JP2948265B2 - ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードするｄｎａ断片 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、バシラス・ステアロサーモフィラスTH6−
２（FERM BP−2758）由来のヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼをコードする遺伝子領域を特定し、それら特定した
DNA断片を使用し、遺伝子工学的手法によってピリミジ
ン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ、プリン・ヌクレオ
シド・ホスホリラーゼのいずれか一方あるいは両方を選
択的かつ大量に製造する方法に関するものである。

＜従来の技術＞ 核酸系化学療法剤は、抗腫瘍、免疫抑制、抗ウィルス
等の種々の用途に使用されている。

近年、エイズの流行とともにヌクレオシドアナログの
抗ウィルス作用が注目され、種々のヌクレオシドアナロ
グの抗ウィルス活性が試験されている（たとえば、化学
と生物、第27巻、第６号、第356〜366頁（1989年）など
参照）。

従来、これらのヌクレオシドアナログは化学的に合成
されていたが、45℃以上の温度条件下でヌクレオシド・
ホスホリラーゼを利用することにより数々のヌクレオシ
ドアナログを収率よく調製することができることが判明
するに至り、ヌクレオシド・ホスホリラーゼを利用した
ヌクレオシドアナログの合成はヌクレオシドアナログを
調製するための重要な技術となっている（たとえば、発
酵と工業、第39巻、第10号、第927〜937頁（1981年）参
照）。

ヌクレオシド・ホスホリラーゼは、動物、微生物など
の種々の生物に存在することが確認されており、そのい
くつかは単離精製されて、酵素学的諸性質が報告されて
いる（たとえば、Methods in Enzymology,Vol.LI,423〜
458、同517〜542（1978）参照）。

ヌクレオシド・ホスホリラーゼの調製源としては微生
物が有利であり、バシラス属に属する好熱菌の一種であ
るバシラス・ステアロサーモフィラスについてもヌクレ
オシド・ホスホリラーゼの存在が確認されている。すな
わち、ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ（E.
C.2.4.2.2）、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ
（E.C.2.4.2.1）ともバシラス・ステアロサーモフィラ
スから単離精製され、その諸性質が報告されているとと
もに（J.Bio.Chem.,244,3691〜3697（1969）、Agric.Bi
ol.Chem.,53,2205〜2210（1989）、Agric.Biol.Chem.,5
3,3219〜3224（1989）参照）、それらの酵素を利用して
のヌクレオシドおよびそのアナログの調製およびその可
能性も報告されている（Agric.Biol.Chem.,53,197〜202
（1989）、特開昭56−166199号公報、特開昭56−164793
号公報、特開平１−320995号公報など参照）。

また、ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードする遺
伝子の解析に関しては、以下の報告がなされている。

Proc.Natl.Acsd.Sci.,U.S.A.,80（14）,4281〜4285
（1983）、Nucleic Acids Res.,12（14）,5779〜5787
（1984）、Gongye Weishengwn,19（４）１〜５（198
9）、Genetika,19（６）,881〜887（1983）。

本発明者は、先に、バシラス属に属する好熱菌から、
耐熱性があって比活性の高いヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼを大量に発現する菌株群を見出し、それらからヌク
レオシド・ホスホリラーゼを単離するのに成功した（日
本農芸化学会誌、第63巻、第３号（1989年度大会講演要
旨集）、第283頁参照）。

〔発明の概要〕

＜発明が解決しようとする課題＞ 上記の本発明者の見出した酵素は極めてすぐれた酵素
であると解されるが、酵素源としてバシラス属の微生物
菌体を使用する場合は、胞子形成に伴う自己溶解により
反応液中に酵素が脱落して、ヌクレオシドの連続的合成
反応に悪影響を及ぼすという欠点を有していた。また、
固定化酵素等の形態で使用する場合には、微生物菌体か
らの酵素の調製が複雑でかつ収率よく回収するのが困難
であるという欠点も有していた。

＜課題を解決するための手段＞ 本発明者らは上記問題点を解決すべく種々研究を重ね
た結果、上記ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードす
る遺伝子を含有するDNA断片を特定することに成功し、
該DNA断片を使用すれば細菌を宿主として大量に上記ヌ
クレオシド・ホスホリラーゼを発現させることができる
こと、さらには宿主からの当該ヌクレオシド・ホスホリ
ラーゼの抽出も容易に行なえることを見出して、本発明
を完成させた。

すなわち、本発明は、バシラス・ステアロサーモフィ
ラスTH6−２（FERM BP−2758）由来の下記（Ａ）の制
限酵素地図の（１）で示される大きさが約2.8kbであるD
NA断片、（２）で示される大きさが約2.6kbであるDNA断
片、または（３）で示される大きさが約4.6kbであるDNA
断片のいずれか１つを使用し、該断片を微生物内で複製
可能なベクターに組み込んだ組換えプラスミドを調製
し、該組換えプラスミドにより形質転換した形質転換体
を培養して、下記（Ｂ）のピリミジン・ヌクレオシド・
ホスホリラーゼ、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラー
ゼのいずれか一方あるいは両方を調製する方法に関する
ものである。

（ここで、EIは制限酵素EcoR I認識部位を、EVは制限酵
素EcoR V認識部位を、Psは制限酵素Pst I認識部位を、S
pは制限酵素Sph I認識部位を、Pvは制限酵素Pvu II認識
部位を、Scは制限酵素Sac I認識部位を、それぞれ示
す。） （Ｂ） ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ 作用： ピリミジンヌクレオシド＋リン酸 ピリミジン塩基＋ペントース−１−リン酸 基質特異性： ウリジン、２′−デオキシウリジン、リボフラノシル
チミン、チミジンに特異的である。

至適温度および温度安定性： 至適温度は60〜70℃、安定温度範囲は60℃までであ
る。

至適pHおよびpH安定性： 至適pHは７〜９、安定pH範囲は５〜９である。

分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）： 約45000 プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ 作用： プリンヌクレオシド＋リン酸 プリン塩基＋ペントース−１−リン酸 基質特異性： イノシン、２′−デオキシイノシン、グアノシン、
２′−デオキシグアノシンに特異的である。

至適温度および温度安定性： 至適温度は60〜80℃、安定温度範囲は60℃までであ
る。

至適pHおよびpH安定性： 至適pHは７〜８、安定pH範囲は５〜９である。

分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）： 約31000 ＜発明の効果＞ 本発明によるDNA断片は、これを用いれば、大腸菌等
の他の宿主においてもヌクレオシド・ホスホリラーゼを
大量に発現させることができるので、この酵素を調製す
るための道具として有用である。特に、バシラス属の微
生物そのものからこの酵素を調製する場合と比較すれ
ば、本発明のDNA断片を使用することにより、下記の
（イ）および（ロ）の利点が得られる。

（イ） 微生物からの酵素の抽出が容易になる。

従来のバシラス・ステアロサーモフィラスからの酵素
の抽出は極めて困難であったが、大腸菌を宿主として利
用する場合にはリゾチーム法等の極めて容易な操作で収
率よく本発明のDNA断片のコードするヌクレオシド・ホ
スホリラーゼを回収することができる。すなわち、本発
明の遺伝子を発現させる際は、宿主の修飾（分泌）系を
介して膜近く（グラム陰性細菌の場合はペリプラズム）
に本発明のDNA断片のコードするヌクレオシド・ホスホ
リラーゼの多くが移行するので、宿主に生育阻害等の悪
影響を及ぼすことなく大量発現がなされる。また、該酵
素の回収はリゾチーム法等細菌で一般的に用いられる簡
便な方法によりなされ、かつ該酵素が耐熱性を有するこ
とから熱処理によって比活性の向上も効率よく行なうこ
とができる。

（ロ） 胞子形成に伴う自己溶解による酵素の漏出、失
活等のデメリットがなくなる。

バシラス属微生物は胞子を形成する際に自己溶解し
て、酵素の漏出、失活等がみられ、これが生菌体を酵素
源として使用して連続反応を行う際のデメリットとなっ
ていたのであるが、大腸菌を宿主とすることにより上記
デメリットを克服することができる。

また、本発明のDNA断片中の発現関連領域は外来遺伝
子を発現させるのにも好適であり、宿主に対する影響を
最少限に抑えながら効率的な異種タンパク質の発現が期
待される。

〔発明の具体的説明〕

＜DNA断片＞ 本発明によるDNA断片は、バシラス属に属する好熱菌
由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼ遺伝子を含み、下
記の制限酵素地図の（１）、（２）または（３）で示さ
れて、大きさが約2.8kb（制限酵素地図（１））、約2.6
kb（制限酵素地図（２））または約4.6kb（制限酵素地
図（３））のものである。

ここで、記号は、下記の通りの制限酵素認識部位を示
す。

記号 制限酵素 EI EcoR I EV EcoR V Ps Pst I Pv Pvu II Sp Sph I Sc Sac I 本発明によるDNA断片はバシラス属に属する好熱菌由
来のヌクレオシド・ホスホリラーゼ遺伝子を含むもので
あることは前記したところであるが、ここで「バシラス
属に属する好熱菌由来」ということは塩基配列がバシラ
ス属に属する好熱菌の遺伝子のそれと実質的に同じてあ
るということを意味するものであって、必ずしも本発明
によるDNA断片がバシラス属に属する好熱菌から抽出さ
れたものに限定されることを意味するものではない。な
お、「塩基配列が実質的に同じ」ということは、ヌクレ
オシド・ホスホリラーゼとしての遺伝情報が維持されて
いる限り、いくつかの単位ヌクレオシド（塩基）の置
換、欠失および（または）付加があってもよいことを意
味する。

また、「バシラス属に属する好熱菌由来」ということ
は、バシラス属に属する好熱菌に属する合目的的なすべ
ての菌株を対象とするものである。ここで、バシラス属
に属する好熱菌としては、バシラス・ステアロサーモフ
ィラス（Bacillus stearothermophilus）、バシラス・
シェレゲリ（Bacillus schlegeli）、バシラス・アシド
カルダリアス（Bacillus acidocaldarius）などの中等
度好熱菌が例示される。

なお、本発明によるDNA断片は上記の制限酵素地図の
（１）、（２）または（３）で示される所定の大きさの
ものであるが、本発明によるこのDNA断片はそれ自身と
しての存在に限定されない。すなわち、本発明によるDN
A断片は、基本的なそれ自身としての存在の外に、その
上流および（または）下流側に希望するDNA鎖が結合し
ている形態ならびに所定DNA鎖中に介在ないし組込まれ
ている形態であってもよい。

後者の所定DNA鎖中に介在している形態の一例は、プ
ラスミドであって、所定宿主細胞に対する発現ベクター
に組込まれてなるプラスミドは本発明によるDNA断片の
有用性が現実のものとなるという点で本発明DNA断片の
好ましい具体例である。発現ベクター中に適当なシグナ
ルペプチド遺伝子を結合させてあれば、発現酵素の菌体
外ないしペリプラズム中への分泌が促進される。

本発明によるDNA断片の一つは、前記制限酵素地図の
（１）、すなわちEI−Psの部分、に対応するものであ
る。このDNA断片がコードするヌクレオシド・ホスホリ
ラーゼは、ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ
（Pyrimidine nucleoside phosphorylase:PyNPase）で
ある。以下において、このDNA断片をDNA断片（１）と呼
ぶ。

本発明によるDNA断片の他の一つは、前記制限酵素地
図の（２）、すなわちEV−Scの部分、に対応するもので
ある。このDNA断片がコードするヌクレオシド・ホスホ
リラーゼは、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ
（Purine nucleoside phosphorylase:PuNPase）であ
る。以下においては、このDNA断片をDNA断片（２）と呼
ぶ。

本発明によるDNA断片のさらに他の一つは、前記制限
酵素地図の（３）、すなわちEI−Scの部分、に対応する
ものである。このDNA断片がコードするヌクレオシド・
ホスホリラーゼは、ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホ
リラーゼおよびプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ
である。この両ヌクレオシド・ホスホリラーゼはDNA断
片（１）および（２）に対応する遺伝情報の寄与によっ
て発現した可能性が考えられる。以下においては、この
DNA断片をDNA断片（３）と呼ぶ。

＜DNA断片の作成／取得＞ 本発明によるDNA断片は、希望するならばその鎖中の
全部または一部を化学合成することによって得ることが
できるが、その鎖長がかなり長いことを考慮すれば、バ
シラス属に属する好熱菌の染色体を適当な制限酵素で一
段ないし多段に分解して得ることが好ましい。

バシラス属に属する好熱菌からのDNA断片の調製は、
既に知られている合目的的な任意の方法によって行なう
ことができる。具体的な方法は、たとえば、下記の通り
である。

染色体DNAを取得するための微生物としてはバシラス
属に属する好熱菌に属し、目的とする酵素を発現してい
るものであれば、ある特定の株に制限されないことは前
記したところであるが、具体的にはバシラス・ステアロ
サーモフィラスTH6−２（微工研条寄第2758号）、同Ｐ
−21、同Ｐ−23ならびにATCC8005、同10149、同12016、
同12976、同12978、同12980、同15952、同21365、同296
09などを例示することができる。TH6−２、Ｐ−21およ
びＰ−23は本発明者の見出した株であって、本発明で対
象とするのに好ましいものの具体例であるが、これらの
微生物、就中特に好ましいTH6−２の詳細、特に菌学的
性質は特願平１−203556号明細書に記載されている。

バシラス属に属する好熱菌からの染色体DNAの調製
は、菌体の溶菌、タンパク質の除去、およびRNAの除去
の工程を順次または同時に行うことにより実施すること
ができる。より具体的には、Marmur法（J.Biol.３,208
（1961））、Thomas法（J.Mol.Biol.,11,476（196
5））、Saito−Miura法（Biochim.Biophys,Acta,72,619
（1963））、Smith法（Methods in Enzymology,Vol.12,
Part A,545（1967））、Takahashi法（J.Mol.Evol.,３,
239（1974）、J.Bacteriol.,89,1065（1965）、Davern
法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,55,792（1966）、Nature,
219,1251（1968））、Kavenoff法（J.Mol.Biol.,72,801
（1972））、Worcel−Burgi法（J.Mol.Biol.,71,127（1
972）、J.Mol.Biol.,82,91（1974））などの各法に記載
の方法を適宜応用することにより染色体DNAを調製すれ
ばよい。

得られた染色体DNAは、BamH I、Sau3A I、Hind IIIな
どの適当な制限酵素で分解した後、ショ糖密度勾配遠心
法（たとえば、生化学実験講座２「核酸の化学Ｉ」第32
3〜333頁（東京化学同人1975年発行）など参照）にて５
〜15kbのDNA断片を分画採取する。

分画して得られたDNA断片とDNA断片を調製する際に使
用した制限酵素もしくは同じ粘着末端を生じる制限酵素
で分解したプラスミドDNAを連結し、これを大腸菌等の
宿主菌内に導入して、宿主菌を形質転換させる。

使用できるプラスミドとしては、通常使用されている
ColE1の系統、pMB9の系統、pBR322の系統、pSC101の系
統、R6Kの系統などいずれであってもよい。具体的にはp
BR322、pSC101、pUC118、pUC119、pBR325などが例示さ
れる。

染色体DNAから切り出したDNA断片とプラスミドDNA断
片との連結は制限酵素で切断したプラスミドDNA断片を
必要によりアルカリホスファターゼ処理（Science,196,
1313（1977））してからリガーゼで結合する方法により
行うことができる。

ハイブリッドプラスミドによる宿主菌の形質転換は、
常法に準じて行なえばよく、たとえば宿主として大腸菌
（たとえば、Ｋ−12株 Ｃ−600）を使用する場合には
塩化カルシウムを用いる方法によればよい（たとえば、
「分子生物実験マニュアル」第159〜161頁（講談社 19
83年発行）など参照）。宿主菌は通常使用されている細
菌であればいずれをも使用することができ、必ずしも大
腸菌に限られるものでもない。具体的には、大腸菌等の
グラム陰性細菌、枯草菌等のグラム陽性細菌等がある
が、大腸菌が使用に便利であるので好ましいといえる。

このようにして得られた形質転換体は、まず上述のハ
イブリッドプラスミドを有する形質転換体を選別後、ヌ
クレオシド・ホスホリラーゼ誘導培地中で培養し、溶菌
液の酵素活性を調べて、ヌクレオシド・ホスホリラーゼ
生産能を有する株を選択する。

第一次の選別は、通常、使用したプラスミドの保持す
る抗生物質（たとえば、アンピシリン、テトラサイクリ
ン等）等の薬剤耐性の有無による判別によって行なうこ
とができる。

薬剤耐性株を培養するのに用いるヌクレオシド・ホス
ホリラーゼ誘導培地は大腸菌等の宿主菌が生育可能な培
地であればよく、具体的には、実施例に示したように、
ペプトン、酵母エキス、肉汁、食塩等を含有する培地を
用いればよい。

また、溶菌液中の酵素活性の測定は、大腸菌等の宿主
由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼと本発明のDNA断
片のコードするヌクレオシド・ホスホリラーゼとを区別
するため、宿主由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼの
失活する温度（75〜85℃）条件下で行えばよい。

ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性陽性の菌株は、菌
体からプラスミドDNAを抽出後、再度上述と同様の方法
により宿主に導入して、酵素活性を確認することが望ま
しい。

プラスミドの抽出はアルカリ溶菌法等（Molecular Cl
oning,p366−369,Cold Spring Harbor Laboratory（198
2））、精製は塩化セシウム−エチジウムブロミドを用
いる方法（Proc.Nat.Acad.Sci.USA,57,1514（1967）な
ど参照）、などの常法により行なうことができる。

活性が確認された菌株からプラスミドを再度抽出し、
制限酵素（たとえばSph Iなど）を用いて染色体由来のD
NA断片を小型化してから、本発明のDNA断片を得ること
ができる。すなわち、DNA断片（１）を得るためにはEco
R IおよびPst Iで、DNA断片（２）を得るためにはEcoR
VおよびSac Iで、DNA断片（３）を得るにはEcoR Iおよ
びSac1で、それぞれこの抽出プラスミドを消化すれば、
それぞれのDNA断片を得ることができる。また、DNA断片
（３）をPat Iで、あるいはEcoR Vで、消化すれば、DNA
断片（１）および（２）がそれぞれ得られる。

上記の方法のうち、好ましい態様をフローシートで示
せば、下記の通りである。

＜DNA断片の利用＞ 本発明のDNA断片は、少なくともバシラス属に属する
好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼの構造遺伝
子領域と構造遺伝子を発現させるのに必要な領域（発現
関連領域）の２つの領域を含有する。

したがって、本発明によるDNA断片は、それが担う遺
伝情報を利用すべく、たとえばバシラス属に属する好熱
菌由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼを発現させ、該
酵素を利用してヌクレオシド類を合成したり、または本
発明のDNA断片中の発現関連領域を利用して他の外来遺
伝子を発現させるべく、分子生物学ないし遺伝子工学技
術に従って、各種の利用が可能である。

本発明によるDNA断片の利用を、本発明のDNA断片を細
菌内で複製可能なベクターに組み込んでなる組換えプラ
スミド、該組換えプラスミドを用いて形質転換させた形
質転換体および該形質変換体の利用について具体的に説
明すれば、下記の通りである。

（１）組換えプラスミド 本発明がDNA断片（１）、（２）または（３）を宿主
菌内で複製可能なベクターに組込んでなる組換えプラス
ミドにも関することは前記したところである。DNA断片
（１）〜（３）は、その一つが組込まれていても、その
二つまたは三つが組込まれていてもよい（本発明は、組
換えプラスミドに関しては、そのように解釈するものと
する）。

このような組換えプラスミドの一例は、それに必要な
宿主菌内で複製可能なベクターと共に、DNA断片取得の
観点で前記した通りであるが、本発明による組換えプラ
スミドは調製後のDNA断片をあらためて発現プラスミド
に組込んで得たものであってもよいことはいうまでもな
い。

この後者の場合は、DNA断片（１）〜（３）の末端の
制限酵素認識配列を考慮して、必要に応じて適当なリン
カーの介在ないし読み枠の調節等を行なって、発現プラ
スミドに組込めばよく、その場合の技術は既に分子生物
学において慣用されたものである。

このような組換えプラスミドによる宿主菌の形質転換
も慣用技術であって、合目的的な任意の方法によって実
施することができる。

宿主菌としては、大腸菌等のグラム陰性菌、枯草菌等
のグラム陽性菌が例示されるが、好ましいのは大腸菌で
ある。大腸菌を具体的に例示すれば、たとえば、Ｋ−12
株（たとえばＣ−600、MC1061）、等の各種菌株が使用
可能である。

（２）形質転換体およびその利用 本発明が上記のようにして得られる形質転換体を培養
してヌクレオシド・ホスホリラーゼを発現させてバシラ
ス属に属する好熱菌由来のヌクレオシド・ホスホリラー
ゼを含有する細菌菌体を含む培養物、該培養物から分離
して得られる菌体、およびその処理物にも関することは
前記したところである。

本発明によるDNA断片から上記培養物を得るには、上
述と同様に適当なプラスミドに本発明のDNA断片を導入
後、大腸菌等の宿主を形質転換させ、該形質転換体を宿
主の増殖しうる培地成分を含有する培地中で培養すれば
よい。

培養に使用する培地成分としては炭素源（グルコー
ス、フラクトース、グリセロール、シュクロースな
ど）、窒素源（塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、
硫酸アンモニウム、尿素などの無機態窒素、酵母エキ
ス、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、などの有機態
窒素）、その他の微量成分（塩化ナトリウム（食塩）、
塩化マグネシウム、塩化マンガンなどの金属塩、ビオチ
ン、ビタミンB₁₂などのビタミン類など）などを使用す
ればよい。

培養条件は、培養温度20〜40℃、pH5〜10、期間１日
〜15日間程度、の範囲内より適宜選定することができ
る。

このようにして得られたバシラス属に属する好熱菌由
来のヌクレオシド・ホスホリラーゼを含有する細菌菌体
を含む培養物は、ヌクレオシドアナログを調製するため
の酵素源として有用である。また、培養物以外にも、こ
の培養液から分離した菌体、菌体の処理物（菌体破壊
物、変性菌体、粗酵素、精製酵素、固定化酵素（菌
体））なども酵素源として有用である。これらの酵素源
は常法に従って調製することができる。たとえば、培養
菌体からのバシラス属に属する好熱菌由来のヌクレオシ
ド・ホスホリラーゼの抽出および精製は、リゾチーム
法、ガラスビーズ法、浸透圧ショック法、その他、好ま
しくはリゾチーム法、により抽出した酵素活性画分につ
いて酵素の通常の単離精製手段（たとえば塩析処理（硫
安分画など）、各種クロマトグラフィー法、各種電気泳
動法など）を適宜組み合わせて行なえばよい。また、大
腸菌由来のタンパク質を除去する目的で酵素の単離精製
の前処理として熱処理（60〜80℃で１〜10分間加熱）を
追加するとより効率的である。

＜実施例＞ 下記の実施例は、バシラス・ステアロサーモフィラス
TH6−２の染色体DNAよりDNA断片（３）を調製する方法
を示すものである。DNA（３）をPst Iで消化すればDNA
断片（１）が、EcoR Vで消化すればDNA断片（２）が、
それぞれ得られる。

本実施例における各種制限酵素、およびT4DNAリカー
ゼはすべて宝酒造（株）から入手し、酵素の反応条件は
「Molecular Cloning」（Cold Spring Harbor Laborato
ry（1982））の記載に従った。

実施例１ TH6−２株のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ
（PuNPase）およびピリミジン・ヌクレオシド・ホスホ
リラーゼ（PyNPase）活性を有するDNAのショットガン・
クローニングを下記の通りに行なった。

（イ） TH6−２株染色体DNAの取得 バシラス・ステアロサーモフィラスTH6−２株をスラ
ントから500ml容三角フラスコ中のVY培地100mlに接種し
た後、48℃で16時間振盪培養し、菌体を集めた。この菌
体を、20mMのEDTAを含む50mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.
0）50mlで洗浄し、同緩衝液20mlに懸濁させ、リゾチー
ム（シグマ社製、グレードＩ）粉体40mgとリボヌクレア
ーゼＡ（RNaseA）（シグマ社製、タイプXII−Ａ）溶液
を終濃度20μg/mlで加え、37℃に30分置いた後、10％SD
S（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液（終濃度0.5％）を加
えてよく混合し、プロテイナーゼＫ（シグマ社製、プロ
テアーゼタイプXI）溶液（終濃度100μg/ml）を加えて3
7℃で更に45分間保温した。この溶菌液に等量のフェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（25:24:
1）溶液を加えて、フェノール処理を行なった。フェノ
ール処理は、続けて２回行なった。回収した水層に２倍
容の冷エタノールを加え、析出した高分子DNAを巻き取
り法により回収し、室温エタノールで洗浄した後、1mM
のEDTAを含む10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）（以下T
E緩衝液と略す）に対して一逸透析を行なって、染色体D
NAを透析内液として得た。

なお、VY培地は次の組成のものである。

ヴイール・インフュージョン（ディフコ社製） 2.5 酵母エキス （ 〃 ） 0.5 （pH7.0、単位は％（重量／体積）、以降の培地組成中
に用いる％も同じ意味を示す。） （ロ） DNAのショットガン・クローニング 前記TH6−２株の染色体DNAを常法により（Advanced B
acterial Genetics,p226−230,Cold Spring Harbor Lab
oratory,（1980）等参照）、制限酵素Hind IIIで完全分
解した。これを10−40％蔗糖密度勾配溶液層（蔗糖はTE
緩衝液に溶解）に重層し、２万６千回転/20℃で18時間
遠心して、分画した。５〜15kbの大きさのDNA断片を含
有する画分を合わせて、TE緩衝液に対して透析した。

一方、プラスミドpBR322（宝酒造（株）製）をHind I
IIで分解後、アルカリホスファターゼ（宝酒造（株）
製、大腸菌C75株由来）処理、次いてフェノール処理し
た後、エタノールを加えて、DNAを回収した。両者のDNA
を混合し、T4DNAリガーゼにより連結した。

このDNAで、常法（Molecular Cloning,p250−251,Col
d Spring Harbor Laboratory,（1982））に従って、大
腸菌Ｋ−12株Ｃ−600（微工研菌寄第8037号）を形質転
換させた。培地は、25μg/mlのアンピシリンを含むＬ−
培地（１％バクトトリプトン（ディフコ社製）、0.5％
酵母エキス、0.5％食塩、0.1％グルコース、pH7.2）を
使用した。得られたアンピシリン耐性形質転換体を12.5
μg/mlのテトラサイクリンを含むＬ−培地にレプリカ
し、テトラサイクリン耐性を示すものはpBR322に目的の
DNA断片が挿入されていないものとして除外した。選択
された形質転換体を、滅菌楊子で誘導培地（バクトペプ
トン（ディフコ社製）1.0％、肉エキス0.7％、酵母エキ
ス0.5％、食塩0.3％、pH7.5）5mlに移して、37℃、一夜
培養した。

得られた菌体を1mlの溶菌緩衝液（5mM EDTA、0.1％
トリトンＸ−100（シグマ社製）を含む50mMトリス−塩
酸緩衝液（pH7.7））に懸濁させ、終濃度0.2mg/mlのリ
ゾチームを加えて、37℃に１時間保った。この溶菌液を
１万６千回転/3℃で10分間遠心し、上清を回収した。こ
の上清をサンプル液として、以下の活性測定を行なっ
た。

1mlの基質溶液（PuNPaseの場合0.1Mリン酸二水素カリ
ウムを含む20mMイノシン溶液（pH8.0）、PyNPaseの場合
0.1Mリン酸二水素カリウムを含む20mMウリジン溶液（pH
8.0））に10μｌのサンプル液を加え、それぞれ80℃及
び75℃で10分反応後、0.1mlの２規定塩酸水溶液を加え
て反応を停止し、遠心後、上清を希釈して、高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）法（カラム:YMC Ａ−312
（（株）山村化学研究所製、溶出剤：アセトニトリル5.
0％含有20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、検出:260n
m）により、分解された塩基の有無を調べた。約3,500株
の候補株より両酵素ともに陽性の株１株が見出された。
陽性株よりアルカリ溶菌法（Molecular Cloning,p368,C
old Spring Harbor Laboratory（1982））によりプラス
ミドを粗精製し、再度大腸菌Ｋ−12株Ｃ−600に導入し
て活性を確認後、大量の培養菌体よりアルカリ溶菌法、
エチジウムブロミドを含む塩化セシウム密度勾配遠心法
によりプラスミドを精製した。得られたプラスミドをpP
YR1と名付けた。このプラスミドは、pBR322のHind III
認識部位に12kbのDNA断片が挿入されたものであること
がわかった。その各種制限酵素に対する切断部位は、第
１図に示す通りであった。この挿入DNAがTH6−２株の染
色体DNAから、欠失や断片の再結合をともなうことな
く、そのままの形でクローニングされていることは、サ
ザン・ハイブリダイゼーション（Molecular Cloning,p3
82−389,Cold Spring Harbor Laboratory（1982））に
より確認された。なお第１図で、太線部分はTH6−２株
由来のDNAを示す。Amp^rはアンピシリン耐性遺伝子を示
し、HdはHind III、SlはSal Iを示す（その他の記号
は、前記の通りである）。実施例２ pUCプラスミドへの挿入、生成DNAのサブクローニン
グ、ならびに両酵素遺伝子のコードされる断片の限定操
作を下記の通りに行なった。

精製したpPYR1のEcoR IとSal Iで得られるTH6−２株
由来のDNA断片（約7kb）をアガロースゲル電気泳動法で
精製し、pBR322をEcoR I及びSal Iで切断してからアル
カリホスファターゼ処理したものに加え、T4DNAリガー
ゼを作用させて連結処理して、両酵素の活性を有するプ
ラスミドpPYR2（第２図）を得た。第２図中、太線はTH6
−２株由来のDNAを示し、その他の部分はpBR322由来のD
NAを示す。

更に、各種制限酵素の組み合わせによる切断によって
得られる好熱菌由来の断片をpUC119プラスミド（宝酒造
（株）製）のポリリンカー部位に挿入したプラスミドを
作成し、これらのプラスミドによって形質転換された大
腸菌より得られる溶菌液の両酵素活性を調べることによ
り、両酵素遺伝子のコードされる領域を限定した。各断
片と酵素活性との相関は、下に示す通りであった。Slは
Sal Iを示す。EI−Sl間は約7kbである。

その結果、両酵素遺伝子を含む断片として上図に示す
4.6kbのEcoR I−Sac I切断断片が限定された。また、Pu
NPase遺伝子およびPyNPase遺伝子は、それぞれ4.6kb断
片の中のEcoR VおよびSac Iで切断される2.6kbの断片内
に、EcoR IおよびPst Iで切断される2.8kbの断片内に、
コードされることが明らかとなった。

実施例３ 両酵素遺伝子を含むEcoR I−Sac I切断断片をプラス
ミドpUC119のポリリンカー部位に挿入して得られたプラ
スミドpUC119PYR2・EI−Ｓ（第３図）で大腸菌Ｋ−12株
MC1061を形質転換した。第３図中、太線はTH6−２株由
来のDNAを示し、その他の部分はpUC119由来DNAを示す。
得られた形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含む5m
lの誘導培地に接種し、37℃で16時間培養した。得られ
た菌体を0.5mg/mlのリゾチームを含む溶菌緩衝液1mlに
懸濁させて37℃に50分保った。この溶菌液を遠心して得
た上清を被験液として、PuNPase、PyNPase両酵素活性を
測定した。

また、対照としてプラスミドpUC119による大腸菌Ｋ−
12株MC1061の形質転換体を上記と同じ方法により培養お
よび溶菌して、活性を測定した。活性の測定法は、実施
例１と同一である。両形質転換体のPuNPase、PyNPase両
活性の測定結果は表１に示す通りであった。

実施例４ 粗酵素液の熱処理によるバシラス・ステアロサーモフ
ィラス由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼの選択的回
収は、下記の通りに行なった。

実施例３で得られた、pUC119PYR2・EI−Ｓで形質転換
された大腸菌Ｋ−12株MC1061の溶菌液の熱処理（50℃、
10分間）上清を更に60℃及び70℃にてそれぞれ10分処理
し、その遠心上清をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動（Nature,Vol.227,p680−685（1970））に供した。対
照として、pUC119で形質転換された大腸菌Ｋ−12株MC10
61の溶菌液の熱処理上清も同時に電気泳動に付した。な
おサンプル、対照ともに50℃熱処理上清時の蛋白質総量
は約45μｇに調製し、分析に供した。プリン・ヌクレオ
シド・ホスホリラーゼ及びピリミジン・ヌクレオシド・
ホスホリラーゼのTH6−２株からの精製標品も同時に泳
動し、両者とも0.8μｇ蛋白をゲルに乗せた。分子量マ
ーカーにはファルマシア社の低分子量マーカーを用い、
１レーン当たり総量で約30μｇを供した。その結果、TH
6−２株由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼは失活せ
ずに上清に残留するのに対して、大腸菌由来のタンパク
質は変性して沈殿部に移行することが確認できた。

なお、当然のことながら、pUC119PYR2・EI−Ｓで形質
転換した大腸菌Ｋ−12株MC1061から得られたヌクレオシ
ド・ホスホリラーゼの酵素学的性質はバシラス−ステア
ロサーモフィラスTH6−２から得られたヌクレオシド・
ホスホリラーゼと同じであって、以下の性質を示すもの
であった。

（Ａ）プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ （１）作用 プリン・ヌクレオシド＋リン酸 プリン塩基＋ペントース−１−リン酸 本発明のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼは、
上記の加リン酸分解反応を蝕媒する。従って、この酵素
は国際酵素分類のE.C.2.4.2.1に属する。

（２）基質特異性 各種のプリン・ヌクレオシドを基質に加リン酸分解反
応を行わせた結果は、表２に示す通りであった。

表２より、本発明のプリン・ヌクレオシド・ホスホリ
ラーゼは、試験した範囲内においてはイノシン、２′デ
オキシイノシン、グアノシンおよび２′−デオキシグア
ノシンに特異的である。

（３）至適pHおよびpH安定性 至適pHはpH7〜８、安定pH範囲はpH5〜９である（第４
図参照）。

（４）至適温度および温度安定性 至適温度は60〜80℃、安定温度範囲60℃までである
（第５図参照）。

（５）分子量 SDS−ポアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した分
子量は、約31000である。

（６）力価（比活性） 80％の酵素の精製度合で比活性は400（U/mg）以上を
示し、90％の酵素の精製度合で450（U/mg）を示す。

（Ｂ）ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ （１）作用 ピリミジン・ヌクレオシド＋リン酸 ピリミジン塩基＋ペントース−１−リン酸 本発明のピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ
は、上記の加リン酸分解反応を蝕媒する。従って、この
酵素は国際酵素分類のE.C.2.4.2.2に属する。

（２）基質特異性 各種のピリミジン・ヌクレオシドを基質に加リン酸分
解反応を行わせた結果は、表３に示す通りであった。

表３より、本発明のピリミジン・ヌクレオシド・ホス
ホリラーゼは、試験した範囲内においてはウリジン、
２′デオキシウリジン、リボフラノシルチミン、チミジ
ンに特異的である。

（３）至適pHおよびpH安定性 至適pHはpH7〜９、安定pH範囲はpH5〜９である（第６
図参照）。

（４）至適温度および温度安定性 至適温度は60〜70℃、安定温度範囲60℃までである
（第７図参照）。

（５）分子量 SDS−ポアクリルアミド電気泳動法で測定した分子量
は、約45000である。

（６）力価（比活性） 80％の酵素の精製度合で比活性は250（U/mg）以上を
示し、90％の酵素の精製度合で297（U/mg）を示す。

なお、上記の酵素的性質は以下の示す方法で測定した
ものである。

力価の測定 プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性 基質溶液（20mMイノシンおよび0.1Mリン酸二水素カリ
ウムを含有するpH8.0の水溶液）1.0mlに酵素溶液（精製
酵素として１μｇを含有する50mM酢酸緩衝液（pH6.0）2
0μｌを加えて50℃で10分間反応させた後、塩酸を最終
濃度で0.1Nになるように加えて反応停止させるとともに
０℃で10分間冷却する。次に、反応液を遠心分離し、得
られた上清をHPLC法（カラム:YMC Ａ−312（（株）山
村化学研究所製）、溶出剤：アセトニトリル5.0％含有2
0mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、検出:260nm）で生成
するヒポキサンチンを定量する。１分間に１μmolのヒ
ポキサンチンを生成する酵素量を１単位（「Ｕ」）とす
る。

ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性 基質溶液中のイノシンの代わりにウリジンを使用し、
HPLC法でウラシルを定量する以外は上記のプリン・ヌク
レオシド・ホスホリラーゼ活性の測定法と同様にして行
う。１分間に１μmolのウラシルを生成する酵素量を１
単位とする。

基質特異性 基質溶液として10mMの各種ヌクレオシドおよび50mMの
リン酸二水素カリウムを含有するpH8.0の水溶液を使用
し、50℃で10分間反応させ、反応後、HPLC法で各種ヌク
レオシドの塩基を定量する以外はプリン・ヌクレオシド
・ホスホリラーゼ活性の測定法と同様にして行う。

至適pH ヌクレオシド（20mMのイノシンまたはウリジン）およ
び0.1Mのリン酸二水素カリウムを溶解させ、希塩酸また
は希水酸化ナトリウムの各水溶液でpH4〜10に調整した
基質溶液を使用した以外はプリン・ヌクレオシド・ホス
ホリラーゼ活性の測定法と同様にして行う。

安定pH 0.2Mの酢酸緩衝液（pH3.5〜６）およびトリス−塩酸
緩衝液（pH7〜９）中で37℃で16時間保持した酵素溶液
を使用した以外は、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼ活性またはピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼ活性の測定法と同様にして行う。

至適温度 反応を30〜80℃の各温度で行う以外はプリン・ヌクレ
オシド・ホスホリラーゼ活性またはピリミジン・ヌクレ
オシド・ホスホリラーゼ活性の測定法と同様して行う。

安定温度範囲 30〜80℃で15分間加熱した酵素溶液を使用する以外
は、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性または
ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性の測定
法と同様にして行う。

＜微生物の寄託＞ プラスミドpUC119にDNA断片（３）を組込んでなる組
換えプラスミドpUCPYR2・EI−Ｓを保持する大腸菌Ｋ−1
2株MC1061は、エシェリシア・コリ（Escherichia col
i）KY−２（pUC119PYR2・EI−Ｓ）という名称で平成２
年１月16日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れて、微工研菌寄第11197号の受託番号を得ている。な
お、寄託された微生物の菌学的性質はバシラス・ステア
ロサーモフィラス由来のヌクレオシド・ホスホリラーゼ
を含有している点を除けば大腸菌Ｋ−12株MC1061と同じ
であって、この形質転換株は大腸菌に分類される。

バシラス・ステアロサーモフィラスTH6−２は、平成
元年２月４日に同様に寄託されて、微工研条寄第2758号
の受託番号を得ている。また、大腸菌Ｋ−12株C600は、
昭和60年１月７日に同様に寄託されて、微工研菌寄第80
37号の受託番号を得ている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドpPYR1の制限酵素地図を示す説明
図である。 第２図は、プラスミドpPYR2の制限酵素地図を示す説明
図である。 第３図は、プラスミドpUC119PYR2・EI−Ｓ制限酵素地図
を示す説明図である。 第４図は、本発明のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼの至適pHおよび安定pH範囲を示したものである。 第５図は、本発明のプリン・ヌクレオシド・ホスホリラ
ーゼの至適温度および安定温度範囲を示したものであ
る。 第６図は、本発明のピリミジン・ヌクレオシド・ホスホ
リラーゼの至適pHおよび安定pH範囲を示したものであ
る。 第７図は、本発明のピリミジン・ヌクレオシド・ホスホ
リラーゼの至適温度および安定温度範囲を示したもので
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】バシラス・ステアロサーモフィラスTH6−
   ２（FERM BP−2758）由来の下記（Ａ）の制限酵素地図
   の（１）で示される大きさが約2.8kbであるDNA断片を使
   用し、該断片を微生物内で複製可能なベクターに組み込
   んだ組換えプラスミドを調製し、該組換えプラスミドに
   より形質転換した形質転換体を培養して、下記（Ｂ）で
   表されるピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼを
   調製する方法。 （ここで、EIは制限酵素EcoR I認識部位を、EVは制限酵
   素EcoR V認識部位を、Psは制限酵素Pst I認識部位を、S
   pは制限酵素Sph I認識部位を、Pvは制限酵素Pvu II認識
   部位を、Scは制限酵素Sac I認識部位を、それぞれ示
   す。） （Ｂ） ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ 作用： ピリミジンヌクレオシド＋リン酸 ピリミジン塩基＋ペントース−１−リン酸 基質特異性： ウリジン、２′−デオキシウリジン、リボフラノシルチ
   ミン、チミジンに特異的である。 至適温度および温度安定性： 至適温度は60〜70℃、安定温度範囲は60℃までである。 至適pHおよびpH安定性： 至適pHは７〜９、安定pH範囲は５〜９である。 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）： 約45000
2. 【請求項２】バシラス・ステアロサーモフィラスTH6−
   ２（FERM BP−2758）由来の下記（Ａ）の制限酵素地図
   の（２）で示される大きさが約2.6kbであるDNA断片を使
   用し、該断片を微生物内で複製可能なベクターに組み込
   んだ組換えプラスミドを調製し、該組換えプラスミドに
   より形質転換した形質転換体を培養して、下記（Ｂ）で
   表されるプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼを調製
   する方法。 （ここで、EIは制限酵素EcoR I認識部位を、EVは制限酵
   素EcoR V認識部位を、Psは制限酵素Pst I認識部位を、S
   pは制限酵素Sph I認識部位を、Pvは制限酵素Pvu II認識
   部位を、Scは制限酵素Sac I認識部位を、それぞれ示
   す。） （Ｂ） プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ 作用： プリンヌクレオシド＋リン酸 プリン塩基＋ペントース−１−リン酸 基質特異性： イノシン、２′−デオキシイノシン、グアノシン、２′
   −デオキシグアノシンに特異的である。 至適温度および温度安定性： 至適温度は60〜80℃、安定温度範囲は60℃までである。 至適pHおよびpH安定性： 至適pHは７〜８、安定pH範囲は５〜９である。 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）： 約31000
3. 【請求項３】バシラス・ステアロサーモフィラスTH6−
   ２（FERM BP−2758）由来の下記（Ａ）の制限酵素地図
   の（３）で示される大きさが約4.6kbであるDNA断片を使
   用し、該断片を微生物内で複製可能なベクターに組み込
   んだ組換えプラスミドを調製し、該組換えプラスミドに
   より形質転換した形質転換体を培養して、下記（Ｂ）で
   表されるピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼお
   よびプリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼを調製する
   方法。 （ここで、EIは制限酵素EcoR I認識部位を、EVは制限酵
   素EcoR V認識部位を、Psは制限酵素Pst I認識部位を、S
   pは制限酵素Sph I認識部位を、Pvは制限酵素Pvu II認識
   部位を、Scは制限酵素Sac I認識部位を、それぞれ示
   す。） （Ｂ） ピリミジン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ 作用： ピリミジンヌクレオシド＋リン酸 ピリミジン塩基＋ペントース−１−リン酸 基質特異性： ウリジン、２′−デオキシウリジン、リボフラノシルチ
   ミン、チミジンに特異的である。 至適温度および温度安定性： 至適温度は60〜70℃、安定温度範囲は60℃までである。 至適pHおよびpH安定性： 至適pHは７〜９、安定pH範囲は５〜９である。 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）： 約45000 プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ 作用： プリンヌクレオシド＋リン酸 プリン塩基＋ペントース−１−リン酸 基質特異性： イノシン、２′−デオキシイノシン、グアノシン、２′
   −デオキシグアノシンに特異的である。 至適温度および温度安定性： 至適温度は60〜80℃、安定温度範囲は60℃までである。 至適pHおよびpH安定性： 至適pHは７〜８、安定pH範囲は５〜９である。 分子量（SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）： 約31000