JPS647760B2 - - Google Patents
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- JPS647760B2 JPS647760B2 JP56064369A JP6436981A JPS647760B2 JP S647760 B2 JPS647760 B2 JP S647760B2 JP 56064369 A JP56064369 A JP 56064369A JP 6436981 A JP6436981 A JP 6436981A JP S647760 B2 JPS647760 B2 JP S647760B2
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- plasmid
- patm2
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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- Genetics & Genomics (AREA)
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- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
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- Microbiology (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
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- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は新規プラスミド（plasmid）に関す
る。 最近、微生物を用いるDNA（デオキシリボ核
酸）組換え実験が盛んになり、大腸菌をはじめと
する細菌を中心にして、これに導入することがで
きる有用なベクター（vector）の開発が広く行な
われている。一方、放線菌は抗生物質や生理活性
物質の生産に関して、多種多様な能力を有するこ
とから、醗酵工業の分野では古くから重要視され
てきている。にもかかわらず、放線菌の育種の手
法はきわめて限られており、それに要する時間と
労力は研究をすすめる上で大きな障害となつてい
る。したがつて、放線菌の育種改良の手段の一つ
としてDNA組み換え実験を可能とする宿主−ベ
クター系の確立が望まで、いくつかのプラスミド
の発見とそのベクターとしての利用が試みられて
きた。しかし、これらの試みもすべてストレプト
マイセス（Streptomyces）属に属する菌を利用
して行なわれてきたにすぎない。 本発明者らは、化学療法剤として有用な抗生物
質、たとえばアミノ配糖体系抗生物質やマクロラ
イド系抗生物質を生産するミクロモノスポラ属菌
におけるDNA組み換え技術を開発すべく探索研
究を行なつたところ、該属菌から新規プラスミド
が得られることを知り、これに基づいてさらに研
究した結果、本発明を完成した。 本発明は、(1)約4.87±0.05メガダルトンの分子
量を有し、制限酵素切断地図 によつて特徴づけられるプラスミドpATM2（以
下、「pATM2」と略称することもある。）（該地
図はpATM2の分子量を4.9メガダルトンとして表
わされている）である。 本発明において用いられるミクロモノスポラ属
に属しプラスミドを有する微生物としては、たと
えばミクロモノスポラ・シルリア
（Micromonospora coerulea）が挙げられ、具体
的にはミクロモノスポラ・シルリアIFO13504
（ATCC27008）が挙げられる。この微生物は、財
団法人発酵研究所発行のリスト・オブ・カルチヤ
ーズ（Institute for Fermentation Osaka List
of Cultures 1978、Sixth Edition）に収載され、
該研究所から入手することができ、また、ジ・ア
メリカン・タイプ・カルチヤー・クレクシヨン
（The American Type Culture Collection）
（米国）発行のカタログ・オブ・ストレインズ
（The American Type Culture Collection
Catalogue of Strains 、Fourteenth Edition
1980）に収載され、該コレクシヨンから入手する
ことができる。 本発明に使用される培地としては、本発明の微
生物が生育して、その菌体内にプラスミドを保持
しうるものであればいかなるものであつてもよ
い。該培地に含有される炭素源としては、たとえ
ばグルコース、シユークロース、グリセリン、で
ん粉、デキストリン、糖蜜、有機酸などが用いら
れる。該培地に含有される窒素源としては、ペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸〔デイ
フコ社（米国）製〕、NZ−アミンＡ〔シエフイー
ルド社（米国）製〕、ソルビーンミール、落花生
粉などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源
が用いられる。その他、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、
マンガン塩、鉄塩、コバルト塩などの無機塩が必
要に応じて培地に添加される。さらに、栄養要求
を示す菌株を用いる場合には、その生育に必要な
栄養物質を培地に添加すればよい。該栄養物質と
しては、たとえば、アミノ酸類、ビタミン類、核
酸塩基類などが挙げられる。 さらに必要により、消泡剤（例、大豆油、ラー
ド油など）などを培地に加えてもよい。 また、培養に際して必要があれば、培地に抗生
物質たとえばクロラムフエニコールが加えられ
る。 培養温度は、通常約15℃ないし42℃、さらに好
ましくは約24℃ないし35℃であり、培地のPHは初
発PHが約6.0ないし8.0でありさらに好ましくは約
6.5なし7.5である。培養時間は、通常約２ないし
８日、さらに好ましくは約２ないし４日である。 次に、上記培養によつて生育された菌体を集
め、溶菌し、溶菌物からプラスミドを単離する。
菌体を集める方法は、自体公知の方法に従えばよ
く、たとえば、遠心分離、過などの方法が挙げ
られる。 ミクロモノスポラ属菌の溶菌方法としては、た
とえば、溶菌酵素（例、リゾチーム）を用いる方
法があげられる。なお必要があれば溶菌酵素のほ
かに、プロテアーゼなどの酵素類やザルコシー
ル、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を
加えたり、凍結融解をほどこしたりして溶菌を容
易にすることができる。 つぎに、このようにして得られた溶菌物から、
プラスミドを単離するにはそれ自体公知の方法に
従えばよく、たとえばエタノールを用いるDNA
の沈殿法、エチジウムブロマイドを含む、塩化セ
シウム密度勾配遠心法、シヨ糖密度勾配遠心法、
アフイニテイークロマトグラフイー、ヒドロキシ
ルアパタイトクロマトグラフイー、ゲル電気泳動
法、セロフアン膜などを用いる透析処理法などを
適宜組み合わせてプラスミドを単離することがで
きる。 後述の実施例１で得られたpATM2は、種々の
制限酵素による切断部位を有している。pATM2
の制限酵素切断地図を以下に示す。 上記の制限酵素切断地図は、pATM2の分子量
を4.9メガダルトンとして作製されており、各種
の制限酵素による切断個所は地図上のEcoRに
よる切断個所（０／4.9）を基にして定められて
いる。 pATM2は各種制限酵素に対して次の感受性を
有している。
る。 最近、微生物を用いるDNA（デオキシリボ核
酸）組換え実験が盛んになり、大腸菌をはじめと
する細菌を中心にして、これに導入することがで
きる有用なベクター（vector）の開発が広く行な
われている。一方、放線菌は抗生物質や生理活性
物質の生産に関して、多種多様な能力を有するこ
とから、醗酵工業の分野では古くから重要視され
てきている。にもかかわらず、放線菌の育種の手
法はきわめて限られており、それに要する時間と
労力は研究をすすめる上で大きな障害となつてい
る。したがつて、放線菌の育種改良の手段の一つ
としてDNA組み換え実験を可能とする宿主−ベ
クター系の確立が望まで、いくつかのプラスミド
の発見とそのベクターとしての利用が試みられて
きた。しかし、これらの試みもすべてストレプト
マイセス（Streptomyces）属に属する菌を利用
して行なわれてきたにすぎない。 本発明者らは、化学療法剤として有用な抗生物
質、たとえばアミノ配糖体系抗生物質やマクロラ
イド系抗生物質を生産するミクロモノスポラ属菌
におけるDNA組み換え技術を開発すべく探索研
究を行なつたところ、該属菌から新規プラスミド
が得られることを知り、これに基づいてさらに研
究した結果、本発明を完成した。 本発明は、(1)約4.87±0.05メガダルトンの分子
量を有し、制限酵素切断地図 によつて特徴づけられるプラスミドpATM2（以
下、「pATM2」と略称することもある。）（該地
図はpATM2の分子量を4.9メガダルトンとして表
わされている）である。 本発明において用いられるミクロモノスポラ属
に属しプラスミドを有する微生物としては、たと
えばミクロモノスポラ・シルリア
（Micromonospora coerulea）が挙げられ、具体
的にはミクロモノスポラ・シルリアIFO13504
（ATCC27008）が挙げられる。この微生物は、財
団法人発酵研究所発行のリスト・オブ・カルチヤ
ーズ（Institute for Fermentation Osaka List
of Cultures 1978、Sixth Edition）に収載され、
該研究所から入手することができ、また、ジ・ア
メリカン・タイプ・カルチヤー・クレクシヨン
（The American Type Culture Collection）
（米国）発行のカタログ・オブ・ストレインズ
（The American Type Culture Collection
Catalogue of Strains 、Fourteenth Edition
1980）に収載され、該コレクシヨンから入手する
ことができる。 本発明に使用される培地としては、本発明の微
生物が生育して、その菌体内にプラスミドを保持
しうるものであればいかなるものであつてもよ
い。該培地に含有される炭素源としては、たとえ
ばグルコース、シユークロース、グリセリン、で
ん粉、デキストリン、糖蜜、有機酸などが用いら
れる。該培地に含有される窒素源としては、ペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸〔デイ
フコ社（米国）製〕、NZ−アミンＡ〔シエフイー
ルド社（米国）製〕、ソルビーンミール、落花生
粉などの有機窒素源、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源
が用いられる。その他、カルシウム塩、マグネシ
ウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、
マンガン塩、鉄塩、コバルト塩などの無機塩が必
要に応じて培地に添加される。さらに、栄養要求
を示す菌株を用いる場合には、その生育に必要な
栄養物質を培地に添加すればよい。該栄養物質と
しては、たとえば、アミノ酸類、ビタミン類、核
酸塩基類などが挙げられる。 さらに必要により、消泡剤（例、大豆油、ラー
ド油など）などを培地に加えてもよい。 また、培養に際して必要があれば、培地に抗生
物質たとえばクロラムフエニコールが加えられ
る。 培養温度は、通常約15℃ないし42℃、さらに好
ましくは約24℃ないし35℃であり、培地のPHは初
発PHが約6.0ないし8.0でありさらに好ましくは約
6.5なし7.5である。培養時間は、通常約２ないし
８日、さらに好ましくは約２ないし４日である。 次に、上記培養によつて生育された菌体を集
め、溶菌し、溶菌物からプラスミドを単離する。
菌体を集める方法は、自体公知の方法に従えばよ
く、たとえば、遠心分離、過などの方法が挙げ
られる。 ミクロモノスポラ属菌の溶菌方法としては、た
とえば、溶菌酵素（例、リゾチーム）を用いる方
法があげられる。なお必要があれば溶菌酵素のほ
かに、プロテアーゼなどの酵素類やザルコシー
ル、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤を
加えたり、凍結融解をほどこしたりして溶菌を容
易にすることができる。 つぎに、このようにして得られた溶菌物から、
プラスミドを単離するにはそれ自体公知の方法に
従えばよく、たとえばエタノールを用いるDNA
の沈殿法、エチジウムブロマイドを含む、塩化セ
シウム密度勾配遠心法、シヨ糖密度勾配遠心法、
アフイニテイークロマトグラフイー、ヒドロキシ
ルアパタイトクロマトグラフイー、ゲル電気泳動
法、セロフアン膜などを用いる透析処理法などを
適宜組み合わせてプラスミドを単離することがで
きる。 後述の実施例１で得られたpATM2は、種々の
制限酵素による切断部位を有している。pATM2
の制限酵素切断地図を以下に示す。 上記の制限酵素切断地図は、pATM2の分子量
を4.9メガダルトンとして作製されており、各種
の制限酵素による切断個所は地図上のEcoRに
よる切断個所（０／4.9）を基にして定められて
いる。 pATM2は各種制限酵素に対して次の感受性を
有している。
【表】
これらの結果は過剰の制限酵素を
pATM2DNAに反応させて得られたものである。
切断個所の数は1.2％（ｗ／ｖ）または1.5％
（ｗ／ｖ）のいずれかのアガロースゲル電気泳動
で分離可能な断片の数から決定されたものを示
す。 用いた制限酵素の略称は、次の通りである。 (1) EcoRは、エシエリキア・コリRY13（R1）
（Escherichia coli）から得られた酵素である。 (2) Bglは、バシラス・グロビギー（Bacillus
globigii）から得られた酵素である。 (3) BamHは、バシラス・アミロリクエフア
シエンスＨ（Bacillus amyloliquefaciens）か
ら得られた酵素である。 (4) Hindは、ヘモフイルス・インフルエンザ
Rd（Haemophilus influenzae）から得られた
酵素である。 (5) Kpnは、クレブシエラ・ニユーモニア
OK8（Klebsiella pneumoniae）から得られた
酵素である。 (6) Smaは、セラチア・マルセツセンスSb
（Serratia marcescens）から得られた酵素で
ある。 (7) Xhoは、キサントモナス・ホルシコーラ
（Xanthomonas holcicola）から得られた酵素
である。 (8) Salは、ストレプトミセス・アルブスＧ
（Streptomyces albus）から得られた酵素であ
る。 上記(1)〜(8)の制限酵素は、宝酒造株式会社、ニ
ユーイングランド・バイオラブズ社（New
England Biolabs、Inc.）（米国）から入手する
ことができる。 pATM2の分子量は、電子顕微鏡観察による方
法、制限酵素消化及びアガロースゲル電気泳動に
よる方法など自体公知の方法により決定すること
ができる。 本発明により得られたプラスミドは、種々の制
限酵素による切断部位を有しており、この事実は
このプラスミドを修飾して多くの有用なベクター
を開発できることを示している。またこのプラス
ミドあるいはその誘導体に目的とする遺伝子をく
みこみ、これを適当な宿主微生物に導入して、宿
主を形質転換させることも可能である。とりわ
け、本発明のプラスミドは、放線菌など醗酵工業
上重要な微生物に対し、ベクターとして有利に利
用できる。すなわち、放線菌からの遺伝情報を本
発明のプラスミドを用いてクローン化し、これを
目的とする微生物に導することによりたとえば、
放線菌による抗生物質、生理活性物質、酵素など
の二次代謝産物の産生の増大をもたらすことがで
きる。 さらに、本発明のプラスミドは微生物遺伝子の
みならず、高等動植物の遺伝子（たとえば、ソマ
トスタチン、インスリンなどをコードする遺伝子
や窒素固定に関与する遺伝子）をクローニングす
るためのベクターとしても利用可能である。 上記使用において、目的とする遺伝子を含む組
み換えプラスミドの作製方法それ自体は公知であ
る。たとえば、サイエンテイフイツク・アメリカ
ン（Scientific American）1975年第233巻No.１第
24〜33頁に記載されている。 また、得られた組み換えプラスミドを宿主へ移
入する方法それ自体も公知であり、たとえば放線
菌を宿主として用いる場合については、ネイチヤ
ー（Nature）第274巻第398〜400頁（1978年）に
記載されている。 また、本発明のプラスミドをベクターとして用
い、目的とする物質の生合成に必要な遺伝子を組
み込んだプラスミドを導入された宿主微生物を自
体公知の方法で培養して、目的とする物質を培地
中あるいは菌体内に生成蓄積させ、その培養物か
ら目的とする物質を分離精製することにより、目
的とする物質を製造できる。 本発明のプラスミドは、放線菌のプラスミドで
あるから、放線菌を宿主とする系に用いることが
できるばかりではなく、他のグラム陽性菌、たと
えばバシラス（Bacillus）、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム
（Brevibacterium）などの細菌のベクターとして
も使用できる可能性がある。 次に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明
するが、本発明はこれに限定されるべきものでは
ない。なお、パーセント（％）はとくにことわり
のないかぎり、重量／容量パーセント（ｗ／ｖ
％）を表わす。 実施例 １ ミクロモノスポラ シルリア
（Micromonospora coerulea）IFO13504から
のプラスミドpATM2の単離。 バクトイーストエキス〔デイフコ社製（米国）〕
0.4％、バクトマルトエキス〔デイフコ社製（米
国）〕１％、グルコース0.4％、からなる液体培地
（PH7.3）10mlを大型試験管（20mmφ×245mm）に
分注後滅菌し、これにミクロモノスポラ・シルリ
アIFO13504を接種して28℃で６日間振とう培養
した。この培養物の全量を、400mlの前記と同様
の組成の培地を２の坂口フラスコに分注して予
め滅菌したものに移植して、28℃で３日間往復振
とう機上で培養した。培養物を8000回転で10分間
遠心して菌体を集め、これをTES緩衝液〔30ｍ
Ｍトリスアミノメタン、５ｍＭ EDTA（エチレ
ンジアミンテトラアセテート）および50ｍＭ
NaCl：PH8.0〕で２回洗浄して15.7ｇの湿菌体を
得た。この菌体をTES緩衝液にけん濁したのち
均一化し、OD600が0.9になるようにTES緩衝液
で調整した。これに240mlの25％シユークロース
液（TES緩衝液にとかしたもの）、40mlの0.25M
EDTA液（PH8.0）、80mlのリゾチーム液（生化学
工業製、上記25％シユークロース液にリゾチーム
の濃度が５mg／mlになるよう溶解したもの）、お
よび８mlのRNaseA−１液（シグマ社製、予め
100℃で10分熱処理したもの。RNaseA−１の濃
度５mg／ml）を加えてよく混合させた。これを37
℃に保ち、ときどきゆるく撹拌しながら１時間反
応させた。この反応液に10％ザルコシール液（和
光純薬製。ソジウム−Ｎ−ラウロイルザルコシネ
イトをTES緩衝液にとかしたもの）を加えて混
合液、さらに１時間保温した。これに40mlのプロ
ナーゼＰ液（科研化学工業製。予め37℃で30分自
己消化したもの。プロナーゼＰ濃度５mg／ml）を
加えてさらに37℃で１時間反応させた。反応終了
後、64mlの10％SDS液（和光純薬製、ソジウム・
ドデシル・サルフエイトを水にとかしたもの）お
よび136mlの5M NaClを加えてよく混合し、０℃
に一夜放置した。この溶液を10000回転で40分遠
心して上清を進め、上清の２倍量の冷却エタノー
ルを加えて−20℃に一夜放置したのち、10000回
転で30分遠心して沈殿を集めた。残存するエタノ
ールを完全に除去したのち、40mlの0.4％ザルコ
シール液（TES緩衝液に溶解したもの）に沈殿
を溶解させた。得られた溶液に固体のセシウムク
ロライドおよび1.5mlのエチジウムブロマイド溶
液（ジメチルスルフオキサイドに30mg／mlになる
よう溶したもの）をくわえて密度を1600となるよ
うに、ベツクマン製超遠心機（米国）で20℃、
38000回転で40時間遠心した。遠心後プラスミド
バンドは、紫外線下（302nｍ）で蛍光バンドと
して検出された。このバンドを分画して集め、再
度同一条件下で超遠心を行ないプラスミド画分を
得た。このプラスミド画分にこれと等量のｎ−ブ
タノールを加えてゆつくり混合させながらエチジ
ウムブロマイドを抽出して除去した。ここに得ら
れた水層を多量の0.1×SSC＋１ｍＭ EDTA（15
ｍＭ NaCl、1.5ｍＭクエン酸ナトリウム・２水
塩、１ｍＭ EDTA、PH・7.4）に対して３回透
析を行ない、DNAとして64μｇのpATM2を得
た。 DNA分子の電子顕微鏡観察の結果、pBR322
を標準として、pATM2の平均外形の長さから対
応する分子量を求めた〔Method in
Enzymology 12巻Part Ｂ第361〜377頁、1968年
アカデミツクプレス、ニユーヨーク（米国）参
照〕ところ、数十回の観察で、4.87±0.05の範囲
内にありその平均値は4.87メガダルトンであつ
た。また各種制限酵素によつてpATM2を単一消
化、二重消化、あるいは三重消化して得られた
DNA断片をアガロースゲル電気泳動にかけ、そ
の移動度から分子量を算出した（Journal of
Virology14巻1235〜1244頁1974年参照）ところ、
十数回の検索で、4.87±0.05の範囲内にありその
平均値は4.85メガダルトンであつた。この場合、
酵素はすべて宝酒造製を使用し、反応はすべて供
給者によつて定められた条件にしたがつた。ま
た、分子量は、λDNAをHindで分解して得ら
れた断片の標準移動度のパターンを基にして決定
した（Journal of Molecular Biology98巻551〜
564頁1975年参照）。
pATM2DNAに反応させて得られたものである。
切断個所の数は1.2％（ｗ／ｖ）または1.5％
（ｗ／ｖ）のいずれかのアガロースゲル電気泳動
で分離可能な断片の数から決定されたものを示
す。 用いた制限酵素の略称は、次の通りである。 (1) EcoRは、エシエリキア・コリRY13（R1）
（Escherichia coli）から得られた酵素である。 (2) Bglは、バシラス・グロビギー（Bacillus
globigii）から得られた酵素である。 (3) BamHは、バシラス・アミロリクエフア
シエンスＨ（Bacillus amyloliquefaciens）か
ら得られた酵素である。 (4) Hindは、ヘモフイルス・インフルエンザ
Rd（Haemophilus influenzae）から得られた
酵素である。 (5) Kpnは、クレブシエラ・ニユーモニア
OK8（Klebsiella pneumoniae）から得られた
酵素である。 (6) Smaは、セラチア・マルセツセンスSb
（Serratia marcescens）から得られた酵素で
ある。 (7) Xhoは、キサントモナス・ホルシコーラ
（Xanthomonas holcicola）から得られた酵素
である。 (8) Salは、ストレプトミセス・アルブスＧ
（Streptomyces albus）から得られた酵素であ
る。 上記(1)〜(8)の制限酵素は、宝酒造株式会社、ニ
ユーイングランド・バイオラブズ社（New
England Biolabs、Inc.）（米国）から入手する
ことができる。 pATM2の分子量は、電子顕微鏡観察による方
法、制限酵素消化及びアガロースゲル電気泳動に
よる方法など自体公知の方法により決定すること
ができる。 本発明により得られたプラスミドは、種々の制
限酵素による切断部位を有しており、この事実は
このプラスミドを修飾して多くの有用なベクター
を開発できることを示している。またこのプラス
ミドあるいはその誘導体に目的とする遺伝子をく
みこみ、これを適当な宿主微生物に導入して、宿
主を形質転換させることも可能である。とりわ
け、本発明のプラスミドは、放線菌など醗酵工業
上重要な微生物に対し、ベクターとして有利に利
用できる。すなわち、放線菌からの遺伝情報を本
発明のプラスミドを用いてクローン化し、これを
目的とする微生物に導することによりたとえば、
放線菌による抗生物質、生理活性物質、酵素など
の二次代謝産物の産生の増大をもたらすことがで
きる。 さらに、本発明のプラスミドは微生物遺伝子の
みならず、高等動植物の遺伝子（たとえば、ソマ
トスタチン、インスリンなどをコードする遺伝子
や窒素固定に関与する遺伝子）をクローニングす
るためのベクターとしても利用可能である。 上記使用において、目的とする遺伝子を含む組
み換えプラスミドの作製方法それ自体は公知であ
る。たとえば、サイエンテイフイツク・アメリカ
ン（Scientific American）1975年第233巻No.１第
24〜33頁に記載されている。 また、得られた組み換えプラスミドを宿主へ移
入する方法それ自体も公知であり、たとえば放線
菌を宿主として用いる場合については、ネイチヤ
ー（Nature）第274巻第398〜400頁（1978年）に
記載されている。 また、本発明のプラスミドをベクターとして用
い、目的とする物質の生合成に必要な遺伝子を組
み込んだプラスミドを導入された宿主微生物を自
体公知の方法で培養して、目的とする物質を培地
中あるいは菌体内に生成蓄積させ、その培養物か
ら目的とする物質を分離精製することにより、目
的とする物質を製造できる。 本発明のプラスミドは、放線菌のプラスミドで
あるから、放線菌を宿主とする系に用いることが
できるばかりではなく、他のグラム陽性菌、たと
えばバシラス（Bacillus）、コリネバクテリウム
（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム
（Brevibacterium）などの細菌のベクターとして
も使用できる可能性がある。 次に実施例をあげて本発明をさらに詳しく説明
するが、本発明はこれに限定されるべきものでは
ない。なお、パーセント（％）はとくにことわり
のないかぎり、重量／容量パーセント（ｗ／ｖ
％）を表わす。 実施例 １ ミクロモノスポラ シルリア
（Micromonospora coerulea）IFO13504から
のプラスミドpATM2の単離。 バクトイーストエキス〔デイフコ社製（米国）〕
0.4％、バクトマルトエキス〔デイフコ社製（米
国）〕１％、グルコース0.4％、からなる液体培地
（PH7.3）10mlを大型試験管（20mmφ×245mm）に
分注後滅菌し、これにミクロモノスポラ・シルリ
アIFO13504を接種して28℃で６日間振とう培養
した。この培養物の全量を、400mlの前記と同様
の組成の培地を２の坂口フラスコに分注して予
め滅菌したものに移植して、28℃で３日間往復振
とう機上で培養した。培養物を8000回転で10分間
遠心して菌体を集め、これをTES緩衝液〔30ｍ
Ｍトリスアミノメタン、５ｍＭ EDTA（エチレ
ンジアミンテトラアセテート）および50ｍＭ
NaCl：PH8.0〕で２回洗浄して15.7ｇの湿菌体を
得た。この菌体をTES緩衝液にけん濁したのち
均一化し、OD600が0.9になるようにTES緩衝液
で調整した。これに240mlの25％シユークロース
液（TES緩衝液にとかしたもの）、40mlの0.25M
EDTA液（PH8.0）、80mlのリゾチーム液（生化学
工業製、上記25％シユークロース液にリゾチーム
の濃度が５mg／mlになるよう溶解したもの）、お
よび８mlのRNaseA−１液（シグマ社製、予め
100℃で10分熱処理したもの。RNaseA−１の濃
度５mg／ml）を加えてよく混合させた。これを37
℃に保ち、ときどきゆるく撹拌しながら１時間反
応させた。この反応液に10％ザルコシール液（和
光純薬製。ソジウム−Ｎ−ラウロイルザルコシネ
イトをTES緩衝液にとかしたもの）を加えて混
合液、さらに１時間保温した。これに40mlのプロ
ナーゼＰ液（科研化学工業製。予め37℃で30分自
己消化したもの。プロナーゼＰ濃度５mg／ml）を
加えてさらに37℃で１時間反応させた。反応終了
後、64mlの10％SDS液（和光純薬製、ソジウム・
ドデシル・サルフエイトを水にとかしたもの）お
よび136mlの5M NaClを加えてよく混合し、０℃
に一夜放置した。この溶液を10000回転で40分遠
心して上清を進め、上清の２倍量の冷却エタノー
ルを加えて−20℃に一夜放置したのち、10000回
転で30分遠心して沈殿を集めた。残存するエタノ
ールを完全に除去したのち、40mlの0.4％ザルコ
シール液（TES緩衝液に溶解したもの）に沈殿
を溶解させた。得られた溶液に固体のセシウムク
ロライドおよび1.5mlのエチジウムブロマイド溶
液（ジメチルスルフオキサイドに30mg／mlになる
よう溶したもの）をくわえて密度を1600となるよ
うに、ベツクマン製超遠心機（米国）で20℃、
38000回転で40時間遠心した。遠心後プラスミド
バンドは、紫外線下（302nｍ）で蛍光バンドと
して検出された。このバンドを分画して集め、再
度同一条件下で超遠心を行ないプラスミド画分を
得た。このプラスミド画分にこれと等量のｎ−ブ
タノールを加えてゆつくり混合させながらエチジ
ウムブロマイドを抽出して除去した。ここに得ら
れた水層を多量の0.1×SSC＋１ｍＭ EDTA（15
ｍＭ NaCl、1.5ｍＭクエン酸ナトリウム・２水
塩、１ｍＭ EDTA、PH・7.4）に対して３回透
析を行ない、DNAとして64μｇのpATM2を得
た。 DNA分子の電子顕微鏡観察の結果、pBR322
を標準として、pATM2の平均外形の長さから対
応する分子量を求めた〔Method in
Enzymology 12巻Part Ｂ第361〜377頁、1968年
アカデミツクプレス、ニユーヨーク（米国）参
照〕ところ、数十回の観察で、4.87±0.05の範囲
内にありその平均値は4.87メガダルトンであつ
た。また各種制限酵素によつてpATM2を単一消
化、二重消化、あるいは三重消化して得られた
DNA断片をアガロースゲル電気泳動にかけ、そ
の移動度から分子量を算出した（Journal of
Virology14巻1235〜1244頁1974年参照）ところ、
十数回の検索で、4.87±0.05の範囲内にありその
平均値は4.85メガダルトンであつた。この場合、
酵素はすべて宝酒造製を使用し、反応はすべて供
給者によつて定められた条件にしたがつた。ま
た、分子量は、λDNAをHindで分解して得ら
れた断片の標準移動度のパターンを基にして決定
した（Journal of Molecular Biology98巻551〜
564頁1975年参照）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 約4.87±0.05メガダルトンの分子量を有し、
制限酵素切断地図 によつて特徴づけられるプラスミドpATM2。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56064369A JPS57179196A (en) | 1981-04-28 | 1981-04-28 | Plasmid and its preparation |
| DE8282301992T DE3277020D1 (en) | 1981-04-28 | 1982-04-19 | Plasmid and production thereof |
| EP82301992A EP0064350B1 (en) | 1981-04-28 | 1982-04-19 | Plasmid and production thereof |
| US06/370,273 US4478937A (en) | 1981-04-28 | 1982-04-20 | Plasmid and production thereof |
| CA000401620A CA1187429A (en) | 1981-04-28 | 1982-04-26 | Plasmid and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56064369A JPS57179196A (en) | 1981-04-28 | 1981-04-28 | Plasmid and its preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57179196A JPS57179196A (en) | 1982-11-04 |
| JPS647760B2 true JPS647760B2 (ja) | 1989-02-09 |
Family
ID=13256288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56064369A Granted JPS57179196A (en) | 1981-04-28 | 1981-04-28 | Plasmid and its preparation |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4478937A (ja) |
| EP (1) | EP0064350B1 (ja) |
| JP (1) | JPS57179196A (ja) |
| CA (1) | CA1187429A (ja) |
| DE (1) | DE3277020D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
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| US5024948A (en) * | 1985-10-17 | 1991-06-18 | American Cyanamid Company | Genetic system for micromonospora |
| JPH01304887A (ja) * | 1988-06-02 | 1989-12-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | クローニングベクター |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPS56154498A (en) * | 1980-04-16 | 1981-11-30 | Upjohn Co | Plasmid puc 10 |
-
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- 1981-04-28 JP JP56064369A patent/JPS57179196A/ja active Granted
-
1982
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- 1982-04-19 DE DE8282301992T patent/DE3277020D1/de not_active Expired
- 1982-04-20 US US06/370,273 patent/US4478937A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-04-26 CA CA000401620A patent/CA1187429A/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0064350A1 (en) | 1982-11-10 |
| JPS57179196A (en) | 1982-11-04 |
| DE3277020D1 (en) | 1987-09-24 |
| EP0064350B1 (en) | 1987-08-19 |
| CA1187429A (en) | 1985-05-21 |
| US4478937A (en) | 1984-10-23 |
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