JP3140045B2 - Ｈｂｖのための改良した増幅核酸ハイブリダイゼーションアッセイ - Google Patents

Ｈｂｖのための改良した増幅核酸ハイブリダイゼーションアッセイ

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JP3140045B2 JP02507075A JP50707590A JP3140045B2 JP 3140045 B2 JP3140045 B2 JP 3140045B2 JP 02507075 A JP02507075 A JP 02507075A JP 50707590 A JP50707590 A JP 50707590A JP 3140045 B2 JP3140045 B2 JP 3140045B2
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Description

【発明の詳細な説明】 詳細な説明 技術分野 本発明は、核酸化学および生化学アッセイの分野に属
している。さらに詳しくは、本発明は、新規な核酸多量
体および核酸ハイリダイゼーションアッセイに関する。
背景技術 核酸ハイブリダイゼーション法は、遺伝子の研究、生
物医学の研究および臨床診断に、現在一般的に用いられ
ている。基本的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
では、分析物の一本鎖核酸（DNAおよびRNAの両方が標識
核酸プローブとハイブリダイズされ、得られた標識二本
鎖が検出される。放射性標識と非放射性標識の両方が用
いられる。
この基本的な機構の改変型が、検出すべき二本鎖を異
物から分離するのを容易にし、および／または検出され
るシグナルを増幅するために開発されている。
ヨーロッパ特許出願公開第0225807号には、溶液相核
酸ハイブリダイゼーションアッセイが記載されている。
この方法では、分析物の核酸を、標識化プローブセット
および捕獲（キャプチャー）プローブセットとハイブリ
ダイズさせる。プローブ分析物複合体は、ハイブリダイ
ゼーションによって、キャプチャープローブセットに相
補的な固体に担持されたキャプチャープローブと、結合
している。この方法によれば、分析物の核酸は、固体相
の複合体として溶液から取り出すことができる。分析物
が固体相複合体の形態で得られると、アッセイ中の次の
分離工程が容易になる。標識プローブセットは、ハイブ
リダイゼーションによって固体相／分析物複合体に結合
している標識したプローブと、相補的である。
PCT特許出願第84/03520号およびヨーロッパ特許出願
公開第124221号には、次のようなDNAハイブリダイゼー
ションアッセイが記載されている。すなわち（１）分析
物を酵素標識したオリゴヌクレオチドに相補的なテール
を有する一本鎖DNAプローブとアニールして、そして、
（２）得られたテールをつけた二本鎖を酵素標識オリゴ
ヌクレオチドとハイブリダイズさせる方法である。Enzo
Biochem社の“Bio−Bridge"標識化システムが、これら
２つの特許出願に記載されているシステムに類似してい
るようである。“Bio−Bridge"システムは、末端デオキ
シヌクレオチド転移酵素を用いて、非修飾３′−ポリＴ
テールをDNAプローブに付加する。得られたポリＴテー
ル付きプローブを、標識DNA配列とハイブリダイズさ
せ、次いでビオチンで修飾したポリＡとハイブリダイズ
させる。
ヨーロッパ特許出願第204510号には、次のようなDNA
ハイブリダイゼーションアッセイが記載されている。す
なわち、分析物DNAをポリＴテールのようなテールを有
するプローブと接触させると、例えばポリＡ配列のよう
な配列を有するアンプリファイア連鎖は、そのプローブ
のテールとハイブリダイズし、複数の標識した鎖に結合
し得る。
1989年５月24日（本願の優先日の後）に公開されたヨ
ーロッパ特許出願第0317077号には、増幅を達成するた
めにオリゴヌクレオチド多量体を用いるハイブリダイゼ
ーションアッセイが記載されている。これらの多量体
は、前述のヨーロッパ特許出願公開第0225807号の溶液
相ハイブリダイゼーションアッセイ法に使用された。こ
れらの多量体は、標識化プローブとハイブリダイズする
１つのオリゴヌクレオチド単位および標識したプローブ
に結合する複数の他のオリゴヌクレオチド単位を含んで
いる。Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）核酸を包含する、各種
の分析物のアッセイがヨーロッパ特許出願第0317077号
に記載されている。ヨーロッパ特許出願第0317077号に
例示されているHBVアッセイでは、単一のHBVサブタイプ
に由来するキャプチャープローブのセットおよび標識化
プローブのセットを用いる。
本発明は、偽陰性が少ない、ヨーロッパ特許出願第03
17077号に例示されているHBVアッセイの改良型を提供す
る。
発明の開示 本発明の１つの面は、分析物中のHBVDNAを検出するた
めの、溶液サンドイッチDNAハイブリダイゼーション法
であって、 （ａ）ハイブリダイズする条件下で、過剰量の （ｉ）それぞれのオリゴヌクレオチドが;HBV染色体の
あるセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第
一のセグメント、および核酸の多量体のオリゴヌクレオ
チド単位に相補的なヌクレオチド配列を有する第二のセ
グメントを含む；一組のアンプリファイアプローブオリ
ゴヌクレオチド、および （ii）それぞれのオリゴヌクレオチドが;HBV染色体の
別のセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第
一のセグメント、および固相に結合しているオリゴヌク
レオチドに相補的なヌクレオチド配列を有する第二のセ
グメントを含む；一組のキャプチャープローブオリゴヌ
クレオチド、に、該分析物を接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ａ）の産物
を、該固相に結合している該オリゴヌクレオチドに接触
させる工程； （ｃ）工程（ｂ）の後、該固相に結合していない物質を
分離する工程； （ｄ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ｃ）の該固
相複合体産物を、核酸多量体に接触させる工程であっ
て、該多量体が、 （ｉ）該アンプリファイアプローブオリゴヌクレオチ
ドの第二のセグメントに相補的な、少なくとも一つのオ
リゴヌクレオチド単位、および （ii）標識したオリゴヌクレオチドに相補的な複数の
第二のオリゴヌクレオチド単位、 を含む、工程； （ｅ）結合していない多量体を除去する工程； （ｆ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ｅ）の固相
複合体産物を、標識したオリゴヌクレオチドに接触させ
る工程； （ｇ）未結合の標識したオリゴヌクレオチドを除去する
工程；および （ｈ）工程（ｇ）の該固相複合体産物中の標識の存在を
検出する工程であって、該アンプリファイアプローブオ
リゴヌクレオチドおよびキャプチャープローブオリゴヌ
クレオチドの第一のセグメントが、HBVサブタイプの多
様性に基づいたコンセンサスなHBVds領域の配列と相補
的な配列を有することによって特徴付けられる、工程、 を包含する、方法である。
本発明の別の面は、HBVのためのハイブリダイゼーシ
ョンアッセイにおけるアンプリファイアプローブとして
有用な合成オリゴヌクレオチドであって、以下の配列を
含む合成オリゴヌクレオチドからなる群から選択され、 この中で括弧は、２重の縮重の位置を示している、 合成オリゴヌクレオチドである。
本発明の他の面は、Ｂ型肝炎イルスのためのサンドイ
ッチハイブリタイゼーションアッセイのアンプリファイ
アプローブとして有用な一組の合成オリゴヌクレオチド
であって、以下の配列を含むオリゴヌクレオチドを包含
し、 この中で括弧は、２重の縮重の位置を示している、一組
の合成オリゴヌクレオチドである。
本発明の別の面は、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）のため
のサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイにおけ
るキャプチャープローブとして有用な合成オリゴヌクレ
オチドであって、以下の配列を含む合成オリゴヌクレオ
チドからなる群から選択され、 この中で括弧は、二重の縮重の位置を示している、合成
オリゴヌクレオチドである。
本発明の他の面は、Ｂ型肝炎ウイルスのサンドイッチ
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、キャプチャ
ープローブとして有用な一組の合成オリゴヌクレオチド
であって、以下の配列を含むオリゴヌクレオチドを含
み、 この中で括弧は２重の縮重位置を示す、一組の合成オリ
ゴヌクレオチドである。
図面の簡単な説明 図１は、実施例１に記載されている直鎖状核酸多量体
の酵素的調製プロセスの概略説明である。
図2Aと図2Bは、実施例２に記載されている直鎖状およ
び分岐の核酸多量体の化学的調製プロセスの概略説明図
である。
図３（パートＡ−Ｆ）は、「櫛状」および／または二
叉構造を有する多量体を作る際に用いられる手順を示
す。
図４は、実施例３に記載のサンドイッチハイブリダイ
ゼーションアッセイの概略説明図である。
図５は、実施例に記載されているドットブロットスク
リーニング試験の結果を示すオートラジオグラムであ
る。
図６〜８は、実施例3Bに記載されている真正のHBV DN
A試料についての試験結果を示す棒グラフである。
図９は、実施例４に記載されているHBVアッセイに用
いられるキャプチャープローブおよびアンプリファイア
プローブの部分ヌクレオチド配列を示す。
本発明の実施態様 多量体の説明 本発明の核酸多量体は、同じ繰り返し一本鎖オリゴヌ
クレオチド単位あるいは異なる一本鎖オリゴヌクレオチ
ド単位の、直鎖状あるいは分岐のポリマーである。単位
の少なくとも１つが、本発明のHBVアンプリファイアプ
ローブのセグメントに特異的に結合できる配列、長さお
よび組成を有している。このような特異性および安定性
を達成するために、この単位は、長さが通常15〜50ヌク
レオチドであり、好ましくは15〜30のヌクレオチドであ
り、GC含量が40〜60％の範囲である。このような単位に
加えて、多量体は、対象の第２の一本鎖ヌクレオチド、
すなわち典型的には、標識したオリゴヌクレオチド、も
しくはその他の多量体と特異的にそして安定してハイブ
リダイズし得る、多量の単位を含んでいる。これらの単
位は、通常長さが15〜50のヌクレオチドで、好ましくは
15〜30のヌクレオチドであり、GC含量が40％〜60％の範
囲である。多量体が他の多量体とハイブリダイズするよ
うに設計される場合、第１と第２のオリゴヌクレオチド
ユニットは異種である（異なる）。
多量体中のオリゴヌクレオチド単位の合計数は、通常
３〜50の範囲であり、より一般的には10〜20である。ア
ンプリファイアとハイブリダイズする単位が、標識オリ
ゴヌクレオチドとハイブリダイズする単位と異なる多量
体では、後者：前者の数の比率が通常2:1〜30:1であ
り、より一般的には5:1〜20:1であり、好ましくは10:1
〜15:1である。
多量体のオリゴヌクレオチド単位は、ホスホジエステ
ル結合を介して、または核酸、アミノ酸、炭水化物ある
いはポリオール架橋のような介入結合剤を介して、また
は核酸もしくは修飾核酸鎖を架橋し得る他の架橋剤を介
して、互いに直接共有結合し得る。連結部位は、単位の
末端（通常の３′−５′配向もしくはランダム配向）お
よび／または鎖の中の１つもしくはそれ以上の内部ヌク
レオチドにあり得る。直鎖状多量体では、個々の単位の
末端同士が連結して、直鎖状ポリマーを形成する。分技
多量体の１つの型では、３つ以上のオリゴヌクレオチド
単位が、起点から発して分技構造を形成する。前述の起
点は、他のオリゴヌクレオチド単位、または少なくとも
３つのユニットが共有結合し得る多官能性分子であり得
る。他の型では、１つまたはそれ以上の付随オリゴヌク
レオチド単位を有するオリゴヌクレオチド単位骨格があ
る。これらの後者のタイプの単量体は、構造が「フォー
ク状」「櫛状」もしくは「フォーク状」と「櫛状」の組
み合わせの形態である。付随単位は、通常、オリゴヌク
レオチドが接合されているかもしくは他の方法で連結さ
れている適切な官能基を有する修飾ヌクレオチドあるい
は他の有機性部分から分枝している。多量体は、すべて
直鎖状か、すべて分枝しているか、または直鎖状と分枝
の部分の組み合わせである。好ましくは、多量体には、
少なくとも１つの分枝点があり、より好ましくは、少な
くとも３あり、好ましくは５〜10である。多量体は、二
本鎖配列の１つまたはそれ以上のセグメントを含み得
る。
多量体の合成 多量体は、クローン化（直鎖状の場合）、酵素による
構築、化学的架橋法、直接化学合成法、またはそれらの
組み合わせで調製し得る。クーロン化で調製される直鎖
状多量体の場合、全多量体もしくはその断片をコードす
る核酸配列は、従来のクローン化法によって、一本鎖も
しくは二本鎖の形で作成され得る。二本鎖の形で作られ
る場合、多量体／断片は、最終的に変性されて一本鎖の
多量体／断片とされる。多量体は、M13のような従来の
一本鎖ファージのベクターを使用して、一本鎖の形でク
ローン化され得る。断片は、酵素的に、もしくは化学的
に連結させて多量体を作り得る。酵素的に構築される場
合、個々の単位は、場合によって、T4 DNAリガーゼも
しくはRNAリガーゼのようなリガーゼによって連結され
る。化学的架橋法によって調製される場合、個々の単位
は、連結部位を与える官能基を有するように誘導された
か、またはオリゴヌクレオチドが合成された後にそのよ
うな連結部位を与えるように誘導された、１つあるいは
それ以上の核酸で合成され得る。化学的架橋連結の好ま
しい方法は、ヨーロッパ特許出願公開第0225807号に記
載されているように、N4修飾シトシン塩基をヌクレオチ
ドに組み込む方法である。
直接化学合成法で調製される場合、誘導された核酸、
またはその官能基が保護されている同等の多官能性分子
を含むオリゴヌクレオチドは、従来のオリゴヌクレオチ
ド合成法で製造される。その官能基の保護をはずして、
そしてその保護をはずされた部位からオリゴヌクレオチ
ド単位が合成される。
多量体に分技点を発生させるために用いられる分子の
一般的構造は次のとおりである。
式中Ｒは有機部分で、好ましくは、核酸であり、R
1は、固体相から合成核酸を除去せず、そして環外の窒
素もしくはリン酸を保護する基を除去しない条件下で除
去され得るヒドロキシル保護基であり、Ｘは、保護され
たホスホルアミダイト基、ホスホン酸基もしくはリン酸
基のような核酸合成を容易にするリン含有基であり、Ｙ
はアミノ基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基または
保護されたリン酸基のような求核性基から誘導されるラ
ジカルであり、R2は、R1またはR1に作用せずに除去さ
れ、そして水素と置換され得る保護基である。二叉のも
しくは「フォーク状」の分技を生成させるのに用いられ
る分子では、R1とR2は同じであるが、一方、「櫛状」の
分技を生成させるために用いられる分子では、R2は、R1
脱保護剤の存在下で安定な保護基である。図３は、「櫛
状」分技、「フォーク状」分技もしくはその組み合わせ
を有する多量体を合成するのに用いられる方法の概略説
明図を示している。
図３のパートＡは、自動ホスホルアミダイト法（Warn
erら、DNA、（1984）３、401頁）のような、直鎖状オリ
ゴヌクレオチドを調製するための従来のオリゴヌクレオ
チド合成法を示す。黒の四角印は、固体支持体を示し、
Ｎはヌクレオチドを示し、ｐ−Ｎ−OR1（R1は以下に述
べるR1に等しい）は、適切な保護基を有する従来のヌク
レオチド誘導体である。
パートＢは、櫛状多量体を製造する方法を示す。化合
物 は、下記の式（２）の修飾塩基を表している。所望の大
きさと配列のオリゴマー単位が合成されて支持体に残さ
れる。次に１つあるいはそれのN4−修飾シトシン塩基
が、前記の自動化法によって鎖に組み込まれる。好まし
くはこの修飾塩基は式： を有し、式中・Ｚは−Ｏ−，−NH−，−Ｓ−,PO4および のような求核性基であり、R1は一般に塩基に対しては安
定性で酸には感受性のジメトキシトリチル（DMT）もし
くはピキシルのようなブロックする基あるいは保護基で
あり、R2は水素もしくはメチルであり、R3は、下記の
基： のような、R1に作用することなく除去され、そして水素
で置換され得るブロックする基あるいは保護基であり、
R5は、化学合成中に、オリゴヌクレオチド鎖の５′位置
にヌクレオチドを付加し得るホスホルアミダイトもしく
は他のリン誘導体（例えばホスホジエステル、ホスホト
リエステルなど）であり、R6はメチル、水素、Ｉ、Brも
しくはＦであり、そしてＸは、１と８を含む１〜８の範
囲の整数である。１つより多い修飾塩基が組み込まれる
場合、それらは鎖の中で中間塩基によって隔てられ、最
も好ましくは、−TT−二量体によって隔てられる。追加
のオリゴヌクレオチド単位が、骨格に組み込まれ、次い
で追加の修飾塩基などが組み込まれ得る。
次に、N4求核性塩基を脱保護し（R3を除去する）次い
で、追加のオリゴヌクレオチド単位をそこから自動化方
法で作成する。連鎖末端におけるR1基の残基を除き、分
技した「櫛状」多量体を支持体から切断させる。
図３のパートＣは、「フォーク状」多量体を製造する
一般的手順を示す。再び、所望の大きさと配列のオリゴ
マー単位が従来の方法で合成され、支持体に残される。
次に、保護されたホスホルアミダイト基のような、保護
された二官能性のリン含有基（図３のパートＣのXPで表
されている）が、自動法によって鎖の中に組み込まれ
る。好ましい二官能性リン含有基は、次式で表されるよ
うな、保護されたホスホスアミダイト基である。
式中、Ｒは前記ヒドロキシル保護基であり、iPrはイ
ソプロピルであり、そしてR1はメチルもしくはβシアノ
エチルである。最も好ましくはＲはDMTであり、R1はβ
シアノエチルである。
あるいは、R1＝R2であるN4−修飾シトシン塩基（例え
ば、DMT）を用い得る。
次に、この２つの保護基が除去され、追加のオリゴヌ
クレオチド単位が、そこから自動化法によって生成され
る。R1基の残基を除去し、二叉の多量体を支持体から切
断させる。
パートＤおよびＥは、２つあるいはそれ以上の二叉の
多量体、「櫛状」多量体もしくはその組合わせが、酵素
的にもしくは化学的にスプライスされる手順を示してい
る。一様に、二叉および／または「櫛状」多量体は前述
のようにして調製され、支持体から除去される。次に多
量体を、前述の酵素的または化学的連結法を用いて、溶
液中で結合させる。
パートＦは、多重「櫛状」多量体の合成方法を示す。
この方法は、パートＢに示されている方法の変法であ
り、分枝している側鎖中に修飾塩基を組み込んで、そこ
から第２のオリゴヌクレオチド側鎖を生成させる方法で
ある。
適切な、開裂し得る、リンカー分子は、多量体の構造
を分析する目的で、または予め決められたセグメント
（例えば標識オリゴヌクレオチドに結合している多量体
の部分）を放出する手段として、予め決められた部位で
多量体に組み込まれ得る。多量体の合成および精製に続
いて、これらのリンカーは、多量体のヌクレオチド構造
をさらに分解することなく、特異的に開裂され得る。好
ましいタイプのリンカー分子は、標準のホスホルアミダ
イド化学的方法で、任意のDNA断片に組み込まれ得るよ
うに、1,2−ジオール基（過ヨウ素酸塩によって選択的
に開裂され得る）、そして保護されたヒドロキシル基お
よびホスホルアミダイド由来のヒドロキシル基を含有す
るように設計された。このようなリンカーの好ましい例
は、化合物： であり、式中、DMTおよび:iPrは前記定義と同一であ
る。DNA断片に組み込んで完全に脱保護すると、リンカ
ー含有断片は下記の式： を有し、式中DNA1、およびDNA2は、同一もしくは異なり
得るDNAのサブ断片を表している。この断片と過ヨウ素
酸ナトリウムを反応させると、この断片は切断されて、
下記のサブ切断となる。
あるいは、この1,2−ジオール基は、ヒドロキシルア
ミン感受性の結合、塩基感受性のスルホン結合、または
チオール感受性のジスルフィド結合を含有するリンカー
基で置換され得る。このようなリンカー基は、タンパク
質を他の物質に結合するのに用いられる従来の架橋剤か
ら誘導することができる。同様に、DMT以外の保護基も
使用し得る。
ハイブリダイゼーションアッセイ HBVの、溶液相サンドイッチハイブリダイゼーション
アッセイは以下のようにして実施される。分析物の一本
鎖核酸を、ハイブリダイズする条件下で、過剰の次の２
つの一本鎖核酸プローブのセットとインキュベートす
る：（１）HBVサブタイプの多様性に基づいたコンセン
サスHBV ds領域配列と相補的な第１結合配列と、固相に
結合された一本鎖オリゴヌクレオチドと相補的な第２結
合配列とを有するキャプチャープローブのセット、およ
び（２）HBVサブタイプの多様性に基づいたコンセンサ
スHBV ds領域配列と相補的な第１結合配列と、増幅多量
体のオリゴヌクレオチドユニットに相補的な第２結合配
列とを有するアンプリファイアプローブのセット。得ら
れた生成物は、２つのプローブが、それらの第１結合配
列によって分析物にハイブリダイズして生成された、３
つの成分の核酸複合体である。プローブの第２結合配列
は、被検体とは相補的でないので、一本鎖テールとして
残留する。各タイプの複数のプローブが使用され得る。
次に、この複合体を、キャプチャープローブの第２の
結合配列に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが結合し
ている固相に、ハイブリダイズする条件下で添加する。
得られた生成物は、固相に結合したオリゴヌクレオチド
で形成された二本鎖を介して固相に結合した複合体と、
キャプチャープローブの第２の結合配列を有している。
次に、結合した複合体を有する固相を、結合していない
物質から分離する。
次に多量体が、固相−被検体−プローブ複合体中のア
ンプリファイアプローブの利用され得る第２の結合配列
と、ハイブリダイズ可能であるようなハイブリダイゼー
ションの条件下で、この多量体を、上記複合体に添加す
る。次いで、得られた固相複合体を、洗浄によって、結
合していない多量体から分離する。次に標識オリゴヌク
レオチドを、該オリゴヌクレオチドが多量体の相補性オ
リゴヌクレオチドユニットとハイブリダイズできる条件
下で添加する。次いで、生成した固相の標識核酸複合体
を洗浄して、結合していない標識オリゴヌクレオチドを
除くことにより、過剰の標識オリゴヌクレオチドから分
離して、そして読み取る。
増幅は、アッセイにおいて１種以上の多量体を使用す
ることによって増大させることができる。このような場
合に、第１の多量体は、アンプリファイアプローブとし
て機能するか、または、アンプリファイアプローブおよ
び第２の多量体に結合するように設計され、そして第２
の多量体は、第１の多量体および標識オリゴヌクレオチ
ドに結合するように設計される。いかなる数の多量体
も、一層大きな増幅を達成できるように、このような方
法で連続して結合できる。
分析物のHBV核酸は、一般に生体液から得られ、例え
ばプロテイナーゼK/SDS、カオトロピック塩などの各種
の手段によって、ハイブリダイゼーション分析用に調製
することができる。また、例えば制限酵素、音波処理、
化学分解（例えば金属イオン）などの酵素的、物理的も
しくは化学的手段によって分析物の核酸の平均の大きさ
を小さくするのが有利である。断片は、0.1kb程度に小
さくてもよいが、通常は少なくとも約0.5kbであり、1kb
以上であってもよい。分析物の配列は、分析用には一本
鎖形で提供される。この配列が天然に一本鎖で存在する
場合は、変性する必要はない。しかし、分析物の配列が
二本鎖形で存在する場合には、その配列は変性される。
変性は種々の方法で実施できる。例えば、一般に約0.05
〜0.2Mの水酸化アルカリ、ホルムアミド、塩類、熱もし
くはその組合わせによる方法である。
分析物のHBV核酸に相補的なキャプチャープローブお
よびアンプリファイアプローブの第１の結合配列は、各
々、少なくとも15ヌクレオチド（nt）、通常少なくとも
25ntであり、そして約5kbを越えず、通常約1kbを越え
ず、好ましくは約100ntを越えない。第１の結合配列は
一般に、約30ntである。第１の結合配列は、HBVゲノム
の保存ds領域に対するコンセンサス配列の、異なる配列
に結合するよう選択される。
キャプチャープローブおよびアンプリファイアプロー
ブの第２の結合配列は、それぞれ、固相に結合したオリ
ゴヌクレオチドおよび多量体のオリゴヌクレオチドユニ
ットに相補的であり、試料／分析物における内在配列に
遭遇しないように、選択される。第２結合配列は、第１
結合配列に隣接させるか、または中間の非相補性配列に
よって第１結合配列から隔ててもよい。これらのプロー
ブは、必要に応じて、他の非相補性配列を有していても
よい。これらの非相補性配列は、結合配列の結合を妨害
してはならず、さもないと非特異的結合が起こる。
キャプチャープローブおよびアンプリファイアプロー
ブは、オリゴヌクレオチド合成法またはクローニングで
製造できるが、前者の方が好ましい。
アッセイに用いられる固相は、粒子であってもよく、
または各種の容器（例えば、遠心分離管、カラム、マイ
クロタイタープレートウェル、フィルター、チューブな
ど）の固体の壁の表面であってもよい。粒子が用いられ
る場合には、その大きさは好ましくは約0.4〜200ミクロ
ンの範囲であり、より一般的には約0.8〜4.0ミクロンで
ある。粒子は、ラテックスもしくはガラスのような都合
のよい物質であり得る。マイクロタイタープレートは好
ましい固体表面である。キャプチャープローブの第２の
結合配列と相補的なオリゴヌクレオチドは、公知の方法
によって、官能基を介して固体表面に安定に結合し得
る。
固相に結合された、キャプチャープローブおよびオリ
ゴヌクレオチドの第２の結合配列は、固相をキャプチャ
ープローブの第１の結合配列に結合する、安定な結合手
を形成する適切なリガンドレセプターにより置換され得
ることが明らかである。このような対の例は、ビオチン
／アビジン、チロキシン／チロキシン結合グロブリン、
抗原／抗体、糖／レクチンなどである。
標識オリゴヌクレオチドは、多量体の第２のオリゴヌ
クレオチドユニットと相補的な配列を有している。その
標識オリゴヌクレオチドは、検出可能なシグナルを直接
にもしくは間接的に提供する１つ以上の分子（“標
識”）を含有している。その標識は、相補的な配列の個
々のメンバーに結合されることができ、あるいは、複数
の標識を有する末端のメンバーもしくは末端のテールと
して存在させることができる。配列に結合した標識を与
える各種の手段は文献に報告されている（例えばLeary
ら、Proc Natl Acad Sci USA、80巻、4045頁、1983年;R
enzおよびKurz,Nucl Acids Res、12巻、3435頁、1984
年;RichardsonおよびGumport,Nucl Acids Res、11巻、6
167頁、1983年;Smithら、Nucl Acids Res、13巻、2399
頁、1985年;MeinkothおよびWahl,anal Biochem,138巻、
267頁、1984年参照）。標識は、相補配列に対して共有
結合もしくは非共有結合で結合させることができる。利
用することができる標識には、放射性核酸、発蛍光体、
化学発光体、染料、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素
阻害剤、酵素サブユニット、金属イオンなどが含まれ
る。具体的な標識の実例としては、フルオレセイン、ロ
ーダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、ウンベ
クリフェロン、ルミノール、NADPH、α−β−ガラクト
シダーゼ、西洋ワサビ大根ペルオキシダーゼなどがあ
る。
標識したオリゴヌクレオチドは、ヨーロッパ特許出願
公開第0225807号に記載されているような化学合成法で
都合よく調製され得る。都合のよい官能基を有する末端
基を与えることによって、種々の標識をその官能基を介
して結合させることができる。従って、配列による二本
鎖の形成に有害な作用を与えずに種々の標識を結合し得
るカルボキシ、チオール、アミン、ヒドラジンあるいは
他の官能基が提供され得る。すでに述べたように、標識
化する配列と相補的な配列に結合した複数の標識を有す
る分子が得られ得る。あるいは、標識化する配列に結合
するリガンドを得ることができ、そのリガンドに結合す
る標識レセプターを使って、標識した分析物複合体が提
供され得る。
分析物の予想されるモル数に対する、キャプチャープ
ローブおよびアンプリファイアプローブの比率は、それ
ぞれ少なくとも化学量論的比率であり、過剰の比率が好
ましい。この比率は、好ましくは少なくとも約1.5:1で
あり、より好ましくは少なくとも2:1である。この比率
は通常2:1から10,000:1の範囲である。各プローブの濃
度は、一般に約10-9Mから10-6Mの範囲であり、試料の核
酸の濃度は10-21Mから10-12Mの範囲で変化する。アッセ
イのハイブリダイゼーションの工程は一般に約10分間か
ら２時間かかり、約１時間で完了することが多い。ハイ
ブリダイゼーションは、ゆるやかに上昇させた温度で実
施され得、一般に約20℃から80℃、より一般には約35℃
から70℃、特に65℃である。
ハイリダイゼーション反応は、通常、水性媒体、特に
緩衝化水性媒体中で行われ、この媒体には各種の添加物
が含有され得る。利用され得る添加物には、低濃度の界
面活性剤（0.1〜１％）、塩類、例えばクエン酸ナトリ
ウム（0.017〜0.170M）、フィコール（Ficoll）、ポリ
ビニルピロリジン、担体核酸、担体タンパク質などが含
まれる。非水性溶媒、例えばジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシド、アルコール類およびホルムアミド
が水性溶媒に添加され得る。これらの他の溶媒が２〜50
％の範囲の量で含有される。
ハイブリダイゼーションの媒体の緊縮性は、温度、塩
濃度、溶媒系などで制御できる。したがって、目的とす
る配列の長さと性質によって緊縮性が変えられる。
アッセイの分離工程で用いられる方法は固相の性質に
よって変えられる。粒子の場合、遠心分離または濾過に
よって粒子の分離がなされ、上澄液は廃棄されるかまた
は分離される。粒子をアッセイする場合には、適切な緩
衝媒体、例えばSDSのような界面活性剤を含有するPBS
で、粒子を通常１〜５回、充分に洗浄する。分離手段が
壁もしくは支持体の場合には、上澄み液は分離もしくは
廃棄され、壁は粒子について示したのと同様の方法で洗
浄される。
標識の種類によって、標識の存在を検出するのに各種
の方法が使用され得る。発蛍光体の場合、多数の異なる
蛍光光度計が利用され得る。化学発光体の場合、光度計
もしくはフィルムが利用され得る。酵素類の場合、蛍光
生成物、発光生成物もしくは着色生成物を提供すること
ができ、これらを蛍光分析、発光分析、分光分析もしく
は視覚的に測定し得る。免疫検定法で使用されてきた各
種の標識と、免疫検定法に適用できる方法は、本発明の
アッセイに使用することができる。
本発明の増幅核酸ハイブリダイゼーションアッセイを
実施するためのキットには、下記の試薬が、組合わせて
パッケージされた中に含まれている：多量体、適切な標
識化オリゴヌクレオチド、分析物に結合し得る固相、キ
ャプチャープローブのセット、およびアンプリファイア
プローブのセット。キット中では、これらの薬剤は一般
に別々の容器に入っている。またキットには、分析物を
変性させるための変性剤、ハイブリダイゼーション緩衝
液、洗浄溶液、酵素の基質、陰性および陽性のコントロ
ール、および検定を行うために使用説明書を入れてもよ
い。
本発明の以下の実施例は、例示のために提供するもの
であり、本発明を限定するものではない。
実施例 1.直鎖状多量体の酵素的調製 アンプリファイアプローブと相補的な18量体の直鎖状
多量体（下記の3.F.の項参照）を図１に示す方法で製造
した。
２つの18量体であるLLA−１およびLLA−２を、Warner
ら、DNA、３巻、401頁、1984年に記載の自動化ホスホル
アミダイト法で合成した。精製は、Sanchez−Pescado
r、およびUrdea,DNA、３巻、339頁、1984年に従って実
施した。LLA−２の５′末端のリン酸化は、本出願人の
同種の係属中のヨーロッパ特許出願公開第0304215号の
実施例１に記載されている化学的リン酸化法で実施し
た。このヨーロッパ特許出願公開第0304215号の開示事
項を本願に援用する。LLA−１およびLLA−２の配列は次
のとおりであった。
直鎖状LLA−２ポリマーはT4 DNAリガーゼを用いて製
造した。この連結反応の生成物は、二本鎖である。一本
鎖ポリマーは、生成物を、変性条件下でゲル精製するこ
とによって得ることができる。
105pmoleの各配列を1.5mlの試験管に入れ減圧下で蒸
発乾固した。
以下の溶液を下記の乾燥した配列に添加した。
100μｌ KBTS緩衝液 100μｌ 10mM DTT 100μｌ 10mM ATP 50μｌ H2O 50μｌ 1M NaCl 500μｌ 30％PEG ＊10×（50mMトリスHCl,pH7.6,10mM MgCl2,1mg/mlスペ
ルミジン） 試験管をボルテックスにより振盪し、次いで55℃で30
分間加熱した。次に試験管を室温まで冷却し、下記の溶
液を添加した。
6.7μｌのT4DNAリガーゼ（New England Nuclear
社、15U/μｌ） 18.8μｌの５×リガーゼ希釈用緩衝液（NEN） 74.5μｌのH2O 再び試験管をボルテックスにより振盪し、ついで一晩
室温でインキュベートした。得られた反応混合物を、ｎ
−ブタノールで抽出して100μｌの容積にし、100μｌの
３×停止混合物（25％グリセロール、0.05％ブロモフェ
ノールブルー、0.5％ドデシル硫酸ナトリウム、25mM E
DTA）を添加し、次いで100℃で５分間加熱して試料を変
性させた。次にこの溶液の20μｌずつを、７％の変性ポ
リアクリルアミドゲルのウエル（10cm×10cm×1.5mm）
に添加した。ブロモフェノールブルー染料がゲルの底部
の0.5cm以内になるまで、このゲルを用いて10V/cmで電
気泳動した。得られたゲルを、紫外蛍光発光染料を含有
しサランラップで覆われた薄層クロマトグラフィーのプ
レート上にのせ、長波長の紫外線ランプで照らして、生
成物を可視化した。生成物は紫外線照射光を吸収し、可
視シャドーを形成する。長さが大きいバンドが観察さ
れ、20オリゴマーユニット長より大きいポリマー生成物
を切り取った。切り取ったゲルをマキサム・ギルバート
の緩衝液（0.1MトリスHCl,pH8、0.5MNaCl、5mM EDTA）
内に浸漬することによって、ゲルからこれらの生成物を
溶出した。
2.直鎖状および分技多量体の化学的調製 A.直鎖状および分技状の多量体の製造 アンプリファイアプローブと相補的な18量体の直鎖状
および分技状の多量体（以下の3Fを参照）を図2Aおよび
2Bに記載の方法で調製した。
図に示すように、フェニルジイソチオシアネート（DI
TC）で架橋され誘導体化された塩基を有するオリゴヌク
レオチドを用いる。
直鎖状多量体を製造するのに用いたオリゴヌクレオチ
ドは下記配列を有していた。
ここで、ＸはシチジンのN4−（６−アミノカプロイル
−２−アミノエチル）誘導体を示す。
分技状多量体を製造するのに用いたオリゴヌクレオチ
ドは下記配列を有していた。
ここで、Ｘは上記と同意義である。
シチジンのN4−（６−アミノカプロイル−２−アミノ
エチル）誘導体は、ヨーロッパ特許出願公開第0225807
号に記載されているのと同様にして製造した。そのオリ
ゴマーは、実施例１に記載したようにして合成し精製し
た。
各断片の0.2単位（OD260）の試料を,0.1Mホウ酸ナト
リウムpH9.3の0.5μｌに溶解し、その溶液に,DITC含有
のジメチルホルムアミド（2mg/ml）9.5μｌを添加し
た。この溶液をボルテックスで振盪し、暗所で一晩室温
にて静置した。300μｌのｎ−ブタノールを添加して混
合した後、300μｌの水を添加した。得られた混合物を
ボルテックスで振盪し、遠心分離して層状に分離させ
た。水性層の容積が約50μｌにまで減少するまで、試料
を数度抽出しついで減圧で乾固した。ついで、得られた
ポリマーを、10μｌの1Mグリシン、pH9.5、で２時間処
理し、残留しているイソチオシアネート基を修飾した。
得られた混合物を10mlのセファデックスＧ−25カラムに
注入し、水で溶出し、採集し、蒸発乾固し、１％SDSに
溶解し、そして７％のポリアクリルアミドゲルに流した
（縦型の２％のアガロースゲルが、調製用電気泳動には
好ましい）。そのゲルを60maで電気泳動させ、臭化エチ
ジウムで染色した。10〜25ユニットのオリゴマーを含有
していると評価されたバンドを切り取って電気的に溶出
し、沈澱させた。
B.櫛状および二又状多量体の製造 このセクションでの略号の意味は次のとおりである。
DMT＝ジメトキシトリチル;T＝デオキシチミジン;DMF＝
ジメチルホルムアミド;BDMS＝ｔ−ブチルジメチルシリ
ル;C＝デオキシシチジン;TLC＝薄層クロマトグラィー;D
MAP＝N,N−ジメチルアミノピリジン;THF＝テトラヒドロ
フラン;DIPEA＝ジイソプロピルエチルアミン;LEV＝レブ
リン酸エステル;DCA＝ジクロロ酢酸;DCC＝ジシクロヘキ
シルカルボジイミド;DCHU＝ジシクロヘキシル尿素;TEA
＝トリエチルアミン;TMS＝トリメチルシリル;FMOC＝９
−フルオレニルメトキシカルボニル。
B.1A.くし状分岐点形成のためのヌクレオチド合成 ５−DMT−Ｔ−OH（27.3g、50mmole）及びイミダゾー
ル（10g、150mmole）をDMF200mlとともに共蒸発させ
た。DMF250mlに残留物を溶解し、BDMS塩化物（75mmol）
を加えた。反応混合物を20℃で18時間攪拌した。メタノ
ール（50ml）を加え、30分後に真空で溶媒を除去した。
油状の残留物を酢酸エチル50mlに溶解し、NaHCO35％水
溶液500mlで２回、そして、80％飽和食塩水500mlで、有
機相を抽出し、最後に固体のNa2SO4で乾燥した。真空で
溶媒を除去すると、５′−DMT−３′−BDMS T35g（50mm
ole）が得られた（収率100％）。この物質をそれ以上精
製せずに使用した。
CH3CN400ml（０℃）にトリアゾール25.6gを懸濁さ
せ、急速に攪拌しながらPOCl3（8ml）を加えた。次に０
℃にて30分間攪拌したスラリーに、15分間にわたってト
リエチルアミン（60ml）を滴下して加えた。CH3CN100ml
に溶解した５′−DMT−３′−BDMS T（25mmole粗製物）
を、上記の０℃で攪拌したスラリーに滴下して加えた。
氷水浴を取り外し、20℃で１時間攪拌し続けた。酢酸エ
チル800mlで反応混合物を希釈し、NaHCO35％水溶液500m
lで２回、及び80％飽和食塩水500mlで有機相を抽出し
た。固体のNa2SO4で乾燥した後、真空で溶媒を除去し
た。生じた残留物をトルエン（400ml）及びCH3CN（400m
l）とともに共蒸発すると、５′−DMT−３′−BDMS−５
−メチル−４−トリアゾイルβ−Ｄ−２−デオキシリボ
フラノシル−２（1H）−ピリミジノンを白色の泡状物と
して定量的収率で得た。この物質をそれ以上精製せずに
使用した。
CH3CN400mlに溶解させた６−アミノヘキサノール（1
1.7g、100mmole）溶液に、CH3CN100mlに溶解させた５′
−DMT−３′−BDMS−５−メチル−４−トリアゾイルβ
−Ｄ−２−デオキシリボフラノシル−２（1H）−ピリミ
ジノン（8.7g、12mmole）を加え、この反応混合物を20
℃で攪拌した。反応の進行をTLCでモニターし（30分
毎）、出発物質が完全に消失してしまった時に（通常１
〜２時間）、反応混合物を酢酸エチル500mlで希釈し、
上述の様にこれをNaHCO35％水溶液及び80％飽和食塩水
で抽出した。有機相を固体のNa2SO4で乾燥した後、真空
で溶媒を除去すると、５′−DMT−３′−BDMS−５−メ
チル−N4−６−ヒドロキシヘキシルデオキシシチジン7.
0g（9.2mmole）が得られた（収率77％）。この物質をそ
れ以上精製せずに使用した。
THF100ml中に溶解させた５′−DMT−３′−BDMS−５
−メチル−N4−６−ヒドロキシヘキシルデオキシシチジ
ン（7g、9.2mmole）の溶液に、THF100mlに溶解させた
（CH3COCH2CH2CO）2O（50mmole）を加え、次に2,6−ル
チジン/THF中の6.5％DMAP10mlを加えた。この反応混合
物を30分間攪拌し続けた。分析すると、出発物質は完全
に消費されていた。反応混合物を酢酸エチル700mlで希
釈した酢酸エチル700mlで希釈し、上述の様にこれをNaH
CO35％水溶液500mlで３回、及び80％飽和食塩水（500m
l）で抽出した。固体のNa2SO4で乾燥した後、溶媒を除
去し、その残留物をトルエン（200ml）及びCH3CN（200m
l）とともに共蒸発すると、粗生成物12.3gが得られた。
この粗生成物をTHF100mlに溶解させ、THF中のテトラ
ブチルアンモニウムフルオライド1.1M溶液10mlを加え
た。反応の進行をTLCでモニターした。これは通常は30
分で終わるが、それ以上長くかかることもある。開始物
質が消費されてしまった時に、この反応混合物を酢酸エ
チル700mlで希釈し、上述の様にこれをNaHCO3及び食塩
水で抽出した。溶液を除去すると、５′−DMT−５−メ
チル−N4（Ｏ−レブリニル−６−オキシヘキシル）−
２′−デオキシシチジンの粗生成物8.5gが得られた。こ
の物質をシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。CH2C
l2中の４％メタノールで溶離して精製品を分離すると、
5.0gの僅かに茶色がかった泡状物を得た（6.7mmole、収
率73％）。
シリカゲルで精製した５′−DMT−５−メチル−N
4（Ｏ−レブリニル−６−オキシヘキシル）−２′−デ
オキシシチジン（7.7mmole）をCH3CNとともに２回共蒸
発した。得られた乾燥粉末を、アルゴン下、フラスコ中
で、DIPEA4.9mlを含有するCH2Cl270mlに溶解した。０℃
まで冷却した後、N,N−ジイソプロピルアミノメトキシ
クロロホスフィン1.65ml（8.5mmole）を注射器で加え、
その反応混合物を０℃で30分間攪拌した。酢酸エチル40
0mlで希釈し、有機相を80％飽和食塩水400mlを用いて４
回洗浄し、次いで固体のNaSO4で乾燥し、さらに濾過し
た。溶媒を真空で除去し、得られた残留物をトルエンと
ともに２回共蒸発すると油状物が得られた。この油状の
トルエン30mlに溶解し、冷却したヘキサン（約−20℃）
400mlに滴下して加えた。沈澱物を濾過により速やかに
集め、真空で18時間乾燥すると、ホスホルアミダイト5.
45g（6.0mmole、収率78％）が得られた。
B.1B. くし状分技点形成のために望ましい別のヌクレ
オチドの合成 CH2Cl2200ml中に溶解させた上述の様に調製した５′
−DMT−３−BDMS−５−メチル−N4−６−ヒドロキシヘ
キシルデオキシチジン（34g、50mmole）溶液に、N,N−
ジメチルアミノピリジン1.5g及びトリエチルアミン25ml
を加えた。０℃のこの溶液に、CH2Cl2（100ml）に溶解
したDMT−Cl（75mmole、25.5g）を滴下して加えた。反
応混合物を１時間攪拌した。分析すると、出発物質は完
全に消費されてしまっていた。次にメタノール50mlを加
えた。30分後にこの反応物を酢酸エチル800mlで希釈
し、上述の様にこれをNaHCO35％水溶液500mlで２回、及
び80％飽和食塩水（500ml）で抽出した。固体のNa2SO4
で乾燥した後、真空で溶媒を除去してから、残留物質を
トルエン（200ml）及びCH3CH（200ml）とともに共蒸発
した。
この粗生成物をTHF200mlに溶解し、THF中のテトラブ
チルアンモニウムフルオライド1.1M溶液200mlを加え
た。反応の進行をTLCでモニターした。これは通常は30
分で終わるが、それ以上長くかかることもある。出発物
質が消費されてしまった時に、この反応混合物を酢酸エ
チル700mlで希釈し、上述の様にこれをNaHCO3及び食塩
水で抽出した。溶液を除去すると、５′−DMT−５−メ
チル−N4（Ｏ−DMT−６−オキシヘキシル）−デオキシ
シチジンの粗生成物36gが得られた。この物質をシリカ
ゲルクロマトグラフィーにかけた。CH2Cl2中の２−４％
メタノールで溶離して精製品を分離すると、32.7gの精
製品が得られた（34mmole、５′−DMT−Ｔ−OHを基準に
した収率は69％）。
シリカゲルで精製した５′−DMT−５−メチル−N
4（Ｏ−DMT−６−オキシヘキシル）−２′−デオキシシ
チジン（34mmol）をCH3CNとともに２回共蒸発した。得
られた乾燥粉末を、アルゴン下、フラスコ内で、DIPEA
7.5mlを含有するCH2Cl2100mlに溶解した。０℃まで冷却
した後、N,N−ジイソプロピルアミノメトキシクロロホ
スフィン7.37ml（38mmole）を注射器で加え、その反応
混合物を０℃で30分間攪拌した。酢酸エチル800mlで希
釈した後、有機相を80％飽和食塩水800mlを用いて４回
洗浄してから固体のNa2SO4で乾燥し、さらに濾過した。
溶媒を真空で除去し、得られた残留物をトルエンととも
に２回共蒸発すると油状物が得られた。この油状物をト
ルエン80mlに溶解し、冷却したヘキサン（約−20℃）70
0mlに滴下して加えた。濾過で沈澱をすばやく集め、真
空で18時間乾燥すると、ホスホルアミダイト31.8g（28.
7mmole、収率84％）が得られた。
５′−DMT−Ｔ−OH（16.4ml、30mmole）を、乾燥CH3C
N200mlに溶解し、１−（TMS）イミダゾール（14.6ml、1
00mmole）を加えた。60分後に、真空で溶媒を除去し
た。油状の残留物を酢酸エチル700mlに溶解し、NaHCO35
％水溶液500mlで２回、及び80％飽和食塩水（500ml）で
抽出し、さらに最後に固体のNa2SO4で乾燥した。真空で
溶媒を除去すると、５′−DMT−３′−TMS−T30mmoleが
得られた（収率100％）。この物質をそれ以上精製せず
に使用した。
トリアゾール（37.8g）をCH3CN450ml（０℃）で懸濁
し、急速に攪拌しながらPOCl3（12ml）を加えた。次
に、０℃で30分間攪拌したスラリーに、15分間にわたっ
てトリエチルアミン（90ml）を滴下して加えた。CH3CN1
00mlに溶解した５′−DMT−３′−TMS−Ｔ（30mmole、
未精製）を、上記の０℃で攪拌したスラリーに滴下して
加えた。氷水浴を取り外し、20℃で１時間攪拌し続け
た。酢酸エチル800mlで反応混合物を希釈し、５％NaHCO
3500mlで２回、及び80％飽和食塩水（500ml）で有機相
を抽出した。固体のNa2SO4で有機相を乾燥した後、真空
で溶媒を除去した。得られた残留物をトルエン（400m
l）及びCH3CN（400ml）とともに共蒸発すると、５′−D
MT−３′−TMS−５−メチル−４−トリアゾイルβ−Ｄ
−２−デオキシリボフラノシル−２（1H）−ピリミジノ
ンを白色の泡状物として定量的収率で得た。この物質を
それ以上精製せずに使用した。
CH3CN400ml中の６−アミノヘキサノール（23g、200mm
ole）溶液に、CH3CN100mlに溶解した５′−DMT−３′−
TMS−５−メチル−４−トリアゾイルβ−Ｄ−２−デオ
キシリボフラノシル−２（1H）−ピリミジノン（20g、3
0mmole）を加え、この反応混合物を20℃で攪拌した。反
応の進行をTLCでモニターし（30分毎）、出発物質が完
全に消失してしまった時に（通常は１〜２時間）、反応
混合物を酢酸エチル800mlで希釈し、上述の様にこれをN
aHCO35％水溶液及び80％飽和食塩水で抽出した。Na2SO4
で有機相を乾燥した後、真空で溶媒を除去すると、５′
−DMT−３′−TMS−５−メチル−N4−６−ヒドロキシヘ
キシルデオキシシチジン20.3g（約30mmole）が得られ
た。この物質をそれ以上精製せずに使用した。
メタノール250ml中の５′−DMT−３′−TMS−５−メ
チル−N4−（６−ヒドロキシヘキシル）デオキシシチジ
ン溶液に、濃アンモニア水25mlを加え、そして密閉した
丸底フラスコ内で攪拌しながら反応混合物を一時間放置
した。次に真空内で溶媒を除去し、エタノール１×200m
l、トルエン１×100ml及びCH3CN1×100mlとともに共蒸
発させると５′−TMT−５−メチル−N4−（６−ヒドロ
キシヘキシル）デオキシシチジンを定量的収率で得られ
た。この物質をそれ以上精製せずに使用した。この物質
をCH2Cl2200mlに溶解し、ピリジン4mlを加えてからCH2C
l2（50ml）に溶解したFMOC−Cl（7.8g,30mmole）を滴下
方式で加えた。反応混合物を30分間攪拌した。分析する
と出発物質は完全に消費された。反応混合物を酢酸エチ
ル500mlで希釈し、上述のようにこれをNaHCO35％水溶液
500mlで３回及び80％飽和食塩水500mlで抽出した。固体
のNaSO4で乾燥した後、溶媒を除去し、その残留物をト
ルエン（200ml）及びCH3CN（200ml）とともに共蒸発さ
せると、粗生成物23,7gが得られた。この粗生成物をシ
リカゲルクロマトグラフィーにかけた。CH2Cl中の約４
％のメタノールで溶離して精製品を分離すると、純粋の
５′−DMT−５−メチル−N4−（Ｏ−FMOC−６−オキシ
ヘキシル）デオキシシチジン13.3g（15.3mmole）が得ら
れた（５′−DMT−TOHを基準にすると収率50％）。
シリカゲルで精製した５′−DMT−５−メチル−N
4（Ｏ−FMOC−６−オキシヘキシル）−２′−デオキシ
シチジン（15.3mmole）をCH3CNとともに２回共蒸発させ
た。得られた乾燥粉末を、アルゴン下、フラスコ中で、
DIPEA4.1mlを含有するCH2Cl260mlに溶解した。０℃まで
冷却した後、N,N−ジイソプロピルアミノメトキシクロ
ロホスフィン3.19ml（16.5mmole）を注射器で加え、そ
してその混合物を０℃で30分間撹拌した。酢酸エチル40
0mlで希釈した後、有機相を80％飽和食塩水400mlを用い
て４回洗浄してから固体のNa2SO4で乾燥し、そして濾過
した。溶媒を真空内で除去し、得られた残留物をトルエ
ンとともに２回共蒸発させると油が得られた。この油を
トルエン 50mlに溶解し、冷却ヘキサン（約−20℃）40
0mlに滴下方式で加えた。濾過で沈澱を速やかに集め、
真空内で18時間乾燥すると、ホスホルアミダイト12.15g
（11.8mmole、収率77％）が得られた。固相合成中のＯ
−FMOC基の除去は、ｔ−ブチルアミン／ピリジン（1:10
v/v）、20℃で１時間行った。Ｏ−レブリニル基の除去
は、ピリジン／氷酢酸（4:1v/v）中の0.5Mヒドラジンヒ
ドレート、20℃で15分間行った。
B.2. 二また状の分岐点形成のための、多官能基性ホス
ホルアミダイトの合成 グリセロール（10mmole）をピリジンと共蒸発して乾
燥した。得られた油をピリジン50mlに溶解し、DMT−Cl
（6.8g、20mmole）を加え、さらにこの反応混合物を20
℃で18時間撹拌した。メタノール（10ml）を加えた後、
ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。得られた
油を酢酸エチル250mlに溶解し、NaHCO35％水溶液（２×
250ml）および80％飽和食塩水（１×250ml）で有機相を
洗浄し、次に固体のNa2SO4で乾燥した。真空内で溶媒を
除去し、トルエン100mlおよびCH3CN100mlとともに残留
物を共蒸発させた。シリカゲルクロマトグラフィーで生
成物を分離して、O,O−ビスDMTグリセロール2.5g（3.6m
mole）を得た（収率35％）。生成物は、０−１％のメタ
ノールで溶離した。
このビス−DMT グリセロール（2.3mmole）をアルゴ
ン下、DIPEA（0.8ml）を含有するCH2Cl2（10ml）に溶解
し、N,N−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエトキシ
クロロホスフィン（1ml）を注射器で加えた。30分後
に、この混合物を酢酸エチル（200ml）で希釈し、80％
飽和食塩水200mlで有機相を洗浄した。固体のNa2SO4で
乾燥した後、真空内で溶媒を除去し、そしてトルエン10
0mlおよび水分を含まないCH3CN100mlとともに残留物を
共蒸発させると、ビス−DMT グリセロール ホスホル
アミダイト2.15g（2.3mmole、収率100％）が得られた。
隔膜ふた付きの小瓶（septum−capped vial）に、水分
を含まないCH3CN100mlとともに生成物を分配し、溶媒を
除去した後、アルゴン下−20℃で保存した。
B.3. 過ヨウ素酸化した開裂可能なリンカーホスホルア
ミダイトの合成 O,O−ジベンゾイルタータリックアシッドモノヒドレ
ート（18.8g、50mmole）をCH3CN250mlに溶解してから真
空内で溶媒を除去した。この工程を反復した。得られた
油をTHF250mlに溶解し、THF50mlに溶解したDCC（10.6
g、50mmole）を加えた。２〜３分で沈澱が生じ始めた。
20℃18時間攪拌した後、反応混合物を濾過し、さらにTH
Fで沈澱を洗浄した。高真空で沈澱を乾燥し、DCHU10.8g
（50mmole）を得た。混合濾液に２−（Ｎ−メチル）ア
ミノエタノール（4.0ml,50mmole）を加え、この反応混
合物を20℃で１時間攪拌した。次にTHF50ml中のDCC（1
0.6g、50mmole）を加えた。小さな沈澱物が生じた。約
１時間後、２−（Ｎ−メチル）アミノエタノール（4.0m
l、50mmole）を加え、この反応混合物を20℃で18時間攪
拌した。
生じた沈澱を濾過し、THFで洗浄した。乾燥したDCHU
の沈澱の重量は10.8gであった。混合濾液を蒸発すると
油が得られた。シリカを用いたクロマトグラフィーで、
8g（17mmole）のO,O−ジベンゾイルタータリックジ（Ｎ
−メチル−２−ヒドロキシエチル）アミド（この生成物
は６％MeOH/CH2Cl2で溶離する）が得られた。
DMAP（0.11g）およびTEA（2.4ml）を含有するCH2Cl25
0ml中のアミド生成物（8.6mmole）に、CH2Cl250mlに溶
解したDMT−Cl（8.6mmole）を滴下方式で加えた。DMT−
Clを加えた後、この反応混合物を20℃で１時間攪拌し、
次に蒸発により溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル60
0mlに溶解し、NaHCO35％水溶液400mlおよび80％飽和食
塩水400mlで有機相を洗浄した。この有機相を固体のNaS
O4で乾燥した。30分後にNa2SO4を濾過し、上澄みを濃縮
して油とし、次にトルエンおよびCH3CNとともに共蒸発
した。溶離にｎ−ブタノール/CH2Cl2を使用して、粗物
質をシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。２〜３％
のｎ−ブタノール/CH2Cl2で溶離すると、純粋なモノ−D
MT生成物、O,O−ジベンゾイルタータリック２−（Ｏ−
ジメトキシトリチル）ヒドロキシエチル−N,N−ジメチ
ル、Ｎ−メチル−２−ヒドロキシエチルジアミド 1.53
g（2mmole）が得られた。
DIPEA（3mmole）を含有するCH2Cl220mlに、この物質
を溶解した。10℃まで冷却した後、メトキシ−N,N−ジ
イソプロピルアミノクロロホスフィン2.2mmoleをアルゴ
ン下で加えた。15分後、酢酸エチルを加え、そして80％
飽和食塩水で有機相を洗浄し、固体のNa2SO4で乾燥し、
蒸発して乾燥した。トルエンおよび水分を含まないCH3C
Nとともに共蒸発させた後、水分を含まないCH2CN10mlに
ホスホルアミダイト残留物を溶解した。この溶液を乾い
たWeaton vial19本に等分し、真空内で溶媒を除去し
た。この小瓶をネジ式の隔膜製のフタ（septum screw c
ap）で密閉し、−20℃で保存した。
このホスホルアミダイトは、標準的なDNA合成法と装
置を使用して、オリゴヌクレオチドにカップリングされ
得る。上述のように、脱保護の後、得られたリンカーを
含むDNAは、1,2−ジオール部位で開裂され得る。
B.4. ４部位分岐した増幅多量体の合成 分岐したフラグメントを合成するため、2000Aのコン
トロール細孔ガラス（CPG）担体（30mg,7.3μmoleのヌ
クレオシド/g）を使用した。CPG担体は、欧州特許第030
4215号に記述されている通りに合成した。分岐したオリ
ゴヌクレオチドセグメントの添加中に、脱トリチル化の
ためにトルエン（CH2Cl2の代わりに）中の2.5％（v/v）
DCAを使用すること以外は、上記のDNA合成には、自動化
メチルホスホルアミダイトカップリング法を用いた。
フラグメントLLA−２（GACACGGGTCCTATGCCT、上記参
照）をCPGで合成し、自動シンセサイザーから取り出し
て、焼結したガラスロートに入れた。次に記述（Urdea,
M.S.,Methods in Enzymol（1987）146:22−41）通り
に、ホスホルアミダイトカップリングを手動で実施し
た。DMT2−グリセロールホスホルアミダイト（２−シア
ノエチル型）100μmoleおよびテトラゾール250moleを
５′脱保護したフラグメントに加えて15分間インキュベ
ートした。その後この工程を繰り返した。次に２つのＴ
メチルホスホルアミダイトを手で加え、さらにグリセロ
ールホスフェートを追加した。次に自動シンセサイザー
にCPGを戻し、各々の分岐の無いフラグメントGATGTGGTT
GTCGTACTTTTを合成した。その後この工程を繰り返し
た。次に上記の様に、標準的な脱保護および精製を行っ
た。
B.5. ４部位または５部位のくし状の増幅多量体の合成 上述の方法を用いてフラグメントTTOTTOTTOTTGACACGG
GTCCTATGCCT（Ｏ＝５′−DMT−N4−［LevO（CH2）６］
−５−Meシチジンメチルホスホルアミダイト）を合成し
た。次にこのフラグメントを機械から取り出し、室温で
１時間、8:2（v/v）のピリジン／濃酢酸中の0.5Mヒドラ
ジンモノヒドレートで処理した。次に、CPGをピリジン
で、その後、1:1:2（v/v/v）のH2O/ルチジン/THFで洗浄
した。次に自動シンセサイザーに担体を戻し、上記の式
のＯがない断片を合成した。次に上述のように、標準的
な脱保護および精製を行った。フラグメントと結合して
いる標識したプローブ（LLA−２）のコピーの１つは多
量体の５′末端で、フラグメントのコピーの３つはＯ残
基であることに注目せよ。
５部位多量体も同様の方法でつくった。
3.多量体を使用した、Ｂ型肝炎ウィルス（HBV）DNAのサ
ンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ 図４は検定の手順を図示したものである。
A.標準分析物HBV DNA EcoR Iで直鎖状化したプラスミドpBR325のEcoR I部位
にクローニングした完全な3.2kb HBVゲノムから構成さ
れており、正常ヒト血清に希釈したプラスミドpHE63を
標準分析物として使用した。この分析物を図４の11に示
す。
B.固相オリゴヌクレオチド複合体（図４のＣ） 実施例Ｉで記述した通りに、塩基21個のオリゴマー
５′−XCACCACTTTCTCCAAAGAAG−３′（ここでＸは上で
定義された通り）を合成し、pH7.5の0.1Mリン酸ナトリ
ウム中のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルビオチンを用
いてビオチニル化した。このビオチニル化したフラグメ
ント５μｌ（800pmole）を、1 X PBS中の0.25％（w/v）
の2.8ミクロンのアビジンポリスチレンビーズ500μｌが
入っている1,5mlエッペンドルフチューブに加えた。37
℃で１時間インキュベートした後、0.1％SDS500ml,4 X
SSCを用いて遠心分離でこのビーズを３回洗浄し、その
後再懸濁して使用するまで同溶液中に保存した。
C.標識オリゴマー（図４のＥ） 塩基18個のオリゴマー５′−XGGTCCTAGCCTGACAGC−
３′（ここではＸは上記で定義された通り）を合成し、
95:5（v/v）のジメチルホルムアミド:0.1Mホウ酸ナトリ
ウムpH9.3中のDITCで修飾し、ｎ−ブタノールで抽出
し、そして西洋ワサビペルキシダーゼ（HRP）と結合さ
せた。
D.キャプチャープローブ（図４のＡ） それぞれのオリゴマーが、HBVゲノムの特異的な配列
と相補的な、塩基30個の長さの可変部分、および固相に
結合したオリゴヌクレオチドに相補的な塩基20個の長さ
の定常の３′部分を持つ、12本の１本鎖オリゴマー１組
を、実施例１に記述した手順で合成した。
E.アンプリファイアプローブ（図４のＢ） それぞれのオリゴマーが、HBVゲノムの特異的な配列
と相補的な、塩基30個の長さの可変部分、および多量体
に相補的な塩基20個の長さの３′定常部分からなる、36
個の一本鎖オリゴマー１組（図４のＤ）を、実施例１に
記述した手順で合成した。
キャプチャープローブおよびアンプリファイアプロー
ブの両方ともHBVウィルスの定常ds領域用に設計したも
のである。
F.ビーズ検定法 分析物のサンプル10μｌを1.5mlエッペンドルフチュ
ーブにいれ、12.51のプロテイナーゼK/SDS（Gene（198
7）61:254）で、37℃で30分間処理した。48個のHBVオリ
ゴヌクレオチドプローブ（キャプチャープローブ12個と
アンプリファイアプローブ36個）のいずれか50fmoleを
含む1M NaOH5μｌを各サンプルに加え、試験管を100℃
まで10分間加熱した。サンプルを氷上に５分間起き、10
秒間軽く遠心分離してから0.38Mの酢酸、12.3 X SSC
（最終4 X SSC）で中和した。55℃で１時間、分析物へ
のプローブのアニーリングを行った。続いてキャプチャ
ービーズ25μｌを加え、その溶液をさらに15分間、55℃
で放置した。500μｌの洗浄液（0.1％SDS,4 X SSC）を
加えて渦巻き攪拌し、１分間遠心分離してさらにデカン
テーションを２回行った。HMバッファー（0.1％SDS,4 X
SSD,音波破砕した1mg/mlのサケ精子DNA、1mg/mlのポリ
Ａ、10mg/mlのBSA）中に多量体（図４のＤ）50fmoleを
含む20μｌを加えた。渦巻き攪拌の後、この試験管を55
℃で15分間放置してから上記のように２回洗浄した。HM
中にＥ型プローブ250fmoleを含む20μｌを用いて37℃で
１時間標識した。上記のように３回洗浄した後、キムワ
イプ上にひっくりかえしてこのビーズを完全に抜き取
り、適切な基質で処理して下記の通りに測定した。プロ
ティナーゼK/SDS溶液の添加からデータの読み取りまで
の分析に必要な総時間は、ケミルミネッセンス法では３
時間50分であった。
Matthewsら、Anal Biochem（1985）151:205−209に報
告されたHRP検出用の強化したケミルネッセンス法を用
いた。ケミルミネッセンス基質溶液（ｐ−ヒドロキシケ
イ皮酸を含むルミノール）15μｌ中にビーズを集め、4m
MのH2O25μｌが入っている8X50mmのエバーグリーンポリ
プロピレン試験管に移した。30秒後に、Turner TD−20e
ルミノメーターで試験管を測定した（遅延10秒、集積化
20秒、スムージング20秒）。反応中に生じた光の総積分
でアウトプットを表した。
新鮮なｏ−フェニレンジアミン溶液（OPD;Sigma Chem
icalsの錠剤;50mgを50mMのクエン酸ナトリウム5mlに溶
解、pH5.1、30％H2O2を３μｌ含有）100μｌを各試験管
に加えた。37℃で20分おいた後、4NのH2SO450μｌを加
えて反応を止めた。次に遠心分離でこのビーズを沈澱に
し、その上澄をマイクロタイターディッシュウェルに移
した。次にこのディッシュを、Biotek EL310プレート読
み取り装置を用いて490nmで読み取った。さらに長くイ
ンキュベートしても、ノイズに対するシグナルの割合は
改善されなかった。
G.マイクロタイターディッシュアッセイ法 マイクロタイターディッシュアッセイ法を行った。下
記の通りにマイクロタイターディッシュウェルを調製し
た。２つの型のマイクロタイターディッシュウェルを調
製した。マイクロタイターウェルの２つの型とは、
（１）サンプル準備用及び陰性コントロール用のＮウェ
ルおよび（２）サンプルおよび陽性コントロールからの
プローブ、分析物複合体の捕獲のためのＳウェルであ
る。
Ｎウェルは次の様に作製した。HMバッファー300μｌ
をImmulon II Remov−ａ−wells（Dynatech Inc.）に加
えた。このウェル小板にカバーをかけ、室温で１時間そ
のまま放置した。HMバッファーを吸引して除去し、１×
PBS400μｌを用いてウェルを３回洗浄した。プラスチッ
クのラップで小板にカバーをかけ、使用するまで４℃で
保存した。あるいは下記のように、ポリフェニルアラニ
ルリシンで、次にHMバッファーで、ウェルをおおった。
Ｓウェルは下記のようにImmulon IIから調製した。ポ
リフェニルアラニルリシン（Sigma Chemical Inc.）の2
00ug/ml水溶液200μｌを各ウェルに加えた。カバーした
小板を30分〜２時間、室温で放置してから上記のように
洗浄した。下記の1 X PBS60μｌ中の3Bのオリゴヌクレ
オチドの10OD260サンプルを、エチレングリコールビス
（スクシンイミジルスクシネート）（Pierce Chemicals
Inc.）10mgを含むDMF140μｌで処理した。この混合物
を渦巻き攪拌し、暗所・室温でインキュベートした。15
分後に、この溶液を、1X PBS30mlであらかじめ平衡化し
ておいたSephadex G−25カラム（PharmaciaのPD−10）
に通過させた。カラムの排除体積分を1X PBSで希釈して
最終量を35mlとした。キャプチャープローブ溶液50μｌ
を各ウェルに加えた。プラスチックのラップでカバーし
た後、このウェルを室温・暗所で30分間から一晩インキ
ュベートした。1X PBSでウェルを洗浄し、次にＨバッフ
ァーでおおい、洗浄してから上記のように保存した。
標識したオリゴヌクレオチドは、下記の通りにアルカ
リホスファターゼ（AP）で誘導した。子牛の腸のAP（バ
ッファー中3mg;イムノアッセイ級、Boehringer−Mannhe
im）をCentricon 30 Microconcentratorの中に入れた。
0.1Mのホウ酸ナトリウム、pH9.5、約2mlを加え、最終量
40μｌが得られるまで装置を3500rpmで回転させた。次
にアルキルアミノオリゴヌクレオチド（セクション3C）
をDITCで活性化し、ブタノールで抽出し、さらにHRPプ
ローブのところで記述したように、タンパク質と結合さ
せた。HRP結合の所で記述したPAGE、溶離（0.1M pH7.5
のTris、0.1M NaCl、10mM MgCl2、0.1mM ZnCl2を使用）
および濃縮法を用いた。
分析を２回行うため、各サンプル20μｌの２個のＮウ
ェルにいれ、プロテイナーゼK/SDS溶液25μｌで処理し
た。Linbro−Titertekマイクロタイタープレート・シー
ラーでこのウェルをカバーし、穏やかに揺り動かし、湯
浴中、65℃で30分間インキュベートした。1M NaOH中の
キャプチャープローブおよびアンプリファイアプローブ
セットを各ウェルに10μｌ加えた。シールした後、上記
のように65℃〜72℃で10〜30分間インキュベートした。
0.38Mの酢酸（または0.76Mの３−［Ｎ−モルホリノ］プ
ロパンスルホン酸（MOPS）、遊離酸）26μｌ、12.3 X S
SCでこの溶液を中和し、65℃でカバーしてさらに15〜30
分間インキュベートした。サンプル40μｌを、各Ｎウェ
ルから固体の担体が結合したキャプチャープローブが入
っている新しいＳウェルに移した。このウェルをシール
して65℃で１−２時間置いた。次に、0.1％SDS、0.1X S
SCを用いて、吸引することにより、各ウェルを２回洗浄
した。HMバッファー中のアンプリファイア多量体（N.go
norrhoeae、ペニシリン耐性N.gonorrhoeae、テトラサイ
クリン耐性N.gonorrhoeae及びchlamydia試験用:5部位く
し状構造（Section2.B.5）を用いた）溶液を加え、その
サンプルを55℃の湯浴中で15分〜１時間、シールして置
いた。上記の通り洗浄した後、HMバッファー中の酵素標
識したプローブ20μｌを加えた。HRPプローブ用に42℃
で15分間インキュベートを行い、その間にアルカリホス
ファイターゼプローブを55℃で15分間用いた。上記のよ
うに洗浄した後、適当な検出試薬を加えた。
上記のように、HRPには強化したルミノール試薬（3F
参照）を使用した。
AP検出には、Lumigen Inc.から入手した酵素誘発性ジ
オキセタン（dioxetane）（Schaapら、Tet Lett（198
7）28:1159−1162及びヨーロッパ特許第0254051号）を
用いた。検出方法は下記の通りであった。標識工程につ
いては、APプローブを含むMMバッファー20μｌを各ウェ
ルに加え、そのウェルを55℃で15分間インキュベートし
た。上澄を除去し、0.1X SSC−0.1％SDS380μｌを用い
てウェルを２回洗浄した。次に0.1X SSC380μｌを用い
てウェルを２回洗浄し、残存しているSDSを全て除去し
た。CTABバッファー中の3.3 x 10-4Mジオキセタン20μ
ｌを各ウェルに加えた。試薬が底まで落ちるようにこの
ウェルを軽くたたき、試薬が底に一様に分布するように
穏やかに渦巻き攪拌をした。マイクロタイタープレート
シーラーでこのウェルをカバーし、37℃のオーブン中で
１時間インキュベートした。次にルミノメーターでウェ
ルを読み取った。
結果 A.標準分析物に関する試験 実施例１−2Aの多量体を用いて、既知量の標準分析物
HBV DNAを含むサンプルに関して前述のアッセイ法を実
施した。比較するため、３部分アッセイ（結合した分析
物；分析物および標識したプローブの両者に相補的なオ
リゴヌクレオチド;HRP標識したプローブ）を実施した。
比較アッセイは、取得値１とした。取得とは、非増幅の
３部分アッセイで得られるシグナルに対する、アンプリ
ファイアアッセイ法で得られるシグナルの割合である。
これらの検定法の結果を下記の表に報告する。S/Nは
シグナル−バックグラウンド比を示す。
B.真正のHBV DNAサンプルに関する試験 真正のHBV DNAサンプルを下記の通り同定した。
HBV表面抗原陽性サンプル49検体中のHBV DNAの有無
を調べるため、Zyzikらのタンパク質−DNA複合体抽出法
（Eur J Chem Microbiol（1986）５:330−335）を用い
てドット・ブロット・スクリーニングを実施した。図５
は、プローブとして32Pニックトランスレーションしたp
HE63を用いて、49検体のセット中に確認されたDNA陽性
の血清６検体の分析を表している。各サンプルをブロッ
トし、希釈せずに（100）、プールした正常ヒト血清に
1:10で希釈して（101）、及び1:100で希釈して（102）
２回プローブした。プールした正常ヒト血清はまた、バ
ッファー（10X SSC）中で、pHE63のサンプルを２回ブ
ロットした。これらの血清に関して、希釈物及びプラス
ミド標準を用いた別々のブロッティング実験を５回実施
し、計算による範囲を確認した。本発明のサンドイッチ
ハイブリダイゼーションアッセイの評価に、これらのサ
ンプルを使用した。
図６は、上述のHBV DNA陽性サンプルを使用して、ビ
ーズキャプチャーアッセイ法のケミルミネッセンスを読
み取り方式で得られた結果を表している。pHE63の4pgサ
ンプルの分析も示す。各サンプルには、線をつけた２つ
の値がある。線をつけた棒は各サンプルで得られた絶対
シグナルを示し、３つのサンプルの２組（全部で６検
体）の平均を表している。白い棒は、Ｃ型キャッチャー
プローブを含まないビーズを使用した、同一の血清に関
する同数のコントロールサンプルを示している。疑陽性
のシグナルを導くような各サンプルマトリックスの非特
異的な結合またはノイズ（Ｎ）の測定に、ブロッティン
グ検定法では不可能な、このコントロールを使用した。
各サンプルの特異的なシグナルは、定義した通りＳとＮ
の比で表すことができる。S/N比が１ならば、特異的結
合が無いことを示す。陽性サンプルを示すS/N最小比は
以下で考察する。
HBV DNAを0.2と8pgとの間で含む血清のS/N比は3.9か
ら49の範囲であった。プールした健常なヒト血清に血清
4825および3657を２倍および４倍希釈したもので実施し
たアッセイでは、各サンプルの絶対シグナルがほぼ直線
的に減少する結果となり、仮定した本法の特定の性質を
実証した。異なるロットのビーズ及び試薬を用いたあら
ゆるサンプルで、繰り返し行ったときの優れた再現性が
確認された。ケミルミネッセンスの基質溶液を加えてか
ら僅か30秒後にサンプルを読み取ったが、45分まで同等
の結果が得られた。さらに長くシグナルを集積してもS/
N比は改善されなかった。見かけ上、濁〜透明の範囲で
使用した血清を凍結保存し、何度も凍結−解凍した。ハ
イブリダイゼーションアッセイに先立ってサンプルを清
澄にしようとはしなかった。溶液ハイブリダイゼーショ
ンまたはビーズ捕獲時間が増大（最大18時間まで）して
も、S/N比は有意に増大しなかった。
図７では、ピコグラム未満のHBV DNAサンプルの分析
を、既知の陰性の血清およびプールした血清中の多量の
異種核酸と比較している。使用した最低の陽性血清（上
のパネル、血清3657を1:10希釈）のＳ値は、陰性の血清
（0092）または非HBV DNA（HIV）のＳ最高値より僅か
に高いが、真の陽性とpgレベルより下の疑陽性を識別す
る明確な区切りは、絶対量Ｓのみを基礎にすると不可能
である。しかしながら、これらの同一サンプルのS/N比
を比較すると（下のパネル）、S/N＝2.5という区切りで
明確な区別ができる。1.7を越える高い値を示す陰性の
サンプルは皆無であったが、0.2pgでの最低の陽性サン
プルは、S/N＝4.3を示した。これは明かに、非特異的に
結合しているコントロールを各サンプルに使用した値を
示している。
図８では、イミノール−ｐ−ヒドロキシケイ皮酸（相
対的ルミネッセンスRLとして示す）およびｏ−フェニレ
ンジアミン（OPD）検出の両者を用いて、HBV DNA陽性
および陰性の血清で実施したアッセイ法間の比較を行っ
た。両方法は感度の点では同等であったが、いくつかの
理由からケミルミネッセンス法の方が望ましかった。第
１に、ビーズ方式を用いてエッペンドルフチューブ内で
OPD反応を行い,ELISA読み取り装置で読み取るために溶
液をマイクロタイターディッシュに移すと、最良の比色
定量結果が得られた。これはビーズからの散乱が重大な
バックグラウンド源たったからである。第２に、ケミル
ミネッセンス法はかなり速かった。検出前、OPDを加え
てから30分間待つのに対して、ケミルミネッセンス反応
は、基質を加えてから30秒後に、迅速に読み取ることが
できた。最後に、OPDに対して、RLを使用すると、SMが
1.5〜２倍増大した。
4.HBVサブタイプ非特異的サンドイッチハイブイダイゼ
ーションアッセイ アメリカ合衆国で得られたサンプルの全ゲノムを含
む、32P標識した菌株adwHBVプロープを使用するドット
・ブロットに対し、上の実施例３の結果のＢに記述し
た、adwHBVサブタイプ用に設計された検定法を広範に比
較すると、後者は小数の疑陰性を示すことが明らかにな
った。日本で得られたサンプルをさらに比較試験する
と、より大きく有意の疑陰性をも示した。これらの結果
は、ハイブリダイゼーションアッセイに使用した比較的
短いオリゴヌクレオチドプロープが、DNAレベルでの菌
株変化のため、一部のサンプルに結合していなかった
（すなわち、サンプルにはオリゴヌクレオチドプロープ
との結合に影響するほど変化した非adwサブタイプが含
まれていた）可能性を示した。
従って、Gene Bankで報告されたHBVサブタイプ９種
のヌクレオチド配列のコンピューター比較から、キャッ
チャープロープおよびアンプリファイアプロープ対を再
設計した。これらのプロープ（サブタイプ非特異的、S
N）は、長さが異なっており、32倍のレベルまでの縮重
（様々な位置の複数のヌクレオチド）を含有することが
できた。これらの３′配列を図９に示す。この図から分
かるように、これらの配列は広がって、20量体のLLA2C
（アンプリファイアセット用）およびXTI（キャッチャ
ーセット用）を有していた。
再設計したこれらのプローブを使用したアッセイ法
を、実施例３のプローブ（adw）およびドット・ブロッ
トを使用したアッセイ法と比較した。（サンドイッチハ
イリダイゼーションには、５つの部位単位の多量体を使
用するマイクロタイターディッシュMTD方式を用い
た。）結果を以下に示す。
記述の通り、adwアッセイでの陰性のサンプルは、SN
アッセイおよびゲノムのドット・プロットでは陽性であ
った。これは、このサンプルがadw以外のサブタイプで
あることを示している。既知のadrサブタイプのサンプ
ルをコントロールとして使用した。
核酸化学、生化学的検定法および関連分野の当業者に
は明白な、本発明を実施するための上述の様式の修飾
は、下記の請求の範囲内であると解釈される。
フロントページの続き (72)発明者 ラニング，ジョイス エー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94519 コンコルド，フィッツパトリッ ク ドライブ 3141 (72)発明者 コルバーグ，ジャニス エー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94804 リッチモンド，シューナー コ ート 179 (72)発明者 クライン，ジェニファー エム. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94553 マーティネズ，アルハンブラ アベニュー 1034 (72)発明者 サンチェズ―ペスカドール，レイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94577 サン リーンドロ，ウッドラン ド アベニュー 787 (72)発明者 ホーン，トーマス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94708 バークレイ，アーチ ストリー ト 1583―エー (56)参考文献 Ｇｅｎｅ，1987，Ｖｏｌ．61，Ｎｏ. ３，ｐ．253−264 Ｎａｔｕｒｅ，1979，Ｖｏｌ．281, Ｎｏ．25，ｐ．646−650 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】分析物中のHBV DNAを検出するための、溶
    液サンドイッチDNAハイブリダイゼーション法であっ
    て、 （ａ）ハイブリダイズする条件下で、過剰量の （ｉ）それぞれのオリゴヌクレオチドが:HBVゲノムのあ
    るセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第一
    のセグメント、および核酸の多量体のオリゴヌクレオチ
    ド単位に相補的なヌクレオチド配列を有する第二のセグ
    メントを含む；一組のアンプリファイアプローブオリゴ
    ヌクレオチド、および （ii）それぞれのオリゴヌクレオチドが;HBVゲノムの別
    のセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第一
    のセグメント、および固相に結合しているオリゴヌクレ
    オチドに相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する第二
    のセグメントを含む；一組のキャプチャープローブオリ
    ゴヌクレオチド、 に、該分析物を接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ａ）の産物
    を、該固相に結合している該オリゴヌクレオチドに接触
    させる工程； （ｃ）工程（ｂ）の後、該固相に結合していない物質を
    分離する工程； （ｄ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ｃ）の該固
    相複合体産物を、核酸多量体に接触させる工程であっ
    て、該多量体が、 （ｉ）該アンプリファイアプローブオリゴヌクレオチド
    の第二のセグメントに相補的な、少なくとも一つのオリ
    ゴヌクレオチド単位、および （ii）標識したオリゴヌクレオチドに相補的な複数の第
    二のオリゴヌクレオチド単位、 を含む、工程； （ｅ）結合していない多量体を除去する工程； （ｆ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ｅ）の固相
    複合体産物を、標識したオリゴヌクレオチドに接触させ
    る工程； （ｇ）未結合の標識したオリゴヌクレオチドを除去する
    工程；および （ｈ）工程（ｇ）の該固相複合体産物中の標識の存在を
    検出する工程であって、該アンプリファイアプローブオ
    リゴヌクレオチドおよびキャプチャープローブオリゴヌ
    クレオチドの第一のセグメントが、HBVサブタイプの多
    様性に基づいたコンセンサスなHBVds領域の配列と相補
    的な配列を有することによって特徴付けられる、工程、 を包含する、方法であって、 ここで、該ハイブリダイゼーション法が、以下の配列を
    含む第一のセグメントを有する一組のアンプリファイア
    プローブオリゴヌクレオチドを使用し、 【化１】 この中で括弧は２重の縮重の位置を示し、そしてここ
    で、該ハイブリダイゼーション法が、以下の配列を含む
    第一のセグメントを有する一組のキャプチャープローブ
    オリゴヌクレオチドを使用し、 【化２】 この中で括弧は、２重の縮重の位置を示している、 方法。
  2. 【請求項２】HBVのためのハイブリダイゼーションアッ
    セイにおけるプローブとして有用な一組の合成オリゴヌ
    クレオチドであって、以下の配列を含むオリゴヌクレオ
    チドを含み、 【化３】 この中で括弧は、２重の縮重の位置を示している、 一組の合成オリゴヌクレオチドであって、 そしてここで、該アッセイは、以下の工程： （ａ）ハイブリダイズする条件下で、過剰量の （ｉ）それぞれのオリゴヌクレオチドが:HBVゲノムのあ
    るセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第一
    のセグメント、および核酸の多量体のオリゴヌクレオチ
    ド単位に相補的なヌクレオチド配列を有する第二のセグ
    メントを含む；一組のアンプリファイアプローブオリゴ
    ヌクレオチド、および （ii）それぞれのオリゴヌクレオチドが;HBVゲノムの別
    のセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第一
    のセグメント、および固相に結合しているオリゴヌクレ
    オチドに相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する第二
    のセグメントを含む；一組のキャプチャープローブオリ
    ゴヌクレオチド、 に、該分析物を接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ａ）の産物
    を、該固相に結合している該オリゴヌクレオチドに接触
    させる工程； （ｃ）工程（ｂ）の後、該固相に結合していない物質を
    分離する工程； （ｄ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ｃ）の該固
    相複合体産物を、核酸多量体に接触させる工程であっ
    て、該多量体が、 （ｉ）該アンプリファイアプローブオリゴヌクレオチド
    の第二のセグメントに相補的な、少なくとも一つのオリ
    ゴヌクレオチド単位、および （ii）標識したオリゴヌクレオチドに相補的な複数の第
    二のオリゴヌクレオチド単位、 を含む、工程； （ｅ）結合していない多量体を除去する工程； （ｆ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ｅ）の固相
    複合体産物を、標識したオリゴヌクレオチドに接触させ
    る工程； （ｇ）未結合の標識したオリゴヌクレオチドを除去する
    工程；および （ｈ）工程（ｇ）の該固相複合体産物中の標識の存在を
    検出する工程であって、該アンプリファイアプローブオ
    リゴヌクレオチドおよびキャプチャープローブオリゴヌ
    クレオチドの第一のセグメントが、HBVサブタイプの多
    様性に基づいたコンセンサスなHBVds領域の配列と相補
    的な配列を有することによって特徴付けられる、工程、
    包含するアッセイである、 一組の合成オリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】HBVのための溶液相サンドイッチアッセイ
    のアンプリファイアプローブとして有用な一組の合成オ
    リゴヌクレオチドであって、以下の配列を含むオリゴヌ
    クレオチドを包含し、 【化４】 この中で括弧は、２重の縮重の位置を示している、 一組の合成オリゴヌクレオチドであって、 そしてここで、該アッセイは、以下の工程： （ａ）ハイブリダイズする条件下で、過剰量の （ｉ）それぞれのオリゴヌクレオチドが:HBVゲノムのあ
    るセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第一
    のセグメント、および核酸の多量体のオリゴヌクレオチ
    ド単位に相補的なヌクレオチド配列を有する第二のセグ
    メントを含む；一組のアンプリファイアプローブオリゴ
    ヌクレオチド、および （ii）それぞれのオリゴヌクレオチドが;HBVゲノムの別
    のセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第一
    のセグメント、および固相に結合しているオリゴヌクレ
    オチドに相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する第二
    のセグメントを含む；一組のキャプチャープローブオリ
    ゴヌクレオチド、 に、該分析物を接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ａ）の産物
    を、該固相に結合している該オリゴヌクレオチドに接触
    させる工程； （ｃ）工程（ｂ）の後、該固相に結合していない物質を
    分離する工程； （ｄ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ｃ）の該固
    相複合体産物を、核酸多量体に接触させる工程であっ
    て、該多量体が、 （ｉ）該アンプリファイアプローブオリゴヌクレオチド
    の第二のセグメントに相補的な、少なくとも一つのオリ
    ゴヌクレオチド単位、および （ii）標識したオリゴヌクレオチドに相補的な複数の第
    二のオリゴヌクレオチド単位、 を含む、工程； （ｅ）結合していない多量体を除去する工程； （ｆ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ｅ）の固相
    複合体産物を、標識したオリゴヌクレオチドに接触させ
    る工程； （ｇ）未結合の標識したオリゴヌクレオチドを除去する
    工程；および （ｈ）工程（ｇ）の該固相複合体産物中の標識の存在を
    検出する工程であって、該アンプリファイアプローブオ
    リゴヌクレオチドおよびキャプチャープローブオリゴヌ
    クレオチドの第一のセグメントが、HBVサブタイプの多
    様性に基づいたコンセンサスなHBVds領域の配列と相補
    的な配列を有することによって特徴付けられる、工程、
    を包含するアッセイである、 一組の合成オリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】HBVのための溶液相ハイブリダイゼーショ
    ンアッセイにおけるキャプチャープローブとして有用な
    一組の合成オリゴヌクレオチドであって、以下の配列を
    含むオリゴヌクレオチドを含有し、 【化５】 この中で括弧は、２重の縮重の位置を示している、 一組の合成オリゴヌクレオチドであって、 そしてここで、該アッセイは、以下の工程： （ａ）ハイブリダイズする条件下で、過剰量の （ｉ）それぞれのオリゴヌクレオチドが:HBVゲノムのあ
    るセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第一
    のセグメント、および核酸の多量体のオリゴヌクレオチ
    ド単位に相補的なヌクレオチド配列を有する第二のセグ
    メントを含む；一組のアンプリファイアプローブオリゴ
    ヌクレオチド、および （ii）それぞれのオリゴヌクレオチドが;HBVゲノムの別
    のセグメントに相補的なヌクレオチド配列を有する第一
    のセグメント、および固相に結合しているオリゴヌクレ
    オチドに相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する第二
    のセグメントを含む；一組のキャプチャープローブオリ
    ゴヌクレオチド、 に、該分析物を接触させる工程； （ｂ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ａ）の産物
    を、該固相に結合している該オリゴヌクレオチドに接触
    させる工程； （ｃ）工程（ｂ）の後、該固相に結合していない物質を
    分離する工程； （ｄ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ｃ）の該固
    相複合体産物を、核酸多量体に接触させる工程であっ
    て、該多量体が、 （ｉ）該アンプリファイアプローブオリゴヌクレオチド
    の第二のセグメントに相補的な、少なくとも一つのオリ
    ゴヌクレオチド単位、および （ii）標識したオリゴヌクレオチドに相補的な複数の第
    二のオリゴヌクレオチド単位、 を含む、工程； （ｅ）結合していない多量体を除去する工程； （ｆ）ハイブリダイズする条件下で、工程（ｅ）の固相
    複合体産物を、標識したオリゴヌクレオチドに接触させ
    る工程； （ｇ）未結合の標識したオリゴヌクレオチドを除去する
    工程；および （ｈ）工程（ｇ）の該固相複合体産物中の標識の存在を
    検出する工程であって、該アンプリファイアプローブオ
    リゴヌクレオチドおよびキャプチャープローブオリゴヌ
    クレオチドの第一のセグメントが、HBVサブタイプの多
    様性に基づいたコンセンサスなHBVds領域の配列と相補
    的な配列を有することによって特徴付けられる、工程、
    を包含するアッセイである、 一組の合成オリゴヌクレオチド。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Ｇｅｎｅ，１９８７，Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．３，ｐ．２５３−２６４
Ｎａｔｕｒｅ，１９７９，Ｖｏｌ．２８１，Ｎｏ．２５，ｐ．６４６−６５０

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