣＧＦ
ｄｓ−ｃＤＮＡに交雑することを必要とする。ＥＣＧＦ
ｃＤＮＡ配列を含むクローンは、³²ｐ−ＡＴＰにより
オリゴヌクレオチドプローブを放射性ラベルし、ＥＣＧ
Ｆ−ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーの個々のクロ
ーンのＤＮＡへ放射性オリゴヌクレオチドプローブを交
雑し、そしてオートラジオグラフィーにより交雑するク
ローンの検出及び単離により単離される。このようなク
ローニングシステムは、ヤング及びデービス、同上によ
り記載されたラムダｇｔ₁₁システムに適用可能である。

【００４１】ＥＣＧＦの全配列を含むクローンは，ＥＣ
ＧＦ特異的オリゴヌクレオチドによる組換えラムダｇｔ
₁₁ ｃＤＮＡライブラリーの最初のスクリーニング中単
離されたＥＣＧＦ組換え体のｃＤＮＡインサートをプロ
ーブとして用いて同定される。ヌクレオチド配列技術を
用いてｃＤＮＡフラグメントによりエンコードされたア
ミノ酸の配列を決定する。この情報を用いてウシＥＣＧ
Ｆ及びＥＣＧＦの臭化シアノゲン開裂により誘導される
ペプチドのアミノ末端の周知のアミノ酸配列に対する比
較により、推定のＥＣＧＦｃＤＮＡクローンの同定性
を決定する。

【００４２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。

【００４３】Ａ．全ＲＮＡの生成全ＲＮＡ（メッセンジャー、リボゾーム及びトランスフ
ァー）を、本質的にチャーグウイン、同上（１９７９）
に記載されたように新鮮な２日経過したヒトの脳幹から
抽出した。細胞ペレットを５倍容の溶液〔４Ｍグアニジ
ンチオシアナート及び２５ｍＭアンチフォーム（Ａｎ
ｔｉｆｏｒｍ）Ａ（シグマ・ケミカル・カンパニー、セ
ント・ルイス、ミズリー）を含む〕中でホモゲナイズし
た。ホモジネートを１０℃で１５分間ソルバル（Ｓｏｒ
ｖａｌｌ）ＧＳＡローター中で６，０００ｒｐｍで遠心
分離した。上澄み液を酢酸の添加によりｐＨ５．０に調
節し、そしてＲＮＡが２時間−２０℃で０．７５倍容の
エタノールにより沈でんした。ＲＮＡを遠心分離により
集め、そして２ｍＭくえん酸ナトリウム及び５ｍＭジチ
オスレイトールを含む７．５Ｍグアニジン塩酸塩中に溶
解した。０．５倍容のエタノールを用いて２回の追加の
沈でん後、残存するグアニジン塩酸塩を無水エタノール
により沈でんから抽出した。ＲＮＡを滅菌水に溶解し、
不溶物質を遠心分離により除きそしてペレットを水によ
り再抽出した。ＲＮＡを０．２Ｍ酢酸カリウムに調節し
そして１晩−２０℃で２．５倍容のエタノールの添加に
より沈でんさせた。

【００４４】Ｂ．ポリ（Ａ）含有ＲＮＡの生成前述の如く生成された全ＲＮＡ沈でんを１０ｍＭＥＤ
ＴＡ及び１％ＳＤＳを含む２０ｍＭヘペスパッファー
（ｐＨ７．２）に溶解し、１０分間６５℃で加熱し次に
２５℃に急速に冷却した。ＲＮＡ溶液を次に等容量の水
により希釈し、ＮａＣｌを加えて最終の濃度を３００ｍ
ＭＮａＣｌとした。２４０Ａ₂₆₀単位以内のＲＮＡを
含むサンプルを標準の方法を用いてポリ（Ｕ）セファロ
ースのクロマトグラフィにかけた。ポリ（Ａ）含有ＲＮ
Ａを１ｍＭヘペスバッファー（ｐＨ７．２）及び２ｍＭ
ＥＤＴＡを含む７０％ホルムアミドにより溶離した。
溶離液を０．２４ＭＮａＣｌに調節しそしてＲＮＡを
−２０℃で２．５倍容のエタノールにより沈でんさせ
た。

【００４５】Ｃ．ラムダｇｔ₁₁中のｃＤＮＡクローンの
構築酵素反応について行われた方法は、図１に示される。ｍ
ＲＮＡ（２０μｇ）をブエル（Ｂｕｅｌｌ）ら、同上及
びウイルケンセン（Ｗｉｌｋｅｎｓｅｎ）ら「Ｊ．バイ
オロ．ケム．」２５３：２４８３（１９７８）に記載さ
れた通りに、逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼＩによ
りｄｓ−ｃＤＮＡへコピーされた。ｄｓ−ｃＤＮＡをセ
ファデックスＧ−５０で脱塩し、そして放出された容量
の画分をさらにメーカーの処方に従ってエルチップ（Ｅ
ｌｕｔｉｐ）Ｄカラム〔シュライヒアー・アンド・シュ
エル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）、
キーン、ＮＨ〕で精製した。ｄｓ−ｃＤＮＡをＳ１ヌク
レアーゼとのインキュベーションによりブラント末端に
した〔リカ（Ｒｉｃｃａ）ら、「Ｊ．オバロ．ケム．」
２５６：１０３６２（１９８１）〕。反応混合物は、
０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、０．４Ｍ塩化
ナトリウム、２．５ｍＭ酢酸亜鉛及び０．１単位のＳ１
ヌクレアーゼ（ｄｓ−ｃＤＮＡ／ｎｇ当り）よりなり、
１００μｌの最終反応容量とした。ｄｓ−ｃＤＮＡを１
時間３７℃でインキュベートし、フェノール：クロロホ
ルムにより抽出し次に前述の如くセファデックスＧ−５
０で脱塩した。

【００４６】ｄｓ−ｃＤＮＡを次にマニアチスら「モレ
キュラー・クローニング」同上に記載された反応条件を
用いてＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ）フラグメント及びＥｃｏＲＩメチラーゼにより処理
した。ｃＤＮＡを再び前述の如くセファデックスＧ−５
０で脱塩し次にＴ₄ＤＮＡリガーゼ（マニアチスら、同
上）を用いて０．５μｇのホスフォリル化ＥｃｏＲＩリ
ンカーにリゲートした。混合物をＥｃｏＲＩにより開裂
しそしてトリス・ボレートバッファ中の８％アクリルア
ミドゲルで分画した（マニアチスら、同上）。１キロベ
ースより大きい大きさのＤＮＡをゲルから溶離しそして
エルチップＤカラムに結合することにより回収し、１Ｍ
ＮａＣｌにより溶離しそしてエタノール沈でんにより
集めた。

【００４７】図２に示されるように、ＤＮＡフラグメン
トは次にＴ₄ＤＮＡリガーゼを用いて開裂されたＥｃｏ
ＲＩ及びホスファターゼにより処理されたラムダｇｔ₁₁
にそう入された。５．７×１０⁶ファージのライブラリ
ーが生成し、その中の約６５％が組換えファージであっ
た。ライブラリーは、Ｅ．コリＹ１０８８〔ｓｕｐＥｓ
ｕｐＦｍｅｔＢｔｒｐＲｈｓｄＲ^- ｈｓｄＭ⁺
ｔｏｎＡ２１ｓｔｒＡｌａｃＵ１６９（ｐｒｏ
Ｃ：；Ｔｎ５）（ｐＭＣ９）〕に４２℃でプレートスト
ックを生成することにより増巾された。増巾方法はマニ
アチスら、同上に記載されている。ヤングおよびデービ
ス、同上により記載されたこの菌株の重要な特徴は、
（１）ｓｕｐＦ（Ｓ遺伝子におけるファージアンバー突
然変異の要求された抑圧）、（２）ｈａｓＲ^- ｈｓｄ
Ｍ^-（宿主修飾前異物ＤＮＡの制限を防止するのに必
要）そして（３）ｌａｃＵ１６９（ｐｒｏＣ：；Ｔｎ
５）さらに（４）（ｐＭＣ９）（ファージ及び／又は細
胞の成長を阻害しうる異物遺伝子の発現をインデューサ
ーの不存在下抑制するｌａｃＩ含有ｐＢＲ３２２誘導
体）を含む。

【００４８】Ｄ．ＥＣＧＦ配列を含むクローンの同定ＥＣＧＦｃＤＮＡを含む組換えファージに関するライ
ブラリーをスクリーンするために、１．５×１０⁶ファ
ージをＥ．コリＹ１０９０〔△ｌａｃＵ１６９ｐｒＡ△
ｌｏｎａｒａＤ１３９ｓｔｒＡｓｕｐＦ（ｔｒｐ
Ｃ２２：；Ｔｎ１０）（ｐＭＣ９）〕の菌叢にプレート
し、そして６時間４２℃でインキュベートした。プレー
トを１晩冷凍した後、ニトロセルロースフィルターをプ
レートの上に置いた。フィルターの位置を針によりマー
クした。フィルターを１分後除きそして室温で放置して
乾燥した。各プレートから、重複したフィルターを前述
した通りに作成したが、ただしフィルターを５分間プレ
ートと接触させたままにした。すべてのフィルターを次
にマニアチスら、同上に記載された如くの交雑のために
生成した。これは０．５ＭＮａＯＨ、１．５ＭＮａ
Ｃｌ中のＤＮＡの変性、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．
５、１．５ＭＮａＣｌ中の中和及び真空下８０℃２時
間にわたるフィルターの加熱を含んだ。

【００４９】ヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリーをＥＣＧＦ
インサートを含むクローンについてスクリーンするため
に、特定のオリゴヌクレオチドをデザインした。このオ
リゴヌクレオチドは、ＥＣＧＦのアミノ末端の部分的ア
ミノ酸配列分析に基いた。図３のラインａ及びｂで示さ
れるように、ウシＥＣＧＦはアルファ及びベータＥＣＧ
Ｆと呼ばれる２種として単離され、それはそれぞれのア
ミノ末端で見い出されるアミノ酸だけが異なる。図３の
ラインｂに示されるように、ベータＥＣＧＦはアルファ
ＥＣＧＦより僅かに大きなものである。ベータＥＣＧＦ
のアミノ末端における正確なアミノ酸配列は未決定であ
るが、配列は高速原子衝撃質量分析により誘導されそし
てウシベータＥＣＧＦのアミノ末端トリプティックペプ
チドのアミノ酸組成が示される。アミノ末端ブロッキン
グ基はアセチルと思われる。もし未処理のベータＥＣＧ
Ｆがトリプシンにより開裂されるならば、ＰｈｅＡｓ
ｎＬｅｕ・・・により始まるアルファではないベータＥ
ＣＧＦに見い出される第二のアミノ酸配列が決定され
る。この配列は、又酸性線維芽細胞成長因子のアミノ末
端で見い出される〔トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、Ｋ．
Ａ．ら「プロシ，ナツル．アカデ．サイ．」８２；６４
０９〜６４１３（１９８５）〕。アルファＥＣＧＦのア
ミノ末端はＡｎｓＴｙｒＬｙｓ・・・・であり（図
３、ラインａ）、そしてアミノ末端を欠いたベータＥＣ
ＧＦと同じである。図３において、ラインｃ及びｄは、
それぞれ臭化シアノゲン開裂ウシアルファ及びベータＥ
ＣＧＦのアミノ酸配列の比較のために示す。

【００５０】オリゴヌクレオチドのデザインのため、ア
ルファＥＣＧＦアミノ酸１９〜２９に相当するアミノ酸
配列ＩｌｅＬｅｕＰｒｏＡｓｐＧｌｙＴｈｒ
ＶａｌＡｓｐＧｌｙＴｈｒＬｙｓが選ばれ
た。可能なコーディング配列のすべてを含むオリゴヌク
レオチドの混合物をデザインするのよりも（遺伝コード
の同義性のために）、長いユニークなオリゴヌクレオチ
ドがデザインされた。このようなオリゴヌクレオチドプ
ローブは、複合ｃＤＮＡ〔ジェイエ（Ｊａｙｅ）ら「ヌ
クレイック．アシズ．リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）」１１：２３２５〜２３３
５（１９８３）〕及びゲノム〔ギチャー（Ｇｉｔｓｃｈ
ｉｅｒ）ら「ネイチュア」３１２：３２６〜３３０（１
９８４）〕ライブラリーをスクリーニングするのに成功
したプローブであることが既に示されている。３種の基
準がＥＣＧＦプローブをデザインするのに用いられた。
（１）ジヌクレオチドＣＧを避けた。

【００５１】この戦略は真核ＤＮＡにおけるＣＧジヌク
レオチドの観察された表示不足に基く〔ジョセ（Ｊｏｓ
ｓｅ）ら「Ｊ．バイオロ．ケム．」２３６：８６４〜８
７５（１９６１）〕。（２）好ましいコドン利用データ
を可能な限り用いた。ヒトコドン利用の最近且包括的な
分析はラテ（Ｌａｔｈｅ）「Ｊ．モル．バイオロ．（Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．）」１８３：１〜１２（１９８５）〕
に見い出された。（３）ＣＧジヌクレオチドの戦略及び
好ましいコドン利用が情報価値がないときは、異常な塩
基対を認めた。この戦略はｔＲＮＡアンチコドンとｍＲ
ＮＡコドンとの間の相互作用中に生ずるＧ：Ｔ、Ｉ：
Ｔ、Ｉ：Ａ及びＩ：Ｃ塩基対の天然の発生に基く〔クリ
ック（Ｇｒｉｃｋ）、「Ｊ．モル．バイオロ．」１９；
５４８〜５５５（１９６６）〕。普通のそして異常な塩
基対の図を図４に示す。交雑プローブにおけるＩ（イノ
シン）の使用は、オーツカ（Ｏｈｔｓｕｋａ）ら「Ｊ．
バイオロ．ケム．」２６０；２６０５〜２６０８（１９
８５）によりモデル実験において先ず立証された。ＥＣ
ＧＦに関するヒト脳幹ｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ンするのに用いられるオリゴヌクレオチドのデザインで
行われた全体の戦略及び選択を図５に示す。さらに、同
じ戦略によりデザインされた２種の他のオリゴヌクレオ
チドも構築された。

【００５２】図５に示された約３０ｐモルのオリゴヌク
レオチドをマニアチスら、同上により本質的に記載され
た³²ｐガンマＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
とのインキュベーションにより放射性ラベルをした。前
述の如く作成したニトロセルロースフィルターを４２℃
で６ＸＳＳＰＥ（１ＸＳＳＰＥ＝０．１８ＭＮａ
Ｃｌ、０．０１ＭＮａＨＰＯ₄ ｐＨ７．２、０．０
０１ＭＥＤＴＡ）、２Ｘデンハートの溶液（１Ｘデン
ハート−０．０２％各フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）、ポリ
ビニルピロリドン、ウシ血清アルブミン）、５％硫酸デ
キストラン、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で
予備交雑した。³²Ｐをラベルしたオリゴヌクレオチドを
４時間の予備交雑後に加え、そして交雑を４２℃で１晩
続けた。未交雑のプローブを３７℃で２ＸＳＳＰＥ、
０．１％ＳＤＳの逐次の洗滌により除いた。

【００５３】スクリーンされた１．５×１０⁶プラーク
から、２個のプラークが、１晩の露出後正のオートラジ
オグラフィーシグナルを示した。これらのクローンを、
交雑プローブとして上記のオリゴヌクレオチドを用いる
精製サイクルの繰返しにより精製して均一なものとし
た。

【００５４】単離された２個のクローン（ＥＣＧＦクロ
ーン１及び２９）をさらに詳しく分析した。ＥｃｏＲＩ
による分解により、クローン１及び２９は、それぞれ
２．２及び０．３ｋｂのｃＤＮＡインサートを示した。
クローンされたｃＤＮＡのニック翻訳及びサザーンブロ
ット分析（マニアチスら、同上）における放射性ラベル
されたプローブとしてのその次の使用は、クローン１及
び２９は関連のある重複したクローンであることを示し
た。これらの２個のクローンの重複性は、図６に示され
る。

【００５５】クローン１及び２９は、さらに詳しく以下
の如く分析された。追加の２個のオリゴヌクレオチド
が、ウシＥＣＧＦのアミノ酸配列に基いてデザインされ
た。これらのオリゴヌクレオチドは、クローン１及び２
９を単離するのに用いられるオリゴヌクレオチドのデザ
インに用いられたのと同じ考え方に基いてデザインされ
た。これらのオリゴヌクレオチド（ＥＣＧＦオリゴヌク
レオチドＩＩ及びＩＩＩ）は、図７に示される。これら
の２個のオリゴヌクレオチド及びオリゴ（ｄＴ） ₁₈は、
前述の如きキネーション反応において放射性ラベルをさ
れ、そしてサザーンブロッティング実験において交雑プ
ローブとして用いた。これらの実験の結果は、クローン
２９の０．３ｋｂｃＤＮＡインサートはＥＣＧＦオリ
ゴヌクレオチドＩ及びＩＩには交雑するがＥＣＧＦオリ
ゴヌクレオチドＩＩＩ又はオリゴ（ｄＴ）₁₈には交雑せ
ず；クローン１の２．２ｋｂｃＤＮＡインサートはオ
リゴヌクレオチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩそしてオリゴ（ｄ
Ｔ）₁₈に交雑することを示した。これらのデータ並にク
ローン１及び２９の次のヌクレオチド配列決定は、クロ
ーン１の３′末端がポリ（Ａ）テールで終ることを示し
た。ウシＥＣＧＦの臭化シアノゲン開裂生成物に基くＥ
ＣＧＦオリゴヌクレオチドＩＩＩに対するそしてオリゴ
（ｄｔ）₁₈に対するクローン１の交雑は、このクローン
が、大きな（１ｋｂより大）３′側面配列と同じくアル
ファ及びベータの両方のＥＣＧＦに関するコーディング
配列の残りを含むことを強く示唆していた。

【００５６】クローン１及び２９からのｃＤＮＡインサ
ートは単離され、Ｍ１３ｍｐ１８にサブクローンされ
そしてＥＣＧＦをエンコードする開放リーディングフレ
ーム及び側面領域は、鎖成長停止法〔サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｒ）ら「プロシ．ナツル．アカデ．サイ．ＵＳＡ」
７４：５４６３〜５４６７（１９７７）〕により配列が
示された。これらのクローンのヌクレオチド配列及び核
酸配列から導かれたアミノ酸配列を図８に示す。ヌクレ
オチド配列を調べるとヒトＥＣＧＦをエンコードする４
６５個のヌクレオチドの開放リーディングフレームを明
らかにする。ヒトＥＣＧＦの１５５個のアミノ酸が、翻
訳停止コドンの側面に位置することが分った。ｃＤＮＡ
から導かれたヒトベータＥＣＧＦのＮＨ₂末端アミノ酸
はメチオニンであり、それは翻訳開始残基として働くも
のと思われる。初めの１５〜２０個のアミノ末端基の比
較的非疎水性とともに、これらのデータは、ヒトベータ
ＥＣＧＦがＮＨ₂末端シグナルペプチドなしに合成され
ることを強く示唆している。

【００５７】図３及び図８の比較は、トリプシン開裂ウ
シベータＥＣＧＦのアミノ末端アミノ酸配列並にウシア
ルファＥＣＧＦのそれは、ラムダＥＣＧＦクローン１及
び２９のヌクレオチド配列から予想されるアミノ酸配列
と殆んど同じであることを示す。９５％以上の２種の間
の全体の同一性が観察される。

【００５８】ノーザンブロット分析（マニアチスら、同
上）は、ＥＣＧＦｍＲＮＡが２８Ｓ γＲＮＡととも
に泳動する単一の分子であることを明らかにしている
（図９）。２８Ｓ γＲＮＡの評価された大きさの変化
を考えて、ＥＣＧＦｍＲＮＡの大体の大きさは４．８
±１．４ｋｂである。アルファ及びベータの両方のＥＣ
ＧＦの成熟した形をエンコードする配列のすべては、Ｅ
ＣＧＦクローン１及び２９（それはともに約２．３ｋｂ
を含む）内にエンコードされる。従って、これらのデー
タは、領域５′及び側面に位置するＥＣＧＦエンコーデ
ィング配列が極めて大きい（約２．５±１．４ｋｂ）を
立証する。

【００５９】クローン１及びクローン２９からのｃＤＮ
Ａインサートは、ＥｃｏＲＩによる分解により切除さ
れ、そしてＥｃｏＲＩ部位でｐＵＣ８でサブクローンさ
れた。クローン１から形成されたプラスミドは、ｐＨＤ
１５と呼ばれ、そしてクローン２９から形成されたプラ
スミドはｐＨＤ１４と呼ばれた。プラスミドは、アメリ
カン・タイプ・カルチュア・コレクション、１２３０１
パークローン・ドライブ、ロックビル、ＭＤ２０８５２
に寄託された。クローン１からのプラスミドのｐＨＤ１
５はＡＴＣＣ５３３３６とされ、クローン２９からのプ
ラスミドのｐＤＨ１４はＡＴＣＣ５３３３５とされた。

【００６０】従って、本実施例は、ヒト起源の他の蛋白
を本質的に含まないヒト内皮細胞成長因子を提供する実
験的な方法を記載している。

【００６１】ＥＣＧＦは、培養中の内皮細胞の成長及び
増殖に有用性がある。最近、細胞培養の用途のＥＣＧＦ
は、マシアグら〔「プロシ．ナツル．アカデ．サイ．」
７６：１１、５６７４〜５６７８（１９７８）〕のプロ
トコールによりウシの脳から抽出されている。この粗製
ウシＥＣＧＦは、ヒトの臍静脈内皮細胞に対してミトゲ
ニックであり〔マシアグら「Ｊ．バイオロ．ケム．」２
５７；５３３３〜５３３６（１９８２）〕そして他のも
のからの内皮細胞についてもそうである。ＥＣＧＦ及び
フィブロネクチンマトリックスによるヘパリンの利用
は、安定な内皮細胞クローンの成立を行わせる。生体外
のミトゲンとしての使用に関するこの粗製ウシＥＣＧＦ
の推せんされる濃度は、成長培地１ｍｌ当り１５０ミク
ロｇである。

【００６２】組換えＤＮＡ誘導ヒトＥＣＧＦは、それ
故、研究の目的でヒト内皮細胞及び他の間葉細胞の生体
外の培養において、粗製のウシＥＣＧＦの改良された置
換物としての用途を有する。ヒトＥＣＧＦは、両方の蛋
白のアミノ酸配列における高度の同一性のために、内皮
細胞の成長の相乗作用にウシＥＣＧＦと同じか又はそれ
よりも良いことが予想される。生体外の細胞の分化及び
成長を増強する予想される有効な投与量の範囲は、培養
培地１ｍｌ当り５〜１０ｎｇの精製されたＥＣＧＦであ
る。本明細書に示された如き組換えＤＮＡ技術を経るＥ
ＣＧＦの生成及びバージスら〔「Ｊ．バイオロ．ケ
ム．」２６０：１１３８９〜１１３９２（１９８５）〕
により記載された如き次の精製は、ヒトのホメスタチス
及びアンジオゲネシスのモデルを発展させるヒト起源の
多量の精製生成物（従来任意の量又は純度で入手不可
能）を提供するだろう。

【００６３】組換えＤＮＡから導かれたヒトＥＣＧＦ
は、又組織培養フラスコ又は瓶よりも人工器管上の細胞
の成長の増大に有用性がある。この器管は、装置への内
皮細胞の付着を助ける他の分子によりコーティングされ
ていてもいなくてもよい。これらの促進分子は、細胞外
マトリックス蛋白（例えばフィブロネクチン、ラミニン
又はコラーゲンの一種）、ヒト血清アルブミン、ヘパリ
ン又は他のグリコサミノグリカン又は不活性有機分子を
含みうる。内皮細胞は、培地中で有効量のＥＣＧＦを用
いてこれらの表面に培養され、最終的に内皮細胞の単層
により器管をカバーする。この器管は、次に人工器管上
に非トロンボゲン表面をもたらし、従って人工器管の植
え込みにともなう潜在的に生命をおびやかすトロンボゲ
ンの発生の危険を低下させる。

【００６４】ＥＣＧＦは、診断の応用に有用性を有す
る。シュライバー（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ）ら〔「プロ
シ．ナツル．アカデ．サイ．」８２：６１３８（１９８
５）〕は、ウシＥＣＧＦについて二重抗体イムノアッセ
イを開発した。このアッセイにおいて、９６穴のポリ塩
化ビニルプレートをウサギ抗ＥＣＧＦによりコートし、
残りの結合部位を次に１０％正常ウサギ血清によりブロ
ックした。ＥＣＧＦサンプルを次に穴に加えそしてイン
キュベートした。洗滌後ネズミモノクローナル抗ＥＣＧ
Ｆを加えた。インキュベーション及び三、四回の洗滌
後、パーオキシダーゼとカップルされたウサギ抗マウス
ＩｇＧを加えた。反応生成物を、過酸化水素の存在下
Ｏ−フェニレンジアミンの転換後分光測光的に定量し
た。同様に考えられたイミノアッセイは、内皮細胞の成
長に影響する疾患状態のヒトＥＣＧＦレベルをモニター
するのに有用であろう。精製された組換えＤＮＡ誘導Ｅ
ＣＧＦは、未知のＥＣＧＦサンプルを定量する標準の試
薬として有用であろう。

【００６５】ＥＣＧＦは、又血管及び他の内皮細胞系構
造の再生又は損傷の治療に可能性がある。

【００６６】本発明は例示的な態様により限定されるも
のと考えられないことは理解されるべきである。本明細
書に開示された発明の概念から離れることなく、他の態
様を作成することは可能である。このような態様は、当
業者の能力の中にある。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｃＤＮＡクローンを生成する酵素反応の一般的
な方法を示す。

【図２】ラムダｇｔ₁₁にそう入されるＤＮＡフラグメン
トを含むライブラリーの生成を示す。

【図３】ウシのアルファ及びベータＥＣＧＦの部分的ア
ミノ酸配列を示す。

【図４】水素結合された塩基対を示す。

【図５】ヒト内皮細胞成長因子のためのオリゴヌクレオ
チドのプローブのデザインを示す。

【図６】ヒトＥＣＧＦｃＤＮＡクローン１及び２９の
概略図を示す。

【図７】ヒトＥＣＧＦｃＤＮＡ配列とオリゴヌクレオ
チドプローブとの間の同一性を示す。

【図８】ヒトＥＣＧＦの完全なｃＤＮＡ配列を示す。

【図９】ＥＣＧＦｍＲＮＡのノーザン・プロット分析
を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ウイルソンバーガスアメリカ合衆国メリーランド州 20879 ゲイザースバーグシダーアベニュー 13 (72)発明者トーマスマーシアアメリカ合衆国メリーランド州 20852 ロックビルバレリアンレーン 6050 (72)発明者ウイリアムドロハンアメリカ合衆国バージニア州 22151 スプリングフィールドパースコート 5232

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト内皮細胞成長因子をコードするＤＮ
Ａ配列を発現し得る複製可能な発現ベクターを適当な主
宿に提供し、該主宿を形質転換させて組換え宿主を得、
そして該内皮細胞成長因子をコードするｃＤＮＡ配列の
発現を可能にする条件下に該組換え宿主を維持して内皮
細胞成長因子を産生させることからなるヒト内皮細胞成
長因子を産生する方法。
【請求項２】該内皮細胞成長因子を採取する工程をさ
らに含む特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】該発現ベクターがバクテリオファージで
ある特許請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項４】該バクテリオファージがラムダｇｔ₁₀及
びラムダｇｔ₁₁よりなる群から選ばれる１つである特許
請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】該発現ベクターがプラスミドである特許
請求の範囲第２項記載の方法。
【請求項６】該プラスミドがｐＢＲ３２２から誘導さ
れる特許請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項７】該発現ベクターのコントロール機能がウ
イルス性物質により提供される特許請求の範囲第２項記
載の方法。
【請求項８】該ウイルス性物質がウシ乳頭腫ウイル
ス、エプスタイン・バー（ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒ）
ウイルス、アデノウイルス、シミアン（Ｓｉｍｉａｎ）
ウイルス４０及びバッキロウイルス（ｂａｃｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ）よりなる群から選ばれる１つである特許請求
の範囲第７項記載の方法。
【請求項９】ヒト内皮細胞成長因子をコードするＤＮ
Ａ配列を発現し得る複製可能な発現ベクターを適当な主
宿に提供し、該主宿を形質転換させて組換え宿主を得、
そして該内皮細胞成長因子をコードするｃＤＮＡ配列の
発現を可能にする条件下に該組換え宿主を維持して内皮
細胞成長因子を産生させ、該内皮細胞成長因子を採取す
ることからなる方法により産生されたヒト内皮細胞成長
因子であり、該ヒト内皮細胞成長因子は下記のアミノ酸
配列(i) 、(ii)及び(iii) からなる群から選ばれるアミ
ノ酸配列からなる、ヒト内皮細胞成長因子： (i)ＡＥＧＥＩＴＴＦＴＡＬＴＥＫＦＮＬＰＰＧＮＹＫ
ＫＰＫＬＬＹＣＳＮＧＧＨＦＬＲＩＬＰＤＧＴＶＤＧＴ
ＲＤＲＳＤＱＨＩＱＬＱＬＳＡＥＳＶＧＥＶＹＩＫＳＴ
ＥＴＧＱＹＬＡＭＤＴＤＧＬＬＹＧＳＱＴＰＮＥＥＣＬ
ＦＬＥＲＬＥＥＮＨＹＮＴＹＩＳＫＫＨＡＥＫＮＷＦＶ
ＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰＲＴＨＹＧＱＫＡＩＬＦＬＰ
ＬＰＶＳＳＤ（β−ＥＣＧＦ）； (ii)ＮＹＫＫＰＫＬＬＹＣＳＮＧＧＨＦＬＲＩＬＰＤＧ
ＴＶＤＧＴＲＤＲＳＤＱＨＩＱＬＱＬＳＡＥＳＶＧＥＶ
ＹＩＫＳＴＥＴＧＱＹＬＡＭＤＴＤＧＬＬＹＧＳＱＴＰ
ＮＥＥＣＬＦＬＥＲＬＥＥＮＨＹＮＴＹＩＳＫＫＨＡＥ
ＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧＳＣＫＲＧＰＲＴＨＹＧＱＫＡ
ＩＬＦＬＰＬＰＶＳＳＤ（α−ＥＣＧＦ）；及び (iii) ＭＨ₂−末端メチオニン残基を付加的に含む(i)
又は(ii)の配列。
【請求項１０】該内皮細胞成長因子の採取が、組換え
宿主システムにより発現された蛋白と、内皮細胞成長因
子に特異的な少なくとも１種の結合蛋白を含む試薬組成
物との反応を含む特許請求の範囲第２項記載の方法。