JP3017320B2 - ヒト造血幹細胞 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明の分野は造血幹細胞の単
離、再生及び使用である。

【０００２】

【従来の技術】哺乳類の血液細胞は並はずれて多様な範
囲の活性を提供する。血液細胞はリンパ球系、骨髄系及
び赤血球系をはじめとするいくつかの系（ｌｉｎｅａｇ
ｅ）に分けられる。Ｂ細胞及びＴ細胞を含むリンパ球系
は抗体の産生、細胞免疫系の調節、血液中の外来物質の
検出、宿主にとって外来性の細胞の検出等を提供する。

【０００３】単球、顆粒球、巨核球及び他の細胞を包含
する骨髄系、例えば、血液流中の外来物質の存在を監視
し、腫瘍細胞（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）に
対しての保護を与え、血流中の外来物質を除去し、血小
板を生産する。赤血球系は酸素運搬体として作用する赤
血球を供給する。

【０００４】血液細胞の性質、形態、特性及び機能の多
様性にも拘らず、自己再生することができ、かつ成長因
子へ接すること（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）によって特定の系
になることができる単一の先祖があると現在考えられて
いる。

【０００５】幹細胞集団は骨髄中の総白血球数の小さな
パーセンテージしか構成しない。加えて、現在のところ
分化細胞に関与するどれぐらいの数のマーカーが幹細胞
上に存在するのか分らない。先祖の活性の幾分の増強を
与えると報告されたあるマーカーはクラスＩＩＨＬＡ
（特にＪＩ−４３と名づけられたモノクローナル抗体に
よって認識される保存ＤＲエピトープ（抗原決定基））
である。

【０００６】しかしながら、これらのマーカーは多数の
系に付された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）造血細胞（ｈｅｍ
ａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）上に見い出されて
いる。幹細胞ＣＤ３４上に存在することが示された１つ
のマーカーはかなりの数の系統に付された先祖上にも見
い出されている。特に、Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋）及び骨髄
系細胞（ＣＤ３３^＋）はＣＤ３４^＋集団の８０−９０％
を構成する。しかも、ＣＤ３，８，１０，１５，１９，
２０及び３３の組合せはすべてのＣＤ３４^＋細胞の＞９
０％を標識する（ｍａｒｋ）であろう。

【０００７】従って、幹細胞である骨髄中の細胞の総数
の小さな集団、より分化した細胞とは別個の幹細胞に関
与するマーカーの不確かさ（ｕｎｅｒｔａｉｎｔｙ）、
生物学的アッセイのヒト幹細胞に対する一般的無能力の
観点から、幹細胞の同定及び精製はつかまえどころがな
かった。

【０００８】最近、マウス幹細胞が精製された形態では
ないが少なくとも高度に濃縮された形態で得られたが、
そこでは骨髄から得られた約３０より少ない細胞が致命
的に照射されたマウスの造血系のすべての系を再構成す
ることができた。実際、１個の注入された細胞でもすベ
ての造血系を再構成することができるであろう。

【０００９】Ｔｈｙ−１分子はラット、マウス及びヒト
の脳及び造血系に存在する高度に保存されたタンパク質
である。これらの種はこの抗原を区別をつけて（ｄｉｆ
ｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現するが、この分子の真の
機能は知られていない。しかしながら、 Ｔｈｙ−１分
子はラット及びマウスの造血幹細胞上で同定された。こ
の蛋白質はまたヒトの骨髄細胞上にも存在し、造血幹細
胞の選択に有用である。

【００１０】ヒトの造血幹細胞の同定に対して強い関心
がよせられている。幹細胞を手にすることによりその自
己再生に関与する成長因子の同定が可能になるであろ
う。加えて、（１）幹細胞の特定の系統への献身（ｄｅ
ｄｉｃａｔｉｏｎ）の初期の工程、（２）かかる献身の
防止、及び（３）幹細胞増殖の負の制御、に関与する未
発見の成育因子があるかもしれない。

【００１１】幹細胞を利用できると、骨髄移植のみなら
ず骨髄の移植と共に他の器官の移植に非常に有用であ
る。幹細胞は遺伝子治療の重要なターゲットであり、そ
こでは挿入された遺伝子が幹細胞を移植した個人の健康
を促進する。

【００１２】加えて、幹細胞を単離できると、リンパ腫
及び白血病、さらには他の腫瘍状態、例えば胸癌の治療
に役立つかも知れない。かくして、実質的に純粋である
かまたは純粋な形態でヒト造血幹細胞を単離することに
向けての世界的規模での努力がなされてきた。

【００１３】

【従来の技術】米国特許４７１４６８０はヒト幹細胞を
含有する組成物を記述している。ヨーロッパ特許公開
（ＥＰＡ）８９．３０４６５１．６はマウス幹細胞の単
離を記述している。そこで引用された文献も参照された
い。造血系先祖の分析はＷｈｉｔｌｏｃｋ及びＷｉｔｔ
ｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ（１９８２）７９：３６０８及び
Ｗｈｉｔｌｏｃｋら、Ｃｅｌｌ（１９８７）４８：１０
０９によって報告されている。

【００１４】Ｔｈｙ−１は齧歯動物の骨髄細胞を再構成
することについての表面マーカーである（Ｂｅｒｍａｎ
及び Ｂｒａｕｓｈ Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．（１
９８５）１３：１９５２及び Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄ
ｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：１
３５１）。Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｓｉｅｂｕｒｇら、Ｃｅｌ
ｌ（１９８６）４４：６５３はＴｈｙ−１ Ｌｉｎ⁻マ
ウス造血幹細胞及び制御希釈（ｌｉｍｉｔｄｉｌｕｔｉ
ｏｎ）の使用を記述している。

【００１５】

【発明の概要】ヒト造血幹細胞の実質上均質な組成物の
単離をもたらす方法が提供される。この方法は予め定め
られた分離方法及び単離された細胞からの各造血系の発
生を確立するバイオアッセイを採用する。

【００１６】ヒト幹細胞は（１）幹細胞を欠く宿主の造
血系の再生、（２）病気にかかっており、骨髄の取り出
し、幹細胞の単離及び幹細胞の再移植（ｒｅ−ｅｎｇｒ
ａｆｔｍｅｎｔ）に先立つ薬物または照射による個々体
の治療によって治療し得る宿主、（３）種々の造血細胞
の生産、（４）幹細胞自己再生に関与する成育因子の検
出及び評価、（５）造血細胞系の発生、及び造形系の発
生に関与する因子についてアッセイ、及び（６）自系幹
細胞における遺伝子置換による遺伝病の治療に、用途を
見い出す。

【００１７】

【具体的態様の説明】実質上特定の系統に捧げられた
（付された）（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）細胞及び系への献
身（ｄｅｄｉｃａｔｉｏｎ）に関与するマーカーを有す
る細胞を含有しないヒト幹細胞組成物が提供され、そこ
で、幹細胞は再生し分化して種々の造血系を生成させる
ことができる。

【００１８】実質上均質な組成物は分化細胞と関連する
マーカーを欠き、他方幹細胞に関連するエピトープの特
性を示す細胞の選択的単離によって、及び定められた培
養系で、異なる造血細胞系をもたらす、単離した幹細胞
を再生することによって得ることができる。

【００１９】幹細胞は抗体によって同定される特異的な
エピトープ部位と関連するマーカーの存在、及びある種
の抗体の結合の欠如によって同定されるある種のマーカ
ーの不存在によって特徴づけられる。

【００２０】選択を幹細胞に特異的なマーカーを用いて
行うことは必要ない。負の選択（細胞の除去）と正の選
択（細胞の単離）の組合せを用いることによって実質上
均質な幹細胞組成物を得ることができる。

【００２１】望まれる場合には、最初に「比較的粗い」
分離によって大部分の分化細胞を除去することも可能で
ある。細胞の由来は骨髄；胎児、新生児もしくは大人や
他の造血細胞源、例えば胎児肝臓、末梢血液、臍帯血等
であることができる。

【００２２】例えば、まず最初に、多数の系統に付され
た（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞、すなわちＴ細胞、Ｂ細
胞、（プレＢ及びＢ細胞）、骨髄単球細胞等の系をはじ
めとする造血系の大部分の細胞集団、または巨核球、肥
満細胞、好酸球及び好塩基球等の少数の細胞集団を除去
するために磁気ビーズ分離を用いることができる。

【００２３】望ましくは、全造血細胞の少なくとも約７
０％、通常少なくとも８０％が除去される。初期の段階
ではあらゆる献身した（ｄｅｄｉｃａｔｅｄ）細胞クラ
ス、特にマイナー集団メンバーを除去する必要はない。
通常、区分け（ｓｏｒｔｉｎｇ）に先立って血小板及び
赤血球を除去する。

【００２４】プロトコル中に正の選択があるので正に選
択されるマーカーを欠く系統に付された細胞は取り残さ
れる。しかしながら、すべての系統に付された細胞系に
対する負の選択があるのが好ましく、その結果最終の正
の選択において存在する系統に付された細胞の数を最小
にすることができる。

【００２５】幹細胞はその多くの場合、ＣＤ３４^＋，Ｃ
Ｄ３⁻，ＣＤ７⁻，ＣＤ８⁻，ＣＤ１０⁻，ＣＤ１
４⁻，ＣＤ１５⁻，ＣＤ１９⁻，ＣＤ２０⁻，ＣＤ３３
⁻及びＴｈｙ−１^＋であることによって特徴づけられ
る。幹細胞が高度に濃縮された細胞組成物はＣＤ３
４^＋，ＣＤ１０⁻，ＣＤ１９⁻，及びＣＤ３３⁻であ
り、より特定的にはさらに ＣＤ３⁻及び ＣＤ８⁻で
あり、好ましくはさらにＴｈｙ−１^＋である。

【００２６】ＣＤ３⁻，８⁻，１０⁻，１９⁻，２０⁻
及び３３⁻は Ｌｉｎ⁻という。ＣＤ１０／１９／２０
マーカーはＢ細胞と関連を有し、ＣＤ３／４／８マーカ
ーはＴ細胞と関連を有し、ＣＤ４／１５／３３細胞マー
カーは骨髄系細胞と関連を有する。Ｔｈｙ−１マーカー
はヒトＴ細胞には欠如している。

【００２７】また、ヒトＣＤ３４^＋についてはローダミ
ン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）１２３が細胞を高いサブセッ
トと低いサブセットに分けることができる。マウス幹細
胞に関してのローダミン１２３の使用の記述について
Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７，７４３３を参照された
い。好ましくは細胞はローダミン低（ｌｏｗ）である。

【００２８】主題の幹細胞を得るには、骨髄または他の
造血源中の他の細胞から希な多能性のヒト幹細胞を単離
することが必要である。まず、骨髄細胞は骨髄源、例え
ば腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊椎または他の骨腔（ｂｏｎ
ｅ ｃａｖｉｔｙ）から得ることができる。ヒト造血幹
細胞の他の入手源は胚卵黄包、胎児肝臓、胎児及び成人
の脾臓、成人末梢血液及び臍帯血をはじめとする血液を
包含する。

【００２９】胎児骨または他の骨源からの骨髄の単離に
際しては、骨から洗い出す（ｆｌｕｓｈ）のに適当な溶
液を用いることができ、かかる溶液は平衡塩溶液であ
り、一般に約５−２５ｍＭの低濃度の許容し得る緩衝液
と一緒にしたウシ胎児血清もしくは他の天然性因子を補
った平衡塩溶液であるのが好都合である。好都合な緩衝
液はヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液
等である。他の方法として常法に従って骨から骨髄を吸
引することができる。

【００３０】３４^＋ Ｔｈｙ^＋ Ｌｉｎ⁻細胞の形態学
的評価は多能性の先祖である「幹細胞」が中位のサイズ
であることを示している。光散乱評価は「幹細胞」が低
い側面散乱（ｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ）を有する芽細
胞のプロフィールを有することを示している。

【００３１】これらの観察は「幹細胞」が独特の密度プ
ロフィールを有することを示している。密度分別された
ヒト骨髄からの低密度画分はＣＤ３４^＋ Ｔｈｙ^＋ Ｌ
ｉｎ⁻細胞について富化されていることが見い出され
た。

【００３２】最初に、系統に付された細胞を除去するこ
とによって細胞を分離するために種々の技術を用いるこ
とができる。特定の細胞系及び／または分化の段階と関
連するマーカー（表面膜タンパク質）を同定するのにモ
ノクローナル抗体が特に有用である。

【００３３】粗分離に備えて固体支持体に抗体を付着さ
せる。用いられる分離技術は回収する画分の生存能力の
保持を最大にするものであるべきである。「比較的粗
い」分離、すなわち、存在する、マーカーを有する総細
胞の１０％まで、通常約５％以下、好ましくは約１％以
下が保持されるべき細胞集団と共に残存するような分離
のため、種々の異なる効能の技術を用いることができ
る。

【００３４】用いられる特定の技術は分離効率、方法の
細胞毒性、作業の容易さ及び速度、及び高性能の器具及
び／または技術的熟練の必要性による。

【００３５】分離方法は抗体で被覆した磁性ビーズを用
いる磁気分離、アフィニィティークロマトグラフィー、
モノクローナル抗体に結合させるかモノクローナル抗体
と組み合わせて用いる細胞毒、例えば補体と細胞毒、固
体マトリックス、例えばプレートに付着させた抗体によ
る「えり分け」（ｐａｎｎｉｎｇ）、または他の簡便な
技術を包含する。

【００３６】正確な分離を与える技術は性能の程度、例
えば複数の色彩チャネル低アングル及び鈍い光散乱を検
出するチャネル、インピーダンスチャネル等を変化させ
ることができる蛍光活性化細胞区分け機（ｆｌｕｏｒｅ
ｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒ
ｔｅｒｓ）を包含する。

【００３７】用い得る１つの手順は骨髄からの細胞を短
時間、低下した温度、一般に約４℃で特定の細胞型に対
して特異的な抗体、例えばＴ細胞決定子（ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｎｔ）についてはＣＤ３及び８の飽和レベルで培
養した後の最初の段階にあり、ついで細胞を胎児子ウシ
血清（ＦＣＳ）緩衝剤（ｃｕｓｈｉｏｎ）で洗浄する。

【００３８】ついで細胞を上記した如き緩衝剤培地に懸
濁し、抗体または抗体−抗原複合体に特異的な種々のタ
ンパク質を用いる特定の決定子についての抗体によって
細胞を分離する。

【００３９】簡便には、抗体は直接的分離を可能にする
磁気ビーズ、支持体に係合させたアビジンもしくはスト
レプトアビジンで除去し得るビオチン、蛍光活性化細胞
区分け機について用いることができる蛍光色素等のマー
カーと結合させることができ、これによって特定の細胞
型の分離が容易になる。残存する細胞の生存にとって不
当に有害でないいずれの技術も用い得る。

【００４０】便利には、成熟細胞マーカーを欠く細胞の
一般に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも約７０
％の実質的富化の後、蛍光活性化細胞区分け機（ＦＡＣ
Ｓ）または他の高特異性を有する方法によって細胞を分
離し得る。特に好都合なＦＡＣＳについては多色分析
（ｍｕｌｉ−ｃｏｌｏｒ ａｎａｌｙｓｅｓ）を用いる
ことができる。

【００４１】特定の抗原に対する染色のレベルをもとに
して細胞を分離できる。第１の分離では少なくとも約１
×１０^１０、好ましくは少なくとも約３×１０^１０の細
胞から始め、ＣＤ３４に対する抗体を１つの蛍光色素で
標識し、他方種々の系統に付された細胞に対する抗体は
別個の蛍光色素に結合させる。

【００４２】多色分析に用い得る蛍光色素はフィコエリ
スリン（藻紅素）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈ
ｙｃｏｃｙａｎｉｎｅｓ）等のフィコビリタンパク質
（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎｓ）、フルオレセ
イン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）等を包含
する。

【００４３】各系は別個の工程で分離できるが、望まし
くはＣＤ３４または同等のマーカーについて系をポジテ
ィブに選択するときに同時に分離する。一般に得られる
細胞数はもとの細胞の約１％より少であり、一般的には
約０．５％より少であり、０．２％以下という低さにす
ることもできる。

【００４４】ついで細胞をさらに Ｔｈｙ^＋についてポ
ジティブに選択することによって分離するが、ここでは
細胞は一般にもとの細胞の０．５％より少なくなり、一
般的には０．０１−０．５％の範囲となる。死んだ細胞
と結合する色素〔ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉ
ｕｍ）、ＬＤＳ〕を用いることによって細胞を死んだ細
胞に対して分離できる。

【００４５】望ましくは、細胞は２％胎児子ウシ血清を
含有する培地中に回収する。アフィニティーカラム等の
正確な分離を可能にする、ポジティブ選択のための他の
技術を用いることができる。この方法は非−幹細胞集団
の約２０％より少ない、好ましくは約５％より少ない残
量への除去を可能にする。

【００４６】ＣＤ３４^＋ Ｌｉｎ⁻及びＣＤ３４^＋ Ｌ
ｉｎ⁻ Ｔｈｙ−１^＋はＦＡＣＳ分析によって低い側面
散乱及び低い前方散乱（ｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅ
ｒ）プロフィールを有する。細胞スピン（ｃｙｔｏｓｐ
ｉｎ）プレパラート（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）は成
熟リンパ球系細胞及び成熟顆粒球との間のサイズを有す
る幹細胞を示す。細胞は光散乱性のみならず種々の細胞
表面抗原の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に基いて選択
し得る。

【００４７】本発明にとって分離の特定の順序は重要で
ないと考えられるが、示される順序が好ましい。好まし
くは、幹細胞に関連を有するマーカーのポジティブ分離
及び系統に付された細胞に関与するマーカーについての
ネガティブ選択を用いて、まず粗い分離によりついで精
密な分離により細胞を分離する。この分離の後、多系潜
在能力及び高められた自己再生能力を有する細胞組成物
についての選択を行う。

【００４８】９０％より多くの、通常は約９５％より多
くのヒト幹細胞を含有する組成物はこの方法によって得
ることができ、そこでは目的とする幹細胞をＣＤ３
４^＋，Ｌｉｎ⁻及び Ｔｈｙ^＋であること並びに細胞再
生及び種々の造血系のすべてのメンバーの発生を与える
ことができることによって同定する。

【００４９】究極的に、単一の細胞を幹細胞組成物から
得ることができ、細胞が生体内の適当な環境に位置する
（ｂｅ ｌｏｃａｔｅｄ）ことを保証することができる
なら、免疫欠損のヒトの長期再生に用いることができ
る。

【００５０】主題の組成物は適当な培養〔骨髄系細胞の
生産のためにはヒドロコルチゾンを供給する培養（デク
スター（Ｄｅｘｔｅｒ）型培養と結びつける）、ヒドロ
コルチゾンを欠く培養においてＢリンパ球（Ｗｈｉｔｌ
ｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅ型培養と結びつける）〕によって、
骨髄系及びリンパ球系細胞を生産することが見い出され
ている。各培養において、種々の株ＡＣ３またはＡＣ６
から生ずるマウスまたはヒトのストローマ細胞（ｓｔｒ
ｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）が提供され、このストローマ細
胞は、ヒト幹細胞等を維持する能力について選択するこ
とによってマウスもしくはヒトの胎児骨髄から導かれる
ものである。細胞を培養するのに用いる培地はＩＭＤＭ
（Ｉｓｃｏｖｅの改良Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地）、ＩＭＤ
ＭとＲＰＭＩの５０：５０混合物等の一定の栄養の豊富
な（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地であることが適当であり、
一般に塩類、アミノ酸類、ビタミン類、５×１０^−５Ｍ
２−ＭＥ、ストレプトマイシン／ペニシリン及び１０％
胎児子ウシ血清より構成され、また時々、一般に１週間
に少なくとも約１〜２回取り替える。

【００５１】特に、ヒドロコルチゾンを用いたある培養
から細胞をヒドロコルチゾンを含まない他の培養に移行
させ、ついで異なる培養細胞中の異なる系のメンバーの
生産を実証することによって、幹細胞の存在及びその維
持が支持される。このようにして、骨髄系細胞とＢ細胞
の両方の生産を同定し得る。

【００５２】Ｔ細胞への分化を実証するため胎児胸腺を
単離し、これを約２５℃で４〜７日培養して、胎児胸腺
のリンパ球系集団を実質上涸渇させる。ついでテストす
る細胞を胸腺組織にマイクロ注入すると、注入された集
団のＨＬＡが胸腺のＨＬＡと不適当に組み合わされる
（不整合化される）。ついで胸腺組織をＥＰＡ ０３２
２ ２４０に記載されたｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに移
植、特に腎包（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｐｓｕｌ）中に移植
する。

【００５３】赤血球細胞については、ＢＦＵ−Ｅ単位を
同定する技術、例えば細胞が赤血球系直系を発生させ得
ることを実証するメチルセルロース培養〔Ｍｅｔｃａｌ
ｆ（１９７７）、Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１．Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン、１−２２７頁〕を用
いるのが適当である。

【００５４】骨髄系及びＢ細胞能力を同定するにあた
り、テストする集団をまずヒドロコルチゾン含有培養に
導入し、かかる培養において６週間増殖させるのが適当
である。用いる培地は１０％ＦＣＳ、１０％ウマ血清、
ストレプトマイシン／ペニシリン、グルタミン及び５×
１０^−７Ｍヒドロコルチゾンを含有する ＲＰＭＩ １
６４０とＩＭＤＭの５０：５０混合物よりなる。

【００５５】６週間の間に、先祖細胞の不存在下ではす
べての成熟細胞は死滅するであろうことが予想される。
６週間の終りに、骨髄細胞が依然として観察されるな
ら、骨髄細胞への絶えざる分化を提供する先祖細胞が存
在していると結論できる。

【００５６】ついでこの時点で培地を変えてヒドロコル
チゾンを欠く培地としＢ細胞の増殖を奨励する。３−４
週間待ってＦＡＣＳ分析によってＢ細胞の存在を実証す
ることにより、以前に骨髄系細胞を生産することができ
た先祖細胞がＢ細胞を生産することもできると結論でき
る。

【００５７】ヒドロコルチゾンの存在下に増殖させたヒ
ト造血系細胞は少なくとも４ケ月維持できる。同様にヒ
ドロコルチゾンの不存在下に増殖させたヒト造血系細胞
は少なくとも４ケ月骨髄系細胞のみならずＢリンパ球
（ＣＤ１９^＋）を含有する。

【００５８】先祖造血幹細胞が実質上濃縮された組成物
を提供するこれらの培養から、ＣＤ３４^＋ Ｌｉｎ⁻，
ＣＤ３４^＋ Ｔｈｙ^＋，Ｔｈｙ^＋ Ｌｉｎ⁻またはＣＤ
３４^＋ Ｔｈｙ^＋ Ｌｉｎ⁻ について区分することが
できる。

【００５９】これらの培養から得られるＣＤ３４^＋ Ｌ
ｉｎ⁻，ＣＤ３４^＋，Ｔｈｙ^＋ Ｔｈｙ^＋ Ｌｉｎ⁻ま
たはＣＤ３４^＋ Ｔｈｙ^＋ Ｌｉｎ⁻細胞は上述のアッ
セイにおいてＢ細胞、Ｔ細胞及び骨髄単球細胞を生じさ
せる。

【００６０】多能性のヒト幹細胞は以下の如く定義でき
る：（１）すべての定められた血液リンパ球系の系にお
いて子孫を生じる、及び（２）限られた数の細胞が、重
い免疫無防備状態のヒト宿主を、細胞再生による多能性
造血幹細胞を含めてのすべての血液細胞型及びそれらの
先祖において、十分に再構成することができる。

【００６１】主題の組成物においては、全骨髄移植物中
に含まれる幹細胞の数（〜１０^７）に比較して、約 １
０^７の総計より少ない細胞、通常 １０^６より少ない細
胞を用いて免疫無防備状態のヒト宿主を再構成すること
ができる。幹細胞が自己再生できる適切な場所で適切な
シーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）が起こるのを保証する
のにある数の細胞が必要とされる。

【００６２】自己再生のための適当な場所でシーディン
グされるのに必要とされる細胞の数は５０個より小であ
り、合計約２０細胞以下という低い数でも上述の条件を
全うすることができる。

【００６３】かくして、もっともはじめの先祖である多
能性幹細胞についての標準セットに基いて主題組成物は
これらの要求を満足することができる。さらに骨髄細胞
の分析に基づいて、主題細胞は骨髄細胞の約０．０１〜
０．１％、特に０．０１〜０．０５％の範囲内にあると
考えられる。

【００６４】幹細胞が単離されたら、それらは次のよう
にして増殖させることができる。すなわち、骨髄細胞、
胎児胸腺または胎児肝臓から得られそしてこれらのスト
ローマ細胞との共存培養により幹細胞維持と関連する成
長因子の分泌を提供するストローマ細胞等のごときスト
ローマ細胞からのコンディショニング培地中で成長させ
ることによって増殖させることができる。

【００６５】あるいは、ストローマ細胞が同種異系（ａ
ｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）であるかまたは移植物に対し異種
（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）である場合、幹細胞の増殖を
支持する維持因子を含有する培地中で増殖させてもよ
い。

【００６６】共存培養で用いる前に、混合ストローマ細
胞調製物から、望ましくない細胞を除去するため適当な
モノクローナル抗体を用いて、例えば抗体−毒素複合
体、抗体及び補体等を用いて、造血細胞を除去すること
ができる。別法としてストローマ細胞系が同種異系であ
るか移植物に対し異種であってもよいクローン化したス
トローマ細胞系を用いることができる。

【００６７】本細胞組成物は種々の方法で使用すること
ができる。該細胞はナイーブ（ｎａｉｖｅ）なので、照
射されたホスト及び／または、化学療法を受けたホスト
を十分に再構成する（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）のに
用いることができる。

【００６８】また該細胞は種々の因子、例えばエリトロ
ポイエチン、コロニー刺激因子（例えばＧＭ−ＣＳＦ，
Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン（例えば
ＩＬ−１，−２，−３，−４，−５，−６，−７，−８
等）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、スティール因子（Ｓ
ｔｅｅｌ Ｆａｃｔｏｒ）（Ｓｔｌ）等を用いることに
よって、本細胞を成熟させ、増殖させ、及び１以上の選
ばれた系へ分化させることを通して特定の系のための細
胞源として用いることができ、あるいは幹細胞と関連す
るストローマ細胞は適当な系統に入る。幹細胞はまた造
血細胞の分化及び成熟に関与する因子の単離及び評価に
用いることができる。

【００６９】かくして、幹細胞はコンディション化培地
等の培地の活性を測定するアッセイ、また細胞成長活性
のための流体、特定の直系の献身との関連等を評価する
アッセイに用いることができる。

【００７０】幹細胞は遺伝病の治療に用いることができ
る。造血細胞に関連する遺伝病は自己のまたは同種異系
の支質細胞の遺伝子欠損（ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｅｆｅｃ
ｔ）を訂正する（ｃｏｒｒｅｃｔ）ための遺伝子修飾に
よって治療できる。

【００７１】例えばＢ−サラセミア（地中海貧血）、鎌
状細胞貧血、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、リコンビ
ナーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）欠乏症、リコンビナ
ーゼ調節遺伝子欠乏症等の病気を、野性型遺伝子の幹細
胞への相同もしくはランダム組換えによる導入によって
治療することができる。

【００７２】同種異系の幹細胞については遺伝子欠損が
ない正常細胞を治療に用いることができる。遺伝子治療
の他の適応は薬物耐性遺伝子の導入によって正常幹細胞
に利点を有せしめ、選択的圧力、例えば多薬物耐性遺伝
子（ＭＤＫ）を受けやすくすることである。

【００７３】造血細胞と関連性を有する病気以外の病気
であっても、その病気がホルモン、酵素、インターフェ
ロン、因子等の特定の分泌産物の欠如に関するものであ
るなら治療できる。適切な調節開始領域を用いることに
よって、欠損タンパク質の誘導生産を、タンパク質の生
産が、かかるタンパク質を正常に生産する細胞型とは異
なる細胞型による生産であっても、天然の生産に匹敵す
るように、行うことができる。

【００７４】リボザイム、アンチセンスまたは他のメッ
セージを挿入して特定の遺伝子産物または病気、特に血
液リンパ性疾患へのかかりやすさを抑制することも可能
である。

【００７５】別法として、Ｔ細胞レパートリーからＴ細
胞受容体の特定可変領域を除去することも望み得る。相
同組換え、または発現を防止するアンチセンスもしくは
リボザイム配列を用いて特定のＴ細胞受容体の発現を抑
制し得る。

【００７６】ＨＩＶ，ＨＴＬＶ−Ｉ及びＩＩ等の血液性
病原体に対しては幹細胞を遺伝子的に修飾して幹細胞ま
たは幹細胞から分化させた細胞中の病原体の増殖を防止
するアンチセンス配列もしくはリボザイムを導入するこ
とができる。

【００７７】哺乳動物細胞での組換えの方法は Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９） Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。

【００７８】該細胞は液体窒素温度で凍結し、長時間貯
蔵し、解凍し、再使用することができる。細胞は通常１
０％ＤＭＳＯ、７０％自己血漿（２５００ｒａｄで照
射）、２０％Ｔｃ１９９（組織培養培地）中で貯蔵す
る。

【００７９】細胞はプログラムに組み込み得る冷凍機中
液体窒素中− １８０℃で凍結する。解凍後、幹細胞増
殖及び分化に関連する成育因子または支質細胞の使用に
よって細胞をふやす（ｅｘｐａｎｄ）ことができる。以
下の実施例は例示のためであり、限定のためのものでは
ない。

【００８０】実 験 材料及び方法 抗体。種々のマーカーに対する抗体が以下のようにして
得られた：ＣＤ３，８，１０，１４，１５，１９，２
０，３３，３４（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ），ＣＤ３３（Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ），（Ｄａｌｃｈａｕ及びＦａｂｒｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．（１９７９）１４９：５７６）。ＣＤ３４抗体
（ＩｇＧ_３）Ｔｕｅｋ３はＡ．Ｚｉｅｇｌｅｒ（Ｌｅｕ
ｋｏｃｙｔｅＴｙｐｉｎｇ ＩＶ；Ｗｈｉｔｅ ｃｅｌ
ｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎｓ
１９８９，８１７）。

【００８１】ＣＤ３，−８，−１０，−１４，−１５，
−１９，−２０，−３３はＦＩＴＣ複合体として購入し
た。Ｚｉｅｇｌｅｒからの抗体はフルオレセイン（Ｆ
Ｌ）、フィコエリトリン（ＰＥ）またはテキサスレッド
（ＴＲ）（Ｃａｌｔａｇ）に複合化させた適切な抗−Ｉ
ｇＧ_３を用いて検出した。 Ｔｈｙ−１抗体はフルオレ
セイン、フィコエリトリンまたはビオチン複合体であ
り、ビオチン複合体はＴＲ，ＦＬまたはＰＥ−アビジン
（Ｃａｌｔａｇ）を用いて検出した。

【００８２】蛍光活性化細胞区分け機（ｓｏｒｔｅｒ）
（ＦＡＣＳ）分析及び区分け（ｓｏｒｔｉｎｇ） Ｐａ
ｒｋｓ及びＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．（１９８４） １０８：１９７に記述されたよ
うに修飾した Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆ
ＡＣＳを用いた。２つの部分からなる（ｄｕａｌ）レー
ザー器具は各分析細胞について記録する４つの蛍光パラ
メーター及び２つの光源散乱パラメーターを可能にす
る。

【００８３】残りの赤血球及び死細胞及び破片は光散乱
ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）及びＰＩ（ヨウ化プロジ
ウム）染色まはた４−色分析中のみでの散乱による分析
から除外された。フルオレセインとフィコエリトリン、
及びフルオレセインとヨウ化プロピジウムの空間的重複
（ｓｐａｔｉａｌ ｏｖｅｒｌａｐｓ）に対する補正
（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）は記述された（Ｐａｒｋ
ｓ及びＨｅｒｚｅｎｂｏｒｇ（１９８４）、上述）よう
にして電子的に調整した。

【００８４】４色染色は、結果が蛍光色素の種々の空間
的重複にかかわらず一貫している（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎ
ｔ）ことを保証するために、異なる蛍光色素に結合させ
た同じ試薬のいくつかの組合せを用いて行った。加え
て、４色分析の結果は２及び３色分析からデータと比較
することによって較正した（ｂｅ ｃａｌｉｂｒａｔｅ
ｄ）。

【００８５】細胞区分けのため、染色サンプルを区分け
操作中４℃に維持した。区分けされた滴を１０％胎児子
ウシ血清（Ｈａｚｅｌｔｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｉ
ｎｃ．，Ｌｅｎｃｘａ，ＫＳ）を含有するＲＰＭＩ１６
４０中に集めた。２色ソート（ｓｏｒｔｓ）は死細胞を
標識するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共に、ＣＤ３４
を標識するフィコエリトリン及びＬＩＮ細胞を標識する
フルオレセインを用いた。

【００８６】両信号は単一のＦＡＣＳチャネルで検出さ
れ除外された。３色ソートはＣＤ３４を標識するテキサ
スレッド、Ｌｉｎ細胞を標識するフィコエリトリン及び
Ｔｈｙ−１細胞を標識するフルオレセインを用いた。
ＦＡＣＳによる細胞集団の単離に続いて、サンプルをＨ
ＢＳＳで１：１希釈し、ＲＣＦ２００で１０分遠心分離
し、血球計計測のため ＨＢＳＳ５０または１００μｌ
中に再懸濁した。

【００８７】培養アッセイは次のようにして行った。種
々のネズミのストローマ細胞系を用いたが、それらのう
ち３つはＷｈｉｔｌｏｃｋら、ｃｅｌｌ（１９７８）４
８：１００９−１０２１に記述されている。コンフルエ
ント状態のストローマ細胞層を、継代なしに組織培養培
地を５−７日毎に取り替えながら３−４週まで維持し
た。

【００８８】ストローマ細胞層を無血清培地で３回洗浄
し、ついで無血清培地中０．５ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ
−ディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，
ＩＮ）の２．５ｍｌ（Ｔ−２５フラスコ）を上からかけ
た（ｂｅ ｏｖｅｒｌａｉｄ）。培養細胞を３７℃で１
５−３０分培養し、ついで酵素含有培地中の細胞を集
め、血清を含有する ＲＰＭＩ−１６４０培地を加え
た。

【００８９】支質細胞をパスツールピペットでピペッテ
ィングすることにより懸濁し、もとの細胞濃度の１／５
〜１／５０で直接培養した。一般に、１：１０で継代培
養した融合性皮質層は５−７日後に再び融合状態（ｃｏ
ｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達した。１穴あたり３０〜０．３
細胞の限定希釈培養によってサブクローンを得た。ヒト
ストローマ細胞系を同様に処理した。

【００９０】ヒト胎児骨髄の細胞懸濁液は妊娠１０−１
８週の胎児の長骨から調製した。骨を縦に裂き、骨髄腔
を表面削り刃で削る。ついで骨をＲＰＭＩ−１６４０中
コラゲナーゼ／ディスパーゼの１ｍｇ／ｍｌ溶液中に入
れる。

【００９１】骨を３７℃で３０分インキュベートし、つ
いで骨髄腔を培地（ペニシリン／ストレプトマイシン、
２−ＭＥ及び５％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４
０）をどっと流して洗い（ｂｅ ｆｌｕｓｈｅｄ）造血
系細胞を除去する。別法として、骨髄腔からコラゲナー
ゼ／ディスパーゼ処理なしに骨髄を洗い出す。

【００９２】１６−２０週妊娠胎児の肝臓から細胞懸濁
液を調製する。肝臓を切り刻み、ついでピペッティング
して細胞をとき放す。ついで細胞懸濁液をＦｉｃｏｌｌ
勾配上に加えて肝細胞、赤血球及び細胞破片を除去す
る。ついで造血系細胞を回収する。

【００９３】成人の骨髄を骨髄吸引液から得、ついで使
用前に処理して赤血球を除く。マウスもしくはヒトのス
トローマ細胞系の予め確立した融合性層の上に上記ヒト
細胞を乗せることによってかさばった（ｂｕｌｋ）培養
細胞を得る。Ｔ−２５フラスコもしくは６穴プレート中
の支質細胞上に３×１０^４〜２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌを、６穴プレートの各穴に３ｍｌまたはＴ−２５フラ
スコに５ｍｌを添加することによって加える。

【００９４】５０μｇ／ｍｌペニシリン／５０μｇ／ｍ
ｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、
２ｍＭグルタミン、５×１０^−５２−メルカプトエタノ
ール及び１０％胎児子ウシ血清を含有する、 ＲＰＭＩ
−１６４０とＩＭＤＭの５０：５０混合物を用いる。

【００９５】Ｄｅｘｔｅｒ型条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ｓ）に対しては５０μｇ／ｍｌペニシリン／５０μｇ／
ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウ
ム、２ｍＭグルタミン、１０％胎児子ウシ血清、２０％
ウマ血清及び１０^−６Ｍヒドロコルチゾンコハク酸ナト
リウムを含有するＩＭＤＭを用いる。

【００９６】Ｄｅｘｔｅｒ型培地で増殖させた骨髄細胞
によってもっぱら骨髄系分化を起こさせる。全細胞集団
でまたは細胞表面抗原の発現によって分別した細胞で培
養細胞を確立した（ＣＤ３４，ＨＬＡ−ＤＲ， Ｔｈｙ
−１、系マーカー）。

【００９７】制限希釈培養細胞をコンフルエント層とし
てマウスストローマ細胞を含有する９６穴プレートを用
いて調製した。ヒト細胞をタイトレートして段階的に低
濃度で少なくとも２４穴のプレートに各細胞濃度で入れ
た。ついでプレートを検査して各細胞数で陽性の穴のパ
ーセンテージを測定する。ついでデータをグラフにプロ
ットする。

【００９８】ＡＣ３及びＡＣ６共培養細胞 マウス骨髄皮質細胞系ＡＣ３またはＡＣ６で確立させた
共存培養細胞はヒト培養細胞のためのフィーダー（ｆｅ
ｅｄｅｒ）層として成功裏に役立ち、低細胞密度で繊維
芽細胞の過剰増殖を抑制した。

【００９９】（１） １００より大の胎児骨髄、胎児肝
臓または成人骨髄サンプルからの細胞懸濁液を２０週ま
での間培養したところ、この期間中造血細胞を連続的に
生産した。このことは初期ヒト先祖すなわち幹細胞がこ
れらの培養細胞で確立されたことを示している。

【０１００】（２）培養細胞はマウスストローマ細胞に
付着した小型〜中型のヒト骨髄細胞を示し、増殖は培養
の最初の１〜３週に亘って（ｏｖｅｒ）起こり、その後
はかなり安定に残る。

【０１０１】（３）細胞はストローマ細胞に被さった非
付着性及び付着性の細胞よりなるゆるい集合体を形成
し、他方ストローマ細胞は上層の小形〜中形の細胞であ
る。全体として、培養細胞の外観はマウスの長期培養細
胞と同様である。

【０１０２】（４）細胞スピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）及
び蛍光活性化細胞区分け機（ＦＡＣＳ）分析はヒト血液
リンパ球系細胞の維持を示している。ヒドロコルチゾン
の不存在（Ｗｈｉｔｌｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅ様条件）下で
培養細胞は形態学によると骨髄系、単球系及びリンパ球
系の直系の混合物である。

【０１０３】細胞の大部分は骨髄系であり、多形核細胞
を成熟させる骨髄芽球と異なる。細胞の１５−４０％は
単核であり、これらの細胞の多くはリンパ球系の形態を
有する。

【０１０４】（５）細胞の約２０−４０％はＣＤ１５抗
体で染色され、また細胞の１０−５０％はＢ直系マーカ
ーＣＤ１０，ＣＤ１９またはＣＤ２０で染色され、かな
りの数のＢ細胞を示している。ＣＤ１９発現に対する胎
児骨髄から選択された細胞は培養において３週間より短
かくしか生残しない。

【０１０５】培養細胞中における４週より後でのＣＤ１
０^＋及びＣＤ１９^＋細胞の存在は初期Ｂ細胞が献身した
先祖から生じていることを示している。さらに、細胞の
１〜１０％は細胞質μ Ｈ鎖に対して染色し、このこと
はプレＢ細胞の存在を確認している。

【０１０６】１％より小しか ｓＩｇを発現しないのに
細胞のかなりの数がＣＤ２０を発現する。このことは初
期Ｂ細胞の少数しか示された培養条件下で成熟していな
いことを示している。さらに、細胞区分けによるＢ細胞
（ＣＤ１０，ＣＤ１９）の固渇後に開始した培養は培養
開始の１週間以内におけるＢ細胞の発生を示している。

【０１０７】（６）ヒドロコルチゾンの存在下（Ｄｅｘ
ｔｅｒ様条件）に開始した培養細胞は検出し得るＴ及び
Ｂ細胞を含有しておらず、ＦＡＣＳ分析及び細胞スピン
によって実証されるように大きなパーセンテージの顆粒
球及び骨髄系細胞を含有している。

【０１０８】有系分裂形態（ｍｉｔｏｔｉｃ ｆｉｇｕ
ｒｅｓ）の存在及びこれらの培養細胞の長期維持はある
種の活性な先祖細胞の存在を示している。これらのヒド
ロコルチゾン含有培養細胞をヒドロコルチゾンを含有し
ない培地に移した場合、２週間以内に２〜６％のＣＤ１
９細胞が見い出される。このデータはこの共培養系にお
ける活性な先祖細胞の存在をさらに実証する。

【０１０９】上記の共存培養系を用いて、種々の細胞副
次集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）中のコロニー
形成性細胞の頻度を測定するのに用い得る制限希釈アッ
セイが開発された。頻度は穴の３７％がコロニーを示さ
ない細胞数によって求める。

【０１１０】１つの代表的実験は全骨髄細胞の１／２０
００が応答した（ｒｅｓｐｏｎｄｅｄ）のに対し、細胞
の１／２００及び１／３０，０００がそれぞれＣＤ３４
^＋及びＣＤ３４⁻で応答した。

【０１１１】さらに、単一細胞アッセイを開発したが、
そこにおいてはＦＡＣＳで単一に区分けした先祖細胞を
マウスもしくはヒトの骨髄皮質細胞フィーダー（ｆｅｅ
ｄｅｒ）層を含有する９６穴プレートの各穴に入れる。

【０１１２】表７に示した結果は４０のＣＤ３４^＋ Ｌ
ＩＮ⁻細胞（Ｌｉｎ＝ＣＤ３，１０，１９，２０，１
５，３３）のうち１または８０のＣＤ３４^＋ ＬＩＮ^＋
細胞のうち１がコロニー形成（骨髄の０．５−１％）に
よって応答した。コロニーの分析はコロニーの４０％及
び２５％がそれぞれＣＤ３４^＋ ＬＩＮ⁻及びＣＤ３４
^＋ ＬＩＮ^＋集団において、ＦＡＣＳ及びメチルセルロ
ース分析（Ｂリンパ球系、骨髄系、赤血球系）によって
決定される多能性であることを示している。

【０１１３】さらに、ＣＤ３４^＋ Ｔｈｙ^＋細胞（骨髄
の０．１−０．５％）は２０穴中１穴でコロニー成長を
示す。コロニーの大部分（＞７０％）は多能性である。
新たな支質層へ移した後の成長に関してはＣＤ３４^＋
Ｔｈｙ^＋細胞がもっとも効率のよい集団である。

【０１１４】対照的にＣＤ３４^＋細胞の＞９０％を表す
ＣＤ３４^＋ Ｔｈｙ⁻細胞は共存培養アッセイで貧弱に
しか応答せず、４００細胞中１細胞しかコロニーを形成
せず、またどれも多能性でない。 Ｔｈｙ^＋集団も成熟
直系マーカーの発現に従ってサブ分割する（ｓｕｂｄｉ
ｕｉｄｅ）ことができる。

【０１１５】Ｔｈｙ^＋ Ｌｉｎ⁻細胞サブセット（骨髄
の０．１−０．５％）は単一細胞アッセイでよく応答す
る（１／２０）がＴｈｙ^＋ Ｌｉｎ^＋サブセットの応答
は貧弱であった（０／８００）。ＦＡＣＳ及びメチルセ
ルロースアッセイはＴｈｙ^＋Ｌｉｎ⁻細胞に由来するコ
ロニーの＞７０％が多能性であることを示している。

【０１１６】上記データは「幹細胞」がＣＤ３４及び
Ｔｈｙ−１を発現するが直系マーカーの発現を欠く細胞
のサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）中に存在することを示し
ている。この表現型を有する細胞は１０００の全体の骨
髄細胞中１細胞より少ない。

【０１１７】上述の条件下で成長する出発集団中の細胞
の頻度を求めることができる。頻度は穴の３７％が成長
を示さない細胞数によって求められる。ある研究による
と区分けされなかった細胞の１／１５００が応答するが
ＣＤ３４^＋画分の１／４０及びＣＤ３４⁻画分の１／４
０００が応答する。以下の表はインビトロ培養アッセイ
についての結果を示す。

【０１１８】

【表１】

【０１１９】

【表２】

【０１２０】胎児骨髄（ＦＢＭ）のＦＡＣＳ分離を画分
をＣＤ３４^＋，１０^＋，１９^＋及びＣＤ３４⁻，１
０⁻，１９⁻に分割することにより行った。ついで画分
をヒドロコルチゾンの不存在下で８週間連続的に成長さ
せ、ついで骨髄系細胞及びＢ細胞の存在についてスクリ
ーニングする。

【０１２１】

【表３】

【０１２２】別法として、胎児ＷＢＭをＦＡＣＳによっ
てＣＤ３４^＋，３３⁻，１０⁻，１９⁻に分離し、細胞
をヒドロコルチゾンの不存在下で成長させる。制限希釈
を用いることによって、約１０−１００の細胞を共存培
養細胞中で６週間より長い間維持することができ、かつ
成熟した、骨髄系細胞及びＢ細胞に分化することができ
ることが見い出される。

【０１２３】

【表４】

【０１２４】ＣＤ３４，３３，１０分離の結果を表４に
示す。区分けした細胞集団のみならず区分けされなかっ
た細胞も分離時点（ｔ＝０）及び２１日後（ｔ＝２１）
に分析した。ｔ＝０でのＦＡＣＳ染色プロフィールの分
析は骨髄系細胞及びＢ細胞がＣＤ３４^＋ ＣＤ１０⁻
ＣＤ３３⁻細胞から５％より少ない汚染Ｂ及び骨髄系細
胞で有効に除去されたことを示している。

【０１２６】対照的に２１日後ではＣＤ３４^＋ ＣＤ１
０⁻ ＣＤ３３⁻の約５０％がＢ細胞であった。さらに
ｔ＝０とｔ＝２１の間で細胞数の１０倍の増加があっ
た。従って、２１日間で全体として１００倍のＢ細胞の
増加があった。さらに、Ｂ細胞の約１／３が ｓＩｇを
カッパ及びラムダＬ鎖２：１の比で発現する。

【０１２７】この結果はＢ細胞がポリクローナルでＥｐ
ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス形質転換を発現しないこ
とを示している。対照的にＣＤ３４^＋ ＣＤ１０^＋ Ｃ
Ｄ３３^＋細胞は２１日間に亘ってＢ細胞及び総細胞数の
劇的な減少を示す。この結果はＣＤ１０及び／またはＣ
Ｄ１９を発現するＣＤ３４^＋細胞が長命の先祖でないこ
とを示している。

【０１２８】骨髄系細胞の分化はＦＡＣＳ及びメチルセ
ルロースアッセイによって分析した。ＦＡＣＳ分析はＣ
Ｄ３４^＋ ＣＤ１０⁻ ＣＤ３３⁻ 細胞サブセットに
おいて成熟骨髄系細胞の１０倍の増加を示す。メチルセ
ルロースデータの分析はＣＦＵ−ＧＭ及び ＢＦＵ−ｅ
活性の９０−９５％が時間０でＣＤ３４^＋ ＣＤ１０＋
ＣＤ３３^＋細胞サブセットに含有されることを示し
た。

【０１２９】しかしながら、２１日目では、ＣＤ３４^＋
ＣＤ１０^＋ ＣＤ３３^＋及びＣＤ３４^＋ ＣＤ１０⁻
ＣＤ３３⁻細胞集団はほぼ同等のＣＦＵ−ＧＭ及び
ＢＦＵ−ｅ細胞レベルを有する。従って、ＣＤ３４^＋
ＣＤ１０⁻ ＣＤ３３⁻細胞は培養中２１日に亘ってＢ
細胞（ＣＤ１９^＋ 細胞質μ^＋， ｓＩｇ^＋）、骨髄系
細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ）（ＣＤ１５^＋，−
３３^＋，ＣＦＵ−ＧＭ）及び赤血球系細胞（ｅｒｙｔｎ
ｒｏｉｄ ｃｅｌｌｓ）（ＢＦＵ−ｅ）を生じさせる能
力を有する。

【０１３０】細胞をＣＤ３４，ＣＤ１０，ＣＤ１９，Ｃ
Ｄ３３またはＣＤ３４，ＣＤ３，ＣＤ７，ＣＤ８，ＣＤ
１０，ＣＤ１４，ＣＤ１５，ＣＤ１９，ＣＤ２０，ＣＤ
３３を基に分離する場合も同様な結果が得られる。ＣＤ
３４^＋細胞を Ｔｈｙ−１^＋及び Ｔｈｙ−１⁻画分に
分けてメチルセルロース分析でアッセイすると、これら
２つの画分は表５に示すごとく同様な読取り（ｒｅａｄ
ｏｎｔ）を与える。

【０１３１】制限希釈によって及び共存培養においてア
ッセイすると、ＣＤ３４^＋， Ｔｈｙ−１^＋画分は１）
共存培養中に発生する（ｇｅｎｅｒａｔｅｄ）Ｂ細胞の
パーセンテージ、２）制限希釈アッセイにおける応答細
胞の頻度、及び３）単一細胞アッセイにおける応答細胞
の頻度（表５及び６）によって実証されるように先祖活
性が豊富化されている。

【０１３２】制限希釈アッセイにおいて７５％陽性の穴
（ｗｅｌｌ）を得るために、 Ｔｈｙ−１^＋画分は約１
／３０−１／５０細胞（ｃｅｌｌｓ）を要し、他方Ｔｈ
ｙ−１⁻画分は１／１７０−１／５００細胞（ｃｅｌｌ
ｓ）を要する。このことはＴｈｙ−１^＋画分が先祖細胞
についてさらに濃縮されていることを示している。

【０１３３】さらにインビボＴ細胞アッセイでアッセイ
すると Ｔｈｙ−１^＋画分はドナー由来Ｔ細胞を生じさ
せるのに対し、 Ｔｈｙ−１⁻画分は生じさせない。

【０１３４】

【表５】

【０１３５】

【表６】

【０１３６】Ｔ細胞発生についての胸腺アッセイは以下
のようにして行った。胎児胸腺断片（個々の胸腺葉）を
約１ｍｍ^３のサイズで得る。前駆体細胞に対する胸腺の
生体外受容性（ｒｅｃｅｐｔｉｕｉｔｙ）を刺激するた
めに断片を胸腺器官培養系中２５℃で３−７日培養す
る。

【０１３７】平衡塩溶液を含有するＦＣＳ中の約１０^０
−１０^４細胞よりなる細胞組成物を油充填測微用スクリ
ュー操作注射器に結合させたガラス製マイクロピペット
を用いて１μｌの容量で注入する。注入２４時間後に、
生体外でコロニー化した胸腺断片をＳＣＩＤマウスの腎
被膜（ｋｉｄｎｅｙ ｃａｐｓｕｌｅ）下に移植する。

【０１３８】ＥＰＡ ０３２２２４０参照。注入された
細胞は胸腺と不適当に組み合わされた（ｍｉｓｍａｔｃ
ｈｅｄ）ＨＬＡである。時々、受容動物を殺し、移植片
を回収する。細胞懸濁液をドナー由来Ｔリンパ球を（Ｃ
Ｄ３^＋，８^＋）の存在について２色免疫蛍光アッセイで
分析する。

【０１３９】

【表７】

【０１４０】

【表８】

【０１４１】上記結果は選ばれた細胞中の少しの集団が
最終的に分化したＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋Ｔ細胞になるＴ
細胞を生じさせることを示している。 Ｔｈｙ−１⁻集
団は検出し得るレベルの分化Ｔ細胞を与えないと考えら
れる。

【０１４２】ヒト骨断片は照射した（２００−３００ｒ
ａｄ（ラド））もしくは非照射のＣＢ１７ ＳＣＩＤ／
ＳＣＩＤマウスに種々の部位で（腹腔内（ｉ．ｐ．）、
皮下（ｓ．ｃ．）等）で移植できる。骨断片は少なくと
も９ケ月絶えずヒトのＢ、骨髄系及び赤血球系細胞を生
産しながら成長する。

【０１４３】骨断片はヒトの同種異系の先祖集団のため
の支えとなるマイクロ環境として働く。同種異系の骨髄
先祖（ＨＬＡクラスＩに対し不整合（ｍｉｓｍａｔｃ
ｈ））を受容マウス中への移植前もしくは後に骨断片中
に注入できる。

【０１４４】先祖細胞を移植前に注入する場合には、区
分けした細胞を骨にマイクロ注入し、注入骨を室温で一
夜インキュベートし、ついで ＣＢ１７ ＳＣＩＤ／Ｓ
ＣＩＤマウス（ｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．）に移植する。
先祖細胞を移植後にマイクロ注入する場合には、 ＧＢ
１７ ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤマウスに骨断片を移植する
（ｉ．ｐ．，ｓ．ｃ．）。

【０１４５】６週間後、骨移植片を照射し（マウスの遮
蔽で移植片に２００−１０００ｒａｄ）、ついで先祖細
胞を注入することができる。別法として、先祖細胞を非
照射骨断片に注入してもよい。

【０１４６】骨髄アッセイの結果はＣＤ３４^＋細胞が事
実上すべての骨髄再生能力を有していることを示してい
る。骨髄再生能力。

【０１４７】ＣＤ３４集団の副次分別はＣＤ３４サブセ
ット中の Ｔｈｙ^＋細胞（ＣＤ３４細胞の５％）が該Ｃ
Ｄ３４画分に事実上すべてのＢ細胞、骨髄系細胞及び赤
血球系先祖の活性を含有することを示した。このアッセ
イは１０と１０，０００の細胞の間で成功裏に行うこと
ができる。表９に概略を示す。

【０１４８】

【表９】

【０１４９】ヒト幹細胞の自己再生及び長命を評価する
ために二次移動アッセイ（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｔｒａ
ｎｓｆｅｒ ａｓｓａｙ）を用いることができる。ドナ
ー先祖細胞を上述の如くＨＬＡ不整合骨断片に注入す
る、２−３ケ月後、成長した（ｅｘｐａｎｄｅｄ）ドナ
ー細胞を「幹細胞」表現型（ＣＤ３４^＋， Ｔｈｙ^＋，
Ｌｉｎ⁻）について再区分けする。

【０１５０】ついでこれらの細胞を第２のＨＬＡ不整合
ドナー中に再注入する。１−３ケ月後、骨を種々の先祖
集団並びに幹細胞について評価する。このようにして、
種々の直系の造血系細胞を生じさせる「幹細胞」の長期
能力、並びに既知インプット「幹細胞」数から生じた
「幹細胞」の数を評価できる。

【０１５１】これによって幹細胞の自己再生について推
定できる。本アッセイにおいては本発明の幹細胞は長期
に亘る再生を与える。

【０１５２】本発明が本発明に沿ったヒト造血系幹細胞
の特性において実質上均質である細胞を提供することは
上記結果から明らかである。このように、特定の因子の
適切な選択、及び幹細胞の自己再生を見込んだバイオア
ッセイの開発、及び表面マーカーによる幹細胞のスクリ
ーニングによって、実質上均質の、生育能力を有するヒ
ト造血幹細胞組成物を種々の目的のために生産すること
ができる。

【０１５３】幹細胞は骨髄移植物中で用いることがで
き、そこで細胞から腫瘍性細胞や他の病原性の細胞、例
えばＨＩＶ−感染細胞を除去する。さらに、純粋な幹細
胞の使用は移植片−対−宿主の病気を排除するであろ
う。

【０１５４】さらに、細胞は適切な組換え（相同もしく
は非相同組換え）によって修飾して、遺伝子欠損を修復
し、または幹細胞中で、個々的にもしくは幹細胞一般に
ついて、天然的に欠けている遺伝的能力を供給すること
ができる。

【０１５５】さらに本組成物には実質上他の細胞が存在
しないので、幹細胞組成物は再生及び分離と関連する因
子を単離し、定義するのに用いることができる。

【０１５６】本発明で述べたすべての刊行物及び出願は
本発明が関与する分野における熟練者の熟練のレベルを
示すものである。すべての刊行物及び特許出願は各々の
刊行物または特許出願が具体的、個々的に引用により移
入されていると同じ程度にここに移入されるものであ
る。

【０１５７】今や本発明は十分に説明されているので、
当業者にとって添えられた特許請求の範囲の精神または
範囲から逸脱することなく多くの変化及び修飾をなし得
ることは当業者にとって明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チャールス エム．バウム アメリカ合衆国，カリフォルニア 94043，マウンテン ビュー，ティレラ コート 79 (72)発明者 相原 雄幸 神奈川県横浜市南区別塩５−６−16 511号 (72)発明者 アービング ウェイスマン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94305，パロ アルト，＃711，ウェルシ ュ ロード 1170

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞の８０％以上が、ヒト造血幹細胞性
   であり且つＣＤ３４⁺ １０^- １９^- ３３^- であることを
   特徴とする細胞組成物。
2. 【請求項２】 前記細胞がさらにＴｈｙ−１⁺ であるこ
   とを特徴とする、請求項１に記載の細胞組成物。
3. 【請求項３】 細胞成分が自己再生でき、そしてリンパ
   球系の、赤血球系の及び骨髄性単球の造血系のメンバー
   への分化を行うことができることを特徴とする、請求項
   １又は２に記載の細胞組成物。
4. 【請求項４】 共存培養培地中で自己再生でき、少なく
   ともＴ，Ｂ及びマクロファージの造血系のメンバーに分
   化でき、系統に付された細胞の含量が５％未満である、
   請求項３に記載の細胞組成物。
5. 【請求項５】 共存培養培地中で自己再生でき、リンパ
   球系の、骨髄細胞系の及び骨髄単球系の造血系のメンバ
   ーに分化でき、且つ系統に付された細胞の含量が５％未
   満である、請求項３に記載の細胞組成物。
6. 【請求項６】 ヒト造血幹細胞を含んで成る細胞組成物
   を得る方法において、ここで共存培養培地中で自己再生
   することができ且つリンパ球系及び骨髄単球系の造血系
   メンバーに分化することができる細胞が約１００個未満
   であり、前記方法が、ヒト造血幹細胞及び分化した細胞
   の混合物を、ヒトの造血細胞であり且つＣＤ３４ ⁺ ，１
   ０ ^- ，１９ ^- ，３３ ^- であることを特徴とする細胞を含
   んで成る実質的に均一な画分に分離することを含んで成
   る方法。
7. 【請求項７】 前記の分化が骨髄細胞系への分化であ
   り、そして前記共存培養培地がヒドロコーチゾンを含ん
   で成る、請求項６に記載の方法。