JPH06509707A - 選択可能な開裂部位を用いるポリヌクレオチド確認法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 選択可、な「裂部位を　いるポリヌクレオチド確認１人立旦 本発明は、オリゴヌクレオチド配列への選択可能開裂部位の組み込み一般に関し 、そしてより詳細には、オリゴヌクレオチド鎖内への過ヨウ素酸で開裂し得る結 合の導入に有用な、新規な試薬類に関する。本発明はまた、この新規な試薬類を 生化学的アッセイに使用する方法に関する。

オリゴヌクレオチド配列を自由に合成し、そして、合成的方法で調製された、ま たは、天然のソースから得られたポリヌクレオチド配列をクローニングし得るこ とで、染色体（単数あるいは複数）、配列の混合物、ｍＲＮＡ等の伸張したオリ ゴヌクレオチド配列中の特定の配列の存在を検出する機会が著しく拡大しつつあ る。以下は僅か数例の代表例に過ぎないが、興味深い特定の配列には、病原体の 存在の診断、対立遺伝子の存在の確認、宿主ゲノム中の損傷の存在、特定の＋ｎ ＲＮＡの検出または細胞宿主の修飾のモニタリング、が含まれ得る。試料中の種 々の抗原の存在を診断するアッセイを行なうための抗体の使用は、ラジオイムノ ア、セイの出現以降、技法およびプロトコールの面で爆発的拡大が見られるが、 つい最近まで、ＤＮＡプローブの領域では同様の拡大はなかった。従って、配列 の検出法の殆どは、ポリヌクレオチド配列を支持体に結合する必要があり、そし て放射標識したプローブを使用する種々のハイブリダイゼーション技術を含んで いる。

経済的方法で大量のオリゴヌクレオチド配列を製造する能力の同上を背景に、研 究者らの関心は、特定のオリゴヌクレオチド配列の検出のための、単純、正確か つ効果的な技術の提供に向けられている。これら技術は、迅速で、技術者がエラ ーを犯す機会を最小にし、自動化が可能で、そして、単純かつ正確な検出方法を 考慮していることが望ましい。この目的のために、ラジオアイソトープ以外の標 識でオリゴヌクレオチドプローブを標識する手段の提供、および、ゲルから支持 体へのＤＮＡ配列の転写の正確さの向上、および、標識の結合を考慮した誘導体 化オリゴヌクレオチドのための改善された方法を提供するために、すでに努力が なされている。多様なソースに由来し得るＤＮＡを用いる種々の状況でも、対象 のＤＮＡ配列をフレキ／プルに検出し得る新しいプロトコールの提供に対する必 要性は存続している。

笈え隨良五旦！ ＭｅｉｎｋｏｔｈとＷａｈｌ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８４ ）　１３８：２６７−２８４は、ハイブリダイゼーション技術の優れた総説であ る。Ｌｅａｒｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９ ８３）　８０：４０４５−４０４９は、特定のオリゴヌクレオチド配列の検出の ための、アビジン−酵素複合体と組み合わせたビオチン化ＤＮＡの使用を記載し ている。

Ｒａｎｋｉら、Ｇｅｎｅ日９８３）２１　ニア７−８５は、オリゴヌクレオチド 配列の検出のための、彼等が「サンドイッチ」ハイブリダイゼーションと呼ぶ技 術を記載している。ＰｆｅｕｆｆｅｒとＩｌｌｅｌｍｒｉｅｈ、　Ｊ。

ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９７５）　２５０：８６７−８７６は、セフ ァロース４Ｂへのグアノシン−５’−０−（３−チオトリホスフェート）のカッ プリングを記載している。Ｂａｕｍａｎら、Ｊ、　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｅｈｅｍ、 　ａｎｄ　Ｃｔｏｅ■ｒｎ、（１９８１）　２９：２２７−２３７は、蛍光を用 いるＲＮＡの３°末端の標識化を記載している。ＰＣＴ出願Ｎｏ／８３０２２７ ７号は、標識用の改変りボヌクレオチドのＤＮＡフラグメントへの付加および、 このようなりＮＡフラグメントを分析する方法を記載している。ＲｅｎｚとＫｕ ｒｚＳＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＜１９８４）　１２：３４３５−３４ ４４は、オリゴヌクレオチドに酵素を共有結合させる方法を記載している。Ｗａ ｌｌａｃｅ、　ＤＮＡ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗｏ ｏ、　Ｓ、ｉｆ集）ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉ ｄａは、診断のためのプローブの使用に関する一般的背景を提供している。Ｃｈ ｏｕとＭｅｒｉｇａｎ、　Ｌ」工ＬＪ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、（１９８３）　３０８ ：９２１−９２５は、ＣＭＶの検出用の、ラジオアイソトープ標識化プローブの 使用を記載している。Ｉｎｍａｎ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３４Ｂ、２４　（１９７４）　３０ −５９は、ポリアクリルアミドへの結合のための手順を記載し、一方、Ｐａｒｉ ｋｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ−ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　３４Ｂ、２４　（１９７４ ）　７７−１０２は、アガロースとの力、ブリング反応を記載している。Ａｌｗ ｉｎｅら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９７７）　 ７４：５３５０−５３５４は、／１イブリダイゼーションのための、ゲルから固 相支持体へのオリゴヌクレオチドの転写方法を記載している。Ｃｈｕら、Ｎｕｃ ｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　＜１９８３）　１１：６５１３−６５２９は、末 端のヌクレオチドの誘導体化技術を記載している。ＨＯら、肛匹お１旺ｒｌ（１ ９８１）垣：６４−６７は、リン酸を付してエステルを形成する末端のヌクレオ チドの誘導体化を記載している。Ａｓｈ　ｌｅｙとＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ａｎａ ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅしく１９８４）　１４０：９５−１０３は、表面に結合した テンプレート力）らプローブを調製する方法を報告している。これらの技術を記 載したこれら参考文献を、標識化オリゴヌクレオチドの調製方法を支持する記載 として、本明細書に援用する。

免凭旦且丞 固相支持体、少なくとも一種類の標識、および試料と標識化プローブが関与する ハイブリダイゼーションを使用する、特定のヌクレオチド配列を検出するための 方法力（提供される。

この方法では、二本鎖形成の存在または不在は、支持体と標識〈単数あるいは複 数の）との間の空間的関係を改変する能力に変換される。この技術の例は、標識 化プローブと試料ＤＮＡとの二本鎖形成を介して、標識と支持体の間（こ開裂部 位を提供することである。この状態では、二本鎖は、支持体（こ結合している。

次に、この開裂部位を切断すると、支持体と標識（単数あるいは複数の）が分離 される。次いで、標識の存在また（ま不在の検出は、通常の技術に従って、行な い得る。

従来技術に対する本発明の主要な利点は、本方法カダ、標識が特異的に結合して いるかあるいは非特異的に結合して−Ａるのかの区別を可能にすることである。

即ぢ、従来の技術では、標識は一般に、固相支持体上で検出されていた。即ち、 試料を支持体に付着させ、そして、相補的な標識化プローブと接触させ；次いで 、二本鎖形成を、支持体上でアッセイしていた。この方法の問題点は、被分析物 が存在しない場合にも標識が支持体と結合する可能性があり、実際に結合するこ とである。この標識の支持体への直接の結合を、本明細書中では「非特異結合」 と呼ふ。任意の有意な量の非特異結合が生じた場合、被分析物の存在に拘らず支 持体上で標識が検出され、偽陽性の結果が出る。

対照的に本発明では、対象被分析物が存在する場合にのみ標識が検出される。即 ち「特異的」結合のみが検出される。

好ましい実施態様では、試料と一種またはそれ以上のプローブ間とから形成され た二本鎖を介して支持体と選択された標識との間に開裂部位を導入することが実 施される。この開裂部位は、米国特許第４．７７５．６１９号（上記に引用し参 考文献として援用する）に記載された制限エンドヌクレアーゼ開裂部位であり得 、または、例えば、本願の親出願である米国出願番号０７７２５１、１５２号に 記載された、多くの種類の化学的開裂部位の一つであり得る。

本出願は、新しいクラスの化学的開裂部位に関する。これらの開裂部位は、ハイ ブリダイゼーションアッセイに用いられる条件および試薬類に対しては極めて安 定であるが、開裂が要求される場合には、過ヨウ素酸イオンにより容易に開裂で きる。本発明はまた、この開裂部位を含むポリヌクレオチド試薬類、および、ポ リヌクレオチド合成に有用な試薬類、即ち、開裂部位を含み、そして、容易にポ リヌクレオチド鎖に組み込まれ得る単量体の試薬類にも関する。これらの種々の 試薬類は、容易に高い収率で合成され、そして、開裂部位自身と同様に種々の条 件下で非常に安定である。

乳ｌ然見！呈笠訓 図１は、固相支持体に特異結合および非特異結合した標識の相違を説明している 。

図２Ａから２Ｄは、本発明の好ましい方法を模式的に説明している。ここで選択 的な開裂部位は、被分析物／プローブ複合体を介して支持体と標識の間に導入さ れる。

今日を＝　するための形態 本発明の方法および試薬を詳細に記載する前に、本発明が本明細書に記載の特定 のプロトコールまたは物質は当然に変化し得るので、これらに限定されないこと は、理解されるべきことである。本明細書で使用される用語は、特定の実施態様 を記述する目的にのみ使用され、そして、限定を意図しないこともまた、理解さ れるべきである。

本明細書中および添付した請求の範囲中で使用する限り、単数形冠詞であるｒａ Ｊ、ｒａｎＪおよび「ｔｈｅＪを付けられた名詞は、その内容が明らかにそうで ないと示さない限り、複数である対象名詞をも包むことを、特記する。従って、 「３ｃｌｅａｖａｇｅ　５ｉｔｅ（開裂部位〉」という用語は、２つまたはそれ 以上の開裂部位をも包含する。「ａｌａｂｅｌ（標識）」という用語は、２つま たはそれ以上の標識をも包含する、等である。

本発明の記述および権利請求では以下に記述した定義に従って、以下の用語が使 用される。

「アルキル」は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ− ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデ シル、エイコシル、テトラデシル等の、１から２４個の炭素原子を有する、分枝 状または分枝状でない飽和炭化水素基を指す。　「低級アルキル」は、１から８ 個の、より好ましくは１から６個の、炭素原子を有するアルキル基を指し、従っ て例えば、メチル、エチル、プロピル、「アルケニル」は、例えば、エチニル、 １−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−インブテニル、オクテニ ル、デセニル、テトラデセニル、Δ８・目−へブタデカジェニル、ヘキサデセニ ル、エイコセニル、テトラデシル等の様な、２から２４個の炭素原子、および、 １つまたはそれ以上の不飽和の炭素−炭素結合を有する分枝状または分枝状でな い不飽和炭化水素基を指す。　「低級アルケニル」は、２から８個の、より好ま しくは２から６個の、炭素原子のアルケニル基を指し、従って例エバ、エチニル 、１−プロペニル、２−プロペニル、１−フチニル、２−インブテニルおよびオ クテニルを含む。

「アルキレン」は、１から６個の炭素原子を含む二官能性の飽和した分枝状また は分枝状でない炭化水素鎖を指し、そして、例えば、メチレン（−ＣＨ２−）、 エチレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＴｏ−） 、２−メチルプロピレン（−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−）、ヘキシレン （−（ＣＨ２）８−）等を含む。

「アルケニレン」は、例えば、１，３−プロピル−１−エン、１，４−ブト−２ −４ニレン、１．５−ベント−２−エニレン、オヨヒ１，６−ヘキサー３−エニ レンの様な、２から２４個の炭素原子、および１つまたはそれ以上の不飽和の炭 素−炭素結合の二官能性で、分枝状または分枝状でない不飽和炭化水素基を指す 。

「アリール」は、フェニルまたは１−または２−ナフチル基を指す。これらの基 は、随意に、１から３個の、好ましくは１から２個の、低級アルキル、低級アル コキシ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、および／またはメルカプト置換基で置換 される。

「アリールアルキレン」は、本明細書で定義されたアルキレン基の一方の末端に 結合された、本明細書で定義された了り−ル基を指す。

「シクロアルキル」は、３から８個の炭素原子を有する、飽和炭化水素環基を指 し、そして例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへ ブチル、ンクロヘキシル、メチルシクロヘキシル、シクロオクチル、等を含む。

「シクロアルキレン」は、本明細書で定義されたアルキレン基の一方の末端に結 合した、本明細書で定義されたシクロアルキル基を含む飽和炭化水素を指す。こ の用語は、例えば、シクロへキンルメチレン、シクロプロピルメチレン、シクロ ブチルエチレン、６−シクロオクチルヘキンレン等を含む。

「シクロオキシアルキレン」は、１つまたはそれ以上のエーテル酸素原子を含む 、本明細書で定義されたシクロアルキレン基を指す。

本発明は、ハイブリダイゼーションを使用する特異的配列の検出を含み、これに より、試料ＤＮＡとプローブとの二本鎖形成が、標識と支持体との空間的関係を 改変する能力に影響を及ぼす。この様にして、試料中の特定の配列の存在または 不在が、媒質中に遊離した標識の量により、容易に測定し得る。

本発明の方法は、核酸試料が支持体に結合している場合、あるいは溶液中に遊離 して存在している場合も考慮して、プロトコールおよび試薬を変え得る。好まし い実施態様では、酸の二本鎖の形成を含み、その結果、選択的な開裂を与える条 件下で放出された標識の量が、核酸試料中の対象の配列の存在および量の尺度と なる。選択可能な開裂部位は、ホモ二本鎖形成による制限酵素認識部位の形成の 結果として生じ得る、または、一本鎖ボソヌクレオチド鎖中のこの様な選択可能 な開裂部位の存在は、一本鎖中へこの様な部位を予め導入した結果であり得る。

対象のオリゴヌクレオチド配列を有し、核酸被分析物にハイブリダイズするポリ ヌクレオチドを含む試薬が使用される。

この試薬は、本明細書中では、場合により、「捕捉プローブ」と呼ばれ、本方法 では、選択した固相支持体に結合されている。標識化プローブもまた使用され、 これには対象の配列が含まれても含まれなくてもよい。

第１の好ましい実施態様では、本発明の方法は、ハイブリグイゼーンフン溶媒中 でのポリヌクレオチド二本鎖の形成を含み、選択可能な開裂部位を介して、標識 が支持体と結合する。試料ＤＮＡが支持体に結合している、または溶液中に分散 している状況の種々のプロトコールが、使用され得る。

関連する種々のヌクレオチド配列を区別するために、以下の用語を使用する： 核酸試料一対象のオリゴヌクレオチド配列を有する核酸配列の含有が考えられる 試料； 核酸被分析物一対象のオリゴヌクレオチド配列を宵する前記核酸前記試料中のＤ ＮＡまたはＲＮＡ；対象のオリゴヌクレオチド配列−一般には、少なくとも６塩 基、より一般には少なくとも約１０塩基、好ましくは少なくとも約１６塩基、５ 　ｋｂかそれ以上でもあり得るが、通常は０．２ｋｂ以上ではない、ヌクレオチ ド鎖の全部または一部のＤＮＡあるいはＲＮＡ配列であり、遺伝上の特徴、病原 体、等の診断に役立つ遺伝子または配列の特徴である、検出されるべき診断上の 性質を示す； ポリヌクレオチド配列一対象のオリゴヌクレオチド配列の検出用の試薬として用 いられるＤＮＡまたはＲＮＡ配列であって、このポリヌクレオチド配列は、標識 されていてもされていなくてもよく、支持体に結合していてもしなくてもよく、 そして、対象のオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含んでも含まなくても よい。単独で、または核酸被分析物と結合させると、標識と支持体との間の選択 可能な開裂部位とを宵し、標識と支持体の間の架橋として機能する、１つまたは ２つのポリヌクレオチドの配列も存在する；および選択可能な開裂部位−過ヨウ 素酸で、選択的に開裂し得る単一あるいは複数の官能基。

記載の便宜上、選択可能な開裂部位が創出された本発明の好ましい実施態様は、 ４つの主要な副次的実施態様に分割される。これらの第１番目（図２Ａ参照）で は、使用する試薬は、単一の構成要素で、試薬は、一方の末端近傍で支持体と結 合し、そして反対の末端近傍で１つまたはそれ以上の検出し得る標識と結合する ポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは、支持体と標識の中間に開裂 可能な部位を含む。

第２の場合（図２Ｂ参照）では、使用する試薬は、核酸試料が支持体に結合する か否かで、変更し得る２つの構成要素を有する。核酸試料が支持体に結合する場 合、２つの構成要素は、（１）架橋用ポリヌクレオチド配列、および（２）架橋 用ポリヌクレオチド配列の一部と相補的でハイブリダイズするポリヌクレオチド 配列である。この相補的ポリヌクレオチド配列は、標識されている。この架橋用 ポリヌクレオチド配列は、相補的配列と二本鎖を形成する配列を有すると同時に 、対象のオリゴヌクレオチド配列と二本鎖を形成する領域を有する。

試料核酸が溶液中に存在する場合には、この２つの構成要素は、（１）対象のオ リゴヌクレオチド配列を定義し得るかどうかには関係はないが、核酸被分析物中 に存在する配列と相補的な領域を有し、支持体と結合させた箪−のポリヌクレオ チド；および、（２）対象オリゴヌクレオチド配列を定義し得るかどうかに関し ては、第一のポリヌクレオチド配列と同じ定義を有し、核酸被分析物中に存在す る配列と相補的領域である、標識化第二ポリヌクレオチド配列。少な（とも二本 鎖化した領域の少なくとも一つは、対象の配列を明らかに示している。

第一または第二ポリヌクレオチド配列のいずれかは、選択可能な開裂部位を含む 。

第３の場合（図２Ｃ参照）では、被分析物が支持体に結合され、そして使用する 試薬が、対象のオリゴヌレオチド配列と相補的な領域を有し、選択可能な開裂部 位を含む、単独の構成要素である。

第４の場合（図２Ｄ参照）では、結合ｒＹＪを介して支持体に結合し、そして、 その反対側の末端が核酸被分析物中に存在する第一の配列と相補的である、ポリ ヌクレオチド鎖の捕捉プローブが提供される。標識した第二ポリヌクレオチド鎖 を含む標識用プローブは、前記第一の配列と異なり、かつに重複しない被分析物 中の第二配列に相補的な領域を有する。図２Ｄで「Ｙ」と略記した結合は、プロ ーブを支持体に結合し得る任意の一般的手段を表わす。結合ｒＸＪは、過ヨウ酸 開裂し得る結合を表わす。

本発明の焦点である選択可能な開裂部位は、構造式−Ｒ＋−０−Ｘ−０−Ｒ２− を有する全ての過ヨウ素酸開裂結合である。式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、 アルキレン、アルケニレン、／クロアルキレン、／クロアルケニレン、シクロオ キシアルキレン、アリール、アリールアルキレン、およびこれらの組合せからな る群から選択され、これらの用語は上記で定義された通りである。また、Ｘは、 過ヨウ酸開裂し得る結合回身である。

ｒＸＪで表現し得る過ヨウ酸開裂し得る部分の例には、ｒＲＪが水素あるいはア ルキル（一般に低級アルキル）の二本方法を実施するためには、相補的配列間で 二本鎖形成が起こる条件で、核酸を含有する試料と、適切な試薬とを混合する。

この混合物を、対象のオリゴヌクレオチド配列上で少なくともへテロ二本鎖形成 またはホモ二本鎖形成が起こる様に考慮された予め定めたストリンジェンンーの 条件下で、ハイブリダイズ゛させる。ハイフ゛リダイゼーションが起こるのに充 分な時間後、支持体を上清から分離し、そして、少なくとも非特異に結合した標 識が実質的に全てなくなる様に洗浄し得る。次に支持体に結合したオリゴヌクレ オチドを、過ヨウ素酸で処理し、その結果、少な（とも１本鎖の開裂が起こり、 そして支持体に結合した標識の放出が起こる。

二本鎖形成を起こす特定の配列が試量中に存在するか否かに依存して、支持体に 結合した標識（単数あるいは複数）の放出が観察される。通常は上清の溶媒を標 識の存在に関してアッセイし得る、種々のプロトコールが使用し得るが、場合に よっては支持体を測定しても良い。上清からの支持体の物理的分離が必要か否か に関わらず、種々のプロトコールおよび試薬類が、使用され得る。

本発明の方法は、広範な状況で、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれのオリゴヌクレオ チド配列の検出にも使用し得る。重要な対象領域の一つは、特定の宿主に感染し 得る病原体、ウィルス、バクテリア、真菌類、原生動物類等の検出である。例え ば、米国特許第４．３５８．５３５号参照。別の対象領域は、対立遺伝子の検出 、および、例えば羊水穿刺液を用いる宿主のゲノム中に存在する変異あるいは欠 失の検出；遺伝子カウンセリング；宿主の過敏性または感受性試験；および細胞 集囲のモニタリング；である。第３の対象領域は、転写のモニタリング、ＲＮＡ ウィルスの検出、未発現のＲＮＡによる微生物の分類等の様に非常に多様な理由 に基づ＜　ＲＮＡの存在の確認である。例示を目的とするため包括的ではないが 、他の対象領域には、染色体外ＤＮＡまたは組込みＤＮＡの存在；　ＤＮＡ配列 の増幅；このような配列の維持；に関する改変微生物のモニタリングが含まれる 。

本発明の方法を使用し得る種々の目的から明白な様に、生理学的試料は広範囲の ソースから取得し得る。ソースは、例えば便、痰、尿、唾液、その他の排拙物； 血漿、血液、血清、接眼レンズ液、を髄液、リンパ液、等の、種々の生理学的液 体を含み得る。試料は改変せずに使用し得る。あるいは、試料の増幅、クローニ ング、等を行い、単離体とし、そのＤＮＡまたはＲＮＡを全体的に増加し、外来 のＩ）ＮＡまたはＲＮＡは全体的に減少する様に改変し得る。ウィルスを、適合 する細胞のローン上にブレーティングし、ウィルスＤＮＡの量を増大し得る；臨 床的な単離体は、試料を栄養物を加えた寒天培地上に試料をストリークまたはス ポットし、個々のコロニーをアッセイすることで得られ得る１あるいは全試料を 液体の培地と細胞の混合物に入れ、選択的にまたは非選択的に増殖し得る。試料 を処理する特定の方法は、試料の性質、ＤＮＡまたはＲＮＡのソースの性質、存 在する核酸の全量に対する存在すると予想される目的のオリゴヌクレオチド配列 の量、および、採用したプロトコールおよびラベルの感度に依存する。

試料の核酸または試薬のポリヌクレオチドの一方は、共有結合または非共有結合 の何れかで、拡散しない様に、支持体に結合し得る（図２Ｄで表される実施態様 の場合には、捕捉プローブ単独が固相の支持体に結合している）。試料の核酸を 支持体に結合する場合には、種々の支持体が、特別の使用法を宵し、その応用範 囲も知られているので、その様な支持体力ダ好ましい。これらの支持体には、非 特異結合が低いかあるいは無い、核酸試料を保持する、取り扱いが容易である、 および、増殖あるいは微生物、洗浄、加熱、転写、標識検出の様な種々の処理が 行える様な望ましい特性を与え、ニトロセルロースフィルター、ジアゾ化紙、エ クテオラ（ｅｃｔｅｏｌａ）紙、または他の支持体を含が含まれる。

ポリヌクレオチド試薬の一成分か支持体に結合と（Ｘう条件で、試料オリゴヌク レオチドと相互作用するタイプの支持体の範囲内で、支持体のタイプは大きく変 動させ得る。支持体は、粒子、紙、プラス千ツク／−ト、コンテナーホルダー壁 、分割器具（ｓｅｐａｒａｔｏｒ）、ミリポアフィルタ−等を含み得る。一方、 支持体の材料は、多糖類、ポリスチレン、ポリアクＩＪ　）し酸およびその誘導 体、例えばポリアクリルアミド、力゛ラス、セラミ、り、金属、炭素、ポリ塩化 ビニル、タン／ザク質、等の様な、天然または合成の有機ポリマーを含み得る。

共有結合または非共有結合のどちらが望まれる力）（こ依存して、種々の材料を 官能基化、または脱官能基化し得る。

核酸試料を支持体に結合する場合、特定の支持体によっては、核酸の満足な結合 に加熱で十分であり得る。他の状況では、核酸に結合させるためにジアゾ基を採 用し得る。し力）し、ポリヌクレオチド試薬の成分を支持体（こ結合する場合、 ポリヌクレオチド試薬の支持体への結合維持を保証するたメ（コ、広範な異なっ た技術を使用し得る。例えば、アルキルアミン類、ヒドラジド類、またはチオセ ミカル１＜ンド類を支持体へ結合させて得られる、結合のための活性アミ７基を 持たせる様に、支持体を官能基化し得る。その後、ターミナルトランスフェラー ゼを用いて、リボヌクレオチドをＤＮＡポリヌクレオチド試薬に付加し得る。例 えば過ヨウ素酸塩、四酸化オスミウム＋過酸化水素、四酢酸鉛等の適切な酸化剤 でグリコール開裂し、ジアルデヒドを形成し、次いでこれを支持体表面のアミ７ 基に結合し、−置換または二置換のアミ７基を生成する。あるいは、チオ燐酸と 共にアルキルチオエステルを形成するマレイミド基も提供し得る。前出のＰａｒ 　ｉｋｈら、および前出のｌｎｍａｎに記述されたアガロースおよびポリアクリ ルアミドについての種々の技術を採用し得、それらの技術は他の物質に対して応 用し得る。

多くの場合、経験に基づいて決定されるため、アッセイ溶媒中で使用し得る支持 体上のポリヌクレオチド試薬の成分の総数は、変化する。ポリヌクレオチドがハ イブリダイゼーションを妨害する密度にならない限り、支持体上の使用し得る官 能基に対して、ポリヌクレオチドの単位表面積あたりの密度は比較的高くして使 用すべきである。

ポリヌクレオチドのサイズは大きく変化し得るが、通常約１５塩基以下ではなく 、５０塩基またはそれ以上であり得、通常は約５００塩基を越えず、より一般に は２５０塩基を越えない。ポリヌクレオチド試薬の成分中には通常少なくとも６ 塩基、通常は少なくとも１２塩基の、通常は対象配列である、核酸試料中の配列 に相同の部位を有する。ハイブリダイゼーションのための部位は、１６塩基また はそれ以上であり得、通常約１　ｋｂｐヲ越えない。完全な相同性か要求されな い場合、少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも８０％の相同性があ れば十分である（相同性百分率は、ループアウトし得る非相補的挿入部分、５塩 基長を越える挿入部分を無視した、相補性を意味する）、３ 特に、対立遺伝子群、多数の異なる株、または、関連し合った種を対象とする場 合、メツセン／ヤーＲＮＡあるいはゲノムタノバク質は高度に保存されているに もかかわらず、冬型か起こっているので、任意の特定の配列に対する、この相違 を反映し、かつ全ての対象配列への、相同性を最適化したプローブを調製するこ とが望まれる場合がしばしばある。

標識したポリヌクレオチド試薬の成分の標識は、選択的開裂部位または他の結合 を介して、ポリヌクレオチド配列に結合し、得る標識はアッセイを通して保持さ れる。多くの種類の標識か使用可能である。標識は、検出可能な信号または検出 可能な信号を得る手段を提供し得る。

それゆえ標識は、直接または間接の何れかで検出可能な信号を提供し得る、リガ ンド、う／オアイントープ、酵素、蛍光物質、化学発光物質、酵素自己不活性化 抑制因子、酵素の補因子、酵素基質、またはその他の置換基の様な多様な置換基 を含んでいる。

リガンドが関与する場合、例えば、ビオチンとアビジン、２．４−７ニトロヘン ゼンと抗（２，４−ンニトロベンゼン）ＩｇＧｉの様な、そのリガンドに特異的 に結合するレセプターが一般に使用される。この場合、上述の様に適切な標識で 置換する。

このようにして、検出可能な信号を与えるための、ポリヌクレオチド配列−個当 りの標識の数を検討し得る。

種々のイムノアッセイで使用する標識は殆ど、本発明のアッセイでも利用し得る 。これらの標識は、米国特許第３．８５０゜７５２号（酵素）；第３．８５３． ９１４号（スピンラベル）；第４．１５０．０１５号（蛍光物質）；第４．１７ ４．３８４号（蛍光物質および消光物質曹第４、１６０．６４５号（触媒）：第 ４．２７７、４３７号〈化学発光物質）；第４．３１１１．７０７号（ｌ両光粒 子）；および第４．３１８．８９０号（酵素基質）に説明されている。

代表的な蛍光性および化学発光性の標識には、フルオレセイン、ローダミン、タ ンンル、ウンベリフェロン、ビリタンパク、ルミノールその他が含まれる。

代表的な対象とする酵素の例には、西洋ワサビベルオキシダーゼ、グルコース− ６−燐酸デヒドロゲナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、β−ガラクトンダー セ、α−アミラーゼ、ウリカーゼ、リンゴ酸デヒドロヶナーゼ、その他が含まれ る。

標識をポリヌクレオチド配列に結合する方法は、標識の性質に依存して大きく変 化する。すでに示したように、リボヌクレオチドをオリゴヌクレオチド配列に加 え、開裂し、得られたジアルデヒドをアミ７Ｋまたはヒドラジン基と結合し得る 。アルキルアミンの生成をもたらす還元条件を用いることで、結合の永続性をさ らに高め得る。あるいは、標識とα−ブロモまたはα−りＣ：ｌニアアセチルの 様な、活性ハロケ７テを換し得る。この活性ハロゲンは、チオ燐酸基またはチオ エステルと結合させることができ、チオエステルが形成される。

あるいは、標識はマレイミド官能基を持ち得、この場合、ポリヌクレオチド上に 存在するメルカプト基がチオエステルを形成する。ポリペプチドの末端の燐酸は 、カルボジイミドで活性化し得、得られるホスホルイミタゾリドはアミノ基ある いはアルコールと反応し、ホスホルアミデートまたは燐酸エステルを与える。ア ミノ修飾したプリンにポリペプチドを形成し得る。従って、標識の選択、結合の 様式、および、結合基の選択には亡範な自由度がある。

このポリヌクレオチド試薬を試料と結合することで、存在する全ての核酸被分析 分が支持体に結合する。選択可能な開裂部位の開裂で、支持体から放出される標 識の量を被分析物の存在量と関連付け、被分析物の量もまた定量的に測定し得る 。

標識と支持体の空間的関係の改変は、数多くの方法で達成し得る。既に示したよ うに、プローブと同じポリヌクレオチドとには、少なくとも一つの共通の認識部 位が存在し得るので、支持体からプローブを放出し得る。

リガンドが検出可能な信号を直接に与えないが、一つ又はそれ以上の標識と結合 している受容体と結合する場合、リガンドで置換したヌクレオチドを使用し得る 。代表的な例には、アビノンと結合するビオチン化されγこヌクレオチド、免疫 グロブリンと結合するハブテン、および、レクチンと糖類、細胞表面膜蛋臼とホ ルモンおよび増殖因子、等の様なタンパク質様のレセプターに結合する種々の天 然化合物が含まれる。

図２Ｄで表される実施唸様では、選択可能な開裂部位は、二つの方法の内一つで 導入し得る。

先ず、架橋用化合物を、捕捉プローブ１自体に、即ち図中に示したように位置ｒ ＸＪで組み込み得る。この目的には、任意の数の架橋用試薬が使用し得、唯一の 制限は、捕捉プローブに導入する開裂部位は、過ヨウ素酸で開裂できなければな らない点である。過ヨウ素酸開裂可能な結合を導入するための適切な架橋用試薬 の例は、硫黄−硫黄架橋を有するビス（カルボン酸＞（Ｐｊｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ ｆｃａｌｓから入手可能）、およびジスクシンイミ／ル酒石酸＜ＤＳＴ）である 。

固相の支持体に付着させる前に、捕捉プローブを適切に改変することでも、選択 可能な開裂部位を導入し得る。この方法は、次の構造式を有するポリヌクレオチ ドの調製を含む。

たたし式中の、Ｘは上述の様に過ヨク素酸開裂可能な部位である、あるいは含む 、ＤＮＡ　ｒはＤＮＡの第１鎖、ＤＮＡ２はＤＮＡの第２鎖、そしてＲ１および Ｒ２は以前に定義した通りである。特に好適な実施態様では、−Ｒ＋−０−Ｘ− ０−Ｒ２−は次にこの化合物を、本技術分野で周知の一般的な方法を使用して固 相の支持体に付着させ、図２Ｄに示した捕捉プローブをとし得る。この様な化合 物は、上の構造式の１．２−ジオール系がＤＮＡ合成中にジベンゾイル混合物と して保護され、さらに次の構造式の置換基Ｙ１に、（ジメトキシトリチル、また は「ＤＭＴＪの様な）酸に感受性で、塩基に安定な保護基、そして置換基Ｙ２に 、水素あるいは、ホスホルアミダイト、燐酸トリエステル、燐酸ジエステル、ホ スファイト、トホスホ不一トまたはホスホチオエートの様なリンの誘導体を含む 次式の試薬を使用し、標準のホスホルアミダイト反応のプロトコールを用いて、 ＤＮＡ断片中に組み込み、調製し得る。代表的な化合物は、ｒ　ＤＭＴＪが、ジ メトキシトリチルでありｒｉＰｒＪはインプロピルである、 て表され得る。

図２Ａから２ｃに示した実施態様と同様に、図２Ｄの実施態様は、溶液中で特異 的に結合した１ｍの検出を（そして、当然被分析物２の正確な測定を）を可能に し、一方、非特異的に結合した襟識６は固相の支持体５に結合したままである。

−広範な種類の支持体、および、オリゴヌクレオチド鎖の非拡散的結合の技術が 、文献中に報告されている。総説は、ＭｅｉｎｋｏｔｈとＷｈａｔ、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｆｆｉ、（１９８４）　１３８：２６７−２８４を参照。

支持体には、温度ｇ　ｏ　’ｃで２時間で十分なニトロセルロースフィルター、 さらなる活性化なしに結合が起こるジアゾ化紙、エクテオラ紙、その他が含まれ る。アガａ−スビーズは、ＤＮＡと直接反応させるために、臭化シアンで活性化 し得る（Ｂａｕｍａｎ　ラ、Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｔｏｃｈｅｍ、　 （１９８１）　２９＋　２２７−２３７）；あるいは、臭化シアンおよびジアミ ／と反応させ、次ぎに例えば、ブロモアセチルの様な−−ハロアセチルと反応さ せる、あるいは、例えば無水マレイン酸のカルボ牛シル置換活性オレフィンと反 応させ、ポリヌクレオチド路上に存在するチオール官能基と反応し得るビーズを 得る。例えば、ＤＮＡを改変してカップリング用の、−一チオ燐酸を形成し得る 。（ＰｆｅｕｆｆｅｒとＨｔ１ｍｒｅ４ｃｈＳＪ、　Ｂ包り匹■ｒａ、　（１９ ７５）±・８６７−８７６）。化学的手段により、オリゴヌクレオチドを合成し テフロン支持体に結合し、そして次ぎに、オリゴヌクレオチドを取り除くことな くこの材料を完全に脱ブロツク化することも可能である。（Ｌｏｈｒｍａｎｎら い五（１９８４）　３：１２２＞。

襟識と試薬が広範な多様性を有するという観点から、本方法の全般に共通する側 面を記載し、その後いくつかの代表的プロトフルを記載する。本性全般に共通し ているのはハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションは、二本鎖 形成に要求される相同性が大きいか小さいかによって、変化する度合のストリン ジエンシーの程度で実施され得る。殆どの場合で、水性溶媒が使用され、種々の 他の成分の混合物を含み得る。特に、有機極性溶媒は、ストリンジエンシーの増 大のために使用し得る。代表的な溶媒の例には、ジメチルホルムアミド、ジメチ ルアセトアミド、ジメチルスルホキッドが含まれる。即ち、使用する濃度で水混 和する有機溶媒である。高いイオン強度を得るために加える塩濃度を高めても、 ストリンジエンシーを増大し得る。さらに、温度上昇もストリンジエンシーに用 い得る。各場合共に、逆にするとストリンジエンノーは低下する。界面活性材の 様な、他の添加物もまた、ストリンジエンシーの改変に使用し得る。

ハイブリダイゼーションだめの時間の長さは、対象配列の濃度、ストリンジエン シー、相補的配列の長さ、等により変化する。一般に、ハイブリダイゼーション は、少なくとも約１５分を要し、そして一般的には、約７２時間を越えず、より 一般には約２４時間を越えない。さらに、あるストリンジエンシーでハイブリダ イゼーションを行い、そして次に、より高いストリンジエンシーで洗浄し、十分 な相同性を欠くヘテロ対合を除去し得る。

核酸試料は、種々の方法で処理し得る。例えば、完全なゲノム、機械的に切断し たまたは制限酵素で消化した、約０．５ｋｂから３０　ｋｂまで変化するゲノム の断片、あるいは、例えば電気泳動で大きさに従って分画された断片を使用し得 る。ある場合に、対象配列は、例えば、例えばＭ２Ｓ、の様な一本鎖のＤＮＡま たはＲＮＡウィルスである適切なベクター中でクローニングされたクローン配列 である。

アッセイ溶媒中には、緩衝剤、例えばＳＤＳである界面活性剤、フィコール、ポ リビニルピロリドン、および、非特異的結合を最小化し得る外来のＤＮＡ、を含 め得る。これらの添加物の全ては、参考文献中に説明があるため、詳細な記述を 要さない。

特定のプロトコルに従い、試料核酸をポリヌクレオチド試薬（単数あるいは複数 ）と共に、予め定められたストリンジエンシーのハイブリダイゼーション溶媒中 に入れる。ハイブリダイゼーションに十分な時間の経過後、支持体を、ハイブリ ！　イセ−シ＊ン溶媒よりも高いかまたは低いストリンジエンシーの溶媒で、少 なくとも一回洗浄する。次に、結合したボッヌクレオチドと被分析物を含む支持 体を、−水路または二本鎖開裂を考慮した選択可能な開裂部位の開裂に必要な反 応物（例えば光の様な物理的処理を含む）と接触させる。多くの場合、制限エン ドヌクレアーゼ、ホスホジェステラーゼ、ピロホスファターゼ、ペプチダーゼ、 エステラーゼ、その他の様な加水分解酵素が使用されるが、還元剤、エルマン試 薬の様な他の試薬、または光も用い得る。開裂の後、支持体と上清とは、標識お よび測定の様式、そして、支持体から放出され測定された標識の量に依存して、 分離しても分離しなくてもよい。

本発明をさらに説明するため、幾つかの代表的プロトコルを記載する。第１の代 表的プロトコール中では、蛍光標識されたポリヌクレオチドが各ウェルの底に結 合しているマイクロタイタープレートを使用する。クローン化された病原体のＤ ＮＡを、一つまたはそれ以上の制限酵素で制限酵素消化し、約０．５２ｋｂの断 片を得る。この断片を穏和な塩基性条件下で単離上変性し、そしてハイブリダイ ゼーション溶媒中に分散し、次に、各ウェルが特定の病原体種の異なる株の配列 に特異的に相同な異なる配列を有する複数のウェルに順次添加する。

ハイブリダイゼーションが起こるのに十分な時間の間、これらのウェルを例えば ６０℃の高温度に維持し、その後に、この上清を取り除き、そして、ウェルをハ イブリダイゼーション溶媒より低いストリンジエンシーの緩衝溶媒で繰り返し完 全に洗浄する。二本鎖形成は、全ての株に共通する制限酵素の認識部位を与える 。次に、各ウェルに二本鎖ＤＮＡを消化するための制限酵素溶媒を添加し、二重 鎖ＤＮＡを消化し１、蛍光性の標識の上清中への放出が起こる。各ウェルからこ の上清を吸引分取し、励起光照射をする。次に対照配列の存在の指標として蛍光 の量を測定する。この様にして、液相中の蛍光の存在を観察することで、どの株 が存在するかを迅速にスクリーニングし得る。

第２の代表的なプロトコールでは、未標識のポリヌクレオチドを結合したガラス ピーズを含むカラムを使用する。次にこのカラムに、哺乳類細胞から得たＤＮＡ 断片を含む試料核酸を添加する。この断片は、約０．５から１０　ｋｂの範囲で ある。この試料ＤＮＡを、適切なハイブリダイゼーション溶媒に分散し、モして カラムに添加し、そしてハイブリダイゼーションが起こるのに十分な時間の間カ ラム中に保持する。試料のハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイゼーショ ン溶媒をカラムから放出し、そして、策１の溶媒よりも厳密な条件下の第２のハ イブリダイゼーション溶媒中のジスルフィド結合を介して西洋ワサビペルオキシ ダーゼ（ＨＲＰ）を標識したポリヌクレオチド試薬を加え、そして、第２の溶媒 をハイブリダイゼーションが起こるのに十分な時間でカラムから放出する。標識 したポリヌクレオチドは、対象配列に相補的な配列を有する。ハイブリダイゼー ション溶媒を、カラムから排出する。

次に、カラムを、より高いストリンジエンシーを有する溶媒で１またはそれ以上 の回数洗浄し、標識したポリヌクレオチドに対して不充分な相同性を有する全て のポリヌクレオチド配列を除去する。次に、エルマン試薬をカラムに加え、ジス ルフィド結合の解裂を起こし、モしてＨＲＰを放出させる。ＥＩＲＰを含む溶媒 をカラムから排出し、回収し、そして、引き続く、遊離した酵素がカラム中に残 らない様保証する洗浄の洗浄液をも、補集した。ＨＲＰ標識を含む得られた溶媒 を次に、）ＩＲＰ標識に関してアッセイし得る。ＨＲＰの代わりに、分光学的に または蛍光的に検出し得る生成物を生成する多くの種類の他の酵素を、使用し得 る。

第３のプロトコールでは、試料をフィルターに吸収させ、そして８０℃で２時間 加熱することで、核酸試料を、ニトロセルロースフィルターの一端に非拡散的に 結合する。このフィルターを洗浄し、そしてその後、ノ＼イブリダイゼーンヨン 条件下で、エステル結合を介して、アルキルカルボキシ置換アデニンに結合させ たウンベリフェロンで標識したポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション溶液 に加える。この標識したポリヌクレオチドは、対象配列に相補的な配列を有する 。／・イブリダイゼーションに充分な時間の後、このフィルターをハイブリダイ ゼーション溶媒から取り出し、洗浄し、非特異的に結合たヌクレオチドを除去し 、そして次に、既知濃度のエステラーゼ溶液中に浸す。蛍光の増加の率を、核酸 試料中の被分析物の量の指標としてモニターする。

他のプロトコールでは、ポリフルオレセイン化した末端を有する被分析物配列に 相補的に配列された１ｍしたポリヌクレオチドを有するストリップを保持する、 ホルダーを有するプラスチックの材質のディノブステイノクを使用し得るｏ核酸 試料を適切なノ・イブリダイゼー／＝Ｉン媒質中で調製し、そして、ディツプス ティ、りを入れ、そしてハイブリダイゼーションを進行させる。ハイブリダイゼ ーションが起こるのに十分な時間の後、このディツプスティックを取り出し、そ して洗浄し、非特異的に結合した全てのポリヌクレオチドを取り除く。対象ポリ ヌクレオチド配列の存在は、制限酵素認識部位の形成をもたらし、そして次に、 ディツプスティックを制限酵素反応混合液に入れ、そして消化を進行させる。消 化が進行するのに十分な時間の後、このディツプスティックを取り出し、徹底的 に洗浄し、そして溶液中の蛍光を読み取る。

また、ベースラインの値より上の蛍光は、被分析物の存在を示す。

別のプロトコールでは、ポリヌクレオチド試薬成分は、核酸被分析物の一つの領 域に対し相補的な配列を有し、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合し ている第一のポリヌクレオチド、および核酸被分析物の他の領域に相補的な配列 を有する標識した第２のポリヌクレオチドである。この標識は　Ｎ８−アミノヘ キシルデオキシアデノンントリホスフェートウンベリフェソル力ルボキンアミド で尾部伸張ポリヌクレオチドから得られる。ハイブリダイゼーション条件下で、 過剰の標識したポリヌクレオチドと共に、核酸試料をウェル中に入れる。ハイブ リダイゼーションに十分な時間の後、ハイブリダイゼーション溶液をウェルから 吸引して取り出し、ウェルを洗浄し、そしてウェル中に残留したＤＮＡを、９０ ％のギ酸溶液を加え、そして６０℃で１時間加熱するか、あるいはビペリジンを 加え、９０℃で３０分加熱することで、脱プリン化する。

あるいは、標識されるべきポリヌクレオチドと、５ｉｌｖｅｒとＦｅ１ｓｈｔ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９８２）　２１：６０５６に従いりｏｏアセト アルデヒドで処理して、ポリ−ｄＡを処理して得られるオリゴマーの過剰量とを ライゲーションし、蛍光性Ｎ６−ニタノアデノシンを作成することで、標識が得 られる。標識の放出は、１０００　ｕｇＭの、ＣａＣｌ２溶液中のミクロコツカ スヌクレアーゼで、３７℃で１時間処理して行われる。

どちらの場合も、このポリマーの蛍光は自己消光のために顕著に減少する。溶解 すると、蛍光の顕著な増加が観察される。この様にして、脱ポリマー化に抵抗性 を有する、非特異結合した標識ポリヌクレオチドは観察される信号に干渉されな い。さらに、バックグラウンドの蛍光レベルが低いので、蛍光の増加率を核酸被 分析物の定量的な指標として測定し得る。自己消光の代わりに、蛍光物質と消光 物質が入れ替わった／ステム、あるいは、２成分試薬システムで、非消光性蛍光 物質が一つの成分上に存在し、消光物質が他の成分上に存在するシステム、も使 用し得る。

以下の実施例は説明を目的に提供され、限定は意図しない。

夫！ ＰＣＬ（過ヨウ素酸開裂可能リンカ−）の合成：この実験では、略号ｒＸＪは、 Ｄ、Ｌ−１，４−ヒス−（４−（２−１＋−ドロキンエチル）フェノキシ）−２ ，３−ブタンジオールを、略号「ｘ’Ｊ　ハ２．３−イア　７’　ａ　ヒ’Ｊ　 ｙ’　ンヲ、＋　Ｌ　テ略号ｒＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ２）−ＢＣＥ」は２−（４−［ ４（４−（２−ジメトキシトリチルオキ／）エチル）フェノキシ−２，３−ジ（ ベンゾイルオキシ）−ブタン−オキシ１フエニル）エチル−２−シア／エチル− Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイトを表す。ｒＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ２）−Ｂ ＣＥ２Ｊ　Ｉｔ次ノｔＲａ　式ヲ有ｔ　ル。

４・ヒドロキシフェニルエタノール（２１，４ｇ：１５５　＊墓ａｌｅ）および １．４−ジブロモ−２，３，−ブタンジオール（１９Ｊ　ｇ、７８■■ｏｌｅ） を４００ｍ１の無水エタノールに溶解した混合物に、Ｎａ０Ｈ（２６ｍｌの６Ｍ 水溶液）を加えた。この反応混合物を１８時時間中かに還流した。室温に冷却し た後、溶媒の半分を減圧で除去しく−２００ｍｌ）、そして、激しく攪拌しなが ら１０００　ｍｌの水に滴加した。生成した沈澱物を濾別し、そして真空デシケ ータ−中で、乾燥を補助する固体Ｎａ０Ｈ（１０ｇ）上で完全に乾燥し、１１． ９　ｇ＜３３　ｍｍｏｌｅ）の「Ｘ」（収量４２％）を得た。

化合物ｒＸＪ　＜３３　ｍｍｏｌｅ＞をＴＨＦに溶解し、次にこの溶液（３３０ ｍｌ）を濾過し、モしてＮ、ＩＪ−ジメチルアミノピリジン（１００＋ｏｇ）と トリエチルアミン（２７■ｌ；２００　ｍｍｏｌｅ）を加え、そして最後にｔ− ブチルジメチルシリルクロライド（ＴＢＤＭＳ−Ｃ１）（１９，８ｇ：１３２ｓ ｖｏｌｅ）を上記混合物に加えた。２０°Ｃ１１８時間の後、全ての出発物質が 消滅しくｔｉｅ分析で確認）、そして、メタノール（５０ｍｌ）を加え過剰なＴ ＢＤＭＳ−ＣＩを消滅した（２５分間）。この反応混合物を少容積に濃縮し、酢 酸エチル（２５０ｍｌ＞で希釈し、そして２５０　ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３で１ 回、２５０　ｍｌのＮａＣ１８０％飽和水溶液で１回洗浄した。有機相を固体Ｎ ａ２ＳＯ４上で乾燥した後、溶媒を減圧下で除去した。粗ＴＢＤＭＳ２−Ｘをピ リジンに溶解し、０℃に冷却し、そして１２５　ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２に溶解した 塩化ベンゾイル（１３２ｍｍｏｌｅ）を滴加した。反応溶液を加熱し室温とし、 そして１８時間放置した。ピリジン溶媒を減圧下で除去し、モして装置を酢酸エ チルに溶解した。上記と同様に水性溶媒で処理した後、この粗ＴＢＤＭＳ２ＸＢ Ｚ２（３０ｍｍｏｌｅ）を１００　ｍｌの濃酢酸を含むＺｏｏ　ｍｌのＴＨＦに 溶解し、そしてテトラブチルアンモニウムフルオライド（１００ｍｌのＩＭのＴ ｌ（Ｆ溶液）を加え、そして反応混合物を４°Ｃで１８時間放置した。次に溶媒 の大部分を減圧下で除去し、そして酢酸エチル中に入れた装置を固体ＮａＨＣＯ ３で処理し、過剰な酢酸を中和し、上記と同様に洗浄と乾燥を行い、Ｘ（ＢＺ２ ）（３０ｍｍｏｌｅ；１７．０　ｇ＞を得た。この物質を精製せずに使用し、そ してピリジン中で３０　ｍｍｏｌｅのＤＭＴ−Ｃ１で処理した。１８時間後、溶 媒を減圧下で除去し、酢酸エチル中の装置を上記と同様に洗浄および乾燥し、２ ７　ｇの粗ＤＭＴ−Ｘ　（ＢＺ２）を得た。この粗生成物を、ＣＦ１２Ｃ１２／ １％トリエチルアミンを溶媒システムとして用イ、ノリ力の大型カラムで精製し 、純粋なりＭＴ−Ｘ（ＢＺ２）（１３，３ｇ：１５ｍｍｏｌｅ）を得た。この精 製した物質を、以下の様して２−シアノエチルホスホルアミダイト誘導体に変換 した：　ＤＭＴ−Ｘ（ＢＺ２）（１５ｍｍｏｌｅ＞をＮ、Ｎ−ジイソプロピルエ チルアミン（１３，１ｍｌ；７５　ｍｍｏｌｅ）を含む５０ｍ１のＣＨ２Ｃｌ２ に溶解し、モしてｏ’ｃに冷却した。

この溶液に、アルゴン気流下で、２−ンアノエト牛ンーＮ、Ｎ−ジイソプロピル アミノクロロホスフィン（３，３ｍｌ；１５　ｍｍｏｌｅＬヲ注射器を用いて加 えた。〜３０分後、反応は完了し、そして５００　ｍｌの酢酸エチルで希釈した 後、有機相を５００　ｍｌの５％ＮａＨＣＯ３で２回、そして５００　ｍｌの８ ０％飽和ＮａＣ１で２回洗浄した。固体Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した後、溶液を濾 過し、蒸発乾固し、１６ｇの白色の泡状のＤＭＴ−Ｘ（ＢＺ２）ＢＣＥアミダイ トを得た。この粗アミダイトをシリカゲルカラムで精製しＣＦ１２Ｃ１２／酢酸 エチル／トリエチルアミン（４５：４５：１０　ｖ／ｖ）で溶出し、白色の泡状 の純粋なりＭＴ−Ｘ（Ｂｚ２）ＢＣＥアミダイト（１４，２ｇ；１３　ｍｍｏｌ ｅ）を得た。（ＮＭＲ”Ｐ　δ　１４４　ｐｐｍ：カップリング効率９７％）本 明細書に開示した他の過ヨウ素酸解裂橿への、１．２−ジオール結合の変換は、 宵機合成化学の技術分野で周知の一般的技術を用いて容易に行い得る。

Ｘｏの合成： 化合物Ｘ（２５ｇ、　６９　ｍｍｏｌｅ）をＣＨ３ＣＮ（２００ｍｌ）に懸濁さ せ、そして５０　ｍｌの２．２−ジメトキシプロパンを加えた。その後の数時間 の間に、無水のｐ−トルエンスルホン酸（０，１Ｍアセトニトリル溶液１０　ｎ ｉｌ＞を加えた。殆ど透明の溶液を得た。１８時間後、溶液を濾過し、そして１ ０ｍ１の８２０を加え、そして１０分間放置し、過剰な試薬および他の副生成物 を破壊した。ビ１７ジン（５０ｍｌ）を加え、そして反応混合物を減圧下で濃縮 し、２５　ｇのＸ°生成物を得た。精製せずに、この物質をＤＭＴに変換し、そ して以前にＸ（Ｂｚ２）の項で記載した様に、さらにＢＣＥホスホルアミダイト に変換した。

結果： 完全に保護されたＤＭＴ−Ｘ（Ｂｚ２）ＢＣＥアミダイトを、固相の支持体上の オリゴマー、５°−ｈｌｌ−Ｘ−Ｔｉｓ−３’中に組み込んだ。この断片を、ジ クロロ酢酸と水酸化アンモニウムを用いた脱保護を、先ず、２０°Ｃで１時間、 （コノ−り酸結合を解裂するために）、次に６０°ＣでＸ部分のベンゾイル基を 除去することで行った。オリゴマーの開裂はまったく観察されなかった。水中の テスト第１ノゴマー試料を水中の１００　ｍＭのＮａ１Ｏａで４°Ｃで１時間、 処理した。

次に過剰の試薬を、リボースで還元した。ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧ Ｅ）で開裂が完了したことが示され、より短０２つの断片、Ｘが０−（ＣＨ２） ２−ＣａＨａ−０−ＣＨ２−ＣＨＯである、５−Ｔｔａｘ−３°および５−Ｘ− Ｔｉｓ−３°を生じた。ＰＡＧＥの結果：３：　５−Ｔｉ１ｌ−Ｘ−Ｔｉ５−３ °、ＮＨａＯＨ２０℃／１時間４：　レーン３と同じ、ただしＮＨ４ＯＨ６０℃ ／１８時間５・　Ｎａ１Ｏａに１時間さらした後はレーン４と同じ６、　レーン ５と同じ 上記の結果から、本方法が、多様なソースに由来する特定のポリヌクレオチド配 列を検出するための、単純、迅速力）つ正確なアプローチを提供することが明か である。本方法（ま、イム／アッセイで使用されてきた検出可能な信号を含む異 なるタイプの標識を考慮した、高い感度と大きな融通性を提供する。従って、本 方法は、放射活性、分光光度計による光吸収、および、蛍光計あるいはンンチレ ーションカウンターによる発光を、検出し得るイムノアッセイ用の従来の装置中 での使用に容易に適応し得る。本方法は、任意のＤＮＡ配列に適用し得、そして 比較的小型のプローブが使用でき偽陽性の減少、および好ましくないヘテロ対合 の最小化をもたらす。測定のために支持体から標識を解裂することで、支持体か ら離れて測定し得るため、バックグラウンド値を大きく減少し得る。

さらに、ポリヌクレオチド鎖からの標識の分離の必要に基因する、バンクグラウ ンドさらなる変更（ｒｅｄｉｒｅｃｔ　１ｏｎ）がある。

従って本方法は、病気の診断、ハイブリッドＤＮＡの操作のモニタリング、遺伝 的特性の確認、等のため、正確で経済的なりＮＡ配列確認の方法を提供し得る。

以上の様に本発明を、明確な理解を得るために、説明および実施例により、部分 的に詳細に記載したが、何らかの変更および改変は、添付の請求項の範囲内で実 施し得ることは明かである。

ＦＩＧ、　２Ｂ　−ＩＡ ＦＩＧ、２Ｂ−ＩＢ ＦＩＧ、２Ｂ−２Ａ ＦＩＧ、　２Ｂ−２Ｂ ＦＩＧ、　２Ｃ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．核酸試料中に存在する核酸被分析物中の対象オリゴヌクレオチド配列の存在 を検出する方法であって：ハイブリダイズ条件下で、該核酸試料とポリヌクレオ チド試薬とを結合する工程、 ここで、該ハイブリダイズ条件では、該試料または該試薬の成分の何れか一つが 支持体と結合され、そして該被分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリダ イゼーションが、Ｒ１およびＲ２が独立して、アルキレン、アルケニレン、シク ロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリ ールアルキレン（ａｒａｌｋｙｌｅｎｅ）、およびこれらの組合せからなる群か ら選択され、そしてｘが過ヨウ素酸で開裂し得る結合である選択可能な開裂部位 −Ｒ１−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２−を介して、該支持体と結合した標識を生じさせる； 該選択可能な開裂部位を介さずに該支持体に結合した標識を該支持体から実質的 に除去する工程；過ヨウ素酸試薬で該開裂部位を切断する工程；および該支持体 から遊離した標識を検出する工程；を含む方法。
2. ２．前記ポリヌクレオチド試薬が、支持体と結合した第一ポリヌクレオチド捕捉 プローブおよび第二ポリヌクレオチド標識プローブを含有する、 ここで、該第一および第二プローブは、前記ハイブリダイズ条件下で前記被分析 物中に存在する配列と二本鎖を形成する様に、該配列に相補的なオリゴヌクレオ チド配列を有し、該第一および第二オリゴヌクレオチド配列の内の少なくとも一 つが対象配列である、 ここで、前記捕捉プローブが前記選択可能な開裂部位を含む、 請求項１に記載の方法。
3. ３．核酸試料中に存在する核酸被分析物中の対象オリゴヌクレオチド配列の存在 を検出する方法であって：水性溶媒中のハイブリダイズ条件下で、該核酸試料と ポリヌクレオチド試薬とを結合する工程、 ここで、該ハイブリダイズ条件では、該試料または該試薬の成分の何れか一つが 支持体と結合され、そして、該被分析物と該ポリヌクレオチド試薬とのハイブリ ダイゼーションが、Ｒ１およびＲ２が独立して、アルキレン、アルケニレン、シ クロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、ア リールアルキレン、およびこれらの組合せからなる群から選択され、そして、Ｘ が過ヨウ素酸開裂し得る結合である選択可能な開裂部位−Ｒ１−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ ２−を介して、該支持体と結合した標識を生じさせる；該液媒から、ポリヌクレ オチド試薬が結合した該支持体および核酸被分析物を分離する工程； 前記液媒と異なるハイブリダイゼーションストリンジェンシーの溶媒で該支持体 を洗浄し、該選択可能な開裂部位を介さずに該支持体に結合した標識を除去する 工程；過ヨウ素酸試薬で該開裂部位を切断する工程；および該支持体から遊離し た標識を検出する工程；を含む方法。
4. ４．前記ポリヌクレオチド試薬が、支持体と結合した第一ポリヌクレオチド捕捉 プローブおよび第二ポリヌクレオチド標識プローブを含有する、 ここで、該第一および第二プローブは、前記ハイブリダイズ条件下で前記被分析 物中に存在する配列と二本鎖を形成する様に、該配列に相補的なオリゴヌクレオ チド配列を有し、該第一および第二オリゴヌクレオチド配列の内の少なくとも一 つが対象配列である、 ここで、前記捕捉プローブが前記選択可能な開裂部位を含む、 請求項３に記載の方法。
5. ５．前記Ｘが、Ｒが水素あるいはアルキルである、▲数式、化学式、表等があり ます▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります ▼，▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります ▼からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
6. ６．前記Ｘが、Ｂが水素あるいはアルキルである、▲数式、化学式、表等があり ます▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります ▼，▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります ▼からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
7. ７．一方の末端近傍で支持体と結合し、そして反対の末端に対象の配列に相補的 な配列を有するポリヌクレオチド配列を含む、核酸試料中に存在する核酸被分析 物中の対象オリゴヌクレオチド配列の存在の検出に有用なプローブであって、さ らに、Ｒ１およびＲ２が独立して、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレ ン、シクロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキ レン、およびこれらの組合せからなる群から選択され、そして、Ｘが、過ヨウ素 酸開裂し得る結合である、選択可能な開裂部位−Ｒ１−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２−を含 む、プローブ。
8. ８．次式の構造： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ＤＮＡ１はＤＮＡの第一鎖であり、ＤＮＡ２は、ＤＮＡの第二鎖であり 、Ｒ１およびＲ２は独立して、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、 シクロアルケニレン、シクロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキレン 、およびこれらの組合せからなる群から選択され、そして、Ｘは過ヨウ素酸開裂 し得る結合である、 を有するポリヌクレオチド試薬。
9. ９．前記Ｘが、Ｒが水素あるいはアルキルである、▲数式、化学式、表等があり ます▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります ▼，▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります ▼からなる群から選択される、請求項８に記載のポリヌクレオチド試薬。
10. １０．前記−Ｒ１−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２−が、▲数式、化学式、表等があります▼ である、請求項８に記載のポリヌクレオチド試薬。
11. １１．次式の構造： Ｙ１−Ｏ−Ｒ１−Ｏ−Ｘ−Ｏ−Ｒ２−Ｏ−Ｙ２ここで、Ｒ１およびＲ２は独立し て、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シク ロオキシアルキレン、アリール、アリールアルキレン、およびこれらの組合せか らなる群から選択され、Ｘは、過ヨウ素酸開裂し得る結合であり、Ｙ１は、酸に 感受性で、塩基に安定な保護基であり、そしてＹ２は、水素、ホスホルアミダイ ト、ホスホトリエステル、ホスホジエステル、ホスファイト、Ｈ−ホスホネート およびホスホロチオエートからなる群から選択される、で表されるポリヌクレオ チド合成に有用なポリヌクレオチド試薬。
12. １２．構造式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ＤＭＴは、ジメトキシトリチルを、そして、ｉＰｒは、イソプロピルを 表わす、 を有する請求項１１に記載の試薬。