JP2957251B2 - エンドトキシンの測定法 - Google Patents

エンドトキシンの測定法

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JP2957251B2 JP2257415A JP25741590A JP2957251B2 JP 2957251 B2 JP2957251 B2 JP 2957251B2 JP 2257415 A JP2257415 A JP 2257415A JP 25741590 A JP25741590 A JP 25741590A JP 2957251 B2 JP2957251 B2 JP 2957251B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血漿又は血清中のエンドトキシンの測定法
に関するものであり、殊にエンドトキシンを高い精度で
測定するための前処理に関するものである。
（従来の技術） カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いて
エンドトキシン（細菌内毒素）を測定する方法（以下リ
ムルステストという）が従来から知られており、医薬
品、水などの汚染試験、臨床検査など多方面に汎用され
ている。リムルステストはエンドトキシンの検出感度が
高いため生体試料中の微量検出に適している。
ところで、生体試料のリムルステストにおいては、蛋
白等に吸着されたエンドトキシンが含まれ、これらから
エンドトキシンを効率よく遊離させるための前処理が必
要である。特に血漿、血清のような蛋白細胞顆粒を含む
生体試料については、従来25℃におけるpKaが３以下の
酸を用いてpH3以下の条件下で処理した後に、変性析出
物を遠心分離して除去し、その上澄液を採取し、アルカ
リで中和したものを被検液とする方法（特公昭63−5567
1号公報）が知られているが、その分離操作が煩雑で全
操作工程も長く、汚染の危険性があるなどの問題があっ
た。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は、血漿及び血清中のエンドトキシンを極めて
高い検出率で、効率よく簡便、迅速に測定するため、血
漿又は血清を前処理して、被検液とする方法を提供する
ものである。
（課題を解決するための手段） 本発明は、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成
分を使用する血漿又は血清中のエンドトキシンの測定法
において、 ａ）ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレ
ンソルビタン類、ｎ−アルキルグルコピラノシド類及び
ドデシル硫酸塩から選ばれた界面活性剤、 ｂ）イミダゾリル基又はアミノ基を有する塩基性化合
物、及び ｃ）塩化カルシウムと水酸化カリウム の混合水溶液で、血漿又は血清を処理して被検液とする
ことを特徴とするエンドトキシンの測定法である。
本発明に用いることができる界面活性剤のうち、ポリ
オキシエチレンエーテル類としては、ポリオキシエチレ
ン−ｐ−ターシヤリーオクチル（又はイソオクチル）フ
ェニルエーテル（重合度８〜40）、ポリオキシエチレン
−４−ターシヤリーオクチル（又はイソオクチル）シク
ロヘキシルエーテル（重合度８〜40）、ポリオキシエチ
レン−ｐ−ノニルフェニルエーテル（重合度９〜15）、
ポリオキシエチレンヘプタメチルヘキシルエーテル（重
合度10〜20）、ポリオキシエチレンドデシルエーテル
（重合度10〜29）などが挙げられる。また、ｎ−アルキ
ルグルコピラノシド類としては、ｎ−（ヘプチル、オク
チル、ノニル、デシル又はドデシル）（α−又はβ−）
Ｄ−グルコピラノシドなどが挙げられる。更に、ポリオ
キシエチレンソルビタン類としては、ポリオキシエチレ
ンソルビタン（重合度約20）のモノラウレート、モノパ
ルミテート、モノステアレート、モノオレエート又はト
リオレエートなどが挙げられる。またアルキル硫酸塩と
しては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウ
ム、ドデシル硫酸カルシウムなどが挙げられる。
イミダゾリル基又はアミノ基を有する化合物として
は、ヒスタミン二塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン二塩酸塩、ポ
リ−Ｌ−ヒスチジン塩酸塩（分子量15,000〜50,000）、
ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（分子量2,000〜70,000）、ポ
リ−Ｌ−アルギニン塩酸塩（分子量5,000〜150,000）、
ポリエチレンイミン（分子量1,000〜70,000）、アデニ
ン塩酸塩、シトシン塩酸塩などが挙げられる。
ａ）の界面活性剤の添加量はその種類により異なる
が、0.04〜0.40％（重量／容量）の範囲で使用すること
が好ましく、ｂ）のイミダゾリル基又はアミノ基を有す
る塩基性化合物は、その種類により異なるが、0.03〜0.
3％（重合／容量）の範囲で使用することが好ましく、
塩化カルシウム及び水酸化カリウムは混合水溶液中それ
ぞれ0.005〜0.05モル／及び0.05〜0.5モル／である
ことが好ましい。
また、混合水溶液にN,N−ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）グリシンを、0.005〜0.05モル／好ましくは0.02
〜0.05モル／を添加することにより、その濁りの生成
が押えられ、透明な溶液が得られる。
上記混合水溶液を用いて血漿又は血清を処理する際の
処理温度は25〜70℃、とくに37〜56℃の範囲が好まし
く、処理時間は５〜30分、とくに５〜20分の範囲が好ま
しい。
このような本発明のａ）〜ｃ）からなる混合水溶液で
血漿又は血清を処理した被検液は、カブトガニ・アメボ
サイト・ライセート成分と反応させ、通常のリムルステ
ストによりエンドトキシンを測定することができる。
（発明の効果） 本発明の混合水溶液で血漿又は血清を処理することに
より、蛋白、脂質、糖蛋白、糖脂質、血小板等に吸着し
たエンドトキシンが効率よく遊離され、血漿および血清
中のエンドトキシンをきわめて高い検出率で効率よく測
定することができる。
（実施例） 以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。
実施例１ 健常人より血液1ml当たりヘパリンを５ユニット添加
して採血した血液2mlを、150×ｇ、10分間遠心分離し
て、多血小板血漿（PRP）を得た。
このPRP試料190μにSalmonella abortusequi由来の
エンドトキシン調製品（エンドトキシンスタンダードNP
1）水溶液（2ng/ml）を10μ加え、よく混合した後、
その５μをエンドトキシンフリーのマイクロプレート
（トキシペットプレート96F、生化学工業販売、商品
名）にとり、0.1モル／水酸化カリウム（KOH）−0.01
モル／塩化カルシウム（CaC２）−0.1％（重量／容
量）トリトンＸ−100（ポリオキシエチレン−ｐ−ター
シャリーオクチルフェニルエーテル、Rohm＆Haas Co.販
売の商品名）を含有する水溶液ならびに、それにさらに
0.016〜0.800％（重量／容量）になるようにポリエチレ
ンイミン（エチレンイミンポリマー、EIP、平均分子量:
70,000）を添加した水溶液の混液（20μ）を加え、37
℃に10分間保持する。これを被検液とした。
被検液に存在するエンドトキシンの測定は、0.1モル
／のトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）4.4mlにカブトガニ
・アメボサイト・ライセート抽出成分からグルカンに反
応する酵素を除去した調製品であるエンドスペシー（登
録商標、生化学工業株式会社製造販売）を溶解して使用
し、被検液25μにエンドスペシー100μを加え、37
℃に30分間加温し、次いで0.04％（重量／容量）の亜硝
酸ナトリウム（１モル／の塩酸溶液）50μ、0.3％
（重量／容量）スルファミン酸アンモニウム50μなら
びに0.07％（重量／容量）Ｎ−１−ナフチルエチレンジ
アミン二塩酸塩（14％（容量／容量）Ｎ−メチル−２−
ピロリドン溶液）50μを順次加えてジアゾカップリン
グし、この吸光度をマイクロプレートリーダーにより波
長630nmを対照として波長550nmで測定した。
第１表にEIP濃度を種々変化させた場合の本実施例に
よる測定結果をエンドトキシンが無添加である比較例の
測定結果とともに示す。
なお、第１表中、EIP濃度（％）は処理時の濃度を示
し、測定結果はエンドトキシンを加えない比較例につい
ては波長550−630nmで測定した吸光度を示し、エンドト
キシンを添加した実施例については対照例（PRP試料の
代わりに注射用生理食塩水を用い、前処理液の代わりに
注射用蒸留水を使用したもの）の測定値を100とした場
合の検出率（％）を示した。
第１表によれば、トリトンＸ−100とEIPとを含まない
0.08モル／ KOH−0.008モル／ CaC２のみによ
る処理では、エンドトキシンの検出率が非常に悪く、0.
08％トリトンＸ−100存在下でEIPの濃度を増やして行く
と検出率が増加することが判る。
また、EIPの濃度が0.32％を超えるとエンドトキシン
の検出率が低下するが、例えば処理に使用するEIPとし
て0.032〜0.240％程度の濃度のものを使用すれば、リム
ルステスト偽陽性因子ならびに阻害因子も完全になくし
た条件下でPRP中のエンドトキシンの真の値を正確且つ
高い信頼度を以て再現性よく検出することが可能である
ことが明らかである。
即ち、エンドトキシンを添加しない比較例の吸光度が
対照例のそれと同値であるということは、PRP中のリム
ルステスト偽陽性因子が完全に変性されたことを示すも
のであり、また、エンドトキシンを添加して測定した実
施例におけるエンドトキシンの検出率が100％であると
いうことはPRP中のリムルステスト反応阻害因子（偽陰
性因子）が完全に変性されていることを意味しているの
であり、これらの妨害因子を同時に変性することができ
る条件、つまり、比較例の測定値が対照例とほぼ同値で
且つ実施例の測定値がほぼ100％（即ち、実施例におい
て添加したエンドトキシンの量がほとんど全て検出回収
することができることを意味している）となる条件が理
想的であり、第１表で示すように0.08％トリトンＸ−10
0存在下で、0.032〜0.240％の濃度のEIPを用いたときが
これに当たる。
実施例２ 実施例１と同様の手段により調製したPRP試料190μ
に40pgのエンドトキシン調製品E.coli 0111:B4を含有す
る水溶液10μを添加した後、その５μをトキシペッ
トプレート96Fにとり、０〜0.5％の範囲内で選択された
所定量のトリトンＸ−100を含有する0.1モル／ KOH
−0.07％EIP−0.01モル／ CaC２水溶液の混液20μ
を加え、37℃に10分間保持した。これを被検液とし
た。
そして、上記被検液を実施例１の場合と同様の手段に
よりエンドトキシンを測定した。
実施例２においてトリトンＸ−100の濃度を種々変化
させた場合の測定結果を、実施例１の場合と同様にエン
ドトキシンを添加しない比較例ならびにPRP試料の代わ
りに生理食塩水を用い、前処理液の代りに注射用蒸留水
を使用した対照例とともに第２表に示す。
なお、測定結果は実施例１と同様にエンドトキシンを
加えない比較例については波長550−630nmで測定した吸
光度を示し、エンドトキシンを添加した実施例について
は対照例の測定値を100とした場合の検出率（％）を示
した。
第２表によれば、トリトンＸ−100が０、即ちトリト
ンＸ−100を加えない場合はエンドトキシン検出率が非
常に低い。これに対して例えば0.06〜0.12％程度の濃度
を有するトリトンＸ−100を含む混液を用いてPRP試料を
処理したものはエンドトキシン添加検出率も100％であ
った。
従って、予め定めた適正な濃度を有する界面活性剤
（トリトンＸ−100）と0.08モル／KOH−0.056％EIP−
0.008モル／ CaC２水溶液の混液（PRP処理時の濃
度）を用いることによって、リムルステスト偽陽性因子
ならびに測定阻害因子が完全に変性された条件下で、PR
P試料中のエンドトキシンの真の値を正確且つ高い信頼
性を以て検出測定することが可能であることが判る。
実施例３ 実施例１と同様の手段により調製したPRP試料190μ
に10pgのエンドトキシン調製品E.coli UKT−Ｂを含有す
る水溶液10μを添加した後、その５μをトキシペッ
トプレート96Fにとり、0.1％トリトンＸ−100−0.1モル
／ KOH−0.07％EIP−0.01モル／ CaC２混液20
μを加え、37℃において所定の時間だけ保持し、被検
液とした。
そして、上記被検液を実施例１の場合と同様の手段に
よりエンドトキシンを測定した。
実施例３の各加温時間についての測定結果を実施例１
の場合と同様にエンドトキシンを添加しない比較例なら
びにPRP試料の代わりに生理食塩水を用い、前処理液の
代りに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第３表に
示す。
第３表によると、加温時間０即ち、該前処理用混液で
処理した後、直ちに被検液とした場合にはエンドトキシ
ンの検出率は非常に低い。これに対して例えば５分以上
の加温時間を経たものを使用すればリムルステスト偽陽
性因子ならびに阻害因子も完全に変性した条件下でPRP
中のエンドトキシンの真の値を正確且つ高い信頼度を以
て再現性よく検出することが可能であることが明らかで
ある。
実施例４ 実施例１と同様の手段により調製したPRP試料190μ
に40pgのエンドトキシン調製品E.coli 0111:B4を含有す
る水溶液10μを添加した後、その５μをトキシペッ
トプレート96Fにとり、0.1％トリトンＸ−100−0.1モル
／ KOH−0.07％EIP−0.01モル／ CaC２水溶液
の混液20μを加え、所定の温度において10分間保持
し、被検液とした。
そして、上記被検液を実施例１の場合と同様の手段に
よりエンドトキシンを測定した。
実施例４の各加温温度についての測定結果を実施例１
の場合と同様にエンドトキシンを無添加とした比較例な
らびにPRP試料の代わりに生理食塩水を用い、前処理液
の代りに注射用蒸留水を使用した対照例とともに第４表
に示す。
第４表によれば、処理温度が４℃の場合にはエンドト
キシンの検出率が低かったが、37℃以上になるとリムル
ステスト偽陽性因子ならびに反応阻害因子も完全に変性
した条件下でPRP中のエンドトキシンの真の値を正確且
つ高い信頼度を以て再現性よく検出することが可能であ
ることが明らかである。
実施例５ 健常人より血液1ml当たりヘパリンを５ユニット添加
して採血した血液2mlを1,000×ｇ、10分間遠心分離し
て、貧血小板血漿（PPP）を得た。
このPPP試料190μに40pgのE.coli 0111:B4エンドト
キシンを含有する水溶液10μを添加した後、その５μ
をトキシペットプレート96Fにとり、０〜1.0％（重量
／容量）の範囲内で選択された所定量のポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレートからなるツィーン20（商
品名、和光純薬工業株式会社販売）を含有する0.1モル
／KOH−0.1％（重量／容量）ヒスタミン二塩酸塩−0.
01モル／ CaC２水溶液の混液20μを加え、37℃
に10分間保持し、被検液とした。
そして、実施例１の場合と同様の手段によりエンドト
キシンを測定した。
実施例５におけるツィーン20の各濃度についての測定
結果を実施例１の場合と同様にエンドトキシンを添加し
ない比較例ならびにPPP試料の代わりに生理食塩水を用
い、前処理液の代りに注射用蒸留水を使用した対照例と
ともに第５表に示す。
第５表によれば、予め定めた適正な濃度を有する界面
活性剤（ツィーン20）を用いることによって、リムルス
テスト偽陽性因子ならびに反応阻害因子が完全に変性し
た条件下で、PPP試料中のエンドトキシンの真の値を正
確且つ高い信頼性を以って検出測定することが可能であ
ることが判る。一方、ツィーン20を全く添加しない0.08
モル／ KOH−0.08％ヒスタミン二塩酸塩−0.008モル
／ CaC２混液による処理を行なっただけのものは
明らかにエンドトキシンの検出率が低いことが判る。
実施例６ 実施例５と同様の手段により調製したPPP試料190μ
に40pgのエンドトキシン調製品E.coli 0111:B4を含有す
る水溶液10μを添加した後、その５μをトキシペッ
トプレート96Fにとり、０〜1.0％（重量／容量）の範囲
内で選択された所定量のドテシル硫酸ナトリウム（SD
S）を含有する0.1モル／ KOH−0.05％（重量／容
量）ε−ポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（分子量:2,000〜4,00
0、和光純薬工業（株）販売）−0.01モル／ CaC２
水溶液の混液20μを加え、37℃に10分間保持し、被検
液とした。
そして、実施例１の場合と同様の手段によりエンドト
キシンを測定した。
実施例６におけるSDSの各濃度についての測定結果を
実施例１の場合と同様にエンドトキシンを添加しない比
較例ならびにPPP試料の代わりに生理食塩水を用い、前
処理液の代りに注射用蒸留水を使用した対照例とともに
第６表に示す。
第６表によれば、予め定めた適正な濃度を有する界面
活性剤（SDS）を用いることによって、リムルステスト
偽陽性因子ならびに反応阻害因子が完全に変性した条件
下で、PPP試料中のエンドトキシンの真の値を正確且つ
高い信頼性を以て検出測定することが可能であることが
判る。
実施例７ 健常人より抗凝固剤を入れないで採血した血液3mlを
４℃に１時間静置した後、1,000×ｇ、10分間遠心分離
して血清を得た。
この血清試料190μに40pgのエンドトキシン調製品
E.coli 0111:B4を含有する水溶液10μを添加した後、
その５μをトキシペットプレート96Fにとり、０〜1.0
％（重量／容量）の範囲内で選択された所定量のｎ−オ
クチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含有する0.1モル
／ KOH−0.07％EIP−0.01モル／ CaC２水溶液
の混液20μを加え、37℃に10分間保持し、被検液とし
た。
そして、実施例１の場合と同様の手段によりエンドト
キシンを測定した。
実施例７におけるｎ−オクチルグルコシドの各濃度に
ついての測定結果を実施例１の場合と同様にエンドトキ
シンを添加しない比較例ならびに血清試料の代わりに生
理食塩水を用い、前処理液の代りに注射用蒸留水を使用
した対照例とともに第７表に示す。
第７表によれば、予め定めた適正な濃度を有する界面
活性剤（ｎ−オクチルグルコシド）を用いることによっ
て、リムルステスト偽陽性因子ならびに反応阻害因子が
完全に変性した条件下で、血清試料中のエンドトキシン
の真の値を正確且つ高い信頼性を以って検出測定するこ
とが可能であることが判る。
実施例８ 種々の実験動物［マウス（ICR,male）、ラット（Wist
er,male）、モルモット（Hartley,male）、ウサギ（JW,
male）、イヌ（Beagle,male）］より実施例１と同様に
抗凝固剤（ヘパリン）を添加して採血して得たPRPを試
料とする。
このPRP試料190μに40pgのエンドトキシン調製品E.
coli 0111:B4を含有する水溶液10μを添加した後、そ
の５μをトキシペットプレート96Fにとり、0.1％トリ
トンＸ−100−0.1モル／ KOH−0.07％EIP−0.01モル
／ CaC２水溶液の混液20μを加え、37℃に10分
間保持し、被検液とした。
そして、実施例１の場合と同様の手段によりエンドト
キシンを測定した。
測定結果を実施例１の場合と同様にエンドトキシンを
添加しない比較例ならびにPRP試料の代わりに生理食塩
水を用い、前処理液の代りに注射用蒸留水を使用した対
照例とともに第８表に示す。
第８表によれば、いずれの動物もほぼ100％の検出率
を示した。
このように検体量に制限のある各種小動物を含めた実
験動物においても良好な成績が得られたことは迅速性、
簡便性に加えて検体処理の特殊性においても顕著な改善
点であることが理解できる。
実施例９ トリトンＸ−100、KOH、EIP及びCaC２をそれぞれ0.
1％、0.1モル／、0.07％、0.01モル／の水溶液とな
るように混合した。また、０〜0.06モル／の範囲内で
選択された所定量のN,N−ビス（２−ヒドロキシエチ
ル）グリシン（ビシン；ドータイト試薬の１種の商品
名；和光純薬工業販売）をも含有する混合水溶液を調製
した。以上の混合水溶液を氷冷下に所定時間保持した。
第９表にビシンの濃度を種々変化させた場合の本実施例
による観察結果をビシンが無添加である比較例の観察結
果とともに示す。
第９表によれば、トリトンＸ−100、KOH、EIPおよびC
aC２を所定量混合した水溶液を氷冷下で２時間放置し
ておくと、ビシンの添加なしでは白濁して均一な採取が
不可能となる。これに対してビシンを添加しておくとそ
の濁りの生成が抑えられるようになり、特に0.02モル／
以上では２時間後でも透明なままであり、均一な採取
が可能であることが判る。
実施例10 実施例１と同様の手段により調製したPRP試料190μ
に40pgのエンドトキシン調製品E.coli 0111:B4を含有す
る水溶液10μを添加した後、その５μをトキシペッ
トプレート96Fにとり、0.1％トリトンＸ−100−0.1モル
／、KOH−0.03モル／ビシン−0.07％EIP−0.01モル
／CaC２水溶液の混液（あらかじめ混合し、氷冷下
に２時間放置しておいたもの）20μを加え、37℃に10
分間保持し、被検液とした。
そして、実施例１の場合と同様の手段によりエンドト
キシンを測定した。
測定結果を実施例１の場合と同様にエンドトキシンを
添加しない比較例ならびにPRP試料の代わりに生理食塩
水を用い、前処理液の代りに注射用蒸留水を使用した対
照例とともに第10表に示す。
第10表によれば、トリトンＸ−100、KOH、EIP、CaC
２およびビシンを所定量混合した水溶液を直ちに使用し
た場合でも、氷冷下に２時間放置後使用した場合でも、
ほぼ100％のエンドトキシンの検出率を示した。したが
って、ビシンの適当量の添加は処理液の濁りを抑え、安
定性を高めることが判る。
実施例11 血漿検体の測定 対象は、健常人30例およびグラム陰性菌による敗血症
を疑った白血病等の重症血液疾患および感染を合併した
肝、胆道疾患を有する患者の10例で、それぞれヘパリン
添加で無菌的に採血した血液を試料として、４℃で150
×ｇ、10分間遠心してPRPを得た。その５μをトキシ
ペットプレート96Fにとり、0.1％トリトンＸ−100−0.1
モル／ KOH−0.03モル／ビシン−0.07％EIP−0.01
モル／ CaC２水溶液混液20μを加え、37℃に10
分間保持し、被検液とした。
そして、実施例１の場合と同様の手段によりエンドト
キシンを測定した。
第11表に本実施例の結果を、別に作成した検量線より
E.coli 0111:B4エンドトキシン換算量として表わした。
第11表の患者１〜10は、血培、白血球数その他の検査
成績および発熱等の臨床症状からグラム陰性菌敗血症の
疑いありと診断された症例であり、本発明方法において
は、全例高濃度のエンドトキシンが検出された（健常人
30例:2.2±1.6pg/ml）。従って、本発明方法は通常の検
査法では確定診断がきわめて困難なグラム陰性菌敗血症
の迅速診断法としてきわめて有力な手法として評価され
るものであることが理解できよう。

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】カブトガニ・アメボサイト・ライセート成
    分を使用する血漿又は血清中のエンドトキシンの測定法
    において、 ａ）ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレ
    ンソルビタン類、ｎ−アルキルグルコピラノシド類及び
    アルキル硫酸塩からなる群から選ばれた界面活性剤、 ｂ）イミダゾリル基又はアミノ基を有する化合物、並び
    に ｃ）アルカリ土類金属塩及び／又はアルカリ金属水酸化
    物 の混合水溶液で、血漿又は血清を予め処理して被検液と
    することを特徴とするエンドトキシンの測定法。
  2. 【請求項２】界面活性剤が、ポリオキシエチレンエーテ
    ル類、ポリオキシエチレンソルビタン類、ｎ−アルキル
    グルコピラノシド類からなる群から選ばれる、請求項１
    記載の測定法。
  3. 【請求項３】イミダゾリル基又はアミノ基を有する化合
    物が、ポリエチレンイミン、ヒスタミン二塩酸塩及びポ
    リ−Ｌ−リジン塩酸塩からなる群から選ばれる、請求項
    １又は２記載の測定法。
  4. 【請求項４】混合水溶液中の界面活性剤の濃度が0.04〜
    0.40％（重量／容量）、イミダゾリル基若しくはアミノ
    基を有する化合物の濃度が0.03〜0.3％（重量／容
    量）、アルカリ土類金属塩の濃度が0.005〜0.05％モル/
    L、又はアルカリ金属水酸化物の濃度が0.05〜0.5モル/L
    である、請求項１〜３のいずれか１項記載の測定方法。
  5. 【請求項５】混合水溶液が、N,N−ビス（２−ヒドロキ
    シエチル）グリシンをさらに含有する請求項１〜４のい
    ずれか１項記載の測定法。
  6. 【請求項６】カブトガニ・アメボサイト・ライセート成
    分を使用する血漿又は血清中の該成分に反応する物質の
    測定に用いられる、下記ａ）及びｂ）のそれぞれの水溶
    液又はこれらの混合水溶液からなる血漿又は血清の前処
    理剤。 ａ）ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレ
    ンソルビタン類、ｎ−アルキルグルコピラノシド類及び
    アルキル硫酸塩からなる群から選ばれた界面活性剤 ｂ）イミダゾリル基又はアミノ基を有する化合物
  7. 【請求項７】水溶液又は混合水溶液の成分として、さら
    に下記ｃ）を含む請求項６記載の前処理剤。 ｃ）アルカリ土類金属塩及びアルカリ金属水酸化物。
  8. 【請求項８】カブトガニ・アメボサイト・ライセート成
    分を使用する血漿又は血清中の該成分に反応する物質の
    測定に用いられる被検液の調製法において、下記工程１
    及び２を含むことを特徴とする方法。 （工程１）下記ａ）及びｂ）のそれぞれの水溶液又はこ
    れらの混合水溶液を血漿又は血清に添加する工程。 ａ）ポリオキシエチレンエーテル類、ポリオキシエチレ
    ンソルビタン類、ｎ−アルキルグルコピラノシド類及び
    アルキル硫酸塩からなる群から選ばれた界面活性剤 ｂ）イミダゾリル基又はアミン基を有する化合物 （工程２）工程１で得られた血漿又は血清を、リムルス
    テスト偽陽性因子並びに反応阻害因子が変性する条件下
    で保持する工程。
  9. 【請求項９】水溶液又は混合水溶液の成分として、さら
    に下記ｃ）を含む請求項８記載の方法。 ｃ）アルカリ土類金属塩及びアルカリ金属水酸化物。
  10. 【請求項１０】請求項１〜５のいずれか１項記載の測定
    法により血漿又は血清中のエンドトキシンを測定し、こ
    れとグラフ陰性菌敗血症とを関連づけることを特徴とす
    る、グラム陰性菌敗血症の検出方法。
  11. 【請求項１１】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
    成分、及び請求項６又は７記載の前処理剤を構成成分と
    して含む、グラム陰性菌敗血症の検出キット。
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