JP2979321B2 - 新規組み換え型リンホトキシン - Google Patents
新規組み換え型リンホトキシンInfo
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- JP2979321B2 JP2979321B2 JP1085724A JP8572489A JP2979321B2 JP 2979321 B2 JP2979321 B2 JP 2979321B2 JP 1085724 A JP1085724 A JP 1085724A JP 8572489 A JP8572489 A JP 8572489A JP 2979321 B2 JP2979321 B2 JP 2979321B2
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- JP
- Japan
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- leu
- ala
- ser
- lys
- thr
- Prior art date
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗癌剤として有用な新規生理活性ポリペプチ
ドおよびその遺伝情報を有するポリデオキシリボ核酸
（以下、DNAと略す）に関する。
ドおよびその遺伝情報を有するポリデオキシリボ核酸
（以下、DNAと略す）に関する。
本発明は又、該DNAを含む複製可能な組み換えDNA及び
該複製可能な組み換えDNAで形質転換された微生物又は
細胞に関し、更に又、該DNAが有する遺伝情報を発現し
て得られる新規生理活性ポリペプチド及びその製造方法
に関する。
該複製可能な組み換えDNAで形質転換された微生物又は
細胞に関し、更に又、該DNAが有する遺伝情報を発現し
て得られる新規生理活性ポリペプチド及びその製造方法
に関する。
本明細書においてアミノ酸およびペプチドはIUPAC−I
UB生化学命名委員会（CBN）で採用された略記法により
表示され、例えば下記の略号が使用される。なお、アミ
ノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特に明示
しなければＬ体を示すものとする。
UB生化学命名委員会（CBN）で採用された略記法により
表示され、例えば下記の略号が使用される。なお、アミ
ノ酸などに関し光学異性体があり得る場合は、特に明示
しなければＬ体を示すものとする。
Gln:グルタミン残基 Asp:アスパラギン酸残基 Pro:プロリン残基 Tyr:チロシン残基 Val:バリン残基 Lys:リジン残基 Glu:グルタミン酸残基 Ala:アラニン残基 Asn:アスパラギン残基 Leu:ロイシン残基 Phe:フエニルアラニン残基 Gly:グリシン残基 His:ヒスチジン残基 Ser:セリン残基 Thr:スレオニン残基 Ile:イソロイシン残基 Trp:トリプトフアン残基 Arg:アルギニン残基 Met:メチオニン残基 Cys:システイン残基 又、本明細書中においてDNAのポリマー又はオリゴマ
ーは下記の如き略号の配列により表記する。
ーは下記の如き略号の配列により表記する。
A:2′−デオキシアデニル酸残基 C:2′−デオキシシチジル酸残基 G:2′−デオキシグアニル酸残基 T:チミジル酸残基 特にことわらない限り、配列の左から右への方向は
５′から３′への方向を示すものとする。
５′から３′への方向を示すものとする。
リンホトキシン（以下LTと略す）はリンパ球由来の抗
腫瘍活性を有する蛋白で、マクロフアージ由来の癌壊死
因子（以下TNFと略す）と共にその臨床応用に期待が寄
せられている。これらのLTやTNFはそれぞれリンパ球や
マクロフアージにエンドトキシンやホルボールエステル
を添加し活性化することにより得られていたが、近年遺
伝子操作技術の進歩に伴いその構造が明らかになり、こ
れらの蛋白をコードする遺伝子を用いることにより微生
物又は細胞培養で該蛋白を製造することが可能となっ
た。Grayら〔ネイチャー（Nature）,312巻（1984年）72
1頁〕及びPennicaら〔ネイチャー（Neture）,312巻（19
84年）724頁〕はそれぞれこの遺伝子操作技術を駆使し
てそのクローニングに成功した。
腫瘍活性を有する蛋白で、マクロフアージ由来の癌壊死
因子（以下TNFと略す）と共にその臨床応用に期待が寄
せられている。これらのLTやTNFはそれぞれリンパ球や
マクロフアージにエンドトキシンやホルボールエステル
を添加し活性化することにより得られていたが、近年遺
伝子操作技術の進歩に伴いその構造が明らかになり、こ
れらの蛋白をコードする遺伝子を用いることにより微生
物又は細胞培養で該蛋白を製造することが可能となっ
た。Grayら〔ネイチャー（Nature）,312巻（1984年）72
1頁〕及びPennicaら〔ネイチャー（Neture）,312巻（19
84年）724頁〕はそれぞれこの遺伝子操作技術を駆使し
てそのクローニングに成功した。
これらの遺伝子技術の進歩に伴い、現在ではLTやTNF
の大量生産が可能となり、臨床応用されるに至ってい
る。しかし今日迄に得られた多くの臨床治験の成績、特
にTNFの臨床データは必ずしも良好なものではない〔田
口鉄夫：癌と化学療法，13,3491（1986），漆崎一朗
ら：オンコロジア（Oncologia），20,105（1987）,A.Kl
ansne:バイオテクノロジー（BioTech.），５,335（198
7）〕。最大の問題は重篤な副作用の発現であり、TNFの
投与は発熱、悪寒、戦慄、血圧低下などを伴い、従って
投与を中止し腫瘍の増大を阻止することができないとい
う欠点を有している。この原因としては、TNFの腫瘍選
択性が当初考えられていた程優れたものではなく、実際
に多くの正常細胞・線維芽細胞にもTNFレセプターが認
められており〔新津洋司郎：テラポイティック・リサー
チ（Therapeu.Res.），７,275（1987）〕,TNFに反応す
るものが見つかっている。
の大量生産が可能となり、臨床応用されるに至ってい
る。しかし今日迄に得られた多くの臨床治験の成績、特
にTNFの臨床データは必ずしも良好なものではない〔田
口鉄夫：癌と化学療法，13,3491（1986），漆崎一朗
ら：オンコロジア（Oncologia），20,105（1987）,A.Kl
ansne:バイオテクノロジー（BioTech.），５,335（198
7）〕。最大の問題は重篤な副作用の発現であり、TNFの
投与は発熱、悪寒、戦慄、血圧低下などを伴い、従って
投与を中止し腫瘍の増大を阻止することができないとい
う欠点を有している。この原因としては、TNFの腫瘍選
択性が当初考えられていた程優れたものではなく、実際
に多くの正常細胞・線維芽細胞にもTNFレセプターが認
められており〔新津洋司郎：テラポイティック・リサー
チ（Therapeu.Res.），７,275（1987）〕,TNFに反応す
るものが見つかっている。
LTに関する臨床結果は未だTNFに関する程多くのもの
は得られていないが、TNAときわめて類似した化学構造
を有することや、また細胞上の共通のレセプターに結合
するという性質〔B.Y.Rubin,et al.:ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.），16
2,1099（1985）〕からも、やはり非腫瘍臓器・組織・細
胞への非特異的な細胞毒性の発現があり、TNFと同様な
副作用の惹起が考えられる。
は得られていないが、TNAときわめて類似した化学構造
を有することや、また細胞上の共通のレセプターに結合
するという性質〔B.Y.Rubin,et al.:ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.），16
2,1099（1985）〕からも、やはり非腫瘍臓器・組織・細
胞への非特異的な細胞毒性の発現があり、TNFと同様な
副作用の惹起が考えられる。
このようにTNFやLTそのものについては、当初期待さ
れた程の臨床効果を得ることは難しく、新しい修飾や併
用療法などを含む新規製剤への適用が待たれている。
れた程の臨床効果を得ることは難しく、新しい修飾や併
用療法などを含む新規製剤への適用が待たれている。
一方、腫瘍細胞を選択的に殺す薬物として、抗癌抗体
を化学療法剤や生物毒素に結合させた抗腫瘍免疫複合
体、いわゆる“ミサイル療法剤”といわれるものが開示
された。これらは腫瘍細胞上の腫瘍特異抗原もしくは腫
瘍関連抗原を認識結合し、かつこれら腫瘍細胞のDNA合
成あるいは蛋白合成を停止せしめ死に至らしめるという
特性を有している。従って、腫瘍臓器・組織・細胞に特
異的で、正常細胞への副作用が少ない、既に臨床応用さ
れた抗体−薬物あるいは抗体−毒素複合体もあり、幾つ
かの良好な結果を挙げているのが現状である。
を化学療法剤や生物毒素に結合させた抗腫瘍免疫複合
体、いわゆる“ミサイル療法剤”といわれるものが開示
された。これらは腫瘍細胞上の腫瘍特異抗原もしくは腫
瘍関連抗原を認識結合し、かつこれら腫瘍細胞のDNA合
成あるいは蛋白合成を停止せしめ死に至らしめるという
特性を有している。従って、腫瘍臓器・組織・細胞に特
異的で、正常細胞への副作用が少ない、既に臨床応用さ
れた抗体−薬物あるいは抗体−毒素複合体もあり、幾つ
かの良好な結果を挙げているのが現状である。
本発明者らはかかる技術的背景のもとに、強力な細胞
毒性作用を有したヒト由来の毒素であるLTをさらに腫瘍
特異的とするため、抗癌抗体に結合させ従来にないイム
ノトキシンを開発することを目的として本研究を進め
た。かかるイムノトキシンの作製においては大きく２つ
の問題が考えられた。１つは、従来のLTあるいはLTムテ
ィンでは分子上の活性部位に抗体が結合する可能性がお
おきく、その結合過程でLT自身の生物活性が損なわれる
こと、２つは、たとえLTの生物活性が幾らか保持された
形でイムノトキシンが合成されたとしても、腫瘍細胞内
に取り込まれたのちにトキシン部分、すなわちLT分子が
抗体から遊離されることがなく、従って細胞内の標的部
位への移行が難しく、その活性発現がきわめて小さいこ
とが予測される。
毒性作用を有したヒト由来の毒素であるLTをさらに腫瘍
特異的とするため、抗癌抗体に結合させ従来にないイム
ノトキシンを開発することを目的として本研究を進め
た。かかるイムノトキシンの作製においては大きく２つ
の問題が考えられた。１つは、従来のLTあるいはLTムテ
ィンでは分子上の活性部位に抗体が結合する可能性がお
おきく、その結合過程でLT自身の生物活性が損なわれる
こと、２つは、たとえLTの生物活性が幾らか保持された
形でイムノトキシンが合成されたとしても、腫瘍細胞内
に取り込まれたのちにトキシン部分、すなわちLT分子が
抗体から遊離されることがなく、従って細胞内の標的部
位への移行が難しく、その活性発現がきわめて小さいこ
とが予測される。
上記の問題点を解決するために、LT分子の非活性部位
で抗体と結合し、かつ腫瘍細胞内へ取り込まれたのちに
容易に抗体からLT分子が遊離される新規組み換え型LTム
テインに関する研究を進めた結果、Ｎ端欠損LTのＮ末端
部に、抗体結合用官能基を有したアミノ酸もしくはペプ
チドと、さらにリソゾール酵素感受性のリンカーペプチ
ドとを結合した形の新規LTムテインを作成し、本発明を
完成したものである。
で抗体と結合し、かつ腫瘍細胞内へ取り込まれたのちに
容易に抗体からLT分子が遊離される新規組み換え型LTム
テインに関する研究を進めた結果、Ｎ端欠損LTのＮ末端
部に、抗体結合用官能基を有したアミノ酸もしくはペプ
チドと、さらにリソゾール酵素感受性のリンカーペプチ
ドとを結合した形の新規LTムテインを作成し、本発明を
完成したものである。
すなわち、本発明は次の如きアミノ酸配列を有する蛋
白質またはその活性部分の一部に関するものである。
白質またはその活性部分の一部に関するものである。
〔式中、R1はCsy,Lys,Ser,Cys−Ser又はLys−Ser,R2
はAla−Leu−Ala,Leu−Ala−Leu,Leu−Ala−Leu−Thr,A
la−Leu−Ala−Leu,Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Ly
s−Pro,Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp,Gly−Phe−Leu
−Gly−Ser,Gly−Phe−Leu−Gly−Ser−Leu−Lys−Pro
又はGly−Phe−Leu−Gly,R3はAla−Ala−Gln−Thr−Ala
−Arg−Gln−His−Pro−Lys−Met−His−Leu−Ala−His
−Ser−Thr−Leuで示されるペプチド又はその一部を示
し、ｍが０又は１、ｎは０又は１を示す。〕 上記式中、R1は抗体結合用官能基を有したアミノ酸残
基もしくはペプチド鎖であり、R2はリソゾーム感受性の
リンカーペプチド鎖であり、R3はＮ端欠損LTのＮ末端部
であり、 で表わされるLTのNo.10−No.27のアミノ酸の全部もしく
は一部である。
はAla−Leu−Ala,Leu−Ala−Leu,Leu−Ala−Leu−Thr,A
la−Leu−Ala−Leu,Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Ly
s−Pro,Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp,Gly−Phe−Leu
−Gly−Ser,Gly−Phe−Leu−Gly−Ser−Leu−Lys−Pro
又はGly−Phe−Leu−Gly,R3はAla−Ala−Gln−Thr−Ala
−Arg−Gln−His−Pro−Lys−Met−His−Leu−Ala−His
−Ser−Thr−Leuで示されるペプチド又はその一部を示
し、ｍが０又は１、ｎは０又は１を示す。〕 上記式中、R1は抗体結合用官能基を有したアミノ酸残
基もしくはペプチド鎖であり、R2はリソゾーム感受性の
リンカーペプチド鎖であり、R3はＮ端欠損LTのＮ末端部
であり、 で表わされるLTのNo.10−No.27のアミノ酸の全部もしく
は一部である。
又本発明は、上記のポリペプチドをコードする塩基配
列を含むポリデオキシリボ核酸およびこれに相補的な配
列を含むポリデオキシリボ核酸を包含する。
列を含むポリデオキシリボ核酸およびこれに相補的な配
列を含むポリデオキシリボ核酸を包含する。
本発明は形質転換された微生物又は細胞中で上記のア
ミノ酸配列を含むポリペプチドを発現しうる複製可能な
組み換えDNAに係る。このような組み換えDNAとしては、
例えばpTB773、pTB775、pTB858、pTB860、pTB864、pTB1
004、pTB1005、pTB1006、pTB1007などが挙げられる。
ミノ酸配列を含むポリペプチドを発現しうる複製可能な
組み換えDNAに係る。このような組み換えDNAとしては、
例えばpTB773、pTB775、pTB858、pTB860、pTB864、pTB1
004、pTB1005、pTB1006、pTB1007などが挙げられる。
更に本発明は上記LTのアミノ酸配列を示すポリペプチ
ドを発現しうる複製可能な組み換えDNAで形質転換され
た微生物又は細胞に係る。このような微生物又は細胞と
して、大腸菌、枯草菌、酵母、高等動物細胞が挙げられ
る。
ドを発現しうる複製可能な組み換えDNAで形質転換され
た微生物又は細胞に係る。このような微生物又は細胞と
して、大腸菌、枯草菌、酵母、高等動物細胞が挙げられ
る。
更に本発明は、新規LTムテイン遺伝子をコードする遺
伝子を、微生物又は細胞中で発現させることからなるLT
の製造方法に係る。詳しくは、複製可能な組み換えDNA
で形質転換された微生物又は細胞を増殖させ、該ペプチ
ドを効率良く回収することからなる該ポリペプチドの製
造方法に係る。
伝子を、微生物又は細胞中で発現させることからなるLT
の製造方法に係る。詳しくは、複製可能な組み換えDNA
で形質転換された微生物又は細胞を増殖させ、該ペプチ
ドを効率良く回収することからなる該ポリペプチドの製
造方法に係る。
本発明の新規LTムテインをコードするDNAは、例えば
下記の方法により調製できる。
下記の方法により調製できる。
1. 12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−アセテ
ート（TPA）およびコンカナバリンＡ（ConA）でLT合成
を誘導させたヒト抹消リンパ球より公知の方法でｍ−RN
Aを採取することができ、さらにそれから約５×105個の
cDNAライブラリーを作製することができる。
ート（TPA）およびコンカナバリンＡ（ConA）でLT合成
を誘導させたヒト抹消リンパ球より公知の方法でｍ−RN
Aを採取することができ、さらにそれから約５×105個の
cDNAライブラリーを作製することができる。
2. LTの部分ペプチド鎖をコードする通常10−merから5
0−merのオリゴヌクレオチドを合成しプローブとして使
用し、LT cDNAのスクリーニングを実施する。例えばＣ
末端側18−mer（TCCAAAGAAGACAGTACT）の合成ヌクレオ
チドを使用した時、約50個のクローンを得ることができ
る。
0−merのオリゴヌクレオチドを合成しプローブとして使
用し、LT cDNAのスクリーニングを実施する。例えばＣ
末端側18−mer（TCCAAAGAAGACAGTACT）の合成ヌクレオ
チドを使用した時、約50個のクローンを得ることができ
る。
3. 得られたLT cDNAクローンからプラスミドを単離し
塩基配列を決定する。既報のLTのアミノ酸配列をコード
するプラスミドを選択し、これを適当な制限酵素で切断
し、適宜発現ベクターに導入して、そのDNAを含む組み
換えDNAを作製することができる。
塩基配列を決定する。既報のLTのアミノ酸配列をコード
するプラスミドを選択し、これを適当な制限酵素で切断
し、適宜発現ベクターに導入して、そのDNAを含む組み
換えDNAを作製することができる。
4. 3.で調製されたベクターを使用して各種宿主、例え
ば大腸菌を形質転換し、LTをコードするDNAを保持する
菌株を得ることができる。
ば大腸菌を形質転換し、LTをコードするDNAを保持する
菌株を得ることができる。
5. 4.で形質転換体を培養しプラスミドを単離したの
ち、以下のようにして新規LTムテインをコードするDNA
を調製できる。
ち、以下のようにして新規LTムテインをコードするDNA
を調製できる。
ヒトLT遺伝子の場合には、Ｎ末端側より20−21番目
のメチオニン−ヒスチジンをコードする領域に制限酵素
Nsi I認識部位が存在する。そこでLT遺伝子をNsi Iで切
断することにより、Ｎ末端LTをコードするDNA断片を得
ることができる。この断片に、下記のアダプター配列
と、抗体結合用アミノ酸もしくはペプチドおよびリンカ
ーペプチドを含むアミノ酸配列をコードするDNAとを結
合させ、該新規LTムテインをコードするDNAを作製し、
適当なベクターに挿入する。
のメチオニン−ヒスチジンをコードする領域に制限酵素
Nsi I認識部位が存在する。そこでLT遺伝子をNsi Iで切
断することにより、Ｎ末端LTをコードするDNA断片を得
ることができる。この断片に、下記のアダプター配列
と、抗体結合用アミノ酸もしくはペプチドおよびリンカ
ーペプチドを含むアミノ酸配列をコードするDNAとを結
合させ、該新規LTムテインをコードするDNAを作製し、
適当なベクターに挿入する。
同様にヒトLT遺伝子の場合には、Ｎ末端側より９−
10番目のセリン−アラニンをコードする領域に制限酵素
Pvu II認識部位が存在する。そこでLT遺伝子をPvu IIで
切断し、Ｎ末端欠損LTをコードするDNA断片を得ること
ができる。この断片に、のアダプター配列と、抗体結
合用アミノ酸もしくはペプチドおよびリンカーペプチド
を含むアミノ酸配列をコードするDNAとを結合させ、該
新規LTムテインををコードするDNAを作製し、適当なベ
クターを挿入する。
10番目のセリン−アラニンをコードする領域に制限酵素
Pvu II認識部位が存在する。そこでLT遺伝子をPvu IIで
切断し、Ｎ末端欠損LTをコードするDNA断片を得ること
ができる。この断片に、のアダプター配列と、抗体結
合用アミノ酸もしくはペプチドおよびリンカーペプチド
を含むアミノ酸配列をコードするDNAとを結合させ、該
新規LTムテインををコードするDNAを作製し、適当なベ
クターを挿入する。
Pvu IIもしくはNsi I切断後のＮ末端欠損LTをコー
ドするDNA断片をさらにエキソヌクレアーゼ、例えばヌ
クレアーゼBAL31で１−18個のアミノ酸をコードする領
域を除去し、これにのアダプター配列と、抗体結合用
アミノ酸もしくはペプチドおよびリンカーペプチドを含
むアミノ酸配列をコードするDNAとを結合させた。その
中で遺伝子の読み枠が正しく保たれているものを選び出
すことにより、LT（ｘ−171）,x＝10〜28のＮ末端部に
抗体結合用アミノ酸もしくはペプチドおよびリンカーペ
プチドを結合した形の新規LTムテインをコードするDNA
を調製することができる。
ドするDNA断片をさらにエキソヌクレアーゼ、例えばヌ
クレアーゼBAL31で１−18個のアミノ酸をコードする領
域を除去し、これにのアダプター配列と、抗体結合用
アミノ酸もしくはペプチドおよびリンカーペプチドを含
むアミノ酸配列をコードするDNAとを結合させた。その
中で遺伝子の読み枠が正しく保たれているものを選び出
すことにより、LT（ｘ−171）,x＝10〜28のＮ末端部に
抗体結合用アミノ酸もしくはペプチドおよびリンカーペ
プチドを結合した形の新規LTムテインをコードするDNA
を調製することができる。
また特定部位指向性変異（site−directed mutagen
esis）〔Smith,M.and Gillam,S,「ジェネティック エ
ンジニアリング（Genetic Engineering）」，３,1（198
1）〕の手法を応用することもできる。すなわちPvu II
切断後のＮ末端欠損LTをコードするDNA断片をベクターM
13に挿入し、これを大腸菌JM103（Pharmacia P−L Bioc
hemicals）に感染させる。成育後、ブロス中に放出され
たM13ファージをポリエチエングリコールで沈殿させ、
ついでフェノール処理によってM13ファージ１本鎖DNAを
得ることができる。
esis）〔Smith,M.and Gillam,S,「ジェネティック エ
ンジニアリング（Genetic Engineering）」，３,1（198
1）〕の手法を応用することもできる。すなわちPvu II
切断後のＮ末端欠損LTをコードするDNA断片をベクターM
13に挿入し、これを大腸菌JM103（Pharmacia P−L Bioc
hemicals）に感染させる。成育後、ブロス中に放出され
たM13ファージをポリエチエングリコールで沈殿させ、
ついでフェノール処理によってM13ファージ１本鎖DNAを
得ることができる。
次にLTのＮ末端側10番目のアラニンから27番目のロイ
シンまでのペプチド鎖内の一部のアミノ鎖またはペプチ
ドを欠損し、かつそのＮ末端部に抗体結合用アミノ酸も
しくはペプチド、およびリンカーペプチドを有するポリ
ペプチドをコードするDNAを化学合成によって作製しプ
ライマーとして使用できる。このプライマーと先に調製
したM13ファージDNAとを混合し、DNAポリメラーゼＩラ
ージ・フラグメントの作用によって２本鎖にしたのち、
T4DNAリガーゼの作用によって環状化することができ
る。この環状DNAを大腸菌JM103に導入し、放出されてく
るM13ファージDNAをフィルターに転移させたのち、32P
で標識した該合成プライマーを用いてプラーク・ハイブ
リダイゼイション〔Maniatis,T.ら「モレキュラー ク
ローニング，ア ラボラトリィー・マニュアル（Molecu
lar Cloning,A Laboratory Mannual）」,Cold Spring H
arbor Laboratory,P.312（1982）〕を行う。強いシグナ
ルが検出されたファージからDNAを調製し、適当な制限
酵素で切り出し、このDNA断片をプラスミドに組み込む
ことにより修飾された新規LTムテインをコードするDNA
が得られる。
シンまでのペプチド鎖内の一部のアミノ鎖またはペプチ
ドを欠損し、かつそのＮ末端部に抗体結合用アミノ酸も
しくはペプチド、およびリンカーペプチドを有するポリ
ペプチドをコードするDNAを化学合成によって作製しプ
ライマーとして使用できる。このプライマーと先に調製
したM13ファージDNAとを混合し、DNAポリメラーゼＩラ
ージ・フラグメントの作用によって２本鎖にしたのち、
T4DNAリガーゼの作用によって環状化することができ
る。この環状DNAを大腸菌JM103に導入し、放出されてく
るM13ファージDNAをフィルターに転移させたのち、32P
で標識した該合成プライマーを用いてプラーク・ハイブ
リダイゼイション〔Maniatis,T.ら「モレキュラー ク
ローニング，ア ラボラトリィー・マニュアル（Molecu
lar Cloning,A Laboratory Mannual）」,Cold Spring H
arbor Laboratory,P.312（1982）〕を行う。強いシグナ
ルが検出されたファージからDNAを調製し、適当な制限
酵素で切り出し、このDNA断片をプラスミドに組み込む
ことにより修飾された新規LTムテインをコードするDNA
が得られる。
ヒトLT遺伝子の全体または一部を含むプラスミドDN
A、コスミドDNA、ファージDNAなどを特定部位指向性変
異のための鋳型DNAとして用いることができる。M13ファ
ージやφX174ファージは、１本鎖DNAが容易に調製でき
るので、鋳型DNAとしてより望ましい。例えばM13ファー
ジやφX174ファージにヒトLT遺伝子の全体または一部が
組み込まれたものを使用する時は、ブロス中に存在する
ファージ粒子をポリエチレングリコールで沈殿させ、フ
ェノール処理で除蛋白を行い、ついでエタノール沈殿を
行いファージ粒子内にあった１本鎖DNAを得ることがで
きる。また鋳型DNAとしてヒトLT遺伝子の全体または一
部が組み込まれた２本鎖のプラスミドDNAやコスミド D
NAを用いる時は、２本鎖DNAを100℃で１分から10分、望
ましくは３分から５分熱処理した後、氷水で急冷し１本
鎖DNAに変性させて使用することができる。
A、コスミドDNA、ファージDNAなどを特定部位指向性変
異のための鋳型DNAとして用いることができる。M13ファ
ージやφX174ファージは、１本鎖DNAが容易に調製でき
るので、鋳型DNAとしてより望ましい。例えばM13ファー
ジやφX174ファージにヒトLT遺伝子の全体または一部が
組み込まれたものを使用する時は、ブロス中に存在する
ファージ粒子をポリエチレングリコールで沈殿させ、フ
ェノール処理で除蛋白を行い、ついでエタノール沈殿を
行いファージ粒子内にあった１本鎖DNAを得ることがで
きる。また鋳型DNAとしてヒトLT遺伝子の全体または一
部が組み込まれた２本鎖のプラスミドDNAやコスミド D
NAを用いる時は、２本鎖DNAを100℃で１分から10分、望
ましくは３分から５分熱処理した後、氷水で急冷し１本
鎖DNAに変性させて使用することができる。
特定部位指向性変異のためのプライマーは、変換しよ
うとするDNA配列を持ち、鋳型DNAとハイブリダイズして
DNA合成時のプライマーとして機能しうるものであれ
ば、どのようなDNA配列のものでもよい。またプライマ
ーの作製は、どのような方法でもよいが、化学合成で適
当な配列の１本鎖DNAを作ることが望ましい。このよう
なプライマーと先に調製した１本鎖DNAとを混合し、DNA
ポリメラーゼＩラージ・フラグメントの作用によって２
本鎖DNAに修復した後、T4DNAリガーゼの作用によって環
状化することができる。この環状DNAを大腸菌に導入し
た後、ラジオアイソトープで標識したプライマーをプロ
ーブに用いて、プラーク・ハイブリダイゼイション〔Ma
niatis,T.ら「モレキュラー クローニング，ア ラボ
ラトリィー・マニュアル（Molecular Cloning,A Labora
tory Mannual）」,Cold Spring Harbor Laboratory,P.3
12（1982）〕や、コロニー・ハイブリダイゼイション
〔同P.326〕を行い、目的とする変異体を選び出すこと
ができる。このようにして得られたプラークやコロニー
からファージDNAやプラスミドDNAを調製し、該DNAを用
いて新規LTムテイン遺伝子を調製することができる。
うとするDNA配列を持ち、鋳型DNAとハイブリダイズして
DNA合成時のプライマーとして機能しうるものであれ
ば、どのようなDNA配列のものでもよい。またプライマ
ーの作製は、どのような方法でもよいが、化学合成で適
当な配列の１本鎖DNAを作ることが望ましい。このよう
なプライマーと先に調製した１本鎖DNAとを混合し、DNA
ポリメラーゼＩラージ・フラグメントの作用によって２
本鎖DNAに修復した後、T4DNAリガーゼの作用によって環
状化することができる。この環状DNAを大腸菌に導入し
た後、ラジオアイソトープで標識したプライマーをプロ
ーブに用いて、プラーク・ハイブリダイゼイション〔Ma
niatis,T.ら「モレキュラー クローニング，ア ラボ
ラトリィー・マニュアル（Molecular Cloning,A Labora
tory Mannual）」,Cold Spring Harbor Laboratory,P.3
12（1982）〕や、コロニー・ハイブリダイゼイション
〔同P.326〕を行い、目的とする変異体を選び出すこと
ができる。このようにして得られたプラークやコロニー
からファージDNAやプラスミドDNAを調製し、該DNAを用
いて新規LTムテイン遺伝子を調製することができる。
このようにして得られる新規LTムテインをコードする
DNAを各種宿主（例、大腸菌，枯草菌，酵母，動物細
胞）で機能するプロモーター領域の３′末端に挿入する
ことにより、新規LTムテインをコードするDNAを発現さ
せうる組み換えDNAを構築することができる。
DNAを各種宿主（例、大腸菌，枯草菌，酵母，動物細
胞）で機能するプロモーター領域の３′末端に挿入する
ことにより、新規LTムテインをコードするDNAを発現さ
せうる組み換えDNAを構築することができる。
プロモーター領域は、RNAポリメラーゼが結合するこ
とによってmRNA合成を開始させるのに必要な部位を含む
領域であれば、いかなるものであってもよい。
とによってmRNA合成を開始させるのに必要な部位を含む
領域であれば、いかなるものであってもよい。
たとえば大腸菌を宿主として用いる場合、新規LTムテ
インをコードするDNAを大腸菌で機能しうるプロモータ
ー領域の３′末端に挿入すれば、新規LTムテインをコー
ドするDNAを発現しうる組み換えDNAが構築できる。また
このように大腸菌を宿主とする場合のベクターとしてpB
R322,pBR325,ptrp 781,pUC8,pUC9,pUC19,pJB8などが用
いられ、これに新規LTムテインをコードするDNAをT4DNA
リガーゼの作用により挿入する。この反応液を用いて、
大腸菌（例、C 600株,MM 294株,DH1株,W3110株,RR1株,P
R13株など）を公知の方法〔Cohen,S.N.ら，「プロシー
ジング オブ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A）」69,2110（197
2）〕もしくはそれに準ずる方法によって形質転換す
る。
インをコードするDNAを大腸菌で機能しうるプロモータ
ー領域の３′末端に挿入すれば、新規LTムテインをコー
ドするDNAを発現しうる組み換えDNAが構築できる。また
このように大腸菌を宿主とする場合のベクターとしてpB
R322,pBR325,ptrp 781,pUC8,pUC9,pUC19,pJB8などが用
いられ、これに新規LTムテインをコードするDNAをT4DNA
リガーゼの作用により挿入する。この反応液を用いて、
大腸菌（例、C 600株,MM 294株,DH1株,W3110株,RR1株,P
R13株など）を公知の方法〔Cohen,S.N.ら，「プロシー
ジング オブ ナショナル アカデミー オブ サイエ
ンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A）」69,2110（197
2）〕もしくはそれに準ずる方法によって形質転換す
る。
使用するプロモーターは、trpプロモーター（trp−
ｐ）に限定する必要はなく、たとえばrecAプロモーター
〔特開昭59−65099号〕,lacプロモーター，λPLプロモ
ーターなどを使用してもよい。
ｐ）に限定する必要はなく、たとえばrecAプロモーター
〔特開昭59−65099号〕,lacプロモーター，λPLプロモ
ーターなどを使用してもよい。
上記のようにして得られた新規LTムテインをコードす
るDNAを含む新規な組み換えプラスミドDNAを保持する形
質転換体は、たとえばアンピシリン耐性、テトラサイク
リン耐性あるいはこれら両薬剤耐性を表現形として選ぶ
ことができる。
るDNAを含む新規な組み換えプラスミドDNAを保持する形
質転換体は、たとえばアンピシリン耐性、テトラサイク
リン耐性あるいはこれら両薬剤耐性を表現形として選ぶ
ことができる。
上記の形質転換体をそれ自体公知の培地で培養する。
培地としては、例えばＬブロス，ペナセイ（Penassay）
ブロスおよびグルコース，カガミノ酸を含むＭ−９培地
〔Miller,J.,「エクスペリメンツ イン モレキュラー
ジェネティクス（Experiments in Molecular Genetic
s）」,431−433（Cold Spring Harbor Laboratory,New
York,1972）〕が挙げられる。ここに、必要によりプロ
モーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−イ
ンドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができ
る。
培地としては、例えばＬブロス，ペナセイ（Penassay）
ブロスおよびグルコース，カガミノ酸を含むＭ−９培地
〔Miller,J.,「エクスペリメンツ イン モレキュラー
ジェネティクス（Experiments in Molecular Genetic
s）」,431−433（Cold Spring Harbor Laboratory,New
York,1972）〕が挙げられる。ここに、必要によりプロ
モーターを効率よく働かせるために、たとえば３β−イ
ンドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができ
る。
該形質転換体の培養は通常15〜43℃，好ましくは28〜
40℃で２〜24時間，好ましくは４〜16時間行い、必要に
より通気や攪拌を加えることもできる。
40℃で２〜24時間，好ましくは４〜16時間行い、必要に
より通気や攪拌を加えることもできる。
宿主として、たとえば、動物細胞を使用する場合にお
いては動物細胞で機能しうるプロモーター（例、SV40プ
ロモーター）の領域の３′末端に新規LTムテインをコー
ドするDNAを挿入し、自体公知の方法により、該組み換
えDNAで宿主を形質転換させ、形質転換体を培養するこ
とにより、新規LTムテインを製造することができる。
いては動物細胞で機能しうるプロモーター（例、SV40プ
ロモーター）の領域の３′末端に新規LTムテインをコー
ドするDNAを挿入し、自体公知の方法により、該組み換
えDNAで宿主を形質転換させ、形質転換体を培養するこ
とにより、新規LTムテインを製造することができる。
宿主として、たとえば枯草菌または酵母を使用する場
合においては枯草菌または酵母で機能し得るプロモータ
ー領域の３′末端に新規LTムテインをコードするDNAを
挿入し、自体公知の方法により、該組み換えDNAで宿主
を形質転換させ、形質転換体を培養することにより、新
規LTムテインを製造することができる。
合においては枯草菌または酵母で機能し得るプロモータ
ー領域の３′末端に新規LTムテインをコードするDNAを
挿入し、自体公知の方法により、該組み換えDNAで宿主
を形質転換させ、形質転換体を培養することにより、新
規LTムテインを製造することができる。
上記の宿主のなかでも、大腸菌がより好ましい。
培養後、公知の方法で菌体を集め、大腸菌の形質転換
体の場合には菌体を適当な緩衝液、例えばトリス−塩酸
緩衝液（pH7.5）に懸濁し、超音波処理、リゾチームお
よび／または凍結融解によって菌体を破壊したのち、遠
心分離により新規LTムテインを含む上澄液を得る方法な
どが適宜用い得る。好ましくは、菌体を集めて緩衝液に
懸濁しリゾチームを加えて０〜10℃で10分〜３時間イン
キュベートし、０〜10℃で30秒〜５分間超音波処理後、
遠心分離して上澄を得る方法が用いられる。
体の場合には菌体を適当な緩衝液、例えばトリス−塩酸
緩衝液（pH7.5）に懸濁し、超音波処理、リゾチームお
よび／または凍結融解によって菌体を破壊したのち、遠
心分離により新規LTムテインを含む上澄液を得る方法な
どが適宜用い得る。好ましくは、菌体を集めて緩衝液に
懸濁しリゾチームを加えて０〜10℃で10分〜３時間イン
キュベートし、０〜10℃で30秒〜５分間超音波処理後、
遠心分離して上澄を得る方法が用いられる。
抽出液からの新規LTムテインの分離、精製はたとえば
ゲルろ過、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフ
ィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、超遠心、
ヒトLT抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーに
より実施できる。
ゲルろ過、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフ
ィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、超遠心、
ヒトLT抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーに
より実施できる。
上記発明の新規LTムテインのＮ末端部に含まれる抗体
結合用官能基を有したアミノ酸もしくはペプチドとして
は、Cys,Lys,Ser,Cys−SerあるいはLys−Serなどが用い
られる。CysおよびCys−Serの場合には、含有されるス
ルフヒドリル基を介して抗体に結合される。特にヒトLT
の場合には、その分子中にCysを含まないので、きわめ
て特異的にLTの非活性部位であるＮ末端部を介して抗体
に結合させうる。LysおよびLys−Serの場合には、含有
されるα−およびε−アミノ基を介して抗体に結合させ
うる。またSer,Cys−SerおよびLys−Serの場合には、含
有される水酸基を通じて抗体に結合させうる。
結合用官能基を有したアミノ酸もしくはペプチドとして
は、Cys,Lys,Ser,Cys−SerあるいはLys−Serなどが用い
られる。CysおよびCys−Serの場合には、含有されるス
ルフヒドリル基を介して抗体に結合される。特にヒトLT
の場合には、その分子中にCysを含まないので、きわめ
て特異的にLTの非活性部位であるＮ末端部を介して抗体
に結合させうる。LysおよびLys−Serの場合には、含有
されるα−およびε−アミノ基を介して抗体に結合させ
うる。またSer,Cys−SerおよびLys−Serの場合には、含
有される水酸基を通じて抗体に結合させうる。
これらの抗体とヒトLTの結合においては公知の種々の
方法が用いられるが〔V.P.Butler:ファーマコロジカル
・レビュー（Pharmacol.Rev.），29,103（1978），北川
常広：有機合成化学，42,283（1984）〕、例えば、抗
癌抗体をＮ−サクシミジル・ピリジル・ジチオプロピオ
ネート（以下、SPDPと略す）で修飾後、本発明のＮ末端
にCysを含有するLTムテインに添加しチオール交換反応
で複合体を作成する、抗癌抗体をＮ−（γ−マレイミ
ド・ブチリロキシ）−スクシイミド（以下、GMBSと略
す）でマレイミド化後、本発明のＮ末端にCysを含有す
るLTムテインに添加しチオエーテル結合で複合体を作成
する、Ｎ末端にLysを含有するLTムテインについてはS
PDPで修飾後に還元し、マレイミド化抗癌抗体に添加し
チオエーテル結合で複合体を作成する、同じくＮ末端
にLysを含有するLTムテインをSPDPで修飾・還元し、SPD
Pで修飾した抗癌抗体に添加しチオール交換反応で複合
体を作成する、などが考えられる。これらの方法におい
て、抗癌抗体IgGの代わりに抗体フラグメントＦ（a
b′）２、Fab′あるいはFabを用いることも可能であ
る。また抗癌抗体とLTムテインの処理を全く相互に逆に
して複合体を作成することも可能である。
方法が用いられるが〔V.P.Butler:ファーマコロジカル
・レビュー（Pharmacol.Rev.），29,103（1978），北川
常広：有機合成化学，42,283（1984）〕、例えば、抗
癌抗体をＮ−サクシミジル・ピリジル・ジチオプロピオ
ネート（以下、SPDPと略す）で修飾後、本発明のＮ末端
にCysを含有するLTムテインに添加しチオール交換反応
で複合体を作成する、抗癌抗体をＮ−（γ−マレイミ
ド・ブチリロキシ）−スクシイミド（以下、GMBSと略
す）でマレイミド化後、本発明のＮ末端にCysを含有す
るLTムテインに添加しチオエーテル結合で複合体を作成
する、Ｎ末端にLysを含有するLTムテインについてはS
PDPで修飾後に還元し、マレイミド化抗癌抗体に添加し
チオエーテル結合で複合体を作成する、同じくＮ末端
にLysを含有するLTムテインをSPDPで修飾・還元し、SPD
Pで修飾した抗癌抗体に添加しチオール交換反応で複合
体を作成する、などが考えられる。これらの方法におい
て、抗癌抗体IgGの代わりに抗体フラグメントＦ（a
b′）２、Fab′あるいはFabを用いることも可能であ
る。また抗癌抗体とLTムテインの処理を全く相互に逆に
して複合体を作成することも可能である。
次に本発明の新規LTムテインのＮ端部に含まれるリソ
ゾール酵素感受性のリンカーペプチドとしては、Ala−L
eu−Ala,Leu−Ala−Leu,Leu−Ala−Leu−Thr,Ala−Leu
−Ala−Leu,Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Pro
およびGly−Phe−Leu−Glyなどが用いられるが、公知の
リソゾーム酵素感受性のペプチド鎖であればいずれでも
よい。とりわけ上記のAla−Leu−Ala,Leu−Ala−Leu,Al
a−Leu−Ala−Leu,又はGly−Phe−Leu−Glyを含むリン
カーは、細胞内に取り込まれたのちの薬物への遊離に効
果的で好ましく用いられる〔HB.Rihova et al.:クリニ
カル・イムノロジー・アンド・イムノパソロジー（Cli
n.Immunol.Immunopathol.），46,100（1988）,A.Trouet
et al.:プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acod.Sci.U.S.
A），79,626（1982）〕。
ゾール酵素感受性のリンカーペプチドとしては、Ala−L
eu−Ala,Leu−Ala−Leu,Leu−Ala−Leu−Thr,Ala−Leu
−Ala−Leu,Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Pro
およびGly−Phe−Leu−Glyなどが用いられるが、公知の
リソゾーム酵素感受性のペプチド鎖であればいずれでも
よい。とりわけ上記のAla−Leu−Ala,Leu−Ala−Leu,Al
a−Leu−Ala−Leu,又はGly−Phe−Leu−Glyを含むリン
カーは、細胞内に取り込まれたのちの薬物への遊離に効
果的で好ましく用いられる〔HB.Rihova et al.:クリニ
カル・イムノロジー・アンド・イムノパソロジー（Cli
n.Immunol.Immunopathol.），46,100（1988）,A.Trouet
et al.:プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acod.Sci.U.S.
A），79,626（1982）〕。
以上により、本発明者が新規LTムテインの遺伝子を取
得し、この遺伝子を用いる新規LTムテインの製造方法が
示されたが、本発明は以上に限定されるものではない。
得し、この遺伝子を用いる新規LTムテインの製造方法が
示されたが、本発明は以上に限定されるものではない。
本発明において各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗
号）の使用頻度が異なる等の理由により、アミノ酸配列
を変えることなく塩基配列の一部又は全部を有機化学的
に合成された人工のDNAに置き換えることも可能であ
る。
号）の使用頻度が異なる等の理由により、アミノ酸配列
を変えることなく塩基配列の一部又は全部を有機化学的
に合成された人工のDNAに置き換えることも可能であ
る。
本発明の新規LTムテインは、活性に関与しないＮ末端
部に抗体との結合に用いうるアミノ酸もしくはペプチド
を有し、さらにその配列に続いてリソゾーム酵素感受性
リンカーペプチドを含む。従って、抗癌抗体との結合に
際して、LT本来の生物活性を損なうことなく免疫複合体
を形成することが可能で、しかも腫瘍細胞に取り込まれ
たのちには、細胞内リソゾーム酵素の影響でLT分子が抗
体より遊離し有効にその細胞毒性を発揮することが期待
される。これらの特性は腫瘍選択的な抗癌剤の作成にき
わめて有利であり、LTの作用増強・副作用の軽減に効果
的である。
部に抗体との結合に用いうるアミノ酸もしくはペプチド
を有し、さらにその配列に続いてリソゾーム酵素感受性
リンカーペプチドを含む。従って、抗癌抗体との結合に
際して、LT本来の生物活性を損なうことなく免疫複合体
を形成することが可能で、しかも腫瘍細胞に取り込まれ
たのちには、細胞内リソゾーム酵素の影響でLT分子が抗
体より遊離し有効にその細胞毒性を発揮することが期待
される。これらの特性は腫瘍選択的な抗癌剤の作成にき
わめて有利であり、LTの作用増強・副作用の軽減に効果
的である。
以下に参考例・実施例により本発明を具体的に説明す
るが、これらが本発明の範囲を制限するものでないこと
はいうまでもない。
るが、これらが本発明の範囲を制限するものでないこと
はいうまでもない。
本発明の実施にあたり組み換えDNAの作製、組み換え
体の微生物への導入は特に断わらない限り下記の実験書
に従って実施した。
体の微生物への導入は特に断わらない限り下記の実験書
に従って実施した。
（１）T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook,「モレキュ
ラー クローニング（Molecular Cloning）」,Cold Spr
ing Harbor Laboratory刊（米国） （２）高木康敬 編著、「遺伝子操作実験法」、講談社
刊 参考例 1. L929細胞傷害活性評価 LTの細胞毒性能はL929細胞を用いて〔ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（J.Immunol.）,126巻（1981年）235
頁〕あるいは〔ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メ
ソッズ（J.Immunol.Methods）,70巻（1984年）257頁〕
の方法に準じて測定した。即ち、96穴の組織培養用マイ
クロプレート（フローラボラトリー社）を用いて10％の
ウシ胎児血清（FCS）を含むRPMI 1640培地で２倍階段希
釈した試料50μにマイトマイシンC 4μg/mを含む上
記培地に懸濁した４×105個/mの濃度のL929細胞50μ
を添加し５％炭酸ガス中37℃,48時間培養した。培養
終了後ジメチルチアゾイル・ジフェニルテトラゾリウム
臭酸塩（MTT）を用いて生細胞を染色し10％SDS−0.01N
HClで溶解後590nmにおける吸光度をタイターテック・マ
ルチスキャン（フローラボラトリー社）で測定した。得
られた吸光度は生細胞数に比例する。L929細胞の50％を
殺すために必要な生物活性量を１ユニット/mと定義し
試料の生物活性をユニット/mで表した。
ラー クローニング（Molecular Cloning）」,Cold Spr
ing Harbor Laboratory刊（米国） （２）高木康敬 編著、「遺伝子操作実験法」、講談社
刊 参考例 1. L929細胞傷害活性評価 LTの細胞毒性能はL929細胞を用いて〔ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（J.Immunol.）,126巻（1981年）235
頁〕あるいは〔ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メ
ソッズ（J.Immunol.Methods）,70巻（1984年）257頁〕
の方法に準じて測定した。即ち、96穴の組織培養用マイ
クロプレート（フローラボラトリー社）を用いて10％の
ウシ胎児血清（FCS）を含むRPMI 1640培地で２倍階段希
釈した試料50μにマイトマイシンC 4μg/mを含む上
記培地に懸濁した４×105個/mの濃度のL929細胞50μ
を添加し５％炭酸ガス中37℃,48時間培養した。培養
終了後ジメチルチアゾイル・ジフェニルテトラゾリウム
臭酸塩（MTT）を用いて生細胞を染色し10％SDS−0.01N
HClで溶解後590nmにおける吸光度をタイターテック・マ
ルチスキャン（フローラボラトリー社）で測定した。得
られた吸光度は生細胞数に比例する。L929細胞の50％を
殺すために必要な生物活性量を１ユニット/mと定義し
試料の生物活性をユニット/mで表した。
参考例 2.形質転換用大腸菌株の作製 大腸菌DH1株のコロニーをSOB培地〔実験書（１）69
頁〕を用いて550nMの吸光度が0.5になるまで培養した。
該培養30mを集め、12mの0.1M RbCl−10mM CaCl2−5
0mM MnCl2−15％グリセロールを含む0.2M酢酸緩衝液（p
H5.8）に懸濁し５分間氷冷後遠心し、次いで10mM RbCl
−75mM CaCl2−15％グリセロールを含む10mM MOPS緩衝
液（pH6.5）に再懸濁した。15分間氷冷後ドライアイス
−エタノールで急冷凍結後−70℃で保存した。
頁〕を用いて550nMの吸光度が0.5になるまで培養した。
該培養30mを集め、12mの0.1M RbCl−10mM CaCl2−5
0mM MnCl2−15％グリセロールを含む0.2M酢酸緩衝液（p
H5.8）に懸濁し５分間氷冷後遠心し、次いで10mM RbCl
−75mM CaCl2−15％グリセロールを含む10mM MOPS緩衝
液（pH6.5）に再懸濁した。15分間氷冷後ドライアイス
−エタノールで急冷凍結後−70℃で保存した。
参考例 3.形質転換用大腸菌株の作製 DH1,C600,MM 294の各種大腸菌株のコロニーをSOB培地
10mを用いて550nmの吸光度が0.3になるまで培養し
た。氷冷後遠心分離し得られた菌体を5mの10mM NaCl
で洗浄した。菌体を5mの50mM CaCl2に再懸濁し氷冷下
15分間放置した。遠心分離後、0.5mの50mM CaCl2に懸
濁し直ちに使用した。
10mを用いて550nmの吸光度が0.3になるまで培養し
た。氷冷後遠心分離し得られた菌体を5mの10mM NaCl
で洗浄した。菌体を5mの50mM CaCl2に再懸濁し氷冷下
15分間放置した。遠心分離後、0.5mの50mM CaCl2に懸
濁し直ちに使用した。
実施例1. ヒトリンパ球由来mRNAを用いたcDNAライブラリーの作製 ヒト抹消血より調製したリンパ球をTPA（15ng/m）
とConA（40μg/m）とを含むRPMI 1640培地（10％FCS
を含む）中、37℃で培養し、LTを誘導させた。24時間
後、この誘導した１×1010個のヒトリンパ球を5Mグアニ
ジンチオシアネート、５％メルカプトエタノール、50mM
Tris・HCl pH7.6,10mM EDTA溶液中でテフロンホモゲナ
イザーによって破壊変性した後Ｎ−ラウロイルザルコシ
ン酸ナトリウムを４％になるように加え、均質化した混
合物を5.7M塩化セシウム溶液（5.7M塩化セシウム、0.1M
EDTA）6m上に重層し、ベックマンSW28のローターを
用いて15℃で24,000rpm48時間遠心処理を行い、RNA沈殿
を得た。このRNA沈殿を0.25％Ｎ−ラウロイルザルコシ
ン酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈殿さ
せ、10mgのRNAを得た。このRNAを高塩溶液（0.5M NaCl,
10mM Tris・HCl pH 7.6,1mM EDTA,0.3％SDS）中でオリ
ゴ（dT）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（Ａ）を含
むmRNAを低塩溶液（10mM Tris−HCl・pH 7.6,1mM EDTA
0.3％ SDS）で溶出させることにより、ポリ（Ａ）を含
むmRNA 300μｇを分取した。
とConA（40μg/m）とを含むRPMI 1640培地（10％FCS
を含む）中、37℃で培養し、LTを誘導させた。24時間
後、この誘導した１×1010個のヒトリンパ球を5Mグアニ
ジンチオシアネート、５％メルカプトエタノール、50mM
Tris・HCl pH7.6,10mM EDTA溶液中でテフロンホモゲナ
イザーによって破壊変性した後Ｎ−ラウロイルザルコシ
ン酸ナトリウムを４％になるように加え、均質化した混
合物を5.7M塩化セシウム溶液（5.7M塩化セシウム、0.1M
EDTA）6m上に重層し、ベックマンSW28のローターを
用いて15℃で24,000rpm48時間遠心処理を行い、RNA沈殿
を得た。このRNA沈殿を0.25％Ｎ−ラウロイルザルコシ
ン酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで沈殿さ
せ、10mgのRNAを得た。このRNAを高塩溶液（0.5M NaCl,
10mM Tris・HCl pH 7.6,1mM EDTA,0.3％SDS）中でオリ
ゴ（dT）セルロースカラムに吸着させ、ポリ（Ａ）を含
むmRNAを低塩溶液（10mM Tris−HCl・pH 7.6,1mM EDTA
0.3％ SDS）で溶出させることにより、ポリ（Ａ）を含
むmRNA 300μｇを分取した。
このmRNAをさらにエタノールで沈殿させ、0.2mの溶
液（10mM Tris・HCl pH 7.6,2mM EDTA 0.3％ SDS）に溶
かし、65℃で２分間処理して10−35％ショ糖密度勾配遠
心処理（ベックマンSW28のローターを用いて20℃,25,00
0で21時間遠心分離）することにより分画した。この各
分画につきNRAの一部づつを、アフリカツメガエルの卵
母細胞に注入し、合成される蛋白質中のLT活性を測定
し、沈降定数16S近辺に相当する分画にLTの活性を検出
した。この分画のLT mRNAは約25μｇであった。
液（10mM Tris・HCl pH 7.6,2mM EDTA 0.3％ SDS）に溶
かし、65℃で２分間処理して10−35％ショ糖密度勾配遠
心処理（ベックマンSW28のローターを用いて20℃,25,00
0で21時間遠心分離）することにより分画した。この各
分画につきNRAの一部づつを、アフリカツメガエルの卵
母細胞に注入し、合成される蛋白質中のLT活性を測定
し、沈降定数16S近辺に相当する分画にLTの活性を検出
した。この分画のLT mRNAは約25μｇであった。
このポリ（Ａ）RNAを鋳型としてcDNAライブラリーをO
kayamaとBergの方法〔モレキュラー アンド セルラー
・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）,2巻（1982年）161
頁；同誌,3巻（1983年）280頁〕に従ってpcDV1ベクタ
ー、pL1リンカーを用いて作製した。環状化したcDNAを
含むベクタープラスミドは大腸菌DH1に感染させ、５μ
ｇのポリ（Ａ）RNAより出発して約５×105個のクローン
よりなる大腸菌DH1を宿主としたcDNAライブラリーを得
ることができた。
kayamaとBergの方法〔モレキュラー アンド セルラー
・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）,2巻（1982年）161
頁；同誌,3巻（1983年）280頁〕に従ってpcDV1ベクタ
ー、pL1リンカーを用いて作製した。環状化したcDNAを
含むベクタープラスミドは大腸菌DH1に感染させ、５μ
ｇのポリ（Ａ）RNAより出発して約５×105個のクローン
よりなる大腸菌DH1を宿主としたcDNAライブラリーを得
ることができた。
実施例2. ヒトLTcDNAを含むプラスミドの単離とその塩基配列の決
定 上記大腸菌DH1を用いたヒトcDNAライブラリーをニト
ロセルロースフィルター（ミリポア社、HATFフィルタ
ー）上に約３×104クローン／フィルターとなるように1
0枚まき、このフィルターをマスターフィルターとして
いる各２枚ずつを１組としたレプリカフィルター計20枚
を作製した。このレプリカフィルター上の大腸菌を0.5N
NaOH溶液でとかし露出変性したプラスミドDNAをフィル
ター上に乾燥固定した〔Grunstein,M,＆ Hogness,D,S.,
「プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス」（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），72巻
（1975年）3961頁〕。
定 上記大腸菌DH1を用いたヒトcDNAライブラリーをニト
ロセルロースフィルター（ミリポア社、HATFフィルタ
ー）上に約３×104クローン／フィルターとなるように1
0枚まき、このフィルターをマスターフィルターとして
いる各２枚ずつを１組としたレプリカフィルター計20枚
を作製した。このレプリカフィルター上の大腸菌を0.5N
NaOH溶液でとかし露出変性したプラスミドDNAをフィル
ター上に乾燥固定した〔Grunstein,M,＆ Hogness,D,S.,
「プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス」（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），72巻
（1975年）3961頁〕。
一方、既に報告されているLT遺伝子の塩基配列〔Gra
y,ら，「ネイチャー（Nature）」，312巻（1984年）721
頁〕の一部（アミノ酸NO.162−167に対応する遺伝子部
分）に相当するオリゴヌクレオチド を合成してヒトLTcDNAのスクリーニングプローブとし
た。
y,ら，「ネイチャー（Nature）」，312巻（1984年）721
頁〕の一部（アミノ酸NO.162−167に対応する遺伝子部
分）に相当するオリゴヌクレオチド を合成してヒトLTcDNAのスクリーニングプローブとし
た。
これらオリゴヌクレオチドプローブの５′末端をT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ，〔γ−32P〕ATPを用いて32P
で標識した。
リヌクレオチドキナーゼ，〔γ−32P〕ATPを用いて32P
で標識した。
標識したプローブをDNAを固定したレプリカフィルタ
ーに別々に会合させた。会合反応は10μCiの標識プロー
ブを含む５×SSC（0.15M NaCl,0.015M Sodium citrat
e）,5×Denhardt's,0.1％SDS,100μg/m変性サケ精子D
NA溶液10m中で40℃16時間行い、反応後、フィルター
を６×SSC,0.1％ SDS溶液で室温で30分ずつ３回、さら
に43℃で60分ずつ２回洗浄した。〔実験書（１）309
頁〕。洗浄したフィルターよりラジオオートグラムをと
り、プローブに対して反応する菌株を１組２枚のレプリ
カフィルターのラジオオートグラムを重ね合わせること
により探した。この方法により約３×105coloniesよ
り、プローブに対して反応する50株のE.coli DH1株を得
た。
ーに別々に会合させた。会合反応は10μCiの標識プロー
ブを含む５×SSC（0.15M NaCl,0.015M Sodium citrat
e）,5×Denhardt's,0.1％SDS,100μg/m変性サケ精子D
NA溶液10m中で40℃16時間行い、反応後、フィルター
を６×SSC,0.1％ SDS溶液で室温で30分ずつ３回、さら
に43℃で60分ずつ２回洗浄した。〔実験書（１）309
頁〕。洗浄したフィルターよりラジオオートグラムをと
り、プローブに対して反応する菌株を１組２枚のレプリ
カフィルターのラジオオートグラムを重ね合わせること
により探した。この方法により約３×105coloniesよ
り、プローブに対して反応する50株のE.coli DH1株を得
た。
これらの菌株よりプラスミドDNAをアルカリ法〔Birnb
oim,H.C.＆ Doly,J.,「ヌクレイック アシッズ リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.）,11巻（1979年）1513頁〕
によって抽出精製した。DNAを制限酵素BamH I（宝酒造
製）で切断し、アガロースゲル電気泳動で分画した後、
DNA断片をアガロースゲル中よりニトロセルロースフィ
ルター（エス アンド エス社,BA85）上に移した〔サ
ザンブロッティング法、実験書（１）382頁〕。このフ
ィルターを前記のオリゴヌクレオチドプローブと会合さ
せると、プラスミドDNA断片はプローブと反応した。
oim,H.C.＆ Doly,J.,「ヌクレイック アシッズ リサ
ーチ（Nucleic Acids Res.）,11巻（1979年）1513頁〕
によって抽出精製した。DNAを制限酵素BamH I（宝酒造
製）で切断し、アガロースゲル電気泳動で分画した後、
DNA断片をアガロースゲル中よりニトロセルロースフィ
ルター（エス アンド エス社,BA85）上に移した〔サ
ザンブロッティング法、実験書（１）382頁〕。このフ
ィルターを前記のオリゴヌクレオチドプローブと会合さ
せると、プラスミドDNA断片はプローブと反応した。
そこで、これらのうち最大のBamH I DNA断片（cDNA部
分）を生じたプラスミドを有する１株Ｅ．coli K12 DH1
/pTB618を選び出した。このプラスミドDNAのcDNA部分の
塩基配列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法〔J.Me
ssingら，「ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nucle
ic Acids Res.）,9巻（1981年）309頁〕によって決定し
た。
分）を生じたプラスミドを有する１株Ｅ．coli K12 DH1
/pTB618を選び出した。このプラスミドDNAのcDNA部分の
塩基配列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法〔J.Me
ssingら，「ヌクレイック アシッズ リサーチ（Nucle
ic Acids Res.）,9巻（1981年）309頁〕によって決定し
た。
その結果、プラスミドpTB618に含まれるLT遺伝子は完
全ではなく３′末端側非翻訳部分より上流側No.18のア
ミノ酸であるProのコドンCCCの第３番目のＣまでを含む
ことが判明した。
全ではなく３′末端側非翻訳部分より上流側No.18のア
ミノ酸であるProのコドンCCCの第３番目のＣまでを含む
ことが判明した。
実施例3. ヒトLT（１−171）発現ベクターpTB69の構築 工程１（pTB693プラスミドDNAの調製） 第１図に示すように、２μｇのプラスミドpTB618を0.
6ユニットのBal I（宝酒造製）を用いて37℃で６時間分
解した。
6ユニットのBal I（宝酒造製）を用いて37℃で６時間分
解した。
一方CAGATCTGの８−merで示されるBgl IIリンカー２
μｇを0.5mM ATPと25ユニットのT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼとでリン酸化後、そのリン酸化リンカー0.2μｇ
を1.6μｇの上記Bal I消化pTB618に添加し35ユニットの
T4 DNAリガーゼ存在下で14℃、一夜反応した。65℃で
５分間不活化後30ユニットBal IIを用いてトリミング
し、1.2％のアガロースゲル電気泳動に供した。
μｇを0.5mM ATPと25ユニットのT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼとでリン酸化後、そのリン酸化リンカー0.2μｇ
を1.6μｇの上記Bal I消化pTB618に添加し35ユニットの
T4 DNAリガーゼ存在下で14℃、一夜反応した。65℃で
５分間不活化後30ユニットBal IIを用いてトリミング
し、1.2％のアガロースゲル電気泳動に供した。
4.3Kbpに相当する主バンドを切り取り、トリス・塩酸
緩衝液で抽出後RDPミニカラム（バイオラッド社）で精
製した。上記直鎖状DNA100ngに10ユニットのT4DNAリガ
ーゼを添加しpTB603プラスミド含有DNAを得、次いで常
法に従い大腸菌DH1株へ形質転換した。詳しくは、参考
例３で作製、−70℃で凍結保存した形質転換用DH1菌株
を氷冷下除々に融解し、その懸濁液100μにpTB693含
有DNA30ngを添加した。氷冷下30分間反応後、42℃で90
秒間ヒートシヨックを与え、１−２分間氷冷した。0.2m
の20mMグルコースを含むSOB培地を添加し37℃で１時
間培養後、該懸濁液を35μg/mのアンピシリンを含むL
B寒天プレート上にまき37℃で一夜培養した。その結果
プラスミドpTB693からアンピシリン耐性形質転換のコロ
ニーを得ることができた。
緩衝液で抽出後RDPミニカラム（バイオラッド社）で精
製した。上記直鎖状DNA100ngに10ユニットのT4DNAリガ
ーゼを添加しpTB603プラスミド含有DNAを得、次いで常
法に従い大腸菌DH1株へ形質転換した。詳しくは、参考
例３で作製、−70℃で凍結保存した形質転換用DH1菌株
を氷冷下除々に融解し、その懸濁液100μにpTB693含
有DNA30ngを添加した。氷冷下30分間反応後、42℃で90
秒間ヒートシヨックを与え、１−２分間氷冷した。0.2m
の20mMグルコースを含むSOB培地を添加し37℃で１時
間培養後、該懸濁液を35μg/mのアンピシリンを含むL
B寒天プレート上にまき37℃で一夜培養した。その結果
プラスミドpTB693からアンピシリン耐性形質転換のコロ
ニーを得ることができた。
プラスミドpTB693を含有する上記大腸菌DH1株を、35
μg/mのアンピシリンを含むLB培地〔実験書（１）68
頁〕250m中で培養後、実験書（１）88頁の方法に従っ
てプラスミドを単離し約300μｇのpTBN693が得られた。
μg/mのアンピシリンを含むLB培地〔実験書（１）68
頁〕250m中で培養後、実験書（１）88頁の方法に従っ
てプラスミドを単離し約300μｇのpTBN693が得られた。
工程２（ヒトLT−cDNAの作成） pTB693プラスミド50μｇを100ユニットのNsi Iと120
ユニットのBgl II（宝酒造製）とで37℃、１時間分解
し、２％アガロースゲル電気泳動に供した。LT−cDNAを
含むNsi I−Bgl II断片に相当する0.56Kbpのバンドを切
り取り、工程１で述べたRDPミニカラムを用いて精製し
た。
ユニットのBgl II（宝酒造製）とで37℃、１時間分解
し、２％アガロースゲル電気泳動に供した。LT−cDNAを
含むNsi I−Bgl II断片に相当する0.56Kbpのバンドを切
り取り、工程１で述べたRDPミニカラムを用いて精製し
た。
一方、LTのＮ末端ペプチド（１−20）をコードする下
記の６本のオリゴヌクレオチド鎖をApplied Biosystems
社（米国）のModel 380A−DMA synthesizerで化学合成
し〔「テトラヘドロン レターズ（Tetrahedron Let
t.）」,21巻（1980年）3243頁〕、それら各１μｇの混
合物にT4ポリヌクレオチドキナーゼ12.5ユニットと1mM
ATPとを加えて37℃、１時間でリン酸化した。
記の６本のオリゴヌクレオチド鎖をApplied Biosystems
社（米国）のModel 380A−DMA synthesizerで化学合成
し〔「テトラヘドロン レターズ（Tetrahedron Let
t.）」,21巻（1980年）3243頁〕、それら各１μｇの混
合物にT4ポリヌクレオチドキナーゼ12.5ユニットと1mM
ATPとを加えて37℃、１時間でリン酸化した。
70℃、５分間不活化後さらに350ユニットのT4DNAリガ
ーゼで14℃、一夜反応させ、次いで65℃で５分間不活化
後反応終了後（約3.5μｇのDNAを含む）にEcoR I（宝酒
造製）45ユニット及びNsi I 35ユニットを添加し37℃で
２時間分解し、10％のポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供した。
ーゼで14℃、一夜反応させ、次いで65℃で５分間不活化
後反応終了後（約3.5μｇのDNAを含む）にEcoR I（宝酒
造製）45ユニット及びNsi I 35ユニットを添加し37℃で
２時間分解し、10％のポリアクリルアミドゲル電気泳動
に供した。
約70bpに相当するバンドを切り取り、RDPミニカラム
を精製した。
を精製した。
上記約70bpのEcoR I−Nsi I断片30ngに0.56KbpのNsi
I−Bgl II断片110ngを添加し35ユニットのT4DNAリガー
ゼ存在下で14℃、２時間反応させた。反応終了液に６ユ
ニットのBgl IIと９ユニットのEcoR Iとで37℃、１時間
分解トリミングし0.63KbpのヒトLT（１−171）の全アミ
ノ酸配列をコードするcDNAを作製することができた。
I−Bgl II断片110ngを添加し35ユニットのT4DNAリガー
ゼ存在下で14℃、２時間反応させた。反応終了液に６ユ
ニットのBgl IIと９ユニットのEcoR Iとで37℃、１時間
分解トリミングし0.63KbpのヒトLT（１−171）の全アミ
ノ酸配列をコードするcDNAを作製することができた。
工程３（pTB692プラスミドDNAの調製） ２μｇのプラスミドptrp781を32ユニットのPst I（宝
酒造製）で37℃、１時間分解した。反応終了後、TNE緩
衝液〔実験書（１）448頁〕と最終濃度0.2％のSDSを添
加してフェノール−クロロホルムで抽出、精製した。
酒造製）で37℃、１時間分解した。反応終了後、TNE緩
衝液〔実験書（１）448頁〕と最終濃度0.2％のSDSを添
加してフェノール−クロロホルムで抽出、精製した。
上記Pst I消化ptrp781 1μｇに0.1mM XTPと４ユニッ
トのT4DNAポリメラーゼとを加え、37℃、５分間反応
後、TNE緩衝液およびSDSを添加しフェノール−クロロホ
ルムで抽出、精製した。
トのT4DNAポリメラーゼとを加え、37℃、５分間反応
後、TNE緩衝液およびSDSを添加しフェノール−クロロホ
ルムで抽出、精製した。
次に工程１に記載のリン酸化Bgl IIリンカー0.2μｇ
と35ユニットをT4DNAリガーゼとを上記のptrp781 DNA
0.8μｇに加え14℃で一夜反応した。65℃で５分間不活
化後、30ユニットのBgl IIでトリミングしフェノール−
クロロホルムで抽出し、さらにセファロース4Bカラムで
精製した。その後、10ユニットのT4DNAリガーゼを添加
しpTB692含有DNAを得、次いで工程１記載の常法に従い
大腸菌DH1株へ形質転換した。但し35μg/mのアンピシ
リンの代りに10μg/mのテトラサイクリンを含むLB寒
天プレートを使用し、テトラサイクリン耐性形質転換菌
のコロニーが得られた。該コロニーを10μg/mのテト
ラサイクリンを含むLB培地で培養し、工程１の方法に従
いpTB692プラスミドが得られた。
と35ユニットをT4DNAリガーゼとを上記のptrp781 DNA
0.8μｇに加え14℃で一夜反応した。65℃で５分間不活
化後、30ユニットのBgl IIでトリミングしフェノール−
クロロホルムで抽出し、さらにセファロース4Bカラムで
精製した。その後、10ユニットのT4DNAリガーゼを添加
しpTB692含有DNAを得、次いで工程１記載の常法に従い
大腸菌DH1株へ形質転換した。但し35μg/mのアンピシ
リンの代りに10μg/mのテトラサイクリンを含むLB寒
天プレートを使用し、テトラサイクリン耐性形質転換菌
のコロニーが得られた。該コロニーを10μg/mのテト
ラサイクリンを含むLB培地で培養し、工程１の方法に従
いpTB692プラスミドが得られた。
工程４（pTB694プラスミドDNAの調製） 工程３記載pTB692プラスミドDNA10μｇにEcoR I 54ユ
ニットおよびBgl II 30ユニットを加え５℃で一夜反応
後、１％アガロースゲル電気泳動で精製し3.3KbpのDNA
バンドを切り出した。この3.3KbpのDNA36ngに工程２記
載の0.63KbpのDNA 15ngを加え10ユニットT4DNAリガーゼ
でpTB694含有DNAを得、工程３記載の方法に従いテトラ
サイクリン耐性の形質転換体を作製し、ヒトLT（１−17
1）発現用プラスミドpTB694を得ることができた。
ニットおよびBgl II 30ユニットを加え５℃で一夜反応
後、１％アガロースゲル電気泳動で精製し3.3KbpのDNA
バンドを切り出した。この3.3KbpのDNA36ngに工程２記
載の0.63KbpのDNA 15ngを加え10ユニットT4DNAリガーゼ
でpTB694含有DNAを得、工程３記載の方法に従いテトラ
サイクリン耐性の形質転換体を作製し、ヒトLT（１−17
1）発現用プラスミドpTB694を得ることができた。
実施例4. ヒトLT〔Lys−Leu−Ala−Leu−Thr−（20−171）〕発現
ベクターpTB773の構築 第２図に示すように、実施例３に記載のプラスミドpT
B694を制限酵素EcoR IとNsi Iとで分解し、LTのＮ末端
部をコードするDNA断片を除去した。次いでラージフラ
グメントに、Lys−Leu−Ala−Leu−ThrをコードしかつA
TGつきEcoR Iリンカーを含むオリゴヌクレオチドをT4DN
Aリガーゼにより結合させた。65℃で５分間不活化後、E
coR Iによりトリミングし0.8％のアガロースゲル電気泳
動に供した。
ベクターpTB773の構築 第２図に示すように、実施例３に記載のプラスミドpT
B694を制限酵素EcoR IとNsi Iとで分解し、LTのＮ末端
部をコードするDNA断片を除去した。次いでラージフラ
グメントに、Lys−Leu−Ala−Leu−ThrをコードしかつA
TGつきEcoR Iリンカーを含むオリゴヌクレオチドをT4DN
Aリガーゼにより結合させた。65℃で５分間不活化後、E
coR Iによりトリミングし0.8％のアガロースゲル電気泳
動に供した。
3.8Kbpに相当する主バンドを切り取りRDPミニカラム
を用いて精製後、T4DNAリガーゼを加えてpTB773含有DNA
を取得した。次いで実施例３、工程３、記載の常法に従
い大腸菌DH1株へ形質転換し、その形質変換体からpTB77
3プラスミドを得ることができた。
を用いて精製後、T4DNAリガーゼを加えてpTB773含有DNA
を取得した。次いで実施例３、工程３、記載の常法に従
い大腸菌DH1株へ形質転換し、その形質変換体からpTB77
3プラスミドを得ることができた。
実施例5. ヒトLT〔Ser−Leu−Ala−Leu（19−171）〕発現ベクタ
ーpTB775の構築 実施例４と同様に、pTB694を制限酵素EcoR IとNsi I
とで切断し、そのラージフラグメントにSer−Leu−Ala
−LeuをコードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含むオリ
ゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。以
下、実施例４と同じ手法でpTB775プラスミドを得ること
ができた。
ーpTB775の構築 実施例４と同様に、pTB694を制限酵素EcoR IとNsi I
とで切断し、そのラージフラグメントにSer−Leu−Ala
−LeuをコードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含むオリ
ゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。以
下、実施例４と同じ手法でpTB775プラスミドを得ること
ができた。
実施例6. ヒトLT〔Lys−Ser−Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Ly
s−Pro−（10−171）〕発現ベクターpTB858の構築 第３図に示すように、pTB694を制限酵素EcoR IとPvu
IIとで切断し、そのラージフラグメントに、Lys−Ser−
Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Proをコードしか
つATGつきEcoR Iリンカーを含むオリゴヌクレオチドをT
4DNAリガーゼにより結合させた。以下、実施例４と同じ
手法でpTB858プラスミドを得ることができた。
s−Pro−（10−171）〕発現ベクターpTB858の構築 第３図に示すように、pTB694を制限酵素EcoR IとPvu
IIとで切断し、そのラージフラグメントに、Lys−Ser−
Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Proをコードしか
つATGつきEcoR Iリンカーを含むオリゴヌクレオチドをT
4DNAリガーゼにより結合させた。以下、実施例４と同じ
手法でpTB858プラスミドを得ることができた。
実施例7. ヒトLT〔Lys−Ser−Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Ly
s−Pro−（10−171）〕発現ベクターpTB864の構築 第４図に示すように、pTB694を制限酵素Bgl Iで分解
後、T4DNAポリメラーゼを反応させ、trp−プロモーター
および1.2KbpのヒトLT（１−171）の全アミノ酸配列を
コードするDNA断片を調製した。次いでプラスミドpUC19
（宝酒造製）をPvu IIで切断し、上記の1.2Kbp DNA断片
とT4DNAリガーゼとを加えてpTB867を取得した。
s−Pro−（10−171）〕発現ベクターpTB864の構築 第４図に示すように、pTB694を制限酵素Bgl Iで分解
後、T4DNAポリメラーゼを反応させ、trp−プロモーター
および1.2KbpのヒトLT（１−171）の全アミノ酸配列を
コードするDNA断片を調製した。次いでプラスミドpUC19
（宝酒造製）をPvu IIで切断し、上記の1.2Kbp DNA断片
とT4DNAリガーゼとを加えてpTB867を取得した。
一方、実施例６で作成したpTB858をEcoR IとBgl IIと
で分解し、0.6Kbp DNA断片を単離した。同じくpTB867を
EcoR IとBgl IIとで分解し、このラージフラグメントに
上記の0.6Kbp DNA断片とT4DNAリガーゼとを添加してpTB
864プラスミドを得ることができた。
で分解し、0.6Kbp DNA断片を単離した。同じくpTB867を
EcoR IとBgl IIとで分解し、このラージフラグメントに
上記の0.6Kbp DNA断片とT4DNAリガーゼとを添加してpTB
864プラスミドを得ることができた。
実施例8. ヒトLT〔Cys−Ser−Ala−Leu−Ala−（22−171）〕発現
ベクターpTB860の構築 実施例４と同様にpTB694を制限酵素Nsi Iで切断後、T
4DNAポリメラーゼを反応させた。次いで、EcoR Iで分解
した後、そのラージフラグメントにCyS−Ser−Ala−Leu
−Alaをコードし、かつATGつきEcoR Iリンカーを含むオ
リゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。
以下、実施例４と同様の方法でpTB860プラスミドを得る
ことができた。
ベクターpTB860の構築 実施例４と同様にpTB694を制限酵素Nsi Iで切断後、T
4DNAポリメラーゼを反応させた。次いで、EcoR Iで分解
した後、そのラージフラグメントにCyS−Ser−Ala−Leu
−Alaをコードし、かつATGつきEcoR Iリンカーを含むオ
リゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。
以下、実施例４と同様の方法でpTB860プラスミドを得る
ことができた。
実施例9. ヒトLT〔Cys−Ser−Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Ly
s−Pro−（10−171）〕発現ベクターpTB865の構築 実施例７で取得したpTB864をEcoR IとEco 47 IIIとで
分解後、そのラージフラグメントにCys−Ser−Ala−Leu
−AlaをコードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含むオリ
ゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。以
下、実施例４と同様の方法でpTB865プラスミドを得るこ
とができた。
s−Pro−（10−171）〕発現ベクターpTB865の構築 実施例７で取得したpTB864をEcoR IとEco 47 IIIとで
分解後、そのラージフラグメントにCys−Ser−Ala−Leu
−AlaをコードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含むオリ
ゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。以
下、実施例４と同様の方法でpTB865プラスミドを得るこ
とができた。
実施例10. ヒトLT〔Lys−Ser−Ala−Leu−Ala−（22−171）〕発現
ベクターpTB866の構築 pTB864をNsi Iで分解後、T4DNAポリメラーゼを反応さ
せた。次いでEco 47 IIIで分解し、スモールフラグメン
トを除去したのち、T4DNAリガーゼを作用させ閉環し
た。以下、実施例４と同様にしてpTB866プラスミドを得
ることができた。
ベクターpTB866の構築 pTB864をNsi Iで分解後、T4DNAポリメラーゼを反応さ
せた。次いでEco 47 IIIで分解し、スモールフラグメン
トを除去したのち、T4DNAリガーゼを作用させ閉環し
た。以下、実施例４と同様にしてpTB866プラスミドを得
ることができた。
実施例11.大腸菌株におけるヒトLTの発現 実施例１および４〜10で作成したプラスミドpTB694,p
TB773,pTB775,pTB858,pTB864,pTB860,pTB865,pTB866を
用いて参考例３記載の大腸菌DH1株を形質転換させた。
TB773,pTB775,pTB858,pTB864,pTB860,pTB865,pTB866を
用いて参考例３記載の大腸菌DH1株を形質転換させた。
得られた形質転換体をM9−CA培地〔実験書（１）69
頁〕4m中37℃、４時間培養し、インドールアクリル酸
25μg/m添加し、さらに４時間培養を継続した。集菌
後、0.01％リゾチームおよび10％庶糖を含むトリス・塩
酸緩衝液（pH7.5）0.3mに懸濁し５℃で１時間反応後
氷冷下45秒間超音波処理した。
頁〕4m中37℃、４時間培養し、インドールアクリル酸
25μg/m添加し、さらに４時間培養を継続した。集菌
後、0.01％リゾチームおよび10％庶糖を含むトリス・塩
酸緩衝液（pH7.5）0.3mに懸濁し５℃で１時間反応後
氷冷下45秒間超音波処理した。
得られた菌体抽出液を参考例１記載のL929細胞傷害活
性試験に供し、LT活性を測定したところ第１表の結果を
得た。
性試験に供し、LT活性を測定したところ第１表の結果を
得た。
実施例12.新規ヒトLTムテインの精製 実施例９に記載された方法で調製したプラスミドpTB8
65を用いて参考例３記載の形質転換用大腸菌株DH1をト
ランスホームした。得られたトランスホーマントを実施
例11に記載の方法で培養後、リゾチームおよび超音波処
理で破砕し、ヒトLTを含む菌体抽出液を得た。
65を用いて参考例３記載の形質転換用大腸菌株DH1をト
ランスホームした。得られたトランスホーマントを実施
例11に記載の方法で培養後、リゾチームおよび超音波処
理で破砕し、ヒトLTを含む菌体抽出液を得た。
次いで、該抽出液を20mMリン酸緩衝液（pH8.0）で平
衡化したDEAE−セファロースCL−6B（ファルマシア社）
のカラムに添加し、同緩衝液で洗浄後、0.1M NaClを含
む同緩衝液で溶出し粗精製液を得た。
衡化したDEAE−セファロースCL−6B（ファルマシア社）
のカラムに添加し、同緩衝液で洗浄後、0.1M NaClを含
む同緩衝液で溶出し粗精製液を得た。
上記粗精製液を塩酸を用いてpH6.0に調整後、01M NaC
l含有20mMリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したブルーセ
ファロースCL−6Bカラムに添加し、十分洗浄後、0.5M N
aClを含む20mMリン酸緩衝液（pH8.0）で溶出した。
l含有20mMリン酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したブルーセ
ファロースCL−6Bカラムに添加し、十分洗浄後、0.5M N
aClを含む20mMリン酸緩衝液（pH8.0）で溶出した。
さらに溶出液を20mMリン酸食塩緩衝液（pH7.3）で平
衡化したセファクリルＳ−200カラムでゲルろ過し、比
活性5.7×106U/mgのヒトLT標品を得た。
衡化したセファクリルＳ−200カラムでゲルろ過し、比
活性5.7×106U/mgのヒトLT標品を得た。
実施例13 ヒトLT〔Phe−（25−171）〕発現ベクターpTB953の構築 （１）ウサギ抗ヒトLT−Ｃ端ペプチド抗体の製造 公知の固相合成法でペプチド合成機（アプライド・シ
ステム，モデム430A型）を用いて作成されたヒトLT−Ｃ
端ペプチド（152−171）の10mg/5m水溶液をBTG40mg/5
m水溶液に加え、軽く超音波処理後、２％GLA溶液1m
氷冷下、静かに滴下し５時間反応させた。生理食塩水で
３回透析後（３×３）、凍結保存し免疫原として用い
た。
ステム，モデム430A型）を用いて作成されたヒトLT−Ｃ
端ペプチド（152−171）の10mg/5m水溶液をBTG40mg/5
m水溶液に加え、軽く超音波処理後、２％GLA溶液1m
氷冷下、静かに滴下し５時間反応させた。生理食塩水で
３回透析後（３×３）、凍結保存し免疫原として用い
た。
ペプチド−BTG複合体4mg/1.5m生理食塩水溶液に等
量のフロイント完全アジュバントを加え、ウサギ（♂,n
＝3.1.3mg/1m／ウサギ）の背部ならびに後肢掌皮下へ
の免疫を開始した。追加免疫は免疫原に等量のフロイン
ト不完全アジュバントを加えて、４週毎に５回接種し実
施した。
量のフロイント完全アジュバントを加え、ウサギ（♂,n
＝3.1.3mg/1m／ウサギ）の背部ならびに後肢掌皮下へ
の免疫を開始した。追加免疫は免疫原に等量のフロイン
ト不完全アジュバントを加えて、４週毎に５回接種し実
施した。
最終免疫後７〜10日に耳静脈から採血し、遠心分離し
て抗血清を得た。
て抗血清を得た。
特異抗体の製造については、上記の血清を公知の方法
に従い、塩析およびカラムクロマト処理に供し、さらに
得られた抗体IgG画分を不溶化ヒトLT−セルロファイン
カラムのアフィニティークロマトで精製した。すなわ
ち、0.15M NaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（pH8.0）で平
衡化したヒトLT結合カラムにウサギ抗ヒトLT−IgG画分
を添加し十分に洗浄後、0.02Mグリシン−塩酸緩衝液（p
H 2.3）で溶出することにより、ヒトLTに親和性の高い
中和特異抗体LT−R1,LT−R2およびLT−R3が得られた。
に従い、塩析およびカラムクロマト処理に供し、さらに
得られた抗体IgG画分を不溶化ヒトLT−セルロファイン
カラムのアフィニティークロマトで精製した。すなわ
ち、0.15M NaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（pH8.0）で平
衡化したヒトLT結合カラムにウサギ抗ヒトLT−IgG画分
を添加し十分に洗浄後、0.02Mグリシン−塩酸緩衝液（p
H 2.3）で溶出することにより、ヒトLTに親和性の高い
中和特異抗体LT−R1,LT−R2およびLT−R3が得られた。
（２）pTB953の構築 第５図に示すように実施例７で取得したpTB864をNsi
Iで切断後、Bal 31（宝酒造製）を添加し末端オリオヌ
クレオチドを分解、除去した。次いでT4DNAポリメラー
ゼを反応させ末端部を平滑化後、EcoR Iで切断した。得
られたDNAラージフラグメントに、Phe−Ser−Thr−Leu
−Lys−ProをコードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含
むオリゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼにより結合させ
た。
Iで切断後、Bal 31（宝酒造製）を添加し末端オリオヌ
クレオチドを分解、除去した。次いでT4DNAポリメラー
ゼを反応させ末端部を平滑化後、EcoR Iで切断した。得
られたDNAラージフラグメントに、Phe−Ser−Thr−Leu
−Lys−ProをコードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含
むオリゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼにより結合させ
た。
得られたプラスミドを用いて大腸菌DH1株を形質転換
後、実施例11に従って菌体抽出液を調製した。次いでウ
サギ抗ヒトLT−Ｃ端ペプチド抗体LT−R2を用いるイムノ
ブロッティングによりLT発現株を選択し、さらにそれら
の発現陽性株より該プラスミドDNAを調製し塩基配列を
確認することにより目的としてヒトLT〔Phe−（25−17
1）〕を発現するプラスミドpTB953を得ることができ
る。
後、実施例11に従って菌体抽出液を調製した。次いでウ
サギ抗ヒトLT−Ｃ端ペプチド抗体LT−R2を用いるイムノ
ブロッティングによりLT発現株を選択し、さらにそれら
の発現陽性株より該プラスミドDNAを調製し塩基配列を
確認することにより目的としてヒトLT〔Phe−（25−17
1）〕を発現するプラスミドpTB953を得ることができ
る。
実施例14 ヒトLT〔Lys−Ser−Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−
（28−171）〕発現ベクターpTB1004の構築 実施例13で取得したpTB953をEcoR IとPvu IIとで切断
・分解し、次いで得られたDNAラージフラグメントに、L
ys−Ser−Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Proを
コードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含むオリゴヌク
レオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。以下、実
施例４と同様の方法でプラスミドを調製し、第６図に示
すように合成オリゴヌクレオチドに由来するNhe Iおよ
びEco47 III切断部位の存在を確認することにより、目
的のpTB1004プラスミドを得ることができた。
（28−171）〕発現ベクターpTB1004の構築 実施例13で取得したpTB953をEcoR IとPvu IIとで切断
・分解し、次いで得られたDNAラージフラグメントに、L
ys−Ser−Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Proを
コードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含むオリゴヌク
レオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。以下、実
施例４と同様の方法でプラスミドを調製し、第６図に示
すように合成オリゴヌクレオチドに由来するNhe Iおよ
びEco47 III切断部位の存在を確認することにより、目
的のpTB1004プラスミドを得ることができた。
実施例15 ヒトLT〔Cys−Ser−Ala−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−
（28−171）〕発現ベクターpTB1005の構築 実施例14で取得したpTB1004をEcoR IとEco47 IIIとで
切断・分解し、次いで得られたDNAラージフラグメント
に、Cys−Ser−Ala−LeuをコードしかつATGつきEcoR I
リンカーを含むオリゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼに
より結合させた。以下、実施例４と同様の方法でプラス
ミドを調製し、第７図に示すようにNhe I切断部位（第
６図参照）を含まずEco47 III切断部位を含む目的のpTB
1005プラスミドを得ることができた。
（28−171）〕発現ベクターpTB1005の構築 実施例14で取得したpTB1004をEcoR IとEco47 IIIとで
切断・分解し、次いで得られたDNAラージフラグメント
に、Cys−Ser−Ala−LeuをコードしかつATGつきEcoR I
リンカーを含むオリゴヌクレオチドをT4DNAリガーゼに
より結合させた。以下、実施例４と同様の方法でプラス
ミドを調製し、第７図に示すようにNhe I切断部位（第
６図参照）を含まずEco47 III切断部位を含む目的のpTB
1005プラスミドを得ることができた。
実施例16 ヒトLT〔Cys−Ser−Gly−Phe−Leu−Gly−Ser−（27−1
71）〕発現ベクターpTB1006の構築 実施例13で取得したpTB953をEcoR IとPvu IIとで切断
・分解し、次いで得られたDNAラージフラグメントに、C
ys−Ser−Gly−Phe−Leu−Gly−Ser−Leu−Lys−Proを
コードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含むオリゴヌク
レオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。以下、実
施例４と同様の方法でプラスミドを調製し、第８図に示
すようにAcc III切断部位を含む目的のpTB1006プラスミ
ドを得ることができた。
71）〕発現ベクターpTB1006の構築 実施例13で取得したpTB953をEcoR IとPvu IIとで切断
・分解し、次いで得られたDNAラージフラグメントに、C
ys−Ser−Gly−Phe−Leu−Gly−Ser−Leu−Lys−Proを
コードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含むオリゴヌク
レオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。以下、実
施例４と同様の方法でプラスミドを調製し、第８図に示
すようにAcc III切断部位を含む目的のpTB1006プラスミ
ドを得ることができた。
実施例17 ヒトLT〔Cys−Ser−Gly−Phe−Leu−Gly−Ser−Leu−Ly
s−Pro（10−171）〕発現ベクターpTB1007の構築 実施例７で取得したpTB867をEcoR IとPvu IIとで切断
・分解し、次いで得られたDNAラージフラグメントに、C
ys−Ser−Gly−Phe−Leu−Gly−Ser−Leu−Lys−Proを
コードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含むオリゴヌク
レオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。以下、実
施例４と同様の方法でプラスミドを調製し、第９図に示
すようにAcc III切断部位を含む目的のpTB1007プラスミ
ドを得ることができた。
s−Pro（10−171）〕発現ベクターpTB1007の構築 実施例７で取得したpTB867をEcoR IとPvu IIとで切断
・分解し、次いで得られたDNAラージフラグメントに、C
ys−Ser−Gly−Phe−Leu−Gly−Ser−Leu−Lys−Proを
コードしかつATGつきEcoR Iリンカーを含むオリゴヌク
レオチドをT4DNAリガーゼにより結合させた。以下、実
施例４と同様の方法でプラスミドを調製し、第９図に示
すようにAcc III切断部位を含む目的のpTB1007プラスミ
ドを得ることができた。
実施例18 大腸菌株におけるヒトLTの発現 実施例14〜17で作成されたプラスミドpTB1004,pTB100
5,pTB1006,pTB1007を用いて実施例11に記載の方法で大
腸菌形質転換体の抽出液を調製した。次いで参考例１記
載の方法でL929細胞障害活性試験を実施し、第２表の結
果を得た。
5,pTB1006,pTB1007を用いて実施例11に記載の方法で大
腸菌形質転換体の抽出液を調製した。次いで参考例１記
載の方法でL929細胞障害活性試験を実施し、第２表の結
果を得た。
実施例19 新規ヒトLTムテインの精製 （１）ヒトLT（21−171）発現ベクターpTB622の構築 上記で作製したプラスミドpTB618を制限酵素Nsi I
（宝酒造製）とBamH Iで切断し、LT遺伝子を含む1.1キ
ロ塩基対（以下、Kbpと略す）のDNA断片を分離した。こ
のDNAにT4 DNAポリメラーゼ（PL社製）を反応させ、末
端を平滑化させた後、フレームが合うように、16−mer
のATGつきEcoR Iリンカー（AACATGAATTCATGTT）をT4DNA
リガーゼによって結合させた。T4DNAリガーゼを65℃10
分間の熱処理によって失活させたのちさらに制限酵素Ec
oR Iで切断し、アガロース電気泳動でリンカーの結合し
たLT遺伝子を含む0.6KbpのDNA断片を分離した。
（宝酒造製）とBamH Iで切断し、LT遺伝子を含む1.1キ
ロ塩基対（以下、Kbpと略す）のDNA断片を分離した。こ
のDNAにT4 DNAポリメラーゼ（PL社製）を反応させ、末
端を平滑化させた後、フレームが合うように、16−mer
のATGつきEcoR Iリンカー（AACATGAATTCATGTT）をT4DNA
リガーゼによって結合させた。T4DNAリガーゼを65℃10
分間の熱処理によって失活させたのちさらに制限酵素Ec
oR Iで切断し、アガロース電気泳動でリンカーの結合し
たLT遺伝子を含む0.6KbpのDNA断片を分離した。
一方〔Kurokawa,T.ら.,「ヌクレイック アシッズリ
サーチ（Nucl.Acids Res）」11巻（1983年）3077頁〕に
記載のプラスミドptrp781を制限酵素EcoR Iで切断し、
５′末端のリン酸をアルカリ性ホスファターゼ処理によ
って除去した。このDNAと、ATGつきEcoR Iリンカーの結
合した、0.6KbpのLT DNA断片を混合し、TA DNAリガー
ゼを作用させて、トリプトファンプロモーターの下流に
LT遺伝子の挿入された、大腸菌のヒトLT発現ベクターpT
B622を構築した。
サーチ（Nucl.Acids Res）」11巻（1983年）3077頁〕に
記載のプラスミドptrp781を制限酵素EcoR Iで切断し、
５′末端のリン酸をアルカリ性ホスファターゼ処理によ
って除去した。このDNAと、ATGつきEcoR Iリンカーの結
合した、0.6KbpのLT DNA断片を混合し、TA DNAリガー
ゼを作用させて、トリプトファンプロモーターの下流に
LT遺伝子の挿入された、大腸菌のヒトLT発現ベクターpT
B622を構築した。
上記の如く作製したプラスミドpTB 622を用いて大腸
菌DH1株を形質転換させた。
菌DH1株を形質転換させた。
得られた形質転換体をM9−CA培地〔実験書（１）69
頁〕2.5中、37℃、４時間培養し、インドールアクリ
ル酸25μg/m添加し、さらに４時間培養を継続した。
集菌後、0.01％リゾチームおよび10％庶糖を含むトリス
・塩酸緩衝液（pH7.5）100mに懸濁し５℃で１時間反
応後、氷冷下５分間超音波処理した。
頁〕2.5中、37℃、４時間培養し、インドールアクリ
ル酸25μg/m添加し、さらに４時間培養を継続した。
集菌後、0.01％リゾチームおよび10％庶糖を含むトリス
・塩酸緩衝液（pH7.5）100mに懸濁し５℃で１時間反
応後、氷冷下５分間超音波処理した。
次いで該抽出液を遠心分離後、5mMリン酸緩衝液（pH
8.0）で平滑化したDEAE−セファロースCL−6B（ファル
マシア社）のカラムに添加した。同緩衝液で洗浄後0.1M
NaClを含む同緩衝液で溶出し比活性7.8×105U/mgの粗
精製液を得た。
8.0）で平滑化したDEAE−セファロースCL−6B（ファル
マシア社）のカラムに添加した。同緩衝液で洗浄後0.1M
NaClを含む同緩衝液で溶出し比活性7.8×105U/mgの粗
精製液を得た。
上記粗精製液を塩酸を用いてpH6.0に調整後、0.1M Na
Cl含有5mMリン酸緩衝液（pH6.0）で平滑化したブルーセ
ファロースCL−6Bカラムに添加し十分洗浄後、0.5M NaC
lを含む5mMリン酸緩衝液（pH 8.0）で溶出した。同溶出
液の比活性は7.4×106U/mgであった。
Cl含有5mMリン酸緩衝液（pH6.0）で平滑化したブルーセ
ファロースCL−6Bカラムに添加し十分洗浄後、0.5M NaC
lを含む5mMリン酸緩衝液（pH 8.0）で溶出した。同溶出
液の比活性は7.4×106U/mgであった。
さらに、この溶出液を5mMリン酸緩衝液（pH7.3）で平
滑化したセファクリルＳ−200のカラムでゲルろ過し、
比活性1.6×107U/mgの精製液を得た。
滑化したセファクリルＳ−200のカラムでゲルろ過し、
比活性1.6×107U/mgの精製液を得た。
（２）マウス抗ヒトLTモノクローナル抗体の製造 上記のヒトLT精製標品200μg/m生理食塩水溶液に等
量のフロイント完全アジュバントを添加し十分乳濁後、
BALB/cマウス（♀、ｎ＝10:20μg/0.2m／マウス）に
腹腔および背部皮下投与し、３週間隔で追加免疫を実施
した。４回の追加免疫後、２週で最大の血清抗体価を示
した個体について、同じLT抗原液（50μg/0.1m生理食
塩水／マウス）を静脈内投与した。
量のフロイント完全アジュバントを添加し十分乳濁後、
BALB/cマウス（♀、ｎ＝10:20μg/0.2m／マウス）に
腹腔および背部皮下投与し、３週間隔で追加免疫を実施
した。４回の追加免疫後、２週で最大の血清抗体価を示
した個体について、同じLT抗原液（50μg/0.1m生理食
塩水／マウス）を静脈内投与した。
最終免疫後３日で脾臓を摘出し、脾細胞懸濁液を常法
により調製した（約108個）。次いでマウス骨髄腫細胞
（P3U1）２×107個を添加し、PEG 6000を用いてケーラ
ーとミルスタインの方法〔ネーチャー（Nature），256,
495（1975）〕に準じて細胞融合に供した。
により調製した（約108個）。次いでマウス骨髄腫細胞
（P3U1）２×107個を添加し、PEG 6000を用いてケーラ
ーとミルスタインの方法〔ネーチャー（Nature），256,
495（1975）〕に準じて細胞融合に供した。
融合終了後、細胞混液をヒポキサンチン・アミノプテ
リンおよびチミジンを含む、いわゆるHAT培地中に懸濁
し10日間培養した。以後は親細胞の選択が終了次第、HA
T培地からアミノプテリンを除いたHT培地に代え培養を
続けた。
リンおよびチミジンを含む、いわゆるHAT培地中に懸濁
し10日間培養した。以後は親細胞の選択が終了次第、HA
T培地からアミノプテリンを除いたHT培地に代え培養を
続けた。
固相に精製ヒトLTを吸着させたマイクロプレートを用
いるELISA法でハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定
した。融合10日から20日後でハイブリドーマの出現を認
め、かつヒトLTに結合する抗体の出現がみられた。特に
結合活性の強いハイブリドーマについて、限界希釈法に
よるクローニングに供した。
いるELISA法でハイブリドーマ培養上清の抗体価を測定
した。融合10日から20日後でハイブリドーマの出現を認
め、かつヒトLTに結合する抗体の出現がみられた。特に
結合活性の強いハイブリドーマについて、限界希釈法に
よるクローニングに供した。
クローン化したハイブリドーマの培養上清を同様にEL
ISA法のスクリーニングに供し、ヒトLT結合能の強いも
のを選択した。これらについては、さらに参考例１記載
のL929細胞障害活性試験を用いて、ヒトLTの活性に対す
る中和能を測定した。すなわち、ヒトLT100ユニット/m
に等量のハイブリドーマ培養上清を加え、37℃で１時
間反応後、L929細胞障害活性試験に供した。
ISA法のスクリーニングに供し、ヒトLT結合能の強いも
のを選択した。これらについては、さらに参考例１記載
のL929細胞障害活性試験を用いて、ヒトLTの活性に対す
る中和能を測定した。すなわち、ヒトLT100ユニット/m
に等量のハイブリドーマ培養上清を加え、37℃で１時
間反応後、L929細胞障害活性試験に供した。
これらの結果、ヒトLTと結合し、かつ、その細胞障害
活性を中和するMoAb産生ハイブリドーマLT3−11およびL
T3−135が得られた。これらの免疫グロブリンクラス・
サブクラスはオークターロニー法による測定で、それぞ
れIgG2bおよびIgG2aであった。
活性を中和するMoAb産生ハイブリドーマLT3−11およびL
T3−135が得られた。これらの免疫グロブリンクラス・
サブクラスはオークターロニー法による測定で、それぞ
れIgG2bおよびIgG2aであった。
クローン化されたハイブリドーマを、10％FCSを含む
イスコフ−ハム混合培地（Ｉ−Ｈ培地）中37℃、５％CO
2濃度インキュベーターを用いて培養し、その上清より
抗体を得た。
イスコフ−ハム混合培地（Ｉ−Ｈ培地）中37℃、５％CO
2濃度インキュベーターを用いて培養し、その上清より
抗体を得た。
一方、多量の抗体を得るためには、予め0.5m鉱油を
腹腔内投与したBALB/cマウスに５×106個のハイブリド
ーマを腹腔内接種した。約10−15日後に腹水の貯溜が見
られた。
腹腔内投与したBALB/cマウスに５×106個のハイブリド
ーマを腹腔内接種した。約10−15日後に腹水の貯溜が見
られた。
抗体の精製は常法により、45−50％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画後、DEAE−セルロースおよびプロテインＡカ
ラムクロマトグラフィーに供し実施した。
ウムで分画後、DEAE−セルロースおよびプロテインＡカ
ラムクロマトグラフィーに供し実施した。
（３）菌体抽出液の調製 実施例８で取得したpTB860を用いて実施例11に記載の
方法で大腸菌形質転換体を調製し、さらにヒトLTを含む
菌体抽出液を得た。次いでこの粗抽出液を40％飽和硫酸
アンモニウムで塩析処理後、20mMリン酸緩衝液−1mMジ
チオスレイトール（pH8.0）を用いて透析した。
方法で大腸菌形質転換体を調製し、さらにヒトLTを含む
菌体抽出液を得た。次いでこの粗抽出液を40％飽和硫酸
アンモニウムで塩析処理後、20mMリン酸緩衝液−1mMジ
チオスレイトール（pH8.0）を用いて透析した。
（４）抗体カラムクロマトグラフィーによる精製 マウス抗ヒトLTモノクローナル抗体LT−311をホルミ
ルセルファイン（生化学工業販売）に結合させることに
より得られるイムノアフィニティカラムを、20mMリン酸
緩衝液−0.15mM NaCl−5mM EDTA（pH8.0）で平衡化した
のち、（３）で取得した菌体抽出液を添加し、同じ緩衝
液で十分に洗浄した。カラムに吸着したヒトLTを20mMリ
ン酸緩衝液−0.15mM NaCl−5mM EDTA（pH8.0）で透析し
た。
ルセルファイン（生化学工業販売）に結合させることに
より得られるイムノアフィニティカラムを、20mMリン酸
緩衝液−0.15mM NaCl−5mM EDTA（pH8.0）で平衡化した
のち、（３）で取得した菌体抽出液を添加し、同じ緩衝
液で十分に洗浄した。カラムに吸着したヒトLTを20mMリ
ン酸緩衝液−0.15mM NaCl−5mM EDTA（pH8.0）で透析し
た。
（５）ゲルろ過カラムカルマトグラフィーによる精製 上記の抗体カラムより溶出されたヒトLT含有液を限外
ろ過により濃縮後、20mMリン酸緩衝液−0.15mM NaCl−5
mM EDTA（pH8.0）で平衡化したセファクリルＳ−200カ
ラムで精製・分離した。
ろ過により濃縮後、20mMリン酸緩衝液−0.15mM NaCl−5
mM EDTA（pH8.0）で平衡化したセファクリルＳ−200カ
ラムで精製・分離した。
（３）〜（５）の操作は全て低温下（５〜10℃）で実
施した。湿重量42gの菌体より3.3mgの精製ヒトLT標品が
得られた。
施した。湿重量42gの菌体より3.3mgの精製ヒトLT標品が
得られた。
実施例20 ヒトLT−ヒトトランスフェリン（hTf）複合物の調製 （１）マレイミド化hTfの調製 市販hTf5mgにジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し
た８倍モルのGMBSを添加し30℃で１時間反応させた。次
いで反応混合物を0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で平衡化
したセファデックスＧ−25カラムに供し未反応のマレイ
ミド化試薬を除去した。得られたマレイミド化hTfはhTf
1分子当り4.7分子のマレイミド基が導入されていた。
た８倍モルのGMBSを添加し30℃で１時間反応させた。次
いで反応混合物を0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）で平衡化
したセファデックスＧ−25カラムに供し未反応のマレイ
ミド化試薬を除去した。得られたマレイミド化hTfはhTf
1分子当り4.7分子のマレイミド基が導入されていた。
（２）ヒトLT−hTf複合物の調製 実施例19で取得したヒトLT〔Cys−Ser−Ala−Leu−Al
a−（22−171）〕1mgを1mlの0.1Mリン酸緩衝液−5mM ED
TA（pH6.5）に溶解し、次いで（１）で取得したマレイ
ミド化hTf 1mgを添加した。４℃で１夜反応後、10mMリ
ン酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−200カラムで
精製・分離したヒトLT−hTf複合物15mgを取得した。
a−（22−171）〕1mgを1mlの0.1Mリン酸緩衝液−5mM ED
TA（pH6.5）に溶解し、次いで（１）で取得したマレイ
ミド化hTf 1mgを添加した。４℃で１夜反応後、10mMリ
ン酸緩衝液で平衡化したセファクリルＳ−200カラムで
精製・分離したヒトLT−hTf複合物15mgを取得した。
（３）ヒトLT−hTF複合物の細胞障害活性 96穴マイクロプレートを用いて各種濃度のヒトLT−hT
f複合物含有液50μｌに腫瘍細胞1.0×104個を添加し、3
7℃で３日間培養した。培養終了後、参考例１記載の方
法で生細胞数を測定し複合物の細胞障害活性を評価し
た。
f複合物含有液50μｌに腫瘍細胞1.0×104個を添加し、3
7℃で３日間培養した。培養終了後、参考例１記載の方
法で生細胞数を測定し複合物の細胞障害活性を評価し
た。
結果は第３表に示した通りであった。ヒトLT−hTf複
合物はヒトLT抵抗性、ヒトトランスフェリンレセプター
（hTfR）陽性の腫瘍細胞に対して細胞毒性を示した。
合物はヒトLT抵抗性、ヒトトランスフェリンレセプター
（hTfR）陽性の腫瘍細胞に対して細胞毒性を示した。
実施例21 ヒトLT−抗hTfR抗体複合物の調製 （１）hTfRの精製 ヒト胎盤組織1.5kgを細かく切断しPBS（PH7.5）中で
ブレンドしたのち、遠心分離した。得られた沈渣を４％
トリトンＸ−100含有PBS中でホモゲナイズし、さらに超
音波処理後再び遠心分離した。次いで上清100m当り約
32gの硫酸アンモニウムを添加し塩析後、抗hTf抗体結合
カラムに供し0.5M NaCl含有PB（pH7.5）で十分に洗浄し
た。0.5M NaClおよび0.5％トリトンＸ−100含有0.02Mグ
リシン緩衝液（PH10.0）で溶出したhTfR画分を、さらに
hTf結合カラムに供し1M NaCl含有PBで洗浄後、1M NaCl
および１％トリトン X−100含有0.05Mグリシン緩衝液
（pH10.0）で溶出することによりhTfR精製標品約1.5mg
を得た。
ブレンドしたのち、遠心分離した。得られた沈渣を４％
トリトンＸ−100含有PBS中でホモゲナイズし、さらに超
音波処理後再び遠心分離した。次いで上清100m当り約
32gの硫酸アンモニウムを添加し塩析後、抗hTf抗体結合
カラムに供し0.5M NaCl含有PB（pH7.5）で十分に洗浄し
た。0.5M NaClおよび0.5％トリトンＸ−100含有0.02Mグ
リシン緩衝液（PH10.0）で溶出したhTfR画分を、さらに
hTf結合カラムに供し1M NaCl含有PBで洗浄後、1M NaCl
および１％トリトン X−100含有0.05Mグリシン緩衝液
（pH10.0）で溶出することによりhTfR精製標品約1.5mg
を得た。
（２）免疫および細胞融合 実施19−（２）に記載の方法に従い実施した。
（３）ハイブリドーマの選択およびクローニング 市販のウサギ抗マウスIgG抗体液20μg/mを96穴マイ
クロプレートに100μづつ分注し４℃で一夜放置後、
さらに２％ BSA 含有PBS（pH7.3）を添加して感作プレ
ートを作成した。また（１）で得たhTfR精製標品を常法
に従いHRP標識後ELISAに用いた〔北川常広：有機合成化
学、42、283（1984）〕。すなわち、上記第２抗体感作
プレートにハイブリドーマ培養上清を添加し室温で２時
間反応後、PBSで洗浄した。次いでHRP標識hTfRを添加し
さらに室温で２時間反応させた。
クロプレートに100μづつ分注し４℃で一夜放置後、
さらに２％ BSA 含有PBS（pH7.3）を添加して感作プレ
ートを作成した。また（１）で得たhTfR精製標品を常法
に従いHRP標識後ELISAに用いた〔北川常広：有機合成化
学、42、283（1984）〕。すなわち、上記第２抗体感作
プレートにハイブリドーマ培養上清を添加し室温で２時
間反応後、PBSで洗浄した。次いでHRP標識hTfRを添加し
さらに室温で２時間反応させた。
プレートを洗浄後、酵素基質としてオルソフェニレン
ジアミンおよびH2O2を含有する0.1Mクエン酸緩衝液を加
え、室温で酵素反応を実施した。1N硫酸で反応停止後、
マルチスキャン（フロー社製）を用いて波長492nmで発
色色素量を測定した。
ジアミンおよびH2O2を含有する0.1Mクエン酸緩衝液を加
え、室温で酵素反応を実施した。1N硫酸で反応停止後、
マルチスキャン（フロー社製）を用いて波長492nmで発
色色素量を測定した。
特に結合能の強いハイブリドーマについて限界希釈法
によるクローニングを実施し、抗hTfR抗体産生ハイブリ
ドーマ22C6を得た。本抗体のサブクラスはIgG1で、ヒト
腫瘍細胞株K562に高い親和性を示した。
によるクローニングを実施し、抗hTfR抗体産生ハイブリ
ドーマ22C6を得た。本抗体のサブクラスはIgG1で、ヒト
腫瘍細胞株K562に高い親和性を示した。
（４）マレイミド化抗体の調製 マウス抗hTfRモノクローナル抗体22C6を実施例20−
（１）記載の方法に従いマレイミド化した。抗体１分子
当りマレイミド基が約7.7個導入された複合物が得られ
た。
（１）記載の方法に従いマレイミド化した。抗体１分子
当りマレイミド基が約7.7個導入された複合物が得られ
た。
（５）ヒトLT−抗hTfR抗体複合物の調製 実施例20−（２）記載の方法に従い、マレイミド化抗
体1.5mgにヒトLT 1mgを反応させセファクリルＳ−200カ
ラムに供しヒトLT−抗hTfR抗体複合物1.9mgを精製・単
離した。
体1.5mgにヒトLT 1mgを反応させセファクリルＳ−200カ
ラムに供しヒトLT−抗hTfR抗体複合物1.9mgを精製・単
離した。
（６）ヒトLT−抗hTfR抗体複合物の細胞障害活性 実施例20−（３）記載の方法に従い、ヒトLT−抗hTfR
抗体複合物の細胞障害活性を測定した。
抗体複合物の細胞障害活性を測定した。
結果は第３表に示した通りであった。ヒトLT−抗hTfR
抗体複合物はLT抵抗性、hTfR陽性の腫瘍細胞に対して細
胞毒性を示した。
抗体複合物はLT抵抗性、hTfR陽性の腫瘍細胞に対して細
胞毒性を示した。
本明細書に記載のプラスミドpTB618,pTB622,ptrp781,
pTB773,pTB775,pTB858,pTB860,pTB864,pTB865およびpTB
866を保持するDH1株もしくはC600株（E.coli DH1/pTB61
8,E.coli C600/pTB622,E.coli DH1/ptrp781,E.coli DH1
/pTB773,E.coli DH1/pTB775,E.coli DH1/pTB858,E.coli
DH1/pTB860,E.coli DH1/pTB864,E.coli DH1/pTB865,E.
coli DH1/pTB866,E.coli DH1/pTB953,E.coli DH1/pTB10
04,E.coli DH1/pTB1005,E.coli DH1/PTB1006,E.coli DH
1/pTB1007）および動物細胞（マウス−マウスハイブリ
ドーマLT3−11およびマウス−マウスハイブリドーマ22C
6）の寄託機関の受託番号は第４表に示す通りである。
pTB773,pTB775,pTB858,pTB860,pTB864,pTB865およびpTB
866を保持するDH1株もしくはC600株（E.coli DH1/pTB61
8,E.coli C600/pTB622,E.coli DH1/ptrp781,E.coli DH1
/pTB773,E.coli DH1/pTB775,E.coli DH1/pTB858,E.coli
DH1/pTB860,E.coli DH1/pTB864,E.coli DH1/pTB865,E.
coli DH1/pTB866,E.coli DH1/pTB953,E.coli DH1/pTB10
04,E.coli DH1/pTB1005,E.coli DH1/PTB1006,E.coli DH
1/pTB1007）および動物細胞（マウス−マウスハイブリ
ドーマLT3−11およびマウス−マウスハイブリドーマ22C
6）の寄託機関の受託番号は第４表に示す通りである。
第１図は組み換えプラスミドpTB 694、第２図は組み換
えプラスミドpTB 773、第３図は組み換えプラスミドpTB
858、第４図は組み換えプラスミドpTB 864の組み立て
を示す模式図である。 第５、６、７、８および９図は各々、プラスミドpTB95
3、pTB1004、pTB1005、pTB1006およびpTB1007に保持さ
れるヒトLTムテインをコードする５′−末端DNA配列、
およびそれらから推測されるアミノ酸配列を示す。 各図中の略号、およびその意味は以下の通りである。 B:Bal I Ba:Bam H I Bg:Bgl II C:Cla I E:Eco R I H:Hind III N:Nsi I ＰもしくはPs:Pst I Pv:Pvu II S:Sal I X:Xho I B I:Bgl I E47:Eco 47 III
えプラスミドpTB 773、第３図は組み換えプラスミドpTB
858、第４図は組み換えプラスミドpTB 864の組み立て
を示す模式図である。 第５、６、７、８および９図は各々、プラスミドpTB95
3、pTB1004、pTB1005、pTB1006およびpTB1007に保持さ
れるヒトLTムテインをコードする５′−末端DNA配列、
およびそれらから推測されるアミノ酸配列を示す。 各図中の略号、およびその意味は以下の通りである。 B:Bal I Ba:Bam H I Bg:Bgl II C:Cla I E:Eco R I H:Hind III N:Nsi I ＰもしくはPs:Pst I Pv:Pvu II S:Sal I X:Xho I B I:Bgl I E47:Eco 47 III
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１８３６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１８３７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１８３６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８２ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２２８６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１８１３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２０５４ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/52 C12P 21/00 - 21/06 C12N 1/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有する蛋白質。 〔式中、R1がLys、R2がLeu−Ala−Leu−Thr、ｍが
１、R3がMet−His−Leu−Ala−His−Ser−Thr−Leu、
R1がSer、R2がLeu−Ala−Leu、ｍが１、R3がLys−Met−
His−Leu−Ala−His−Ser−Thr−Leu、R1がCys−Se
r、R2がAla−Leu−Ala、ｍが１、R3がLeu−Ala−His−S
er−Thr−Leu、R1がCys−Ser、R2がAla−Leu−Ala−L
eu−Ser−Asp−Lys−Pro、ｍが１、R3がAla−Ala−Gln
−Thr−Ala−Arg−Gln−His−Pro−Lys−Met−His−Leu
−Ala−His−Ser−Thr−Leu、R1がLys−Ser、R2がAla
−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Pro、ｍが１、R3がA
la−Ala−Gln−Thr−Ala−Arg−Gln−His−Pro−Lys−M
et−His−Leu−Ala−His−Ser−Thr−Leu、R1がLys−
Ser、R2がAla−Leu−Ala、ｍが１、R3がLeu−Ala−His
−Ser−Thr−Leu、R1がLsy−Ser、R2がAla−Leu−Ala
−Leu−Ser−Asp、ｍが０、R1がCys−Ser、R2がAla−
Leu−Ala−Leu−Ser−Asp、ｍが０、R1がCys−Ser、R
2がGly−Phe−Leu−Gly−Ser、ｍが１、R3がLeu、また
は10 R1がCys−Ser、R2がGly−Phe−Leu−Gly−Ser−Le
u−Lys−Pro、ｍが１、R3がAla−Ala−Gln−Thr−Ala−
Arg−Gln−His−Pro−Lys−Met−His−Leu−Ala−His−
Ser−Thr−Leuを示し、かつｎが０または１を示す。〕 - 【請求項２】下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含むことを特徴とするポリデオキシリボ核酸およびこ
れに相補的な配列を含むポリデオキシリボ核酸。 〔式中、R1がLys、R2がLeu−Ala−Leu−Thr、ｍが
１、R3がMet−His−Leu−Ala−His−Ser−Thr−Leu、
R1がSer、R2がLeu−Ala−Leu、ｍが１、R3がLys−Met−
His−Leu−Ala−His−Ser−Thr−Leu、R1がCys−Se
r、R2がAla−Leu−Ala、ｍが１、R3がLeu−Ala−His−S
er−Thr−Leu、R1がCys−Ser、R2がAla−Leu−Ala−L
eu−Ser−Asp−Lys−Pro、ｍが１、R3がAla−Ala−Gln
−Thr−Ala−Arg−Gln−His−Pro−Lys−Met−His−Leu
−Ala−His−Ser−Thr−Leu、R1がLys−Ser、R2がAla
−Leu−Ala−Leu−Ser−Asp−Lys−Pro、ｍが１、R3がA
la−Ala−Gln−Thr−Ala−Arg−Gln−His−Pro−Lys−M
et−His−Leu−Ala−His−Ser−Thr−Leu、R1がLys−
Ser、R2がAla−Leu−Ala、ｍが１、R3がLeu−Ala−His
−Ser−Thr−Leu、R1がLsy−Ser、R2がAla−Leu−Ala
−Leu−Ser−Asp、ｍが０、R1がCys−Ser、R2がAla−
Leu−Ala−Leu−Ser−Asp、ｍが０、R1がCys−Ser、R
2がGly−Phe−Leu−Gly−Ser、ｍが１、R3がLeu、また
はR1がCys−Ser、R2がGly−Phe−Leu−Gly−Ser−Leu
−Lys−Pro、ｍが１、R3がAla−Ala−Gln−Thr−Ala−A
rg−Gln−His−Pro−Lys−Met−His−Leu−Ala−His−S
er−Thr−Leuを示し、かつｎが０または１を示す。〕 - 【請求項３】遺伝子コードの縮重に基き、請求項１記載
のアミノ酸配列を変化させることなく、請求項２記載の
塩基の１又は２以上を置換して得られるポリデオキシリ
ボ核酸。 - 【請求項４】請求項２記載のポリデオキシリボ核酸およ
びこれに相補的な配列を含むポリデオキシリボ核酸、あ
るいは請求項３記載のポリデオキシリボ核酸と、複製可
能なベクターとからなる複製可能な組み換えDNA。 - 【請求項５】請求項４記載の複製可能な組み換えDNAで
形質転換された微生物又は細胞。 - 【請求項６】請求項２記載のポリデオキシリボ核酸およ
びこれに相補的な配列を含むポリデオキシリボ核酸、あ
るいは請求項３記載のポリデオキシリボ核酸のいずれか
のポリデオキシリボ核酸を複製可能なベクターに組入れ
て該ポリデオキシリボ核酸を含む複製可能な組み換えDN
Aを得、得られた該組み換えDNAで微生物または細胞を形
質転換させて該組み換えDNAを含有する形質転換体を
得、得られた該形質転換体を培養して該ポリデオキシリ
ボ核酸の有する遺伝情報を発現させることからなる、請
求項１記載の蛋白質の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1085724A JP2979321B2 (ja) | 1988-04-07 | 1989-04-06 | 新規組み換え型リンホトキシン |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8397288 | 1988-04-07 | ||
| JP63-83972 | 1988-04-07 | ||
| JP1085724A JP2979321B2 (ja) | 1988-04-07 | 1989-04-06 | 新規組み換え型リンホトキシン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0265793A JPH0265793A (ja) | 1990-03-06 |
| JP2979321B2 true JP2979321B2 (ja) | 1999-11-15 |
Family
ID=26425008
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1085724A Expired - Lifetime JP2979321B2 (ja) | 1988-04-07 | 1989-04-06 | 新規組み換え型リンホトキシン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2979321B2 (ja) |
-
1989
- 1989-04-06 JP JP1085724A patent/JP2979321B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0265793A (ja) | 1990-03-06 |
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