JPS5885162A - エンドトキシン測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、実際上、従来なし得なかった優れた正確性、
信頼性及び再現性をもって、カブトガニ・アメボサイト
・ライゼート成分を用いて、生体試料中に存在するエン
ドトキシン’ｅ　１１１定することを可能としたエンド
トキシンの測足法に関する。

巣に詳しくり、本発明は１．カブトガニ・アメボサイト
・ライセード成分を用いて生体試料中に存在するエンド
トキシンを創足する方法に於て、骸試料中のカブトガニ
凝固糸＃素基質切断活性が検出されなくなる条件下に酸
処理した生体試料を用いることを籍像とする方法に関す
る。

１９６８年、Ｌａｖｉ％によルカブトガニ・アメボサイ
ト・ライゼート成分いるエンドトキシン（細菌内毒素）
の％異的インビトロ検出法が報告され、そｎ以来、すＡ
Ａ／？ス）　（ＬＡＬ　−Ｔｅｘｔ）として、医学、薬
学の基礎及び応用分野において簡便且つ迅速なエンドト
キシン測定法として利用され、例えは、米国に於ては、
医療器具や生物製剤のパイロジエンテストに、制約条件
付きではあるが、ＬＡＬ−Ｔｅａｔの代用が公認される
にまで至っている。

このようなエンドトキシンの特異的検出法の出現により
敗血症、肝硬変症などの重篤症状についての病因論的研
究が臨床医学研究者間に於て、近年とくにさかんとなっ
ている。そして、生体試料中のエンドトキシンと疾病症
状との関連性を探究する目的で、生体試料中のエンドト
キシンをＬＡＬ−Ｔｅｓｔによシ測定しようとする試み
が数多く行われてき次。そのような試みに際して、エン
ドトキシンの存在にも拘わらず、カブトガニ・アメボナ
イト・ライゼートのエンドトキシンによるゲル化現象が
阻害されたり、或は又、エンドトキシンが存在しないの
くゲル化現象が生起したシするいわゆる阻害現象や擬陽
性現象がおこるというトラブルのあることが判明してき
た。

更に、このようなトラブルには、その原因物質が存在す
るのであろうとの仮説のもとに、生体試なる原因物質を
除去しようという試みもなされたが、その目的が達成さ
れているというｉＩｆ価は未だなされていない。それど
ころが、そのような前処理の試みを加えた生体試料を用
いたＬＡＬ　−Ｔｅｓｔによる臨床病理学的成績は、敗
血症、膵胆管癌、播穐性血管内凝固症候群、肝硬変症等
の患者血液試料中のエンドトキシンレベルが、臨床症状
や菌培養Ω結果や他のノセラメディカルデータと一致し
ないケースが多く見られ、ＬＡＬ−Ｔｅｓｔによる生体
試料中のエンドトキシンの検出の有用性をも疑われつつ
あるのが現状である。

斯くして、生体試料を用いるＬＡＬ−Ｔｅａｔの臨床診
断への適用の可否について、再杖討を要する時期に至っ
ている。更に、近年、カブトガニ・アメポサイト・ライ
ゼートのエンドトキシンによるゲル化現象の発生機構に
ついての生化学的解析が進んだ結果、該ゲル化現象に関
与するエンドトキシンの作用を受ける因子と該ゲル化現
象に於ける酵素系の役割とが明確となり、生化学的解析
の結果からも、従来のＬＡＬ−ＴｅｐｔＫよる生体試料
中のエンドトキシンの検出測定の妥尚性に多くの疑問が
生ずるに至っている。

すなわち、カブトガニ・アメボサイト・ライゼートのエ
ンドトキシンによるゲル化現象の発生機構についての生
化学的解析の結果、カブトガニ・アメボサイト・ライゼ
ートのゲル化機構に、哺乳動物の血＊ａｔｉ糸に類似し
た数種の不活性因子からなる系から構成されており、エ
ンドトキシンに特異的な因子が先ず、エンドトキシン量
に比例して活性化され、次いで段階的に順次不活性因子
（プロ・二ンザイム）が活性因子（エンザイム）Ｋ変換
され、最終因子（プロ・クロツテイングエンザイム）を
活性化し、活性化クロツテイングエンザイムが凝固性蛋
白前駆体コアギュロゲンを基質として作用してコアギュ
リン・モノマーとし、この物質が１合してゲル状蛋白と
なることが明らかになツｐ　（Ｓ、　Ｉｓｕａｎａｇａ
　ａｔ　ａｌ　Ｆｔｔｂａ、　Ｌｅｔｔｅｒ。

１２０．２１７　　（１９８０）　　〕ｅ斯＜Ｌ、て、
！ロクロツテングエンザイムがエンドトキシンにより直
接活性化を受けてクロツテングエンザイムとなり、これ
がコアギュロゲンに作用してゲル化を生ずるという従来
から云われてき次作用ｅｉｌ！橋とは異った機構によっ
て上記ゲル化現象が起こることが解明され友。

更に、カブトガニ・アメボサイト・ライゼートの凝固系
と、哺乳動物の血液凝固糸の対比により、前者における
コアギュロゲンが後者におけるフイプリノゲンに、前者
におけるクロツテングエンザイムが後者におけるＸα因
子に１そして前者におけるプロクロツテイングエンザイ
ム活性化酵素が後者におけるトロンビンに、夫々、類似
した性質を有することが判明した。これらの新たに判明
した事実の妥当性は、哺乳動物の血液中に存在する上記
凝固系因子やトリプシンなどの蛋白氷解酵素によっても
、カブトガニ・アメボサイト・ライゼートはゲル化する
ことから確認される。

又更に、生体試料にエンドトキシン調製品（例えば、大
腸菌からのエンドトキシンＥ、ａｏｌｉＱＨＢ　Ｂ１１
　Ｄｉｆｃｏ　　社製品）をね加し、ＬＡＬ−’１ｍｍ
ｇを用いて、該生体試料中のエンドトキシンを検出し、
その検出度から該試料中のエンドトキシンｍを確認する
方法が採石されているが、血液試料を用いて該方法を行
つｔ場合、添加したエンドトキシンｋに見合った検出レ
ベルが畑誌されず。

ＬＡＬ−Ｔｅａｔ　Ｋよるゲル化が阻害されることが判
明している。

上述のように、疵米のＬＡＬ−Ｔｅｓｔによる生体試料
中のエンドトキシンの検出測定の妥当性には多くの疑問
が生ずるに至っており、生体試料を用いるＬＡＬ−Ｔｅ
ａｔの臨床診断への適用の可否もしくは意義について再
検討を要する時期に至っているのが実情であり、生体試
料中のエンドトキシンの測定に際して、し試料中に存在
するカブトガニ・アメボサイト・ライゼー）＆分による
凝固系に関与する因子を適確に除去しなければ、ＬＡＬ
−Ｔｅｓｔによって、正確に且つ信頼性及びＭｌ性をも
って、エンドトキシンを検出測定することができないの
は勿論のこと、測定の意味さえも全く失われるであろう
ことは明らかである。

本ｙ明者等は、１ｉＪ−出１人の先に開発したカブトガ
ニ・アメボサイト・ライゼート利用の０成基質を用いる
エンドトキシンの高感度検出定量方法（特開昭５４−１
５７９７号；米国特許第４１８＆２６４号；西ドイツ国
特許公告公報ＤＥ２’１４０３２３号）を利用して、従
来、ＬＡＬ　−Ｔｅｓｔに際して、生体試料前処理法と
して公知の一１■処理法についてＷ＝細々検討を行つ九
。

その結果、ぜ来、血液前処理法として評価されてき次ク
ロロホルム処理法（Ｊ、Ｌａｔｉｎ、　ａｔ　ａｌｌＪ
、Ｌ６ｂ、Ｃ１１ｓ、　ｂｌｅｄ１？　５．９０３（１
９〕Ｏ））、酸性化法［Ｐ、Ｂ、Ｒａ１ｎｆａｌｄ　ａ
ｔ　ａｌ　ＨＰｒｏｓ。

Ｓｅｅ−ａｇ、Ｂｉａｌ、　Ｍａｄ、１３７，３３４（
１９７１）、加熱法（Ａ１．Ｓ、　Ｃｏｏｐａｒａｔａ
ａｋ、　Ｌａｍｅｓｔ１１１１１１丁ｔ　（１９７５）
）により前処理した血液試料を用いて、エンドトキシン
を正確に且つ信頼性をもって検出測定することは、！！
！際上、不可能であるという重大な事実を発見し次。

更に研究を進めた結果、後にＥｚｔｔｍｐｌａｍ　　に
於て実験的に詳しく示すとおシ血液試料にエンドトキシ
ンの既知量を添加し、上記従来法により前処理し光検体
試料中のエンドトキシン検出レベルを、上記合成基質法
による定量により検討し九結果、クロロホルム処理法、
酸性化法のいずれの場合にも、薄液試料中に存在するカ
ブトガニ・アメポサイト・ライゼート成分の凝固系に作
用する妨害因子が残存し、エンドトキシンの真の存在量
を、正確に且つ信頼性をもつ工検出測定することは不可
能であることがわかった。又、上記加熱法の場合には、
血液試料中の妨害酵素活性を完全に失活さセることかで
きる力ζこの試料を用い次エンドトキシン検出しベル扛
、該試料のａｔ類や希釈度の差異により、対照に比して
ｙｓ〜３倍というような大巾な数値変動を示し、エンド
トキシンの真の存在量な信頼度よく検出測定できないこ
とがわかった。

本発明省等は、従来慣用されてきた前処理した血液試料
を用い次エンドトキシン検出測定における上述の如き技
術的トラブルを克服し得る新しい匈処理手段七ｇｊＦ３
発することによって正抛に且つ伯軸性をもって、且つ又
、優れた再現性をもって、生体試料中に存在するエンド
トキシンをカブトガニ・アメボサイト・ライゼート成分
を用いて測定する方法を提供すべく更に研究を行ってき
た。

その結果、生体試料ｔ−１＃試料中にカブトガニ凝固系
酵素基質切断活性が検出されなくなる条件下で酸処理し
た試料を用いることによって、正確に且つ優れた信頼性
をもって、再現性良く、皺試料中に存在する真のエンド
トキシンｔを、カブトガニ・アメボサイト・ライゼート
成分を用いて検出測定できることを発見した。更に、こ
の方法は実際の臨床的応用においても充分な評価をうけ
られる優れ次男法であることがわかった。

斯くして、本発明者等の研究によれば、前述したように
、従来ＬＡＬ−Ｔｅａｔの臨床診断への適用の有用性が
疑問視されていた多くのトラブルが一挙に解決でき、そ
れ自体公知の凝固法（ゲル化法）或は合成基質法などに
より、カブトガニ・アメボサイト・ライゼート成分を用
いて生体試料中に存在するエンドトキシン管検出測定し
て、医薬。

医学の基礎及び臨床診断を含む応用分野に大きく貢献す
ることが可能となることがわかった。

従って、本発明の目的は顕著に改善され次エンドトキシ
ンの測定方法を提供するＫある。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。

カブトガニ・アメボサイト・ライゼート成分を用いて、
凝固法或は合成基質を用いて生体試料中に存在するエン
ドトキシンを検出測定する方法それ自体は、よく知られ
ており、例えば、丹羽光「臨床検査」、２３，３４３〜
３４８　　（１９７９）、“リムルステス）Ｋよる内毒
素微量定量”；Ｂａｃｔｇｒｉａｌ　Ｅｎｄｏｔｏｘｉ
ｎｓ　Ｔｅｘｔ　／ＢｉｏｌｏｇｉｅａｌＴｅｓｔｓ、
　Ｕ　５ＰＸＸ、　＜　８５　＞　１米国特許第４１８
　＆２６４号（％開開５４−１５７９７号１西ドイツ特
許公告ＤＥ２１４０３２Ｓ号）などに詳細に記載されて
おり、本発明方法の実施に利用できる。

本発明方法においては、カブトガニ・アメボサイト・ラ
イゼート成分を用いて、上記の如きそれ自体公知の方法
で生体試料中に存在するエンドトキシンを検出測定する
に際して、鋏生体試料を該試料中にカブトガニ凝固系酵
素基質切断活性が検出されなくなる条件下で酸処理する
。

既述の従来公知の酸性化法に於ては、１−の血漿をα１
−の２５チ氷酢酸（１９Ｎ　、　ｐ　ＨＬ　２　）管用
いて、ｐＨ４０で処理され、引き続いて中和される。こ
の酸性化法によっては、後に実験的に示すとお）、カブ
トガニ凝固系酵素基質切断活性が検出され、真のエンド
トキシン量の測定に影譬を与える因子が存在することを
示す。従って、この酸性化法によって処理された生体試
料を用いて真のエンドトキシン量を測定することはでき
ない。

本発明方法において、生体試料を、該試料中のカブトガ
ニ凝固系酵素基質切断活性が検出されなくなる条件下に
酸処理するに際して、好ましくは、５Ｃ ｐＫａ　　値が３以下の酸を用いて、ｐｕｓ以下の条件
下で処理するのがよい。

このような酸処理に用いる酸の例としては、モノ−、ジ
ー、トリーク・ル酢酸の如き、に、２５Ｃ値が３以下の
９酸や塩素酸、臭木酸の如きハロゲン酸、過塩素酸の如
き過ハロゲン酸、塩酸、硫酸、５Ｃ 硝酸などの如きｐＫａ　　　値が１以下の強酸を例示す
ることができる。

本発明においてに、生体試料中に存在し得る蛋白ａｍや
細胞顆粒が有するカブトガニ・アメボサイト・ライゼー
トによる測定に影４１を与える因子が失活するような酸
化作用乃至変性作用をこれら火線成分に及はし、これら
を不溶性沈殿物として測定系外に除去し得るような酸処
理が行われる。

このために、生体試料中のカブトガニ凝固系酵素基質切
断活性が検出されなくなる条件下に酸処理が行われる。

利用する酸の種類、濃度、処理条件などを適宜に選択す
ることによ・うて、生体試料中のカブトガニ凝固系酵素
基質切断活性が検出されなく表る処理が可能となること
が発見され友。

生体に１中にカブトガニ凝固系酵素基質切断活性が検出
されなくなる条件は、使用する甑にりいて、予め実験的
に容易に設定することができる。

上記予備実験は、例えば以下のようにして行うことがで
きる。試料のアミダーゼ活性を、あらかじめ合成基質Ｂ
ｅｅ−Ｌｍ％−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＮＡを用いて測定し
、次いで、骸試料を使用する過轟なｌｌを用いてｐＨ３
以下の条件下で温度、時間条件を選択して処理し、生じ
た沈殿を遠沈除去した注、上清の、Ｈを塩基を用いて中
和し再度合成基質を用いて処理ずみ試料中にアきダーゼ
活性がｌＮ認出来なくなる条件の範囲を設定する。

本発明方法によれば、例えば上述のようにして予め設定
された条件に従って、前記例示の如き酸を用いて酸処理
を行い、処理系中に沈殿してくる資性失活沈殿物を１例
えは、濾紙Ｐ別、遠心分離の如き手段で処理系から除去
したのち、糸のｐＨを中性条件に戻した生体試料を用い
て、それ自体公知の手法を利用して該生体試料中のエン
ドトキシンをカブトガニ・アメボサイト・ライゼート成
分管用いて測定することができる。

従来法で処理され九生体試料を用いた場合とは異なって
、本発明方法に従って酸処理された生体試料を用いるこ
とによって、生体試料中の阻害原因物質や擬陽性原因物
質の影響から解放されて、正確に且つ優れた信頼性をも
って、再現性喪く、生体試料中に存在する真のエンドト
キシン量を、カブトガニ・アメボサイト・ライゼート成
分を用いて検出測定することができる。

本発明で利用する生体試料としては、例−１えば、血漿
、血清、血液画分であるアルブミン、グープリンなどの
試料、腹水、関節液、尿などの循積液や体内外の浸出排
泄液の如きエンドトキシンが１着されやすい蛋白質や細
胞軸粒を含む生体試料管例示することができる。

本発明方法によれは、病気の種類、生体試料の種類など
に影響されることなしに、生体試料中のエンドトキシン
を優れた正確さ、高い信頼性をもって再現性よく且つ迅
速に検出測定することが可能となる。

本発明方法は、広い範囲のエンドトキシン血症患者の生
体試料中のエンドトキシンの検出及び＃ｊ定に利用する
ことができ、このような患者症例としては、例えば、以
下の如き症状を例示することかで色る。

菌血症、腹膜炎、髄膜炎、尿路感染症、術後感染症の如
きダラム陰性細菌の感染により発症した疾病、肝炎、肝
硬変等の肝疾患の原因として網内系不全が予測される疾
病、胆道系に生ずる急性化膿性胆管炎、胆嚢炎総胆道管
結石症等と腸内細菌群の因果関係予測、腸閉塞症、潰瘍
性大腸炎、膵炎ＤＩＣ（播種性血管向凝固症候群）、癌
、糖尿病、腎炎等の末期の網内系機能不全の判定に用い
られる。

以下、比較例と共に実施例により、本発明方法の数例に
ついて更に詳しく例示する。

ｔｌｌ　　生体試料の採取、調製ニー 健常人或は患者の体液（血漿、血清、腹水、関節液、髄
液、尿）を細菌やエンドトキシンの汚染を伴わないよう
に充分注意して採取する。

例えば、血漿は、ヒトの前腕肘静脈から真空採血管（ベ
ノジエクトチューブ：テルモ（株）ｌｉ品、日本）を用
いて、各種抗凝固剤（ヘパリン、クエン酸ナトリウム、
ＥＤＴＡ−２・ナトリウム岬）を収容した試験管に採取
し、遠心下（１５００〜１８００ｒｊｓ、１０分間）に
血球と血漿に分離し、血小板を含む画分を採取して血漿
試料（ＰＲＰ）とした、又、血清は、ヒ゛トの肘静脈か
ら採取した静脈血を清浄なガラス製スピッツ試験管に採
取し、室温に３０分間靜装して凝固を生じさせ、生じた
血餅を、２，５００〜３．００　Ｏｒｐｍ、　１０分の
条件で遠心し、上澄液を別の試験管に分取して血清試料
とし友。

腹水、関節液、髄液は、局部穿刺によシ採取し次分泌参
出液を用いた。

（２１エンドトキシンの測定ニー 特開昭４４−１５７９７　　（米国時１↑隷＋４．１８
へ２６４号：西ドイツ国特計公普公＠ＤＥ２７４０３２
３号）に基いて商品化され九エンドトキシン砿振定普試
薬・臂イロデツク（ＰＹＲＯＤＩＣ商品名：生化学工業
株式会社、日本、製品）を用いて、合成基質法によるＬ
ＡＬ−Ｔｅｓｔにより行った。

大腸菌からのエンドトキシンＥ、ｃｏｌｉ　Ｏ，、、Ｂ
４に換算しｆｃ値で示した。

（３）　　カブトガニ凝固系酵素基質切断活性及びその
測定ニー カブトガニ凝固系酵素基質切断活性（以下、アミダーゼ
活性と略称することがある）は、カブトガニ・アメボサ
イト・ライゼート非存在下に、カブトガニ・アメボサイ
ト・ライゼート中に存在する凝固蛋白コアギュロゲンの
切断部分構造をモデルとして調製されたペプチド性合成
基質ＢｏＣ−Ｌａｘ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＮＡ（生化学
工業株式会社、日本、製品）に対する基質切断活性を示
す、上記（２）エンドトキシンの測定に準じて測定しｔ
遊離ＰＮＡ（バラニトロアニリン）ｆ＆ｔを対応するエ
ンドトキシンＥ、　ｃｏｌｉ　　Ｏ，、、Ｂ４　　ｉｉ
Ｋ換算し次値で示した。

（４）生体試料の処理ニー （４−１）本発明例〔過塩素＠　（ＰＣＡ）処ａｉ法〕
前記（１）の生体試料α１ｍｌに、５囁過塩素酸水溶液
を終濃度が１．５−となるように添加し、３フＣで２０
分間インキュベートした。形成さｒＬ＋沈殿物を、３６
００　ｒｙｎ、１５分の条件で遠心し、上澄液を採取し
てこれをα２ＮのＮａＯＨ水浴液を用いてｐＨｅＬｓ〜
＆Ｏの中性附近に中和し、酸処理生体試料を得友。

（４−２）本発明例〔トリクロル酢酸（７’ＣＡ）処理
法〕 前記（１）の生体試料α１−に、５嘔トリクロル酢酸水
溶液を同量添加し、４５Ｃで１０分間インキュベートし
た。形成された沈殿物を、３００Ｇデｇｍ、１５分の条
件で遠心し、上澄液を採取してこれを（ＬＩＮのＮａＯ
Ｈ水浴液を用いてｐｈｉｓ〜＆Ｏの中性附近に中和し、
酸処理生体試料を得た。

（４−３）本発明例〔硝酸ＣＩｆＮＯｓ　）処理法〕前
記（１１の生体試料へ１−に、３％ＨＮＯ，水溶液の同
量を添加し、４０Ｃで１０分間インキュベートした。形
成され友沈殿物を、３０００ｒヤ愼、１５分の条件で遠
心し、上澄液を採取してこれを０．２ＮのＮαＯＨ水溶
液を用いてｐ　Ｈ６，５〜８．０の中性附近に中和し、
酸処理生体試料を得た。

（４−４）比較例〔クロロホルム処理法〕Ｊ、　Ｌａｂ
、　Ｃ１ｔｎ、　Ｍａｄ、、　７５　９０　Ｂ　（１９
７Ｇ）に記載されたところに従って、前記（１）の生体
試料（ヘノ々リン血漿）４容に対し、クロロホルムｌ容
を加え、２５Ｃで６０分間はけしく振盪攪拌したのち、
１．１０Ｏｆで１０分間、遠心すると、三層に分離する
。この中間層を分取して、クロロホルム処理生体試料と
する。

（４−５）比較例〔酸性化処理法、〕 Ｐｒｏｅ０ｇｏＣ，ｅｚｌｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍａｄ、
、　　１３　’ｒ　。

３３４　（１９７１）に記載されたところに従って。

前記（１）の生体試料０．１　ｙｘｌに、２５％氷酢＠
（ｚｓＮ％ｐＨ２，２）０．１ｄ！添加１．−（系ｔ２
）　ｐ　Ｈを１０±ａｌＫ低下させ、続いて５０チ（Ｗ
／Ｖ＞無水二塩基性燐酸カリ緩衝液（ｓ　ｏ　％　Ｋ、
ＨＰＯいｊｌＢｓ、４）のａ２＊ｌ添加ｔ、−’ｃ血漿
（１）ｐＨ１′＆２キ０、１に戻して酸性化処理生体試
料を１１友。

（４−６）比較例〔加熱処理法〕 Ｌａｍｅｓｔ　１１　！！？　２　（１１１丁４）に記
載されたとζろに従って、前記（１）の生体試料（血漿
）をパイロジエンフリーの滅菌蒸留水を用いて３倍に希
釈し、ｔｏｏｃｘｏ分間加熱して加熱処理生体試料を得
た。

（４−７）比較例〔アルカリ処理法〕 前記（１）の生体試料ａｒｍに、ａ　！　Ａ／　ＯＮａ
ＯＨ水溶液ａ！−を添加して、３マＣで１０分間インキ
エベートしたのち、ａ意Ｎ　　ＨＣＩ　　水溶液４Ｌ！
−を加えてｊＨ亀５−ｔＯの中性附近に中和し、アルカ
リ処曹生体試料を得た。

実施例１及び比較例１〜４ 前記（４の（４−１）〜（４−３１）Ｋ記載した本発明
例の酸処理生体試料、前記（４−４）〜（４−？）Ｋ記
載した比較例処理生体試料及び無処理の前記（１）の生
体試料の夫々について、前記（３）Ｋ従って、アミダー
ゼ活性を測定した。その結果は、下掲第１表のとおりで
あった。

（記号）（エンド）　＊　シンＥ、　Ｃｏ１１　Ｏ，、
、Ｂ４換算値／−生体試料） −７４０９ｇ＞ ±　　　　　３０〜７０　ｖ（Ｊ ＋７ＯＮ１７０ｊｇ （１丁Ｏ〜７００　ｐｇ 骨　　　　　　７００１ｇ＜ 上掲第１表のｓｑ＊に示されているように、本発明方法
に従って酸処理さｎた生体試料及び比較試料中、加熱処
理ならびにアルカリ処理された生体試料では、試料中の
アミダーゼ活性の残存は認められず、消失していること
がわかる。しかしながら、比較試料中、クロロホルム処
理ならびに酸性化処理された生体試料においては、対照
試料（無処理）よりアミダーゼ活性が大となった９＊は
アンダーゼ活性は実質的に消失せず、カブトガ＝に同系
酵素基質切断活性が留保されており、生体試料中の真の
エンドトキシン黛を正確に測定することは不可能である
ことがわかる。

尚、第１表に於て、対照試料（無処理）に示されている
ように、他の生体試料とは異？て髄液には、通常、アミ
ダーゼ活性は見られない、しかし試料採取時や患者症状
によって、血液の混入などの原因でアミダーゼ活性の認
められる場合がある。

上記実験の結果、生体試料中のアミダーゼ活性が完全に
消失していることのわかった試料について、以下の実施
例２及び比較例５．６のテストを行つ次。

実施例２及び比較例５．６ 前記実施例１及び比較例１〜４で得られた結果に基いて
、生体試料中のアミダーゼ活性を完全に消失せしめるこ
とのわがりｔ本発明酸処理及び比較のための加熱処理な
らびにアルカリ処理を採用後掲第２衣に示し几生体試料
に、予めシぜめられ次既知量のエンドトキシンを添加し
た後、実姉例１及び比較例１．２と同様に処理し几試料
群、及びこれら生体試料を同様に処理した体、予め定め
られた既知量のエンドトキシンを離別し次試料群につい
て、前記（２１に１載の方法で、該エンドトキシン置を
測定し、添加し７た既知量のエンドトキシン菫に対する
検出測定され次エンドトキシンＭｖ割合（チ）で樵出軍
を示す。

テストの結果を下掲第２表に示した。尚、第２表には、
本発明酸処理生体試料約Ｎｄ（４−１）〜（４−３）中
、ＰＣＡ処理試料についてのデーターを代表例として示
したが、他の本発明試料についても、はぼ同様な結果が
得られ友。

又、表中、　（×３）、　（×６）、　（ＸＳ）Ｖｉ、
夫々、　（測定時における）試料の希釈倍率を示す。

上掲第２表に明らかなとおり、前記ｍＩＮに示したテス
トに於て生体試料中のアミダーゼ活性の消失が飴められ
た加熱処理試料又はアルカリ処理試料を用いた測定結果
は、添加したエンドトキシンの量と相関関係を全く示さ
ずに、添加したエンドトキシンのほんの一部しか検出さ
れまかったり或は又数倍の検出率を示し次すすること、
更に試料の希釈の度合によって検出率が大巾に変化する
ことがわかる。斯して、これら比較例の手法で処理され
た生体試料を用いて、試料中の真のエンドトキシンの量
を正確に且つ信頼性をもって再現性よく検出測定するこ
とはできないことがわかる。

これに対して、本発明の酸処理生体試料を用いた場合に
は、生体試料の種類、エンドトキシンの添加時が処理の
前の場合と後の場合との相違、希釈の度合などに、拘わ
りなしに、＃９１１００％の検出率で、正確に且つ信頼
性をもって再現性よ〈検出測定することが可能となるこ
とがわかる。

更に１上記実施例２及び比較例５．６に於けると同様に
して、血漿及び血清を生体試料として処理した後、夫々
の試料中に残存する蛋白を、Ｌｏｗｒｙ法（Ｑ、　Ｈ，
Ｌｏｗｒｙ、　ａｔ　（１１＄　Ｊ、Ｂｉａｌ。

Ｃｋｇ惟１．　１９３．２６５　　（１９５１））によ
シ定量した、結果を下掲第３表に示した。尚、表中の数
値の単位は■蛋白／ｄ試料であり、数値は３回の実験の
平均値で示しである。血漿の欄の下段は使用した抗凝固
剤を示す。

第３表 上掲第３衣の実販結来に示されているように、未処理（
対照）試料中の蛋白が、比較処理例の加熱処理及びアル
カリ処理では、はとんど除去されていないのに対し、本
発明の酸処理を行つｆｃ場合には＜　２　”Ｉ　／　ｄ
オーダーの極めて倣門にまで充分な除蛋白効果が達成さ
れていることがわかる。

周知のように、血中成分がカブトガニ凝固系酵素と交差
反応をすることや一般的な蛋白の保護効果などからみて
、測定しようとするエンドトキシンに実質的な失活作用
を及ぼすことなしに充分な除蛋白効果を達成することは
、測定の正確性、信頼性、再現性などの点から極めて望
ましいことである。そして、上掲第３表及び前掲第２表
の実験結果から、本発明方法によれば、このよう表希望
が有利に達成されることが理解できる。

実施例３ 生体試料中に存在する測定しようとするエンドトキシン
に対して吸着能を有する蛋白質類や細胞顆粒の如き妨害
因子を、エンドトキシンに不都合な失活作用を及ばずこ
となしに、分解乃至変性除去できることが、本発明方法
における酸処理の最も重要な特色である。

本発明方法における上記特色の優れた作用効果を示す几
めに１本発明のＰＣＡ処理、ＴＣＡ処理、ＨＮＯ，処理
の場合を例に、これら処理を行った血漿試料（ＰＲＰ：
前記（１１参照）、並びに生理食塩液中の添加エンドト
キシン（Ｅ、　ｃｏｌｔ　Ｏ…Ｂ、）の検出率及び該処
理血漿試料（Ｐ　ＲＰ）中の残存アミダーゼ活性を測定
した結果を後掲第４表に示す、測定は以下のようにして
行った。

健常血漿αｌＷｔに、血漿ｌ−当す１０００　ｐｇにな
るようにエンドトキシン溶液を添加したのち、５ｑｌｂ
’ＰｃＡ水溶液、６％ＴＣＡ水溶液及び３％ＨＮＯ，水
溶液を、夫々、添加し２て、各試料の終濃度が、Ｏ囁（
対照：添加せず）、０．５％、１％、Ｌｔ６１．２．０
％、１５％、５％及び１０チとなるようＫｖＩ４製し元
、これら試料を３７Ｃで１０分間インキュベートし、次
いで３０００　ｒｐｍ、　１５分の条件下に遠心処理し
て、上澄液５Ｏ−１００ｐｔを採取し、α１〜α２Ｎの
ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ７゜５となるように中和し
て、これ會被検試料液とした。エンドトキシンの測定は
、前記（２）に記載の方法に従って、合成基質として前
記（３）Ｋ記載したペプチド性合成基質を用いて行つ几
。

更に、対照とレズ、血漿試料の代りに生理食塩水（注射
用）を用いて同様なテストを行い、その測定値管１００
として、検出率（％）を算出した。

又、健常者の血漿試料（ＰＲＰ）に、前記エンドトキシ
ン溶液の代りに、生理食塩水を６加したのち、前記同様
に、ＰＣＡ処理、ＴＣＡ処理及びＢＮＯ，処理した試料
群について、上記と同様にして、残存アミダーゼ活性を
測定し次。

上掲第４表の結果に一例を示したように、酸処理剤の種
類によって、成る濃度以上になると、血漿試料又は生理
食塩水中でのエンドトキシンそれ自体の分解と予諭され
る検出率の低下が見られるが、本発明方法によれば、撤
処理剤の種類及び／又は処理条件などを予め実験的に適
宜に返択設定する仁とＫよって、アミダーゼ活性の影響
の無視し得る条件下で、生体試料中のエンドトキシンの
真の値を、正確に且つ高度な信頼性管もって再現性良く
、検出測定できることが容易に理解できよう。

以下、災に臨床データーによシ、本発明方法実施の数例
について説明する。

実施例４ 匍常人及びエントドキシ血症患者から、前記（１）Ｋ記
載の手法で採取し元血漿試料（ＰＲＰ）を用い、本発明
方法に従ってＰＣＡ処理した酸処理Ｐ記載のペプチド性
合成基質を用いて、これら処理血檗試料中のエンドトキ
シンの実ＩＩＩを行った。

その結果を、添付第１図に示した。第１図の例に示され
ているように、鍵常人（πｏｒｍａｌ　：図中Ａ）Ｋ於
ては、エンドトキシンは０〜αＯ［す／―の間に集って
分布していることがわかる。これに対して、エンドトキ
シン血症患者群【図中、Ｂ＃ｉ肝炎（ｈｅＷａｔｉｔｉ
ｓ）患者、Ｃは肝硬変（１ｏｗｅｒａｉｒｒｋｏａ４ｍ
）患者、Ｄは感染症（ａａｊａｓｓ）患者、Ｅは悪性島
瘍ｉｔｌ＆ａｉｌｔｇｎａ＊ｔ　ｔａｍｅｒ）患者。

Ｆは白血病←ｉ％＆＃惰Ｓａ）患者〕に於ては、エンド
トキシンはＯ〜［す／−の広い範囲にわたって。

夫々、異なつ九分布様式で分布しており、健常人とは明
瞭に区別できる分布状１１ｔ−示してお９１本発明方法
によって、エンドトキシンを正確に且つ高度な信頼性を
もって再現性良く検出測定できる事実と相俟って、本発
明方法が、診断上、きわめて有力な手段として注目すべ
き手法を提供するものである仁とが理解できょう。

実施例５ Ｔ、　Ｋ、敗血症（ｍａｄｅ　ｔ　ｏｚａｍｉａ　）患
者（３８９）の血漿試料、Ｕ、Ｂ、肝硬変症（ｌｔｖａ
ｒ　ａｉｒｒｈｏａｉａ）患者（６）ａ）の血清試料１
Ｍ、　Ｓ、尿路感染症患者（４３９）の尿試料、Ｓ、　
Ｏ，膵胆管癌患者（５４＆）の腹水試料について、前実
施例４と同様にしてエンドトキシン検出測定を行ない、
エンドトキシンの１１１Ｍされたこれら生体試料に検出
測定され九エンドトキシン蓋と同量のエンドトキシンＥ
、ＣｏＨＯ，、、Ｂ４を、添加して、エンドトキシンの
検出測定を行った。

上記生体試料の夫々について、各々、ＰＣＡ処理％ＴＣ
Ａ処理、ＨＮＯ，処理した酸処理試料群を作成し、上記
エンドトキシン溶液を、各試料について最初の検出測定
テストで測定されたエントド中シン量の２倍の濃度とな
るように、これら各試料に添加したのち、前実施例艦と
同様にして、エンドトキシンを測定した。上記処理を、
エンドトキシン溶液の添加後に行った試料群にりいても
、同様なテストを行った。

その結果を、後掲表５〜表８に示し友。これら表に示し
几結果から明らかなように、病気及び生体試料の種類の
如何に拘わらずに、添加したエンドトキシンのほぼ１０
０％が回収され、更に、この結果は、生体試料６酸処理
前にエンドトキシンを添加しても、酸処理後に添加して
も同様であることがわかる。このことは、本発明方法に
従って酸処理した場合には、添加エンドトキシンが、な
んらの失活変性も生ずることがなく、史に、絵加したエ
ンドトキシンと被検液との間の相互作用による検出阻害
や増感などの不都合な非特異的現象も伴わずに、添加し
九エンドトキシンがほぼ理論量で回収できることを意味
し、本発明方法による測定結果の優れた正確さ及び高度
な信頼性ならびに再現性を一層明らかにするものである
。

【図面の簡単な説明】

添付第１図は、実施例４に＠：［Ｌ、たエンドトキンン
測定の結果を示す図面である。 外１名 ｎｇ／ｍｌ 第１図 手続補正書 昭和５８年２月１４日 特許庁黄官　　若　杉　和　夫　　　殿１、事件の表示 鴫４１昭５６−１８２１９０＋５ ２、発明の名称 エンドトキシン側メＥ法 ３、補正をする渚 事件との関係　　特許出願人 住所　　米水ｉｆ）中火１６日本輌本町二丁目九１才地
八４、代　理　人〒１０７ （１）明細誓第７頁９行に−ｒＯｏｓＪとあるを。 「０１　ｌ　ＩＪ と訂正する。 （２）明Ｍ４＠９負７行に、　　「Ｐ、　　Ｂ、　Ｒｅ
ｔｉｎｆａＬｄ」とあるを。 ｊ　Ｒ，Ｂ、　Ｎａ１ｎｈｏＬｄ　Ｊ と訂正する。 （３）　　明細誓嘱９頁８行に、　　「ＢｉａＬ、」と
あるを。 ｆ　ＢｉｏＬ、Ｊ と訂正する。 （４）明＃ｔＵ誉第９頁１０行に、　　１−（１）Ｊと
あるを、ｒ　（＜）　Ｊ と訂正する。 （５）明細書第１３自１１行に「酸処理する。」とある
慄に、 ｒすなわち、該生体試料中のエンドトキシン非依存性酵
素活性（ｈｙｄｒｏＬｙｔｉｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏ
ｆａｎｄａｔｏｒｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｇｖ
ｓｇｙｒｒｕｓ）が検出されなくなるように酸処理する
。」 と加入する。 （６）明細誓甲２０貞７行及び第２１頁４行に。 夫々−ｒＯｍＪとあるを。 ｒｏｌ　１１　Ｊ と訂正する。 （７）明ｍ’ｄＦＭ　２　ｓ真下から４有に％　　ｕα
ｎｃｍｔ１　１２７２（１９７４）Ｊとめるを。 ｒＬａｎｃｍｔ（ｉ）１２Ｔ２Ｃ１９７５）Ｊと訂正す
る。 （８）明＃ｌ＠ｘａ１負ｌＯ行に、「示す。」とある恢
に。 ｒ更に１表中には前記（４−５）比較例〔酸性化処理〕
で得た生体試料についても同様に行った蛋白定鷲の結果
を示した。」 と加入する。 （９）明細薔第３２頁の第３衣中、ＰＣＡ処理（本発明
）の各個に、夫々、「〈２」とあるを。 「〈ｌ」 と訂正する。 α１　明細４第３２負の第３表のアルカリ処理（比較）
の下に表の各−に対応して、以下のとおりリロ入する。 」 α力　明ｉｔ第３２頁下から４行に、「及びアルカリ処
理」とあるを。 「、アルカリ処理及び散性化処理」 と訂正する。 ＣＩ邊　明細４第３２負末行に、「く２岬／１」とある
を。 と訂正する。 ｅｌｌ　　明ａ３誉第３３自下から６行に、「存在する
」とある後に。 ｒ　ＬＡＬ　−Ｔｅ５ｔ阻害因子及びアミダーゼ活性。 さらに」 と加入する。 ノ ａ４　　明細１＃第３４貞２〜５行に、「本発明の・・
◆（Ｅ、　　ｃａｄｉ、　　Ｏｌ、、Ｂ４）とあるを。 ｒ　Ａ　＊　　ｅ　ｏ　ｌ　ｓ　（）ｌ　１　ｉ　Ｂ＊
自由米エントドキシンを添加した血漿サンプルを本発明
のＰＣＡ処理。 ＴＣＡ＠埋、＃ＶＯ，処理に賦した場合を例に。 これら酸処理を行った血漿試料（ＰＲＰ　を前記（１）
参照）、並びに生理食塩液中にＥ、　　ｃｏＬｉｏｌｌ
ｌＢ、白米のエンドトキシンを添加したのち。 上記各々の酸処理を行った三つのコントロール試料につ
いて、添加したエンドトキシン」ａＳ　　明ｓｉｎ第３
４貝１１？ｘ［、［ｓ％ＰＣＡ水浴液、５襲ＴＣＡ水浴
故及び３％ｊとあるを。 ｒ　Ｐ　ＣＡ７に浴Ｑ、　Ｔ　ＣＡ水１ｅ液及Ｕ　Ｊと
訂正する。 ＤＩ　　４３１１．、ｉｔ１４ｇ３５ｊｊ２行に、ｒｐ
Ｂ７．ｓＪ　とｈる紮、 ｒｐＨ６，５〜８．ＯＪ と訂正する。 ａり　明細着側３６貝の第４病を以下のとおり訂正する
。 （ＩＩＩ　　明７１＋Ｉ１１誓素３９貞下から５行に「
Ｏ□、」とあるを。 ０１１１Ｊ と訂正する。 α罎　明細４ｆｔ第４５負の衣の衾に、行を改めて。 以下のとおり刀目人する。 ｒ　以上に詳しく述べたとおり１本発明によれば生体試
料たとえば体液やそのａｏｉｌ製物中のエンドトキシン
を優れた正確性、１ｄ籾性及び再現性をもって慣用測定
することができる。したがって。 本兜明方法の実施に利用できるエンドトキシン測定用具
として１例えばｐＫα２５°０イ＾が３以下の瞭（α）
とカブトガニ・アメボサイト・ライゼート成分（ｂ）と
の組み合わせもしくはこの組み合わせを含むエンドトキ
シン測定用キットを例示することができる。すなわち１
本発明方法の実施に利用できる測定用キットとして、被
験試料の酸処理用のｐＫａ２５′Ｃ愼が３以下の醒（ａ
）を収容した容器及びカブトガニ・アメがサイト・ライ
ゼート成分（ｂ）を収容した容器の組み合わせもしくは
この組み合わせを含む測定用キットが提供できる。 このような胛］定用キットけ、さらにエンドトキシン測
定用合成基爾、中和用アルカリ、稀釈用もしくけ溶解用
の緩衝液、カップリング試薬、酵素反応停止剤、蒸留水
その他の補釈用液などの如き、測定に利用する各種の剤
を収容した容器を、適宜、史に組み合せたキットの形態
とすることができる。」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　カブトガニ・アメボサイト・ライゼート成分を用
   いて生体試料中に存在するエンドトキシン管測定する方
   法に於て、該試料中のカブトガニ凝固系酵素基質切断活
   性が検出されなくなる条件下に酸処理した生体試料を用
   いることを特徴とする方法。 ２　該酸処理が、ｐＫａ”＝％”２：値が３以下の酸を
   用いてｐｆ１３以下の条件下に行われる特許請求の範囲
   第１項ｔｆｄ載の方法。