JPS6140221A - 腫瘍壊死因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明はリンホカイン類に関する。更に詳しくは、本発
明はリンパ細胞から分泌される細胞毒性因子類、並びに
それを組換え細胞内で製造する方法に関する。 従来技術 Ｂ細胞、Ｔ細胞、天然のキラー細胞およびマクロファー
ジ等の免疫細胞は、正常細胞にとっては無毒であるが、
腫瘍細胞に対しては細胞毒性作用を及ぼす物質を産生す
ることが知られている。これらの物質には様々な名称、
例えばリンホトキシン、腫瘍壊死因子、ＮＫ細胞細胞毒
性因子、出血性壊死因子、マクロファージ細胞毒素また
はマクロファージ細胞毒性因子の如き名称が付されてい
る。現時点において、これらの名称の下で示されるタン
パク質は明確に同定されていない。それを困難ならしめ
ている根本的な点は、これらのタンパク質を検出するた
めに利用される生物学的分析によっては、これらを識別
することができないこと、また、天然に見出されるこれ
らタンパク質は凝集または加水分解産物の形をとってい
るらしいこと、更に、これまでに得られた量が余りに少
く、タンパク質を完全に特徴づけるのに必要とされる程
度にまで精製することができなかったこと、にある。 一般に５その様な細胞毒性物質は、免疫細胞の増殖刺激
物質であるとされている物質（ある種の「インジューサ
ー」って処理された無傷（インタクト）の動物の血清、
あるいは同じく処理されたリンパ細胞またはセルライン
の細胞培養物上清の中に見出される。処理後、血清また
は上清を回収し、標的とする腫瘍セルライン（細胞系統
用こ対する細胞毒性活性を測定する。標準的な標的はネ
ズミの腫瘍セルラインの、Ｌ−９２９である。 この種の型のバイオアッセイに用いられるセルライン、
または他のセルラインは、それに対して明らかに別々の
リンパ細胞産物が溶解作用を示すことから、非特異的な
溶解応答性を有すると思われる。インビトロにおける腫
瘍壊死分析においても。 同様に、非特異的応答が認められる。この様に、インビ
トロでの腫瘍細胞の溶解の観察、およびインビボでの腫
瘍壊死の観察に基く細胞溶解分析法は、種々の細胞毒性
リンパ球産物を識別するのには不適当である。 これまで、細胞毒性因子は、それが導かれるすンパ細胞
に基いて、仮に分類されてきた。例えば、リンホトキシ
ンは、ＢまたはＴリンパ細胞からの細胞毒性分ａ物、あ
るいはそれらから得られるセルラインに付される一般名
であり、他方、腫瘍壊死因子は、マクロファージまたは
それから導かりるセルラインの細胞毒性分泌物を表すの
によく用いられる。しかしながら、この分類システムで
は、その名称が唯１個のタンパク質を表している、ある
いは、名称の異るタンパク質は、事実工具なっている、
ということが何ら保証されていない。 各細胞型によって分泌される細胞毒性因子を精製し、確
認する試みがなされてきた。細胞毒性因子の性質に関す
る報告が様々に異っている、または、それらが特定の性
質に関して完全に食い違っているので、特徴づけが誤っ
ていたか、あるいは各細胞型から多数の別個の細胞毒性
因子が分泌されると結論することができる。例えば、マ
クロファージ、単球細胞または単球性七ルラインから導
かれる細胞毒性因子は、時に腫瘍壊死因子の名称で総括
されるが、単一の細胞毒性産物についての理論とは矛盾
した性質を有していることが報告されている。以下の文
献例を参照されたい：に、マクロ７７−−ｙ　７　（Ｒ
，Ｍａｃ　Ｆａｒｌａｎ　）ら、１９８０、’　ＡＪ　
ＥＢＡＫ″互炙（ｐＬ５）：４８９−５００；　Ｄ。 マネル（Ｄ、Ｍａｎｎｅｌ）ら、１９８０Ｃインフエク
シヨン・アンド・イムノロシイ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　
ａｎｄＩｍｎｕｎｏｌｏｇｙＪＪ　３ｏ　（２）：　５
２３−５３０　：　Ｈ，オオ＝’１（ＨｏＯｈｎｉｓｈ
ｉ）ら、英国特許出願２，１０６゜１１７Ａ：およびＪ
、ハ？−ストロム（Ｊ、Ｈａｍｍｅｒｓ　−ｔｒｏｍ）
１９８２ｒスカンＪ、イムノｏ　（Ｓｃａｎｄ　Ｊ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ　、　）　ｊ　１５　３１１　３１８゜
また、Ｃ，ザツハー・チャック（Ｃ：、　Ｚａｃｈａｒ
ｃｈｕｋ　）らは、モルモットのリンホトキシンとモル
モットマクロファージから得られる細胞毒性因子は免疫
学的に、同一ではないが似通っていることを示唆してい
る［１９８３、［プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミイ・オブ・サイエンスイズ（プロナス
）　（Ｐｒｏｃ、ＮａＬ　、ＡＣａｄ　、５ｃｉＪＵ　
Ｓ　Ａ　Ｊ　８０　：　６３４１−６３４５　］。ラフ
（Ｒｕｆｆ）らも同様の結論に達している〔リンホカイ
ン（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅす２巻ＰＰ２３５−２７２、
ＰＰ２４１−２４２〕。 免疫性細胞毒性因子の特徴づけは、免疫原性抗原にさら
された動物の血清または腹水を出発物質として集中的に
行われた。これらの供給源は単一のセルタイプまたはセ
ルラインから得られる産物（類）とは対照的に、緊張（
ストレスつ状態下にある免疫システムの蓄積物の全てを
含有している。 これに関連する出版物の例を次に挙げる：Ｓ、Ｓリグ７
（Ｓ、Ｇｒｅｅｎつら、１９８２ｒジエイ・ナト・力７
サ−・イ７スｉ　（Ｊ、Ｎａｔ　、Ｃａｎｃｅｒ　　Ｉ
ｎ　−５ｔ）」閃（６）　：　９９’７−１００３　Ｃ
ｒ腫瘍壊死−誘導因子（Ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ
　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ｆａｃｔｏす」〕；■（、エノモ
ト（Ｈ，Ｅｎｏｍｏｔｏ）　　ら、ヨーロッパ特許出願
８６４７５　［ｒ抗腫瘍物質（ａｎｔｉｔｕ−ｍｏｒ　
５ｕｂｓｔａｎｃｅ）Ｊ　〕：　Ｈ，ｊ−’７　トゲン
（Ｈ，Ｏｅｔｔ−ｇｅｎ　）ら、１９８０　［：　ｒが
ん研究における最近の成果（Ｒｅｃｅｎｔ　Ｒｅ５ｕｌ
ｔｓ　Ｃａｎ５ｅｒ　Ｒｅｓ、）　Ｊ）７５：２０７−
２１２　　［ｒ腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏ
ｓｉｓｆａｃｔｏｒ　）　、　Ｊ　］　：　　Ｆ、り／
ｌ／　（Ｆ、Ｋｕｌ　１つら、１９８１「ジャーナル・
オブ・イムノロシイ（Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ〕」遅狙
（４）：　１２７９−１２８３（ｒ腫瘍細胞細胞毒素：
Ｊ）：Ｄ、７７ネル（Ｄ、　Ｍａｎｎｅｌ　）ら、１９
８０ｒインフエクシヨン・アンド・イムニテイ（Ｉｎｆ
ｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）Ｊ　２８（
１）　：２０４−２１１　（ｒ細胞毒性因子Ｊ、ｌ；Ｎ
、マシュー（Ｎ、Ｍａｔｔｈｅｗｓ）ら、１９８０　ｒ
ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・カンサー（Ｂｒ　
、Ｊ、Ｃａｎ５ｅｒ〕」す１４１６〜４２２　（ｒ腫瘍
壊死因子」）；Ｓ、グリ−７（Ｓ、Ｇｒｅｅｎ）ら、１
９７６　ｒプロナス（Ｐｒｏｃ　、Ｎａｃ　、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ　、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ　Ｊ　：　　７３（２）
：　３８１−３８５（ｒ血清因子ｊ　）　：　Ｎ、サト
ミ（Ｎ、Ｓａｔｏｍｉ）ら、１９８１、　「ジャパニー
ズ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メゾイソ
７　（Ｊｐｍ　Ｊ　、ＥｘｐｌＭｅｄ、　）」５１（６
）：３１７−３２２：Ｎ、７シユース（Ｎ、Ｍａｔｈｅ
ｗｓ）１９７９　ｒブリティッシュ・ジャーナル・オブ
・カンサー（Ｂｒ　、Ｊ　、Ｃａｎｃｅｒ）Ｊ４０　：
５３４　５３９　　（ｒ腫瘍壊死因子」）：に−”ラナ
カ（Ｋ　、　Ｈａｒａｎａｋりら。 １９８１ｒジヤパニーズ・ジャーナル・オブ・工クスペ
リメンタル・メデインンＪ　５１（３）：　１９１−１
９４　（ｒ腫瘍壊死因子」；　およびり、オールド（Ｌ
、０１ｄ）ら、ヨーロッパ特許出願９０８９２；Ｔ、ウ
メダ（Ｔ、Ｕｍｅｄａ　）ら、１９８３　ｒ、ｌ胞オよ
び分子生物学（Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ月盈隻（５）　：３４９−３５
２　：およびＨ。 エノモトら、１９８３ヨーロッパ特許出願８６，４７５
゜その他の参照文献として、Ｊ、ニツセンーメイヤ−（
Ｊ　、Ｎｉ　５ｓｅｎ　−Ｍｅｙｅｒ　）ら、１９８２
　　ｒ感染と免疫（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍ
ｍｕｎｉｔｙ　）　４３８　Ｃ１）　’６７−７３　：
　Ｊ、クロスターガード（Ｊ　、Ｋｌｏｓｔｅｒ　−ｇ
ａａｒｄＪら、１９８１　Ｆモレキュラー・イムノロシ
イ（Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ　）　Ｊ　１８（１２）
：　１０４９−１０５４；Ｎ、スラーネ（Ｎ、５ｌｏａ
ｎりら、アメリカ特許４゜３５９．４１５　；およびＨ
，ハヤシ（Ｈ，Ｈａｙａｓｈりら。 アメリカ特許４．４４７．３５５　：に、　ハナマカ（
Ｋ、Ｈａｎａｍａｋａ）ら、１９８３．ヨーロッパ特許
出願９０゜８９２；およびＧ、グランガー（Ｇ、Ｇｒａ
ｎｇｅｒ）ら２１９７８　ｒセルラー・イムノロシイ（
ＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）　Ｊ　３８
　：　３８８−４０２゜ヨーロッパ特許出願公開番号１
００６４１　　には、実質上ヒト−リンパ芽球様細胞培
養に起因する不純物を含まない様に精製された細胞毒性
ポリペプチドに関する記載がある。このポリペプチドは
。 これと、他の文献記載のリンホトキシンの名前を有する
ポリペプチドとの関係は推測の域を出ないが、リンホト
キシンと命名された。このポリペプチドが、ザツハチャ
ックら（同上りの示唆した、免疫細胞によって生成され
る単独の細胞毒性ポリペプチドであるか、または、それ
が細胞毒性因子の潜在ファミリイの一員であるのかはわ
かっていない。 上記１００６４１出願のポリペプチドは２つのアミノ末
端を有しており、大きい方の変異型のアミノ末端は、Ｌ
ｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈ
ｒＰｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　
Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　ＨｉｓＰｒｏ　Ｌｙｓ　Ｍｅ
ｔ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ
　、、、。 であり、小さい万の変異型のアミノ末端はＨｉｓＳｅｒ
　Ｔｈｒ　Ｌ６ｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　
、　、　、の如く先端を切断されている。 先行文献によると、いくらかの抗腫瘍活性を示し、Ａｌ
ａＡｌａ　　アミノ末端を有するが、その特徴づけが殆
んどなされていないタンパク質であるインターフェロン
（イギリス特許出願公開番号２，１１７゜３８５Ａ、ｌ
が、非−リンホトキシン細胞毒性因子の候補者とされて
いる。明らかに、本発明の腫瘍壊死因子はインターフェ
ロンでもリンホトキシンでもなく、また、ＡＩａＡｌａ
　　アミノ末端を有していない。 本発明の目的は、　（ａ）　ＩＪンホトキシン以外の腫
瘍壊死因子が存在するか否かを確定すること、および、
もし存在するならば、それを、他の同様の因子類と明瞭
に区別し得る方法で同定する；（ｂ）その様な因子を、
誘導細胞培養（多額の経費を要し、生産物は誘導用の試
薬で汚染されている〕または末梢血管リンパ球の誘導（
経済上、非実用的であり、再生産性

【こ乏しく、得られ
る産物はホモローガスな細胞や血漿タンパク質で汚染さ
れているり以外の方法で生産する：（Ｃ）その様な腫瘍
壊死因子をコードしているＤＮＡを得、該ＤＮＡを組換
え培養中で発現させる；（ｄ）その様な因子を組換え培
養中で成熟な形で発現させる；（Ｃ）その様な因子の暗
号配列または構造を改良Ｔる；（ｆ）その様な因子を治
療用投与剤形に製剤化し、それを、腫瘍の治療のために
、動物に投与する；そして（ｇ）その様な因子に関連し
た診断用試薬を製造することにある。 要約 本発明者らは、細胞毒性因子をホモジーニティ（同質り
な程度にまで精製し、特徴付けを行い、組換え培養内で
発現させることに成功した。便宜−上、この因子を腫瘍
壊死因子（ＴＮＡ）と称することとし、その定義を後述
する。この物質は細胞培養から、比活性約１０７単位／
タンパク質ｑ以上、通常約１０８単位／ｍｇ以上を示す
ものとして、実質上、ｍｌモジーニアス（同質のりな形
で得られる。 組換え培養内で生成されたヒト腫瘍壊死因子は、該腫瘍
壊死因子と一緒に患者に投与されても、その性質および
量において生理学的に許容し得るものである非−ヒト細
胞成分（タンパク質を含む〕を含んでいることを特徴と
する。通常、これらの成分は、酵母、原核細胞およびよ
り高等な非−ヒト真核細胞ｊこ由来し、重量比で約１％
以下の、不純物含有量として無毒な程度に存在している
。更に、組換元細胞培養によって、ホモローガスナ（同
質の）タンパク質を全く含まない腫瘍壊死因子を生産す
ることができる。ホモローガスなタンパク質とは、天然
に見出される如く、正常な状態で、腫瘍壊死因子に伴な
っているタンパク質であり、例えば、細胞内での細胞分
泌物または体液等である。ヒト腫瘍壊死因子にとってホ
モローガスなタンパク質の１例はヒト血清アルブミンで
ある。ヘテロローガスな（異質のノタンパク質とは逆に
、天然状態では問題の腫瘍壊死因子に随伴せず、あるい
はそれと−緒に見出されることのないタンパク質である
。 本発明に係るＤＮＡには腫瘍壊死因子がコードされてお
り、組換えまたは形質転換培養中で発現したとき、移し
い量の腫瘍壊死因子を与える。このＤＮＡは、誘導され
た単球性（モノサイティック〕セルラインからのｍＲＮ
　Ａの逆転写によって得られたｃＤＮＡであり、イント
ロンを含まず、また、ｍＲＮＡの供給源である生物の、
他のタンパク質をコードしている非翻訳領域を全く含ん
でいない、新規なＤＮＡである。 ＴＮＦをコードしている染色体ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ
ライブラリィをＣＤＮＡでプローブすることにより、得
ることができる。染色体ＤＮＡは他のタンパク質をコー
ドしている非翻訳領域を含まないが、イントロンは含ん
でいるであろう。 単離した腫瘍壊死因子はヌクレオチドの置換、欠失また
は挿入によって容易に修飾され、腫瘍壊死因子またはそ
の誘導体をコードしている新規なＤＮＡ配列を与える。 これらの修飾を施されたＤＮＡ配列（改良配列）は、突
然変異腫瘍壊死因子の生産、及び成熟腫瘍壊死因子の直
接的な発現のために用いられる。改良配列は１選択され
た宿主−ベクター系における腫瘍壊死因子の発現の促進
にとっても有用である（例えば、宿主細胞に好都合なコ
ドンと適応すべく修飾するり。 これらの新規なＤＮＡ配列およびそのフラグメントをラ
ベルし、腫瘍壊死因子をコードしている遺伝物質のハイ
ブリダイゼーション・アッセイに用いることができる。 腫瘍壊死因子を合成するには、腫瘍壊死因子をコードし
ているＤＮＡを複製可能な（再生産性の）ベクターにラ
イゲートし、このベクターを用いて宿主細胞を形質転換
し、この宿主細胞を培養してその培養から腫瘍壊死因子
を回収する。この一般工程を用い、ベクターの組立て万
および形質転換に用いる宿主の選択に応じて、単球性腫
瘍壊死因子の特徴を有する腫瘍壊死因子を組立てたり、
腫瘍壊死因子の新規な誘導体を組立てることができる。 本発明に従って合成し得る腫瘍壊死因子種（ｓｐｅｃｉ
ｅリ　には、成熟腫瘍壊死因子〔バリル（バリン）アミ
ノ末端つ、プレ腫瘍壊死因子（本明細書中で定義する［
プレＴＮＦＪ）並びに以下のＴＮＦ誘導体：（ａ）ＴＮ
Ｆまたはそのフラグメント（成熟腫瘍壊死因子を含む〕
と他のタンパク質またはポリペプチドとが、ＴＮＦ＊た
はそのフラグメントのアミノおよび／またはカルボキシ
末端において、ペプチド結合を介して結合している融合
タンパク質：　（ｂ）　　Ｔ　Ｎ　Ａフラグメント（成
熟腫瘍壊死因子またはプレＴＮＦのフラグメントを含む
〕であって、そのフラグメントのアミノ末端が何らかの
プレタンパク質やアミノ酸である様なＴＮＦフラグメン
ト；（ｃ）ｔまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換、挿
入または欠失されているＴＮＦ突然変異体またはそのフ
ラグメント（成熟腫瘍壊死因子を含む〕；および／また
は、（ｄ）　　上記タンパク質、フラグメントあるいは
突然変異体のアミノ末端に、メチオニルまたは修飾され
たメチオニル（メチオニル誘導体、例えばホルミルメチ
オニルあるいは保護されたメチオニル種）が付加するこ
とにより得られる物質が含まれる。 通常、哺乳類細胞を（ａ）　　腫瘍壊死因子の全構造遺
伝子（５′開始コドンを含む〕あるいは（ｂ）　　真核
性分泌リーダー（これには、腫瘍壊死因子分泌リーダー
のプレ配列を含んでいてよい〕と機能的にライゲート（
結合りしている、成熟腫瘍壊死因子または腫瘍壊死因子
誘導体の遺伝子を含有するベクターによって形質転換し
、この細胞を培養した後、該培養から成熟腫瘍壊死因子
を回収する。 同様に、形質転換すべき宿主（通常、これはリーダー配
列の供給源である月こよって適切にプロセス（処理りさ
れる分泌リーダーと機能的にライゲートしている場合に
、この宿主をベクターで形質転換して培養すれば、アミ
ン末端にメチオニルあるいは保護されたメチオニルを有
しない腫瘍壊死因子が合成される。特に、成熟腫瘍壊死
因子をコードしているＤＮＡの５′と、５ＴＩＩエンテ
ロトキシンシグナルポリペプチドをコードしているＤＮ
Ａとがライゲートしているベクターによって形質転換さ
れた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）は、ハイブリッド−プレタ
ンパク質を高い比率で適切ｔこプロセスし、成熟腫瘍壊
死因子を与える。分泌リーダーおよび宿主細胞はまた、
成熟タンパク質を細胞壁周囲（ペリプラズマ月こ適切に
移行させるべく選択される。 アミノ酸配列の変化またはグリコジル化以外による腫瘍
壊死因子誘導体もまた本発明の範囲内に含まれる。その
様な誘導体は、化学的な部分に対し、共有（コバレント
）結合的または集合（アグリゲート〕的に結合している
。これらの誘導体は、一般に３つのクラスに分けること
ができる：塩、側鎖および末端残基の共有結合的修飾物
、および吸着コンプレックス。 もしも成熟腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡがベク
ター内に機能的にライゲートしているならば、このベク
ターを用いて宿主細胞を形質転換し、この細胞を培養す
ると、この細胞の細胞質内に成熟腫瘍因子が見出される
。従って、成熟＠瘍壊死因子を得るために分泌系を配慮
する必要がない。これは、普通ならば、直接発現によっ
て得られるタンパク質はメチオニル化されたタンパク質
であることから、驚異的な事柄である。その上、このタ
ンパク質は組換え宿主細胞培養内で安定かつ可溶性であ
る、即ち、これは、細胞内プロテアーゼ（タンパク分解
酵素）によりタンパク分解的に開裂されたり、屈折性物
質として沈降したりＴることがない。従って、本発明は
下等な真核細胞または原核細胞であって、その細胞質に
メチオニル化されていない成熟腫瘍壊死因子を含有して
いる細胞からなる新規な発酵物質を提供するものである
。 腫瘍壊死因子は動物のセルライン〔例えば４−β−ホル
ボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭ
Ａ）の存在下で増殖させて誘導した単球性セルライン学
あるいはハイブリドーマまたはＥＢＶ形質転換細胞（ア
メリカ特許４，４６４゜４６５）の如き不死のセルライ
ン〕を培養することによって製造することができるが、
以下に述べる如く、組換え細胞培養を用いて合成するこ
とが好ましい。 腫瘍壊死因子か発酵によって製造されたならば、通常、
培養液上清または細胞溶解液上清を回収して固型物質を
除去し、この上清混合物（腫瘍壊死因子と他のタンパク
質を含む）中の腫瘍壊死因子を疎水性物質に吸着させ、
該物質から腫瘍壊死因子を溶離し、次いで腫瘍壊死因子
を三級アミノ陰イオン交換樹脂に吸着させ、該樹脂から
腫瘍壊死因子を溶離し、更に腫瘍壊死因子を実質上均一
な粒径の陰イオン交換樹脂（好ましくは四級アミノ−置
換樹脂りに吸着させ、該樹脂から腫瘍壊死因子を溶離す
ることにより、精製する。所望により。 この腫瘍壊死因子組成物は、その精製過程の任意の段階
で、例えば等電点泳動法の如きクロマトフォーカス法や
セファデックスＧ−２５の如きふるいゲルを通す方法等
によって濃縮および精製される。 組換え細胞培養または誘導細胞培養から精製された腫瘍
壊死因子は、治療に用いるために生理学的に無毒な安定
剤および賦形剤と一緒にし、投薬ビン内で凍結乾燥して
投与剤形に製剤１ヒしたり、安定化された水性製剤中で
保存しておく。あるいは、腫瘍壊死因子をポリマー・マ
トリックスに組み込み、腫瘍そのもの、あるいは腫瘍切
除術後の外科的部位に植え込み、該腫瘍壊死因子が局所
的に高い濃度勾配で好機に放出される様にすることもて
きる。 本発明の組成物は、リンホトキシンおよびインターフェ
ロン、その他文献記載の細胞毒性タンパク質を含まない
状態で得られる。しかしながら、治療に用いる際には、
予め定めた量のリンホトキシンおよび／またはインター
フェロンと一緒に腫瘍壊死因子を用いるのが良い。腫瘍
壊死因子とγ−インターフエロン等のインターフェロン
を含ム組成物は、それらが相乗的な細胞毒活性を現すこ
とが知られているので、特に有用である。 腫瘍壊死因子組成物は、動物、特に悪性腫瘍に罹患して
いる患者に対してその治療有効量を投与される。治療に
好適な用量は治療に携わる関係者にとっては自明であり
、詳細については後述する。 図面についての説明 第１図は調節多孔性ガラスからの腫瘍壊死因子の溶離像
を示す。 第２図はジエチルアミノエチルセルロースからの腫瘍壊
死因子の溶離像を示す。 第３図は高速タンパク質液体クロマトグラフィーからの
腫瘍壊死因子の溶離像を示している。 第４図本はクロマトフオーカシング番こおける腫瘍壊死
因子の溶離像を示している。 第５図はＳｏＳ　　ＰＡＧＥゲル電気泳動で求めた腫瘍
壊死因子の分子量を示している。 第６図は腫瘍壊死因子の分子量を示すＨＰ　ＬＣ溶離像
である。 第７図はＨＰＬＣＣ４カラムからの腫瘍壊死因子の溶離
像を示している。 第８図は腫瘍壊死因子のトリプシン消化フラグメントの
１（ＰＬＣによる分離状態を示すグラフである。 第９図はγ−インターフエロンと腫瘍壊死因子との混合
物の細胞毒性作用を示している。 第１０図は全腫瘍壊死因子分泌リーダーを含む、プレー
ヒト腫瘍壊死因子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を
示している。 第１１図はヒト腫瘍壊死因子の発現ベクターの組立て模
式図である。 詳しい記述 本明細書中、腫瘍壊死因子という物質は、好ましい細胞
毒性活性を有する、リンホトキシン以外のポリペプチド
であって、第１０図に示した成熟腫瘍壊死因子のアミノ
酸配列と機能的なアミノ酸ホモロジイ（相同性つを示す
領域を持つポリペプチド、またはそのフラグメント、あ
るいはそれらポリペプチドまたはフラグメントの誘導体
を対象とするものと定めるっ 好ましい細胞毒性活性とは、同一条件下での正常細胞と
の比較において、腫瘍細胞を好都合に破壊し、またはそ
の増殖を阻害する活性をいう。好ましい細胞毒性活性は
、インビボまたはインビトロにおいて、ポリペプチドの
腫瘍細胞に対する作用を、正常細胞または正常組織に対
する作用と比較Ｔることにより、検出される。細胞溶解
作用は針である。しかしながら、細胞毒性活性は静細胞
（ｃｙ【ｏｓｔａｓｉり活性または抗増殖活性として発
現することもある。好適なアッセイ（分析つシステムは
良く知られている。例えば、腫瘍壊死因子の比活性を測
定するための細胞溶解分析は、次の文献に記載されてい
る分析法で行うことができる：Ｂ、７ガーワ／ｌ／　（
Ｂ　、Ａｇｇａ　ｒｗａ　ｌ　）ら、［胸腺ホルモンと
リンホカイ７　（Ｔｂｙｍｉｃ　Ｈｏｒｍｏｎｓ　ａｎ
ｄ　Ｌｙｍ−ｐｈｏｋｉｎｅｓ月１９８３　　Ａ、ゴー
ルドスタイン（Ａ。 Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）編、スプリングシンポジウム・オ
ン・ヘルスサイエンスイズ（Ｓｐｒｉｎｇ　Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ　ｏｎＨｅａｌｔｈ　５ｃｉｅｎｃｅリ　ジョ
ーシワシントン大学メディカルセンター（この文献中で
言及されているＡ３４９セルラインは、ＡＴＣＣから、
ＣＧＬＩ８５の下で入手可能である）。 本明細書中では、ＴＮＦの比活性を静細胞作用ではなく
、標的細胞に対する溶解作用を意味するものとする。腫
瘍壊死因子１単位を、実施例１に示す如く、各ウェル１
こ入れた標的細胞の内、５０チを溶解させるのに必要な
量と定義する。しかしながら、このことは他の比活性測
定法、例えば標的細胞の増殖速度に基く方法等を排除す
ることを意味するものではない。 プレＴＮＦは、前記の腫瘍壊死因子に関する定義内に包
含される腫瘍壊死因子様である。この物の特徴は、分子
内【こ、転写された後、タンパク質を細胞の内、あるい
は外のいずれに存在せしめるかの指令を行う機能を有す
る、シグナル（またはリーダー〕ポリペプチドを有Ｔる
ことにある。 一般に、シグナルポリペプチド（それ自身は本来、腫瘍
壊死因子活性を有することを要しない）は、タンパク質
を宿主細胞のペリプラズマ（細胞壁外）あるいは培地に
移行させる過程において、即ち分泌プロセスの一行程に
おいて、腫瘍壊死因子活性を有する残余タンパク質から
タンパク分解的に切す離される。このシグナルペプチド
は微生物起源であっても哺乳動物起源（固有の、７６残
基から成るプレ配列を含む）であっても良いが、宿主細
胞とホモローガスなシグナルであることが好ましい。 正常な生物学的供給源から得られる固有の腫瘍壊死因子
は、後述の如くドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に基く分子量の
測定値が約１７，０００であり、等電点が約５．３であ
って、複数のトリプシン加水分解感受性部位を有してい
る。後述の条件下、逆相ＨＰＬＣで精製された固有の腫
瘍壊死因子はトリプシンによって少くとも９つのフラグ
メントに加水分解される。トリプシンによる加水分解で
腫瘍壊死因子が正確にいくつのフラグメントに分れるか
は、トリプシンの活性、腫瘍壊死因子の濃度並びにイオ
ン強度、ｐＨ％温度およびインキュベ−ショア時間等の
インキュベーションパラメーターによって左右される。 腫瘍壊死因子は、レクチンアフイニテイ力ラムに保持さ
れず、また、推定アミノ酸配列分析において何ら、グリ
コジル化部位と思われる部位が認められないことから、
糖タンパク質ではないと思われる。また、組換え大腸菌
培養（グリコジル化機能を有しない月こおける生産物は
、５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、天然のＴＮＦと共−泳動
（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔすする。 ある候補タンパク質が本発明に係る腫瘍壊死因子の定義
の範囲内に含まれるのに必要なアミノ酸配列上のホモロ
ジイの程度は、該タンパク質と腫瘍壊死因子とのホモロ
ジイ部分が腫瘍壊死因子の細胞毒性活性に係る領域内に
あるか否かによって左右される；前の定義内に含まれる
ためには、細胞毒活性に臨界的な領域でのホモローガス
は高くなければならないが、腫瘍壊死因子のコンホメー
ションの維持に関与しない配列や受容体との結合に影響
しない配列の場合に要求されるホモロジイ一度はもつと
近くなる。また、臨界的な領域は、それが、機能的に類
似であるアミノ酸側鎖を含む残基で置換されている場合
には細胞毒性活性を示し、本明細書で定義したホモロー
ガスの範囲に止まる。機能的に類似、とは、側鎖の主な
性質、例えば塩基性、中性または酸性、あるいは立体的
な大きさを有するか否か、等に関して言う。ただし、本
明細書で定義される腫瘍壊死因子からは、特にリンホト
キシンは、除外される。 通常、腫瘍壊死因子は第１０図に示すタンパク質または
そのフラグメントと、約２０〜１００アミノ酸残基から
なる連続したブロック（範囲）（特に、残基、３５−６
６および１１０−１３３に囲まれたブロック内のアミノ
酸残基用こわたって実質上ホモローガスな領域を含有し
ている。 あるポリペプチドを腫瘍壊死因子であると同定する上で
最も重要なファクターは、第１０図に示す成熟腫瘍壊死
因子の細胞毒性活性を実質上中和し得る抗血清が、その
問題のポリペプチドの細胞毒性活性を実質上中和するこ
とができる。という点にある。しかしながら免疫学的な
同一性と細胞毒性上の同一性とは必ずしも同一枠内にあ
るわけではない、ということは明らかであろう。第１０
図の腫瘍壊死因子の中和抗体は、たまたま、その抗体が
腫瘍壊死因子の細胞毒性活性にとって臨界的な部位と特
異的に結合すべく形成されていないという理由で腫瘍壊
死因子の候補タンパク質と結合しないかもしれない。む
しろ、この中和抗体は、非活性な領域に結合し、立体障
害を介して中和効果を現わしているのかもしれない。従
って、この非活性な（無害な）領域に突然変異を生じた
候補タンパク質は最早中和抗体と結合しないが、それに
も拘らず、実質上ホモロジイという定義、およびその生
物学的活性という意味において、腫瘍壊死因子である。 末梢リンパ球培養または確立されているセルライン培養
から得られた、第１０図に示される固有のまたは野生型
の成熟ヒト腫瘍壊死因子に関する特徴、例えば分子量、
等電点等の値は、単にこれら固有の腫瘍製死因子種につ
いて示される値に丁ぎないということを知っておくこと
が重要である。 既にその定義について考慮した如く、腫瘍壊死因子には
、固有の腫瘍壊死因子の特徴の全てを現わすわけでない
、他の種のポリペプチドも含まれる。 本明細書中で定義した腫瘍壊死因子には、固有の腫瘍壊
死因子が含まれるが、その他の関連する細胞毒性ポリペ
プチドも該定義内に含まれる。例えば、前記の如き、Ｔ
ＮＦの挿入による突然変異体、欠失による突然変異体、
あるいは融合タンパク質等のＴＮＦ誘導体としての腫瘍
壊死因子の分子量は固有のヒト腫瘍壊死因子に関して確
立されている分子量の範囲外になるであろう（成熟腫瘍
壊死因子との融合タンパク質またはプレＴＮＦそのもの
、並びに挿入突然変異体の分子量は固有の成熟腫瘍壊死
因子のそれよりも大きく、他方、固有の成熟腫瘍壊死因
子の欠失による突然変異体の分子量はより小さい〕。同
様に、腫瘍壊死因子を工作してトリプシン等のタンパク
分解酵素による加水分解を受は難くすることもできる。 最後に、ヒト−プレＴＮＦが霊長類以外の哺乳動物に由
来するセルライン内で翻訳後のプロセッシングを受ける
と、アミノ末端領域に微妙な不均一性が生じ、アミン末
端のアミノ酸はバリンでなくなる。 ｃＤＮＡから推定されるヒト腫瘍壊死因子のアミノ酸配
列を第１０図に示した。成熟または固有の腫瘍壊死因子
は、アミノ酸残基１〜１５７で表わされる。この配列に
は、翻訳された転写物が正常にプロセッシングされて成
熟タンパク質となる間に除去されると思われる７６残基
のシグナル配列が含まれていることに注意されたい。ト
リプシンで加水分解される部位を矢印で示した。 １細胞毒活性を有する″あるいはインビボにおける１腫
瘍壊死作用を有する′という語句は、腫瘍壊死因子とい
う言葉が、例えば酵素的加水分解を受けて、酵素原に似
た不活性な形から、所望の生物学的活性を現わすポリペ
プチドフラグメントに転換され得るポリペプチドをも包
含している、ということを意味するものであることに注
目されたい。不活性な前駆体の代表例は、腫瘍壊死因子
のカルボキシ末端に、ヒトタンパク質またはそのフラグ
メントがペプチド結合を介して結合している融合タンパ
ク質である。インビボで、あるいは製造工程の一段階で
の、タンパク分解的加水分解を受は易くすることにより
、腫瘍壊死因子を放出させるために、このペプチド結合
またはその近くの配列を選択する。この様にして生成さ
れた腫瘍壊死因子は、明確な、所望の細胞毒活性を現わ
す。 通常、腫瘍壊死因子とはヒト−腫瘍壊死因子を表わすが
、ネズミ、ブタ、ウマまたはウシの様な他の供給源から
得られた腫瘍壊死因子も、それが、ホモローガス領域お
よび生物学的活性に関して述べた前の基準に合致する限
り、腫瘍壊死因子の定義内に含まれる。ＴＮＦは種特異
的でなく、例えばヒト−ＴＮＦはマウスの腫瘍に対して
活性である。従って、ある種から得たＴＮＦを他の種の
治療に用いることができる。 腫瘍壊死因子には重合形も含まれる。腫瘍壊死因子は自
然に凝集し１通常、二量体またはそれ以上のマルチマー
（こ重合する。マルチマーは細胞毒性を有するのでイン
ビボでの治療に用い得る。←実質上均質なマルチマー、
またはモノマーとして発現させ、回収することが好まし
いが、腫瘍壊死因子は、種々のマルチマーの混合物とし
ても治療上有用である。 腫瘍壊死因子の誘導体も腫瘍壊死因子という語句の範囲
Ｑ＋こ含まれる。これら誘導体には、アミノ酸配列にお
ける突然変異体、グリコジル化変異体、並びに他の化学
的物質との共有結合的または凝集（集合）的な結合に基
〈誘導体が含まれる。 共有結合的誘導体は、機能を有する物質と、ＴＮＦアミ
ノ酸側鎖に見出される基、あるいはＮ−またはＣ−末端
とを、当業者周知の方法で結合させることにより、得ら
れる。この様な誘導体の例を次に示す：　Ｔ　Ｎ　Ｆの
カルボキシ末端またはカルボキシ側鎖を有する残基（例
えばａｓｐｌｏ　）の脂肪族エステルまたはアミド誘導
体：５ｅｒ５２、ｓｅｒ　３．５ｅｒ４またはｓｅｒ　
５等のヒドロキシ含有残基の〇−アシル誘導体；アミノ
末端アミノ酸またはアミン基含有残基（例えばリンＡま
たはアルギニン）のＮ−アシル化誘導体；並びにＣｙｓ
　１０１　　およびｃｙｓ　５９　の誘導体。アシル基
をアルキル基（ｃ３〜ＣＩＯ直鎖アルキルを含む）の内
から選択することにより、アルカノイル種を得、または
炭素環状あるいは異項項状化合物から選択することによ
り、アロイル種を得る。反応に用いる基は、反応性の側
鎖グループを介してタンパク質を交差結合させ、不溶性
のマトリックス構造を形成させ得ることが自体既知であ
る三機能性化合物であることが好ましい。その様な誘導
体を生成させるのに好ましい残基部位はシスティンおよ
びヒスチジン残基である。 共有結合または凝集反応誘導体はイムノアッセイまたは
アフイニテイ精製法に用いることができる。例えば、腫
瘍壊死因子を臭化シアン−活性化セファロースと自体既
知の方法で共有結合的に結合させて不溶化するか、ある
いはポリオレフィン表面（グルタルアルデヒド交差結合
を持つまたは持たない月こ吸着させることにより不溶化
し、抗−ＴＮＦ抗体または細胞表面受容体の分析または
精製に用いる。また、腫瘍壊死因子を診断分析、特に競
合型イムノアッセイによって生物学的試料中のＴＮＦレ
ベルを測定する診断分析法に用いるために、例えば、ク
ロラミンＴ法によって放射性沃素化する、希土類キレー
ト化合物と共有結合させる。あるいは別の螢光成分と結
合させる、等の方法で標識する。この様な誘導体に要求
されるのは抗−ＴＮＦとの交差反応性のみてあって、細
胞毒活性を示す必要がないので、本発明のＴＮＦの定義
に該当しなくてもよい。 突然変異による腫瘍壊死因子誘導体には予め定められた
、即ち部位特異性の、ＴＮＦまたはそのフラグメントの
突然変異誘導体が含まれる。突然変異誘発の目的は、前
記の定義に従う腫瘍壊死因子を得ること、即ち、インビ
トロにおいて、腫瘍細胞に対する細胞毒作用を、そして
インビボにおいては腫瘍壊死作用を現わし、第１０図に
示した配列とホモロジイな残基を保持するものであって
、更に改良された特性および活性を有する腫瘍壊死因子
を得ることにある。突然変異腫瘍壊死因子は、欠失、置
換または挿入の結果、腫瘍壊死因子と異なるアミノ酸配
列を有しているが、そうでなければ本明細書中に記載、
の腫瘍壊死因子のホモロジイに関する定義に含まれる物
質であると定義する。 例えば、腫瘍壊死因子のリジンまたはアルギニン残基（
アルギニン２　、６　、８２　、４４　　および１３１
、リジン９８　、９０および６５）を、ヒスチジン等の
、上記タンパク質をタンパク分解的加水分解され難くす
るアミノ酸残基で置換する。同様に、酸化に対する安定
性を得るために、システィン１０１を他の残基で置換し
て化学的に交差結合させることもできる。生物学的には
不活性な突然変異体であっても、イムノアッセイにおけ
る試薬として標識したり固定化する上では有用であると
いう理由から、突然変異体は、腫瘍壊死因子として必要
な活性を必ずしも有していなくて良い。しかしながら。 この様な場合には、この突然変異体は腫瘍壊死因子に対
する抗体と交差反応し得る抗原決定基を少くとも１個保
持していることが必要である。 腫瘍壊死因子の分子領域中、残基３５〜６６および１１
０〜１３３（これらの数値を含む）の範囲はリンホトキ
シンと実質上ホモロジイ（５０％っである。これら両分
子の疎水性のカルボキシ末端（腫瘍壊死因子の１５０〜
１５７残基〕もまた、重要な保存的配列である。これら
両タンパク質は細胞毒活性および生体内腫瘍壊死作用を
示すので、上記の領域はリンホトキシンと腫瘍壊死因子
とに共通の活性にとって重要な部分であると考えられて
いる。従って、特定の細胞に対する腫瘍壊死因子活性に
、直接的な影響を及ぼすことを目的とする場合には、こ
れらの領域内の残基に突然変異を誘発することが好まし
い。相対的に非保存的な領域である腫瘍壊死因子の残基
６７−１０９は、それを囲む相対的；こホモローガスな
両領域を細胞毒活性にとって不可欠なコンホメーション
をとル様。 正しく位置させる機能を有しているのかもしれない。そ
の様な位置決めは腫瘍壊死因子のＣｙｓ５９−Ｃｙｓｌ
Ｏｌ　　ジ、ルフイド結合によってなされていると思わ
れ、リンホトキシンにおいても同様に、対応する領域で
なされているであろうが、この位置決めが、両分子の特
異性および活性における相違に関与しているのかもしれ
ない。この様番こ、これらの残基が腫瘍壊死因子の活性
中心（核）であると仮定されるので、それらを化学合成
するか欠失による突然変異を誘発Ｔることにより、腫瘍
壊死因子活性を有する切断された、鎖長の短いポリペプ
チドを得ることができる。 突然変異誘発部位は予め定めておくが、突然変異そのも
のを予め定めておく必要はない。例えば１３１位での突
然変異を適切に行うためには、アルギニン１３１に関す
るコドンに無作為な変異誘発を行い、発現された腫瘍壊
死因子突然変異体を、細胞毒活性とタンパク分解酵素耐
性の適当な組合わせについてスクリーニングする。既知
の配列を有するＤＮＡの予定の部位で置換突然変異を誘
発する方法はよく知られている（例、Ｍ１３プライマー
突然変異誘発）。 腫瘍壊死因子の突然変異誘発は、通常、アミノ酸残基数
約１〜１０程度の挿入、または約１〜３０残基の欠失が
含まれる。置換、欠失、挿入、またはそれらの併用、等
を組合わせて最終的な組立てを行う。挿入には、アミン
末端またはカルボキシ末端の融合、例えばカルボキシ末
端に疎水性の延長部分を付加すること、も含まれる。し
かしながら、置換的突然変異誘発だけを行うことが好ま
しい。言・うまでもなく、暗号ＤＮＡ内における突然変
異は、その配列をリーディングフレーム外に位置せしめ
るようなものであってはならず、また、ｍ　ＲＮ　Ａの
二次構造を形成させる可能性のある相補領域をつくらな
いことが好ましい。 腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡに於ける突然変異
の全てが最終的な分泌生産物として発現されるわけでは
ない。例えば、置換型のＤＮＡ突然変異体の主なものは
、固有のヒト分泌リーダーが、そのリーダー配列内での
欠失、または置換のいずれかによって異る分泌リーダー
またはシグナルで置き換えられ、固有のリーダー配列の
全部または大部分が所望の宿主によって一層認識され易
いリーダーに変化されたものである。例えば、原核性の
発現ベクタ・−を組立てるには、ヒト分泌リーダーを細
菌性のアルカリ性ホスファターゼまたは熱安定性エンテ
ロトキシン■リーダーに有利な様に欠失させ、酵母のた
めの発現ベクターを組立てるには、リーダー配列を酵母
インバターゼ、アルファ因子、または酸ホスファターゼ
・リーダーに好都合な様に置換する。しかしながら、ヒ
ト分泌リーダーはヒトセルライン以外の宿主によっても
認識されるが、高等な真核細胞の細胞培養内で最もよく
認識される。宿主によって分泌リーダーが゛認識”され
ると、通常、腫瘍壊死因子とリーダーからなる融合タン
パク質はリーダー−腫瘍壊死因子間のペプチド結合の位
置で切り開かれ、ついに、腫瘍壊死因子が分泌される。 この様に、宿主の形質転換に突然変異プレＴＮＦ　ＤＮ
Ａを用いても、そして、この突然変異プレＴＮＦが中間
体として合成されたものであっても、得られる腫瘍壊死
因子生産物は、通常、固有の成熟腫瘍壊死因子である。 腫瘍壊死因子誘導体として発現されないもう一つの主要
なＤＮＡ突然変異体は、発現を促進する様にヌクレオチ
ド置換を行なうものであり、それは、主として転写され
たｍＲＮＡ内でアミノ末端ループ構造が生じることを避
ける（同時出願係属中のＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　３０３．６
８７号参照）か、あるいは選択した宿主内で、より転写
され易いコドンを与える（例えば、大腸菌内で発現させ
るには、よく知られている大腸菌にとって好ましいコド
ンがある）ためにヌクレオチド置換を行なうものである
。 実質的にホモジーニアスな腫瘍壊死因子という語句は、
実質上、この腫瘍壊死因子が単離された供給源に固有の
他のタンパク質を含まない腫瘍壊死因子であることを意
味する。即ち、ホモジーニアスな腫瘍壊死因子は実質上
、アルブミン、フイブリノゲン、セリンプロテアーゼ、
α−グロブリン、リンホトキシンまたはインターフェロ
ンの如き腫瘍壊死因子以外の細胞毒性ポリペプチド等の
血漿タンパク質、あるいは腫瘍壊死因子の合成（生成）
場所を与える細胞または微生物に由来する他のタンパク
質（全細胞および微粒子状の細胞分層を含む）を含有し
ていない。しかしながら、ホモジーニアスな腫瘍壊死因
子は、後述する安定剤や賦形剤、並ひに合成場所を供給
する細胞や微生物に由来するタンパク質、腫瘍壊死因子
の供給源である細胞または微生物以外に由来するタンパ
ク質、およびポリーＬ−リジンの如き合成ポリペプチド
を、予め定めた量、含有していてもよい。異型的な（例
えば細菌性の）宿主細胞内で発現される組換え腫瘍壊死
因子は、遺伝子の供給源であるタンパク質を全く含まず
に発現されることは言うまでもない。 腫瘍壊死因子は組換え生物の培養内で好適に産生される
。末梢性の血中リンパ球（ＰＢＬｓ）もセルラインも好
ましくない。現実に、ある１つのクラスのＰＢＬを他の
クラスの細胞類で汚染されていない状態で得ること（例
えばＢまたはＴ細胞を伴なわずにマクロファージを得る
こと）は困難である。その様な汚染は、これら汚染に係
る細胞から他の細胞毒性因子やタンパク質が放出される
可能性がある故に、これら細胞の産物に適用される分離
行程を一層困難にする。その上、非組換え培養による腫
瘍壊死因子の製造は高い費用を要し、また、得られる腫
瘍壊死因子は固有の腫瘍壊死因子のみである。従って、
その培養は、組換え培養の如き腫瘍壊死因子の特徴を改
良する際の融通性を有しないものである。 腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡは、化学合成する
か、ＰＢＬまたはセルライン培養からのｍ　ＲＮ　Ａ逆
転写物をスクリーニングする、あるいは何らかの細胞か
らのゲノムライブラリィをスクリーニングすることによ
り、得ることができる。 適当なセルライン培養には、前骨髄球セルラインであっ
て当該技術分野で１−ＨＬ−６０Ｊと称されるもの（そ
の内の１つはＡＴＣＣからＣＣＬ２４０の下に入手可能
である）、あるいは組織球性リンパ腫セルラインＵ９３
７　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）の如き単球性セルライ
ンが含まれる。これから、並ひに他のセルラインは、こ
れらの細胞を、当該技術分野で周知の化学的または物理
的試薬（一般に、腫瘍誘発物質またはミトゲン性物質）
にさらすことにより、腫瘍壊死因子の発現および分泌を
誘導することができる。腫瘍壊死因子の誘導は、ある単
球性セルラインをＰＭＡで誘導することによってのみ、
効果的に行われる；その他の一般的な試薬である、リポ
多糖類、ブドウ球菌のエンテロトキシンＢあるいはチモ
シンα−１等は、これらのセルラインにおける腫瘍壊死
因子の誘導に関し、ＰＭＡ程、有効でない。あるセルラ
インを腫を含有するもの）であると分類するためには、
様々な量でスクリーニングしなければならないので、所
望の遺伝子を単純に合成する方が効率が良い。 合成法の場合には、以下に述べる様に、単一の制限部位
を導入することができ（そのことにより、天然の配列中
には存在しない制限部位を有する、ベクター内での遺伝
子の利用を促進することができ、また翻訳効率を高める
ための手段を構しることかできるので好都合である。 ＤＮＡは自体既知の方法に従い、螢光性の基、放射活性
な原子、あるいは化学発光性の基等の検出可能な物質で
共有結合的に標識される。次いで、この物質を通常のハ
イブリダイゼーションアッセイに適用する。その様なア
ッセイは、後述する実施例の如（ＴＮＦベクターおよび
形質転換体の同定、あるいは、血球中のＴＮＦｍＲＮＡ
の検出の如きインビトロでの診断に利用される。 意外にもＴＮＦのためのｍ　ＲＮ　Ａは、その原因は不
明であるが、おそらく不安定であるために、誘導された
ＨＬ−５Ｑ細胞内においてさえもかなり稀れにしか存在
しない。さらに、細胞を誘導してからＴＮＦｍＲＮＡが
現れるまでの時間の経過が重要である。ＴＮＦｍＲＮＡ
は、誘導後約４時間目に、極く短時間、細胞内に現れる
にすぎない。この出現までの時間に関して言えば、リン
ホトキシンは誘導後約１２時間目に現れることから、リ
ンホトキシンのそれとは全く異なっている。上記の事情
があるので、探し出すべき対象に関する知識がないと、
このｃＤＮＡは見過されてしまい勝ちである。しかしな
がら、一度その存在が正しく認識され、相補的なＤＮＡ
を得ることができた（本発明において開示している様に
）ならば、その様なＤＮＡ配列を有するプローブを用い
て誘導ＨＬ−６０またはＰＢＬのｃＤＮＡライブラリィ
をスクリーンすることは日常的な操作となる。実施例に
おいてスクリーンした２つのＨＬ−５Ｑフアージライブ
ラリイは、陽性プラークの数においてかなりの一致を示
しているので、日常的なハイブリダイゼーションアッセ
イによって所望のｃＤＮＡを含有しているファージを同
定することができることが明らかとなった。 まず、ＨＬ−５Ｑセルラインの腫瘍壊死因子−合成細胞
を、約８−１２ＸＩＱ５細胞／−の濃度に達するまで常
法通り培養する。培養混合物から細胞を除き、洗浄して
血清不含−培地に移し、ＰＭＡを含有する培地中で増殖
させる。次いて、培地中に腫瘍壊死因子が所望の濃度（
通常、約４００腫瘍壊死因子単位／ｍｅ）蓄積されるま
で培養を続ける。好ましくはその後、遠心分離その他の
、可溶性成分から細胞分層（断片）を分離し得る方法に
より、培養上清を澄ませる。遠心分離は、懸濁状態の粒
子だけを分離させる様、低速で行わねばならない。次い
で、上清を後述の如く精製する。 別法として、腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡを含
有するベクターで形質転換した宿主細胞内で該腫瘍壊死
因子を合成させる方法があり、これは好ましい方法であ
る。ベクターは複製可能なＤＮＡ組立て物である。本発
明においては、腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡの
増幅および／または腫瘍壊死因子をコードしているＤＮ
Ａの発現のためにベクターを用いる。発現ベクターは、
腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡと、その腫瘍壊死
因子の適当な宿主内での発現に影響を及ぼし得る適当な
コントロール配列とが機能的に結合してなる複製可能な
ＤＮＡ組立て物である。その様なコントロール配列には
転写プロモーター、転写をコントロールするための任意
のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡＩＪボゾーム結合
部位をコードしている配列、および転写および翻訳の終
止をコントロールするための配列が含まれる。 ベクターにはプラスミド、ウィルス（ファージを含む）
、および組込み可能なＤＮＡフラグメント（即ち、組換
えによって宿主のゲノム内に組込まれ得るもの）が含ま
れる。適当な宿主に導入（トランスフオーム）されると
、ベクターは宿主ゲノムとは独立に複製、機能し、また
は、ある場合にはゲノムそのものの中に組込まれる。プ
ラスミドは、今日最も普通に用いられるベクターである
か、本明細書中では、「ベクター」を、［プラスミド」
をも含む総括的な用語として用いることとする。しかし
ながら、同等の機能を有し、当該技術分野で知られてお
り、またはいずれ知られるであろう、その他の形のベク
ターも全て、本発明方法に用いるのに好適である。好適
なベクターは、発現させようとする宿主と適合し得る種
から導かれたレプリコンおよびコントロール配列を含ん
でいる。形質転換された宿主細胞とは、組換えＤＮＡ技
術を用いて組立てられた腫瘍壊死因子ベクターで形質転
換され、もしくはトランスフェクトされた細胞である。 形質転換された宿主細胞は、通常、腫瘍壊死因子を発現
する。発現された腫瘍壊死因子は、選択された宿主細胞
により、細胞内に止まるか、あるいはべりプラスミック
空間、または培養上清中に分泌される。 ＤＮＡ領域は、それらが、互いに機能的に関連している
場合は、機能的に結合している。例えば、プレ配列また
は分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチド
の分泌に与るプレタンパク質として発現されるならば、
該ポリペプチドに関するＤＮＡと機能的に結合している
；プロモーターは、それが結合している暗号配列の転写
をコントロールするならば、該配列と機能的に結合して
いる；リボゾーム結合部位は、それが結合している暗号
配列を翻訳され得る位置に置くならば、該暗号配列と機
能的に結合している。一般に、機能的に結合している、
ということは近接（コンテイギュアス）していることを
意味し、分泌リーダー配列の場合には、近接し、かつ解
読相内にあることを意味する。 適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞およびより高等
な真核細胞である。原核生物にはダラム陰性またはダラ
ム陽性の微生物、例えば、大腸菌やバチルス（桿菌、Ｂ
ａｃｉｌｌｉ　）が含まれる。より高等な真核細胞には
、以下に述べる如く哺乳類動物起源から得られたセルラ
インが含まれる。好適な宿主細胞は実施例に記載した、
ファージ耐性のＥ、ｃｏｌｉＷ３１１０　（ＡＴＣＣ２
７，３２５）株であるが、他の原核生物、例えばＥ、　
ｃｏｌｉ　Ｂ、　Ｅ、　ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ
３１，５３７）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４（ＡＴＣＣ３
１，４４６）、　シュードモーナス（ｐｓｅｎｄｏｍｏ
ｎａｓ　）種、あルイハセラシア・マーセサンｘ　（５
ｅｒｒａｔｉａ　Ｍａｒｃｅｓａｎｓ、　　霊菌）等も
適する。 腫瘍壊死因子の発現には原核性宿主−ベクター系が好ま
しい。腫瘍壊死因子分子は２個のシスティン残基を有し
ており、このことは、転写後、潜在的なジスルフィド結
合を形成させる様な適当なプロセッシングが必要である
ことを示唆しているが、例えば、大腸菌は生物学的に活
性な腫瘍壊死因子を発現させることができる。適当な微
生物系ベクターは、多数子に入れることができる。一般
に、微生物類のベクターは所望の宿主が認識し得る複製
起源、宿主内で機能し得るプロモーター、を満す様な遺
伝子）を含む。他の宿主に関しても、同様な組立て物を
作ることができる。大腸菌は、通常、ｌｌｉ、、　ｃｏ
ｌｉ種から得られるプラスミドｐＢＲ３２２を用いて形
質転換される（ポリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら、１９７
７、゛ジー７　（Ｇｅｎｅ　）２：９５）。 ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐
性のための遺伝子を含有しており、これらは形質転換細
胞を容易に同定し得る手段となる。 ベクターは宿主微生物によって認識され得るプロモータ
ーを含有していなければならない。一般にプロモーター
は所望の宿主にとってホモローガスである。組換えＤＮ
Ａの組立てに最も普通に用いられるプロモーターには、
β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース
プロモーター系〔チャン（Ｃｂａｎｇ　）ら、１９７８
　”ネイチャー”、２７５　：　６１５　；およびゲッ
デ／ｌ／　（Ｇｏｅｄｄｅｌ　）ら、１９７９”ネイチ
ャー”２８１　：５４４］、トリプトファン（ＬｒＰ）
プロモーター系〔ゲラデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、１９
８０　”ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ”３：４０
５７およびＥＰＯ出願公開番号３６，７７６〕、並びに
ｔａｃプロモーター〔Ｈ、ドウボニル（Ｈ。 Ｄｅ　Ｂｏｅｒ　）ら、”プロシーディンゲス・オブ・
ザ・ナショナル　アカデミイ・オブ・サイエンスイズ、
Ｕ、Ｓ、Ａ、”　８０　：２１−２５　（１９８３））
が含まれる。これらか最も普通に用いられているが、そ
の他の既知の微生物プロモーターも使用し得る。それら
の詳しいヌクレオチド配列は公開されているので、当業
者は、それらをプラスミドベクター内の、腫瘍壊死因子
をコードしているＤＮＡ（シーヘンリスト（５ｉｅｂｅ
ｎｌｉｓｔ　）ら、１９８０．６セル°゛２０：２６９
）、および腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡと、機
能的にライゲート（結合）させることができる。現在の
ところ好ましいベクターは、大腸菌アルカリ性ホスファ
ターゼプロモーターとｔｒｐシャイン−ダルガノ配列を
有するｐＢＲ３２２誘導体である。このプロモーターお
よびシャイン−ダルガノ配列を、腫瘍壊死因子をコード
しているＤＮＡと機能的に結合させる（即ち、ＤＮＡか
らのＴ　Ｎ　Ｆ　ｍ　ＲＮ　Ａの転写を促進する位置に
結合させる鬼 原核生物に加えて、酵母培養の如き真核性微生物も腫瘍
壊死因子−暗号ベクターにより、形質転換される。下等
な真核性宿主微生物の内、サツカロミケス・セレビシｘ
　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｃｉａ
ｅ）または通常のパン酵母が最も一般的に用いられるが
、その他多数の菌株も普通に用い得る。酵母ベクターは
、通常、２ミクロン酵母プラスミドからの複製起源また
は自律的複製配列（ＡＲ８）、プロモーター、ＴＮＦ、
並びにポリアデニル化および転写の終止のための配列、
および選択性遺伝子配列を含有している。酵母内で腫瘍
壊死因子を発現させるのに好適なプラスミドはＹ　Ｒ、
７である（ステインチ：Ｉ　ム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ
　）ら、１９７９、“ネイチャー”２８２：３９；キン
ゲスマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ　）ら、１９７９、”ジー
ン”、７：１４１；チェンバー（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ　
）ら、１９８０、′ジーン”１０：１５７）。このプラ
スミドは既にＬｒｐｌ遺伝子を含有しており、この遺伝
子は、酵母の突然変異株、ｆ例えばＡｒｃ（Ｊ１４４０
７６またはＰＥＰ４−１（ｌジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ　
）、１９７７、“ジェネテックス”８５　：１２　）に
トリプトファン中で増殖する能力を持たないという選択
マーカーを与える。この酵母宿主細胞ゲノムはｔｒｐｌ
障害を有するので、形質Ｊ　　　　　　　　転換体をト
リプトファンの非存在下で増殖させることで、形質転換
体の検出に効果的な環境を得ることができる。 酵母用ベクターの好適なプロモーティング配列には、以
下のものに対するプロモーターが含まれル：メタロチオ
ｆ　イア　（ｍｅｃａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　）、３
−ホスホグリセレート・キナーゼ〔ヒララマン（Ｈｉ　
ｔｚｅｍａｎ　）ら、１９８０　”ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリイ″２５５：２０７３：］
またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ート・デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベート
・デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース−６−ホスフェート・インメラーゼ、３−ホスホ
グリセレート・ムターゼ、ピルベート・キナーゼ、トリ
オセホスフェート・インメラーゼ、ホスホグルコース・
インメラーゼ、グルコキナーゼ等の他の解糖酵素類〔ヘ
ス（Ｈｅｓｓ）ら、１９６８、“ジャーナル・オブ・ア
ドバンスイズ・イン・エンザイム・レグ（Ｊ　、Ａｄｖ
、ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ、）”７：１４９；およびホラン
ド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、１９７８、′バイオケミスト
リイ”１７　：　４９００〕。更に、酵母内で発現させ
る上で好適なベクターおよびプロモーターはに、ヒララ
マン（Ｒ。 Ｈｉｔｚｅｍａｎ　）らにより、ＥＰＯ公開番号第７３
，６５７号の中に記述されている。 その他、増殖条件によって転写がコントロールされると
いう利点をも有するプロモーターとして、アルコール・
デヒドロゲナーゼ２、インチトクロームＣ１酸ホスフア
ターゼ、窒素代謝に関連する減成酵素、前記メタロチオ
ナイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒ
ドロゲナーゼ、並びにマルトースおよびラクトースの利
用に与る酵素類等に関するプロモーター領域が含まれる
。 適当な発現プラスミドを組立てるには、これらの遺伝子
に伴なった終止配列を、発現ベクター内の、腫瘍壊死因
子暗号配列の３側にライゲートし、ｍ　ＲＮ　Ａのポリ
アデニル化および終止を与える。 微生物に加えて、多核生物からの細胞培養を宿主として
用いることもできる。しかしながら、腫瘍壊死因子の発
現は、これまで微生物によって卓越した成果が得られて
いるので、それが好ましいとは言えない。原則として、
を推動物であるか無を推動物であるかに拘らず、あらゆ
る高等な真核細胞培養を使用し得る。しかしながら、最
近ではを推動物細胞に大きい関心が寄せられており、培
養（組織培養）でを推動物細胞を増殖させることは日常
的な操作となっている〔ティッシュ・カルチャー（Ｔｉ
５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　）アカデミツク　プレス、
クルスおよびパターン７　（Ｋｒｕｓ　ａｎｄ　Ｐａｔ
ｔｅｒｓｏｎ）編、（１９７３）’：Ｉ。有用な宿主セ
ルラインの例には、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ　細胞、チ
ャイニーズハムスターの卵巣（Ｃｔ−１０）セルライン
、並びにＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯ５−７およびＭＤＣＫ
セルライン等が含まれる。その様な細胞のための発現ベ
クターには、通常（必要ならば）複製起源および発現さ
れるべき遺伝子の前方に位置しているプロモーターが、
リボゾーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位（イントロ
ン含有ゲノムＤＮＡを用いる場合）、ポリアデニル化部
位および転写終止配列と共に含有されている。 を推動物細胞の形質転換に使用される発現ベクター用の
ための転写およびコントロール配列は、しばしばウィル
ス起源から供給される。例えば、普通用いられているプ
ロモーターはポリオーマ、アデノウィルス２、および最
も好ましくはシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）から導
かれる。アーリイ（早期）およびレイト（後期）プロモ
ーターは、いずれも５Ｖ４Ｑウイルスの複製起源含有フ
ラグメントとして該ウィルスから容易に得られるので特
に有用である〔ファイヤーズ（Ｆｉｅｒｓ　）ら、１９
７８、゛ネイチャー”２７３：　１１３］。ＳＶ４０の
より小さい、またはより大きいフラグメントも、それら
がウィルス性複製起源内に位置するＨｉｎｄ■部位から
Ｂｇｌ　１部位に至る約２５０　ｂｐの配列を含有して
いる限り用いることができる。更に、正常な状態で腫瘍
壊死因子と関連しているヒト−ゲノムプロモーター、コ
ントロールおよび／またはシグナル配列も、その様なコ
ントロール配列が宿主細胞系に適合し得ることを条件と
して用いることができ、またしばしば好ましいことであ
る。 複製起源は、例えばＳＶ４０その他のウィルス性起源（
例えばポリオーマ、アデノウィルス、■ＳＶ、ＢＰＶ等
）から導かれる複製起源等の外来性起源を含む様にベク
ターを組立てることにより、あるいは宿主細胞の染色体
性複製機構により、与えられる。もしもベクターが宿主
細胞染色体に組込まれるのなら、しばしば、後者の機構
でも十分である。 腫瘍壊死因子とデヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の両
者をコードしているＤＮＡ配列を含むベクターでトラン
スフェクトするのに好適な哺乳類宿主細胞を選択するに
際しては、用いるＤＨＦＲタンパク質のタイプに従って
宿主を選択するのが適当である。野生型ＤＨＦＲタンパ
ク質を用いる場合には、ＤＨＦＲ欠損宿主細胞を選択す
るのが好ましく、そうすることにより、ヒポキサンチン
、グリシンおよびチミジンを欠く選択用培地内で、満足
のいくトランスフェクションを選択するためのマーカー
としてＤＨＦＲ暗号配列を用いることができる。この場
合、好ましい宿主細胞はＤＨＦＲ活性を欠くチャイニー
ズノλムスターの卵巣（ＣＨＯ）セルラインであり、こ
れは、ウーラウブおよびチャフ’／７　（Ｕｒｌａｕｂ
　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ　）　（１９８０，６プロシー
デイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ　オブ
・サイエンスイズ”（Ｕ−５Ａ）７７：４２１６）　　
の述べた如くにして調製し、増殖させることができる。 他方、メトトレキセー）　（ＭＴＸ）に対する結合親和
性の低いＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパク質をコードしてい
るＤＮＡをコントロール配列に用いる場合には、Ｄ　Ｈ
Ｆ　Ｒ耐性細胞を用いる必要はない。何故ならば突然変
異ＤＨＦＲはＭＴＸ耐性であるので、宿主細胞自身がＭ
ＴＸ感受性であるならば、ＭＴＸ含有培地を選択の手段
として用いることができるからである。ＭＴＸを吸収す
ることのできる真核細胞の大多数は、メトトレキセート
感受性であると思われる。その様な、有用なセルライン
の１つはＣｌ−１０系、ＣＩ（ＯＫ　ｌ　（ＡＴＣＣ陽
ＣＣＬ６１）である。 まず、腫瘍壊死因子を培養物から回収する。形質転換し
た非分泌型細胞の場合は、音波処理等の許容し得る方法
で細胞を溶解し、遠心して細胞分層を分離して上滑を得
るが、分泌型細胞（誘導されたセルライン等）の場合に
は遠心して細胞を分離するだけで上清を得ることができ
る。次し）で、下記の手順のどれかを使用すること、ま
たはそれに更に他の手順を加えること、あるいは、全く
別の方法で置換えることにより、処理する。以下番こ示
す方法は、配列決定を行うのに充分な程度にまで腫瘍壊
死因子を精製するのに用いた方法である。 このことは、治療用の生産物にとって必要な精製法とは
必ずしも一致しない。 精製の第一段階として、溶解された培養液または培地上
清中の腫瘍壊死因子を疎水性物質に吸着させる。疎水性
物質としては非ゼラチン性の疎水性表面を有するケイ酸
塩やポリオレフィン等が好ましいが、アルキルセファロ
ースもまた適する。 調節多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ　
ｇｌａｓｓ　）　ｉコよって好適な状態が得られる。こ
の調節多孔性ガラス約１容量と上清５０容量とを混合し
、約４°Ｃにおいて、攪拌せずに約３０分〜２時間、好
ましくは１時間にわたり、微アルカリ性条件下で吸着さ
せる。通常、この吸着物は、その後、吸着された汚染タ
ンパク質を除くために適当な緩衝液で洗浄する必要があ
る。 周囲媒質の溶媒和特性を変えることによって疎水性物質
に吸着された腫瘍壊死因子を該物質がら溶離させる。溶
離は、ｐＨ約７〜８．５（好ましくはｐＨ約８）に緩衝
化された溶液であって、ＩＭの塩と、エチレングリコー
ルまたはグリセリンの如き水と混ざり合う有機ポリオー
ルの有効量（通常は、エチレングリコールをｌｏ〜３０
　Ｖ／Ｖ％、好ましくは約２０　Ｖ／Ｖ％用いる）とを
含有する溶液を通すことにより、行う。勿論、好適な条
件は使用されるポリオールによって異る。得られた腫瘍
壊死因子を含有する溶出液画分を、下記のインビトロア
ッセイ、または別の適当なアッセイによって検出する。 この段階並びに、その後の段階における単球細胞培養か
らの精製Ｃ度）および収率を表１に示す。 それ以上の精製は、腫瘍壊死因子を三級または四級アミ
ン陰イオン交換樹脂に吸着させて行う。 この目的に好適な樹脂はアルキル三級アミン基またはア
ルキル四級アミン基で置換されている交差結合したポリ
スチレン、デキストラン、あるいはセルロースの如き親
水性のマトリックス樹脂である。この型の市販製品は、
ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥセファデックスまたは商標
名モノ（Ｍｏｎｏ　）Ｑ（各場合において、これら各製
品のアルキル置換基はエチル基である）の名の下に入手
可能である。最良の結果は、ウゲルスタッ）　（Ｕｇｅ
ｌｓｔａｄｔ）ら（１９８３、ネ（ｆＶ　−”　３０３
：９５−９６　）の示した実質上均一なマクロポーラス
粒子を用い、Ｊ、リツケイ（Ｊ、Ｒ４ｃｈｅｙ　）らが
示した高速タンパク質液体クロマトグラフィー系Ｃ１９
８２年１０月、“アメリカ７・−７ボラトリ４　（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒ））“〕により、得
られる。この系によれば、腫瘍壊死因子を高レベルに精
製することができる。 実質上均質な程度にまで精製するには、後述の実施例に
示す如く、更にＳＤＳ　　ＦＡＧ電気泳動またはＣ４−
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて
分離する以外に方法はない。しかしながら、この様にし
て得られる生産物は、ＳＤＡまたはＨＰＬＣの有機溶媒
にさらされることにより、実質上その活性を失なってい
るので、治療に用いるのは不適当である。タンパク質濃
度はＭ、ブラットフォード（Ｍ、　Ｂｒａｄｆｏｒｄ　
）の方法〔１９７６、アナリテイカル・バイオケミスト
リイ（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　７２　：２
４８−２５４１によって測定された。精製の最終段階で
は、このタンパク質濃度はアミノ酸組成およびアミノ酸
配列から見積って算出された。 腫瘍壊死因子は、所望の純度の該腫瘍壊死因子と、生理
学的に許容し得る担体、即ち、使用される用量および濃
度においては、被投与者にとって無毒な担体を混合する
ことにより、投与のために製剤化される。通常、この様
な製剤化には、腫瘍壊死因子と緩衝液、アスコルビン酸
等の抗酸化剤、低分子量（１０残基以下）ポリペプチド
、タンパク質、アミノ酸、グルコースまたはデキストリ
ンを含む炭水化物、ＥＤＴＡの如きキレート剤、並びに
その他の安定剤および賦形剤とを混合する必要がある。 ダイマー（二量体）および／または、好ましくはトリマ
ー（三量体）の形で、腫瘍壊死因子を安定化する様、担
体を処方する必要かある。 このことは、腫瘍壊死因子をモノマー（単量体）に解離
させる様な塩濃度または洗浄剤濃度になることを避ける
ことによってなされる。他方、腫瘍壊死因子をこれ以上
の多量体に集合させる様な条件も避けなければならない
。一般に、凍結乾燥および水性液中ての保存の場合と同
様に、精製過程においても、過剰の凝集を阻止するため
に、トウイーン２０　（Ｔｗｅｅｎ　２０　）の如き非
イオン性界面活性剤を用いる。治療のために投与される
腫瘍壊死因子は滅菌されねばならない。滅菌処理は、滅
菌ｒ過膜を通すことにより、容易に行うことができる。 通常、腫瘍壊死因子は、凍結乾燥した形で保存する。 腫瘍壊死因子は、随意、化学療法剤抗生物質（アドリア
マイシン−Ｄ）、アドリアマイシン、アクラシノマイシ
ンＡ）等の他の抗新生物剤、あるいはガンマグロブリン
等の免疫グロブリンの様な免疫応答を増し、刺激する様
な物質（新生物細胞の表面抗原に親和性を有する免疫グ
ロブリンを含む）と併用することができる。更に、イン
ターフェロンは細胞溶解分析において腫瘍壊死因子と相
乗的に作用するので、α、βまたはγ−インターフエロ
ンを、腫瘍壊死因子組成物、または腫瘍壊死因子とリン
ホトキシンを含有する組成物に配合することが好ましい
。代表的な処方は、腫瘍壊死比 因子とｒ−インターフエロンとを、単位活性イ明こして
、０．１：１〜２００：１、通常は１０対１の割合で含
有するものである。これらの割合は、治療上、経験的に
生じた必要性に応じて改良に委ねられるものであること
は言うまでもない。 腫瘍壊死因子組成物は、腫瘍を有する動物に投与するこ
とができる。投与経路は、静脈内、腹腔内、筋肉内投与
、滅菌腫瘍壊死因子溶液の病巣内注入または注射の如き
既知の方法により、あるいは以下に述べる如き放出時間
調節系により投与することもできる。腫瘍壊死因子は病
巣内投与（即ち、固状の腫瘍内に直接注射する）し得る
。白血病の様な播種性腫瘍の場合には、静脈内またはリ
ンパ系への投与が好ましい。卵巣腫瘍の様な腹部器官の
腫瘍は、腹膜透析器を使用腰腹膜適合性の溶液で腹腔内
に注入することにより、有効に治療できる。ポーラス注
入も可能であるか、通常、腫瘍壊死因子は連続注入法で
投与する。 腫瘍壊死因子は、埋め込み可能な、時間調節製品を介し
て投与することができる。腫瘍壊死因子の二量体または
三量体の分子量を有するタン／Ｎ６り質に対する適当な
系の例には、Ｌグルタミン酸とγ−エチルーＬ−４ルタ
マートトのコポリマー〔Ｕ、　シト？　ン（Ｕ、Ｓｉｄ
ｍａｎ　）ら、１９８３．６ノマイオホリマーズ（Ｂｉ
ｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　）　”　２２　（１）　：　５４
７−５５６　）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタク
リレート）〔ｋ、ランガー（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ　）ら、
１９８１　”ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マ
テリアルズ・リサーチ（Ｊ、　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｍａｋ
ｅｒ。 Ｒｅｓ、）１５　：１６７−２７７、およびに、ランガ
ー、１９８２″ケミカル・チク１０シイ（Ｃｈｅｍ、　
Ｔｅｃｈ。 ）”１２　：９８−１０５　’：］またはエチレングリ
コール（Ｒ，ランガーら、同）が含まれる。この製品は
腫瘍が切除された後の外科的部位に埋め込まれる。 別法として、腫瘍壊死因子を半透膜のマイクロカプセル
またはりポゾーム内に封入し、腫瘍内部へ注射してもよ
い。この方法は、脳腫瘍の如き外科的な切除術を適用で
きない腫瘍に対して特に有用である。 腫瘍壊死因子の投与量は、例えば、投与経路、問題とな
っている腫瘍、および患者の症状等によって左右される
。腫瘍壊死因子の体重当りの必要量は、静注よりも病巣
内投与の場合の方が少なくてすむが、ある型の腫瘍（例
えば固型腫瘍）は他の型の腫瘍（例えば白血病）よりも
腫瘍壊死因子に対して抵抗性を有する様である。治療を
施す者は、標的腫瘍に対して適切な細胞毒性を奏す様に
、例えば腫瘍の生検、または胎生期がん抗原の如き推定
の腫瘍マーカーの診断学的測定、等により、用量の増加
に伴なうあらゆる組換え体の毒性を考慮しながら用量を
検定し、投与経路を改良する必要がある。マウスに対し
ては、通常、腫瘍壊死因子を最大投与量約１２０μｙ／
にワ体重／日までの静注投与か実質上、非毒性であり、
インビボで有効であることが分っている。 腫瘍壊死因子はその細胞毒活性において種特異性ではな
いと考えられるので、ヒト腫瘍壊死以外の腫瘍壊死因子
、例えばウシまたはウマ起源のものもヒトの腫瘍の治療
に用いることができる。しかしながら、自己抗体が生成
する危険性を避けるために、被治療種に由来する腫瘍壊
死因子を用いることが好ましい。 実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用いられる方法
を短い熟語に略して示す。 プラスミドは小文字のＰを先頭にし、そして／または大
文字および／または数字を続けることによって表わされ
る。本発明の出発物質であるプラスミドは市販されてい
るか、または非制限的な施設から一般に入手可能であり
、あるいはこの様にして入手し得るプラスミドから、公
知の方法に従つて組立てることができる。更に、その他
の同等なプラスミドも当業者には知られており、通常の
技術者にとって自明であろう。 ＤＮＡの７消化”とは、ＤＮＡを、該ＤＮＡのある位置
に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂することを指
す。その様な酵素を制限酵素と称し、該酵素にとって特
異的な部位を制限部位（サイト）と称する。゛部分”消
化とは、制限酵素による不完全な消化であり、与えられ
たエンドヌクレアーゼに対するＤＮＡ基質中の部位の全
てでなく、そのうちのいくつかを開裂する様な条件を選
んで行う。本発明において用いる様々な制限酵素は市販
岳されており、その反応条件、コファクター、およびそ
の他必要なものは、酵素の供給業者の指示に従って使用
した。制限酵素類は、各制限酵素が最初に得られた微生
物を表示する大文字、次いで他の文字、更に、通常、数
字からなる略号で表わされる。一般に、約１μｍのプラ
スミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０μｌの緩衝
液中の約１単位の酵素と共に使用する。特定の酵素につ
いて適当な緩衝液および基質の量は、製造業者によって
明示されている。通常、インキュベーション時間は３７
℃で１時間とするが、供給者の指示に従ってかえてもよ
い。インキュベーションした後、フェノールおよびクロ
ロホルムでタンパク質を抽出して除き、水性フラクショ
ンからエタノール沈殿によって消化された核酸を回収す
る。 時たま、制限酵素による消化の後、５′末端のホスフェ
ートを細菌性アルカリホスファターゼで加水分解するこ
とがある。これは、ＤＮＡフラグメントの２つの制限的
開裂末端が１閉環（サーキュライデイング）″したり、
閉じたループを形成することにより、該制限部位に他の
ＤＮＡフラグメントが挿入されにくくなるのを防止する
ためである。 明示しない限り、プラスミドの消化には、５′末端の脱
りん反応は伴なわないものとする。脱りんの方法および
試薬は常法に従う〔Ｔ、マニアテイス（Ｔ、　Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　）ら、１９８２、モレキュラー゛クローニン
グ（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）ｐｐ、　
１３３−１３４〕。 制限酵素による消化によって得られたＤＮＡフラグメン
トの６回収”または“単離”とは、この消化物をポリア
クリルアミドゲル電気泳動にがけて分離し、フラグメン
トの移動度を分子量既知のマーカーＤＮＡフラグメント
のそれと比較して所望のフラグメントを同定し、該フラ
グメントを含むゲルの部分を取り除き、該ゲルからＤＮ
Ａを分離することを意味する。この方法は一般的に知ら
れテイル。例、Ｒｌｏ−ン（Ｒ，Ｌａｗｎ　）ら、１９
８１、“ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ″９：６１
０３−６１１４およびり、ゲラデル（Ｄ、　Ｇｏｅｄｄ
ｅｌ　）ら、１９８０　　”ヌクレイツク・アシッズ・
リサーチ°′３：４０５７　　参照。 “サザーン分析”とは、消化物またはＤＮＡ含有組成物
中のＤＮＡ配列の存在を、既知の、標識したオリゴヌク
レオチドまたはＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼ
ーションによって確認スる方法である。本明細書中では
、特に断らない限り、サザーン分析という時は、Ｅ、サ
ザーン（Ｅ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ）、１９７５　°ジャ
ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジイ（ＪｌＭｏ
ｌ、　Ｂｉｏｌ、　）９８：５０３−５１７、の方法に
従って、消化物を１％アガロース上で分離し、変性し、
そしてニトロセルロース上に移し、■、マニアティスら
の方法〔１９７８、“セル”１５　：６８７−７０１　
’：ｌに従ってハイブリダイゼーションを行なうことを
意味する。 ・形質転換・とは、ＤＮＡを生物内に導入することを意
味し、その結果ＤＮＡが染色体外成分として、あるいは
染色体内に組込まれて複製されることを意味する。特に
明示しない限り、本発明における大腸菌の形質転換法に
はマンデル（Ｍａｎｄｅｌ）らのＣａ　Ｃ１２法（１９
７０、“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
イ”５３：１５４）を採用する。 “ライゲーション（結合）”とは、２個の二重鎖核酸フ
ラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する工程
を言う（Ｔ、マニアティスら、前掲ｐ１４６）。特に明
示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と条件を
使用し、略等モル量のライゲートすべきＤＮＡフラグメ
ント０．５μ２当ｔ：＝すＴ４ＤＮＡ＋Ｊガーゼ（”　
Ｕｔｆ−ゼ”）１０単位を用いて行う。 形質転換体からＤＮＡを“調製する”とは、プラスミド
ＤＮＡを微生物培養物中から単離することを意味する。 明示しない限り、マニアティスらのアルカリ性／ＳＤＳ
法（同上ｐ、９０）を採用する。 ”オリゴヌクレオチド”とは、短かい一本鎖または二本
鎖ポリデオキシヌクレオチドであって、実施例１に記載
の引用文献の方法によって化学的に合成され、次いでポ
リアクリルアミドゲル上で精製されたものである。 引用した文献は全て参照例として示した。 実施例１　アッセイ（分析法） 腫瘍壊死因子の比活性は前述の改良細胞溶解アッセイ（
Ｂ、　ｘボッフォード（Ｂ、Ｓｐｏ［ｆｏｒｄ　）　　
［ジャーナル・オブ・イムノロシイＪ　１１２　：　２
１１１）に従って測定した。マウスＬ−９２９線維芽細
胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−９２９）を、９６のウェルを設け
た底が平らなトレー（３０４０：ファルコンプラスチッ
クス（Ｆａｌｃｏｎ　　Ｐｌａｓｔｉｃｓ　Ｌオックス
フォード、ＣＡＪを用い、３０，０００／ウエルの割合
で細胞を、アクチ／マイシンｌμｇ／ｒｎｌ　　と連続
的に希釈した被検試料（０，１２５ｉ）の存在下におい
で増殖させる。加温雰囲気下、３７℃においてＣＯ□５
％の存在下で細胞を増殖させる。１８時間後、被検試料
を除き、平板を洗浄し、この平板をメタノール：水（１
：　４　Ｖ／Ｖ　）　　中の０．５％クリスタル・バイ
オレット溶液で染色することにより、細胞溶解を検出し
た。マイクロタイター平板の終末点をマイクロリザ（Ｍ
ｉ　ｃｒｏｌ　ｉ　ｓａ　）オートリーダー〔ダイナチ
ク（Ｉ５γｎａｔｅｃｈ）　　］を用いで４５０　ｎｍ
における吸収および５７　Ｑ　ｎｍにおける透過率を測
定して定めた。培地のみにさらされた細胞を０％溶解と
定め、３Ｍグアニジン塩酸塩溶液にさらしたものを１０
０％溶閑の終末点とした。５０％の細胞を溶解するのに
必要な腫瘍壊死因子の量（測定に用いた量か０．１２５
ｍ１である場合）を腫瘍壊死因子１単位と定義する。 腫瘍壊死因子はまたインビボでの腫瘍壊死因子アッセイ
によっても分析することができる。簡単に述べると、こ
の分析法は、ＭｅｔｈＡサルコーマ（肉ａ）細胞（５ｘ
　１０”　　細胞）　ヲＣＢ６　Ｆｌ　酸マウス（ＢＡ
ＬＢ／　ｃ　ｘ　Ｃ５７ＢＬ／６　）　Ｆｌ　中で７−
１０日間増殖させた後、被検腫瘍壊死因子と一緒に腫瘍
内に注入することからなる方法である。 ２４時間後、マウスを頚部脱臼法で殺し、腫瘍を切除し
てＥ、カースウｘ　／ｌ／　（Ｅ、　Ｃａｒ　ｓｗｅｌ
　ｌ　）らの方法（１９７５、プロシーディンゲス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンスイ
ズ、７２　：　３６６６−３６７０　）に従い、組織学
的に壊死を採点する・　　子 実施例２　腫瘍壊死因冷合成するためのＰＢＬまたは単
球性セルラインの利用 ２１のローラービン（８９０ｃｍ　）を用い、】ＯｍＭ
ＨＥＰＥＳ　、０．０５ｍＭβ−メルカプトエタノール
、１００単位／−ペニシリン、ｉｏｏμｇ／−ストレプ
トマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を含んだ５００ｄ
のＲＰＭＩ　１５４Ｑ　培地〔アーヴイン・サイエンテ
ィフィック（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）サ
ンタ・アンテ、ＣＡ）中テＨＬ−６０ヒトプロ骨髄球セ
ルラインの種培養（細胞密度ｌＸ１０５細胞／−）を増
殖させた。３７℃で３日間経過し、培養物の細胞密度が
８’−１２Ｘ１０５　細胞／ｍｌに達した時点で、１０
００１００Ｏ分間の遠心によって細胞を集め、血清不含
ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、前記と同じ培地（
血清を含まず）に移し、細胞密度１５−２０ｘ１０５に
なる様調節した。、、２１−ローラービンの中で１０ｎ
ｇ／−のＰＭＡの存在下、細胞を増殖させた。 １６〜２４時間１３μｍシールクリーンフィルター〔ポ
ール・トリニティ・マイクロ・コーホ（Ｐａｌｌ　　Ｔ
ｒｉｎｉｔｙ　Ｍｉｃｒｏ　ｃｏｒｐ、）、コートラン
ト、ＮＹ〕に通して細胞を沖去した。澄明なｒ液の腫瘍
壊死因子活性を測定し、引き続き精製および特徴付けに
付した。この方法により、培地上清中に腫瘍壊死因子４
００単位／−を得た。 腫瘍壊死因子は、ヒト末梢血中の単球細胞からも製造さ
れた。アメリカ赤十字（ボストン、ＭＡ）からプラット
レットフエレンス（ｐｌａＬｌｅＬｐｈｅｒｅｓｉｓ）
残渣を入手し、収集後２４時間以内に用いた。まず、Ｆ
ｉｃｏｌ　１−Ｈｙｐａｑｖｅグラディエンドを用いて
遠心（１０００ｇ　ｘ　３０分間）することにより赤血
球から用法を分離した。境界面に集められた細胞を、リ
ン酸緩衝化食塩水で３回洗浄した。各供給源からの単球
を別々に、２１のローラービン内で、血清不含ＲＰＭ１
１６４０　　培地中、細胞密度２．５Ｘ１０６　細胞／
−においで増殖させた。１μｇ／ｉづつのブドウ球菌エ
ンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）および組換えチモシンα−
１をこの培地に加え、加湿雰囲気下、３７℃においで、
１０％ＣＯ２の存在下で細胞をインキュベートした。供
給源に応じで、２４−７４時間後に、細胞上清を収穫し
、ＨＬ　−６Ｑセルラモ △ た。ＰＢＬ培養からの腫瘍壊死因子の収率は用いた誘導
試薬によつぜ一囲に変化し得る。上記の如く、この誘導
系にＰＭＡを加えると細胞上清の細胞溶解活性が増加し
た。しかしながら、得られた細胞−上清中には腫瘍壊死
因子とリンホトキシンの両者が含有されでいた（腫瘍壊
死因子とリンホトキシンとの混合物中の腫瘍壊死因子ま
たはリンホトキシンの測定は、被検試料を腫瘍壊死因子
またはリンホトキシンに対するウサギ中和抗体とブレイ
ンキュベートし、Ｌ−９２９細胞溶解分析で残存活性を
測定することからなる細胞溶解法によって行った）。 実施例３　調節多孔性ガラスピーズクロマトグラフィー 細胞培養中に含まれる腫瘍壊死因子活性を、１０ｍＭり
ん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化した調節
多孔性ガラスピーズ〔カタログＡＣＰＧ００３５０　、
　　エレク１トロヌクレオニックス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−
Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ　）フェアーフィールド、Ｎ１３
と、４℃で一定速度で攪拌することにより、これらビー
ズにバッチ（中東）吸着させた。培地５１に対してガラ
スピーズ１００ｍ１を用いた。１時間攪拌した後、ビー
ズを鎮静させ、上清をデカントして除いた。次いで、室
温で５×５０αカラムにビーズを入れ、ｌＱｍＭりん酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０，１ＭＮａｃ／　　含有
）により、洗浄した。ｌＱｍＭりん酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８，０，１ＭＮａｃｌ！含有）中の２０％エチレ
ングリコールを用いてガラスピーズから腫瘍壊死因子活
性を溶離した。カラムからのＨＬ　−５Ｑ上清の溶離像
を第１図に示す。 実施例４　　ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー 実施例３で得た溶出液を直接、ｌＱｍＭりん酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８，０）および０．０１％Ｔｗｅｅｎ　
２０で平衡化したＤＥＡＥセルｏ−ス５３〔ワットマン
（ｗｈａｔｍａｎ　）　）カラム（２，５Ｘ２０１、流
速的５００ｍ／／ｈ）にかけた。カラムの流速を１００
ｍ／／ｈに調節した後、４℃においで、試料１．０８０
ｍ／（腫瘍壊死因子４．２Ｘ１０６単位）を充填し、こ
のカラムを平衝化緩衝液で洗浄した後、１０ｍＭりん酸
緩衝液（ＰＨ８，０）中に塩化ナトリウム、７５ｍＭ、
１５０ｍＭおよび５００ｍＭを含有する段階的（ステッ
プアップ）グラディエンドで溶離した。溶出液を２８０
　ｎｍにおける吸収に基いてモニターし、腫瘍壊死因子
活性を溶離フラクションの関数として表した。結果を第
２図に示す。 実施例５　高速タンパク質液体クロマトグラフィー 実施例４で得た腫瘍壊死因子活性を示すフラクションヲ
濃縮シ、アミコン・スター・セル（Ａｍｉｃｏｎｓｔｉ
ｒ　ｃｅｌｌ　）中、ＴＮＦの分子量よりも小さい分子
量カット−オフ（保持限界）を示すＹＭ−１０膜その他
の半透膜を使用し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ　２０および
１ｍＭナトリウムアジドを含有する２０ｍＭトリスＨＣ
ｌ！（ＰＨ８，０）　（バッファーＡ）に対して透析し
た。次いて、半透膜をバッファーＡで２回洗浄した。グ
ラディエンドプログラマ−（ＧＰ−２５０）と２個のポ
ンプ（ｐ−５００）を備えた高速タンパク質液体クロマ
トグラフィー（ＦＰＬＣ）装置〔ファルマシア（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　）　　）中の四級アンモニウム基−置換
セファロースビーズカラム［５ｘ０．５αカラム中にビ
ーズ９．８μＭを含む；商品名モノ（Ｍｏｎｏ　）　Ｑ
樹脂、ファーマシア製］を、Ｊ、リツケイ（Ｊ、Ｒｉｃ
ｈｅｙ　）の記載した如＜　（”Ｔｌ”）ｈ　ン５ボラ
トリイ（ＡｍｅｒｉｃａｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　）″
　１９８２年１０月、ｐｐｌ　）、透析緩衝液をスーパ
ーループ（５ｕｐｅｒｌｏｏｐ　）から流速１、．１１
　／　ｍ　ｉ　ｎ　　で流してプレー平衡処理した。 プールした洗浄液および透析濃縮物をこのカラムに充填
し、該カラムをバッファーＡで洗浄した後、バッファー
Ａ中に塩化ナトリウム４０−７５ｍＭを含有せしめた線
状グラディエンドにより、溶離した。線状グラディエン
ドは次の様に計画されていた：０−５分：平衡綬衡液：
５．１−１５分２５ｍＭ　ＮａＣ／　：　１５．１−２
５分、４　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１：２５−６０分、４０−
７５　ｍＭ　ＮａＣ！線状グラディエンド：６０−６５
分、７５ｍＭ　ＮａＣ／　　：６５．１−７０分、ｌＱ
ＱｍＭ　　ＮａＣ１；　７０−８０分、１００−１００
０ｍＭ　ＮａＣ／線状グラディエンド：８０−９０分、
１００ｍＭＮａＣ／：９０．１−１１０分、平衡緩衝液
。溶出液を２ｒｎｌづつのフラクションとしてとり、２
８００ｍにおける吸収、伝導率、および腫瘍壊死因子活
性をモニターした。結果を第３図に示す。 実施例６　クロマトフオーカシング クロマトフオーカシング（Ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓ
ｉｎｇ　）は、実施例５て用いたＦＰＬＣ系においてフ
ァルマシアモノＰカラムを用いることにより、行った。 実施例５におけるフラクション番号３７〜４５で溶出し
た生物学的に活性（腫瘍壊死因子活性）なフラクション
を濃縮し、ＹＭ−ＩＱ半透膜を使用し、アミコン・スタ
ー・セル中で、カラム平衡化緩衝液（０，０２５Ｍビス
−トリスＭＣＩ　、　　ｐ）１６．７）に対して透析し
た。試料を、室温において、流速１−／　ｍ　ｉ　ｎ　
でスーパーループからモノデカラムに充填した。このカ
ラムを、２８０ｎｍにおける吸収が基準線に戻るまで平
衡化緩衝液で洗浄し、次いで、このカラムをＰＨ４，７
において７．５％ポリバッファー７４（ファルマシア）
で洗浄することからなる線状ｐｉ（グラディエンドによ
り、溶離した。フラクションを１ｒｎｌづつ集め、溶出
液の２８００ｍにおける吸収およびｐＨを記録した。 結果を第４図に示す。第４図から分る様に、腫瘍壊死因
子の等電点は約５．３である。 実施例７　プレパラティグ５ＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動 Ｕ、レムリ（Ｕ、　Ｌｅｍｍｌ　ｉ　）　　の方法（１
９７０、ゞネイチャー”２２７：６８０−６８５）の改
良法により、厚さ１．５−３．０　ｍｍの１５％ポリア
クリルアミドゲル（１１Ｘ１６％）を調製した。分離用
（レゾルピング）ゲルおよび堆積用（スクッキング）ゲ
ルはいずれも０．１％ＳＤＳと０．０５％Ｔｗｅｅｎ　
２０を含有しでいた。その他、緩衝液や交差結合用試薬
の濃度は分析法５１）Ｓ−ＰＡＧＥゲルの場合と同様で
ある。実施例５または６の方法で得た腫瘍壊死因子活性
を有するフラクションをプールして濃縮し、アミコン・
スター・セル中てＹＭ−１０半透膜を使用し、０．００
５％ＳＤＳを含有する６、２５ｍＭトリスＨＣ１！（ｐ
）ｆ’７．ｏ　）　　ニ対して透析した。透析濃縮物を
除いた後、半透膜を少量の試料緩衝液Ｃ０，２％ＳＯ８
，０，０２％Ｔｗｅｅｎ　２０１３０％グリセリン、０
．０３Ｍ）リスＨＣ／。 ｐＨ６，８，０，００５％の追跡染料（トラッキングダ
イ）〕で３回洗浄した。透析濃縮物および洗液をプール
しく全１１１−４ｍ１）、所望によりメルカプトエタノ
ールを加えてＳＤＳ　　ＰＡＧＥ　　還元条件にし、こ
の試料をスタッキング・ゲル内の大きいウェル鋳型中に
充填した。試料の入ったウェルに隣接する小さいウェル
は、予め染色された分子量マーカーのホスホリラーゼ−
ａ（９４Ｋ）、ウシ血清アルブミン（６７Ｋ）、オバル
ブミン（４３Ｋ）、炭酸脱水酵素（３０Ｋ）、大豆トリ
プシン阻害物質（２０Ｋ）およびリゾチーム（１４，４
Ｋ）のために用いた。このゲルをバイオラッド（Ｂｉｏ
ｒａｄ　）垂直電気泳動系で１２℃に冷却して、追跡用
染料がゲルの下端に達するまで、２０ｍＡ／ｍｍ（ゲル
の厚み）の一定の電流により、展開させた。 電気泳動の後、ガラス平板の１つ令ゲルから除去し、分
子量マーカーの位置を記した。次いで、用いた腫瘍壊死
因子試料のレーンを、マーカータンパク質の分子量と一
致させ、０．２５ｃＩｍの断片に切り分けた。これらの
ゲル断片を、ｌＱｍＭ重炭酸アンモニウム１−２−およ
びｏ、ｏｉ％Ｔｗ　ｅ　ｅ　ｎ２０、ｐＨ８の入ったポ
リプロピレンチューブに入れ、４℃で１６時間、溶離し
た。次いで溶出液の腫瘍壊死活性を測定した。結果を第
５図に示す。 ＳＤＳゲルに基く腫瘍壊死因子の分子量は、還元または
非還元条件のいずれにおいても約１７，０００であり、
これが−木調分子の分子量であることを示している。 ゲル断片の溶出液を以下の如く処理し、該溶出液から塩
類および低分子量物質を含まない状態で所望のタンパク
質を回収した：即ち、予めアセトニトリル、１−プロパ
ノーノペ　１％トリフルオロ酢酸、および蒸留水で洗浄
し、次いでｏ、ｏｉ％Ｔｗｅｅｎ　２０　ｓ　ｐＨｓ、
　０を含むｌＱｍＭ重炭酸アンモニウムで平衡化された
Ｓｅｐ　−ｐａｋ　Ｃ１８樹脂０゜２ｒｎｌを入れた小
さいカラムを調製した。このカラムにゲル溶出液を充填
し、溶出液を収集した。次いて、この樹脂を約５ｒｎ１
つつの蒸留水および０．１％ＴＦＡで洗浄し、遊離アミ
ノ酸と緩衝液の塩類を除去した。腫瘍壊死因子は、０゜
１％ＴＦＡ中に５０％１−プロパツールを含む混合物で
この樹脂から溶離された。更に、１ｒｎｌづつの１％Ｔ
ＦＡ中の５０％１−プロパノーノペおよび１％ＴＦＡ中
の９９％１−プロパツールによって溶離させたが、通常
、タンパク質は最初に用いた緩衝液によって溶離された
ゆこの段階で約８０％の腫瘍壊死因子の生物学的活性が
失なわれた。この様にして得られた腫瘍壊死因子を配列
決定に用いることはできるが、この使用目的には、次の
実施例８で述べるＨＰＬＣで得られる溶出液の方が好適
である。 実施例８　高速液体クロマトグラフィー固有の、無傷の
腫瘍壊死因子の分子量を高速ゲル浸透クロマトグラフィ
ーで測定した。これは、ＴＳＫＧ２０ＱＯ５ＷゲルＨＰ
ＬＣカラム［オールテツクアソシエーツ（Ａ１１ｔｅｃ
ｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　）ディアーフィールド、Ｉ
ｔ　〕　（７７，５６６０ｍｍ）を使用し、室温で行っ
た。およそ、１８ｇのタンパク質と１５，６００単位の
活性を含有する、実施例５から得られた精製腫瘍壊死因
子の試料１ｙ＋＋１を、０．２Ｍりん酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，０）を用いて流速０．５　ｍｌ　／　ｍ　
ｉ　ｎ　　で、このゲルカラムからインクラティック（
１ｓｏｃｒａｔｉｃ　）　　に溶出させた。 カラムを、ウシ血清アルブミン（ＭＷ６６．０００）、
オバルブミン（ＭＷ４５．０００　）、ウシ炭酸脱水酵
素（ＭＷ２９，０００　）　　およびリゾチーム（ＭＷ
１４．３００　）により、検定した。１ｒｎｌのフラク
ションを得、その腫瘍壊死活性を測定した。腫瘍壊死因
子活性を示すフラクションは分子ｆｆ１４５，０００±
６　、０００　ｉこ相当する位置で溶出した。 実施例９　逆相ＨＰＬＣ 腫瘍壊死因子を、既知のクロマトグラフシステムである
、Ｃ４シンクロパックカラム（ｘ−７（Ｗａｔｅｒｌｓ
　　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　、　Ｉｎｃ、））を用イ△
て精製しり［Ｗ、コール（Ｗ、　Ｋｏｈｒ　）ら、１９
８２、アナリテイカル・バイオケミカルスイ、１２２　
：＝ ３４８−３５９）。このカラムを、最初の１５分間は０
．１％ＴＦＡ水溶液中１−２３％ｖ／ｖｌ−プロパツー
ル、続く１５分間は０，１％ＴＦＡ中２３−３０％ｖ／
ｖｌ−プロパツールを用いで、流速１　、ｎｌ　／　ｍ
ｉ　ｎで線状グラディエンド溶出し、２１０ｎｍおよび
２８０　ｎｍにおけるタンパク質ピークを検出した。ピ
ークに相当する部分の細胞溶解活性を測定した。Ｃ４カ
ラムから腫瘍壊死因子を溶出させるのに用いた有機溶媒
によって、腫瘍壊死因子活性が約８０％減少した。この
様番こして精製した腫瘍壊死因子を真空乾燥し、次いで
アミノ酸分析および配列決定に付した。結果を第７図に
示す。第７図は、実施例５で調製した溶出液から得られ
た腫瘍壊死因子が、保持時間約１６および１９分で溶出
する生物学的に不活性な汚染タンパク質を含有している
ことを示している。Ｃ４−ＲＰ　−ＨＰＬＣから得られ
る生物学的に活性な溶出液はアミン末端配列を基準にし
たとき、実質的にホモジーニアスである。 実施例１０　腫瘍壊死因子の部分アミノ酸配列以下の如
くにして腫瘍壊死因子をトリプシン消化した：実施例９
で得たホモジーニアスな腫瘍壊死因子を乾燥し、これを
、５％ｗ／ｗ　Ｔ　Ｐ　ＣＫ　トＩＪプシン〔ウーシン
トン・バイオケミカルス（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　　）、ｌｍＭＣａ　Ｃｌ
　２および０．０１％Ｔｗｅｅｎ　２０　（酵素：基質
、１：２０）を含有する１００ｍＭ重炭酸アンモニウム
緩衝液（ｐＨ８，０）に再溶解して３７℃で６時間イン
キュベートし、次いで５％のトリプシン（重量％）を追
加し、得られた加水分解混合物を更に１２時間、３７℃
でインキュベートした。ペプチドフラグメントを分離す
るために、この反応混合物を上記の如く、Ｃ４ＨＰ　Ｌ
　Ｃに適用した。 結果を第８図に示す。９フラグメントの全てが示されで
いる（第８図において、フラグメント２と２′は、Ｔ２
　と名付けたピークの位置で、−緒に溶出した）。第１
０番目のフラグメントはこのカラムに保持されないと思
われる。 実施例８および９で得た無傷の腫瘍壊死因子および本実
施例で得たトリプシン加水分解フラグメントのアミノ酸
配列は、コールド・トラップ（冷却トラップ）を備えた
、ベックマン・シーケンサ−（Ｂｅｃｋｍａｎ　５ｅｑ
ｕｅｎｃｅｒ　）モデル８９０Ｂの改良機種を用いて、
自動配列決定用エドマン分解法（ａｕｔｏｍａｔｅｄ　
５ｅｑｕｅｎｔｉａｌ　　Ｅｄｍａｎ　ｄｅｇｒａｄａ
ｔｉｏｎ）により、決定した。カップ中の担体番こはポ
リブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ　）　　１．２５ｍ１ｉ
’を用いた。無傷の分子のアミノ酸組成に基く無傷の腫
瘍壊死因子の分子量は１７，１００　であった。この数
値は５ＤＳ−ＰＡＧＥからのデーターと一致しており、
グリコジル化されていないことが確認された。 実施例１１　腫瘍壊死因子とｒ−インターフエロンとの
相乗作用 Ｃ５７Ｂ１／６起源のセルラインの１つである、ネズミ
・メラノーマ（色素細胞１１ｉ）Ｂ１６［メインン・リ
サーチ（Ｍａｓｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　、ウオセ
スター、ＭＡ）の細胞をマイクロタイター平板に、５．
０００細胞／ウエルの割合でまき、リンホカイン類を加
えるまで、５％ＣＯ２−加湿インキュベーター内で、３
７℃において４時間インキュベートした。実施例１て得
た腫瘍壊死因子をＨＰＬＣにより、実質上、均質になる
まで精製し、その生物学的活性を、前に述べたＬ９２９
細胞の細胞溶解に基くバイオアッセイによって測定した
。同様に、精製組換えネズミｒ−インターフエロン〔Ｐ
、グレイ（Ｐ、Ｇｒａｙ　）ら、１９８３”プロシーデ
ィンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンスイズ、ＵＳＡ”８０　：　５８４２−５８４
６〕の、ＥＭＣ−感染し細胞（Ｄ、　　ゲラデルら、１
９８０．１ネイチヤー”（ロンドン）２８７　：４１１
−４１６３　　に対する抗ウィルス活性を測定した。ネ
ズミｒ−インターフエロンとヒト腫瘍壊死因子とを、第
１０図に示す如く別々に希釈した。 まず最初にγ−インターフエロンを意図するウェルに入
れ、その直後に希釈した腫瘍壊死因子を、最終容量０．
２＋ｎｌ／ウエルとなる様に加えた。７２時間インキュ
ベーションした後、細胞を２０％メタノール中０．５％
クリスタルバイオレットで染色した。結果を第１０図に
示す。Ｂ１６は腫瘍壊死因子またはＩＦＮ−γのいずれ
に対しても、単独ではかなり抵抗性を有する；腫瘍壊死
因子１，０００単位／ｉの場合には、肉眼で観察し得る
細胞溶解は認められなかった。しかしながら、極く少量
のｒ−インターフエロン（５単位／−という少量）を加
えただけで、細胞溶解が起きた。 実施例１２　メツセンジャーＲＮＡの単離ＨＬ−５Ｑ細
胞培養（ＰＭＡ誘導後４時間目）または実施例２と同様
に培養した末梢血中の単球細胞培養から、実施上、ワー
ド（ｗａｒｄ　）　　らの報告（１９７２，６ジヤーナ
ル・オブ・ヴイロロジイ”９　：　６１　）ｌこ従い、
全ＲＮＡを抽出した。遠心して細胞をペレット化し、ｌ
　ＱｍＭＮａＣｌ　、１０ｍＭトリｘ−ＨＣ／（ｐＨ７
，５）、１．５ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　２の混合物中に再懸
濁した。ＮＰ−４０（終濃度１％）を加えて細胞を溶解
し、遠心して核をペレット化した。全ＲＮＡを含む上清
をフェノールおよびクロロホルムによる複数回抽出に付
し、更に精製した。水層を０．２ＭＮａＣ／に調節し、
２倍容のエタノールを加えることにより、全ＲＮＡを析
出させた。培養細胞１ｇからの全ＲＮＡの収量は、通常
約６■であった。Ｈ，アビブ（Ｈ。 Ａｖｉｖ　）らの方法（１９７２、“プロシーディンゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
イズ、Ｕ’Ｓ　Ａ”６９　１４０８−１４１２）に従い
、オリゴ（ｄＴ）セルローズを用いてポリアデニル化ｍ
ＲぺＡ（約１００μｇ）を得た。 実施例１３　　ｃＤＮＡライブラリィ 実施例１２で調製したポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ７．５μｇ
に、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼクレノー（Ｋｌｅ
ｎｏｗ）フラグメント、およびＳ１ヌクレアーゼを順次
作用させることにより、これを二本鎖ｃＤＮＡｌこ変換
した〔Ｐ、グレイ（Ｐ、　Ｇｒａｙ　）ら、１９８２″
ネイチヤー”２９５　：　　５０３−５０８　；Ｍ、ウ
イッカーズ（Ｍｌｗｉｃｋｅｒｓ　）ら、１９７８１ジ
ヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリイ”２５
３　：　２４８３−２４９５　）。ポリアクリルアミド
ゲルから、鎖長６００ｂｐ以上のｃＤＮＡ約ｓｏｎｇを
単離した。 このｃＤＮＡに、式： ％式％ で示される合成ＤＮＡアダプター配列をライゲート（結
合）させ、ＥｃｏＲ１粘着末端を作成した。 当該技術分野では常法であるが、このアダプターは、２
本の鎖を別々に合成し、１方の鎖の５′　末端をポリヌ
クレオチドキナービでりん酸化した後、２本の鎖をアニ
ールすることにより、化学合成した。次いでｃＤＮＡを
ポリアクリルアミドゲルから再単離し、ＥｃｏｋＩ消化
λｇ消化２ｇ区ライゲーションすることにより、挿入し
、ファージ粒子（パーティクル）ｌこパッケージし、次
いで大腸菌Ｃ６００ｈｆｌ　　株〔ヒュイ（ｔ（ｕｙｎ
ｈ）ら、１９８４、プラクティカル・アプローチイズ・
イン・バイオケミストリイ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐ
ｐｒｏａｃｈｅｓ　ｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、
　ＩＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ　　ＬＴＤ。 オックスフォード、イギリス〕またはその他の、ラムダ
・ファージの増殖に適した既知の菌株内で増殖させた。 約２０，０００　　の独立したクローンからなるｃ　Ｄ
　Ｎ　Ａライブラリィが得られた。 実施例１４　腫瘍壊死因子ｃＤＮＡのためのデオキシオ
リゴヌクレオチドプローブの製造腫瘍壊死因子のトリプ
シン処理（トリブチツク）ペプチドＴＤ（３（Ｅ−Ｔ−
Ｐ−Ｅ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ａ−に−Ｐ−Ｗ−Ｙ−Ｅ−に−）
の予備的なアミノ酸配列を基に、公表されでいるコドン
利用頻度ＣＲ，グ５７＋）７．　（Ｒ，Ｇｒａｎｔｈａ
ｍ　）ら、１９８１．１ヌクレイツク・アシッズ・リサ
ーチ”９：４３−７４）、およびヒトＩ　ＦＮ−ｉ　　
のコドンバイアス（性癖）〔Ｐ、グレイら、１９８２　
”ネイチャー”２９５　　：　　５０３−５０８３、並
びにヒドリンホトキシンの配列に基づいて、４２ヌクレ
オチドからなるＤＮＡハイブリダイゼーションプローブ
を設計した。調製に用いた上記の配列は間違っていた（
最後のＫはＰであるべきであった）。それにも拘らず、
この配列からのプローブ作成は成功であった。合成プロ
ーブの配列は、式：％式％ で示され、その合成は、ｋ、フレア（Ｒ，Ｃｒｅａ　）
らの方法（１９８０，”ヌクレイツク・アシツズ・リサ
ーチ”８　：　２３３１−２３４８　）　　に従って行
われた。既知の方法（ゲラデルら、１９７９．１ネイチ
ヤー”　２８１　：　　５４４　）に従って、（ｒ−３
２Ｐ）ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより、
このプローブをりん酸化した。 実施例１５　腫瘍壊死因子の暗号（コーディング）配列
を含有するｃＤＮＡクローンの同定λｇｔ　ｌ　Ｑ　ｃ
ＤＮＡ　　ライブラリィからの、約２００．０００個の
組換えファージを、実施例１４で調製した３２ｐ−標識
４２マー（量体）を用い、Ａ、　　＋７−／ｌｚす７　
ヒ（Ａ、　Ｕｌ　１ｒｉｃｈ　）らの低ストリジエンシ
イ条件［１９８４、ＥＭＢＯジャーナル”３：３６１−
３６４、あるいは、Ｐ、グレイら、１９８３、”プロシ
ーティンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オ
ブ・サイエンスイズＵＳＡ”　８０　：　５８４２−５
８４６、Ｓ、アンダーソン（Ｓ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　）
　　ら、′プロシーティンゲス・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミイ・オブ・サイエンスイズＵＳＡ″８０　：
　６８３６−６８４２、または、Ｍ、ジャＩ　（Ｍ、　
Ｊａｎｅ　）　　ら、１９８３１ヌクレイツク・アシツ
ズ・リサーチ′１１：２３２５−２’３３５〕の下で、
ＤＮＡハイブリダイゼーション法により、スクリーンし
た。９個の別個のクローンがプローブとハイブリダイズ
し、得られたプラークを精製した。次いで、非−誘導Ｈ
Ｌ−６０細胞から得たｍ　ＩＬ　Ｎ　Ａを用いて３２ｐ
　−標識ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを調製した。これら９個のファ
ージクローンの内７個は、この５非誘導プローブとハイ
ブリダイズせず、従ってこれらを腫瘍壊死因子のｃＤＮ
Ａ配列に関する候補者と判定した。最も大きい挿入体を
含有しているｃＤＮＡクローンをλ４２−４と命名した
。この挿入体をベクターＭ１３ｍＰ８［Ｊ、メツシング
（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ　）ら、１９８１　、”ヌクレイ
ツク・アシッズ・リサーチ”旦：　３０９−３２１　〕
にサブクローンし、ジデオキシ鎖ターミネーション法［
Ａ、スミス（Ａ。 Ｓｒｎ＞　ｔｈ　）　１９８０　％　”メソッド・イン
・エンザイモロジイ”６５　：　５６０−５８０　およ
びＦ、サンガー（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ　）　　ら、１９
７７”プロシーティンゲス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミイ・オブ・サイエンスイズＵＳＡ　　”　７４　
：　５４６３−５４６７３　により、配列決定した。 λ４２−４に関しで得られたｃＤＮＡ配列は、分を表す
暗号領域を含んでいた。このＤＮＡの正しい方向性およ
び解読フレームを、腫瘍壊死因子のトリプシン処理ペプ
チドＴ４のアミノ酸配列との比較に基いて推定した。タ
ンパク質配列決定によって定められた腫瘍壊死因子のア
ミノ末端のバリン残基をアミノ酸を１とすると、解読相
内の終止コドンの前まで、さらに１５６個のアミノ酸が
後続している。分子量の計算値は１７，３５６　　ダル
トンである。 実施例１６　完全なプレＴＮＦ暗号配列を含有している
ｃＤＮＡクローンの同定 ｃＤＮＡクローンλ４２−４は、それが開始コドンを有
していないことで証明される様に、成熟ＴＮＦの全暗号
領域は含んでいるが、完全なシグナルペプチドの暗号配
列は有していない。この失なわれている配列に関する情
報を得るために、ヘキサデカヌクレオチドプライマー：
　ｄＴＣ，ＧＡＴＧＴＴＣＧＴＣＣＴＣＣ（第１０図の
ヌクレオチド８５５〜８７０に相補的な配列）を化学合
成した。このプライマーを、実施例１２で得たｍ　ＲＮ
　Ａにアニールし、次いで、実施例１３の方法に従っで
ｃＤＮＡを合成した。実施例１３に記載の方法に従い、
２ｇ【１０　内で、約２００．０００　ｃＤＮＡクロー
ンからなる新らしいライブラリィを調製した。このライ
ブラリィを、３２Ｐ−標識を付されたλ４２−４ｃＤＮ
Ａ　挿入体をプローブに用いて、ハイブリダイゼーショ
ン法でスクリーンした。１６個の陽性クローンが得られ
、その内最長のクローン（λ１６−４）は、λ４２−４
挿入体の５′側から、更に３３７　ｂｐ伸長しでいるｃ
ＤＮＡ挿入抹挿入体しでいた。ス１６−４のＴＮＦ　ｃ
ＤＮＡ挿入体（ヌクレオチド１−８７０）およびλ４２
−４の挿入体（ヌクレオチド３３７−１６４３）の合成
配列を第１０図に示した。 実施例１７　腫瘍壊死因子の直接発現のための発現ベク
ターの組立で 実施例１５で得た、腫瘍壊死因子のためのｃＤＮＡを発
現させるのに用いた方法は第１１図に示されている。実
施例１５において得られた、全成熟壊死因子の暗号配列
と部分的な推定の腫瘍壊死因子分泌リーダーとを含有し
ているファージλ４２−４をＥ′Ｃ０ＲＩ消化し、腫瘍
壊死因子暗号領域を含む約ｓ　ｏ　ｏ　ｂｐフラグメン
トを回収した。このフラグメントをＡｖａ　ＩおよびＨ
ｉｎｄＮ　　で消化し、５７８　ｂｐフラグメント（第
１１図においてＣ”と表示されている）を回収した。こ
のフラグメントは、腫瘍壊死因子のアミノ酸８−１５７
をコードしている。 ５′末端にＸｂａｆｉ粘着末端、３′末端１（Ａｖａ工
粘着末端、さらにｍｅｔ開始コドンおよび腫瘍壊死因子
の最初の７個のアミノ末端アミノ酸のためのコドンが一
体となっている合成デオキシオリゴヌクレオチド（第１
１図においてフラグメントＢ”と表示されている）を調
製した（実施例１３のアダプター配列の組立て方法参照
）。これらのアミノ酸に関するコドンは大腸菌にとって
好都合な様に選択された。開始コドン上流のＡＡＴＴ配
列は、開始コドンとリボゾーム結合配列との間隔を適当
にし、アミノ酸コドンとの結合により、メツセンジャー
ＲＮＡのループ構造か生じる可能性を失くする様、選択
されでいる。 セグメントＢおよびＣを、ｔｒｐリーダーペプチドのシ
ャイン−ダルガノ（５ｈｉｎｅ　−Ｄａｒｇａｎｏ　）
配列（ヨーロッパ特許出願公開番号３６７７６）とｔｒ
ｐ　　プロモーターとを含んでいるｐＢＲ３２２誘導体
とによる３重ライゲーションで結合させた。 上記誘導体はｔｒｐ　　プロモーターとＴｅｔ　　遺伝
子との間に１個のＸｂａ工およびＩＦ−１ｉｎｄｌ［部
位を含んで得られ、または含む様、設計されている。こ
の型のベクターの出発物質としては、ｐＬＴｔｒｐｌ（
グレイら、１９８４＠ネイチヤー″３１２　ニア２ｌ−
７２４）またはｐｔｒｐＥＴＡ　　（グレイら、１９８
４”プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンスイズＵＳＡ″８１：２６４５
−２６４９　）が適するが、ＰＢＲ３２２、ｔｒｐ　　
プロモーターおよび必要な合成リンカ−から組立てるこ
ともてきる。ｐＢＲ３２２およびｔｒｐ　　プロモータ
ーを含むプラスミドは公の施設から入手し得る。選択さ
れた、ベクター中のｐＢＲ３２２部分は、ｂｐ１４２４
から２０６５までのＡｖａ　］：　−Ｐｖｕ　■セグメ
ントを欠失したもの（プラスミド名”ＸＡＰ”を表わす
）であってもよい。 前記のプラスミドの内、任意のものをＸｂａ工　および
Ｈｉｎｄ　ｆｆｌで同時に消化し、大きいベクターフラ
グメントを回収する。このフラグメント、フラグメント
ＢおよびフラグメントＣをＴ４ＤＮＡリガーゼでライゲ
ートし、得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌
２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換した。アン
ピシリン耐性コロニーヲ選択し、プラスミドＤＮＡを回
収して制限エンドヌクレアーゼマツピングおよびＤＮＡ
配列決定により、特徴づけた。挿入体ＢおよびＣを含有
しているｐＴｒｐＸＡＰＴＮＦが得られた。 実施例１８　大腸菌内での腫瘍壊死因子の発現ｐＴＮＦ
ｔｒｐで形質転換した大腸菌ＡＴＣＣ３１４４６をアン
ピシリン２０μｇ／ｒｎ１．を含有するＭ９培地で増殖
させ、培養物をＡｓ、ｏ＝Ｑ、３に達するまで増させた
。インドール酢酸を終濃度２０μｇ／−まで加え、培養
物をＡ　　　　＝ｌまで増殖させた。細胞１０−を濃縮
し、りん酸緩衝化食塩水に懸濁させた。細胞を音波処理
し、実施例１の分析法によって腫瘍壊死因子を測定する
ために希釈した。培養物１４当り約１０５　単位の活性
が得られた。この活性は、ヒト腫瘍壊死因子に対して免
疫されたウサギから得たウサギ抗血清と一緒にブレイン
キュベーションすることにより、中和された、 実施例１９　大腸菌内での腫瘍壊死因子の発現この方法
は実施例１８の方法よりも好ましい。 前記ベクターを使用するための宿主は非−リバータプル
（非−復帰型）のｔｏｎＡ大腸菌株が好ましい。この様
な菌株はバクテリオファージ耐性であるため、野生型菌
株よりも大規模な培養に適している。この様な菌株を得
るために適した方法を以下に示す。Ｅ、ｃｏｌｉＷ３１
１０を、トランスポーザブルエレメントＴｎｌＱ　を含
有しているラムダバクテリオファージ、λ：：ＴｎｌＱ
によって形質導入（トランスジュース）し、大腸菌Ｗ３
１１ＱのＴｎ　１０ｈｏｐ　ｐｏｏｌ　　（ホップ・プ
ール）を得た〔Ｎ６　　フレツカ−（Ｎ−Ｋｌｅｃｋｅ
ｒ　）ら、１９７７１ジヤーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジイ”１１６　：　１２５　）。 この大腸菌Ｗ３１１０；：Ｔｎ　１０　ｈｏｐ　ｐｏｏ
ｌを３７℃において、細胞密度が約１　ｘ　１０９／−
に達するまで増殖させた。培養物０．５ｄを遠心し、得
られたペレットを７．０Ｘ１０９　のｐｆｕを含むλｐ
ｈｉ８０（またはＴｌ）リゼイト（溶菌液）０．２ｒｎ
ｌに懸濁した。３７℃で３０分間、ファージを吸着させ
た。次いでこの懸濁液を、テトラサイクリン（１５μｇ
／ｒｎｌ）を補充したＥＭＢ平板上に広げた。 ３７℃で一夜インキユベートした後、薄桃色のコロニー
を３艷のＬブロスにプールし、３７℃で一夜増殖させた
後、２回洗浄し、再びＬブロスに懸濁させた。この培養
物をバタテリオファージＰ１ｋｃに感染させ、ファージ
リゼイトを回収した〔Ｊ、ミラー（Ｊ、Ｍｉｌｌｅｒ　
）　１９７２　”分子生物学実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔｓ　　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）
”コール、ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ（
Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　）　ｐ３０４Ｊ。 このＰｌｋｃ　　リゼイトで形質導入し、大腸菌ＡＴ９
８２　（ｎｏ、４５４６、イー・コリ・ジェネティック
拳ストック・センター（Ｅ、叩１ｉ　ＧｅｎｅｔｉｃＳ
ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　）　＝ユーヘブン、コネクチ
カット〕をテトラサイクリン耐性にした。形質導入体を
、テトラサイクリン（１５μｇ／−）とｄａｐ　（ジア
ミノピメリン酸）（４０μｇ／ｍｚ）とを含んだＬブロ
ス平板上で選択した。得られた形質導入体をテトラサイ
クリン耐性およびｄａｐ遺伝子（ｄａｐ＋、【Ｃ−）の
再生に関してスクリーンした。次いで、ｄａｐ＋、ｔｅ
ｔ　形質導入体のλＰｈ１８０（またはＴｌ）耐性を試
験した。 次イテ数個のｄａｐ十、ｔｅｔＲ，λＰｈ１８０（また
はＴｌ）耐性菌株についで、Ｐ１ｋｃ＋７ゼイトを作成
した。大腸菌Ｗ３１１０をテトラサイクリン耐性にする
ために、このリゼイトを用いて形質導入した。形質導入
体をλｐｈｉ８０（またはＴｌ）耐性に関してスクリー
ンした。 テトラサイクリン感受性単離体をＷ　３１１０　ｆｈｕ
Ａ；ＨＴｎｌＱ−λｐｈｉ８ＱＲ形質導入体から選択し
り（Ｓ、　　ｔロイ（Ｓ、Ｎａ１ｏｙ）　ら、１９８１
″ジヤーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、、　Ｂｅ
ｃｔ　）１４５　：　１１１０３゜これらの単離体の単
１のコロニーを精製した後、そのファージλｐｈｉ８Ｑ
耐性およびテトラサイクリン感受性を調べた。 数個のテトラサイクリン感受性λｐｈｉ８Ｑファージ耐
性突然変異体からＤＮＡを単離し、５ｓｔｌｉで消化し
た。この５ｓｔｌ）消化ＤＮＡを、放射活性に標識され
、５ＳＳＬＩＩて消化されたλＨＨＴｎｌＱＤＮＡをプ
ローブに用いたサザーン・プロット法に適用し、Ｔｎｌ
Ｑが切除されたか否かに関して特徴付けた（Ｒ，ｆイビ
ス（ＲｏＤａｖｉｓ　）ら、１９８０６アドバンスド・
バクチリアル・ジエネテツクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ〕。テトラサイク
リン感受性単離体の内の１つが、λ：二ＴｎｌＯ，並び
に元のＷ３１１０　ｆｈｕＡ：：ＴｎｌＯλｐｈｉ８Ｑ
Ｒとのハイブリダイゼーションの場合に比較して、２本
のＴｎｌＱハイブリダイゼーション・バンドを有してい
ないことが明らかになった。 三本目のハイブリダイゼーション・バンドは移動度が変
化しており、不正確なＴｎｌＱの切除に起因する欠失が
起っていることを物語っている。 不正確なＴｎｌＯ切除に係る株から調製した外層膜標本
の５ＤＳ−ゲル電気泳動により、ｆｈｕＡおける移動度
は野生型ｆｈｕ　Ａタンパク質のそれとの比較において
、変化していることが分った。得られたタンパク質は、
λｐｈｉ８Ｑファージ受容体タンパク質としての機能を
有していなかった。これもまたＴｎｌＯの不正確な切除
に係る、第２の独立した株は、ＳＤＳゲルにかけたとき
、ｆｈｕ　Ａタンパク質の存在を示さなかった。 これらの菌株はどれもテトラサイクリン耐性またはλｐ
ｈｉ８Ｑ感受性株への復帰を証明するものでなく、ｆｈ
ｕＡ　遺伝子の部分的な、または完全な欠失を伴なう、
ＴｎｌＯ）ランスポゾンの全て、または一部の不完全な
切除が起きていることを示すものであった。その様なＷ
３１１０株（ＮＬ１０６）の内の１つを、本明細書に示
すＴＮＦ−暗号化ビヒクルの宿主として用いることが好
ましい。 ＮＬ１０６をｐｔｒｐＸＡＰＴＮＦ　で形質転換し、以
下の組成の培地（ＰＨ７，４）１０１に接種した。 成　　　分　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｇｍ
ｓ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４５，０ Ｋ２ＨＰＯ４６，Ｏ Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　０４３−０ クエン酸・Ｎａ　　　　　　　　　　　　１．０Ｌ−）
リプトファン　　　　　　　　　　　　０．２ＮＺアミ
ンＡＳ　　　　　　　　　　　　　４・０酵母エキス　
　　　　　　　　　　　　４．０Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４１，
２ グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　２５．
０微量原素溶液 （Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｏ、ＭＯｌ ＣｕＳＢおよびＭｎイオン）　　　　　　　０．５　ｍ
Ｊテトラサイクリン　　　　　　　　　　１．０ｍグ培
地のＡ３５ｏが約２０に達した時点でグルコースを培地
にｌ　ｇ　７ｍ　ｉ　ｎ速度で加えた。Ａ３５ｏが１３
６に達するまで、３７℃で発酵させた（約２０時間）。 この培養物を遠心して細胞ペーストを形成させ、次いで
このペーストを、５０ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ１
１０００ｍ１００Ｏ／、２０００ｍＭ尿素および０．１
％β−メルカプトエタノールを含む緩衝液により、ｐ）
Ｉｓ、ｏにおいて室温で３０分間抽出した。この抽出液
を希釈し、実施例１て述べた如く番こして分析した。こ
の分析で、腫瘍壊死因子１■と等価の活性として１×１
０８単位の腫瘍壊死因子活性が確立された。培養物１１
から、最高約２ｇの腫瘍壊死因子活性が得られた。アミ
ノ末端配列決定により、約７５〜８６重量％がバリルア
ミノ末端（成熟）腫瘍壊死因子であり、残りはｍｅ　ｔ
　−ＴＮ　Ｆであることが分った。更に、高レベルの発
現に加えて、得られたタンパク質は屈折体の状態で存在
することがないばかりか、それが得られた細胞は非常に
高密度であるという理由から、他の毒性を有していない
と思われる。 実施例２０　突然変異腫瘍壊死因子遺伝子の組立でおよ
び発現 この実施例においては、アルギニン６コドンＣＧＴの代
すにヒスチジンコドンＣＡＴを含むオリゴヌクレオチド
フラグメントＢを合成することを除いて、実施例１７−
１８の方法を踏襲して行なった。突然変異的腫瘍壊死因
子は発現された。 実施例２１　他の突然変異体腫瘍壊死因子遺伝子の組立
て この実施例においては、残基２のアルギニンコドンの代
りにロイシン（ＣＴＴ）をコードしでいるオリゴヌクレ
オチドフラグメントＢを用いて実施例１７−１８と同様
に行った。最初の試みで、培養物１１から約１２００η
の成熟ＴＮＦ活性が得られた。培養物中から、プロセス
されていないＴＮＦは検出されなかった。 実施例２２　分泌シグナル配列との腫瘍壊死因子融合物
をコードしているベクターの組立て大腸菌の熱に安定な
エンテロトキシ遺伝子ＳＴ■は、ピッケン（Ｐｉｃｋｅ
ｎ　）　　らによって示された１：１９８３”感染症と
免疫（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ　
）”４２（１）：　２６９−２７５　）。この実施例で
は、５Ｔｌｉ分泌シグナルおよびシャインーダルガ／配
列を含有するフラグメントを大腸菌アルカリ性ホスファ
ターゼプロモーターの下流にライゲートした。この５Ｔ
ＩＩシグナルの３′側には、腫瘍壊死因子の最初の７個
のアミノ末端アミノ酸に関するコドンを与える合成オリ
ゴヌクレオチドおよび、残りの腫瘍壊死因子に関する暗
号配列が続いている。前記の配列全てをｐＢＲ３２２ベ
クター内で合体させた。 ｐＷＭ　５０１　（ピッケア　（Ｐｉｃｋｅｎ　）ら、
１９８３１感染と免疫（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　）”４２（１）：　２６９−２７５
　〕は、この５ＴＩＩ遺伝子を含有している。ｐＷＭ５
０１をＸｂＯ工およびＮ５ｉｆｉで消化し、約９０　ｂ
ｐのフラグメントラ単離した。このフラグメントも自体
既知の方法で有機合成することができる（フラグメント
Ａ）。 実施例１７に述べた如＜　（Ｐ２０ｋＬＴ）、ＰＢＲ３
２２をＸｂａＪおよびＨｉｎｄｌ［テ消化し、大キいベ
クターフラグメントを回収した（フラグメン）Ｂ）。こ
のフラグメントは大腸菌の複製起源とアンピシリン耐性
の表現型を付与する遺伝子を含有しでいる。 ２本の鎖として、合成オリゴヌクレオチドを合成し、ア
ニールして下記の構造のものを得た（このオリゴヌクレ
オチドがコードしている制限部位粘着末端およびアミノ
酸も示されでいる）。 ＶＡＬ　ＡＲＧ　　ＳＥＲＳＥＲＳＥＲＡＲＧ　ＴＨＲ
５’　　　　ＧＴＡ　ＣＧＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ
　ＣＧＴ　ＡＣｒ　　　３’ＡＣＧＴ　ＣＡＴ　ＡＣＧ
　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＴＧＡ　ＧＧＣＴ
Ｎｓｉｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｖａ
ｌこれをフラグメントＣと命名した。 実施例１８で得たｐＴＮＦｔｒｐをＡｖｌｌおよびＨｉ
ｎｄｌ［で消化した。５７８ｂｐのＡｖａ　ニーＨｉｎ
ｄｌ［フラグメントを回収した（フラグメントＤ）。こ
のフラグメントは、最初の７個のアミノ酸を除く全ての
ＴＮＦ暗号配列を含有している。 ヘテロローガスなシャイン・ダルガノ（Ｓ、Ｄ、）配列
（ｔｒｐ）と結合した大腸菌アルカリ性ホスファターゼ
（ＡＰ）プロモーターからなり、ＥｃｏＲＩおよびＸｂ
ａＩ　末端を有するＤＮＡ配列を次の様にして組立てた
。ＡＰプロモーターの一部を含有するＤＮＡフラグメン
トをプラスミドｐＨ１−１（Ｈ，イノウニ（ＨｌＩｎｏ
ｕｅ　）ら、１９８１”ジャーナル・オブ・バクテリオ
ロジイ”１４６　：６６８−６７５　）から単離した。 もちろん、その他のＡＰプロモーターＤＮＡを含有する
あらゆる適当な供給源を用いてよい。ＰＨＩ−１をＨｐ
ａＩ消化に付してプラスミドを開環させ、合成ＥｃｏＲ
Ｉリンカー： をこのプラスミドにライゲートし、このリンカ−を加え
たプラスミドをＥｃｏＲＩの過剰量で消化して全Ｅｃｏ
ＲＩ部位を開裂すると共に、Ｒ８ａ工　活性不足量のＲ
８ａ　Ｉで消化して全Ｒ８ａ１部位の部分的な開裂をも
たらした（これらＥｃｏＲＩおよびＲ５ａＩ処理法は、
同時にてな（連続的に行うこともできる）。ＥｃｏＲＩ
　−Ｒ５１Ｉ部分消化により、ＡＰプロモーターを含有
する４　２０　ｂｐフラグメｔｒｐプロモーターを含有
するプラスミドまたは生物（ｐｌＦＮ−ベータ２、Ｄ、
／ｌ／７グ（Ｄ、Ｌｅｕｎｇ　）ら、１９８４．５バイ
オチクノロシイ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　”　
２　：　４５８−４６４　〕をＸｂａ　工およびＲ５ａ
工　消化し、ｔｒｐｓ、Ｄ、配列を含む３０ｂｐ　フラ
グメントを回収した。このフラグメントを４２０ｂｐの
ＡＰプロモーターフラグメントにライゲートし、４５０
ｂＰのＥＣＯＲニーＸｂａ　ＩフラグメントＥを得た。 フラグメントＥのヌクレオチド配列を次に示す。 フラグメントＡ、Ｂ、ＣおよびＤを４重ライゲーション
に付し、得られたライゲーション混合物を用いて大腸菌
２９４を形質転換した。アンピシリンを含んだＬＢ平板
上で増殖させ、形質転換体を同定した。形質転換体コロ
ニーからプラスミドｔｒｐ　ＳＴ　ＩＩＴＮＦ　を単離
した。このプラスミドＸｂａＩおよびＥｃｏＲｌで消化
してｔｒｐプロモーターを除き、次いで一大腸菌アルカ
リ性ホスファーゼプロモーターを含有する長さ４５０ｂ
ｐのＥｃｏＲニーＸｂａＩ　フラグメントＥにライゲー
トした。得られたプラスミドをｐＡＰｓＴＩＩＴＮＦと
称する。 実施例２３　分泌シグナルリーダーとの腫瘍壊死因子融
合物の発現およびプロセッシング大腸菌ＮＬ１０６をｐ
ＡＰＳＴＩＩ　ＴＮＦ　　によってトランスフェクトし
、以下の組成を有する培地（ＰＨ７，０）１０１！に接
種した。 組　　成　　　　　　　　　　　　　　　　ｇｍｓ／Ｌ
（ＮＨ４）２８０．ｉ　　　　　　　　　　　　５．０
Ｋ２ＨＰＯ４２，６ ＮａＨ２ＰＯ４１，３ クエン酸・Ｎａ　　　　　　　　　　　　１．ＯＫＣ／
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．
５ＮＺ７ミンＡ５　　　　　　　　　　　　　　５．０
酵母エキス　　　　　　　　　　　　　２．０Ｍ　ｇ　
Ｓ　Ｏ４１−２ グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　２５．
０微量元素溶液 ＢおよびＭｎイオン） アンピシリン　　　　　　　　　　　　　　２０．０　
ｍｇ培養は、Ａ３５ｏが１４０になるまで行うことを除
いて、前記実施例１９の方法と同様にして実施された。 この時点で、培養物中には腫瘍壊死因子的４００〜／ｌ
が含有されており、その約７０−８０重量％が適当にプ
ロセスされ、成熟タンパク質になっていることがゲル電
気泳動によって示された。実施例１９において使用した
全細胞抽出法によって回収された腫瘍壊死因子活性は、
細胞の浸透圧ショックによって回収された活性とほぼ同
様であった。 実施例２４　付加的な腫瘍壊死因子誘導体の組立ておよ
び発現 少くとも次に示す目的の１つまたはそれ以上をかなえる
ために、第１０図に示したＴＮＦアミノ酸配列配列然変
異誘導体を調製した：目的とは、インビボでの半減期の
延長、細胞毒活性の増大、腫瘍細胞と屯営細胞に対する
細胞毒活性の差異（正味の）の増大、診断用抗−ＴＮＦ
抗体を製造するためのＴＮＦ免疫原の調製、共有結合的
な修飾を施すために弔１の部位を工作すること（例えば
、ＥＭＩＴまたはＥＬＩＳＡ法での診断用試薬製品では
、酵素標識が共有結合的に結合している）、並びにＴＮ
Ｆの物性（例えば溶解性やＰＩ等）を変えること等であ
る。選択された誘導体の所望の活性は自体既知の適当な
アッセイを用いて常法通リスクリーンすることにより、
測定される。 ＴＮＦまたはその誘導体は、非霊長類のＴＮＦ配列に相
当するＴＮＦを含まないことが好ましく、また、非霊長
類のアミノ末端（例えば、ウサギ腫瘍壊死因子に特徴的
なデスＶａｌ　　Ａｒｇ　　アミノ末端）や、配列：　
Ｖａｌ　−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒ。 −８ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−
Ａｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−によって同定される
ＴＮＦ遺伝子〔ウオン（Ｗａｎｇ　）ら、１サイエンス
”２２８　：　１４９−１５４．１９８５）のアミノ末
端を有しでいないことが好ましい。 以下に示すＪ、　　７デルマン（Ｊ、　Ａｄｅｌｍａｎ
　）らの方法（”ＤＮＡ”２　（３）　：　１８３−１
９３　　）に基く方法は、サイレント突然変異を含んだ
、または突然変異ＴＮＦをコードしている、あらゆる突
然変異ＴＮＦＤＮＡ配列を組立て、発現させる上で一般
的に適用することができる。重複を避けるために、Ａｒ
ｇ３２がヒスチジルに変換され（置換による）、Ｈｉｓ
７３が欠失され（欠失突然変異）、そしてロイシルがＬ
ｅｕ１５７に融合している（挿人による）、代表的な誘
導体を例として示す。しかしながら、同様の方法で他の
あらゆる突然変異種も生成され得ることは理解されるは
ずである。 腫瘍壊死因子−暗号ＤＮＡ内にサイレントな、または発
現される突然変異を生成させる他の方法は当業者には知
られている。突然変異ＤＮＡは、例えば、単にその全配
列を化学合成するか、あるいはその配列の一部を合成し
、このフラグメントを、所望のＤＮＡの残余部分にライ
ゲートすることによって組立てることができる。、ＤＮ
Ａの化学合成は、技術者が、まず最初に天然起源から腫
瘍壊死因子をコードしているＤＮＡを得る、という工程
なしに、直接的に突然変異体を調製することを欲する場
合には有利な方法である。しかしながら、通常は、出発
物質であるＤＮＡは天然のアミノ酸（そのアレル変異種
も含めて）をコードしており、そのものから、ある突然
変異型誘導体を調製するのが望ましい。 突然変異型ＴＮＦ誘導体をコードしているＤＮＡの調製
にあたっては、そのものから転写されたｍ　ＲＮ　Ａに
強力なステム・アンド・ループ構造を生ぜしめない様、
コドンを変化さぜることが望ましい。上記の如き構造を
回避することにより、通常、高収率をあげることができ
る。加えて、同様の理由から形質転換体宿主にとって好
ましいコドンを用いる必要がある。 適当な出発物質ＤＮＡはｐＴｒｐＸＡＰＴＮＦ　（実施
例１７）をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ［で連続消化し、次い
で、ＴＮＦ遺伝子含有フラグメントを単離することによ
り得られる、該プラスミドのＥｃ。 Ｒ■−Ｈｌｎｄｌｌ［フラグメントである。このフラグ
メントはｔｒｐ　　プロモーターとメチオニル−腫瘍壊
死因子の構造遺伝子を含有しでいる。突然変異誘発に適
した、この遺伝子の一重鎖コピーを得るために、該Ｅ（
ｏＲニー１−ｆｉｎｄ　ｌ［フラグメントをファージＭ
ｌ　３ｍｐ８ＲＦ−ＤＮＦ　（Ｊ、メッシング（Ｊ、　
Ｍｅｓｓｉｎｇ　）ら、１９８２”ジーン”１９　：２
６９−２７６　；　＠ＲＦ”　は、複製可能な型のファ
ージであることを表す；このファージは市販品を入手し
得る〕のポリリンカ一部位にクローンする。Ｅ　ｃ６　
Ｒｌ：　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｌｌ［消化混合物の一部を、
予めＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩ［で消化したＭ　１３ｍＰ
　８ＲＦ　−ＤＮＡ　Ｉ　Ｑ　ｎ　ｇを含むライゲーシ
ョン反応物に加える。室温で２時間インキュベートした
後、このライゲーション混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０
３　（市販品から入手可能な菌株；ＪＭＩＯＩも使用で
きる）を形質転換する。形質転換された細胞をＸ−ＣＡ
Ｌ　（ジブロモ−ジクロロ−インドリル−ガラクトジッ
ド）とＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトジッド）と
を含んだトップ・アガー（ｔｏｐ　ａｇａｒ　）により
、平板培養した。無色のプラークから、ファージ感染さ
れた細菌性培養物（１＋ｎｌを選び取り、これを、ミニ
スクリーン法〔ハ〜ンボイムおよびドーリイ（Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ　ａｎｄＤｏｌｙ）１９８０＠ヌクレイツク・
アシッズ・リサーチ”７　：　１５１３−１５２３　）
によるＭ１３ｍｐ８／ＴＮＦＲＦ　−ＤＮＡ　　の単離
に用いた。得られた組換えファージＭ１３　　８／ＴＮ
ＦはＴＮＦ遺伝子ｐ の暗号鎖を担っていた。 部位指向的突然変異を誘発するために、以下に図式的ｌ
ζ示す様に、突然変異部位のどちらの側ｌこも伸びる１
５塩基と相補的な配列を有するオリゴデオキシリボヌク
レオチド（突然変異誘発オリゴマー）を合成した二式中
、Ｎは相補的な塩基であることを表し、Ｍは挿入、欠失
または置換されるべき核酸を表す）。挿入体または欠失
体は、遺伝子の下流部分を相内に保持するために、３つ
のグループの中で作成される。 Ｍ工は、塩基またはオリゴマーであるＭ２と相補性を有
さない塩基またはオリゴマーを表わす。ここに、Ｍ□は
所望の突然変異配列である。通常、オリゴマーは、一度
に１個以上の突然変異型金生成する様にも作られる。 Ａｒｇ−ｈｉｓ　３２突然変異体のためのアンチセンス
（非転写）オリゴマーは、ｐ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＧＣ
Ｍ丁ＧＧＣＡＴＣ，ＧＣＧ　ＧＴＴ　ＣＡＧ　ＣＣＡ　
ＣＴＧ−０）Ｉ　である。 ＯＨである。 Ｌｅｕ１５８挿入突然変異体のためのオリコ゛マーは、
ｐ　ＴＧＴ　ＴＣＧ　ＴＣＣＴＣＣＴＣＡ　ＡＡＧ　Ｃ
ＡＧ　ＧＧＣＡＡＴ　ＧＡＴ　ＣＣＣ−側である。 これらのプライマーは常法通り合成される。突然変異誘
発法に用いるため、１０ｐｍｏｌのオリゴ゛？　−ｔ　
タハｌ　ａ　Ｃ７’　ライ７−５’　−ＧＴＴＴＴＣＣ
ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’　の各々を、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼ２単位を含む、５０ｍＭトリスＨＣｌ
（ＰＨ７，５）、０．１　ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＭｇ
Ｃ／２、ｌＱｍＭ　　ジチオトレイトール、Ｑ、　ｌ　
ｍＭＡＴ　Ｐ　の混合物１０μｌ中で、３７℃において
３０分間りん酸化する。プローブとして用いるために（
下記参照）、合成オリゴヌクレオチド２Ｐｍ０１を、Ｑ
、１ｍＭＡＴＰ　の代りに１μＭｒ−ＰＡＴＰ　　（ア
マ−ジャム）を使用する外は上記と同様にりん酸化した
。比活性は常にｓ　Ｘ　１０　　ｃｐｍ／ピコモル（オ
リゴヌクレオチド鎖）以上である。 各オリゴマーおよびｌａｃプライマーをファージＭ１３
　ｍｐ　８／ＴＮ　Ｆから得た一本鎖ＤＮＡと７１イブ
リダイゼーシヨンさせ、次いでプライマー延長させるこ
とにより、１方の鎖が突然変異型ＤＮＡを含んでいる、
部分的なヘテロ二本鎖ＤＮＡを得る。 この部分的ヘテロ二本鎖ＤＮＡを得るには、−木調Ｍ１
３ｍｐ８／丁ＮＦ　ＤＮＡ　（３００ｎｇ　）を、Ｉｐ
ｍｏｌ　　づつのりん酸化オリゴマーおよびプライマー
を含有する（キナーゼ反応から得た一部を加える）１０
ｍＭ）リス−〇Ｃ１！（ｐＨ７，５）、Ｑ、　ｌ　ｍＭ
　Ｅ　ＤＴＡ　、　　および５　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１の
混合物２０μｌ中で、８０℃（２分間）、５０℃（５分
間）および室温（５分間）加熱する。２単位の大腸菌Ｄ
ＮＡポリメラーゼエ、ラージフラグメントと２０単位の
Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを含有する５０ｍＭ）リス−ＨＣ
Ｉ（ｐＨ８，０）、Ｑ、　ｌ　ｍ　Ｍ　Ｅ　ＤＴ’Ａ　
。 １２　ｒｎ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２、１０ｍＭジチオト
レイトール、Ｑ、　７　ｍＭ　ＡＴＰ　、　０．０７　
ｍＭ　ｄ　ＡＴＰ、　　および０゜２ｍＭづつのｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ　　の混合物３０μｌを加えて
プライマー延（伸）長を開始させる。室温で３０分間経
過した後、反応混合物を３７℃で４時間、次いで４℃で
一部インキユベートする。一部をフェノール抽出し、Ｄ
ＮＡをエタノール沈殿させ、水１５μｌに溶かす。これ
ら各部分のＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０３の形質転換に用い
る。 ｌａｃプライマーはファージと、オリコ゛マーの５′位
置で雑種形成する。プライマー伸長によってヘテロ二本
鎖構造が安定化される。オリゴマーおよびプライマーを
、１４ＤＮＡリガーゼによってＤＮＡ鎖の連結がなされ
る様、酵素的にりん酸化しておく。 前記の部分ｃ（ｉｏμｊ）からのフェノール抽出へテロ
二本鎖ＤＮＡを２００単位のＳｉヌクレアーゼを含む０
．０６Ｍ酢酸ナトリウム（ＰＨ４，５）。 Ｑ、５ＭＮａＣ１！、０．６　ｍＭＺｎｃｌ！２の混合
物１０μｊに加える。３７℃で５分間インキュベーショ
ンした後、酵母ｔＲＮＡ（５μｇ）を加え、フェノール
抽出とエタノール沈殿ｌこより、核酸を回収す下 る。同じ５１条件には、３０　ｎｇの一本鎖Ｍ１３ｍｐ
　８ＤＮＡ　（約ｉｏ、ｏｏｏプラークー形成単位）は
、ＤＮＡ形質転換分析においで１００個以下のプラーク
しか与えないが、同一量のＲＦ−ＤＮＡの場合には、形
質転換された性質の８０％以上が保持されている。Ｓｌ
　−処理ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭＪＯ３を形質転換し
、得られたファージをそのままの（ｉｎ　　５ｉｔｕ）
プラーク・スクリーニング法で分析する。 数百個の組換えＭ１３ファージプラークを含んだ細菌平
板（直径１５ｃｍ）を、別々のフィルターセット上に付
した適当な標識オリゴマー（フィルター当り約ＩＱ６ｃ
ｐｍ）を使用し、元の（親の）、あるいは突然変異体の
遺伝型両者に関し、１ｎｓｉｔｕ（そのままの）プラー
ク・スクリーニング法〔ベントン、（Ｂｅｎｔｏｎ　）
ら、１９７７”サイエンス”　１９６：　１８０−１８
２　Ｊ　　でスクリーンする。４０％ホルムアミド、５
ＸＳＳＣ中においで、５０℃で一夜ハイブリダイゼーシ
ョンする。フィルターヲ４５℃で、２ＸＳＳＣ，０，０
２％ドデシル硫酸ナトリウムにより洗浄して風乾し、強
化スクリーンを用いて一７０℃においてＸ線にさらす。 オリゴマーと突然変異ＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーシ
ョン（完全に相補的）を、出発物質であるＤＮＡとのハ
イブリダイゼーションに対抗させて分割させる様、ハイ
ブリダイゼーションのストリジエンシイを変える必要が
ある（ＳＳＣ濃度を変えること番こより）；各突然変異
体は本質的に、並びに、置換、欠失または挿入された塩
基の数に応じてハイブリダイズし得る能力が変化するで
あろう。例えば、唯１個の塩基に関する突然変異体を検
出する場合、その突然変異が微少な程度である突然変異
体と非−突然変異型の親ＤＮＡとを判別するために、高
いストリジエンシイを必要とするであろう（例えば、１
個のコドンの欠失またはｌ−３塩基の置換の場合、ハイ
ブリダイゼーションプローブハ突然変異オリゴマーより
も小さいものでなければならない）。一般に、この様な
プローブは約１４〜２０塩基からなる。突然変異体の欠
失のスクリーニング作業は、配列の喪失を検出するため
に、その欠失された配列を含む、または、その様な配列
で構成されたプローブを用いること番こより、容易なも
のとなる。ある特定のプラークから得たＤＮＡがこのプ
ローブとハイブリダイズしない場合には、目的とする配
列の所望の喪失が起きていると結論し得る。 標識したオリゴマーとハイブリダイズするプラークを選
択しで取り、大腸菌ＪＭ１０３に接種する。上清から一
本鎖（ｓｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａを調製し、細胞ペレットから
二本鎖（ｄｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａを調製する。この５ｓＤＮ
Ａを、Ｍ１３普遍（ユニバーサル）プライマーまたは腫
瘍壊死因子ＤＮＡの突然変異領域の３′側に位置する合
成オリゴマー相補配列を用いて行う、クローンのジデオ
キシ配列決定における鋳型に用いた。ジデオキシ配列決
定の結果、回収したプラークには突然変異ＤＮＡが含有
されていることが確認された。その様なファージをＭ１
３ｍｐ　８／’ｒＮＦｍｔｎｔと命名する。 Ｍ１３ｍｐ　８／ＴＮＦｍｔｎｔをＥＣ０ＲＩとＨｉｎ
ｄｌＩ［で消化し、ＴＮＦ−暗号化フラグメントを回収
する。ｐＴｒ　ｐ　Ｘ　Ａ　ＰＴＮ　ＦをＥｃｏＲＩと
Ｈｉｎｄｌｌ［て消化し、ベクターフラグメントを回収
する。次いで突然変異フラグメントをベクターフラグメ
ントにライゲートし、このライゲーション混合物を用い
て大腸菌Ｗ３１１０　、ＮＬ１０６．または２９４　（
ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換する。 実施例１８または１９の方法に従って突然変異ＴＮＦを
回収する。Ｍ１３突然変異変異原に関する情報はイギリ
ス特許出願第２．７３０．２１９　Ａ　　によって提供
されている。 この方法に従って得られた突然変異体は３つのクラスに
分けることができる：置換体、欠失体および挿入体の３
クラスであり、さらに、次の表１に示す如く、再分割す
ることができる。特に言及しない限り、突然変異体は第
１θ図に示す成熟腫瘍壊死因子の突然変異体を表すもの
とする。 表１ Ａ、置換 ■、荷電性の程度にお ける修飾（改良） １、　　　　ａｒｇ　６　　　　　　　ｈｉｓ２、　　
　　ｌｙｓ　６５　　　　　　　ａｒｇ３、　　　　ｐ
ｒｏ　２０　　　　　　　ａｒｇ４−　　　　ａｓＰ　
１０　　　　　　　ｂｉｓ５、　　　　ｇｌｕ　５３　
　　　　　　ｔｈｒ５、　　　　ｇｌｎ　４７　　　　
　　　ａｓｐ７、　　　　　ａｓｐ　４５　　　　　　
　　ｇＩｎまたはａｓｌ８、ａｓｎ　３９　　　　　　
　ａｓｐ９、　　　　ａｓｌ　３４　　　　　　　ｇＩ
ｎｌｏ、　　　　ｌｅｕ　２９　　　　　　　ａｓｐｌ
ｌ、Ｃｙｒ　１１５　　　　　　ｉｌｅ”’　　　　ｇ
ｌｕ１１６　　　　　１ｙｓ１３、ｐｒｏ　１１７　　
　　　　ｔｈｒ１４−　　　　ｇｌｕ　１２７　　　　
　　ｔｙｒ１５．１γＳ　１２８　　　　　　ｈｉｓ１
６、　　　　ａｌａ　１３４　　　　　　ｔｙｒ１７、
ｇｌｕ　１３５　　　　　１ｙｓ１８、　　　　Ｌｙｒ
　１４１　　　　　　ｐｒ。 工９、　　　ａｓｐ　１４３　　　　　５ｅｒ２０、　
　　　ａｌａ　１４５　　　　　　ｔｈｒ２１、ｇ”　
１４６　　　　　　ａｓｌ２２−　　　　ｇｉｎ　１４
９　　　　　１ｙｓ２３、　　　１ｅｕ１２Ｄ　　　　
　　ｌｙｓ■、親水性または疎水における修飾 １．ｌｅｕ　５７　　　　　　　Ｌｙｒ２、　　　　　
ｓｅｒ　５２　　　　　　１ｅｕ３、　　　　　ｖａｌ
　４１　　　　　　　ｔｙｒ４−　　　　ｇｌＹ　ｉｏ
ｓ　　　　　　ｐｈｅ５、　　　　ｌｅｕ　１２０　　
　　　　ｔｈｒ６、　　　　ｓｅｔ　１３３　　　　　
　ｇ’Ｙ７、　　　　ａｌａ　１３４　　　　　　ｔｈ
ｒ８−　　　　ｇｉｙ　１４８　　　　　５ｅｒ９、　
　　　ｖａｌ　１５　　　　　　　ｔｈｒ■、立体的な
修飾 （側鎖の立体的なかさの変化） ｌ、　　　　Ｌｅｕ　５３　　　　　　　ｐｈｅ２、Ｓ
ｅｒ　５２　　　　　　　ｃｙｒ３、　　　　　ｉｌｅ
　５Ｂ　　　　　　　ｌｅｕ’　　　　ｇ’ｙ４０　　
　　　　　Ｈｅ５、　　　　ｖａｌ　１３　　　　　　
　ｐｈｅ５、　　　　ｌｅｕ　１２０　　　　　　ｐｈ
ｅ７、　　　　　ｉｌｅ　１４６　　　　　　ｇｌＹ８
、　　　ａｓｎ　１３７　　　　　　ｇｌｕ９、　　　
　ｉｌｅ　１５４　　　　　　ｐｈｅｌｏ、　　　　　
ｉｌｅ　１５５　　　　　、　ｇ’Ｙ１１、　　　　ｐ
ｈｅ　１４４　　　　　１１ｅＢ、挿入 １、　　Ｌｅｕ　１５７後方　　　　　ｇｌＹｇＩＹ−
α）ＯＨ２、ＡＪｐｌＯとＬｙｓｌｌの間　ｈｉｓ３．
１ｌｅ５８とｔｙｒ５９の間　１ｅｕ４、　　Ｓｅｒ　
　５Ｑとｇｌｎ５１の間　１ｙｓ５、　　ａｒｇ　　３
１とＡｒｇ３２の間　ａｌａ６、　　ｇｌ）’１２１と
ｇｌＹ１２２の間　ｇｌＹ７、　　ｖａｌ　　ｌの前　
　　　　　免疫原性ポリペプチド８、　　ｌｅｕ　１５
７の後　　　　　　免疫原性ポリペプチド９、　　　ｇ
ｉｎ　１４９とＶａｌｌｉ５ＱのＩＰ＋　　　ｇｌｙｇ
ｌｙｌｏ、　　プＬ、ＴＮＦのａｌａ−１とｖａＪｌ４
の間ｌｙｓ　ａｒｇ Ｃ０欠失 １、　　　　　　Ｇｉｎ　１４９ ２、　　　　　　ｌｙｓ　１１２ ３、ｖａｌ　ｌ　−Ａｒｇ２ ４、ｖａｌ　ｌから　ｐｌ’ｏ　８ ５、ａｌａ　２２ ６、　　　　　　ａｒｇ　３２ ７、　　　　　ｇｌｕ　５３ ８、ａｌａ　１１１−１７ｓ　１１２ ９、　　　　　　ａｌａ　１２３ １０、　　　　　　ｉｌｅ　１５４ １１、　　　　　　ｇｌｕ　１２７ Ｄ、併用 １、　　　　　　　　　　ｉｌｅ　５１３　　　１ｅｕ
Ｉｅｕ　５７　　　　ｐｈｅ ６、　　ｇｌＹ１２１とｇｌＹ１２２の間にｇｌＹを挿
入し、Ｉｅｕ　１５７の後にｇｌ　ｙ　ｇｌ　ｙ−ＣＯ
ＯＨを付加する。 ７、ｖａＪｌからｇｌＹ６６を欠失させ、懸−Ｌｅｕ　
Ａｌａ　１１　ｅ　１１　ｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ
　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｇｌ　ｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ
−Ｐｈｅ　Ａｓｐ　ＬｅｕＴｙｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａ
ｒｇ　Ａｓｎ　ＩＩ　ｅＧｌｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅ
ｕ　Ａｒｇ−Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌ　ｕ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌ　ｙＧｌｙ　Ｌｅｕ
Ｔｙｒ　１１　ｅ　Ｐｒｏ−Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　
Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ＡｌａＧｌｕＡｌａＧｌｙＧｌｕ　Ｐ
ｒｏＴｌｌｒ　−で置換する、 ８、　　　　　　　　ａｌｅｌｌｌ ａｌｌ　１０９　　　　　　　　ｇＩｎｌｅｕ１２０を
欠失　　ｈｉ３ ９、　　　　　　　ａｓｎ　　１９　　　　　　　ｇＩ
ｎａｓｎ　　９２　　　　　　ｇｉｎ ａｓｎ１３７　　　　　　　ｇｉｎ 注目される突然変異体は、Ａｒｇ２、Ａｒｇ５（実施例
２０および２１）、Ａｒｇ３２およびＡｒｇ１３１のト
リプシン加水分解部位を欠失するか、あるいはトリプシ
ンに対する感受性を持たない様に修飾して得られる突然
変異体である。このことにより、ファーメンテイテイブ
・クリッピング（発酵的刈り取り）の可能性は減少する
が、腫瘍壊死因子の生体内半減期は延長される。Ａｒｇ
２およびａｒｇ５部位は、これらに関連する領域を除去
した後も生物学的活性は維持されていることから、臨界
的な部位ではない。しかしながら、Ａｒｇ３２　および
ａｒｇ　１３１部位を開裂すると活性が失なわれる。従
って、Ａｒｇ３２および／またはａｒｇ１３１部位をヒ
スチジルで置換することが望ましく、あるいは、左程好
ましくはないが、ｇｉｎで置換する。この置換では、該
部位の酵素感受性は喪失もしくは減少されるが、側鎖の
塩基性は保持される。また、ａｒｇ３１をヒスチジルで
置換するか、あるいは同じ理由から、左程好ましくはな
いがグルタミンで置換する。また、酵素加水分解部位を
融合ポリペプチドとＴＮＦ配列との間に挿入し、予定通
り１こ成熟または突然変異ＴＮＦを放出させること、あ
るいは、上記の如き部位をプレＴ　Ｎ　Ｆのリーダー配
列内の残基で置換することもできる。 ａｓｐ　４５のａｓｎによる置換体をグリコジル化能を
有する宿主細胞（例えば酵母または哺乳動物）内で発現
させることにより、グリコジル化された腫瘍壊死因子を
生産することができると思われる。 実施例２５　酵母（こ於ける、ＡＤＨプロモーターのコ
ントロール下での腫瘍壊死因子の発現Ｐ２０ＫＬＴまた
はｐｔｒｐＥＴＡ　　（またはｐＢＲ３２２）を、Ｘｂ
ａｌ：およＯＨｉ　ｎｄ　ＩＩＩ　Ｔ：　ハナ（Ｅｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄｆｆｌで開裂させ、Ｘｂａｉ粘着末
端ではな（ＥｃｏＲ：［粘着末端を持った合成フラグメ
ントＢを調製する外は実施例１７と同様にして、プラス
ミドＴｒｐＸＡＰＴＮＦを組み立てる。 このライゲーション（結合）混合物を使って大腸菌ＡＴ
ＣＣ３１４４６を形質転換し、ＥｃｏＲｌ：部位に囲ま
れた腫瘍壊死因子暗号化ＤＮＡを含んでいるプラスミド
ｐ　ＴＮ　Ｆ　ＲＩを制限分析により同定する。プラス
ミドｐ　ＴＮ　Ｆ　ＲＩ　を分離し、Ｅｃ。 ｋ工を分離し、ＥｃｏＲｌで消化し、腫瘍壊死因子ＤＮ
Ａ含有フラグメントＴ−１を回収スル。 プ５７．ミｌ’ｐＦＲＰｎ（ＥＰ６０，０５７Ａ）をＥ
ｃ。 Ｒ■で消化し、再環化を防止するためにアルカリホスフ
ァターゼで処理し、Ｔ４ＤＮＡ　　リガーゼを使ってＴ
’−１１１１瘍壊死因子フラグメントに結合させ、この
ライゲーション混合物を使って大腸菌ＡＴＣＣ３１４４
６を形質転換する。アガロース電気泳動ゲル上での制限
分析で判明することだが、アンピシリン耐性コロニーは
、方向を異にするＴ−１挿入体を持った２種類のプラス
ミドを産生ずる。プラスミドを大腸菌形質転換体がら精
製し５、これを使つでｔｒｐｌ変異を持った酵母（例え
ば酵母株ＲＨ２１８、非制限ＡＴＣＣ寄託番号４４０７
６）を形質転換してｔｒｐ十表視表現型る。断片Ｔ−１
の開始コドンがアルコールデヒドロゲナーゼプロモータ
フラグメントに隣接する様ｌこ配回されたプラスミドが
、酵母を、腫瘍壊死因子を発現させる様に形質転換する
ことがわかる。酵母形質転換体の抽出物から腫瘍壊死因
子を回収する。ｐＦ、ＲＰｎ染色体複製起源（ａｒｓｌ
）の代りに２ミクロン複製起源を含有する発現プラスミ
ド、および適合し得る宿主株を使用することにより、大
規模な発酵に於けるプラスミドの安定を改善する〔ジエ
ー・ベッグス（Ｊ、　Ｂｅｇｇｓ　）、１９７８、ネー
チャー（Ｎａｔｕｒｅ　）、２７５　：　　１０４−１
０９　〕。 実施例２６　哺乳動物細胞中での腫瘍壊死因子の発現 プラスミドｐＥＨＥＲ（ＥｐＨ７，０６ＯＡ）をＥｃｏ
Ｒ，ｌ：で消化し、牛腸アルカリホスファターゼで処理
し、実施例２５からのフラグメントＴ−１に結合させ、
このライゲーション混合物を使っで大腸菌ＡＴＣＣ３１
４４６を形質転換する。ポリアク、ジルアミドゲル上の
制限分析により判明した、方向を異にするＴＮＦ　ＤＮ
Ａ含有プラスミド（ｐＥＨＥＲＴＮＦｌおよびｐＥＨＥ
ＲＴＮＦ　Ｈと命名）を分離する。これらのプラスミド
を使ってトランスフェクトを行ない、ＣＨＯＤＨＦＲ−
ＤＵＸ−Ｂ１１、ＣＨＯｌおよびＬｔＫ−細胞を選択す
る。 上で調製した１μｇのｐ　ＥＨＥ　ＲＴＮ　Ｆ　］：ま
たはｐＥＨＥＲＴＮＦｌｉを、２５０　ｐｉの０．２５
　Ｍ　Ｃａ　Ｃ１２中、ラットキャリアーＤＮＡ１０μ
縁と混合し、次いて２５０　ｔｔｌのＨＥＰＥＳ　緩衝
食塩水（２８゜細胞をトランスフェクトする。室温で３
０分間放置した後、この溶液を、５　Ｑ　ｍｍのプラス
チック製組織培養皿中で増殖させた組織培養細胞番ご添
加する。ＣＨＯｌｌＣＨＯＤＨＦＲ−ＤＵＸ−Ｂｌｌお
よびＬｔＫ−細胞を使用する。この皿は、宿主細胞に適
切な培養培地３ｄを含んでいる。 ＣＨＯｌおよびＣＨＯＤＨＦＲ−ＤＵＸ−Ｂｌ工−のペ
ニシリン、１００μｇ　／　ｍｌのストレプトマイシン
および２μｍＭのし一グルタミンを補足したＨａｍＦ−
１２培地（Ｇｉｂｃｏ　）である。ＬＬＫ　　＋ルライ
ンのための培地は、上記と同様に補足したＤｕｌ　ｂｅ
ｃｃｏの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）　である。 ３〜１６時間後に培地を除去し、細胞を燐酸緩衝食塩水
中の２０％グリセリンで？ｌ−する。新しい培地を各プ
レートに加え、細胞を更に２日間インキュベートする。 細胞を２日間増殖させた後トリプシン処理しく滅菌細胞
を、０．２　ｍｙ　／、Ｉ　Ｅ　ＤＴ　Ａ含有トリプシ
ン０．５■／ｍｌで処理する）、選択培地を入れた１０
ｍｍの組織培養プレートに約３×１０　細胞を加えるこ
とにより、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を行
なう。ｄｈｆｒ−細胞のための培地はグリシン、ヒポキ
サンチンおよびチミジンを欠く（Ｆ−１２ＧＩＢＧＯ）
培地の製剤である（ＧＨＴ−培地）。ＤＨＦＲ＋宿主細
胞用には、通常の増殖培地番こメトトレキセート（１０
１００−１０００ｎを加える。プラスミドを使わないも
の、および正常なりＨＦＲを含んでいるプラスミドｐＦ
Ｄ−１１（ＥＰ　１１７，０６ＯＡ）を使用し、トラン
スフェクション条件下にコントロール（対照）試験を行
なう。 ＤＨＦＲプラスミドを取り込んで発現する細胞から生じ
るコロニーは１〜２週間以内に現われる。 腫瘍壊死因子を発現する形質転換体を同定する。

【図面の簡単な説明】

第１図は調節多孔ガラスからの腫瘍壊死因子の溶離像を
図式化したグラフである。第２図はジエチルアミノエチ
ルセルロースからの腫瘍壊死因子の溶離像を図式化した
グラフである。第３図は高速タンパク質液体クロマトグ
ラフィーにおける腫瘍壊死因子の溶離像を図式化したグ
ラフである。 第４図はクロマトフオーカシングにおける腫瘍壊死因子
の溶離像を図式化したグラフである。第５図はＳＤＳ　
　ＰＡＧＥゲル電気泳動による腫瘍壊死因子の分子量測
定結果を図式化したグラフである。第６図はＨＰＬＣか
らの腫瘍壊死因子の溶離像を図式化したグラフである。 第７図はＨＰＬＣＣ４−カラムからの腫瘍壊死因子の溶
離像を図式化したグラフである。第８図は、トリプシン
消化腫瘍壊死因子のフラグメントのＨＰＬＣによる分離
状態を図式化したグラフである。第９図はｒ−インター
フエロンと腫瘍壊死因子との混合物の細胞毒性作用を示
す写真の模写図である。第１０図は全腫瘍壊死因子分泌
リーダーを含むプレーヒト＠瘍壊死因子のヌクレオチド
およびアミノ酸配列を示す模式図である。第１１図はヒ
ト腫瘍壊死因子の発現ベクターの組立て模式図である。 特許出願人　ジエネンテク、インコーポレイテッド代　
理　人　弁理士　青　山　　葆　外１名フラクションＩ
ｔ号

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、腫瘍壊死因子と他のタンパク質との混合物から腫瘍
   壊死因子を得る方法であつて、該混合物中の腫瘍壊死因
   子を疎水性物質に吸着させた後、この物質から腫瘍壊死
   因子を溶離することからなる方法。 ２、疎水性物質がケイ酸塩またはポリオレフインである
   第１項記載の方法。 ３、疎水性物質が調節多孔性ガラスである第１項記載の
   方法。 ４、疎水性物質がポリスチレンビーズである第１項記載
   の方法。 ５、腫瘍壊死因子をエチレングリコールで溶離する第１
   項記載の方法。 ６、腫瘍壊死因子と他のタンパク質との混合物から腫瘍
   壊死因子を得る方法であつて、該混合物中の腫瘍壊死因
   子を、実質上均一な粒子径を有する陰イオン交換樹脂の
   粒子に吸着させ、次いで、腫瘍壊死因子を溶離すること
   からなる方法。 ７、陰イオン交換樹脂が４級アミノ−置換交差ポリスチ
   レン樹脂である第６項記載の方法。 ８、実質上、ホモジーニアスな腫瘍壊死因子。 ９、ヒト腫瘍壊死因子である第８項記載の腫瘍壊死因子
   。 １０、他の細胞毒性タンパク質を含まない第９項記載の
   腫瘍壊死因子。 １１、リンホトキシンを含まない第１０項記載の腫瘍壊
   死因子。 １２、約１０＾７単位／ｍｇタンパク質以上の腫瘍壊死
   因子比活性を有する第８項記載の腫瘍壊死因子。 １３、生理学的に許容し得る緩衝液、抗酸化剤、低分子
   量ポリペプチド、アミノ酸、炭水化物または非イオン界
   面活性剤のいずれか、あるいはそれらの混合物を配合し
   てなる第８項記載の腫瘍壊死因子。 １４、凍結乾燥されている第１３項記載の腫瘍壊死因子
   。 １５、腫瘍壊死因子と、該腫瘍壊死因子を拡散させ得る
   マトリツクスからなる組成物。 １６、マトリツクスがポリマーである第１５項記載の腫
   瘍壊死因子。 １７、腫瘍壊死因子がカプセル膜に含有されている第１
   ５項記載の腫瘍壊死因子。 １８、治療上有効量の腫瘍壊死因子を腫瘍を有する宿主
   に投与することからなる、腫瘍を有する宿主の治療法。 １９、哺乳類の細胞を含まないプレ腫瘍壊死因子、メチ
   オニル成熟腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子誘導体および保
   護メチオニル成熟腫瘍壊死因子からなる群から選択され
   る腫瘍壊死因子を含有する組成物。 ２０、第１０図のタンパク質の、１またはそれ以上のア
   ミノ酸残基が置換、欠失または挿入されてなる突然変異
   腫瘍壊死因子を含有する組成物。 ２１、第１０図のタンパク質が第１０図に示されている
   成熟タンパク質である第２０項記載の突然変異体。 ２２、成熟タンパク質に対し、１個のアミノ酸が置換、
   欠失または挿入されてなる第２０項記載の突然変異体。 ２３、第１０図に示されているタンパク質のアミノ酸残
   基３５−６６、１１０−１３３または１５０−１５７の
   間に位置する部位において、第１０図の成熟タンパク質
   が置換または欠失され、あるいは該タンパク質に挿入が
   なされている第２１項記載の突然変異体。 ２４、第１０図に示されているタンパク質のアミノ酸残
   基６７−１０９に位置する部位で第１０図の成熟タンパ
   ク質に対する置換、欠失または挿入がなされてなる第２
   １項記載の突然変異体。 ２５、中性、酸性または塩基性のアミノ酸残基を置換に
   用い、その置換に用いられるアミノ酸とは別のクラスに
   属する第１０図の成熟タンパク質の残基を置換して得ら
   れる第２０項記載の突然変異体。 ２６、立体的にかさばつた側鎖を有する残基がその様な
   かさばつた側鎖を持たない残基と置き換わつている第２
   ０項記載の突然変異体。 ２７、立体的にかさばつた側鎖を持たない残基がグリシ
   ンまたはセリンである第２６項記載の突然変異体。 ２８、その様な側鎖を有する残基がフエニルアラニンま
   たはトリプトフアンである第２６項記載の突然変異体。 ２９、腫瘍壊死因子が不溶化されているか、または検出
   可能な基で共有結合的に標識されているものである第１
   ９項記載の腫瘍壊死因子誘導体。 ３０、第１０図の成熟タンパク質のリジンまたはアルギ
   ニン残基が欠失されているか、あるいはリジンおよびア
   ルギニン以外の残基で置換されている第２１項記載の突
   然変異体。 ３１、細胞毒性を有する第２０項記載の突然変異体。 ３２、腫瘍壊死因子と、少くとも１個の、他のホモロー
   ガスなタンパク質を含有する組成物、ただし、その様な
   他のホモローガスなタンパク質の含有量は予め知られて
   おり、かつ、該組成物中には存在量不明の他のホモロー
   ガスなタンパク質が含まれていないことを条件とする。 ３３、ホモローガスなタンパク質を全く含まない腫瘍壊
   死因子。 ３４、ヒト起源のものである、第１９、２０、３２また
   は３３項のいずれかに記載の腫瘍壊死因子。 ３５、第１０図の成熟タンパク質の細胞毒性突然変異体
   である第３２または３３項記載の腫瘍壊死因子。 ３６、特定の種からの腫瘍壊死因子と、それ以外の種の
   細胞からの成分であつて、患者に対して投与する上で生
   理学的に許容し得る成分とを含有する組成物。 ３７、成分が原核生物のタンパク質である第３６項記載
   の組成物。 ３８、ヘテロローガスな腫瘍壊死因子を含有する細胞を
   含む組成物。 ３９、細胞が原核生物または下等な真核生物の細胞であ
   り、腫瘍壊死因子がヒト起源のものである第３８項記載
   の組成物。 ４０、腫瘍壊死因子が成熟腫瘍壊死因子である第３９項
   記載の組成物。 ４１、腫瘍壊死因子が突然変異体である第３９項記載の
   組成物。 ４２、更に、栄養培地をも含む第３９項記載の組成物。 ４３、更に、緩衝液、抗酸化剤、キレート剤、低分子量
   ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、陰イ
   オン交換樹脂、またはそれらの混合物からなる群から選
   択される生理学的に許容し得る担体を、予め定められた
   量で含有する第２０、３３または３６項記載の組成物。 ４４、凍結乾燥されている第２０、３３または３６項記
   載の組成物。 ４５、第２０項記載の突然変異腫瘍壊死因子をコードし
   ているＤＮＡ。 ４６、腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡであつて、
   介在非翻訳配列を含まないＤＮＡ。 ４７、腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡであつて、
   該ＤＮＡが導かれた生物の他のタンパク質をコードして
   いる非翻訳領域を含まないＤＮＡ。 ４８、腫瘍壊死因子をコードしている合成ＤＮＡであつ
   て、天然に見出される腫瘍壊死因子をコードしているＤ
   ＮＡの対応する位置には認められない置換ヌクレオチド
   を含有するＤＮＡ。 ４９、腫瘍壊死因子と他のポリペプチドとの融合物をコ
   ードしているＤＮＡ。 ５０、他のポリペプチドが細菌または下等真核生物のも
   のである第４９項記載のＤＮＡ。 ５１、他のポリペプチドがヘテロローガスな分泌リーダ
   ーである第４９項記載のＤＮＡ。 ５２、リーダーが大腸菌のリーダーである第５１項記載
   のＤＮＡ。 ５３、リーダーがＥ．ｃｏｌｉ　ＳＴIIエンテロトキシ
   ンのリーダーである第５２項記載のＤＮＡ。 ５４、複製可能なベクターにライゲートされた、腫瘍壊
   死因子をコードしているＤＮＡ。 ５５、複製可能なベクター内に存在している、第４５、
   ４６、４７、４８または４９項のいずれかに記載のＤＮ
   Ａ。 ５６、ベクターがプラスミドまたはウイルスである第５
   ５項記載のＤＮＡ。 ５７、検出可能な物質によつて共有結合的に標識された
   、腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡまたはそのフラ
   グメント。 ５８、検出可能な物質が螢光性の基、放射活性な原子ま
   たは化学発光性の基である第５７項記載のＤＮＡ。 ５９、第５７項記載の標識されたＤＮＡと、測定すべき
   ＤＮＡフラグメントとを、２フラグメントをハイブリダ
   イゼーシヨンさせるのに有効な条件下で接触させ、次い
   で、ハイブリダイゼーシヨンの程度を測定することから
   なる分析法。 ６０、第５５項記載のＤＮＡで形質転換された細胞。 ６１、第６０項記載の細胞を培養し、培養中に腫瘍壊死
   因子を蓄積させ、次いで生成物を回収することからなる
   方法。 ６２、腫瘍壊死因子をコードしているＤＮＡを調達し、
   該ＤＮＡの対応する配列中に存在するヌクレオチドに対
   して、予め定めたヌクレオチドの欠失、予め定めたヌク
   レオチドによる置換または予め定めたヌクレオチドの挿
   入を行なうために該ＤＮＡを処理する方法。 ６３、ヌクレオチドが、ＤＮＡによつてコードされてい
   るアミノ酸の配列を変化させない様に選択されたもので
   ある、第６２項記載の方法。 ６４、処理が、ＤＮＡフラグメントを合成オリゴデオキ
   シリボヌクレオチドで置換することを含むものである、
   第６２項記載の方法。 ６５、ヌクレオチドの置換により、宿主細胞に好適なコ
   ドンが生成される、第６２項記載の方法。 ６６、第２０、３３または３６項のいずれかに記載の組
   成物を動物に投与する方法。 ６７、投与される組成物中の腫瘍壊死因子含有量が治療
   に有効な量である第６６項記載の方法。 ６８、動物が腫瘍を有しており、また投与量は腫瘍壊死
   を引き起こすのに充分な量である第６７項記載の方法。 ６９、腫瘍壊死因子とインターフエンロンとを含有する
   組成物。 ７０、他の細胞毒性ポリペプチドを含まない第６９項記
   載の組成物。 ７１、他の血漿性のタンパク質または細胞を含まない第
   ７０項記載の組成物。 ７２、更に、生理学的に許容し得る緩衝液、抗酸化剤、
   低分子量ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化
   物または陰イオン界面活性剤、あるいはこれらの混合物
   を付加してなる第６９項記載の組成物。 ７３、凍結乾燥されている第６９項記載の組成物。 ７４、ヒト起源のものである第６９項記載の組成物。 ７５、リンホトキシンを含まない第６９項記載の組成物
   。 ７６、インターフエロンがγ−インターフエロンである
   第６９項記載の組成物。 ７７、第６９項記載の組成物を動物に投与することから
   なる方法。 ７８、治療上有効量の組成物を投与することからなる第
   ７７項記載の方法。 ７８、治療上有効量の組成物を投与することからなる第
   ７７項記載の方法。 ７９、その量が腫瘍壊死を引き起こすのに充分な量であ
   る第７８項記載の方法。 ８０、腫瘍壊死因子がウサギ腫瘍壊死因子以外のもので
   ある第１９項記載の組成物。 ８１、腫瘍壊死因子突然変異体がアミノ末端残基Ｖａｌ
   　１−Ａｒｇ２を欠失されたヒト腫瘍壊死因子以外のも
   のである第２０項記載の組成物。 ８２、Ａｒｇ３２残基が欠失されたものである第２０項
   記載の組成物。 ８３、Ａｒｇ３２残基がヒスチジルで置換されている第
   ２０項記載の組成物。