JPH02291260A - 細胞培養担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野ノ 本発明は、細胞培養担体に関するもので．１、特に付着
依存性細胞の高密度培養に適した担体Ｋ関するものであ
る。 （従来の技術及び発明が解決しようとする課題）細胞を
大量かつ高密度状態で培養する方法として、マイクロカ
プセル法、ホローファイバー法、セラミックス担体法、
マイクロキャリア法、ガラスビーズ法等の培養方法が知
られている。 しかしながら近年、培養方法の進展に伴い、より高密度
状態の培養が達成できる培養担体、及びその培養方法が
求められるようになってきた。 マイクロキャリア、ガラスビーズ法のような担体表面の
みを付着面とするような担体では、単位体積当シの表面
積（以下、Ｓ／Ｖ値と略す〕が低いため高密度培養に限
界がある。・この目的を達成するためには、担体内部ま
でも付着面とするような培養担体が求められ、既に幾つ
か報告されている。しかしながら、これらの培養担体に
も以下に述べるような問題点がある。 特開昭６２−タＯＪ９３６号及びバイオ／テクノロジー
　５巻．ｐ　ｇＪ！ｒ−ｇＪ７．（ｌ９ｇ７）（ヘラノ
クス・コーポレーション）テハ，コラーゲン繊維を三次
元的に織った球状担体を用い、高密度培養が達成されて
いる。しかしながら、素材がコラーゲンであるため、オ
ートクレープ滅菌ができないという最大の問題点を有し
ている。 特開昭１２−／６９ｇ３７号及びニルンンらのパイオ／
テクノロジー．ｑ巻，　ｐ　９　ｇ　？　−　９　９　
０　．（ｌデｇ７ノでは，多孔性ゼラチン担体を用い、
高密度培養の可能性を報告している。本担体は、コラー
ゲン担体とは異なりオートクレープ滅菌が可能であるが
、強付着依存性細胞でさえも付着性が悪く、特殊な付着
方法が必要である。 Ｇ．Ａ．　Ｐｋｈａｋａｄｚｅらは、ウクレインスキ　
ノでイオキミツニ　ジャーナ／Ｌ／　（　Ｕｋｒ．　Ｂ
ｉｏｋｈｉｍ．Ｚｈ．　）．５７巻，４ｔ号，ｐＪ夕３
−．ｙｇａ．ＣＩタクタノでポリウレタンを用い、ラッ
トの繊維芽細胞が培養できることを既に報告している。 更に、特開昭６２−．２／！ｉＪｇＡ号（日本電気工業
■〕では、発泡ポリウレタンを用い、高密度培養の可能
性を報告している。しかしながら、発泡ポリウレタンを
基材とした担体では、細胞の付着性や、増殖性が悪く、
しかも増殖した細胞が剥離しやすいばかりではなく、付
着した細胞によって分泌された蛋白質やウイルスを吸着
しやす込という問題点を有している。また、渡辺らは、
ポリウレタンは、溶出物が多く生育が不良であることを
報告

【東京医科歯科大学医用器材研究所報告．，／Ｏ巻
．ｐ６タークＳ，（ｌタクル）〕シている。 ところで、本発明者らは特開昭６３−７／／７．７号、
特開昭６３−２．２６２ｇコ号及び特開昭６グー１０９
７９号において、（メタ）アクリル酸エステルを構成単
位とする水不溶性重合体粒子に、正Ｋ荷電しうる化学的
残基または、蛋白質を表面に化学結合してなるマイクロ
キャリアを報告している。しかしながら、前述のように
、微粒子表面の付着面のみでは、高密度培養の達成には
限界があシ、Ｓ／Ｖ値の向上が、高密度培養の達成の成
否を握る鍵となっていた。 以上の状況から、細胞の付着性や増殖性が良好で、オー
トクレープ滅菌が可能な担体が求められていた。 本発明の目的は、細胞とシわけ付着依存性細胞の高密度
かつ大量培養を可能にする培養担体を提供しようとする
ものである。 （課題を解決するだめの手段） 本発明者らは、゛上記の問題点に鑑み鋭意検討を行った
結果、（メタ〕アクリル酸エステル、または（メタノア
クリルアミド等の水不溶性ポリマーを、特定の発泡ポリ
ウレタンにコーティングすることにより従来の技術の欠
点を補った担体が得られることを知得した。即ち、相応
する重合性モノマーを特定の発泡ポリウレタンに含浸し
コーティングした後、重合することによシ、Ｓ／Ｖ値が
大きく、しかも適切な平均細孔径及び比重？有し、ＭＪ
胞の付着、増殖性か良好で、生理活性物質等の蛋白質を
非特異的に吸着することの少ない細胞培養担体を得るこ
とができ、これにより細胞の高密度培養を達成できるこ
とを知得し、本発明に到達した。 すなわち、本発明の要旨は、空隙の平均細孔径がｌμｍ
−３朋である発泡ポリウレタンの表面を、重合性モノマ
ーを構成単位とする水不溶性高分子で被覆してなり、ま
たは５更に、該水不溶性高分子に正に荷電しうる官能基
を化学結合してなり、かつ発泡ポリウレタンの空隙率が
６０〜タデ係であることを特徴とする細胞培養担体に存
する。 以下、本発明を詳細に説明する。 細胞、と９わけ付着依存性細胞を効率的に培養し，該細
胞が分泌する生理活性蛋白質を、効率的に回収するだめ
の細胞培養担体が具備すべき条件として、以下の項目が
あげられる。 （ａｌ　　細胞が付着，増殖しやすいこと。 （ｂｌｓ／Ｖ値が大きいこと。 （ｃｌ　　付着面の曲率半径が大きいこと。 ｆｄｌ　　培養液が流通しうる適度な細孔を有すること
。 （ｅｌ　　細胞が受けるせん断力をできるだけ抑えられ
る構造体であること。 げ）蛋白質の非特異的吸着が少ない素材であること。 （ｇ１　　オートクレープ滅菌が可能であること。 （ｈｌ　　光学的に透明な素材であること。 （１）化学的、生物学的Ｋ安定な素材であること。 （ｊｌ　　廉価な培養担体であること。 これらの条件を満たす担体の支持体として、本発明者ら
は特定の発泡ポリウレタンを採用した。本発明に用いら
れる発泡ポリウレタンの空隙の平均細孔径は７μｍ〜３
龍であシ、空隙率は６０〜ワデチである。また該ポリウ
レタンの大きさは、一般に／　０−７ｃｔｌ〜／　０６
ｃｒｉｌである。 通常、担体の大きさは、その平均細孔径Ｋよって大きく
異なるが、流動状態で培盪するけん濁培養、還流培養、
流動床培養もしくは、回転培養等においては、一辺の長
さがｉｏｏμｍ〜７００μｍの範囲にある構造体である
ことが好ましい。この範囲を越えた場合、担体内部に培
養液が充分拡散しにくくなり、多孔性担体の内部の付着
面を有効に利用できない。この培養担体を用いた場合、
多孔性担体の平均細孔径は、通常、７μｍ−　ｓ　ｏ　
ｏμｍ１好ましくは７０μｍ〜一〇〇μｍである。しか
も培養液の内部拡散を考慮し、担体は、多孔性ポリウレ
タンであることが好ましい。また、該担体は、球状に近
い形状であることが好ましい。これは、（１）培養液を
できるだけ内部に均一に拡散させるため、（２４培養液
中の見かけの粘度を低くするため、（３）担体同士の衝
突による細胞の損傷をできる限シ抑えるためである。 一方、固定床培養担体として用いる場合、該担体の大き
さは、培養規模により大きく異なるが、！　ｃｔ＆　−
　／　Ｏ’ａｔｉの範囲であることが好ましい。 また、その平均細孔径は培養液の担体の内部での拡散性
をよくするため、前述の流動状態での培養に用いられる
担体よシ大きいことが好ましく、一般にＳＯＯμｍ　”
””　Ｊ　Ｍｌｊｉの範囲であることが好ましい。この
場合担体は、培養容器の形状に合わせて裁断することに
よシ得られる。 本発明担体は、付着依存性細胞以外にもハイブリドーマ
、プロトプラスト等の浮遊性細胞も培養することができ
る。この場合、担体の平均細孔径は、比較的小さいこと
が好ましく、その範囲はｌμ７７１　−　／　０　０μ
ｍである。 細胞培養担体の比重は、培養方法やモノマーの含浸量に
よって大きく異なるが、一般にその比重は、／．００−
／．クＯタ／　ｍｌであることが好ましい。 付着依存性細胞を対象とした場合、本発明で用いられる
発泡ポリウレタンは、三次元構造の骨格構造体であれば
連続構造体であっても、骨格間に膜が張った半連続構造
体であっても、いずれでもよい。しかしながら，Ｓ／Ｖ
値を大きくするためには、三次元構造体の骨格構造体間
に適度に膜が張った半連続構造体であることが好ましく
具体的にはそのＳ／Ｖ値として、コ。 ｃｙｉ〜／ｅ０　０　０ｃｎｌ／ｍｌ−；ｔ？　！ｊ　
’ｙ　レタン以上テアルことが好ましい。 細胞は、付着体表面の曲率半径を認識することが、既に
知られてぃる（ＷＳ．Ｈｕ　　バイオテクノロジーアン
ドバイオエンジニアリング．ＪＯ巻，　ｐ！；ｌｌｇ，
　／　９　ｇク〕。即ち、付着体表面の曲率半径が大き
い方が、付着性、増殖性が良好である。発泡ポリウレタ
ンにおいても、細胞付着面が外側に凸で、その曲率半径
ができる限り大きい、または内側に凹の構造体で膜が張
った発泡ポリウレタンであることが好ましい。 本発明において、重合性モノマーを発泡ポリウレタンに
含浸、コーティングするためには、発泡ポリウレタンは
耐薬品性であシ，且つ使用される重合性モノマー成分及
び希釈剤は、該ポリウレタンに対して、良溶媒的である
ことが好ましい。本発明において好適に使用される重合
性モノマーは、親水性モノマーであシ、かつ重合したボ
リマーに蛋白質等の非特異的な吸着が少ないビニルモノ
マーが好適であシ、代表的には（メタ〕アクリル酸エス
テル、または（メタノアクリルアミドがあげられる。具
体的には、一一ヒドロキシエチル（メタ冫アクリレート
、ジエチレングリコール（メタ〕アクリレート、トリエ
チレングリコール（メタ〕アクリレート、テトラエチレ
ングリコール（メタノアクリレート、オクタエチレング
リコール（メタ）アクリレート，ポリエチレングリコー
ル（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート
、グリ七ロール（メタノアクリレート％　（メタ〕アク
リルアミド、メチル（メタ冫アクリルアミド，エチル（
メタ〕アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレー
ト、クリセロール（メタ）アクリレ〜ト、下記表一／ｉ
たは下記表一一のモノマー等があげられる。なお．表中
においてＭｅ基はメチル基を，Ｅｔ基はエチル基を示す
。 また，ＣＬＯＧＰ値は、溶質の水一ｌ−オクタノール系
におけるモノマーの分配係数の対数値を計算によシ求め
た値でアシ、その意義については後述する。 以上の中から適宜選択された重合性モノマー成分に、必
要に応じて架橋剤成分を添加することが好ましい。ここ
で、支持体表面を被覆する高分子膜が水不溶性であれば
、架橋剤成分は必須成分ではないが、該高分子膜及び支
持体からの可溶性成分等の溶出、または、重合した高分
子膜の剥離等を考慮し、架橋剤成分を添加することが好
ましい。架橋剤成分としては、前述のモノマー成分と共
重合性を有し、できる限り親水性の高い多官能性のビニ
ルモノマーが好適である。例えば、エチレングリコール
ジ（メタ〕アクリレート、ジエチレングリコールジ（メ
タクアクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ〕
アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アク
リレート、グリセロールジ（メタラアクリレート、トリ
メチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、エチレ
ンビス（メタ〕アクリルアミド、トリエチレンピス（メ
タ）アクリルアミド等があげられる。架橋剤成分は、支
持体の構成成分の漏出を最小限に抑えるために、欧用す
ることが好ましいが、架橋剤成分の含有率が高すぎる場
合には、血清中の蛋白質及び細胞によって分泌された生
理活性蛋白質を吸着し、効率的にそれらを回収できない
という問題点が生じる場合がある。従って、架橋剤成分
の含有率は、ｏ．ｉ−ｓｏＭ量チ、特に／−ＪＯ重量係
であることが好ましい。 本発明において上記モノマーに対して、希釈剤を添加す
ることが好ましい。これにより発泡ポリウレタンの内部
にまで含浸でき、均一にコーティングすることができる
。しかも得られた高分子に適度の可とり性をもたせるこ
ともできる。 モノマー成分に添加される希釈剤としては，モノマーを
溶解し、モノマー成分の官能基即ち、メタクリロイル基
、水酸基、グリシジル基、アミド基、アミノ基等や、発
泡ポリウレタンに対し不活性であればよい。一般に好適
な希釈剤は、使用される七ノマ一種によって異なる。通
常、ベンゼン、トルエン、メチルイソプチノレケトン、
酢酸エチル、酢酸プチル、ｌ−ヘキサノーノレ、シクロ
ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、シクロヘ
キサノン、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、ム
コージクロロエタン，／，Ｆ−ジオキサン、クロロホル
ム、四塩化炭素、ジメテルホルムアミド、ジメテルスル
ホキシド、アセトニトリル、エタノール、グロパノール
、メタノール、アセトン及び上記水溶性有機溶媒と水と
の混合溶液等が好適である。 一般に、被覆を行う水不溶性高分子は、細胞と高分子と
の接触点を多くするため、非多孔性の膜であることが好
ましいが、微多孔性高分子膜であっても差し支えない。 上記希釈剤としてモノマーに対し良溶媒を添加した場合
には、被覆した水不溶性高分子膜は、光学的に透明な高
分子膜となシ、一方、貧溶媒を添加した場合には、光学
的に不透明な多孔性高分子Ｍ．！：なる。 また同一溶媒を欧用した場合でも、よシ親水性のモノマ
ーや架橋剤を１吏用した場合には、生成する高分子膜は
光学的に透明な高分子膜になシやすい。 全モノマーに対する希釈剤の添加量は，Ｏ〜ＩＯ倍量で
あることが好ましく、特に好ましくは、／．０−グ．θ
倍量である。希釈剤ｔ過剰に添加した場合には、高分子
膜が剥離しやすいばかりではなく、重合収率が低下する
等の問題点が生じる。 本発明者らは、正に荷電しうる官能基量が培養液中にお
いてＯ．Ｓ〜．３．３０ミリ当量／ｇであり、かつボリ
マー中の正に荷電しうる相当するモノマーの．ＣＬＯＧ
Ｐ値が−２．０〜＋コ．０の範囲Ｋある培養担体が、細
胞の付着率が良好であシ、しかも伸展性や増殖性も良い
こと・を見いだした。 正に荷電しうる官能基量は、細胞や官能基によって異な
るが、低い場合には、一般に細胞の付着性が悪くなる。 一方、高い場合には、付着率は良好であるが、上記の範
囲を越えると再び細胞の伸展性や増殖性が悪くなる。細
胞の付着性や増殖性に影響を与えるのは、官能基量ばか
りではなく、ボリマー中の正に荷電しうる相当するモノ
マーのＣＬＯＧＰ値も重要である。本発明ＫおけるＣＬ
ＯＧＰシステムは、ポモナ大学（カリフォルニア州）　
（　Ｔ，Ｎｉｓｈｉｏｋａ　　（京都大学〕によってＦ
ＡＣＯＭ．７．．？．？版に編集されたプログラム）に
よって開発されたもので、以下のように定義される。Ｃ
ＬＯＧＰ値は、上述のとおり溶質の水一ｌ−オクタノー
ル系におけるモノマーの分配係数の対数値を計算によシ
求めた値である。これによシ中性分子の疎水性を定量的
に表現することができるようになった。本発明における
正に荷電しうるモノマー単位のＣＬＯＧＰ値も、この方
法によシ求めたものである。正に荷電しうる官能基は、
培養液において、その一部は、解離状態にあると考えら
れるが、Ｗ．　Ｓ．　Ｈ　ｕらは、ｐＨ７．．１０にお
ける増殖速度に及ぼす正味の荷電量の影響は少ない、ま
たは全く規則性がないことを報告している（バイオテク
ノロジーアンドバイオエンジニアリング，一タ巻，ｐ　
／／ｊｊ−１１６．３．　／９ｇ’）　）。従って、ボ
リマー中の正に荷電しうる相当するモノマー単位の疎水
性度は、中性分子のＣＬＯＧＰ値を考慮すればよい。本
発明では、相当するモノマー単位のＣＬＯＧＰ値が，　
−２．０より小さい値の官能基の場合、培養担体に対す
る細胞の付着性は悪くなシ、逆に、ＣＬＯＧＰ値が、＋
コ．Ｏより大きい場合も、細胞の付着性や増殖性は悪く
なる傾向にある。ＣＬＯＧＰ値が、十一．Ｏより大きい
場合に起こる現象を、本発明者らは、疎水性阻害と呼ん
でいる。この場合、細胞によって分泌された生理活性蛋
白質を、培養担体が吸着することも見い出した。更に、
該モノマー単位の含有率と相当するモノマー単位のＣＬ
ＯＧＰ値との間には、規則性が観察された。即ち、培養
担体上で細胞を良好に付着、増殖させるためには、ＣＬ
ＯＧＰ値が低い場合には、官能基量を多くし、高い場合
には、それを低くすることが好ましいことも判明した。 ＣＬＯＧＰ値が、一一．Ｏ〜＋コ．Ｏの範囲にあシ、且
つ正に荷電しうる官能基をもつモノマー単位としては，
前述の表一ｌ及び表一一に示したものをあげることがで
きる。表一７及び表一一に示していない化合物でも、本
発明の特許請求の範囲を越えない限り、表中の化合物に
限られるものではない。 発泡ポリウレタンの表面を水不溶性高分子で被覆する方
法は、以下の手順に従って行うことができる。 モノマー，架橋剤、希釈剤を混合して成るモノマー溶液
に重合開始剤を添加する。この溶液を発泡性ポリウレタ
ンに含浸し、過剰のモノマー溶液は、ポリウレタンを圧
縮し絞シ出した後、窒素雰囲気下でモノマーを重合する
。固定床用担体を製造する場合には、発泡ポリウレタン
にモノマーを含浸し、均一にコーティングするため、で
きる限Ｆ）　／　Ｏａｎ片以下に裁断し、上記の重合反
応を行う。培養器に合わせた固定床用培養担体を製造す
る場合には、裁断し上記の操作を行った後、遠心分離機
で過剰のモノマー溶液を除去する。培養担体が小さい場
合には、カラム内に充填した後、含浸及びコーティング
することも可能である。上記の製造工程において注意す
る点としては、過剰のモノマー溶液を除去する際、ウレ
タン内部に液溜りが生じないようにしなければならない
ことである。 本発明で使用される重合開始剤として、以下のものをあ
げることができる。過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイ
ル、過酸化アセチル等の過酸化系重合開始剤、コ．コー
アゾビス一一一シクロプロビルプロピオニトリル等のア
ゾ系重合開始剤または過酸化水素水一Ｆｅ２＋塩、過酸
化物塩一硫酸水素ナトリウム、トリエチルホウ素、ジエ
チル亜鉛等の極低幅用重合開始剤によシ重合を開始させ
ることができる。 ここで重合開始剤の選択は、モノマー、架橋剤、希釈剤
等によって，大きく異なる。モノマー溶液が水溶性であ
る場合には、レドンクス系重合開始剤、水溶性アゾ系重
合開始剤または過酸化アンモニウム、過酸化カリウムー
Ｎ，Ｎ．Ｎ’Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミン等が
用いられる。また、モノマー溶液が水に難溶性である場
合には、過酸化系重合開始剤またはアゾ系重合開始剤が
好ましく用いられる。 重合温度は、一般にレドックス系重合開始剤の場合には
、θ℃〜ＳＯ℃とするのが好ましく、またアゾ系重合開
始剤及び過Ｉ酸化物系重合開始剤の場合には３０℃〜／
００℃とするのが好を有する場合、得られた高分子はそ
のまま用いることができる。しかし、高分子が上記荷電
しうる官能基を全く含まない場合、または、特許請求の
範囲に記載した官能基量の範囲以下である場合には、更
に化学反応によって正に荷電しうる官能基を化学結合に
よシ導入しなければならない。例えば、高分子中のグリ
シジル基は、アミンとの反応によシ容易に化学修飾して
正荷電しうる官能基を導入できる。高分子中の水酸基、
コ，３−ジヒドロキシグロビル基等の場合には、臭化シ
アンとの反応によシイミドカルボネートを得た後、ジア
ミンとの反応によシ、化学修飾して、正荷電しうる官能
基とすることができる。また同様に水酸基、コ，３−ジ
ヒドロキシグロビル基をトリクロロトリアジンと反応さ
せ、生成したジクロロトリアシル基とジアミンとの反応
によシ，化学修飾することもできる。 担体に導入された正に荷電しうる官能基量は、支持体に
よっては、測定することが難しい場合が多い。その場合
、別にガラスシャーレ上にモノマーをコーティングした
後、ポリマーを回収し、正の荷電量を滴定によって推定
する・ことはできる。なお、実施例に示した正の荷電量
は、上記の方法によって推定により求めた値である。 本発明の細胞培養担体を用いて培養する方法として、培
養規模，培養の目的等によって異なるが、例えば、以下
の方法があげられる。シャーレ、Ｔ−フラスコを使用し
た場合４靜地培養法、スビンナーフラスコ，ローラーボ
トルの場合、けん濁培養法、固定床を用いた場合、固定
床培養法，その他エアーリフトを用いた場合、還流培養
法等があげられる。 培養方法によシ培養担体の投入量は異なシ、一般に培養
液に対して５％〜６０％の範囲であることが好ましい。 （実施例） 以下、実施例によシ本発明を詳細に説明するが、本発明
は、その要旨を越えない限シ、以下の実施例によシ限定
されるものではない。 （実施例一ｌ） ボリエテレングリコールメタクリレート（ＰＥ一コＯＯ
；日本油脂■製）！．／０９，グリシジルメタクリレー
トａ．ｓｏｙ，ポリエチレングリコールジメタクリレー
ト（４’Ｇ；新中村化学■製）コ．ｑ　ｏタ、ｌ．ダー
ジオキサンコｏ．ｏ　ｙ及び塩化メテレンｏ．ｓｍｌに
溶解したアゾ系重合開始剤＋７）Ｖ　−　７　０　（　
２．．２’−７ゾヒス（＜＜−メトキ’／一一，クーバ
レロニトリル）　；ｆＯ光純薬工業■製〕ａｏｒｎ９を
混合し、モノマー溶液を調製した。室温で窒素ガスを通
じ、モノマー溶液中の溶存酸素を除去した。 発泡ポリウレタン（平均細孔径．２ＳＯμｍ、半連続発
泡体、ＭＤ化成■製ノ（ｌＯｃＭＬｘｌＯ儂Ｘ　７　ｃ
ｎＬ；　７　０　０　ｃｒｄ　）に上記調裂したモノマ
ー浴液を含浸し、過剰のモノマー溶液を圧縮し絞シ出し
た。該ポリウレタン片をガラス容器内Ｋ入れ、窒素雰囲
気下ＳＯ℃に加湛し、一時間重合反応を行った。重合反
応終了後、残留モノマー及びジオキサンを除去するため
、ＳＯ℃に加温したアセトン水溶液で洗浄し、最後に蒸
留水で洗浄した。 更に、このポリウレタン片をジオキサンで置換した後，
この中へエタノールアミンコ．θ２のジオキサン溶液／
ｏｍｌを滴下し，？！ｒ℃でｑ時間アミン化を行った。 反応終了後、ポリウレタン片をＳＯ％アセトン水溶液で
十分洗浄した後、蒸留水で洗浄し尼。被覆されたボリマ
ーの量は／ｇ．！；チであった。 相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル酸一
一一ヒドロキシエチルアミノー一一ヒドロキシグロビル
でメシ、そのＣＬＯＧＰ値は，−０．６４９である。推
定される官能基量は、約ｌ．クｌミリ当量／ｇであシ、
表面積は！；　２ｃｒｄ／ｍｌ、空隙率は約ざ７チであ
った。 （実施例一コ） ポリエチレングリコールメタクリレ−”｝（ＰＥ−３！
；０；日本油脂■製）　ｓ．ｏ　ｙ、グリシジルメタク
リレート２．４Ｏｆ，グリセロールジメタクリレートム
ダ０２、／，９−ジオキサンコ０．０？及び塩化メチレ
ンｏ．ｓｍｌに溶解したアゾ系重合開始剤の■−７０　
（　．２，．２’−アゾビス（グーメトキシ一一，クー
バレロニトリル】；和光純薬工業■製〕コｏｒｎ９を混
合し、モノマー溶液を調製した。室温で窒素ガスを通じ
、モノマー溶液中の溶存酸素を除去した。 発泡ポリウレタン（平均細孔径７θμｍ、半連続発泡体
）（　／　ＯａｎＸＩ　Ｏｃｍ×７ｃｍ：　７００ｄ）
に上記調製したモノマー溶液を含浸し、過剰のモノマー
溶液を圧縮し絞シ出した。該ポリウレタン片をガラス容
器内に入れ，窒素雰囲気下６０℃に加温し、２時間重合
反応を行った。 重合反応終了後、残留モノマー及びジオキサンを除去す
るため、！；　０　′Ｃに加湛したｓｏ％アセトン水溶
液で洗浄し，最後に蒸留水で洗浄した。 更に、このポリウレタンフォームをジオキサンで置換し
た。この中へコーアミノエタンチオール一．θノのジオ
キサン溶液／θｍｌｆ滴下し，７５℃でグ時間アミン化
を行った。反応終了後、ポリウレタン片を５０俤アセト
ン水溶液で十分洗浄した後、蒸留水で洗浄した。被覆さ
れたボリマーの量は／コ．３％であった。 相当する正に荷電するモノマー単位は、メタクリル酸一
λ−メルカブトエチノレアミノ一一一ヒドロギシグロビ
ルでアシ、そのＣＬＯＧＰ値１’ｌ：、−ｏ．ｏｔｂで
ある。推定される官能基量は、約／．７７ミリ当量／ｇ
であり、表面積はｉ　ｙ　ｔ，ｃｎＬ／１ｎｌ、空隙率
は約ククチであった。 （実施例−３） シエチレングリコールメタクリレート７．Ｏｆ、ジメチ
ルアミノエチルメタクリレー｝，ｚ．ｔ／ＩＦ（　ＣＬ
ＯＧＰ値ｉ．ｉａ３）、グリセローノレメタクリレート
ｏ．ｓ　ｏ　ｒ　，テトラヒドロ７ランコ／．０２及び
重合開始剤のＶ−１５［ｕ，！−アゾビス（コ，クージ
メチルパレロニトリル）　；和光純薬工業■製］コＯ■
を混合し、モノマー溶液を調製した。室温で窒素ガスを
通じ、モノマー溶液中の溶存酸素を除去した。 発泡ポリウレタン（平均細孔径／００μｍ、半連続発泡
体）　（　／　Ｏ　ｃｍ　Ｘ　／　Ｏ　ｃｍ　Ｘ　７　
ｃｍ　：　？　０　０ｃｄ）に上記調製したモノマー溶
液を含浸し、過剰のモノマー溶液を圧縮し絞シ出した。 該ポリウレタン片をガラス容器内に入れ、窒素雰囲気下
１．０”Ｃに加温し、ｔ時間重合反応を行った。 重合反応終了後、残留モノマー及びジオキサンを除去す
るため、５０℃に加湛したアセトン水溶液で洗浄し、最
後に蒸留水で洗浄した。 被覆されたボリマーの量は、ｑ．ｓ　ｑ６であった。 推定される官能基量は、約７．３一ミリ当量／７であり
、表面積は／　／　７　７／　ｍｌ、空隙率は約ｇｌ係
であった・ （実施例一ク） ポリエチレングリコールメタクリレー｝（ＰＥ一．２ｏ
ｏ　；日本油脂■製）　７．Ｏ　ｆ、ジエチルアミンエ
チルメタクリレートΩ．ｙ　３？　（　ＣＬＯＧＰ値：
　ｌ．／ｇｇ），グリセロールメタクリレート／．！０
９，７！；％テトラヒド口フラン水溶液／ｇ．０？及び
アゾ系重合開始剤のＶ　−　ｂ　ｓＣ２．２−アゾビス
（コ，クージメチルバレロニトリルラ；相光純薬工業■
製〕一〇　ｍ９　ｆ混合し、モノマー溶液を調製した。 室温で窒素ガスを通じ、モノマー溶液中の溶存酸素を除
去した。 発泡ポリウレタン（平均細孔径クＯμｍ５半連続発泡体
）　（　５　ｃｍ　Ｘ　３　ｃｍＸ　３　（Ｘ　；クＳ
ｄ）に上記調製したモノマー溶液を含浸し、過剰のモノ
マー溶液を圧縮し絞シ出した。該ポリウレタン片をガラ
ス容器内に入れ、窒素雰囲気下６０℃に加湛し、ｑ時間
重合反応を行った。重合反応終了後、残留モノマー及び
ジオキサンを除去するため、６５℃に加温したアセトン
水溶液で洗浄し、最後に蒸留水で洗浄した。被榎された
ポリマーの量は６．７％であった。推定される官能基量
は、約／．Ｊａ　ミＩ）当量／ｇであり、表面積は／コ
ｔ　ｃｒｌ　／　”　％空隙率は約７７％であった。 試験例ｌ　（細胞培養実験ラ 実施例−７で製造された細胞培養担体を用いて、細胞培
養実験を行った。 実施例一ノで製造された細胞培養担体を蒸留水で充分洗
浄し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で置換し、更にダルベソ
コ変性イーグル培地（高圧蒸気滅菌可能）（日水製薬■
製ノで置換し、ｌコ７℃で一〇分間、蒸気滅菌を行った
。 細胞培養は、／０％牛胎児血清（三菱化成■冫を含有す
る、ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬■ラ及びダルベツコ変性
イーグル培地（日水製薬■製９で培養を行った。培養に
供した細胞は、Ｖｅｒ６（アフリカミドリザル腎）細胞
，ＭＤＣＫ（コツ力スパニエル腎）細胞、Ｃ６（ラット
グリア）細胞、ＫＮ（ヒト肺ガン）細胞、ＨｅＬａ（ヒ
ト子宮頚部ガン）細胞、Ｗ　Ｉ　−　．７　ｇ　（ヒト
胎児正常二倍体〕細胞である。 試験例２　（静置培養実験〕 ＡＣＩｎシャーレを用いて、細胞培養実験を行った。各
々のシャーレ内に、実施例−７で製造した細胞培養担体
片を，約ｉ．Ｏｍｌ入れ，３７℃の炭酸インキエペータ
ー内で培養を開始した。５時間後、及び５日後の付着性
及び増殖性は、以下の通りでめった。 シャーレ内の細胞密度は、以下の通りであった・細胞種
　　　　　細胞密度Ｃｃｅｌｌ５／ｍｔ）Ｖｅｒｏ細胞
　　　？．！；　Ｘ　／　０７ＨｅＬａ細胞　　　ざ＋
ｊ　Ｘ　／　０″Ｃ６細胞　　　　　ｇ．／　Ｘ　／　
０’ＣＨＯ−Ｋ／細胞　　　　６．ｇ　Ｘ　／　０’Ｗ
ｌ−．２ｇ細胞　　　　八コＸ　／　０７試験例Ｊ　（
けん濁培養実験） 全容１／ｋ八０７３のスビンナーフラスコを用いてけん
濁培養を行った。スビンナーフラスコ内に実施例一ｌ，
一実施例一コ、実施例−３及び実施例一ｑで製造された
滅菌済みの細胞培養担体片（Ｏ．ｊｍ１角）をｓ．ｏｍ
ｌ投入し、血清２　０．θｍｌ及びｅ−ＲＤＦ培地を加
え３００ｍｌとした。 この中へトリプシンで分散したＶｅｒｏ細胞をコ．Ｏ　
ｘ　／　０７ｃｅｌｌｓ播種し、／　！；　ｒｐｍで連
続攪拌し培養を行った。各実施例における担体は、いず
れも良好な付着性及び増殖性を示し、高密度培養が達成
された。 試験例４Ｉ（蛋白質吸着量測定〕 ｏ．ｉ％牛血清アルブミン（シグマ社製クのリン．酸緩
衝溶液（ｐ８　　７．１１０）／００ｍｌを調製した。 この中へ実施例−７、実施例一コ、実施例−３及び実施
例一グで合成した培養担体、及び比較例として重合処理
を行っていないポリウレタンＣＩ−Ｏｍｍ角）ｉ０．Ｏ
ｍｌを上記溶液中に投入し、Ｊク℃で振とうした。Ｓ時
間後、上溌み液のコｇ　Ｏ　ｎｍにおける吸光度を測定
し、ポリウレタンに吸着した牛血清アルブミンの量ヲ算
出した。結果を下記表−３に示す。 表−３ （発明の効果） 本発明によれば、培養担体を構成する重合性モノマーが
、液体であるため種々の形状の発泡ポリウレタンに含浸
し、コーティングすることができる。このことによシ、
各種用途に適した担体を製造することが可能となった。 本発明の細胞培養担体は、Ｓ／Ｖ値（単位体積当シの付
着表酢積冫が大きく、培養液が流通しうる細孔を有する
ため、高密度培養を達成しやすい。付着表面の曲率半径
が大きく，また、細胞の増殖にとって適切な荷電量及び
疎水性を有している。発泡ポリクレタン表面を親水性ポ
リマー成分でコーティングしているため、蛋白質の非特
異的吸着がほとんど観祭されない。その他、光学的に透
明であるため細胞を観察しやすく、オートクレープ滅菌
が可能である等の効果があげられる。これらの効果によ
シ動物細胞の培養や、それによって分泌される生理活性
蛋白質、モノクローナル抗体、ワクチン、ウイルス等を
効率的Ｋ生産できるようになった。 出　願　人　　三菱化成株式会社 代　理　人　　長谷川 （ほかｌ名）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）空隙の平均細孔径が１μｍ〜３ｍｍである発泡ポ
   リウレタンの表面を、重合性モノマーを構成単位とする
   水不溶性高分子で被覆してなり、または、更に、該水不
   溶性高分子に正に荷電しうる官能基を化学結合してなり
   、かつ発泡ポリウレタンの空隙率が６０〜９９％である
   ことを特徴とする細胞培養担体。
2. （２）水不溶性の重合性モノマーが、（メタ）アクリル
   酸エステル、または（メタ）アクリルアミドであること
   を特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。
3. （３）被覆する水不溶性高分子の正に荷電しうる官能基
   量が培養液中において、０．５０〜３．５０ミリ当量／
   ｇであり、かつ相当する正に荷電しうるモノマー単位の
   ＣＬＯＧＰ値が、−２．０〜＋２．０の範囲にあること
   を特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。