JP2811371B2 - 体液中の病原を不活性化する方法 - Google Patents

体液中の病原を不活性化する方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の背景 本発明は、一般には体液中に含まれ得る病原を不活性
化する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は特に血
液製品中の感染病を引き起こし得る病原を不活性化する
方法に関する。
輸血および移植のような種々の療法において、体液、
特に赤血球、血小板、血漿、白血球および骨髄のような
血液成分が１人以上の個人から患者へ注入される。その
ような療法はそのいくつかは生命救助であり、他の方法
によっては提供できない治療を提供するが、感染病伝播
のためそのような療法に対して潜在的なリスクが存在す
る。
例えば、血液は肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス
（エイズの病因）およびヘルペスウイルスのような感染
性作因を担持することができる。そのようなウイルスを
含むかも知らない血液を固定するためのスクリーニング
方法が存在するが、ウイルスおよび他の病気を引き起こ
すバクテリアのような病原を可能な血液成分源のプール
から100％排除することはできず、輸血がウイルス感染
を伝播できる少ないチャンスはなお存在する。従って生
医学的研究のゴールはそのような血液成分中に存在する
病原を選択的に不活性化または除去することによって感
染性作因を伝播することを減らすことであった。
一つのアプローチは、適切な波長の波の光によって活
性化するとき病原が感染が引き起こす能力を破壊する感
光（光活性）剤を使用することであった。光動力学的療
法の使用は、貯蔵および輸血前、採取した血液およびそ
の成分から感染性作因を根絶する一方法として提案され
る。Neyndorff et al.,“Development of Model t
o Demonstrate Photosensitizer Mediated Viral
Inactivation in Blood",Transfusion 1990:30:485
−490;North et al.,“Photodynamic Inactivation
of Retrovirus by Benzoporphyrin Derivative:A
Feline Leukemia Virus Model",Submitted to T
ransfusio;Matthews et al.,“Photodynamic Therap
y of Viral Contaminants With Potential for
Blood Bank Applications",Transfusion,28（１）,p
p.81−83（1988）参照。
病原の破壊に有効であるが、病原の光化学的不活性化
は、赤血球または血小板のような製品の治療要素に対し
副作用をもたらし得る。この点に関し、免疫血液学的研
究を通じ、膜に作用する光活性剤で処理した血液成分の
細胞は細胞膜に会合したIgGおよび他の血漿タンパクを
有することが観察された。IgGは、存在する時光活性化
プロセスの間細胞と結合する免疫グロブリン血漿タンパ
クである。
この現象を回避する最近の試みは不成功であった。Wa
gner et al.,“Red Cell Surface Alterations R
esulting From Virucidal Photochemical Treartme
nt",Photochemistry ＆ Photobiology 53:545,1991
は、“予期に反し、メチレンブルーまたはメロシアニン
光処理した細胞に対するウサギ抗ヒトIgGを使用する凝
集反応テストは、光増感した赤血球はそれらの表面に会
合したIgGを持っていることを示した。光処理前赤血球
の洗浄による血漿除去は、後に未処理の自家またはAB血
漿の添加時このIgG結合を防止しなかった。”と報告し
ている。
赤血球の膜へ結合したIgGの存在は、血液成分中の病
原を不活性化するために光不活性化薬物の使用に潜在的
な心配および困難性の宿主を高める。生理学的な問題は
処理した赤血球の細胞内皮組織系クリアランスおよび補
体活性化を含んでいる。IgGで被覆された赤血球はRESシ
ステムによって輸血患者中あまりに速く除去され得る。
多分重要なIgG結合に関する関心は、IgGの存在が細胞
生存または製品安全性に影響ないとしても、診断上のか
かり合いについてである。処理後、血球へ結合したIgG
はたとえかなりの洗浄を行ったとしても血球の洗浄によ
って細胞膜から除去することができない。血球へIgGの
結合のため、血球は直接凝集反応テスト（DATまたはク
ームス試験）を採用する時陽性テスト結果を示す。
クームス試験は赤血球上の抗体を検出するために使用
される。このテストは免疫グロブリンに対するウサギ抗
血清を使用する。IgGで被覆された赤血球がウサギ抗血
清と混合されるとき、凝集反応が起こる。もしIgG被覆
赤血球が患者へ輸血されれば、臨床医は、そのような製
品を受けるすべての患者は陽性クームステストを示すで
あろうから、患者の血液学的変化を理解する彼の重要な
診断テストの一つを失って了う。
そのようなIgG被覆血球の使用は現在使用されている
血清学的および診断テスト操作の多くを妨害するであろ
う。例えば、赤血球は典型的にはクームス試験を使用し
てスクリーニングされる。従って光活性剤は生きている
病原の減少をもたらし得るが、IgG結合赤血球に固有の
不利益は利益を上廻り得る。
さらに、病原を不活性するためのどんな商業的に活用
し得るプロセスも不当な長期間を持たない活性化フェー
ズを持たなければならない。そのような光動力学的プロ
セスの光活性化フェーズは存在する光活性剤の量に依存
する。しかしながら体液は当初病原のすべてが剤に結合
することを確実にするための光活性剤の十分な量を負荷
されなければならない。それ故過剰の光活性剤がプロセ
スの活性化フェーズを増加させ得る。
本発明の概要 本発明は、赤血球、血小板、白血球および骨髄のよう
な体液中の病原を不活性化するための方法を提供する。
本発明は、光増感剤によって生ずる副作用を、そのよう
な剤およびプロセスの消毒活性を保持しながら最小化す
る。このため、本発明の一具体例に従って、少なくとも
赤血球１単位中５〜６対数のウイルスが14日間の貯蔵期
間にわたり溶血２％以下で不活性化される。この操作は
ウイルスのような病原性夾雑物の殺滅をもたらす。正常
な細胞または組織はそれらの機能的完全性を保ち、そし
て赤血球の場合陽性の直接凝集反応テストを示さない。
本発明によれば、病原の破壊を実現する条件下で光活
性剤の存在下細胞を処理するステップを含む、医療用途
のために調製された細胞を含んでいる液体中の病原を破
壊するための方法が提供され、前記処理ステップは細胞
外タンパクの減少した含量を有する液体中で実施され、
加えて照射プロセス後、得られた液体はあらかじめ規定
した期間、そのような細胞外タンパク、例えば血漿タン
パクと接触することを許容されない。
赤血球に関し、光活性剤の活性化後、赤血球の少なく
とも一部は血漿タンパクに対して非特異的親和性を持つ
ことが発見された。もし照射した赤血球が照射プロセス
後一定時間内に生体内または生体外で血漿タンパクと結
合するならば、それらは少なくとも血漿中に存在するIg
Gタンパクと結合するであろう。しかしながら、もしあ
るかじめ定める時間待てば、赤血球はIgGを含む血漿タ
ンパクと十分に結合しないであろう。ベンゾポルフィリ
ン誘導体に関し、少なくとも約３時間の待機期間が十分
であることが発見された。一具体例において、好ましい
待機時間は約18時間である。
細胞外液は、体液へ光活性剤が添加される前または後
で洗浄、濾過または他の方法により体液から除去するこ
とができる。
一具体例において、本発明は、採取した体液へ光活性
剤を添加し、末結合光活性剤および細胞外成分を除去も
しくは少なくとも実質上減らすように体液を処理し、得
られた体液中の病原を不活性化するために適切な光で得
られた体液を照射するステップよりなる、体液中の病原
を不活性化するための方法を提供する。
一具体例において、採取した血液成分へ光活性剤を添
加し、光活性剤が血液成分と平衡下するのを許容し、末
結合光活性剤および血漿タンパクを実質的に減少または
除去するように血液成分を処理し、病原を不活性化する
のに適切な波長の光で得られた血液成分を照射し、そし
て得られた血液成分が血漿および／または他のタンパク
含有物質と接触することを許容する前に、少なくとも３
時間待機するステップよりなる、血液成分中の病原を不
活性化する方法が提供される。
一具体例において、血漿タンパクを減らすように血液
成分を処理し、血液成分へ光活性剤を添加し、病原を不
活性するのに適切な波長の光で得られた血液成分を照射
し、そして照射した血液成分がタンパク含有組成物と接
触するのをあらかじめ定めた期間防止するステップより
なる、赤血球を含んでいる血液成分中の病原を不活性化
する方法が提供される。
好ましくは、本発明により、血液成分の全重量の約５
％以下は処理ステップ後残っている血漿タンパクよりな
る。
本発明の一具体例においては、光活性剤は限定なし
に、ポルフィリン、ポルフィリン誘導体、MC540のよう
なメロシアニン、アルミニウムフタロシアニンのような
フタロシアニン、他のピロールマクロ環、プソラレン、
およびメチレンブルーのような他の光活性染料から選ば
れる。好ましい具体例においては、光活性薬物はベンゾ
ポルフィリン誘導体である。
一具体例において、処理ステップは血液成分をペレッ
トを形成するように遠心し、上清を除去し、そしてペレ
ットを再懸濁することよりなる洗浄ステップを含む。
一具体例において、処理ステップは濾過ステップを含
む。
もし望むならば複数の洗浄ステップを本発明方法に用
いることができる。
一具体例において、照射した得られた製品へ貯蔵液が
添加される。
一具体例において、少なくとも３時間後血液成分は患
者へ注入される。
本発明のこれ以外の特徴および利益は現在好ましい具
体例の詳細な説明および図面に記載され、そしてそれか
ら明らかであろう。
図面の簡単な説明 図１は、洗浄しない血液成分へ添加した時の感光性薬
物の分布のための三つのコンパートメントモデルを概念
的に図示する。
図２は、洗浄なしおよび洗浄プロセスを使用し、光線
量の関数としてVSVのBPD不活性化をグラフとして図示す
る。
図3a−3cは、赤血球へのIgG結合のフロー血球計算分
析のグラフである。
図4a−4bは、赤血球へのIgG結合のフロー血球計算分
析のグラフである。
現在好ましい具体例の詳細な説明 本発明は、体液中の病原を不活性化する方法を提供す
る。詳しくは、本発明は血液および血液成分源から、感
染病の伝播を引き起こすウイルスのような病原を不活性
化する方法に関する。
ここで使用する“体液”なる術語は、血漿または血漿
成分、赤血球、白血球および血小板、骨髄、組織培養中
に発生した細胞のような血液成分および精液を含む。
一般に本発明方法は、体液へ光活性剤を添加し、病原
を不活性化するように光活性剤を活性化することによっ
て病原を不活性化する。特に血液成分に関し、光活性剤
の添加またはその照射前、IgGのような血漿タンパクが
除去または実質的に減らされる。本方法の照射ステップ
後、あらかじめ定めた期間が経過するまで、血液成分は
患者へ注入されないか、または血漿および／または他の
タンパク含有材料と混合されない。
少なくともBPDに関し、この期間は少なくとも約３時
間、そして好ましくは約18時間でなければならないもの
と信じられる。この期間は使用される光活性剤に応じて
異なることができる。重要なことは、光活性化と血漿タ
ンパク接触の間に一定の時間遅延が存在することであ
る。
本発明は、処置に対する増大した“治療窓”を含む多
数の利益を提供する。この方法は増大したウイルス不活
性化および／または除去をもたらす。
また赤血球に関し、この方法は光活性剤が血漿タンパ
クの存在下活性化される血球に比較し、貯蔵において赤
血球の増加した安定性をもたらす。加えて、この方法は
直接凝集反応テスト（DAT）陽性の以前の問題を排除す
る。
さらに、最大の（100％まで）ウイルス不活性化およ
び／または除去を達成するためにより少量の光増感剤
（BPD）しか必要としない。同様に本発明の一具体例に
おいては、光増感剤とのインキュベーション後光露出直
前に実施される洗浄ステップを使用することにより、光
増感剤および／または光生産物の減少した量が最終製品
中に存在する。
一具体例において、この方法は血液成分のような採取
した体液へ光活性剤を添加するステップを含む。光活性
剤は体液と平衡下することか許容される。体液は次に、
末結合光活性剤および細胞外物質、例えば血漿およびタ
ンパクを除去もしくは少なくとも実質的に減らすため、
洗浄または他のステップによって処理される。得られる
体液は次に体液中の病原を不活性化するため適切な光で
照射される。
膜活性を有し、そして照射した時血液中のウイルス性
作因のような病原を不活性することができる多数の光活
性剤が同定されている。これら光活性剤はポルフィリ
ン、ポルフィリン導電体、MC540のようなメロシアニ
ン、アルミニウムフタロシアニンのようなフタロシアニ
ン、他のピロールマクロ環、プソラレン、およびメチレ
ンブルーのような光活性染料を含む。前に記したよう
に、これら光活性剤の少なくともあるものは、赤血球の
ような少なくともある種の体液に使用した時一定の不利
益を発揮し得る。本発明はこれら剤の有益な効果を維持
しつつこれら不利益を回避する。
光活性化合物は、例示としてベンゾポルフィンから誘
導された光活性化薬物のファミリーを含む。これら誘導
体は通常BPDと呼ばれる。BPDはカナダ、ブリティシュコ
ロンビア州バンクーバーのQuadra Logic Technologie
s,Inc.から入手し得る。
BPDは他のタイプのヘマトポルフィリン誘導体と同時
に、細胞壁または血中に担持されている多数のウイルス
生物の膜に対し親和性を持っている。それ故それらは細
胞壁または膜へ結合または付着する。光線へ露出する
時、BPDは酸素とのエネルギー移動プロセスを受け、一
重項酸素を生成する。一重項酸素が酸化する時、それは
それが付着した生物学的細胞を殺滅する。他の光学的出
来事も細胞殺滅に貢献し得る。
少なくとも血液成分が使用される時、血漿タンパクは
光活性剤の照射前に除去もしくは少なくとも実質的に減
らされなければならない。血漿タンパクの除去もしくは
実質的減少は、血液成分へ光活性剤の添加物、またはそ
れが添加された後に行うことができる。後で詳しく論ず
るように、何時除去ステップが行われるかによっていく
つかの追加の利益が得られる。やはり後で詳しく述べる
ように、それにもかかわらず重要なステップは、照射プ
ロセス後、血液成分はあらかじめ定めた期間生体内また
は生体外で追加の血漿タンパクとの接触が防止されるこ
とである。BPDに関し、この期間は少なくとも照射後約
３時間でなければならないものと信じられる。
本発明の一具体例により、最初光活性剤が成分液、例
えば赤血球へ添加される。光活性剤は液、例えば赤血球
と平衡化することが許容される。ここで使用される“平
衡化”とは、剤が液の異なるコンパートメントへ分布さ
れることを意味する。しかしながら平衡化物は平衡が必
然的に達成されることを意味しない。
モデルが図示されている図１を参照すると、血液成分
は三つのコンパートメント、血球、病原、そして血漿お
よび水性媒体（細胞外液）を含む。図１は、血球および
病原、血漿タンパクおよび病原、および血漿タンパクお
よび血球に関して平衡状態を図示している。平衡状態は
病原のすべてまたは実質的部分は不活性化されることを
確実にするために重要である。
出願人らは、光活性剤が液へ添加された後平衡状態へ
達するのに要する時間は、好ましくは約５分ないし約６
時間であることを発見した。５分以内に十分な剤が病原
コンパートメントへ分布されるものと信じられる。出願
人らは、約１時間後病原コンパートメントは完全に負荷
され、１時間後ウイルス不活性化は照射時増加されない
ことを発見した。
本方法のこの具体例において、プロセスのこの段階に
おいて細胞外液（血漿タンパク）は細胞コンパートメン
ト（赤血球）から分離されていない。光活性剤の添加前
に細胞外液を除去しないことにより、いくつかの利益が
得られる。細胞外液コンパートメントはリポタンパクを
含んでいるから、それはプロセスの間貯蔵ステーション
として作用する。
この点に関し、赤血球コンパートメント中の光活性剤
の病原コンパートメントに対する比が重要である。少な
くともある種の親油性光活性剤に関し、もし血漿タンパ
クが光活性剤添加前に除去されるならば、病原コンパー
トメント内の光活性剤の血球コンパートメントに対する
比は望ましくない態様にシフトし得る。
理想的には、もし光活性剤の全部が病原コンパートメ
ント内に含まれ、赤血球コンパートメントになければ望
ましいであろう。血漿タンパクが残ることを許容するこ
とにより（最初剤が病原、赤血球および細胞外コンパー
トメント間に分布されている時）、光活性剤の大部分は
血球コンパートメントへ入るのを防止され、その間なお
病原コンパートメントが適切に負荷されるのを許容され
る。細胞外コンパートメントは脂質、リポタンパク、お
よび親油性光活性剤と可逆的態様で結合し、そのため光
活性剤の分布のためのキャリアとして役立つタンパクを
含んでいる。多数の親油性光活性剤の添加時に存在する
細胞外脂質／タンパクを持つことを正味の結果は、病原
コンパートメントの適切な負荷が赤血球コンパートメン
トの負荷を最小にしながら得られることである。
血漿タンパクが当初除去されず、そして光活性剤が血
液成分へ添加される時に残っている時は、剤が液と平衡
化した後、光活性剤の約80ないし約90％が細胞外（タン
パク）コンパートメントに見られ、そして約10ないし約
20％が細胞（赤血球）コンパートメントに見られること
が判明した。それ故、血漿タンパクが洗い流された後、
血球コンパートメントへ負荷された光活性剤の最大20％
だけが残る。
光活性剤が添加された後に血漿タンパクを除去するこ
とによる一利益は、遊離または結合であり得るものを含
む過剰の光活性剤を除去できることである。たとえ光活
性剤が血液成分細胞膜と結合しなくても、光活性剤は細
胞損傷をおこし得る。損傷は細胞膜へ隣接するが外側で
ある光活性剤活性化によって発生した一重項酸素または
他の光化学的出来事によって生じた酸化的損傷に対して
二次的である。
加えて、どんな光生産物の発生をも減らすため過剰の
光活性剤を除去することが望ましいであろう。照射前末
結合光活性剤を洗い流すことにより、そのような光生産
物の発生のリストを減らすことができる。
末結合光活性剤を除去するため血液成分を処理するこ
との他の利益は、製品を消毒するのに要する露光時間を
減らすことができることである。末結合光活性剤を除去
することにより、末結合光活性剤の洗浄除去後与えられ
た殺微生物効果を得るのに必要な露光時間を短くするこ
とが可能になる。これは例えば多数の赤血球単位の処理
に関し重要になり得る。
前に記したように、もし望むならば、血漿タンパクは
光活性剤の添加前に除去することができる。この具体例
によりいくつかの利益が達成される。例えば、親水性の
光活性剤に関し、もし血液成分がそのような光活性剤か
添加された後に洗浄されたならば、光活性剤の全部また
は大部分が洗い落とされ得る。それ故、スルホン化アル
ミニウムフタロシアニンのような親水性光活性剤に関
し、洗浄ステップは光活性剤の添加前に実施すべきであ
る。
プロセスのこの具体例の追加の利益は、大スケール処
理プロセスへのこのプロセスの導入容易性と、そしてプ
ロセスのコストを減らすように少量の光活性剤が必要で
あることを含む。さらに、もし血漿タンパクが洗浄によ
って除去されるならば、光活性剤は細胞を再懸濁するた
めに使用する溶液中に存在し得る。
もし血漿タンパクが光活性剤の添加前に除去されるな
らば、その後過剰の光活性剤を吸収する化合物を液へ添
加または使用することができる。そのような化合物の例
は活性炭を含む。
この処理または除去ステップにおいて、実質上すべて
の血漿タンパクを除去しようと試みる。当初血液成分の
細胞外成分は90重量％より多く血漿を含むことがある。
最低血液成分は、約５重量％以下の血漿を含むように処
理すべきである。好ましくは、血液成分は、血液成分の
全成分が例えば赤血球の場合１重量％以下の血漿を含む
ように処理されなければならない。
体液は、細胞外成分の濃度を減らすため多数の方法で
処理することができる。その例は濾過、洗浄、洗い分
け、およびクロマトグラフィーを含む。
血球成分に関し、ここで使用する“洗浄”とは、血液
成分が遠心されるプロセスを意味する。これはペレット
と上清をもたらす。上清は次に除去され、ペレットは例
えば緩衝食塩水の添加により再懸濁することができる。
もし望むならば、血球を再懸濁するため貯蔵溶液を使用
することができる。貯蔵溶液の使用により、プロセスの
照射フェーズの後、血液成分は貯蔵することができる。
しかしながら、後で詳しく述べるように、どんなタンパ
ク含有物質の添加前にもあらかじめ定めた時間照射後に
経過しなければならない。
もし望むならば、複数の洗浄ステップを用いることが
できる。
洗浄ステップの間、血球コンパートメントから過剰の
親油性光活性剤を抽出するため洗浄剤を使用することが
できる。例えば、血球を再懸濁するため親油性リン脂質
溶液を使用することができる。そのような親油性リン脂
質溶液はトリグリセライド（LCT,MCTおよびSCT）および
脂質酸を含む。
洗浄ステップが終了した後、製品は次に適切な波長を
有する光で照射される。ステップは以下のように進める
ことができる。光増感剤ベンゾポルフィリン誘導体で処
理した赤血球の場合、赤血球サンプルは、例えば30秒な
いし６時間の適切な時間、約690nmを中心とする波長の
光へ露光される。
もし望むならば、照射ステップ後、さらに洗浄ステッ
プまたは他の除去ステップを実施することができる。
本発明によれば、照射ステップ後、血液成分はあらか
じめ規定した期間、生体内でも生体外でも、追加の血漿
および／または他のタンパク含有物質と合併されない。
光活性剤の照射は細胞成分、例えば赤血球が活性化さ
れ、そのためそれらは血漿タンパクと非特異的に結合
し、IgGで被覆されることを生じさせる。
後で述べるように、BPDで処理した細胞については、
約３時間後細胞成分例えば赤血球は血漿タンパクと実質
上結合しないことが発見された。従ってあらかじめ規定
した時間、例えば少なくとも３時間そして好ましくは18
時間後、細胞は次に患者へ注入することができ、または
血漿もしくは他のタンパク含有物質と混合することがで
きる。
限定でなく例示のため、今や本発明の実施例が与えら
れるであろう。
実施例１ この実施例は、ベンゾポリフィリン誘導体（BPD）に
よる赤血球（RBC）処理プラス赤色光活性化前の洗浄のB
PD投与量の関数としての赤血球濃縮物に対する殺ウイル
スおよび免疫学的効果を検討する。
以下の材料を使用した。
1. 直径150cmのペトリ皿： 2. AS−１ヒト赤血球濃縮物： 3. 生理的リン酸緩衝食塩水（BPS）： 4. ARC−８貯蔵培地ロットNR5203アメリカ赤十字（Vo
Sanguinis 60:88−89,1991）： 5. 150ml血液貯蔵バッグ（PL146）： 6. BPD2.02mg/mlロット:CB1−91Quadra Logic Techn
ologies ベンゾポルフィン誘導体（BPD）： 7. 小水疱性口内炎ウイルス（VSV）： 使用した操作は以下の通りであった。
1. 血液約216mlを１×106pfu/ml（AS−１ RBC中108VS
Vの2.16ml）を達成するようにVSVで傷つけ、そしてPBD
添加前かきまぜながら１時間インキュベートした。
2. 血液体積31mlを50ml遠心チューブへ分注した。BPD
を直接チューブへ加え、0,1.0,または1.5μg/mlの最終
濃度とし、混合し、洗浄前１時間血液と平衡化するのを
許容した。
3. RBCをPBSを用いて２回洗浄し、2500×ｇで10分間遠
心した。洗浄液体積は25mlであり、サンプルは良好な混
合を確実にするため洗浄ステップ間でゆるやかに渦巻き
した。最終洗浄のため、血球はPBSを用いて31mlの全体
積へ再懸濁された。
4. 血液はかきまぜながら光ボックス中のペトリ皿で１
時間露光された（照射6.5ジュール/cm2）（GE赤色ラン
プ螢光1.8mW/cm2にて）。
5. 照射後のサンプルは50ml遠心チューブへ移された。
6. チューブは2500×ｇで10分間遠心され、上清は捨て
た。BCをARC−８の１回洗浄で洗浄された。最終洗浄の
ため、サンブルはARC−Ｒを用いて全体積31mlまでにも
たらされた。
7. ウイルス殺滅の定量のためのサンプル（3ml部分標
本）を採取し、照射日にアッセイした。
8. 細胞生理評価のためのサンプル（2ml）部分標本を
照射後、1,7,14および28日に採取した。測定したパラメ
ータはヘモグロビン、ヘマトクリットおよび直接凝集反
応テスト（DAT）であった。DATテストは慣用方法（Rich
ard H.Walker編、アメリカ血液銀行協会技術マニュア
ル第10版,ISBN0−915355−75−2,145−157頁に記載され
ているような）に従って実施された。DATテスト実施
前、RBCは３時間以上インキュベートすることが許容さ
れ、そして次に37℃において１時間自家血漿中に置かれ
た。
チューブは以下の情報を使用してラベルされた。
コード： ウイルスTCID50は、各サンプルに対して対数スケール
での赤血球ml当りの組織培養感染投与量を表わす。例え
ば、３の値はml当り1000感染性ウイルスを示し、値＜２
はml当り100より少ない感染性ウイルスを意味する。
VSVアッセイのための指示薬細胞は96ウエルマイクロ
タイタープレート中に生育させたベロ細胞であった。ア
ッセイ方法は、Virology,Wolfgang K.Joklik,2nd E
d.,“The Nature,Isolation,and Measurement of A
nimal Viruses",p.10,1985に要約されている基本的ウ
イルス学技術を採用した。PL−HGBは貯蔵した血液サン
プルからの上清ヘモグロビン値を表わす。HCTは貯蔵し
たサンプルのヘマトクリットを表わす。％溶血した赤血
球の％を表わす。
DAT結果はウサギ抗ヒトIgG抗体でのRBCの凝集反応に
基いて陽性（＋）または陰性（−）である。陽性結果は
ヒトIgGで被覆されたRBCの指示である。
この実験結果は、本発明の洗浄方法（サンプルD,E）
は、BPDの低濃度を用いて時でさえも非洗浄方法（サン
プルＣ）中よりもより大きいウイルス減少をもたらすこ
とを示す。洗浄方法で処理した血球はより良好な生理学
的特性を有し、貯蔵時溶血が少なく、そして血漿でチャ
レンジされた後陰性DAT結果を持っている。
実施例２ この研究は目標は、露光時間の関数として、非洗浄方
法および洗浄方法を使用して、ベンゾポルフィリン誘導
体（BPD）によるRBC処理の殺ウイルスおよび免疫学的結
果を比較することであった。
使用した材料は実施例１と同じであった。
以下の操作を以下のサンプルＡ−Ｆを発生させるため
の使用した。
チューブは以下の情報を用いてラベルされた。
コード： 1. 血液約256mlをVSVで１×106pfu/ml（216ml AS−１
RBS中108VSV2.56ml）を得るように傷つけ、BPD添加前
かきまぜながら１時間インキュベートした。
2. 血液体積31mlを50ml遠心チューブへ加えた。BPDは
チューブへ直接添加し、1.0μg/mlの最終濃度とし、混
合し、次のステップ前に１時間血液と平衡化することを
許容した。
3. 非洗浄法（サンプルＥ）のため、血液を光ボックス
中ペトリ皿中でかきまぜながら露光（GE赤色ランプ1.8m
W/cm2にて）し、そして水平シェーカー（100rpm）でか
きまぜた。
4. ａ）洗浄法（サンプルＦ）のため、RBCをPBSで２回
洗い、そして2500×ｇで10分間遠心した。洗浄体積は25
mlであり、そしてサンプルは良好な混合を確実にするた
め洗浄ステップ間でゆるやかに渦巻きした。PBSによる
最終洗浄後、サンプルは全体積31mlへもたらされた。
ｂ）上のステップNo.3に記載したように、サンプルを
かきまぜながら光ボックス中ペトリ皿中で露光した。
5. 両方法のため、サンプル（1ml部分標本）を15,30,4
0および100分においてウイルス殺滅の定量のために採取
した。サンプルは照射日にアッセイされた。
6. 照射後のサンプルは50ml遠心チューブへ移された。
7. チューブを3000rpmで10分間遠心し、上清を捨て
た。サンプルＢおよびＦのRBCはARC−８で１回洗浄し
た。最終洗浄後、サンブルはARC−８を用いて最終体積2
7mlへもたらされた。
8. 細胞生理を評価するためのサンブル（3ml部分標
本）が照射後1,7,14および28日に採取された。測定した
パラメータはヘモグロビン、ヘマトクリットおよびDAT
状態であった。
サンプル： コード サンプル説明 Ａ VSV無BPD無洗浄無光 Ｂ VSV無BPD無洗浄無光ARC−８洗浄×１ Ｃ VSV無BPD無洗浄光 Ｄ VSV無BPD2×PBS洗浄光１×ARC−８洗浄 Ｅ VSVBPD1.0μg/ml無洗浄光無洗浄 Ｆ VSVBPD1.0μg/ml2×PPS洗浄光１×ARC洗浄 図２は、非洗浄法および洗浄法を用い、光線量の関数
としてVSVのBPD不活性化をグラフで図示する。BPD投与
量は両方のサンプルについて1.0μg/mlである。
この実験結果は、ウイルス殺滅効果は非洗浄および洗
浄方法について同じであり、そして洗浄方法について非
洗浄方法よりも大きい総体ウイルス減少を示している。
これは末結果BPDの除去は処理の殺ウイルス効果を減じ
なかったことを示す。実施例１と同様に、洗浄方法はよ
り少ない溶血および陰性のDAT赤血球をもたらした。
実施例３ 以下の実施例は、やはり血漿の制限された量の存在下
または不存在下処理した赤血球濃縮物に対するウイルス
不活性化プロセス間の相違を例証する。
赤血球濃縮物（RCC）を全血から調製し、ウイルス
（小水胞性口内炎ウイルスもしくはVSV）の特定量で実
施例１に記載したプロトコールと同様な状態で傷つけ
た。血漿制限法では、サンプルを露光前に洗浄した。こ
れら実施例は以下のパラメータを評価する。水水胞口内
炎ウイルス（VSV）（VSVはこれら研究においてモデルウ
イルスとして使用される）不活性化／減少およびDAT結
果。
BPD研究： 以下の二つの操作を使用したウイルス不活性化研究か
らの結果の比較： ａ）血漿非制限法 ｂ）血漿制限法 表３および４に示す結果については以下の操作に従っ
た。
表３について、パック赤血球21mlをPBS中３回洗浄し
（総体積50ml）、次にARC−８（赤血球貯蔵液）中１回
（総体積50ml）洗浄した。洗ったRCから以下のように部
分標本を調製した。＞106pfu VSV/mlをRCへ加えた。２
％,3％または５％血漿をARC−８中のRC（４サンプル
群）へ加えた。
各サンプル群の部分標本をBPD（0,0.25,0.5または0.7
5μg/ml）で１時間処理し、次に赤色光（実施例１に記
載のものに類似の光ボックス）へ１時間露光した。サン
プルをVSV不活性化についてアッセイ（プラックアッセ
イ）し、そしてDAT状態を処理後そして血漿挑戦後目視
により決定した。血漿挑戦は処理したRCCの４℃におけ
る約18時間（一夜）貯蔵と、次に37℃において１時間10
0％血漿の添加を含んでいた。
赤血球の最初の洗浄は、指示した量の血漿の添加が規
定した濃度になることを確実にするために実施されたこ
とに注意すべきである。
以下の表４に示す結果は表３に用いたのと類似の態様
で実施した研究についてのものである。
表３および表４は、DAT陽性をなくすためには、ウイ
ルス不活性化操作を制限量（約５％以下）の血漿の存在
下実施することが必要であることを示している。
これらのデータおよび実施例４に述べたデータは、本
発明者らは、処理した血液成分が露光後規定した期間血
漿へ露出されない限り、血漿制限法によって処理された
赤血球の陽性DATスコア（赤血球表面へ結合するIgGの有
義レベル）を防止することが可能であることを示したこ
とにおいて、前に引用したWagnerらの発表を反駁する。
BPDの場合、この期間は３時間（最低）および好ましく
は18時間であることが示された。
他の光増感剤： RCCの処理は、種々の光増感剤および光による処理の
後、RCのDAT状態を評価するため血漿制限法および血漿
無制限法を使用して実施された。フォトフリルおよびメ
ロシアニン540を使用する研究では白色光が使用され、
アルミニウムフタロシアニンについては赤色光が使用さ
れた。検討した各光増感剤の投与量は以下の表に示され
ている。
実施例４ 以下の実験は、フロー血球計算法を用い、BPDおよび
光の用いる血漿制限法によって処理した赤血球が露光後
３時間挑戦（血漿添加により）されてもIgG結合に対し
て有意な親和性を持たないことを示す。
処理プロトコールは以下のとおりである。
赤血球濃縮物（Adsol中約14％血漿を有するRCC）全血
から調製した。
RCC20mlを2000rpmで10分遠心した。
上清（血漿/Adsol）を除去した。
得られたペレット（RC）をAdsolで50mlに再懸濁し、
次に2000rpmで10分遠心した。
上清を捨て、RCをAdsolで20mlに再懸濁した。
BPDを0,0.5,0.75,1.0μgBPD/mlになるようにサンプル
へ加えた。
サンプルを１時間暗所でインキュベートし、赤色光
（光ボックス）へ１時間露光した。
サンプルへAdsol中14％血漿を与えるように自家血漿
を加えた。サンプルを４℃で一夜貯蔵した。
フロー血球計算法を実施した。
フロー血球計算法のための赤血球の調製は以下のとお
りである。
1. PBS中RCCを1/10に希釈せよ。
2. 希釈したRCC50μを12×75mlスナップキャップつ
きチャーブへ加えよ。
3. PBS約3mlを加えよ。
4. 約3000rpmで２分間遠心せよ。
5. 上清を吸引せよ。
6. チューブをゆるやかにはじいて残りのPBS中で血球
を混合せよ。
7. PBS約3mlを添加せよ（２回目の洗浄）。
8. 前と同様に遠心せよ。
9. 上清を吸引せよ。
10. チューブをゆるやかにはじいてPBSの残りの液滴中
で血球を混合せよ。
11. １′Ab1/100の400μを加えよ。
12. チューブを時々振とうし４℃で30−40分インキュ
ベートせよ。
13. PBSを加え、前と同様に２回洗浄せよ。
14. ２′Ab400μを加えよ。
15. チューブを時々振とうして暗所で30−40分インキ
ュベートせよ。
16. 血球を前と同様にPBSで２回洗浄せよ。
17. 血球ペレットをBBS中１％パラホルムアルデヒド60
0μ中に再懸濁せよ。
18. フロー血球計算法を使用する分析までサンプルを
暗所に４℃で貯蔵せよ。サンプルは３日まで貯蔵するこ
とができる。
以下の試薬が使用された。
１′Ab:ウサギ抗ヒトIgG（Cedarlaneへ注文したSerote
c,カタログ＃STAR33） ２′Ab:ヤギＦ（ab）抗ウサギIgG（全分子）FITC Capp
lへ注文，カタログ＃55658 PBS中１％（w/v）パラホルムアルデヒド:70℃まで加熱
して溶解、煮沸してはならない。冷後pHを7.4へ調節せ
よ。４℃で暗所に貯蔵せよ。貯蔵期間６ケ月。
以下の表は、それらの表面上にIgGの存在を決定する
ため、抗血清で標識した処理したRCのフロー血球計算法
分析からの結果を示す。
区域１に含まれる血球はIgG結合に対し陰性と考えら
れる。区域２に含まれる血球は陽性と考えられる。図3a
−3cは代表的グラフを示す。
図において、赤血球濃縮物（RCC）＝14％血漿,55％HC
T,1回洗浄した赤血球濃縮物（１×RCC），および洗浄な
し上清除去＝洗浄なしRCC。
実施例５ 実施例４と類似の態様で実施した他の実験において、
Adsol中１回洗浄し、そしてAdsol中に再懸濁したRCCを
処理するため、1.0μg/mlBPDが使用された。露光後、３
時間の待機期間後14％自家血漿が添加された。
RCは次に以下の方法で処理された。４℃で１夜放置，
（１）を見よ。；または37℃へ１時間加熱後４℃で一夜
放置，（２）を見よ；または14％血漿中室温でさらに１
時間放置後37℃で１時間加熱し、４℃で一夜貯蔵，
（３）を見よ。その後すべてのサンプルについてフロー
血球計算法を実施した。
これらの結果は、もし血漿による挑戦前に３時間待機
するならば、生体内状況をシミュレートする37℃におい
て血球が挑戦される時でさえも、IgGのRCへの結合につ
いて対照から有意差はない（すなわちそれらはIgG結合
に対して陰性である）ことを示す。
ここに記載した現在好ましい具体例に対する種々の変
更および修飾が当業者には自明であることを理解すべき
である。そのような変更および修飾は本発明の精神およ
び範囲を逸脱することなく、そしてその利益を減ずるこ
となく可能である。それ故そのような変更および修飾は
請求の範囲によってカバーされることが意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャップマン，ジョン アメリカ合衆国60046イリノイ、レーク ビラ、ケビンアベニュー67 (72)発明者 ローガン，パトリシア エム カナダ国ブイ５ブイ ２ティー６、ブリ ティッシュコロンビア、バンクーバー、 オーブリプレース462 (72)発明者 ネブンドルフ，ヘルマ シー カナダ国ブイ６エイチ １ジェイ５、ブ リティッシュコロンビア、バンクーバ ー、ウエストテンスアベニュー1265 (72)発明者 ノース，ジャニス カナダ国ブイ６アール ２エイチ６、ブ リティッシュコロンビア、バンクーバ ー、ウエストテンスアベニュー4335 (56)参考文献 特開 平４−226919（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−500531（ＪＰ，Ａ) Ｐｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎ ａｌ，Ｖｏｌｕｍｅ226ｉｓｓｕｅｄ ｐ757−766 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A01N 1/02

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞および細胞外タンパクを含んでいる体
    液中の病原を不活性化する方法であって、 該体液を細胞外タンパクを少なくとも実質的に減らすよ
    うに処理し、 細胞を含んでいる得られた体液を光活性剤の存在下病原
    を不活性化するため適切な波長の光で照射し、そして 照射した細胞を含んでいる体液をあらかじめ定めた期間
    追加の細胞外タンパクとの接触を防止する ステップを含むことを特徴とする体液中の病原を不活性
    化する方法。
  2. 【請求項２】細胞外タンパクは光活性剤を添加する前に
    減らされる請求項１の方法。
  3. 【請求項３】細胞外タンパクは光活性剤添加後に減らさ
    れる請求項１の方法。
  4. 【請求項４】細胞外タンパクを減らすステップは、細胞
    外タンパクを５重量％以下へ減らす請求項１の方法。
  5. 【請求項５】あらかじめ定めた時間は少なくとも３時間
    である請求項１の方法。
  6. 【請求項６】細胞および細胞外タンパクを含んでいる体
    液中の病原を不活性化する方法であって、 採取した該体液へ光活性剤を添加し、 該体液を未結合光活性剤および細胞外タンパクを少なく
    とも実質的に減らすように処理し、そして 細胞を含んでいる得られた体液を病原を不活性するため
    適切な波長の光で照射する ステップを含むことを特徴とする体液中の病原を不活性
    する方法。
  7. 【請求項７】未結合光活性剤および細胞外タンパクを減
    らすステップの前に、光活性剤が体液と平衡化すること
    を許容するステップを含んでいる請求項６の方法。
  8. 【請求項８】未結合光活性剤および細胞外タンパクを減
    らすステップは、細胞外タンパクを５重量％以下へ減ら
    す請求項６の方法。
  9. 【請求項９】照射した細胞を含んでいる体液をあらかじ
    め定めた期間追加の細胞外タンパクとの接触を防止する
    ステップを含んでいる請求項６ないし８のいずれかの方
    法。
  10. 【請求項１０】体液は、血液、生体外細胞培養物、また
    は骨髄である請求項１ないし９のいずれかの方法。
  11. 【請求項１１】細胞は赤血球または血小板であり、細胞
    外タンパクは血漿タンパクである請求項１ないし９のい
    ずれかの方法。
  12. 【請求項１２】光活性剤は、ポルフィリン、ポルフィリ
    ン誘導体、メロシアニン、アルミニウムフタロシアニン
    を含むフタロシアニン類、ピロールマクロ環類、プソラ
    レン類、光活性染料、およびメチレンブルーよりなる群
    から選ばれる請求項１ないし11のいずれかの方法。
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