JP2952013B2 - 不均一系イムノアッセイ - Google Patents

不均一系イムノアッセイ

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JP2952013B2 JP2206628A JP20662890A JP2952013B2 JP 2952013 B2 JP2952013 B2 JP 2952013B2 JP 2206628 A JP2206628 A JP 2206628A JP 20662890 A JP20662890 A JP 20662890A JP 2952013 B2 JP2952013 B2 JP 2952013B2
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 不均一系イムノアッセイは、非標識結合試薬から標識
結合試薬の分離を可能にする手段を要求する。多くの場
合、特異的結合リガンドまたは受容体が結合する表面が
与えられる。これまで様々な表面が用いられてきた。た
とえば、濾過できるラテックス粒子、通常プラスチック
でアッセイ混合物の容器ともなるチューブまたはウエ
ル、磁場勾配中で分離できる磁性粒子、遠心分離で分離
されるかまたはクロマトグラフィーの静止相として用い
られる不溶性ポリマー、試薬を濾過できまた毛細管作用
で移送できるセルロースまたはガラス濾紙のような吸水
性材料である。
米国特許第4,659,678号には、ハプテンで標識された
抗体が液体メジウム中の被験物質と複合体を形成させて
イムノアッセイを行う方法が記載されている。複合体
は、ハプテンに対する抗体が結合する固体支持体に結合
する。結合したサンプルの検出は、放射性ヨード、蛍光
体または酵素のような試薬で標識された被験物質に対す
る第二の抗体を用いて行われる。
米国特許第4,298,685号には、酵素に共有結合させた
抗原、ビオチン化抗原およびアビジンでコートした表面
を用いる検定方法が記載されている。診断的検定に適し
た競合的イムノアッセイ系であると述べられている。
ヨーロッパ特許出願第０ 201 079号には、ビオチン
が結合した第一の抗体、検出可能な標識に結合した第二
の抗体、および固体支持体に付着したビオチンに対する
結合物質を用いるサンドイッチイムノアッセイが記載さ
れている。
米国特許第4,228,237号には、酵素標識アビジンとビ
オチン標識試薬を用いる液体メジウム中のリガンドの存
在の測定方法が記載されている。得られた酵素活性がサ
ンプル中に存在するリガンド量に相関する。
英国特許出願第２ 084 317号には、ハプテンまたは
アビジンに対する抗体でコートした固体表面、抗原−ハ
プテンまたは抗原−ビオチン接合体、抗原に対する可溶
性抗体、および抗体に対する酵素標識抗体を用いる抗原
の競合的イムノアッセイが記載されている。
米国特許第4,780,423号には、制御された細孔ガラス
粒子を用いる不均一系アッセイが記載されている。この
制御された細孔ガラスビーズはリガンドに結合できる特
異的結合パートナーの支持体として蛍光イムノアッセイ
に使用されている。この発明に用いられているように、
ガラス粒子は興味ある複合体を結合し、その検出は蛍光
プローブを用いて達成される。蛍光の測定はガラス粒子
の存在下に行なわれる。
磁性粒子やガラスビーズのような固体粒子が免疫検定
法の支持体として有用なことはよく知られている。この
ような検定の例としては、米国特許第4,777,145号に記
載されている蛍光イムノアッセイにおける固体支持体と
しての磁性粒子の使用がある。イムノアフィニティーク
ロマトグラフィーにおけるアビジンでコートされたガラ
スビーズの使用、およびアビジンでコートされたビーズ
の製造方法は、Babashak,J.V.＆T.M.Phillips:J.Chroma
togr.，444:21,1988に記載されている。
本発明は、高い適用能、迅速な結合と、遠心分離や慣
用の濾過を行うことなく不均一系イムノアッセイの静止
相の便利な洗浄が可能な本発明の改良方法を用いて様々
な不均一系イムノアッセイを行う手段を提供するもので
ある。
発明の要約 イムノアッセイにおける表面結合成分を液体メジウム
中に溶解または懸濁した成分から分離するにあたり、固
体支持体が結合のための表面を与え、液体メジウムは反
応容器に挿入されたチューブを介して吸引により支持体
から分離される方法を提供する。支持体にはその表面に
多くの特異的結合対（sbp）のメンバー、通常は受容体
を付着させ、これが相補性sbpメンバー、通常は小分子
に結合し、ついでこれが被験物質に結合可能な試薬と結
合する。分離には、標識に接合して液体メジウム中に存
在する小分子に対する受容体の、支持体に結合した同じ
受容体接合体からの分離が包含される。
本発明の一態様は、被験物質のイムノアッセイを実施
するにあたり、（ａ）被験物質の含有が疑われるサンプ
ルと、被験物質の検出に有用な複数の試薬、ひとつは支
持体をひとつは標識を包含する試薬をアッセイメジウム
に取り、（ｂ）メジウムと支持体を分離し、（ｃ）メジ
ウムまたは支持体について標識の存在または量を観察す
ることからなる方法である。標識の存在または量はサン
プル中の被験物質の存在または量に相関する。方法の改
良は、２種の試薬として、第一および第二の接合体を用
い、それぞれは特異的結合対（sbp）メンバーからなり
それはアッセイメジウム中で互いに他のsbpメンバーと
相補性であって、その各メンバーは小分子に結合し、こ
の小分子は各接合体で互いに異なる改良方法である。
本発明の他の態様は、被験物質のイムノアッセイを実
施するにあたり、水性メジウム中に（１）被験物質に対
する受容体と被験物質の類縁体からなる第一の特異的結
合対（sbp）のメンバーに結合した第一の小分子、
（２）第一の小分子に対する第一の受容体に結合した標
識、（３）被験物質の含有が疑われるサンプル、（４）
被験物質または第一のsbpのメンバーに相補性でＸに結
合した第二のsbpのメンバー（Ｘは第二の小分子（Ｚ）
または第二の小分子に対する第二の受容体（抗−Ｚ）で
ある）、および（５）Ｙに結合した支持体（ＹはＺまた
は抗−Ｚであり、ＹはＸとは実質的に異なる）を混合す
る方法である。ついでメジウムと支持体を分離し、メジ
ウムまたは支持体のいずれかについて、標識の存在また
は量を観察する。標識の存在または量はサンプル中の被
験物質の存在または量に相関する。
本発明のさらに他の態様は、イムノアッセイを実施す
るにあたり、水性メジウム中に、（１）第一の小分子
と、（ｉ）被験物質（Ａ）に相補性の第一の特異的結合
対（sbp）メンバーまたは（ii）被験物質の類縁体との
接合体（C1）、（２）被験物質の含有が疑われるサンプ
ル、（３）第二の小分子と、被験物質に相補性の第二の
sbpメンバーまたは被験物質の類縁体との接合体（C3）
を混合する方法（ただしこの場合、C1およびC3の少なく
とも一方は、被験物質に相補性のsbpメンバーを含有す
る）を混合する方法である。この水性メジウムを、
（１）〜（３）の試薬と同時にまたは試薬の混合物をイ
ンキュベーションしたのち、第二の小分子に対する第二
の受容体に結合した支持体（Ｓ）と、接合体（C1）を含
む複合体が支持体にサンプル中の被験物質の存在の関数
として結合する条件下に混合する。メジウムと支持体を
インキュベートし、ついで分離し、標識と第一の小分子
に対する第一の受容体との接合体（C2）が水性メジウム
中に存在しない場合にはその接合体（C2）の溶液を支持
体と混合する。ついで支持体について、通常は接合体
（C2）の溶液から分離したのち、標識の存在または量を
観察する。
本発明のさらに他の態様は、サンプル中の被験物質の
検出のためのイムノアッセイを行うにあたり、水性メジ
ウム中に（１）第一の小分と被験物質の類縁体との接合
体（Ｃ′１）、（２）被験物質の含有が疑われるサンプ
ル、（３）第二の小分子と被験物質のひとつに相補性の
抗体との接合体（Ｃ′３）、および（４）標識と小分子
の一多に相補性の抗体との接合体（Ｃ′２）を混合する
ものである。試薬は、水性メジウムおよび、接合体
（Ｃ′２）の抗体に相補性ではない他方の小分子に対す
る受容体に結合した支持体と同時に、標識を有する複合
体がサンプル中に存在する被験物質の量に逆相関して支
持体の表面に結合する条件下に混合する。メジウムと支
持体を分離し、メジウムまたは支持体について標識の存
在または量を観察する。
本発明の他の態様においては、サンプル中にその存在
が疑われるモノエピトープ抗原を検出するにあたり、サ
ンプル中の抗原の量に逆相関する関係で、次の形の複合
体、 （１）標識−AbF:F−Abハプテン：ハプテン−X:Y−支持
体または （２）標識−AbF:F−ハプテン:Abハプテン−X:Y−支持
体 （式中、標識−AbFは標識に結合した第一の小分子
（Ｆ）に対する抗体であり、Ｆ−ハプテンおよびハプテ
ン−Ｘは抗原の類縁体に結合した小分子（ＦまたはＸ）
でありAbハプテン−ＸおよびＦ−Abハプテンは抗−ハプ
テン抗体と第二の小分子（ＸまたはＦ）の接合体であ
り、Ｙ−支持体は支持体に結合した受容体である）を形
成させる工程からなるアッセイである。
本発明のさらに他の態様は、サンプル中の抗体被験物
質（Ａ）の検出のためのアッセイを行うにあたり、
（１）第一の小分子と抗体被験物質に相補性の抗体また
は抗体被験物質に対する抗原との接合体（Ｃ″１）、
（２）標識と第一の小分子に対する第一の受容体との接
合体（Ｃ″２）、（３）抗体被験物質の含有が疑われる
サンプル、（４）抗体被験物質に相補性の第二の抗体ま
たは抗体被験物質に対する抗原と第二の小分子との接合
体（Ｃ″３）を水性メジウム中に混合する方法である。
水性メジウム中の試薬は同時にまたはインキュベーショ
ン後に、第二の小分子に対する第二の受容体に結合した
支持体（Ｓ）と、標識を含む複合体がサンプル中の被験
物質の存在の関数として支持体の表面に結合する条件下
に混合する。試薬の混合後、メジウムを支持体から分離
し、メジウムまたは支持体のいずれかについて、サンプ
ル中の抗体の存在または量に関連する標識の存在または
量を観察する。
本発明のさらに他の態様は、式 Ｅ−AbF:F−ハプテン:Abハプテン−X:Y−支持体 （式中、Ｅ−AbFは酵素に結合した抗−フルオレセイン
抗体であり、Ｆ−ハプテンはフルオレセイン結合ハプテ
ンであり、Abハプテン−Ｘはビオチンに結合した抗−ハ
プテン抗体であり、Ｙ−支持体は支持体に結合したアビ
ジンである）で示される組成物に関する。
本発明の他の態様においては、サンプル中に存在する
ハプテンの検出にあたり、複合体 標識−AbF:F−ハプテン:Abハプテン−X:Y−支持体 （式中、標識−AbFは酵素に結合した抗−フルオレセイ
ン抗体であり、Ｆ−ハプテンはフルオレセイン結合ハプ
テンであり、Abハプテン−Ｘはゼオチンに結合した抗−
ハプテン抗体であり、Ｙ−支持体は支持体に結合したア
ビジンである）を形成させる工程からなるアッセイであ
る。
本発明のさらに他の態様は、次の形 （１）Ｅ−AbF:F−Ab:Ab:Ag−X:Y−支持体 または （２） Ｅ−AbF:F−Ag:Ab:Ab−X:Y−支持体 （式中、Ｅ−AbFは酵素に結合した第一の小分子に対す
る抗体であり、Ｆ−AgおよびＦ−Abはそれぞれ、サンプ
ル中に存在する抗体に相補性の抗原、および免疫グロブ
リンに対する抗体に結合した第一の小分子（Ｆ）であ
り、Abはサンプル中に存在する抗体であり、Ab−Ｘおよ
びAg−Ｘはサンプル中の抗体に相補性の抗体および抗原
に結合した第二の小分子（Ｘ）であり、Ｙ−支持体は支
持体に結合したアビジンである）を有する組成物に関す
る。
本発明のさらに他の態様は、式 Ｅ−AbF:F−Ab1:A:Ab2−Ｘ （式中、Ｅ−AbFは酵素に結合した抗−Ｆ抗体であっ
て、Ｆは第一の小分子であり、Ｆ−Ab1は第一の抗体に
結合した上記第一の小分子（Ｆ）であり、Ab2−Ｘは第
二の小分子に結合した第二の抗体である）で示される組
成物に関する。
本発明の他の態様は、被験物質のイムノアッセイを行
うためのキッドであり、（ａ）第一の小分子と被験物質
に相補性の第一のsbpメンバーとの接合体、（ｂ）第二
の小分子と上記被験物質の類縁体であるかまたはその被
験物質に相補性の第二のsbpメンバーとの接合体、
（ｃ）上記小分子の一方に対する受容体と酵素の接合
体、（ｄ）その酵素に対する基質、および（ｅ）他方の
小分子に対する受容体に結合した表面からなる支持体を
パッケージした形態のキットに関する。
発明の詳細な記述 本発明は、既知のイムノアッセイよりも多目的に使用
できて便利なイムノアッセイ法を提供する。本発明はと
くに、分離工程を必要とするサンプル中の被験物質のア
ッセイに応用できる。
本発明の特定の態様についてさらに説明を進める前
に、多くの用語について定義する。
「被験物質」は、興味ある材料であるサンプル中の測
定すべき化合物または組成物を意味する。被験物質は特
異的結合体（sbp）のメンバーであり、リガンドであっ
てもよく、１価または多価、通常抗原性またはハプテン
性で、単一の化合物であるかまたは少なくとも１個の共
通のエピトープまたは抗原決定部位を有する複数個の化
合物である。被験物質は粒子の成分であってもよく、ま
たアッセイ時に粒子に結合してもよい。粒子の成分であ
る被験物質の例としては、細胞表面上の抗原、たとば血
液型抗原（A,B,AB,O,D等）またはHLA抗原がある。被験
物質が粒子に結合する場合に生じる結合は、特異的また
は非特異的、免疫学的または非免疫学的結合であってよ
い。
多価リガンド被験物質は通常、ポリ（アミノ酸）すな
わちポリペプチドおよび蛋白質、多糖、核酸、ならびに
それらの組合せである。このような組合せには、細菌、
ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞
膜等が包含される。
多くの場合、本発明に用いられる多エピトープリガン
ド被験物質は、少なくとも約5,000、通常は少なくとも
約10,000の分子量を有する。ポリ（アミノ酸）の範疇で
は、興味のあるポリ（アミノ酸）は一般に、分子量約5,
000〜5,000,000、さらに通常には約20,000〜1,000,000
であり、興味のあるホルモンの場合は、分子量は通常約
5,000〜60,000の範囲である。
広範囲の蛋白質類、類似の構造的特徴を有する蛋白質
群、特定の生物学的機能を有する蛋白質群、特定の微生
物とくに病原微生物に関連する蛋白質群等が考慮され
る。
モノエピトープリガンド被験物質は、一般に分子量約
100〜2,000、さらに通常では分子量125〜1,000である。
興味ある被験物質には、薬剤、代謝物、有害生物殺滅
剤、汚染物質等が包含される。興味ある薬剤にはアルカ
ロイドが包含される。アルカロイドとしては、モルフィ
ン、コデイン、ヘロイン、デキストロメトロファン、そ
れらの誘導体および代謝物を包含するモルファンアルカ
ロイド、コカインおよびベンゾイルエクゴニン、それら
の誘導体ならびに代謝物を包含するコカインアルカロイ
ド、リゼルグ酸ジエチルアミドを含むエルゴットアルカ
ロイド、ステロイドアルカロイド、イミナゾイルアルカ
ロイド、キナゾリンアルカロイド、イソキノリンアルカ
ロイド、キニンおよびキニジンを含むキノリンアルカロ
イド、ジテルペンアルカロイド、それの誘導体ならびに
代謝物がある。
次の薬剤群にはステロイド、たとえばエステロジェ
ン、アンドロジェン、アンドロコーチカルステロイド、
胆汁酸、強心グリコシドおよびアグリコンがあり、ジゴ
キシンおよびジゴキシゲニン、サポニンおよびサポゲニ
ン、それらの誘導体および代謝物が包含される。また、
ジエチルスチルベストロールのようなステロイド様作用
物質も含まれる。
次の薬剤群は、５〜６員環を有するラクタム類であ
り、バルビツール酸たとえばフェノバルビタールおよび
セコバルビタール、ジフェニルビダントイン、プリミド
ン、エトスキシミド、ならびにそれらの誘導体が包含さ
れる。
次の薬剤群は、２〜３個の炭素原子を有するアルキル
基をもつアミノアルキルベンゼン類であり、オキサゼパ
ム、クロルプロマジン、テグレトール、イミプラミン、
それらの誘導体および代謝物が含まれ、この場合、異項
環はアゼピン、ジアゼピンおよびフェノチアジン類であ
る。
次の薬剤群はプリンであり、テオフィリン、カフェイ
ン、それらの代謝物および誘導体が包含される。
次の薬剤群はマリハナから誘導される化合物であり、
カンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノールが包
含される。
次の薬剤群はビタミンを包含し、これにはA,Bたとえ
ばB12,C,D,EおよびＫ、葉酸チアミンが含まれる。
次の薬剤群はプロスタグランジン類であり、これらは
ヒドロキシル化および不飽和結合の数および位置による
多様な化合物を含んでいる。
次の薬剤群は抗生物質であり、ペニシリン、クロロマ
イセチン、アクチノマイセチン、テトラサイクリン、テ
ラマイシン、それらの代謝物および誘導体が包含され
る。
次の薬剤群はヌクレオシドおよびヌクレオチドであ
り、ATP、NAD、FMN、アデノシン、グアノシン、チミジ
ンおよびシチジン、ならびにそれらの適当な糖およびリ
ン酸置換体が包含される。
次の薬剤群、その他の個々の薬剤であり、たとえばメ
サドン、メプロバメート、セロトニン、メペリジン、ア
ミトリプチリン、ノルトリプチリン、リドカイン、プロ
カインアミド、アセチルプロカインアミド、プロプラノ
ール、グリセオフルビン、バルプロ酸、ブチロフェノン
類、抗ビスタミン剤、アトロピンのような抗コリン剤、
それらの代謝物および誘導体が包含される。
病態に関連した代謝物には、スペルミン、ガラクトー
ス、フェニルピルビン酸、およびポルフィリンＩ型があ
る。
次の薬剤群はアミノグリコシドであり、たとえばゲン
タマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、およびア
ミカシンが包含される。
興味ある有害生物殺滅剤としては、ポリハロゲン化ビ
フェニル、リン酸エステル、チオリン酸エステル、カル
バメート、ポリハロゲン化スルフェンアミド、それらの
代謝物および誘導体がある。
受容体被験物質については、分子量は一般に10,000〜
２×108、通常は10,000〜106の範囲である。免疫グロブ
リン、IgA,IgG,IgEおよびIgMについては、分子量は一般
に約160,000から約106の間を変動する。酵素は、通常約
10,000〜1,000,000の範囲の分子量を有する。天然の受
容体は広範囲に変動し、一般的には少なくとも約25,000
の分子量を有するが106またはそれ以上の場合もある。
これらの物質には、たとえば、アビジン、DNA、RNA、サ
イロキシン結合グロブリン、サイロキシン結合プレアル
ブミン、トランスコルチン等が包含される。
特異的結合対のメンバー（sbpメンバー）とは、他の
分子の特定の空間および極性機構に特異的に結合し、そ
れに対して相補性と定義される領域を表面上または空洞
内に有する１種または２種の異なる分子を意味する。特
異的結合対のメンバーはリガントおよび受容体（抗リガ
ンド）と呼ばれることもある。これらは通常、免疫学的
ペア、たとえば抗原−抗体であるが、他の免疫学的ペア
ではない特異的結合対、たとえばビオチン−アビジン、
ホルモン−ホルモン受容体、IgG−プロテインＡ等も本
発明に包含される。
「リガンド」は、受容体が天然に存在するかまたは製
造できる任意の有機化合物を意味する。
「受容体」は、分子の特定の空間および極性機構、た
とえばエピトープまたは抗原決定部位を認識できる任意
の化合物または組成物を意味する。受容体の例には、天
然の受容体たとえばサイロキシン結合グロブリン、抗
体、酵素、Fabフラグメント、レクチン、プロテイン
Ａ、補体成分C1q等がある。
「ハプテン」は分子量100〜1,000,000またはそれ以
上、通常は100〜2,000のリガンドであり、相補性sbpメ
ンバー、抗体または他の受容体のいずれかに結合でき、
この場合リガンドは、被験物質とは少なくとも小分子へ
の結合の存在によって異なり、sbpメンバーへの結合に
際し被験物質と競合できる被験物質類縁体である。ハプ
テンの例としては、ビタミンB12、葉酸、ジゴキシン、
サイロキシノン等の誘導体を挙げることができる。これ
らのハプテンに相当するsbpメンバーの例としては、そ
れぞれ内因子、葉酸結合蛋白質、抗−ジゴキシン抗体お
よび抗サイロキシン抗体がある。ハプテンの語はまた、
甲状腺結合グロブリン、アルブミン、免疫グロブリン等
のような高分子量リガンドにも、とくに相当する被験物
質がサンプル中に比較的高濃度に存在することが期待さ
れる場合、リガンドがsbpメンバーとの結合で被験物質
と競合できることを条件に、適用されるものである。
「支持体」は任意の多孔性または多孔性でない表面を
意味する。代表的な支持体表面としては、ガラスまたは
プラスチックビーズ、ラテックスまたはセルロース粒
子、ガラスまたはセルロース濾紙、ニトロセルロース
膜、ポリスチレンプレート、磁性粒子、プラスチックチ
ューブまたは容器等を挙げることができる。支持体は、
sbpメンバーが非拡散的に結合可能で、リガンドメジウ
ムに溶解せずまた悪影響を与えない任意の便利な材料で
製造できる。支持体は通常、ポリスチレン、ポリカルボ
ネート、ポリアクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリウレ
タン、テフロン等のようなプラスチックであり、また鉄
鋼、ニッケル、銅、金のような金属性材料でもよく、ま
た好ましくは、たとえば石英、ガラス等を含めたセラミ
ックである。支持体がビーズのマトリックスである場合
は、ビーズは通常、所定のほぼ均一なサイズ、好ましく
は0.2〜2.5mmのサイズを有し、粗いまたは平滑な表面、
好ましくは平滑な表面をもっている。ビーズは好ましく
は円形または長円形で、通常はほぼ球形であって、非特
異的結合を最小限にする表面特性を有する。本発明のイ
ムノアッセイに使用される場合、支持体には、リガンド
たとえばビオチン、または受容体、好ましくは受容体た
とえば、抗体、アビジン、アポ酵素、リプレッサー蛋
白、内因子等のsbpメンバーが結合されている。
「小分子」は、分子量100〜2,000、好ましくは150〜
1,000、好ましくは150〜1,000の有機または有機金属基
を意味し、通常はsbpメンバーまたは支持体に結合して
いて、それに対する受容体が存在するかまたは製造でき
る。本発明に有用な小分子の例には、ビオチン、リゼル
グ酸、ブルシン、フルオレセイン、ビタミンB12および
一般的には検定すべきサンプル中に通常は高濃度には存
在しない分子の誘導体が包含される。生物学的サンプル
の場合には、毒性の高い分子および薬剤以外の合成的に
誘導される分子が多くの場合好ましい。
「接合体」は、１つまたは多くの小分子または標識に
非共有または共有、好ましくは共有結合によって結合し
た特異的結合対メンバーたとえばリガンドまたは受容
体、通常は抗体を意味する。接合体は、被験物質と相補
性のハプテンまたは受容体に結合した１または２以上の
小分子であってもよい。
「標識」は、小分子と相補性の受容体に共有結合する
シグナル生成系のメンバーを意味する。標識は同位元素
または非同位元素のいずれでもよいが、通常は非同位元
素で、たとえば酵素のような触媒、蛍光体、染料または
化学発光体のような発色原、金属粒子等である。
「シグナル生成系」は、１または２以上の成分を有
し、その少なくとも一成分は標識であるシグナル生成系
を意味する。シグナル生成系は、サンプル中の被験物質
の存在または量に関連したシグナルを発生する。シグナ
ル生成系は、測定可能なシグナルの生成に必要なすべて
の試薬を包含する。標識は通常、直接または間接的に、
小分子に対する受容体に接合される。シグナル生成系の
成分は、化学発光体、放射性物質、補酵素、酵素生成物
と反応する物質、酵素、および触媒、固体粒子、蛍光
原、発色原、金粒子等とすることができる。シグナル生
成系は外部装置で、好ましくは粒子の凝集程度の測定、
または電磁照射線の使用により、望ましくは肉眼検査に
よって検出できるシグナルを与える。多くの場合、シグ
ナル生成系は、色原体基質と酵素（この場合、色原体基
質は、紫外部または可視領域の光を吸収する染料に酵素
的に変換される）、リン光体、蛍光体、化学発光体、放
射性原子、電子活性基等を含有する。
シグナル生成系は少なくとも１種の触媒、通常は酵
素、少なくとも１種の基質を包含することができるし、
また２種またはそれ以上の触媒と複数個の基質を包含し
てもよい。１種の酵素の基質が他の酵素の生成物である
ような酵素の組合せを包含させることもできる。シグナ
ル生成系は、サンプル中の被験物質の量に関連する検出
可能シグナルを与える生成物を生成するように操作され
る。
とくに興味ある酵素には、過酸化水素の産生および染
料前駆体を染料に酸化するための過酸化水素の使用に関
与する酵素である。特定の組合せとしては、糖オキシダ
ーゼたとえばグルコース、ガラクトースオキシダ、また
は異項環オキシダーゼたとえばウリカーゼ、キサンチン
オキシダーゼと、過酸化水素を染料前駆体の酸化に使用
する酵素、すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ラ
クトペルオキシダーゼまたはミクロペルオキシダーゼと
の組合せを挙げることができる。本発明においてとくに
興味がある他の酵素には、β−ガラクトシダーゼ、ウレ
アーゼ、アルカリホスファターゼおよびＱ−ベータレプ
リカーゼがある。
「非特異的結合」の語は、結合する分子の特異的構造
とは比較的独立な、表面への標識または分子の非共有結
合を意味する。このような非特異的結合は、電荷または
静電的相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファンデ
ルワールスカ等によって生じる。
「補助材料」の語は、本発明によるアッセイに用いら
れる様々な付加的材料を意味する。たとえば、アッセイ
メジウム中に通常存在する緩衝剤、ならびにアッセイメ
ジウムおよびアッセイ成分のための安定化剤等である。
これらの添加物に加えて多くの場合、補助的蛋白質たと
えばアルブミン、界面活性剤とくに非イオン界面活性
剤、結合増強剤たとえばポリアルキレングリコール等が
包含される。
上述のように、本発明の一態様は、支持体に結合した
受容体−標識接合体を、液体メジウムに溶解した同じ接
合体から分離する方法に関するものである。この方法
は、接合体を含有する液体メジウムを、溶液中に存在す
る被験物質の量に関連して接合体に直接または間接に結
合できるsbpメンバーを結合する支持体と混合するもの
である。本発明の好ましい実施態様においては、固体支
持体はビーズのマトリックスである。完全な分離を達成
するためには、接合体を含有する液体メジウムはビーズ
のマトリックスを完全に覆うのに必要な容量を著しく越
えるものではなく、ビーズを覆うのに十分でない容量で
もよい。sbpメンバーの量はすべての接合体を結合する
のに少なくとも十分であればよい。しかしながら、液体
の容量がビーズを覆うのに必要な容量よりも実質的に多
い場合の分離法も本発明に包含される。いずれの場合
も、分離を行う方法は同じである。インキュベーション
後、液体メジウムはまずそのマトリックスとインキュベ
ートされ、これは通常、濾過装置のような他のものが装
備されていない、したがって液体に対して不透過性の容
器中で行われる。ついで、メジウムを吸引によってビー
ズから分離する。吸引は、１個もしくは２個以上の開口
部、好ましくは１個の開口部を有するチューブを用いて
行われる。チューブの断面が円形の場合、開口部直径
は、それと接触する最小のビーズの直径よりも小さくな
るようにする。チューブの断面が円形でない場合には、
開口部の最短または最長の断面の径が少なくとも相当す
るビーズの直径よりも小さくなければならない。その結
果、液体はマトリックスから、ビーズの喪失を招くこと
なく高価的に分離される。
本発明のイムノアッセイに用いられる試薬は、本発明
の設計にとくに重要である。設計にあたっては、大部分
の被験物質に広く適用できて、イムノアッセイ系におけ
る自動化と試薬の安定性の制御が容易な試薬を用いる方
法が選択される。
本発明の一実施態様として、サンプル中のモノエピト
ープ抗原、たとえば薬剤の検出のための方法を説明す
る。この方法では、第一の小分子に結合したハプテンの
接合体がサンプル中の抗原と、第二の小分子に結合した
抗−ハプテン抗体の接合体への結合で競合するような競
合的アッセイ様式が用いられる。ハプテン接合体と抗−
ハプテン接合体との複合体の生成量が被験物質の量に関
連する。生成した複合体は、小分子の一方に対する受容
体が結合した固体支持体に結合する。支持体への結合の
前または後に、他の小分子に対する受容体と標識の接合
体を、複合体と混合する。ハプテンの検出に適用された
本発明のこの方法で生成する複合体を構成的に示すと次
の通りである。
Ｅ−AbF:F−ハプテン:Abハプテン−X:Y−支持体 Ｅ−AbF:F−Abハプテン：ハプテン−X:Y−支持体 式中、Ｅ−AbFは標識に結合した小分子（Ｆ）に対す
る受容体、たとえば酵素に結合した抗−フルオレセイン
抗体であり、Ｆ−ハプテンおよびハプテン−Ｘはハプテ
ンに結合したフルオレセインまたはビオチンのような小
分子（ＦまたはＸ）であり、Abハプテン−ＸおよびＦ−
Abハプテンは第二の小分子（ＸまたはＦ）たとえばビオ
チンまたはフルオレセインと抗−ハプテン抗体の接合体
であり、Ｙ−支持体は支持体に結合したＸに対する受容
体たとえばアビジンである。
本発明の他の応用においては、アッセイ方法はとく
に、少なくとも２つの抗原決定基、すなわち受容体が同
時に結合できる少なくとも２つの部位を有するサンプル
中の被験物質の検定に適するように設計されている。本
発明の好ましい実施態様においては、この検定方法は以
下の試薬、すなわち、小分子に対する受容体に結合した
標識たとえば抗−フルオレセインに結合した酵素；被験
物質の第一の抗原決定部位に相補性で小分子たとえばフ
ルオレセインが結合した第一の抗体；被験物質の第二の
抗原決定基に相補性で第二の小分子たとえばビオチンが
結合した第二の抗体；問題の被験物質の含有が疑われる
サンプル；および第二の小分子に対する受容体たとえば
アビジンが結合した支持体を使用する。このアッセイの
抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよいが、
モノクローナルが好まし。このようなアッセイ系におい
ては、固体支持体に結合する標識の量は、サンプル中に
存在する被験物質の量に直接関連する。とくに、標識が
結合する第一の小分子に対する受容体は、第一の抗体に
結合した第一の小分子に結合する。被験物質の存在下に
は、第一の抗体は被験物質とその第一の抗原決定部位で
結合する。第二の小分子が結合する第二の抗体は、被験
物質とその第二の抗原決定部位で結合する。一方、第二
の抗体上の第二の小分子は支持体に結合した第二の小分
子に対する受容体に結合し、その結果、問題の複合体は
支持体に結合する。試薬およびサンプルは、同時に、ま
たはすべてもしくは一部を順次、互いにまた固体支持体
と混合することができるが、受容体に結合した標識を、
支持体がすべての他の試薬と接触したのちに支持体に別
個に添加される場合を除いて、試薬およびサンプルは固
体支持体への導入前に混合することが好ましい。被験物
質の検出に適用される、本発明のイムノアッセイで生成
する複合体を構成的に示さば次の通りである。
Ｅ−AbF:F−Ab1:A:Ab2−X:Y−支持体 式中、Ｅ−AbFは標識たとえば酵素に結合した第一の
小分子に対する受容体たとえば抗−フルオレセイン抗体
であり、Ｆ−Ab1は被験物質に対する第一の抗体に結合
した第一の小分子たとえばフルオレセインであり、Ａは
サンプル中に存在する問題の被験物質であり、Ab2−Ｘ
は被験物質に対する第二の抗体に結合した第二の小分子
たとえばビオチンであり、Ｙ−支持体は、支持体に結合
した第二の小分子に対する受容体たとえばアビジンであ
る。
本発明のアッセイ方法は、微生物学的抗原、とくに感
染疾患において生じる抗原、たとえばクラミジア、AIDS
に伴うヒト免疫不全症ウイルス（HIV−１）等の検出に
とくに適している。
本発明のアッセイ方法はまた、抗体の検出に適当であ
る。本発明の好ましい実施態様におけるイムノアッセイ
では次のような試薬が利用される。すなわち、抗−フル
オレセイン抗体に結合した酵素、フルオレセインに結合
した抗体被験物質と相補性の抗原の類縁体、抗体の含有
が疑われるサンプル、ビオチンに結合した免疫グロブリ
ンに対する抗体、およびアビジンが結合した支持体であ
る。このイムノアッセイ法を用いると、問題のサンプル
が抗体を含む場合、酵素を含む複合体が支持体に結合す
る。非結合酵素を分離したのち、支持体上に存在する酵
素活性はサンプル中の抗体の存在と相関する。このよう
なアッセイの一変法では、たとえば、フルオレセイン結
合抗原をフルオレセインに結合した免疫グロブリンに対
する抗体に置換し、ビオチンに結合した免疫グロブリン
に対する抗体をビオチンに結合した抗原に置換する。サ
ンプル中に存在する特定の抗体の検出に適用される本発
明の方法において生成する複合体を構成的に示すと次の
通りである。
Ｅ−AbF:F−Ag:Ab:Ab−X:Y−支持体 Ｅ−ABF:F−Ab:Ab:Ag−X:Y−支持体 式中、Ｅ−AbFは標識に結合した第一の小分子に対す
る抗体であり、Ｆ−AbおよびＦ−Agはそれぞれ、免疫グ
ロブリンに対する抗体、およびサンプル中に存在する抗
体に相補性の抗原に、それぞれ結合した第一の小分子
（Ｆ）であり、Abはサンル中に存在する問題の抗体であ
り、Ag−ＸおよびAb−Ｘは、サンプル中の抗体と相補性
な抗原、およびサンプル中の抗体に相補性の抗体にそれ
ぞれ結合した第二の分子（Ｘ）である。
本発明のさらに他の応用においては、イムノアッセイ
法はサンプル中のIgMの存在を検出するために設計され
る。とくに、この方法は、肝炎コア抗原に対する抗体の
検出に適している。このアッセイ系においては、以下の
成分が使用できる。すなわち、抗−フルオレセイン抗体
に結合した酵素、フルオレセインに結合した抗原、サン
プル、ビオチンに結合した抗−ヒトIgM、およびアビジ
ンでコートした支持体である。サンプル中にIgMが存在
すると、検出可能な複合体が生成する。酵素活性の程度
がサンプル中のIgM濃度に相関する。このアッセイの変
法においては、フルオレセインが抗原に直接ではなく
て、抗−抗原抗体に結合される。
アッセイ系の設計によって、包括的な試薬、すなわち
問題の被験物質なく任意のアッセイ系に使用できる試薬
の使用が可能になる。上述の例から明らかなように、各
アッセイでは小分子に結合した受容体からなる接合体が
使用される。
上述の各方法では、第一の小分子と第一のsbpメンバ
ーの接合体（C1）は、第一の小分子に対する受容体と標
識の接合体（C2）と直接非共有結合で結合し、また、第
二の小分子と第二のsbpメンバーの接合体（C3）に非共
有結合で結合している。この場合、C1とC3の間の結合
は、アッセイがただ１個の抗原決定部位をもつ被験物質
について行われる場合は直接であり、他方、アッセイが
多重抗原決定部位をもつ被験物質について行われる場合
は直接または間接である。接合体C3はさらに、表面に第
二の小分子に対する受容体が結合している支持体に直
接、非共有結合で結合する。アッセイに要求されるすべ
ての結合が起こると、以下の組成の複合体が生成する。
C2:C1:（Ａ）n:C3:S 式中、Ａは被験物質の分子であり、Ａに結合するただ
１個のsbpメンバーが使用される場合、すなわち被験物
質が１個の抗原決定部位をもつときはｎは０であり、被
験物質が多重抗原決定部位をもつ場合はｎは１である。
アッセイの実施に際しては、より便利なある工程順序
が存在し、他方、最高のアッセイ感度を与える順序があ
る。使用する特定な順序の選択はしたがって、アッセイ
を実施する人の要求に依存する。一般的には、まず、水
性メジウム中に通常添加順序は考慮せずに、サンプル、
C1,C2およびC3を混合するのが好ましい。ただし、単一
の抗原決定基をもつ被験物質についての競合的アッセイ
の場合には、通常、被験物質に相補性のsbpメンバーを
含む接合体とサンプルを同時に、または被験物質の類縁
体を含む接合体とサンプルを混合する前に、混合するこ
とが好ましい。サンプル、C1,C2およびC3を含有する水
性メジウムをついで、所望により１時間までまたはそれ
以上インキュベートしたのち、支持体（Ｓ）と混合し、
通常はさらに５秒〜５時間、通常は１分〜１時間インキ
ュベートする。支持体に結合した標識またはメジウム中
に残った標識の量をついで直接、しかし通常は支持体か
らメジウムを分離したのちに測定する。
使用できる他のプロトコールとして、サンプルならび
に全試薬C1,C2,C3およびＳをほぼ同時に混合し、５時間
までインキュベートしたのち、メジウムと支持体の分離
前または分離後、通常は分離後に、支持体（Ｓ）上また
はメジウム中の標識を検出する方法がある。これは便利
さは加わるが、特定の検定感度を達成するためにはイン
キュベーション時間の延長が必要になる。
使用できる他のプロトコールとして、支持体に、C3、
サンプル、C1およびC2の溶液を順次添加し、各添加後に
インキュベーションを行いまたは行わず、次の溶液の添
加前に各溶液の支持体からの分離を行いまたは行わずに
実施する方法があり、感度を増大させることができる。
支持体へC2の溶液を添加したのち、メジウムと支持体の
分離前または分離後、通常は分離後に、支持体上または
メジウム中で標識を検出する。
とくに好ましいプロトコールにおいては、サンプルを
水性メジウム中、メジウムを支持体と混合する前または
それと同時にC1およびC3と混合する。メジウムと支持体
の任意のインキュベーション後に、支持体をメジウムか
ら分離し、C2を含む溶液と混合する。C2を支持体とイン
キュベートしたのち、溶液と支持体の分離前または分離
後、通常は分離後に、支持体上または水性メジウム中で
標識を検出する。
これらのアッセイにおいては、任意の便利な標識が使
用できる。標識には、酵素、たとえばアルカリホスファ
ターゼのようなホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ（HRP）のようなペルオキシダーゼ、ウレアー
ゼ、β−ガラクトシダーセのようなグリコシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼのようなオシダーゼ、コリンエス
テラーゼのようなエステラーゼ、Ｑ−ベーターレプリカ
ーゼのようなヌクレオチドポリメラーゼ、ペニシリナー
ゼ、ルシフェラーゼ等が包含される。また、酵素に対す
る抗体もしくは機構に基づくインヒビターのような酵素
インヒビター、または酵素補欠分子族のような酵素アク
ティベーター、またはNAD、NADH、NADP、ATP、FAD、FMN
のような補酵素の誘導体も使用できる。また、フルオレ
セイン、ウンベリフェロン、オキサジン、アクリジニウ
ム塩、アクリドン、ピレン、スクアレート染料、蛍光性
希土類キレート、シアニド、メロシアニド、フィコビリ
プロティン、ビメイン、ナフチルアミン等の誘導体のよ
うな蛍光原も使用できる。他の有用な種類の標識として
は、ジオキシタン、ルミソール、ホタルルシフェリン、
アクリジニウムエステルの誘導体を含む化学発光標識が
ある。粒子状の標識も使用できる。それらは直径100nm
未満であることが好ましく、またそれらが検出可能な分
子をもつかそれら自体が容易に検出可能であればとくに
好ましい。有用な粒子状標識には、コロイド状金、コロ
イド状セレニウム、染色ガラスビーズ、検出可能分子を
結合もしくは吸蔵したりリポゾーム染料粒子もしくは結
晶等が包含される。他の標識としてはさらに、放射性原
子、電子活性標識たとえば有機水銀化合物、ヒドロキノ
ン、ベンチジン、フェロセン、α−ジケトン、ヒドロキ
シルアミンおよびヒドラジン、酵素以外の触媒たとえば
フェナジンメトサルフェート、およびメルドラブルーが
ある。
標識は通常、小分子に対する受容体、通常は抗体に共
有結合させる。結合は、標識の水素原子の受容体への結
合への単なる置換であってもよいし、また標識と受容体
の間に任意のサイズの連結基を包含させてもよい。しか
しながら、連結基のサイズは必要以上に長くないことが
好ましく、標識に結合したsbpメンバーと相補性のsbpメ
ンバーの結合に影響与えるものではなく、また標識によ
るシグナル生成を妨害しないものでなければならない。
一般的には、連結基は、結合または１〜100個の原子好
ましくは１〜15個の原子を含む基である。
sbpメンバーに結合した小分子を含有する本発明の接
合体は、天然の受容体が存在するかまたはそれが製造で
きる小分子を含有する。小分子は通常、極端に親水性で
も疎水性でもなく、サンプル中に存在する可能性がある
物質と構造的に類似しないものが好ましい。接合体がハ
プテンに結合した小分子である場合には、小分子は好ま
しくは少なくとも10個の原子長、多くの場合少なくとも
20個の原子長の原子鎖を介してハプテンに結合させる
が、この原子鎖はもっと短くても長くてもよく、条件は
この鎖が小分子に対する受容体によるおよび接合体内の
sbpメンバーに相補性のsbpメンバーによる接合体への同
時結合を妨げないことのみである。ハプテン接合体は通
常、１個の小分子に結合した１個のハプテンを有する
が、ハプテンに２個以上の小分子が結合したハプテン接
合体も本発明の範囲に包含される。多重抗原決定部位を
有するかまたは受容体であるsbpメンバーと小分子の接
合体は、接合体内に少なくとも１個、多くの場合２〜20
個の小分子を有し、これらは通常共有結合している。結
合は、小分子の水素原子のsbpメンバーへの結合への単
なる置換であってもよいし、また小分子とsbpメンバー
の間に任意のサイズの連結基を包含させてもよい。しか
しながら、連結基のサイズは必長以上に長くないことが
好ましく、小分子に対する受容体および接合体内のsbp
メンバーと相補性のsbpメンバー、両者の接合体への結
合を妨害しないものではなければならない。
本発明の支持体は通常、ビーズ、リポゾーム、セル、
ゾル等のような粒子；吸湿性材料たとえば多孔膜、セル
ロース紙、ガラス紙およびニトロセルロース膜；非孔性
材料たとえばガラス、プラスチック、金属、セラミック
等である。受容体は支持体の表面に、その受容体に相補
性な小分子リガンドを含む接合体が容易に結合できるよ
うな様式で、共有結合または非共有結合によって結合さ
せる。この表面に対する受容体の結合は通常、表面を受
容体とインキュベートすることによって達成されるが、
この場合、表面を予め結合を増強させるような試薬、た
とえばポリリジンのようなポリカチオン；カルボジイミ
ド；シリル化剤；二官能性架橋試薬たとえばカルボニル
ジイミダゾール、過ヨウ素酸塩、および類似の活性化試
薬で処理してもよい。別法として、支持体は、受容体に
対して相補性のsbpメンバーたとえば受容体に対するリ
ガンドまたは受容体に対する抗体がすでに表面に結合し
ている形に製造することもできる。受容体をこのような
表面とインキュベートすれば、受容体は非共有結合で結
合する。受容体に対するリガンドが最初から表面上に存
在するこの結合方法を採用すれば、受容体は通常、リガ
ンドに対して少なくとも２個の結合部位をもつことにな
る。
本発明の実施に際しては、液体メジウム、通常は水性
メジウムが使用される。他の極性溶媒、通常は１個から
６個、さらに通常では１〜４個の炭素原子を有する酸化
型有機溶媒、たとえばアルコール、エーテル等も使用で
きる。通常、これらの補溶媒は約40重量％未満、さらに
通常では約20重量％未満存在させる。一般的には５〜10
のpH範囲、通常は６〜９の範囲が使用される。アッセイ
に際してpHに関しさらに注意すべき点は、sbpメンバー
の結合に必要なレベルの維持、また一方ではジグナル生
成効率を至適にするレベルの維持である。場合によって
は、これらを考慮して妥協しなければならない。所望の
pHを達成し、測定時このpHを維持するためには、様々な
緩衝剤が使用される。緩衝剤の例としては、ホウ酸塩、
リン酸塩、炭酸塩、トリス、バルビタール等を挙げるこ
とができる。本発明に使用される緩衝剤にはとくに制限
はないが、個々の分離または個々のアッセイについて
は、ある緩衝剤が他のものよりも好ましい場合がある。
分離およびアッセイを実施する場合には通常、穏和な
温度が用いられ、アッセイの実施中は通常一定の温度に
維持される。アッセイ温度はとくにイムノアッセイの場
合、一般に約０゜〜50℃の範囲で、さらに通常では約15
゜〜40℃である。
様々な試薬の濃度は、液体メジウム中のsbpメンバー
またはアッセイ中の被験物質の濃度範囲によって一般的
に決定されるが、各試薬の最終的な濃度は通常、興味あ
る範囲にわたって、分離または検定の感度および特異性
を至適にするように経験的に決定される。
本発明のイムノアッセイにおいては、水性メジウムに
シグナル生成系の１種または２種以上の成分を含有させ
ることができる。シグナル生成系の各成分の濃度は、興
味ある被験物質の濃度範囲、および用いられる測定また
は検定の種類に依存し、変動する。一般的にいえば、シ
グナル生成系の各成分の濃度は、被験物質の興味ある濃
度範囲内で検定の感度を至適にするように選択される。
便宜上、アッセイを行うための試薬は、被験物質のア
ッセイに使用する既定量をパッケージとして組合せたキ
ットとして提供することもできる。キットは、（ａ）第
一の小分子と被験物質に相補性の第一のsbpメンバーと
の接合体、および（ｂ）第二の小分子と、被験物質の類
縁体であるかまたは被験物質に相補性の第二のsbpメン
バーとの接合体から構成される。キットにはまた、標識
と小分子の一方に対する受容体との接合体、および他方
の小分子に対する受容体が表面に結合している支持体も
包含させることができる。キットにはさらに、サンプル
中の被験物質の量に関連したシグナルを生成させるため
の他の試薬を包含させてもよい。補助剤も必要に応じて
包含させることができる。
サンプル中の被験物質の存在または量を測定するため
の試薬を包含させた好ましいキットは、（ａ）第一の小
分子と被験物質に相補性の第一のsbpメンバーとの接合
体、（ｂ）第二の小分子と、被験物質の類縁体であるか
または被験物質に相補性の第二のsbpメンバーとの接合
体、（ｃ）小分子の一方に対する受容体と酵素の接合
体、（ｂ）酵素に対する基質、および所望により（ｅ）
シグナル生成系の他の成分、小分子他方に対する受容体
に結合した表面をもつ支持体、補助剤から構成される。
本明細書に記載した発明において、固体支持体がビー
ズのマトリックスである場合には、ビーズは通常、非孔
性で、普通はガラスまたはラテックスであり、通常は平
均直径0.2〜2.5mmである。マトリックスは50〜50,000個
のビーズから構成するのが適当である。とくに好ましく
は、ビーズの平均直径は0.5〜2mmである。ビーズは通常
ほぼ球状であり、粗いまたは平滑な表面を有する。
イムノアッセイに有用であるためには、ビーズは特定
の表面特性をもつものでなければならない。その表面
は、標識およびsbpメンバーに対する非特異的結合性は
低く、一方、非結合標識から、被験物質またはその相補
性sbpメンバーに結合した標識の分離の効率的な手段を
与えるものでなければならない。ビーズのサイズおよび
形状は、液体メジウムの容量に対するビーズ表面の比を
最大にするように選択され、またビーズマトリックスへ
の吸引チューブの挿入を容易にし、マトリックスからの
液体メジウムの分離を効率的にするように選ばれる。容
量に対する表面の比が大きいほど、ビーズへの標識のさ
らに迅速な結合が可能になるが、小さなビーズを使用す
ると分離効率が必然的に悪くなる。通常は0.2〜2.5mmの
サイズが最も有用であることが明らかにされている。さ
らに、多くの場合、結合能を最大にするため、ビーズ上
のsbpンバーの表面密度を最大にすることが望ましい。
一般に、表面密度は10,000nm2あたりsbpメンバー少なく
とも１分子でなければならず、好ましくは1000nm2あた
り少なくとも１分子、とくに好ましくは100nm2あたり少
なくとも１分子であって、アッセイメジウム中に存在
し、ビーズに接触するすべての相補性sbpメンバーを結
合するのに十分高いことが好ましい。
ビーズの表面積が大きいことから、バックグランドの
非特異的結合が低く維持されるように、その表面の性質
には注意を払わなければならない。ビーズに結合される
受容体としてアビジンを使用する場合には、ビーズには
アビジンを結合させたのち、スクロースの存在下にガラ
ス粒子を乾燥させることによって、非特異的結合を減少
させることができる。糖のほかに、有用なことが明らか
にされているコーティングの例には、ウシ血清アルブミ
ン（BSA）、ポリ（ビニルアルコール）、カゼインおよ
び脱脂ミルクがある。
どのような種類の固体支持体を使用しても、受容体が
その表面に結合し、その受容体が小分子に特異的に結合
するように処理しなければならない。本発明の好ましい
実施態様においては、支持体は様々な異なるアッセイに
使用できるように、それにリガンドまたは受容体を結合
させる。たとえば、アビジンは0.5〜1.5mmの球状ガラス
ビーズに共有結合させることができる。これらのビーズ
のマトリックスを水性メジウム中、被験物質に対するビ
オチン標識抗体、被験物質を含むサンプル、および溶液
中の被験物質の量の関数としてビオチン標識抗体に結合
する標識抗体またはリガンドと混合する。ビーズはビオ
チンに結合し、ビオチンはどの抗体にも結合できるので
同じビーズが大部分の抗体−抗原対に使用できる。標識
抗体またはリガンドのビオチン化抗体への結合および後
者のビーズへの結合が起こるのに十分な時間インキュベ
ートしたのち、溶液を吸引によってビーズから除去す
る。同じまたは別のチューブを使って、次に洗浄液を加
え、液体を再び吸引する。洗浄サイクルを反復したの
ち、標識を検出すると、標識の量はサンプル中の被験物
質の量に相関する。
本発明の方法は、任意の被験物質の不均一系結合アッ
セイに応用できる。特定のアッセイとしては、たとえ
ば、ジゴキシン、トリヨードサイロニン（T3）、甲状腺
刺激ホルモン（TSH）、甲状腺結合グロブリン（TBG）、
ビタミンB12、肝炎抗原（たとえばHBsAg）および肝炎抗
体、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）関連抗原および抗
体のアッセイを挙げることができる。各系において、被
験物質に相補性のビオチン化抗体またはビオチン化抗原
が用いられる。アビジン（ストレパビジンを包含する）
以外の受容体としては、たとえば抗体、プロテインＡ、
内因子、プロテインＧ、C1q、レクチン、アポ酵素等を
ビーズに付着させることができ、さらに被験物質に相補
性のsbpメンバーまたは被験物質の類縁体に接合した相
補性小分子が使用される。
本発明の好ましい態様においては、すべてのアッセイ
が同一の２種の一般的試薬、一般的な受容体たとえばア
ビジンに結合した非孔性ビーズおよび第二の一般的受容
体たとえば抗−フルオレセインに結合した酵素が使用さ
れる。このようなアッセイにおては、ビオチンおよびフ
ルオレセイン結合sbpメンバーは互いにまたは溶液相中
の被験物質と、ビーズマトリックスと混合する前に結合
させる。この場合、結合反応はより迅速に進行し、つい
で被験物質の結合が表面において、通常、酵素連結イム
ノソーベントアッセイ（ELISA）の場合のように起こ
る。
多重エピトープ被験物質、たとえばTSH、特異的TSHの
アッセイにおいては、抗体はビオチンに接合され、つい
でアビジン被覆ガラスビーズによって捕捉される。第二
のTSH特異的抗体はフルオレセインに接合される。酵素
接合体は、抗−フルオレセイン抗体に連結した少なくと
も１個のHRPを有する。全成分の混合物を短時間インキ
ュベートしたのち、アビジンで被覆したガラスビーズを
加え、表面に複合体（ビオチン−抗体:TSH:抗体−フル
オレセイン：抗−フルオレセイン−HRP）を結合させ
る。
全抗体−サンプルインキュベーション容量が完全にビ
ーズ間の空間に捕捉されるように十分な量のビーズを含
むマトリックスを加える。これにより表面と容量の比を
最大にし、拡散距離を比較的短くし、振盪しないでもビ
オチン化抗体の定量的な結合が可能になる。
次に、ビーズの表面を、ビーズマトリックスの底まで
吸引チューブを差し込んで、洗浄液の添加、吸引を繰り
返すことによって洗浄する。ビーズの密度およびサイズ
により、ビーズは洗浄液の噴流によって容易に懸濁さ
れ、ついで速やかに沈降する。ビーズは洗浄プローベに
よって吸引されないだけの大きさを有する。次に基質を
加え、酵素生成物の量を適当なインキュベーション時間
後に比色的に測定し、既知濃度の被験物質サンプルを用
いて得られた生成物の量と比較する。
本発明の好ましい態様における化学および方法によ
り、標準的ELISAに対して以下の有意な利点が達成され
る。すなわち、１）受容体結合支持体はすべてのアッセ
イに広く適用できる、２）溶液相での被験物質と抗体の
結合により、固体表面に固体化された抗体を用いる場合
に比べてきわめて迅速な反応が起こる、３）高い抗体結
合能をもつ大きな表面積の存在により、捕捉が迅速に達
成される、４）捕捉表面は定量的に添加される必要がな
い。さらに、受容体−標識接合体はすべてのアッセイに
広く適用でき、それが至適化および安定化が必要な唯一
の標識試薬である。これは、各アッセイについて別個の
標識試薬を必要とする標準的な不均一系イムノアッセイ
のフォーマットと全く異なるものである。小分子たとえ
ばビオチンまたはフルオレセインの抗体またはハプテン
へ結合させる化学的操作は単純で能率的である（たとえ
ば、D.M.Boorsma:Immunocytochemistry,２:155,1983参
照）。小分子接合体の安定性は、接合体に用いられる抗
体と同様に良好である。
例 以下の例は本発明を例示するものであって、本発明を
限定するものではない。とくに指示がない限り、試薬は
市販のものを入手し、製造業者の指示が適用可能な場合
はそれに従った。
例中、アッセイプロトコールのもとに記載したインキ
ュベーション後のビーズからのアッセイメジウムの吸引
およびその後の洗浄液の吸引は、真空ラインに接続した
細いスチールチューブ（ビーズはチューブ内に入れない
ような）を用い、ビーズの間を通して反応試験管の底部
にさし込んで実施した。
例には、以下の略号を用いる。
AbDig:抗ジゴキシン抗体 AF:抗フルオレセイン抗体 AbT3:抗−トリヨードサイロニン抗体 ANS:8−アニリノナフタレン−１−スルホン酸 ビオチン−LC−NHS:スクシンイミジル６−（ビオチン
アミド）ヘキサノエート Bis−NH2:2,2′−オキシビス（エチルアミン） BSA:ウシ血清アルブミン DCC:N,N′−ジシクロヘキシルカルボジイミド Dig:ジゴキシン Dig−CMO:ジゴキシンカルボキシメチルオキシム Dig−LC−F:ジゴキシンカルボキシメチルオキシム−L
C−NH−カルボキシフルオレセイン F:フルオレセイン EDAC:1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド EDTA:エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩 F:フルオレスセイン Ｆ−COOH:6−カルボキシフルオレセイン Ｆ−LC−NH2:カルボキシフルオレセイン−LC−NH2 GB:ガラスビーズ HRP:西洋ワサビペルオキシダーゼ LC:3,3′−ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミン NaPi:リン酸ナトリウム緩衝液 NHS:N−ヒドロキシスクシンイミド o/n:一夜 PBS:リン酸緩衝食塩溶液 Sulfo−NHS:スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド T3:3,3′,5′−トリヨード−Ｌ−チロシン TMB:3,3′,5,5′−テトラメチルベンチジン−二塩酸
塩。
TNBSA:2,4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸 例1:ジゴキシン検出用の不均一系酵素ベースイムノアッ
セイ 材料の調製 A. HRP−スクシニル−オキシビス（エチルアミド）−ジ
ゴキシンの調製 1.HRP−スクシニル−ビス−NH2の調製 この試薬は連続した２工程、すなわち１）天然HRPの
２個の反応性アミノ基を、HRP−COOHへのスクシニル化
によりカルボキシル基に変換した、２）ついでHRP−COO
Hを過剰量のオキシビス（エチルアミン）およびEDACと
反応させてHRP−スクシニル−ビス−NH2を生成させた、
によって製造した。
HRPのスクシニル化:0.1M Borax中20mg/ml HRP溶液2ml
に室温で、DMF中2.5M無水コハク酸40μを加えた。20
分間攪拌後、さらに40μの無水コハク酸溶液を加え、
混合物をさらに１時間室温でインキュベートした。反応
混合物を0.005Mリン酸ナトリウム緩衝液（NaPi）/pH＝
7.0中で平衡化したSephadex Ｇ−25カラム上において
精製し、低分子量物質を除去した。HRP−COOHをアミコ
ンYM−10膜を用いて20mg/ml HRP−COOHに濃縮した。反
応生成物をゲル電気泳動に付し、反応性アミノ基をTNBS
A滴定した。
スクシニル化HRPの反応性アミノ基の導入:0.005M NaPi
/pH＝7.0中20mg/ml HRP−COOH 1mlに、固体の2,2′−
ビスオキシ（エチルアミン）二塩酸塩8.86mgを加えた。
反応混合物のpHを0.2M Na2HPO4により7.0に調整した。
この混合物にEDAC14mgを加え、反応混合物を穏やかに攪
拌しながら４℃で２時間インキュベートした。0.05M N
aPi、0.05M NaCl/pH＝7.8で平衡化したSephadex Ｇ−
25カラムによって、HRP−スクシニル−ビス−NH2から未
反応低分子量物質を除去した。反応性アミノ基の数はTN
BSAにより、HRP−スクシニル−ビス−NH2あたり1.5と測
定された。HPR−スクシニル−ビス−NH2をCM−Sephadex
（Ｃ−50）上で精製すると、２種の主生成物、（１）１
個のアミノ基を有するHRP−スクシニル−ビス−NH2およ
び（２）HRPあたり２個のアミノ基を有するHRP−スクシ
ニル−ビス−NH2が分離された。
2.ジゴキシン−NHSの調製 20mgのDig−CMO、5mgのNHSおよび9mgのEDACをDMF0.2m
l中に含有する溶液を、室温で攪拌しながら一夜（o/n）
インキュベートした。濾過して不溶性の物質を除去した
のち、溶媒（DMF）をロータリーエバポレーターで除去
した。
3.HRP−スクシニル−オキシビス（エチルアミン）−ジ
ゴキシン 0.05M NaPi、0.05NaCl/pH＝7.8中1.3mg/mlのHRP−ス
クシニル−ビス−NH2（HRPあたり２つの反応性アミノ基
を有する）4mlに、４℃で、DMF中１μmole/mlのDig−NH
S 1.3mlを加えた（４×324μ、15分毎に325μのDi
g−NHS溶液を添加した）。反応混合物を次に、４℃で攪
拌しながら３時間インキュベートした。2Mグリシン/pH
＝8.0を150μ加え、さらに１時間室温でインキュベー
トして反応を停止させた。最後に反応混合物を遠心分離
して不溶性物質を除去し、0.05M Borax中Sephadex Ｇ
−25上で精製した。TNBSAを用いて残った反応性アミノ
基を滴定して、ハプテン数は約２と評価された。この接
合体は４℃で保存した。
B. AbDig−ビオチンの調製 抗−ジゴキシン抗体を固定プロテインＡで精製して、
AbIgG分画を得た。次に、このAb（0.05M NaPi,0.05M
NaCl/pH＝7.8中約２〜2.5mg/ml）とビオチン−LC−NHS
（まずDMF中に可溶化し、反応にはその小部分を使用）
と混合し、４℃で３時間インキュベートしてAbDig−ビ
オチンを製造した。反応混合物中の反応原料のモル比は
Ab:ビオチン−LC−NHS＝1:25とした。結合しなかったビ
オチンをSephadex Ｇ−25カラムで除去した。最終の接
合体は0.05M NaPi、0.001％チメロサール/pH＝7.4中に
４℃でまたは凍結して保存した。
C. Dig−LC−Ｆを調製 この試薬は、（１）Ｆ−NHS、（２）Ｆ−LC−NH2、お
よび（３）Dig−LC−Ｆを調製する３連続工程で製造し
た。
1.F−NHSの調製 DMF中100mg/ml6−カルボキシフルオレセインおよび3
0.6mg/mlNHSの混合物2mlに、275mg/mlDCC 0.4mlを加え
た。この混合物を、暗所、室温でo/n攪拌した。生成し
たジシクロヘキシル尿素を濾過して除く。Ｆ−NHSの生
成を、CH2CH2:メタノール：酢酸＝85:15:1の溶媒系を使
用するシリカ板上薄層クロマトグラフィーTLCによって
調べた。DMFをロータリーエバポレーターで除去し、生
成物（Ｆ−NHS）を強力な減圧下でさらに乾燥し、４℃
でデシケーター中に保存した。
2.F−LC−NH2の調製 LC 1.5mlに、DMF中125mg/mlのＦ−NHS 1.2mlを加
え、暗所、室温で攪拌しながらo/nインキュベートし
た。Ｆ−NHC:LCのモル比は1:40とした。反応混合物を0.
5M NaPi/pH5.0で1/20に希釈し、混合物のpHをリン酸に
よって5.0に調整した。全混合物を、0.5M NaPi/pH＝5.
0中に平衡化した（2.5×10cm）BioRex−70カラムに負荷
した。負荷後、カラムを開始緩衝液ですべての3,3′−
ジアミノ−Ｎ−メチルジプロピルアミンが除去されるま
で（TNBSA反応でモニタリング）洗浄した。カラムを0.0
01M NaPi/pH＝6.0で洗浄して６−カルボキシフオレス
セイン來雑物を除去した。低イオン強度緩衝液での洗浄
により、６−カルボキシフルオレスセインのみでなく、
フルオレセイン含有來雑物も除去される。カラムを脱イ
オン水（Ｄ−H2O）で洗浄して塩を除去した。最後にカ
ラムを0.8M NH4OHで洗い流した。水酸化アンモニムを
凍結乾燥によって除去した。純度をチェックしたのち、
生成物を−20℃のデシケーター中に保存した。反応は濾
紙電気泳動（0.05M NaPi/pH＝5.8,20分）およびTLC（C
18プレート、溶媒としてＤ−H2O中50％メタノールを用
いて）によって追跡した（生成物の純度もチェックし
た）。
3.Dig−LC−Ｆの調製 DMF/DMSO（5:1）溶媒1.5ml中に23.05mg（0.05mmole）
Dig−CMO、50.35mg（0.1mmole）フルオレスセイン−LC
−NH2および19.2mg（0.1mmole）EDACを含む溶液を、暗
所、室温で一夜攪拌した。3mlのＤ−H2Oを加えるとDig
−LC−ＦおよびDig−CMOが沈殿し、これを濾過し、溶媒
を捨てた。濾過された物質をCH2CH2:メタノール：酢酸
＝60:40:5からなる溶媒系に最溶解し、同じ溶媒系中シ
リカゲルカラム（1.5×20cm）上に負荷した。これらの
条件下には、Dig−CMOはDig−LC−Ｆ接合体の前を移動
し、Ｆ−LC−NH2はカラムの項部に結合したままであっ
た。物質の純度は、上述の溶媒系を用いてTCLシリカゲ
ルプレート、およびpH＝5.8での濾紙電気泳動によって
調べた。精製された物質から溶媒をロータリーエパポレ
ーターにより減圧下で除去し、生成物を最小容量のメタ
ノール/DMF（70:30）に再溶解し、遠心分離して不溶性
物質（シリカゲル）を除去した。最後の工程は、精製時
に溶解して生成物と共溶出することのあるシリカゲルの
大部分を除去するために実施された。生成物はメタノー
ル/DMF（70:30）溶媒系中−10℃〜−20℃で保存した。
生成物の濃度は、既知量の６−カルボキシフルオレセイ
ンを用いて作成した標準曲線から、A490によって求め
た。
D. 抗−フルオレセイン−HRP接合体の調製 使用される抗−フルオレセイン抗体は、標準的モノク
ローナル抗体製造法（Milstein,C.＆kohler,C.:Nature,
256:495,1975）を用いて製造されたモノクローナル抗−
フルオレセイン抗体であった。HRPに接合させる前に、
これらの抗体は固定化プロテインＡまたはAbxマトリッ
クス（Sephacryl S−200のサイジングカラムと組合せ
て）によりIgG分画に精製した。後者の操作pH範囲は5.8
〜7.0とした。
1.HRP−NHSの製造 接合体の製造にはスクシニル化HRP（HRP−COOH）を使
用した。0.003M NaPi/pH＝6.9中20mg/mlHRP−COOH1.25
mlに、13mgのスルホ−NHSを加えた。混合物のpHを0.2M
Na2HPO4によって6.9に戻して調整したのち、20mgのED
ACを加えた。反応混合物を室温で20分間インキュベート
したのち、PBS/pH＝7.1中Sephadex Ｇ−25カラム上で
精製した。精製したHRP−NHSは直ちに、フルオレセイン
抗体（AbF）との接合に使用した。
2.抗−フルオレセイン−HRP接合体（AbF−HRP）の製造 接合前に、フルオレセイン抗体を0.02M NaPi、0.14M
NaCl/pH＝7.2に対して透析し、F520を最終濃度が結合
部位と等モルになるように添加した（F520は抗−フルオ
レセイン抗体の結合部位を遮断するために使用され
た）。
20mg/mlHRP−NHS 0.9mlにPBS中2mg/mlAbF520の3mlを
加え、混合物を４℃で4.5時間インキュベートした（混
合物を最初に濃縮すると、接合の化学的効率は改善され
るが、凝集の形成を最小限にするように注意が必要であ
る）。ヒドロキシルアミンを反応混合物中0.1Mの終濃度
（pH＝7.0）になるように加えて反応を停止させ、一夜
４℃でインキュベートした。反応混合物を、アミコン濃
縮装置によりYM−10膜を用いて、約2mlに濃縮し、つい
でSephacryl S−300カラム（1.5×114cm）上で精製し
た。MW＝200K〜250Kに相当するピーク物質をアッセイに
使用した。
E. アビジン−ガラスビーズ（GB）の製造 直径約0.75mmのガラスビーズ（Glen Mills,Inc.,Mayw
ood,NJ）をまず５％硝酸中で１時間煮沸して清浄化し、
ついで洗液のpHが中性になるまで脱イオン水で洗浄し
た。ビーズを室温で真空下に乾燥した。
酸洗浄ビーズ1kgに、酢酸エチル300ml中1mlのアミノ
プロピルトリエトキシシランに加えた。次に混合物をロ
ータリーアスピレーター中に取り、溶媒を除去すると、
ビーズはアミノシラン試薬の薄いフィルムによって被覆
された。ビーズをついでステンレス鋼反応器に移し、窒
素／アルゴン雰囲気下、オーブン中で130℃に一夜加熱
した。冷却後ビーズはそのまま次工程に使用した。
アミノ化されたビーズ500gを傾斜組織培養フラスコに
取り、これに0.1Mホウ酸ナトリウム（pH9.0）170mlを加
え10分間放置した。無水コハク酸（20mlDMF中2.0g）の
溶液をピペットで添加した。フラスコに栓をして手で振
盪した。無水コハク酸溶液の最終添加後にすべての液体
を除去し、ビーズは脱イオン水200ml×４で洗浄した。
ビーズを１回、0.1M MES（２−［Ｎ−モルホリノ］
エタンスルホン酸）pH5.2の150mlで洗浄したのち、ビー
ズを丁度覆う液量のMESに再懸濁した。MES2ml中100mgの
EDAC（１−エチル−３−［ジメチルアミノプロピル］カ
ルボジイミド）を一度に加え、手で振盪して５分間混合
した。アスピレーターを用いて液体を除去し、アビジン
（20mg）の20mlMES溶液およびBSA（40mg）を一度に加え
た。ビーズを手で混合し、さらにMES緩衝液をビーズが
丁度覆われるまで加えた。最後に培養フラスコを軌道振
盪器に置き、内容物を４℃で一夜振盪した。
ついで、ビーズを1N NaCl（200ml×４）、次に脱イ
オン水（200ml×４）で洗浄した。各洗浄の前後に、液
体は完全に除去した。ビーズをついで0.1％BSAおよび2.
5％スクロース含有リン酸−食塩緩衝液（20mMリン酸
塩、140mM NaCl、0.02％NaN3、pH7.4）で処理した（15
0ml×３）。過乗の液体を除去し、湿ったビーズを真空
デシケーター中の容器に移した。
最後に、米国標準試験用篩No.16または20を通過さ
せ、保存中に互いに付着するのを防ぐため、カゼイン末
をビーズに散布した。
3H−ビオチンとの結合試験によれば、このようにして
製造されたビーズには1gあたり２〜11μｇの活性アビジ
ンが導入されていた。
F. TMB/H2O2HRP基質 TMBおよび尿素過酸化水素の濃厚保存溶液は別個に調
製し、凍結保存した。新鮮な操作用基質溶液は、各回、
２種の試薬溶液を希釈し、混合して調製した。濃厚保存
溶液は次のようにして調製した。
TMB保存溶液（溶液１） 6.82gクエン酸（MW＝192.1） 0.62gTMB二塩酸塩（MW＝313.3） 100mlのＤ−H2Oに溶解する 尿素過酸化水素保存溶液（溶液２） 5gのクエン酸三ナトリウム二水和物（MW＝294.1） 0.372gEDTA（Na4）（MW＝380.2） 0.752g尿素H2O2（MW＝94.07） 100mlのＤ−H2Oに溶解する 基質操作用溶液の調製 0.125M NaH2PO4 8ml 1mlの溶液１ 1mlの溶液２ 混合後、直ちに使用した アッセイプロトコール ジゴキシンアッセイのプロトコールは以下の３部から
なる。すなわち、１）溶液相でのアッセイ成分（ビオチ
ン−AbDig＋Dig−LC−Ｆ＋AbF−HRP）間の結合反応によ
る複合体（ビオチンAbDig・Dig−LC−Ｆ・AbF−HRP）の
形成、２）GB−アビジンによる複合体の結合と非結合ア
ッセイ成分からの分離、および３）酵素基質の添加と発
色である。
ジゴキシンアッセイは10×75mmの使い捨てガラスチュ
ーブ中に、正常ヒト保存血清中標品または未知サンプル
50μ、アッセイ緩衝液（0.2M NaPi、0.14M NaClお
よび0.1％BSA、pH7.4）中1.74ng/mlDig−LC−F50μ、
および80ng/mlビオチン−AbDigと１μg/mlAbF−HRP接合
体の混合物100μを順次加えて行われた。アッセイ混
合物をボルテックスミキサー中で攪拌し、37℃で10分間
インキュベートした。インキュベーション後、各チュー
ブに0.65gのGB−アビジンを加えて、結合シグナル発生
体（AbF−HRP）を非結合成分からの分離を行い、ついで
37℃で10分間インキュベートし、最後に洗浄緩衝液（0.
01M NaPi,pH7.2）４×1mlで洗浄した。洗浄後、各チュ
ーブにHRP基質（TMB/尿素H2O2）0.3mlを加え、37℃で５
分間インキュベートした。記載の方法で作成した標準曲
線を用い、39例の患者サンプルについてジゴキシン濃度
を定量した。一例として第１図に示されているように、
得られた結果は既知のラジオイムノアッセイ（RIA）で
得られた値とよく一致した。
例2:総T3の不均一系酵素ベースイムノアッセイ 材料の
調製 A. T3−LC−Ｆ接合体の製造 この試薬は、（１）Ｆ−NHS、（２）Ｆ−LC−NH2およ
び（３）T3−LC−Ｆを製造する３連続工程で製造され
た。Ｆ−NHSおよびＦ−LC−NH2の製造は例１に記載した
と同様であった。
DMF/DMSO（4:1）溶媒1ml中に、トリヨードサイロギ酸
30.4mg（0.05mmole）、Ｆ−LC−NH250.35mg（0.1mmol
e）およびEDAC19.2mg（0.1mmole）を含む溶液を、暗
所、室温で一夜攪拌した。T3−LC−Ｆおよびトリヨード
サイロギ酸（未反応で残っていれば）をＤ−H2O5mlを加
えて沈殿させ、濾過し、溶媒を捨てた。濾過された物質
をCH2Cl2:メタノール：酢酸（50:50:5）からなる溶媒系
に再溶解し、同じ溶媒系中に1.5×20cmシリカゲルカラ
ム上に負荷した。これらの条件下には、トリヨードサイ
ロギ酸はT3−LC−Ｆ接合体の前を移動し、Ｆ−LC−NH2
はカラムの頂部に結合したままであった。この物質の純
度は、上述の溶媒系を用いてTLCシリカゲルプレートで
調べた。調製された物質からロータリーエバポレーター
で溶媒を除去し、生成物を最小容量のメタノール/DMF
（70:30）に再溶解した。この最終工程は、精製時に溶
解して生成物と共溶出するシリカゲルの大部分を除去す
るために実施した。生成物は、メタノール/DMF（70:3
0）溶媒系中に−20℃で保存した。保存溶液中のT3−LC
−Ｆの濃度は、既知量の６−カルボキシ−フルオレセイ
ンを用いて作成した標準曲線からA490によって測定し
た。
B. AbT3−ビオチンの製造 抗−T3抗体は、固定化プロテイン−Ａを用いてIgG分
画に精製した。抗体IgGはビオチン−LC−NHSを用いてビ
オチン化した（反応混合物中のモル比は、Ab:ビオチン
−LC−NHS＝1:25とした）。非結合ビオチンをSephadex
−G25カラムで除去し、AbT3−ビオチンは0.05M NaPi/p
H＝7.4中、４℃でまたは凍結して保存した。
C. アビジンのガラスビーズ（GB）へのカップリング この試薬は0.5mm〜1.0mmの非孔性ガラスビーズを３−
アミノプロピルトリエトキシシランで処理して、ガラス
ビーズの表面上に反応性アミノ基を生成させることによ
って製造した。このGB−NH2をついでEDACを用いてCMデ
キストランでコートし、最後にスクシニル化してすべて
のアミノ基をカルボキシル基に変換した。アビジンはED
AC化学によってCK−デキストラン被覆GBにカップリング
させた。最後に、アビジン標識ガラスビーズを2.5％ス
クロース、0.1％BSA含有溶液で被覆した。ビーズを減圧
下に乾燥してアッセイに使用した。
例１にはアビジン被覆ガラスビーズの製造のための別
法が与えられている。
D. アッセイ操作溶液 1.アッセイ緩衝液 0.075Mバルビタールナトリウム、0.2M NaCl、0.002
％チメロサール、0.1％BSA、pH＝8.6 2.放出試薬（RR） 1mg/mlANS、5mM EDTA、0.5mg/mlBGG、0.5mg/mlヒツ
ジIgG、４％正常マウス血清を含有するアッセイ緩衝液
を血清蛋白質から結合T3を放出させるために使用した。
3.TMB/H2O2HRP基質 例１に記載したと同様にして濃厚保存溶液を調製し
た。
アッセイプロトコール アッセイは10×75mmの使い捨てガラスチューブ中に、
市販の標準品または未知サンプル50μ、放出試薬中1.
5ng/mlのT3−LC−F50μ、80ng/mlビオチン−AbT3と１
μg/mlAbF−HRP接合体の混合物100μを順次加えて実
施した。アッセイ混合物をボルテックスミキサー中で攪
拌し、37℃で15分間インキュベートした。インキュベー
ション後、結合シグナル発生体（AbF−HRP）の非結合成
分からの分離を、各チューブへのGB−アビジン0.65gの
添加、37℃での10分間のインキュベーションおよび洗浄
緩衝液（0.01M NaPi、pH7.2）４×1mlでの洗浄によっ
て実施した。洗浄後、各チューブあたり0.3mlのHRP基質
（TMB/尿素H2O2）を加え、37℃で５分間インキュベート
した。1mlの1N H3PO4を加えて反応を停止させ、発色量
をA450で測定した。上述の方法で作成した標準曲線を用
い、41例の患者血清サンプルについてT3濃度を測定し
た。得られた結果は、一例として第２図に示されている
ように、既知のラジオイムノアッセイ（RIA）で得られ
た値とよく一致した。
例3:TSHの検出のための不均一系酵素ベースイムノアッ
セイ 材料の調製 A. AbTSHβ＃１−ビオチンの製造 抗−TSH抗体は、固定化プロテインＡによって精製し
てAbIgG分画を得るか、純粋な市販品（Bios Pacific,Me
nlo Park,CA;Cambridge medical,Cambridge,MA）を入手
した。Ab−ビオチンはAb（0.1M NaPi,0.2MNaCl/pH7.5
中１〜3mg/ml）とスルホ−NHS−LC−ビオチンを混合し
て製造した。スルホ−NHS−LC−ビオチンは３〜５回に
分けて15分間を要して加え、反応は室温で1.5時間進行
させた。結合しなかったビオチン化試薬はSephadex Ｇ
−25カラムによって除去した。Ab:スルホ−NHS−LC−ビ
オチンのモル比は1:10,1:20および1:40とした。接合体
は0.001％チメロサールを含有する反応緩衝液中に保存
した。
B. AbTSHβ＃２−F1の製造 1.F−NHSの製造 377.12mgの６−カルボキシフルオレセインおよび115m
gのNHSを含有するDMF3.4mlに、206.3mgのDCCを含有する
DMF0.6mlを加えた。混合物を一夜、室温で攪拌した。ジ
シクロヘキシル尿素を濾去した。Ｆ−NHSは、ジクロロ
メタン：メタノール：酢酸＝90:10:1を用いてシリカプ
レート上TLCによってチェックした。Ｆ−NHSはDMF中に
−20℃で保存した。
2.AbTSHβ−Ｆの製造 抗−TSHをプロテインＡクロマトグラフィーで精製
し、0.1M NaPi、0.2M NaCl、5mM EDTA、pH7.3に透析
した。Ab−ＦはDMF中Ab（1.5〜2.0mg/ml）をＦ−NHSと
混合し、室温で１時間反応させて整造した。Ｆ−NHS:Ab
の比は12.5:1および25:1とした。
C. 抗−フルオレセイン−HRP接合体の製造 試薬は例１に記載したと同様にして製造した。
D. アッセイプロトコール TSHアッセイのプロトコールは３部からなる。すなわ
ち、１）溶液相におけるアッセイ成分（ビオチンA
bTSH1、TSH、ATSH2−ＦおよびAbF−HRP）間の結合反
応、２）複合体の非結合成分からのGB−アビジンによる
分離、および３）酵素基質の添加および発色である。
TSHアッセイは10×75mmガラスチューブ中で実施す
る。様々な量のTSHを含有するヒト血清またはウシ血清1
50μに、AbF−HRP200ngを含有する緩衝液（0.01M Na
Pi、0.150M NaCl、1.0％BSA、0.1％Tween−20）20μ
および、180ngのAbTH1−ビオチンとAbTSH2−Ｆを含有す
る緩衝液20μを加える。アッセイチューブはボルテッ
クスミキサー上で攪拌し、37℃で12.5分間インキュベー
トした。インキュベーション後、0.65gのGB−アビジン
を加え、インキュベーションをさらに12.5分間続けた。
ついで、ビーズを1.0mlの洗浄緩衝液（0.01M NaPi、0.
15M NaCl、0.1％Tween、pH7.4）で４回洗浄した。洗浄
後、0.2mlのHRP基質（TMB/H2O2）を加え、５分間発色さ
せた。0.4mlのH3PO4を加えて反応を停止させた。サンプ
ルを全容1.0mlに希釈し、OD450における光学密度を測定
した。結果は、0.05μI.U TSH/ml血清で再現できた。
例4:hCGの検出のための不均一系酵素ベースイムノアッ
セイ 材料の調製 A. AbhCGα−ビオチンの製造 抗−hCG抗体は、固定化プロテインＡによって精製し
て、抗体IgG分画を得た。このビオチン−AbhCGαはNHS
−SC−ビオチンを用いて製造した。（このAbhCGαはhCG
のα−サブユニットに特異性のモノクローナル抗体であ
り、標準モノクローナル抗体技術を使用して、実験室で
製造した。）上記Ab（２〜4mg/ml）を0.1M NaHCO3、pH
8.2中に透析した。
NHS−LC−ビオチンは一夜にわたり乾燥させた。Abに
対して50倍モル過剰のNHS−LC−ビオチンを、攪拌され
ているAbにゆっくり加え、室温で1.5時間攪拌した。結
合しなかったビオチン化試薬は0.02％NaN3を使用し、PB
Sに対して透析することによって分離した。接合体はPBS
/0.02％NaH3中に保存した。
B. AbhCGβ−Ｆの製造 A. NES−Ｆの製造:AbhCGβ−フルオレセインは、NHS/ED
AC化学によって製造した。（このAbhCGβはhCGのβ−サ
ブユニットに対して特異性のモノクローナル抗体であ
り、標準モノクローナル抗体技術を使用して、実験室で
製造した）。この抗体（プロテインＡカラムで精製した
もの）を0.1M NaHCO3、pH8.2中に透析した。６−カル
ボキシフルオレセイン、スルホ−NESおよびEDACは、P2O
5上で一夜にわたり乾燥させた。スルホ−NHS2.1mg（9.7
μモル）、EDAC1.74mg（9.06μモル）および６−COOH−
F2.6mg（16.9μモル）を乾燥DMF138μ中に溶解し、暗
所で、４℃において一夜にわたり攪拌した。シリカ板上
でクロロホルム；メタノール：酢酸90:10:1を使用する
薄層クロマトグラフィ（TLC）を行ない、NHS−Ｆ−エス
テル反応が完了に達したかを決定した。
B. AbhCGβ−フルオレセイン： 攪拌されているAb（３〜5mg/ml）に、30倍モル過剰の
NHS−Ｆをゆっくり加え、この反応は室温で２時間進行
させた。未反応のNHS−ＦはPBS/0.02％NaH3に対して透
析することによって分離し、接合体はこの緩衝液中に保
存した。
C. AbF−HRP接合体の製造 フルオレセイン抗体は、プロテインＡカラムで精製し
た。この接合体はチオール化抗フルオレセインAbとマレ
イミド化HRPとの反応によって製造した。チオール化AbF
はSAMSAとの反応によって製造した。HRPは、スルホ−SM
CCとの反応によって、マレイミド化した。下記のプロト
コールをAbF−HRP接合体の製造に使用した。
HRP（9.6mg/ml）は、マレイミド化処理の間、50mMホ
ウ酸塩緩衝液中に保持した。このHRPに、10倍過剰のス
ルホSMCC（同一ホウ酸塩緩衝液中）を加え、反応を25℃
で２時間、進行させた。この反応混合物をSephadex Ｇ
−25カラムに通し、緩衝液Ｃ（0.1M NaH2PO4、0.1M N
aCl、5mM EDTA、pH7.5）中に透析した。
AbFをチオール化するために、50mM重炭酸塩緩衝液、p
H9.5中のAb17.9mg/mlおよび乾燥ジメチルホルムアミド
（DMF）中に0.1Mで溶解したｓ−アセチルメルカプト無
水コハク酸（SAMSA）を使用した。攪拌されているAb
Fに、24倍モル過剰のSAMSAをゆっくり加え、４℃で1.5
時間、反応させた。過剰の試薬はSephadex Ｇ−25カラ
ムでゲルクロマトグラフィによって分離した。生成物
は、緩衝液Ｃ中に透析した。脱アシル化は、誘導された
AbFをヒドロキシルアミンの溶液中でインキュベートす
ることによった達成した。攪拌されている、誘導された
AbFに、ヒドロキシルアミンの1M溶液をゆっくり加え（1
00mMのヒドロキシルアミン最終濃度まで）、窒素雰囲気
の下に、25℃で１時間、インキュベートした。このAbF
−SHはSephadex Ｇ−25カラムで精製した。
接合体は、AbF−SHに12倍モル過剰のHRP−マレイミド
を加え、室温で３時間攪拌した。反応は、２−メルカプ
ト酢酸の添加（1mMの最終濃度まで）および15分間の攪
拌によって、止めた。ヨード酢酸を加え（2mMの最終濃
度）、過剰の２−メルカプト酢酸を抑え、この反応を５
分間、進行させた。接合体は、Sephacryl S.200カラム
で精製した。接合体の最終濃度は、IgG当り6.2HRPで、
1.4mg/mlであった。
hCGアッセイプロトコール アッセイは、12×75mm使い捨てガラスチューブ中で、
標準血清試料または未知血清試料100μ、アッセイ緩
衝液中の0.4μg/ml（20ng/試験）AbF−HRP50μおよび
アッセイ緩衝液中の６μg/mlビオチン−AbhCGα（300ng
/試験）と0.6μg/ml AbhCGβ−Ｆ（30ng/試験）との混
合物50μを順に添加することによって行なった。この
アッセイ混合物は、おだやかに混合し、次いで37℃で13
分間、インキュベートした。インキュベーションの後
に、結合したシグナル発生体（AbF−HRP）を非結合成分
から分離するために、各チューブにGB−アビジン0.65g
を添加し、37℃で13分間インキュベートし、次いで洗浄
緩衝液（10mM リン酸塩、pH7.2）４×1mlで洗浄した。
洗浄の後に、HRP基質（TMB/尿素H2O2）0.25ml/チューブ
を加え、37℃で５分間、インキュベートした。反応は、
1N H2SO41mlの添加によって止めた。発色量をA450で測
定した。
hCGアッセイの結果 このアッセイおよび対照アッセイ（Hybritech Tandem
−Ｅ）で、44の患者の未知試料を試験した。スカッター
グラムから誘導された等式はｙ＝0.954×−3.2およびγ
＝0.956（γは相関係数）であった。
以上の記述および実施例は、その好ましい態様におけ
る混合物を完全に開示するためのものである。本技術分
野の通常の熟練者には様々な改変が自明であろうが、こ
れらは本発明の特許請求の範囲に包含されるものであ
る。
【図面の簡単な説明】 第１図は、患者血清試料中ジゴキシン濃度に対する例１
の結果と既知のRIA値との相関を示すグラフであり、そ
して第２図は例２によって測定された血清試料（ng/d
l）もしくはRIA（臨床実験室であらかじめ測定された）
とT3濃度との相関を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 フライアー キラコシアン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サ ン ジョセ，ウイリアムズ ロード 4851 (72)発明者 リチャード ピー．ワッツ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ブ リスベン，ピー．オー．ボックス 223 (56)参考文献 特開 昭55−10590（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−30963（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−250257（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−118656（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/543

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】イムノアッセイを行うにあたり、（ａ）
    （ｉ）第一の小分子と（イ）被験物質（Ａ）に相補性の
    第一の特異的結合対（sbp）メンバーまたは（ロ）上記
    被験物質の類縁体との接合体（C1）、（ii）上記被験物
    質の含有が疑われるサンプル、（iii）第二の小分子と
    （イ）上記被験物質に相補性の第二のsbpメンバーまた
    は（ロ）上記被験物質の類縁体との接合体（C3）を水性
    メジウム中に混合し（ただしこの場合、C1およびC3の少
    なくとも一方は、上記被験物質に相補性のsbpメンバー
    を含有する）、（ｂ）この水性メジウムを工程（ａ）と
    同時にまたは工程（ａ）に続くインキュベーション後
    に、上記第二の小分子に対する第二の受容体に結合した
    支持体（Ｓ）と、上記接合体（C1）を含む複合体が上記
    支持体に上記サンプル中の上記被験物質の存在の関数と
    して結合する条件下に、混合し、（ｃ）上記水性メジウ
    ムを上記支持体とインキュベートし、（ｄ）上記メジウ
    ムと上気支持体とを分離し、（ｅ）標識と第一の小分子
    に対する第一の受容体との接合体（C2）が上記水性メジ
    ウム中に存在しない場合はその接合体（C2）溶液を支持
    体と混合し、（ｆ）上記標識の存在または量を上記支持
    体について観察するための方法。
  2. 【請求項２】サンプル中の被験物質の検出のためのイム
    ノアッセイを行うにあたり、（ａ）（ｉ）第一の小分子
    と上記被験物質の類縁体との接合体（Ｃ′１）、（ii）
    上記被験物質の含有が疑われる上記サンプル、（iii）
    第二の小分子と上記被験物質に相補性の抗体との接合体
    （Ｃ′３）、（iv）標識と上記小分子の一方に相補性の
    抗体との接合体（Ｃ′２）を水性メジウム中に混合し、
    （ｂ）この水性メジウムを工程（ａ）と同時にまたは工
    程（ａ）に続くインキュベーション後に、上記小分子の
    他方に対する受容体に結合した支持体（Ｓ）と、上記標
    識を有する複合体が上記サンプル中に存在する上記被験
    物質の量に相反する関係で上記支持体表面に結合する条
    件下に混合し、（ｃ）上記メジウムと上記支持体を分離
    し、（ｄ）上記標識の存在または量を上記メジウムまた
    は上記支持体について観察する請求項（１）記載の方
    法。
  3. 【請求項３】サンプル中における存在が疑われるモノエ
    ピトープ抗原を検出するにあたり、上記サンプル中の上
    記抗原の量に相反する関係で、複合体 標識−AbF:F−ハプテン:Abハプテン−X:Y−支持体 （式中、標識−AbFは標識に結合した第一の小分子
    （Ｆ）に対する抗体であり、Ｆ−ハプテンは上記抗原の
    類縁体に結合した上記第一の小分子であり、Abハプテン
    −Ｘは第二の小分子（Ｘ）に結合した上記抗原に対する
    抗体であり、Ｙ−支持体は支持体に結合した上記第二の
    小分子に対する受容体である） を形成させる工程からなる請求項（１）記載の方法
  4. 【請求項４】サンプル中の抗体被験物質（Ａ）の検出の
    ためのアッセイを行うにあたり、（ａ）（ｉ）第一の小
    分子と（イ）上記抗体被験物質に相補性の抗体または
    （ロ）上記抗体被験物質の抗原との接合体（Ｃ″１）、
    （ii）標識と上記第一の小分子の第一の受容体との接合
    体（Ｃ″２）、（iii）上記抗体被験物質の含有が疑わ
    れるサンプル、（iv）（イ）上記抗体被験物に相補性の
    第二の抗体または（ロ）上記抗体被験物質の抗原と第二
    の小分子との接合体（Ｃ″３）を水性メジウム中に混合
    し、（ｂ）この水性メジウムを工程（ａ）と同時にまた
    は工程（ａ）に続くインキュベーション後に、上記第二
    の小分子に対する第二の受容体に結合した支持体（Ｓ）
    と、上記標識を含む複合体が上記サンプル中の上記被験
    物質の存在の関数として上記支持体の表面に結合する条
    件下に混合し、（ｃ）上記メジウムと上記支持体とを分
    離し、（ｄ）上記サンプル中の抗体の存在または量に関
    連する上記標識の存在または量を上記メジウムまたは支
    持体について観察する請求項（１）記載の方法
  5. 【請求項５】サンプル中に存在するハプテンを検出する
    にあたり、複合体 標識−AbF:F−ハプテン:Abハプテン−X:Y支持体 （式中、標識−AbFは標識に結合した抗−フルオレセイ
    ン抗体であり、Ｆ−ハプテンはフルオレセイン結合ハプ
    テンであり、Abハプテン−Ｘはビオチンに結合した抗−
    ハプテン抗体であり、Ｙ−支持体は支持体に結合したア
    ビジンである）を形成させる工程からなる請求項（１）
    記載の方法
  6. 【請求項６】第一の小分子の分子量は150〜1000である
    請求項（１）〜（５）のいずれか一項に記載の方法
  7. 【請求項７】第二の小分子の分子量は150〜1000である
    請求項（１）〜（５）のいずれか一項に記載の方法
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