JP2827298B2 - 細胞培養担体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、細胞培養担体に関するものであり、特に動
物細胞を培養する際に使用される担体に関するものであ
る。詳しくは、動物細胞を本培養担体に付着させ、静置
状態、懸濁状態等で高密度培養するのに好適な細胞培養
担体に関するものである。

（従来の技術） 近年、動物細胞を培養するために種々の培養方法が開
発され、急速に発展しているが、その一つに培養担体を
用いるマイクロキャリア法がある。

現在、知られているマイクロキャリアの多くは、正に
荷電し得る化学的残基のみを導入したアニオン交換型の
マイクロキャリアであり、例えば、サイトデックス−１
（ファルマシア社製）、スーパービーズ（Flow Labs社
製）、ドーマセル（Pfeifer＆Langen社製）、DE−52、D
E−53（ワットマン社製）、MC−シリーズ（Waitaki社
製）等のマイクロキャリアは、セファデックス、セルロ
ース等のポリマー担体にジエチルアミノエチル基を化学
結合させたものである。

また特開昭63−71173号、特開昭63−226282号、特開
昭64−10979号において、（メタ）アクリル酸エステル
を構成単位とする水不溶性の重合体粒子に正に荷電し得
る化学的残基を導入して成るマイクロキャリアが記載さ
れている。その他、ポリアクリルアミドゲルにジメチル
アミノプロピル基を化学結合させたバイオキャリア（バ
イオラド社製）も知られている。一方、逆に、ポリスチ
レン表面に放電処理を施し、負電荷を導入したバイオシ
ロン（ヌンク社製）やサイトスフェア（Lux社製）等も
知られている。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、従来の培養担体は、細胞の付着性や増
殖性が充分なものではなく、長期間の培養によっても細
胞が剥離しやすいという欠点を有していた。従って、細
胞の付着性や増殖性が良好で、長期培養においても剥離
しにくく、しかも容易に高密度培養が達成できる培養担
体が求められていた。

本発明の目的は、動物細胞とりわけ付着依存性動物細
胞を高密度かつ大量に培養できる細胞培養担体を提供し
ようとするものである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記の問題に鑑み鋭意検討を行った結
果、細胞剥離の原因は、担体が正電荷のみ又は負電荷の
みを有することにあり、正に荷電し得る化学的残基と、
更に、負に荷電し得る化学的残基とを担体表面に併用す
ることにより細胞の付着性及び増殖性が向上するばかり
ではなく、特に長期培養においても細胞が剥離しにくい
ことを見い出し、本発明に達した。

即ち、本発明の要旨は、支持体自身が重合性モノマー
を構成単位とする水不溶性高分子から成るか、もしくは
支持体表面が該水不溶性高分子によって被覆されて成
り、かつ該高分子は、正に荷電し得る化学的残基及び負
に荷電し得る化学的残基を有して成ることを特徴とする
細胞培養担体に存する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の細胞培養担体の製造に用いられる重合性モノ
マーとしては、重合して得られるポリマーが蛋白質等に
対して非特異的な吸着が少なく、動物細胞によって産生
される目的物のワクチン蛋白質を効率的に回収でき、か
つ、ポリマーの疎水性環境により細胞の伸展・増殖性が
抑えられることを防ぐ親水性ビニルモノマー（即ち、CL
OGP値が低いモノマー:CLOGP値は、溶質の水−１−オク
タノール系におけるモノマーの分配係数の対数値を珪酸
により求めた値であり、その意義については後述す
る。）が好適である。代表的には、（メタ）アクリル酸
エステルまたは（メタ）アクリルアミドが挙げられる。
具体的には、ジエチレングリコール（メタ）アクリレー
ト、トリエチレングリコール（メタ）アクリレート、テ
トラエチレングリコール（メタ）アクリレート、オクタ
エチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレ
ングリコール（メタ）アクリレート、グリセロール（メ
タ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、
（メタ）アクリルアミド、メチル（メタ）アクリルアミ
ド及び表−１、表−２に記載したモノマー等が挙げられ
る。

荷電し得る化学的残基をもたないモノマーは、ポリマ
ーを親水性にするため、オキシエチレン類〔（−CH₂−C
H₂−Ｏ）_ｎ〕においてｎが２以上であることが好まし
い。

ここで重合して得られるポリマーが水不溶性であれば
架橋剤成分は必要ではないが、該ポリマー及び支持体か
らの可溶成分の溶出、又は被覆した場合の該ポリマーの
支持体からの剥離を考慮し、架橋剤成分を添加すること
が好ましい。

架橋剤成分としては、前述のモノマー成分と共重合性
を有し、できる限り親水性の高い（CLOGP値の低い）多
官能性のビニルモノマーが好適である。例えば、ジエチ
レングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレン
グリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレング
リコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコ
ールジ（メタ）アクリレート、グリセロールジ（メタ）
アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）ア
クリレート、エチレンビス（メタ）アクリルアミド、ト
リエチレンビス（メタ）アクリルアミド等が挙げられ
る。架橋剤成分は、支持体の構成成分の漏出を最小限に
抑えるために、使用することが好ましいが、架橋剤成分
の含有率が高すぎる場合には、血清中の蛋白質及び細胞
によって分泌された生理活性蛋白質を吸着し、効率的に
それらを回収できないという問題が生じる場合がある。
従って、架橋剤成分の含有率は、0.1〜50重量％、特に
好ましくは１〜20重量％であることが好ましい。

本発明において上記モノマーに対して、希釈剤を添加
することが好ましい。これにより支持体内部にまで含浸
でき、均一に被覆することができる。しかも得られる水
不溶性高分子に適度の可とう性をもたせることもでき
る。

本発明においては、培養液中における正に荷電し得る
化学的残基の含有量が水不溶性高分子1g当り0.5〜3.0ミ
リ当量であり、かつ、負に荷電し得る化学的残基の量
が、水不溶性高分子1g当り0.01〜2.0ミリ当量であると
き、一層好ましい結果をもたらす。

正に荷電し得る化学的残基の量が、上記範囲以下の場
合には付着性が劣り、上記範囲以上の場合には電荷阻害
が観察される。また、負に荷電し得る化学的残基の量
が、上記範囲以下の場合には付着性が劣り、上記範囲以
下の場合には付着性増殖性ともに劣る。

細胞の付着性、増殖性に影響を与えるのは、化学的残
基の量ばかりではなく、ポリマー中の正に荷電し得る化
学的残基に相当するモノマー単位のCLOGP値も重要であ
る。支持体表面に細胞が付着し増殖するためには、ポリ
マー中の正に荷電し得る相当するモノマー単位のCLOGP
値が、−1.5〜＋2.0の範囲にあることが好ましい。本発
明におけるCLOGPシステムは、ポモナ大学（カリフォル
ニア州）〔T.Nishioka（京都大学）によってFACOM3.33
版に編集されたプログラム〕によって開発されたもの
で、以下のように定義される。CLOGP値は、溶質の水−
１−オクタノール系における分配係数の対数値を計算に
より求めた値である。これにより電荷的に中性な分子の
疎水性を定量的に表現することができるようになった。
本発明における正に荷電し得るモノマー単位のCLOGP値
も、この方法により求めたものである。正に荷電し得る
化学的残基は、培養液中において、その一部は、解離状
態にあると考えられるが、W.S.Hu〔バイオテクノロジー
アンドバイオエンジニアリング29巻、1155−1163（198
7）〕らは、pH7.20における増殖速度に及ぼす正味の荷
電量の影響は少ない、又は全く規則性がないことを報告
している。従って、ポリマー中の正に荷電し得る相当す
るモノマー単位の疎水性度は、中性分子のCLOGP値を考
慮すれば良いことになる。相当するモノマー単位のCLOG
P値が小さ過ぎると培養担体に対する細胞の付着性は悪
くなり、逆に、CLOGP値が、大き過ぎる場合も細胞の付
着性や増殖性は悪くなる。しかも、細胞によって分泌さ
れた生理活性蛋白質が、培養担体に吸着されてしまう。
更に、該モノマー単位のCLOGP値とその含有率との間に
は、規則性が観察された。即ち、培養担体上で細胞を付
着増殖させるためには、CLOGP値が低い場合には含有率
を高くし、CLOGP値が高い場合には、含有率を低くする
ことが好ましい事も判明した。正に荷電し得る化学的残
基をもつモノマー単位で、かつ、そのCLOGP値が−1.5〜
＋2.0の範囲にあるものとしては、表−１及び表−２に
示したものを挙げることができる。一方、支持体表面の
水不溶性高分子に負電荷を導入する方法として、重合体
モノマー中に負に荷電し得る化学的残基を有するモノマ
ーを用いる場合と、重合後化学結合により導入する方法
の二通りがある。負に荷電し得る化学的残基をもつモノ
マー単位で、かつ、そのCLOGP値が−1.5〜＋2.1の範囲
にあるものの具体的な例として、メタクリル酸、β−メ
タクリロイルオキシエチルハイドロジェンサクシネー
ト、β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジェンフ
タレート、メタクリロキシエチルホスフェート、スルホ
プロピルメタクリレート等が挙げられ、表−３に示し
た。

勿論、表−１、表−２及び表−３に示していない重合
性モノマーでも、本発明の特許請求の範囲を越えない限
り、使用することができる。尚、表中において、Meはメ
チル基を、Etはエチル基を示す。

本発明における細胞培養担体の構造支持体として好適
に使用できるものとしては、例えば以下のような物が挙
げられる。シャーレ類、Ｔ−フラスコ、マルチトレイ
類、ローラー・ボトル類、紙（セルロース製濾紙、その
他）、布、発泡性ポリマー（ウレタン系、エーテル系、
エステル系）、多孔性セラミックス（シリカ系、アルミ
ナ系）、金属担体、金属箔、ガラスビーズ、発泡ガラ
ス、シート類、木材類、繊維類等が挙げられる。これら
の支持体の形状や大きさは、培養方法や培養規模によっ
て大きく異なる。支持体に付着した細胞を観察するため
には、光学的に透明な素材であることが好ましいが、こ
れは培養のための必須条件ではない。

これらの担体の形状としては、団塊状、球状、フィル
ム状及びフィルムのロール状、多孔性膜状、棒状等が挙
げられる。球状体としては、マイクロキャリアとして特
開昭63−71173号、特開昭63−226282号及び特開昭64−1
0979号に記載された方法により製造することができる。
また、フィルム状の担体は、特開昭64−47372号に記載
された方法により製造することができる。団塊状の担体
はモノマーのバルク重合後、適切な方法により裁断する
ことにより得ることもできる。

一方、支持体の表面を水不溶性高分子で被覆する方法
は、例えば以下の手順に従って行うことができる。モノ
マー、架橋剤、希釈剤を混合してなるモノマー溶液に重
合開始剤を添加する。この溶液を支持体に含浸又は被覆
し、過剰のモノマー溶液は、圧縮し絞り出し又は、窒素
を流し除去する。次いで、窒素雰囲気下でモノマーを重
合する。ここで、セラミックスや発泡性ポリウレタン等
の固定床用担体を製造する場合には、均一に被覆するた
め、担体はできる限り10cm以下に裁断することが好まし
い。培養器に合わせた固定床用担体を製造する場合に
は、裁断し上記の操作を行った後に、遠心分離機で過剰
のモノマー溶液を除去する。培養担体が小さい場合に
は、カラム内に充填した後、含浸及び被覆することも可
能である。上記の製造工程において注意する点として
は、過剰のモノマー溶液を除去する際、担体内部に液溜
りが生じないいようにしなければならないことである。

モノマー成分に添加される希釈剤としては、モノマー
を溶解し、モノマー成分の官能基即ち、メタクリロイル
基、水酸基、グリシジル基、アミド基、アミノ基、カル
ボキシル基等及び支持体に不活性であればよい。それに
好適な希釈剤は、使用されるモノマー種によって異なる
が、通常、ベンゼン、トルエン、シクロヘキサン、酢酸
エチル、酢酸ブチル、エタノール、プロパノール、ブタ
ノール、１−ヘキサノール、シクロヘキサノール、オク
タノール、ヘプタノール、エチレングリコール、アセト
ン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、ジブ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、1,4−ジオキサ
ン、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、アセトニト
リル及び上記の水溶性有機溶媒と水との混合溶媒等が挙
げられる。

上記希釈剤として、モノマーに対し良溶媒を添加した
場合には、被覆した水不溶性高分子は光学的に透明な高
分子となる。

全モノマーに対する希釈剤の添加量は、０〜10倍量で
ある。希釈剤を過剰に添加した場合には、高分子膜が脆
弱になるばかりではなく、重合収率が低下する等の問題
が生じる。

使用される重合開始剤としては、以下のものをあげる
ことができる。即ち、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロ
イル、過酸化アセチル等の過酸化系重合開始剤、2,2′
−アゾビス−２−シクロプロピルプロピオニトリル等の
アゾ系重合開始剤、過酸化水素水−Fe²⁺塩等のレドック
ス系重合開始剤等により重合開始させることができる。

ここで重合開始剤の選択は、モノマー、架橋剤、希釈
剤等によって、大きく異なる。モノマー溶液が水溶性で
ある場合には、レドックス系重合開始剤、水溶性アゾ系
重合開始剤及び過酸化アンモニウム、過酸化カリウム−
N,N,N′,N′−テトラアゾエチレンジアミン等が好まし
く用いられる。

重合温度は、一般にレドックス系重合開始剤及び過酸
化物系重合開始剤は30℃〜100℃で行ことが好ましい。

また、重合性モノマー内に負に荷電し得る化学的残基
が存在する場合、得られた重合体は、それ自身、負に荷
電し得る化学的残基になり得、重合性モノマー内に、正
に荷電しうる化学的残基が存在する場合は、得られた重
合体はそのまま正に荷電しうる化学的残基になり得る。
しかし、重合体が前述の正又は負の官能基量を満足しな
い場合には、更に化学反応によって正に荷電しうる官能
基を化学結合によって導入しなければならない。重合体
がグリシジル基を含有する場合は、アミンとの反応によ
り導入することができ、水酸基、2,3−ジヒドロキシプ
ロピル基等の場合には、臭化シアンとの反応によりイミ
ドカルボネートを得た後、ジアミンとの反応により、導
入することができる。負に荷電しうる化学的残基を化学
結合によって導入する場合には、末端の水酸基を用いて
ハロゲン化酢酸と塩基性溶液中で反応させることにより
カルボキシル基を導入することができる。これらの結合
の方法に関しては、モスバック（メソッズ・イン・エン
ザイモロジー、134巻、135巻、136巻）によって詳細に
記述されている。担体に導入された正及び負に荷電しう
る量は、支持体によっては、推定することが難しい場合
が多い。その場合、別にガラスシャーレ上でモノマーを
重合した後得られたポリマーを回収し、電荷量を滴定に
よって推定することはできる。尚、実施例に示した被覆
させて得られる培養担体の電荷量は、上記の方法によっ
て求めた値である。

本発明の細胞培養担体を用いて培養する方法として
は、培養規模、培養の目的等によって異なるが、例えば
以下の方法が挙げられる。シャーレ、Ｔ−フラスコを用
いた場合には懸濁培養法が、固定床を用いた場合には固
定床培養法がその他エアーリフトを用いた場合には還流
培養法等が挙げられる。

培養方法により培養担体の投入量は異なり、一般に培
養液に対して５％〜100％の範囲であることが好まし
い。

（実施例） 以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発
明は、その要旨を越えない限り以下の実施例により限定
されるものではない。

（実施例−１） 球状の細胞培養担体（マイクロキャリア）を、以下に
述べる方法により製造した。

300mlの四ツ口フラスコに温度計、冷却管、窒素導入
管、撹拌羽根を取り付け、この中へ塩化カリウム・二水
塩30g、３％ポリビニルアルコール水溶液50ml、イオン
交換水85mlを入れ撹拌した。この中へ１−ヘキサノール
60g、シクロヘキサノール30g、ポリエチレングリコール
メタクリレート（商品名:PE−350、日本油脂社製）12.4
g、グリシジルメタクリレート6.0g、メタクリル酸0.8
g、ポリエチレングリコールメタクリレート（商品名:4G
新中村化学社製）0.8g、重合開始剤として2,2′−アゾ
ビス−（2,4−ジメチルバレロニトリル）（商品名:V−6
5和光純薬社製）0.02gを溶解した有機溶媒をフラスコ内
へ加えた。徐々に昇温し、65℃で５時間、窒素雰囲気下
で重合反応を行った。反応終了後、該ポリマーをブッフ
ナー漏斗上にあけ、50％メタノール水溶液で洗浄した。
ポリマーを再度フラスコ内へ戻した。この操作を繰り返
し、１−ヘキサノール及びシクロヘキサノール臭がしな
くなるまで、４回洗浄した。得られたポリマーは無色透
明球状体であった。重合収率は87％であった。このポリ
マーを標準篩を用い、120μｍ〜130μｍに粒径を揃え
た。

該ポリマーを用いて更に以下の反応を行った。30ml
（水中）のポリマーを1,4−ジオキサンで充分に洗浄し
置換した。これを300mlのフラスコ内に入れ、更にジオ
キサンを30ml追加した。この中へエタノールアミン5.0g
のジオキサン溶液15mlを滴下し、70℃で４時間アミノ化
反応を行った。反応終了後、ポリマーを充分に洗浄し
た。

元素分析及び酸塩基滴定より、アミンの官能基量は1.
46ミリ当量/g、カルボン酸の官能基量は0.26ミリ当量/g
であった。リン酸緩衝溶液（以下PBSと略す）中におけ
る該ポリマーの膨潤度は17.9ml/g、平均粒径は184μ
ｍ、比重は1.03g/mlであった。相当する正に荷電するモ
ノマー単位は、メタクリル酸ヒドロキシエチルアミノ−
２−ヒドロキシエチルでありそのCLOGP値は−0.669であ
り、相当する負に荷電するモノマー単位は、メタクリル
酸でありそのCLOGP値は0.470である。

（実施例−２） 球状の細胞培養担体（マイクロキャリア）を、以下に
述べる方法により製造した。

300mlの四ツ口フラスコに温度計、冷却管、窒素導入
管、撹拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシウム・二
水塩30g、３％ポリビニルアルコール水溶液50ml、イオ
ン交換水85mlを入れ撹拌した。この中へ１−ヘキサノー
ル30g、シクロヘキサノール30g、１−オクタノール30
g、ポリエチレングリコールメタクリレート（商品名:PE
−200、日本油脂社製）12.7g、グリシジルメタクリレー
ト5.4g、β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジェ
ンサクシネート（商品名:SA、新中村化学社製）1.1g、
グリセロールジメタクリレート（商品名:NKエステル70
1、新中村化学社製）0.8g、重合開始剤として2,2′−ア
ゾビス−（2,4−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−65:前
述）0.02gを溶解した有機溶媒をフラスコ内へ加えた。
徐々に昇温し、65℃で５時間窒素雰囲気下で重合反応を
行った。重合終了後の後処理は、実施例−１と同様に行
った。アミノ化は、エタノールアミンの代わりに３−ア
ミノ−１−プロパノールを用いた以外は、実施例−１と
同様に行った。

元素分析及び酸塩基滴定より、アミンの官能基量は1.
37ミリ当量/g、カルボン酸の官能基量は0.22ミリ当量/g
であった。PBS溶液中における該ポリマーの膨潤度は18.
8ml/g、平均粒径は192μｍ、比重は1.03g/mlであった。
相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル酸ヒ
ドロキシプロピルアミノ−２−ヒドロキシプロピルであ
りそのCLOGP値は−1.125であり、相当する負に荷電する
モノマー単位は、β−メタクリロイルオキシエチルハイ
ドロジェンサクシネートでありそのCLOGP値は0.866であ
る。

（実施例−３） 球状の細胞培養担体（マイクロキャリア）を、以下に
述べる方法により製造した。

300mlの四ツ口フラスコに温度計、冷却管、窒素導入
管、撹拌羽根を取り付け、この中へ塩化カルシウム・二
水塩30g、３％ポリビニルアルコール水溶液50ml、イオ
ン交換水85mlを入れ撹拌した。この中へ１−ヘキサノー
ル30g、シクロヘキサノール60g、ポリエチレングリコー
ルメタクリレート（PE−350:前述）12.7g、ジメチルア
ミノエチルメタクリレート4.4g、β−メタクリロイルオ
キシエチルハイドロジェンサクシネート（SA:前述）1.1
g、ポリエチレングリコールジメタクリレート（商品名:
NKエステル9G、新中村化学社製）0.8g、重合開始剤とし
し2,2′−アゾビス−（2,4−ジメチルバレロニトリル）
（Ｖ−65:前述）0.02gを溶解した有機溶媒をフラスコ内
へ加えた。徐々に昇温し、65℃で５時間窒素雰囲気下で
重合反応を行った。重合終了後の後処理は、実施例−１
と同様に行った。実施例−３においては、アミノ化は行
わなかった。元素分析及び酸塩基滴定より、アミンの官
能基量は1.23ミリ当量/g、カルボン酸の官能基量は0.25
ミリ当量/gであった。PBS溶液中におけるポリマーの膨
潤度は17.3ml/g、平均粒径は181μｍ、比重は1.03g/ml
であった。相当する正に荷電するモノマー単位は、ジメ
チルアミノエチルメタクリレートでありそのCLOGP値は
0.290であり、相当する負に荷電するモノマー単位は、
β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジェンフタレ
ートでありそのCLOGP値は2.1である。

（実施例−４） フィルム状の細胞培養担体を、以下に述べる方法によ
り製造した。

エチレングリコール30g、ポリエチレングリコールメ
タクリレート（PE−350:前述）12.4g、グリシジルメタ
クリレート5.4g、メタクリル酸0.85g、ポリエチレング
リコールジメタクリレート（4G:前述）0.8g、重合開始
剤として塩化メチレン0.5mlに溶解した2,2′−アゾビス
−（４−メトキシ−2,4−バレロニトリル）（商品名:V
−70、和光純薬社製）0.02gモノマー溶液を調製した。
この溶液に窒素ガスを導入し、溶存酸素を除去した。0.
5μｍのポリエステルフィルムのスペーサーを鋏んだ二
枚のガラス板より成るセル中に、上記モノマー溶液を流
し込んだ。このガラス版を60℃の水浴中に10分間漬け、
窒素雰囲気下で重合反応を行った。重合終了後、フィル
ムゲルを取り出し、50％メタノール水溶液で招浄した。
該フィルムゲルは無色透明であった。

この表面積3,600cm²のフィルムゲルをジオキサンで充
分に洗浄しジオキサンで置換した。これを100mlのフラ
スコ内に入れ、更にジオキサンを30ml追加した。この中
へ２−アミノエタンチオール1.0gのジオキサン溶液5ml
を滴下し、70℃で４時間アミノ化反応を行った。反応終
了後、ポリマーを充分に洗浄した。元素分析及び酸塩基
滴定より、アミンの官能基量は1.53ミリ当量/g、カルボ
ン酸の官能基量は0.29ミリ当量/gであった。比重は1.03
g/mlであった。模厚は約1.0μｍであった。

相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル酸
メルカプトエチルアミノ−２−ヒドロキシプロピルであ
りそのCLOGP値は0.375であり、相当する負に荷電するモ
ノマー単位は、メタクリル酸でありそのCLOGP値は0.470
である。

（実施例−５） フィルム状の細胞培養担体を、以下に述べる方法によ
り製造した。1,4−ジオキサン26g、グリセロールメタク
リレート（商品名：ブレンマーGLM、日本油脂社製）9.7
g、アクリルアミド3.4g、ジエチルアミノエチルメタク
リレート4.1g、β−メタクリロイルオキシエチルハイド
ロジェンサクシネート（SA:前述）0.9g、グリセロール
ジメタクリレート（701:前述）0.8g、重合開始剤として
塩化メチレン0.5mlの2,2′−アゾビス−（４−メトキシ
−2,4−バレロニトリル）（Ｖ−70:前述）0.02gから成
るモノマー溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを導入
し、溶存酸素を除去した。0.5μｍのポリエステルフィ
ルムのスペーサーを鋏んだガラス板より成るセル中に、
上記モノマー溶液を流し込んだ。このガラス版を60℃の
水浴中に10分間漬け、窒素雰囲気下で重合を行った。重
合終了後、フィルムゲルを取り出し、50％メタノール水
溶液で洗浄した。得られた該フィルムゲルは無色透明で
あった。

元素分析及び酸塩基滴定より、アミンの官能基量は1.
53ミリ当量/g、カルボン酸の官能基量は0.29ミリ当量/g
であった。比重は1.03g/mlであった。膜厚は約1.0μｍ
であった。相当する正に荷電するモノマー単位は、ジエ
チルアミノエチルメタクリレートでありそのCLOGP値は
1.981であり、相当する負に荷電するモノマー単位は、
β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジェンサクシ
ネートでありそのCLOGP値は0.866である。

（実施例−６） 発泡性ポリウレタンを支持体とする細胞培養担体を、
以下に述べる方法により製造した。

エチレングリコール30g、ポリエチレングリコールメ
タクリレート（PE−350:前述）12.4g、グリシジルメタ
クリレート5.4g、β−メタクリロイルオキシエチルハイ
ドロジェンサクシネート1.05g、ポリエチレングリコー
ルジメタクリレート（4G:前述）0.8g、重合開始剤とし
て塩化メチレン0.5mlに2,2′−アゾビス−（４−メトキ
シ−2,4−バレロニトリル）（Ｖ−70:前述）0.02gを溶
解したモノマー溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを
導入し、溶存酸素を除去した。発泡性ポリウレタン（平
均細孔径80μｍ、半連続性発泡体、MD化成社製）（10cm
×10cm×7cm）に上記調製したモノマー溶液を含浸し、
過剰のモノマー溶液を圧縮し絞り出した。該ポリウレタ
ン片をガラス容器内に入れ、窒素雰囲気下60℃に加温
し、２時間窒素雰囲気下で重合反応を行った。重合反応
終了後残留モノマー及びジオキサンを除去するため、50
℃に加温したアセトン溶液で洗浄し、最後に蒸留水で洗
浄した。

更に、該ポリウレタン片をジオキサンで置換した後、
この中へエタノールアミン溶液1.5gのジオキサン溶液5m
lを滴下し、75℃で４時間アミノ化を行った。反応終了
後、ポリウレタン片を50％メタノール水溶液で充分洗浄
した後、蒸留水で洗浄した。被覆されたポリマーの量
は、8.7％であった。

推定される正に荷電し得る官能基量は約1.45ミリ当量
/gであり、負に荷電し得る官能基量は約0.19ミリ当量/g
である。表面積は90cm²/ml、空隙率は、約87％であっ
た。相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル
酸ヒドロキシエチルアミノ−２−ヒドロキシプロピルで
ありそのCLOGP値は−1.125であり、相当する負に荷電す
るモノマー単位は、β−メタクリロイルオキシエチルハ
イドロジェンサクシネートでありそのCLOGP値は0.866で
ある。

（実施例−７） 多孔性セラミックスを支持体とする細胞培養担体を、
以下に述べる方法により製造した。１−ヘキサノール22
g、ポリエチレングリコールメタクリレート（商品名:PE
−90、日本油脂社製）7.0g、グリシジルメタクリレート
5.4g、β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジェン
サクシネート1.05g、グリセロールジメタクリレート（N
Kエステル701:前述）0.8g、重合開始剤として2,2′−ア
ゾビス−（2,4−ジメトキシバレロニトリル）（Ｖ−65:
前述）0.02gから成るモノマー溶液を調製した。この溶
液に窒素ガスを導入し、溶存酸素を除去した。多孔性セ
ラミックス（ブリジストン社製セラミックスフォーム＃
40平均細孔径3000μｍ）10mlに上記調製したモノマー溶
液を含浸し、過剰のモノマー溶液を窒素ガスを吹き付け
除去した。該セラミックスフォーム片をガラス容器内に
入れ、窒素雰囲気下60℃に加温し、２時間窒素雰囲気下
で重合反応を行った。重合反応終了後残留モノマー及び
１−ヘキサノールを除去するため、50℃に加温した50％
メタノール水溶液で洗浄し、最後に蒸留水で洗浄した。

更に、該セラミックスをジオキサンで置換した後、こ
の中へジエチルアミン溶液1.5gのジオキサン溶液5mlを
滴下し、75℃で４時間アミノ化を行った。反応終了後、
セラミックスフォーム片を50％メタノール水溶液で充分
洗浄した後、蒸留水で洗浄した。被覆されたポリマーの
量は、8.7％であった。

推定される正に荷電し得る官能基量は約1.45ミリ当量
/gであり、負に荷電し得る官能基量は約0.19ミリ当量/g
である。表面積は90cm²/ml、空孔率は、約87％であっ
た。相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル
酸ジエチルアミノ−２−ヒドロキシプロピルでありその
CLOGP値は1.116であり、相当する負に荷電するモノマー
単位は、β−メタクリロイルオキシエチルハイドロジェ
ンサクシネートでありそのCLOGP値は0.866である。

（比較例−１） 比較例の球状の細胞培養担体は、以下に述べる方法に
より製造された。300mlの四ツ口フラスコに温度計、冷
却管、窒素導入管、撹拌羽根を取り付け、この中へ塩化
カルシウム・二水塩30g、３％ポリビニルアルコール水
溶液50ml、イオン交換水85mlを入れ、撹拌した。重合反
応は窒素雰囲気下で行った。この中へ、１−ヘキサノー
ル60g、シクロヘキサノール30g、ポリエチレングリコー
ルメタクリレート（PE−350:前述）13.2g、グリシジル
メタクリレート6.0g、ポリエチレングリコールジメタク
リレート（4G:前述）0.8g、重合開始剤として2,2′−ア
ゾビス−（2,4−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−65:前
述）0.02gを溶解した有機溶媒をフラスコ内へ加えた。
徐々に昇温し、65℃で５時間重合反応を行った。反応終
了後、該ポリマーをブッフナー漏斗上にあけ、50％メタ
ノール水溶液で洗浄した。ポリマーを再度フラスコ内へ
戻した。この操作を繰り返し、１−ヘキサノール及びシ
クロヘキサノール臭がしなくなるまで４回洗浄した。得
られたポリマーは無色透明球状体であった。重合収率は
87％であった。このポリマーを標準篩を用い、120μｍ
〜130μｍに粒径を揃えた。該ポリマーを用いて更に以
下の反応を行った。30ml（水中）にポリマーを1,4−ジ
オキサンで充分に洗浄し置換した。これを300mlのフラ
スコ内に入れ、更にジオキサンを30ml追加した。この中
へエタノールアミン5.0gのジオキサン溶液15mlを滴下
し、70℃で４時間アミノ化反応を行った。反応終了後、
ポリマーを充分に洗浄した。元素分析及び滴定より、ア
ミンの官能基量は1.46ミリ当量/gであった。PBS溶液中
における該ポリマーの膨潤度は17.9ml/g、平均粒径は18
4μｍ、比重は1.03g/mlであった。

相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル酸
ヒドロキシエチルアミノ−２−ヒドロキシエチルであり
そのCLOGP値は−0.669である。

（細胞培養実験） 実施例１、２、３、６及び比較例−１で製造された各
細胞培養担体を用いて細胞培養実験を行った。上記の各
細胞培養担体を蒸留水で充分洗浄した後、PBS溶液で洗
浄し、更にダルベッコイーグル変性培地で２回洗浄置換
した。

細胞培養には、10％牛胎児血清（三菱化成（株）社
製）を含有するｅ−RDF培地（極東製薬（株）社製）で
培養した。細胞培養に供した細胞は、CHO−K1（チャイ
ニーズハムスター子宮卵巣）細胞、Vero（アフリカミド
リザル腎）細胞、MDCK（コッカスパニエル腎）細胞であ
る。マイクロキャリア培養は以下のように行われた。実
施例−１、２、３、６及び比較例−１で製造したマイク
ロキャリアをダルベッコイーグル変性培地で置換した。
１のスピンナーフラスコ内にこのマイクロキャリア15
mlを入れ、121℃で30分間オートクレーブ滅菌した。こ
の中へ牛胎児血清を20ml及びeRDF培地を加え295mlとし
た。更に、上記のCHO−K1細胞、Vero細胞、MDCK細胞を
2.5×10⁷cells/ml入れ、25rpmで連続撹拌し培養を開始
した。４日目より５％血清で培地交換をし６日目より２
％血清で培地交換をし、更に８日目より無血清培養を開
始した。この状態で100日間無血清培養を行った。結果
を表−４に示す。

なお、表中の結果は、次の基準で評価結果を示したも
のである。

＋＋＋：非常に良好 ＋＋ ：良好 ＋ ：細胞の付着、培養が見られるが、あまり
良くない。

図−１に実施例−１の担体を用いてVero細胞を84日間
培養したときの写真を示す。長期間培養したときも細胞
の伸展性は良好である。

図−２に実施例−１の担体を用いてCHO−K1細胞を84
日間培養したときの写真を示す。長期間培養したときも
CHO−K1細胞の伸展性は良好である。

図−３に比較例−１の担体を用いてVero細胞を69日間
培養したときの写真を示す。マイクロキャリア上で剥離
及び凝集した細胞が多く観察される。

（発明の効果） 本発明によれば、少なくとも支持体の表面に正に荷電
しうる化学的残基及び負に荷電しうる化学的残基が共存
するための細胞の付着、増殖性が良好であるばかりでな
く、特に、長期間培養した場合にも細胞が剥離しにくい
ことを見い出した。

また、培養担体を構成する重合性モノマーが、透明な
液体であるため種々の形状の構造体に含浸し、被覆する
ことができ、しかも光学的に透明であるため細胞を観察
しやすい等の特徴が挙げられる。また、親水性ポリマー
であるため蛋白質の非特異的吸着がほとんど観察されな
い。

このことにより、各種用途に適した担体を製造するこ
とが可能となり、動物細胞の培養や、それによって分泌
される生理活性蛋白質、モノクローナル抗体、ワクチ
ン、ウイルス等を効率的に生産できるようになった。

【図面の簡単な説明】 図−１及び図−２は、それぞれ実施例−１の担体を使用
し、84日間培養したVero細胞及びCHO−K1細胞の形態の
顕微鏡写真（写真倍率×100）を表わした図面である。 また、図−３は、比較例−１の担体を使用し、69日間培
養したVero細胞の顕微鏡写真（写真倍率×100）を表わ
した図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−291260（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−10979（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−226283（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−71173（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−74580（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−56073（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−502244（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−504221（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 5/06

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】支持体自身が重合性モノマーを構成単位と
   する水不溶性高分子から成るか、もしくは支持体表面が
   該水不溶性高分子によって被覆されて成り、かつ該高分
   子は、正に荷電し得る化学的残基及び負に荷電し得る化
   学的残基を含有して成ることを特徴とする細胞培養担
   体。
2. 【請求項２】重合性モノマーが、（メタ）アクリル酸エ
   ステル及び／又は、（メタ）アクリルアミドであること
   を特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。
3. 【請求項３】正に荷電し得る化学的残基に相当するモノ
   マー単位のCLOGP値が−1.5〜＋2.0、その含有量が水不
   溶性高分子1g当り0.5〜3.0ミリ当量であり、かつ、負に
   荷電し得る化学的残基に相当するモノマー単位のCLOGP
   値が−1.5〜＋2.1、その含有量が、水不溶性高分子1g当
   り0.01〜2.0ミリ当量であることを特徴とする請求項１
   記載の細胞培養担体。