JPH0814579B2 - 特異的結合性物質の測定法及び試薬 - Google Patents
特異的結合性物質の測定法及び試薬Info
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- JPH0814579B2 JPH0814579B2 JP1264061A JP26406189A JPH0814579B2 JP H0814579 B2 JPH0814579 B2 JP H0814579B2 JP 1264061 A JP1264061 A JP 1264061A JP 26406189 A JP26406189 A JP 26406189A JP H0814579 B2 JPH0814579 B2 JP H0814579B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、試料溶液を、R3がR1及びR2並びに測定すべ
き物質と特異的結合性であり、R2が固相への結合を仲介
しかつR3が標識を担持する少なくとも３種のレセプター
R1、R2及びR3と一緒に恒温保持し、結合した標識と結合
していない標識とを分離し、かつ両方の相の一方におけ
る標識を測定することにより、特異的結合性物質の測定
法及び好適な試薬に関する。
き物質と特異的結合性であり、R2が固相への結合を仲介
しかつR3が標識を担持する少なくとも３種のレセプター
R1、R2及びR3と一緒に恒温保持し、結合した標識と結合
していない標識とを分離し、かつ両方の相の一方におけ
る標識を測定することにより、特異的結合性物質の測定
法及び好適な試薬に関する。
従来の技術 体液及び組織中では、免疫学的に活性である、即ち特
異的な結合性パートナーと結合性でありかつ人体の一定
の疾患又は健康状態のパラメータとして使われる物質が
極めて多数産生する。とりわけ、例えばホルモンのよう
なハプテン、腫瘍マーカーのような蛋白質、蛋白質ホル
モン及びウイルス性蛋白質並びに抗体が挙げられる。薬
物治療の管理にもしばしば血中医薬の測定が必要であ
る。この例は抗てんかん剤、抗生物質、ジギタリス及び
オピエートである。しばしばこれらの物質は非常に僅か
な量で産生するに過ぎないので、その検出にはイムノア
ツセイの原理による方法が使われる。これには多数の方
法がある。種々の免疫学的測定方法は均一（homogen）
法及び不均一（heterogen）法に区分することができ
る。不均一法では常に固相反応が関与し、これにより標
識した成分の結合分を非結合分から分離する。均一法で
は、結合した標識と非結合の標識との分離は行なわず、
それ故結合した標識と非結合の標識との区別化は他の方
法により行なわなければならない。
異的な結合性パートナーと結合性でありかつ人体の一定
の疾患又は健康状態のパラメータとして使われる物質が
極めて多数産生する。とりわけ、例えばホルモンのよう
なハプテン、腫瘍マーカーのような蛋白質、蛋白質ホル
モン及びウイルス性蛋白質並びに抗体が挙げられる。薬
物治療の管理にもしばしば血中医薬の測定が必要であ
る。この例は抗てんかん剤、抗生物質、ジギタリス及び
オピエートである。しばしばこれらの物質は非常に僅か
な量で産生するに過ぎないので、その検出にはイムノア
ツセイの原理による方法が使われる。これには多数の方
法がある。種々の免疫学的測定方法は均一（homogen）
法及び不均一（heterogen）法に区分することができ
る。不均一法では常に固相反応が関与し、これにより標
識した成分の結合分を非結合分から分離する。均一法で
は、結合した標識と非結合の標識との分離は行なわず、
それ故結合した標識と非結合の標識との区別化は他の方
法により行なわなければならない。
不均一イムノアツセイを実施するに当り、基本的に２
つの方法があり、一方は測定すべき物質に対する抗体を
固定化しかつ他方は測定すべき物質自体を固定化する。
最初の方法では、測定すべき物質を含有する試料溶液
と、測定すべき物質と標識とからの接合体とを固定化し
た抗体と一緒に恒温保持する。その際に、測定すべき物
質と標識した物質とが抗体への結合をめぐつて競合す
る。溶液中の測定すべき物質の量が多ければ多いほど、
標識した物質は少量でしか結合し得ない。それ故、標識
物質の結合量が測定物質の量の間接的な尺度である。固
相と液相との分離後に、両相の一方における標識を測定
することができる。
つの方法があり、一方は測定すべき物質に対する抗体を
固定化しかつ他方は測定すべき物質自体を固定化する。
最初の方法では、測定すべき物質を含有する試料溶液
と、測定すべき物質と標識とからの接合体とを固定化し
た抗体と一緒に恒温保持する。その際に、測定すべき物
質と標識した物質とが抗体への結合をめぐつて競合す
る。溶液中の測定すべき物質の量が多ければ多いほど、
標識した物質は少量でしか結合し得ない。それ故、標識
物質の結合量が測定物質の量の間接的な尺度である。固
相と液相との分離後に、両相の一方における標識を測定
することができる。
他の別法では、測定すべき物質を含有する試料溶液
を、測定すべき物質に対して特異的な標識した抗体並び
に固定化した試料物質と恒温保持する。この際に、固定
化した試料物質と溶液中に存在する測定すべき物質とが
標識した抗体への結合をめぐつて競合する。測定すべき
物質の量が溶液中に多く存在するほど、固相に固定化し
た試料物質への標識した抗体の結合量は少なくなる。従
つて、結合した標識した抗体の量はこの場合も同様に、
試料溶液中の測定すべき物質の量の間接的尺度である。
ここでも固相と液相との分離後に、結合した標識の量を
測定する。
を、測定すべき物質に対して特異的な標識した抗体並び
に固定化した試料物質と恒温保持する。この際に、固定
化した試料物質と溶液中に存在する測定すべき物質とが
標識した抗体への結合をめぐつて競合する。測定すべき
物質の量が溶液中に多く存在するほど、固相に固定化し
た試料物質への標識した抗体の結合量は少なくなる。従
つて、結合した標識した抗体の量はこの場合も同様に、
試料溶液中の測定すべき物質の量の間接的尺度である。
ここでも固相と液相との分離後に、結合した標識の量を
測定する。
これらの方法の欠点は、変性した抗体をいつも使用し
なければならないことである。第１の方法では抗体固相
に結合させ、第２の方法では抗体を標識物質に結合させ
る。これらの変性は経費がかかり、抗体の性質の望まし
くない変化、例えば特異性及び親和性の低下をもたらす
ことがある。このために、しばしばポリクロナール抗体
を使用できないので、低い交叉反応性及び高い親和性に
するために莫大な経費をかけて選択されたモノクロナー
ル抗体を使用しなければならず、しかもこの抗体は多く
の場合経費のかかる方法で精製しなければならない。更
に、それぞれの測定のためにすべての試薬が特異的であ
るように選択しなければならず、これもまた望ましくな
い。西ドイツ国特許公開第3138489号明細書から、形成
した標識複合体の固定化を抗体を使わずに行なうことは
既に公知であるが、この方法でも標識した抗体、それ故
変性した抗体の使用が必要である。
なければならないことである。第１の方法では抗体固相
に結合させ、第２の方法では抗体を標識物質に結合させ
る。これらの変性は経費がかかり、抗体の性質の望まし
くない変化、例えば特異性及び親和性の低下をもたらす
ことがある。このために、しばしばポリクロナール抗体
を使用できないので、低い交叉反応性及び高い親和性に
するために莫大な経費をかけて選択されたモノクロナー
ル抗体を使用しなければならず、しかもこの抗体は多く
の場合経費のかかる方法で精製しなければならない。更
に、それぞれの測定のためにすべての試薬が特異的であ
るように選択しなければならず、これもまた望ましくな
い。西ドイツ国特許公開第3138489号明細書から、形成
した標識複合体の固定化を抗体を使わずに行なうことは
既に公知であるが、この方法でも標識した抗体、それ故
変性した抗体の使用が必要である。
発明が解決しようとする課題 それ故、本発明の課題は、多方面で使用することがで
き、抗体を変性せずに使用することができかつ必ずしも
モノクロナール抗体を使用する必要のない、免疫学的に
活性な物質の測定法を開示することである。
き、抗体を変性せずに使用することができかつ必ずしも
モノクロナール抗体を使用する必要のない、免疫学的に
活性な物質の測定法を開示することである。
課題を解決するための手段 この課題は、R3がR1及びR2並びに測定すべき物質と特
異的結合性であり、R2が固相への結合を仲介しかつR3が
標識を担持する少なくとも３種のレセプターR1、R2及び
R3と一緒に恒温保持し、結合した標識と結合していない
標識とを分離し、かつ両方の相の一方における標識を測
定することにより、特異的結合性物質の測定法により解
決され、この方法は、レセプターR1として、測定すべき
物質のエピトープと特異的に結合する結合部位を少なく
とも２個有するレセプターを使用し、R2として、特異的
に結合するペアのパートナーP1と、測定すべき物質に相
当するか又はその誘導体でありかつ測定すべき物質のエ
ピトープ少なくとも１個を有する物質Ｓとからの接合体
を使用し、その際にパートナーP1は特異的に結合するペ
アの他方のパートナーであるP2を介して固相に結合して
いるか又は固定化されており、かつR3として、少なくと
も物質Ｓと１種の標識を含有する複合体を使用すること
を特徴とする。
異的結合性であり、R2が固相への結合を仲介しかつR3が
標識を担持する少なくとも３種のレセプターR1、R2及び
R3と一緒に恒温保持し、結合した標識と結合していない
標識とを分離し、かつ両方の相の一方における標識を測
定することにより、特異的結合性物質の測定法により解
決され、この方法は、レセプターR1として、測定すべき
物質のエピトープと特異的に結合する結合部位を少なく
とも２個有するレセプターを使用し、R2として、特異的
に結合するペアのパートナーP1と、測定すべき物質に相
当するか又はその誘導体でありかつ測定すべき物質のエ
ピトープ少なくとも１個を有する物質Ｓとからの接合体
を使用し、その際にパートナーP1は特異的に結合するペ
アの他方のパートナーであるP2を介して固相に結合して
いるか又は固定化されており、かつR3として、少なくと
も物質Ｓと１種の標識を含有する複合体を使用すること
を特徴とする。
本発明方法は、体液又は組織エキス中で検出される、
特異的結合能を有する実質的にすべての物質の測定に好
適であり、その際に低濃度の物質も高濃度のものと同様
に良好に検出可能である。本方法の感度及び精度は従来
公知の方法に比べて改良されている。本発明により、簡
単な試薬で迅速かつ確実に測定することができる。
特異的結合能を有する実質的にすべての物質の測定に好
適であり、その際に低濃度の物質も高濃度のものと同様
に良好に検出可能である。本方法の感度及び精度は従来
公知の方法に比べて改良されている。本発明により、簡
単な試薬で迅速かつ確実に測定することができる。
特に、本方法はハプテン、即ち特異的結合性パートナ
ーに対して結合部位１個だけを有する物質の測定に好適
である。例としてホルモン並びに抗てんかん剤、抗生物
質、ジギタリス及びオピエートのような医薬が挙げられ
る。
ーに対して結合部位１個だけを有する物質の測定に好適
である。例としてホルモン並びに抗てんかん剤、抗生物
質、ジギタリス及びオピエートのような医薬が挙げられ
る。
本発明方法を実施すると公知方法とは異なり抗体の品
質に対する要求は高くなく、それ故直ちにポリクロナー
ル抗体を使用することができることが判明し驚異的であ
つた。更に、得られた空値は極く僅かであり、それ故感
度は公知方法に比べて高いことが認められた。
質に対する要求は高くなく、それ故直ちにポリクロナー
ル抗体を使用することができることが判明し驚異的であ
つた。更に、得られた空値は極く僅かであり、それ故感
度は公知方法に比べて高いことが認められた。
本発明の明細書中でエピトープとは、他の物質との特
異的結合を成立させる結合部位である。エピトープの例
は抗原及びハプテン上の抗原決定基又は蛋白質上の特異
結合部位である。
異的結合を成立させる結合部位である。エピトープの例
は抗原及びハプテン上の抗原決定基又は蛋白質上の特異
結合部位である。
本発明方法を実施するに当り、試料溶液を３種のレセ
プターR1、R2及びR3と恒温保持する。その際、レセプタ
ーR3はレセプターR1及びR2並びに測定すべき物質と特異
的結合性でありかつ標識を有する。レセプターR2は固相
への結合を仲介する。本発明方法により実施することの
できる種々の反応原理は第１図に図示した。優れた方法
は第1a図に図示した実施形である。その際に、特異的に
結合するペアの、P1に対して相補性のP2が多数壁に結合
している反応容器中に、物質Ｓと、特異的に結合するペ
アのパートナーP1とからの接合体であるレセプターR2を
加える。この接合体はパートナーP1を介してパートナー
P2に結合する。引続いて、測定すべき物質のエピトープ
に対して少なくとも２個の結合部位を有するレセプター
R1及び、物質Ｓと標識とからの接合体であるレセプター
R3を反応容器中に加える。溶液中でR2のＳ部分、R3のＳ
部分及び測定すべき物質がレセプターR1への結合をめぐ
つて競合する。例えば、R1が２価の抗体である場合、次
の複合体： R1の両方のパラトープにそれぞれＳを介してR2が結合
している； R1の両方のパラトープに測定すべき物質が結合してい
る； R1の両方のパラトープにＳを介してR3が結合してい
る； 並びに混合複合体、即ち R1の一方のパラトープに測定すべき物質が及び他方の
パラトープにＳを介してR3又はR2が結合している； R1の一方のパラトープにＳを介してR3が及び他方のパ
ラトープにＳを介してR2が結合しているものが生成す
る。
プターR1、R2及びR3と恒温保持する。その際、レセプタ
ーR3はレセプターR1及びR2並びに測定すべき物質と特異
的結合性でありかつ標識を有する。レセプターR2は固相
への結合を仲介する。本発明方法により実施することの
できる種々の反応原理は第１図に図示した。優れた方法
は第1a図に図示した実施形である。その際に、特異的に
結合するペアの、P1に対して相補性のP2が多数壁に結合
している反応容器中に、物質Ｓと、特異的に結合するペ
アのパートナーP1とからの接合体であるレセプターR2を
加える。この接合体はパートナーP1を介してパートナー
P2に結合する。引続いて、測定すべき物質のエピトープ
に対して少なくとも２個の結合部位を有するレセプター
R1及び、物質Ｓと標識とからの接合体であるレセプター
R3を反応容器中に加える。溶液中でR2のＳ部分、R3のＳ
部分及び測定すべき物質がレセプターR1への結合をめぐ
つて競合する。例えば、R1が２価の抗体である場合、次
の複合体： R1の両方のパラトープにそれぞれＳを介してR2が結合
している； R1の両方のパラトープに測定すべき物質が結合してい
る； R1の両方のパラトープにＳを介してR3が結合してい
る； 並びに混合複合体、即ち R1の一方のパラトープに測定すべき物質が及び他方の
パラトープにＳを介してR3又はR2が結合している； R1の一方のパラトープにＳを介してR3が及び他方のパ
ラトープにＳを介してR2が結合しているものが生成す
る。
R2に結合している複合体だけが固定化され、かつレセ
プターR3が結合している複合体だけが結合標識の測定を
介して評価することができる。溶液中に含まれている測
定物質の量が多い程、R1に結合するR2及びR3の量は少な
くなり、従つて固定化される複合体の量は少なくなりも
しくは標識を有する複合体の量は少なくなる。それ故、
結合した標識の割合が測定すべき物質の間接的尺度であ
りかつ検量曲線を介して評価することができる。
プターR3が結合している複合体だけが結合標識の測定を
介して評価することができる。溶液中に含まれている測
定物質の量が多い程、R1に結合するR2及びR3の量は少な
くなり、従つて固定化される複合体の量は少なくなりも
しくは標識を有する複合体の量は少なくなる。それ故、
結合した標識の割合が測定すべき物質の間接的尺度であ
りかつ検量曲線を介して評価することができる。
実施法ｂ）は、試料溶液中に極く僅少濃度で存在する
物質の検出に有用である。この場合、第１工程では、特
異的に結合するペアのパートナーP2に結合しているマト
リクスを測定すべき物質とレセプターR1とを恒温保持す
る。その際に、試料溶液中に存在する測定すべき物質は
レセプターR1と結合する。固相への結合は行なわれな
い。第２工程で、レセプターR2及びR3を添加する。添加
したレセプターは、既に測定すべき物質が一部結合して
いるレセプターR1への結合をめぐつて競合する。測定す
べき物質の結合している量が多ければ多いほど、レセプ
ターR2及びR3の結合し得る量は少なくなる。更に、レセ
プターR2は、マトリクスのパートナーP2と結合し得るパ
ートナーP1を含有するので、生成する複合体の固定化が
もたらされる。この場合にも結合相を液相から分離した
後で、検量曲線を介して標識を評価する。
物質の検出に有用である。この場合、第１工程では、特
異的に結合するペアのパートナーP2に結合しているマト
リクスを測定すべき物質とレセプターR1とを恒温保持す
る。その際に、試料溶液中に存在する測定すべき物質は
レセプターR1と結合する。固相への結合は行なわれな
い。第２工程で、レセプターR2及びR3を添加する。添加
したレセプターは、既に測定すべき物質が一部結合して
いるレセプターR1への結合をめぐつて競合する。測定す
べき物質の結合している量が多ければ多いほど、レセプ
ターR2及びR3の結合し得る量は少なくなる。更に、レセ
プターR2は、マトリクスのパートナーP2と結合し得るパ
ートナーP1を含有するので、生成する複合体の固定化が
もたらされる。この場合にも結合相を液相から分離した
後で、検量曲線を介して標識を評価する。
別法ｃ）は、固相を形成するマトリクス及び標識接合
体はすべての測定に関して同じであつてよい実施形であ
る。この場合もまた第１工程では特異的に結合するペア
のパートナーP2を担持するマトリクスを測定すべき物質
及びレセプターR1と恒温保持し、そのときに測定すべき
物質がレセプターR1に結合し得る。第２工程では、測定
すべき物質とパートナーP1とからの接合体R2と、パート
ナーP2と標識とからの接合体R3′とを同時に加える。測
定すべき物質とパートナーP1とからの接合体R2と試料溶
液からの測定すべき物質がレセプターR1への結合をめぐ
つて競合する。更に、マトリクスに結合したパートナー
P2並びにパートナーP2と標識とからの接合体R3′はパー
トナーP1への結合をめぐつて競合する。この場合も、結
合した標識された複合体の評価を検量曲線を介して行な
う。
体はすべての測定に関して同じであつてよい実施形であ
る。この場合もまた第１工程では特異的に結合するペア
のパートナーP2を担持するマトリクスを測定すべき物質
及びレセプターR1と恒温保持し、そのときに測定すべき
物質がレセプターR1に結合し得る。第２工程では、測定
すべき物質とパートナーP1とからの接合体R2と、パート
ナーP2と標識とからの接合体R3′とを同時に加える。測
定すべき物質とパートナーP1とからの接合体R2と試料溶
液からの測定すべき物質がレセプターR1への結合をめぐ
つて競合する。更に、マトリクスに結合したパートナー
P2並びにパートナーP2と標識とからの接合体R3′はパー
トナーP1への結合をめぐつて競合する。この場合も、結
合した標識された複合体の評価を検量曲線を介して行な
う。
この別法では、R1、つまり特に抗体の濃度及びR2の濃
度は試験における試料濃度と一致する。その際に、パー
トナーP2と標識とからの接合体を、測定すべき物質とパ
ートナーP1とからの接合体R2のほぼ半分以下を結合する
量で使用すると有利であり、それにより接合体R2が、過
剰量で存在すべき、マトリクスに結合したパートナーP2
への結合に関して十分に存在する。P1を含有する接合体
R2の量は、測定すべき物質の量で、つまり約10-5モル／
（例えばテオフイリン）〜10-10モル／（例えばジ
ゴキシン）で使用すると有利である。別法ｃ）ではR2は
P2（マトリクス又は接合体における）に対する結合部位
だけを有していればよく、これにより妨害的な架橋を回
避する。このことは方法ａ）及びｂ）には該当しない。
度は試験における試料濃度と一致する。その際に、パー
トナーP2と標識とからの接合体を、測定すべき物質とパ
ートナーP1とからの接合体R2のほぼ半分以下を結合する
量で使用すると有利であり、それにより接合体R2が、過
剰量で存在すべき、マトリクスに結合したパートナーP2
への結合に関して十分に存在する。P1を含有する接合体
R2の量は、測定すべき物質の量で、つまり約10-5モル／
（例えばテオフイリン）〜10-10モル／（例えばジ
ゴキシン）で使用すると有利である。別法ｃ）ではR2は
P2（マトリクス又は接合体における）に対する結合部位
だけを有していればよく、これにより妨害的な架橋を回
避する。このことは方法ａ）及びｂ）には該当しない。
この実施形は、一方で唯１種の接合体−ＳとP1とから
の接合体−だけを供給する必要がありかつ他方では免疫
反応が均一に進行するという大きな利点を有し、これに
より感度及び再現性は明らかに高まる。
の接合体−だけを供給する必要がありかつ他方では免疫
反応が均一に進行するという大きな利点を有し、これに
より感度及び再現性は明らかに高まる。
従つて、本発明により定義した方法原理には多数の種
々の実施形がある。それぞれ、少なくとも３種のレセプ
ターが必要である。
々の実施形がある。それぞれ、少なくとも３種のレセプ
ターが必要である。
測定すべき物質は特異的結合能を有する物質であつて
よく、かつ特に前記のようなハプテンであつてよい。
よく、かつ特に前記のようなハプテンであつてよい。
第１レセプターR1としては、測定すべき物質のエピト
ープと特異的に結合する結合部位少なくとも２個を有す
るレセプターを使用する。このレセプターはその都度測
定すべき物質に応じて選択する。モノクロナール又はポ
リクロナール抗体もしくはそれらのFab2−フラグメント
を使用すると優れている。
ープと特異的に結合する結合部位少なくとも２個を有す
るレセプターを使用する。このレセプターはその都度測
定すべき物質に応じて選択する。モノクロナール又はポ
リクロナール抗体もしくはそれらのFab2−フラグメント
を使用すると優れている。
レセプターR2は特異的結合性ペアの一方のパートナー
P1と、測定すべき物質に相当するか又はその誘導体であ
りかつ測定すべき物質のエピトープ少なくとも１個を有
する物質Ｓとからの接合体である。特異的に相互に結合
するペアは公知である。好適な結合ペア（P1−P2）は、
特にビオチン−ストレプトアビジンもしくはアビジン；
ハプテン−抗体；抗原−抗体；コンカナバリン−抗体；
糖−レクチン；ハプテン−結合蛋白質、例えばチロキシ
ン結合グロブリン及びチロキシン又はオリゴペプチド−
抗体である。
P1と、測定すべき物質に相当するか又はその誘導体であ
りかつ測定すべき物質のエピトープ少なくとも１個を有
する物質Ｓとからの接合体である。特異的に相互に結合
するペアは公知である。好適な結合ペア（P1−P2）は、
特にビオチン−ストレプトアビジンもしくはアビジン；
ハプテン−抗体；抗原−抗体；コンカナバリン−抗体；
糖−レクチン；ハプテン−結合蛋白質、例えばチロキシ
ン結合グロブリン及びチロキシン又はオリゴペプチド−
抗体である。
結合するペアとしてはビオチンとストレプトアビジン
もしくはアビジンを使用すると特に優れており、それ故
レセプターR2はパートナーP1としてビオチンを含有する
と特に優れている。
もしくはアビジンを使用すると特に優れており、それ故
レセプターR2はパートナーP1としてビオチンを含有する
と特に優れている。
レセプターR2の部分Ｓはもとのままの測定すべき物質
に相応すると優れている。それは測定すべき物質の誘導
体もしくは例えば蛋白質エピトープのような測定すべき
物質の一部を使用してもよい。重要なことは、部分Ｓが
レセプターR1と結合性であることであり、その際にＳと
測定すべき物質とが同じ結合強さでR1に結合している必
要は必ずしもない。
に相応すると優れている。それは測定すべき物質の誘導
体もしくは例えば蛋白質エピトープのような測定すべき
物質の一部を使用してもよい。重要なことは、部分Ｓが
レセプターR1と結合性であることであり、その際にＳと
測定すべき物質とが同じ結合強さでR1に結合している必
要は必ずしもない。
接合体の製造は公知方法で行なう〔例えば“Eur.J.Bi
o−chem.",131巻,333〜338頁（1980年）と同じよう
に〕。
o−chem.",131巻,333〜338頁（1980年）と同じよう
に〕。
レセプターR2は固相への結合を仲介する。R2は別法に
おいてはP1を介して直接又はスペーサを介して固相に結
合していてもよい。他の別法では固相への結合を免疫反
応の間に、固相に固定化されている特異的に結合するペ
アのパートナーP2へP1を結合させることにより行なう。
おいてはP1を介して直接又はスペーサを介して固相に結
合していてもよい。他の別法では固相への結合を免疫反
応の間に、固相に固定化されている特異的に結合するペ
アのパートナーP2へP1を結合させることにより行なう。
本方法の他の優れた実施形では、ＳとP1とからの接合
体であるレセプターR2を使用する。固相として、マトリ
クスを使用し、この場合にも特異的結合性ペアの多数の
P1が固定化されている。免疫反応に必要な成分の恒温保
持後、P1に対する結合部位少なくとも２個を有するパー
トナーP2を添加する。このようにしてレセプターR2の固
定化を行なう。
体であるレセプターR2を使用する。固相として、マトリ
クスを使用し、この場合にも特異的結合性ペアの多数の
P1が固定化されている。免疫反応に必要な成分の恒温保
持後、P1に対する結合部位少なくとも２個を有するパー
トナーP2を添加する。このようにしてレセプターR2の固
定化を行なう。
固相としては、ポリスチレン及び類縁のプラスチツク
製の試験管又は微量滴定板が特に好適であり、その内面
はP1もしくはP2で吸着被覆されている。更に、粒状物
質、例えば分子篩材料、パール状ガラス、プラスチツク
チユーブ等も好適である。固相としては紙のような多孔
性層状担体も好適である。固相が例えばヨーロツパ公開
特許第0240770号明細書、米国特許第4141687号明細書及
び同第4197337号明細書に記載されているように、磁気
粒子から成る実施形も優れている。殊に、磁気粒子は二
酸化クロム又は酸化鉄から成る。粒子へのパートナーP2
の結合は、例えばヨーロツパ公開特許第0240770号明細
書に記載されているように行なうことができる。
製の試験管又は微量滴定板が特に好適であり、その内面
はP1もしくはP2で吸着被覆されている。更に、粒状物
質、例えば分子篩材料、パール状ガラス、プラスチツク
チユーブ等も好適である。固相としては紙のような多孔
性層状担体も好適である。固相が例えばヨーロツパ公開
特許第0240770号明細書、米国特許第4141687号明細書及
び同第4197337号明細書に記載されているように、磁気
粒子から成る実施形も優れている。殊に、磁気粒子は二
酸化クロム又は酸化鉄から成る。粒子へのパートナーP2
の結合は、例えばヨーロツパ公開特許第0240770号明細
書に記載されているように行なうことができる。
レセプターR3は、少なくとも物質Ｓと標識とを含有す
る複合体である。その際に、標識としては酵素、けい光
−、化学ルミネツセンス−又は放射性物質を使用する。
標識法は例えば“Clin.Chim.Acta",81巻,1〜40頁（1977
年）から当業者に公知であり、これ以上の説明は必要で
はない。標識は公知方法で測定することができる。
る複合体である。その際に、標識としては酵素、けい光
−、化学ルミネツセンス−又は放射性物質を使用する。
標識法は例えば“Clin.Chim.Acta",81巻,1〜40頁（1977
年）から当業者に公知であり、これ以上の説明は必要で
はない。標識は公知方法で測定することができる。
レセプターR3は、免疫反応の際に、物質Ｓと特異的結
合性ペアのパートナーP1とを含有する接合体及び特異的
結合性ペアのパートナーP2と標識とからの接合体から初
めて形成することもできる。
合性ペアのパートナーP1とを含有する接合体及び特異的
結合性ペアのパートナーP2と標識とからの接合体から初
めて形成することもできる。
本方法は１工程又は数工程で実施することができる。
評価は公知方法で行なう。それぞれのレセプター及び測
定すべき物質はその都度それらにとつて特定の反応成分
とだけ特異的に反応するので、すべてのレセプター及び
試料を一緒に恒温保持しかつ本方法を１工程で実施する
ことができる。これは、本方法を自動分析器中で実施す
るときに特に有利である。
評価は公知方法で行なう。それぞれのレセプター及び測
定すべき物質はその都度それらにとつて特定の反応成分
とだけ特異的に反応するので、すべてのレセプター及び
試料を一緒に恒温保持しかつ本方法を１工程で実施する
ことができる。これは、本方法を自動分析器中で実施す
るときに特に有利である。
非常に低濃度の物質又は非常に高濃度の物質の検出に
は多工程法が優れている。
は多工程法が優れている。
すべての方法を緩衝溶液中で実施すると有利である。
本方法用の緩衝剤系は公知である。このための特に好適
なのはグツド（Good）の緩衝剤及びリン酸塩緩衝剤であ
る。
本方法用の緩衝剤系は公知である。このための特に好適
なのはグツド（Good）の緩衝剤及びリン酸塩緩衝剤であ
る。
本発明により、簡単かつ迅速に実施することができか
つポリクロナール抗体を使用する場合にも非常に敏感で
ある方法が得られる。
つポリクロナール抗体を使用する場合にも非常に敏感で
ある方法が得られる。
本発明の他の目的は、特異的結合性物質を測定するた
めの試薬であり、これは測定すべき物質に対して特異的
な結合部位を少なくとも２個有するレセプターR1、特異
的に結合するペアのパートナーP1と、測定すべき物質に
相当するか又はその誘導体でありかつ測定すべき物質の
エピトープ少なくとも１個を有する物質Ｓとからの接合
体であるレセプターR2及び少なくとも１個のパートナー
P1と物質Ｓとを含有する複合体であるレセプターR3′及
びこれから物理的に相互に分けられた固相を含有するこ
とを特徴とする。
めの試薬であり、これは測定すべき物質に対して特異的
な結合部位を少なくとも２個有するレセプターR1、特異
的に結合するペアのパートナーP1と、測定すべき物質に
相当するか又はその誘導体でありかつ測定すべき物質の
エピトープ少なくとも１個を有する物質Ｓとからの接合
体であるレセプターR2及び少なくとも１個のパートナー
P1と物質Ｓとを含有する複合体であるレセプターR3′及
びこれから物理的に相互に分けられた固相を含有するこ
とを特徴とする。
他の実施形では、本発明による試薬は、特異的に結合
するペアのパートナーP2が多数結合している固相並びに
物理的にそれとは別個にレセプターR1,R2及びR3又は
R3′を含有する。
するペアのパートナーP2が多数結合している固相並びに
物理的にそれとは別個にレセプターR1,R2及びR3又は
R3′を含有する。
他の実施形では、本発明による試薬は、パートナーP1
が結合している固相及び物理的にそれから分けられた特
異的に結合するペアのパートナーP2並びにレセプター
R1,R2及びR3もしくはR3′を含有する。
が結合している固相及び物理的にそれから分けられた特
異的に結合するペアのパートナーP2並びにレセプター
R1,R2及びR3もしくはR3′を含有する。
他の優れた実施形では、試薬は、第１の層中に固相を
パートナーP2及びレセプターR3と共に、かつこの第１の
層から物理的に分けられたレセプターR1及びR3を含有す
る多層試薬担体を有する。
パートナーP2及びレセプターR3と共に、かつこの第１の
層から物理的に分けられたレセプターR1及びR3を含有す
る多層試薬担体を有する。
この試薬は体液及び組織エキス中の多数のパラメータ
の測定に好適である。
の測定に好適である。
優れた実施形では試薬は付加的に緩衝物質を含有す
る。リン酸塩緩衝剤又はグツド緩衝剤を含有すると特に
優れている。
る。リン酸塩緩衝剤又はグツド緩衝剤を含有すると特に
優れている。
本発明を添付図面及び実施例により詳説する。
第１図は本発明方法の種々の優れた実施形の反応原理
を示す図である。図示されたすべての方法においてレセ
プターR1は抗体である。
を示す図である。図示されたすべての方法においてレセ
プターR1は抗体である。
第1a図は、初めに、特異的に結合するペアのパートナ
ーP2が結合している固相を特異的に結合するペアのパー
トナーP1を有するレセプターR2と恒温保持し、その際に
P1を介してレセプターR2が結合した固相が生成する。第
２工程でこの固相とレセプターR1及びR3並びに試料溶液
とを恒温保持する実施形を示す。
ーP2が結合している固相を特異的に結合するペアのパー
トナーP1を有するレセプターR2と恒温保持し、その際に
P1を介してレセプターR2が結合した固相が生成する。第
２工程でこの固相とレセプターR1及びR3並びに試料溶液
とを恒温保持する実施形を示す。
第1b図は、第１工程でパートナーP2が結合している固
相をレセプターR1及び試料溶液と恒温保持し、第２工程
でレセプターR2及びR3を加える実施形を示す。
相をレセプターR1及び試料溶液と恒温保持し、第２工程
でレセプターR2及びR3を加える実施形を示す。
第1c図は、それぞれ測定すべき物質とは関係なく、パ
ートナーP2が結合している固相及び、標識とパートナー
P2との接合体を使用し、固相及び標識接合体をレセプタ
ーR1、R2、R3′及び試料と恒温保持する実施形を示す。
ートナーP2が結合している固相及び、標識とパートナー
P2との接合体を使用し、固相及び標識接合体をレセプタ
ーR1、R2、R3′及び試料と恒温保持する実施形を示す。
実施例 例１ T4の測定（反応図式第1a図により） 緩衝液A: バルビツレート 120 mmol/ リン酸塩緩衝液、pH8.6 18.2 mmol/ ８−アニリノ−１−ナフタリンスルホン酸 1.27mmol/ 牛血清アルブミン 0.2 重量％ 緩衝液A980μ及びT4とビオチンとの接合体（例４に
より製造、最終濃度１もしくは10mmol/ml）の溶液20μ
を、ストレプトアビジンで覆つたポリスチレン容器
（ヨーロツパ公開特許第0269092号明細書により製造）
中に装入し、かつ30分間25℃で恒温保持する。引続いて
洗浄し、かつ試料（T4が蓄積したヒト血清）50μ、緩
衝液A980μ、T4に対するポリクロナール抗体0.1mg/ml
の溶液20μ及びT4−ペルオキシダーゼ−接合体（50mU
/試験）2.5U/mlを加え、30分間25℃で恒温保持し、洗浄
しかつ9.1mmol/のABTS 〔2,2′−アジノ−ジ−（３
−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホン酸−（６）−ジ
アンモニウム塩〕の溶液1mlを添加する。30分間25℃で
更に恒温保持した後で、T4含量の尺度として422nmの光
学密度を測定する。その結果は第２図から明らかであ
る。図中、曲線１はT4−ビオチン10nmol/、曲線２はT
4−ビオチン1nmol/である（試験中の最終濃度） 例２ T4の測定（反応式図第1b図により） 試料（T4が蓄積したヒト血清）50μを緩衝液A480μ
及びT4に対するポリクロナール抗体（0.1mg/ml）の溶
液20μと25℃で30分間ストレプトアビジンで覆つたポ
リスチレン容器中で恒温保持する。引続いて、緩衝液A4
80μ、T4−ビオチン−接合体（５×10-8mol/、試験
中の最終濃度1nmol/に相当）の溶液20μ及びT4−PO
D−接合体（2.5U/ml、50mU/試験）を加えかつ25℃で30
分間恒温保持する。洗浄し、かつ引続いてABTS −溶液
（9.1mmol/）1mlを添加しかつ25℃で30分間恒温保持
し、422nmで光学密度をT4含量の尺度として測定する。
結果は第３図から明らかである。
より製造、最終濃度１もしくは10mmol/ml）の溶液20μ
を、ストレプトアビジンで覆つたポリスチレン容器
（ヨーロツパ公開特許第0269092号明細書により製造）
中に装入し、かつ30分間25℃で恒温保持する。引続いて
洗浄し、かつ試料（T4が蓄積したヒト血清）50μ、緩
衝液A980μ、T4に対するポリクロナール抗体0.1mg/ml
の溶液20μ及びT4−ペルオキシダーゼ−接合体（50mU
/試験）2.5U/mlを加え、30分間25℃で恒温保持し、洗浄
しかつ9.1mmol/のABTS 〔2,2′−アジノ−ジ−（３
−エチル−ベンゾチアゾリン−スルホン酸−（６）−ジ
アンモニウム塩〕の溶液1mlを添加する。30分間25℃で
更に恒温保持した後で、T4含量の尺度として422nmの光
学密度を測定する。その結果は第２図から明らかであ
る。図中、曲線１はT4−ビオチン10nmol/、曲線２はT
4−ビオチン1nmol/である（試験中の最終濃度） 例２ T4の測定（反応式図第1b図により） 試料（T4が蓄積したヒト血清）50μを緩衝液A480μ
及びT4に対するポリクロナール抗体（0.1mg/ml）の溶
液20μと25℃で30分間ストレプトアビジンで覆つたポ
リスチレン容器中で恒温保持する。引続いて、緩衝液A4
80μ、T4−ビオチン−接合体（５×10-8mol/、試験
中の最終濃度1nmol/に相当）の溶液20μ及びT4−PO
D−接合体（2.5U/ml、50mU/試験）を加えかつ25℃で30
分間恒温保持する。洗浄し、かつ引続いてABTS −溶液
（9.1mmol/）1mlを添加しかつ25℃で30分間恒温保持
し、422nmで光学密度をT4含量の尺度として測定する。
結果は第３図から明らかである。
例３ T4の測定（反応式図第1c図により） 試料（T4が蓄積したヒト血清）50μを緩衝液A480μ
及びT4に対するポリクロナール抗体（0.1mg/ml）の溶
液20μを25℃で30分間ストレプトアビジンで覆つたポ
リスチレン容器中で恒温保持する。引続いて、緩衝液A4
80μ及びT4−ビオチンからの接合体（５×10-7モル／
、試験中の最終濃度10nmol/に相当）の溶液20μ
及びストレプトアビジン−POD−接合体2.5U/ml（50mU/
試験）を添加しかつ25℃で30分間恒温保持する。洗浄し
かつABTS 溶液（9.1mmol/）1mlを加え、25℃で30分
間恒温保持し、かつ光学密度を422nmでT4含量の尺度と
して測定する。結果は第４図から明らかである。
及びT4に対するポリクロナール抗体（0.1mg/ml）の溶
液20μを25℃で30分間ストレプトアビジンで覆つたポ
リスチレン容器中で恒温保持する。引続いて、緩衝液A4
80μ及びT4−ビオチンからの接合体（５×10-7モル／
、試験中の最終濃度10nmol/に相当）の溶液20μ
及びストレプトアビジン−POD−接合体2.5U/ml（50mU/
試験）を添加しかつ25℃で30分間恒温保持する。洗浄し
かつABTS 溶液（9.1mmol/）1mlを加え、25℃で30分
間恒温保持し、かつ光学密度を422nmでT4含量の尺度と
して測定する。結果は第４図から明らかである。
例４ T4−ビオチン−接合体の製造： “Eur.J.Biochem.",131巻,333〜338頁（1980年）に記
載されているように、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル
−テトラヨードチロニンをペンタメチレンジアミンを介
してビオチンと結合させる。
載されているように、Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル
−テトラヨードチロニンをペンタメチレンジアミンを介
してビオチンと結合させる。
第1a図は本発明方法の１つの優れた実施形の反応原理を
示す図、第1b図は本発明方法の他の優れた実施形の反応
原理を示す図、第1c図は本発明方法の他の優れた実施形
の反応原理を示す図、第２図は第1a図の反応式によりT4
−POD−接合体を使用してT4測定するための検量曲線を
示す図、第３図は第1b図の反応式によりT4−POD−接合
体を使用してT4測定するための検量曲線を示す図、第４
図は第1c図の反応式によりT4−ビオチン−接合体及びス
トレプトアビジン−POD−接合体を使用してT4測定する
ための検量曲線を示す図である。
示す図、第1b図は本発明方法の他の優れた実施形の反応
原理を示す図、第1c図は本発明方法の他の優れた実施形
の反応原理を示す図、第２図は第1a図の反応式によりT4
−POD−接合体を使用してT4測定するための検量曲線を
示す図、第３図は第1b図の反応式によりT4−POD−接合
体を使用してT4測定するための検量曲線を示す図、第４
図は第1c図の反応式によりT4−ビオチン−接合体及びス
トレプトアビジン−POD−接合体を使用してT4測定する
ための検量曲線を示す図である。
Claims (3)
- 【請求項１】試料溶液を、R1がR2及びR3並びに測定すべ
き物質と特異的に結合性であり、R2が固相への結合を仲
介し、かつR3が標識を担持する少なくとも３種のレセプ
ターR1、R2及びR3と恒温保持し、結合した標識と結合し
ていない標識を分離し、かつ両方の相の一方における標
識を測定することにより、特異的結合性物質を測定する
方法において、レセプターR1として、測定すべき物質の
エピトープと特異的に結合する結合部位を少なくとも２
個有するレセプターを使用し、R2として、特異的に結合
するペアのパートナーP1と、測定すべき物質に相当する
か又はその誘導体でありかつ測定すべき物質のエピトー
プ少なくとも１個を有する物質Ｓとからの接合体を使用
し、その際にパートナーP1は特異的に結合するペアの他
方のパートナーP2を介して固相に結合しているか又は固
定化されており、かつR3として、少なくとも物質Ｓと標
識を含有する複合体を使用することを特徴とする、特異
的結合性物質の測定法。 - 【請求項２】測定すべき物質に対して特異的な結合部位
を少なくとも２個有するレセプターR1、特異的に結合す
るペアのパートナーP1と、測定すべき物質に相当するか
又はその誘導体でありかつ測定すべき物質のエピトープ
少なくとも１個を有する物質Ｓとからの接合体であるレ
セプターR2及び少なくとも１個の標識と物質Ｓとを含有
する複合体であるレセプターR3及びこれから物理的に分
けられ、特異的に結合するペアの他方のパートナーP2が
それに固定化されている固相を含有することを特徴とす
る、特異的結合性物質を測定するための試薬。 - 【請求項３】測定すべき物質に対して特異的な結合部位
を少なくとも２個有するレセプターR1、特異的に結合す
るペアのパートナーP1と、測定すべき物質に相当するか
又はその誘導体でありかつ測定すべき物質のエピトープ
少なくとも１個を有する物質Ｓとからの接合体であるレ
セプターR2及び少なくとも１個の標識と、特異的に結合
するペアの他方のパートナーP2とを含有する複合体であ
るレセプターR3′及びこれから物理的に分けられ、特異
的に結合するペアの他方のパートナーP2がそれに固定化
されている固相を含有することを特徴とする、特異的結
合性物質を測定するための試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3834766A DE3834766A1 (de) | 1988-10-12 | 1988-10-12 | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| DE3834766.0 | 1988-10-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02156155A JPH02156155A (ja) | 1990-06-15 |
| JPH0814579B2 true JPH0814579B2 (ja) | 1996-02-14 |
Family
ID=6364963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1264061A Expired - Lifetime JPH0814579B2 (ja) | 1988-10-12 | 1989-10-12 | 特異的結合性物質の測定法及び試薬 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5126241A (ja) |
| EP (1) | EP0363942B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0814579B2 (ja) |
| KR (1) | KR920005963B1 (ja) |
| AT (1) | ATE101723T1 (ja) |
| AU (1) | AU612907B2 (ja) |
| CA (1) | CA2000545C (ja) |
| DE (2) | DE3834766A1 (ja) |
| ES (1) | ES2050200T3 (ja) |
| ZA (1) | ZA897689B (ja) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3836348A1 (de) * | 1988-10-25 | 1990-04-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von fuer ein antigen klassenspezifischen antikoerpern und dazu geeignetes reagenz |
| US5792606A (en) * | 1990-02-26 | 1998-08-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid hybridization based assay for determining a substance of interest |
| DE4006054A1 (de) * | 1990-02-26 | 1991-08-29 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur immunologischen bestimmung von liganden |
| US5437981A (en) * | 1990-02-26 | 1995-08-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method for the immunological determination of ligands |
| US5556748A (en) * | 1991-07-30 | 1996-09-17 | Xenopore Corporation | Methods of sandwich hybridization for the quantitative analysis of oligonucleotides |
| DE4218257A1 (de) * | 1992-06-03 | 1993-12-09 | Behringwerke Ag | Verfahren zur immunchemischen Bestimmung eines Analyten |
| DE4328070C1 (de) * | 1993-08-20 | 1994-11-24 | Henning Berlin Gmbh | Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einem Volumen einer flüssigen Probe sowie seine Anwendung zur Bestimmung von anti-TSH-Rezeptor-Autoantikörpern in einem Patientenserum |
| US6991907B1 (en) * | 1995-04-18 | 2006-01-31 | Biosite, Inc. | Methods for the assay of troponin I and T and complexes of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays |
| US6627404B1 (en) * | 1995-04-18 | 2003-09-30 | Biosite, Inc. | Methods for improving the recovery of troponin I and T in membranes, filters and vessels |
| WO1997006439A1 (en) | 1995-08-09 | 1997-02-20 | Quidel Corporation | Test strip and method for one step lateral flow assay |
| US5691152A (en) * | 1995-11-09 | 1997-11-25 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Stable avidin composition |
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