JP3143064B2

JP3143064B2 - シアン化物を含まない試薬、ヘモグロビンの定量方法および白血球の区分方法

Info

Publication number: JP3143064B2
Application number: JP08156784A
Authority: JP
Inventors: アイレスゴミルタ; ジェイヤングキャロル
Original assignee: クールターインターナショナルシーオーアールピー
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1996-06-18
Publication date: 2001-03-07
Anticipated expiration: 2016-06-18
Also published as: JPH09281111A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液中の総ヘモグ
ロビンを定量するために有効な試薬（この試薬はシアン
化物およびフェリシアン化物を含まない）および方法に
関する。更に、この試薬および方法は、適当な電気的な
手段による単一な全血中の総白血球数（total white bl
ood cell count）および白血球の少なくとも２個の母集
団の区別を可能にする。

【０００２】

【従来技術】血液試料中の白血球およびヘモグロビンの
測定は、白血病および貧血などの病気の臨床診断法にと
って極めて重要である。この発明を理解したり、説明す
るための目的として、次の言葉が定義される。

【０００３】１．ヘモグロビンは、赤血球細胞（red bl
ood cells ）に含まれ、血液中で酸素運搬体として働
く。ヘモグロビンは、色素タンパク質であり、４個のヘ
ムグループ、即ち２個のαグロビン鎖よび２個のβグロ
ビン鎖からなる。

【０００４】２．ヘムグループ：酸素を結合させる容量
は、ヘムグループの存在に依存している。また、ヘムグ
ループはヘモグロビンにその特有な色を与える。ヘム
は、プロトポルフィンと呼ばれる有機部分および鉄原子
から成る。ヘム中の鉄原子は、プロトポルフィン環の中
心部にある４個の窒素原子に結合している。鉄原子は、
第１鉄状態（２＋）または第２鉄（３＋）酸化状態であ
ることができる。

【０００５】３．ヘミグロビン（記号Ｈｉ）は、鉄原子
が第２鉄状態に酸化されているヘモグロビンである。別
な言葉では、メトヘモグロビンおよびフェリヘモグロビ
ンである。

【０００６】４．ヘミグロビンシアニドは、鉄原子が第
２鉄状態に酸化され、かつシアニドイオンと錯体化され
ているヘモグロビンである。別な言葉では、シアンメト
ヘモグロビン、シアンフェリヘモグロビンおよびメトヘ
モグロビンシアニドである。

【０００７】５．ヘモグロビン型は、すべてのヘモグ
ロビン誘導体が通常循環血液中に存在している。これら
のヘモグロビン誘導体としては、デオキシヘモグロビン
（Ｈｂ）、オキシヘモグロビン（ＨｂＯ₂）、ヘモグロ
ビンＳ、ヘモグロビンＡ₂、カルボキシヘモグロビン
（ＨｂＣＯ）、ヘミグロビン（Ｈｉ）を含む。

【０００８】６．ＮＣＣＬＳ（National Committee for
Clinical Laboratory Standards）は、血液中のヘモグ
ロビンの定量手順に言及している（Ｈ１５−ＡＶｏ
ｌ．４Ｎｏ．３）。標準的な手順は、全臨床研究所職員
に対して向けられ、かつヘミグロビンシアニド方法によ
ってヘモグロビン濃度を測定するための器械製品、試薬
および物質に対して向けられている。

【０００９】７．ヘモグロビン測定：全ヘモグロビン濃
度は、血液の物理的特性、例えば特定の重力および特定
の屈折能、ヘモグロビン分子の化学的組成、ヘモグロビ
ンの酸素結合能力、一酸化炭素結合能力、硫黄結合能力
など、およびヘモグロビン誘導体のスペクトル特性など
によって決定することができる。

【００１０】８．ヘモグロビン安定剤としては、化学的
化合物がヘモグロビン測定中に形成されるヘモグロビン
誘導体または色原体の安定した物理的−化学的特性（化
学的構造、光学濃度など）を維持させるために使用され
ている。

【００１１】通常、自動血液分析器が血液試料中の白血
球数を計測したり、白血球を区別させるために使用され
ている。等張の希釈剤を用いて全血液試料を希釈し、次
に白血球を含む試料となるように溶血剤を添加すること
によって試料中の赤血球を溶解して、自動血液分析器を
用いた白血球数の計測を始める。

【００１２】次に、得られた試料を自動血液分析器の検
知部分にある小さい流路または微細なオリフィスを通じ
て通過させる。個々の白血球を通過に応答して発生する
信号を検知することによって、白血球数を計測し、かつ
区別する。

【００１３】等張の希釈剤は、米国特許明細書第３，９
６２，１２５号、４，３４６，０１８号および４，５２
１，５１８号に更に詳述されている。溶血剤は、米国特
許明細書第３，８７４，８５２号、４，５２８，２７４
号、３，８７４，８５２号、４，３４６，０１８号、お
よび４，４８５，１７５号に更に詳述されている。

【００１４】例えば、米国特許明細書第４，３４６，０
１８号には、白血球を区別しうる２個の体積値のための
溶解試薬系を用いた等張の多目的血液希釈剤およびこの
希釈剤の使用方法を開示している。

【００１５】米国特許明細書第４，４８５，１７５号に
は、溶解剤として第四アンモニウム塩およびCouler Cou
nter Model S-Plus （クールター株式会社製の登録商
標、マイアミ、フロリダ州）自動化された血液計数器を
用いて、リンパ球の３個に区別しうる体積値、白血球の
単核性および顆粒球の母集団を測定する方法および試薬
系を開示している。

【００１６】また、米国特許明細書第４，４８５，１７
５号には、ヘモグロビン定量のための適当な色原体を形
成し、シアン化カリウムなどのシアン化アルカリ金属を
供給することができることが開示されている。

【００１７】ヘモグロビン濃度の測定はシアンメトヘモ
グロビン方法によって行われている。この方法を用いる
と、非イオン性界面活性剤を含む赤血球の溶血剤を血液
試料に加えて、赤血球細胞膜によって生ずる濁りを減少
させることができる。

【００１８】放出したヘモグロビンは、フェリシアン酸
カリウムなどの酸化剤の作用によって酸化され、メトヘ
モグロビンを生ずる。次いで、メトヘモグロビンに対す
るシアン化物イオン結合は、シアンメトヘモグロビン
（HiCN）を形成し、これが適切なヘモグロビン測定試料
となる。

【００１９】シアンメトヘモグロビン試料の吸光度は、
所定の波長で測定される。この方法は、ヘモグロビン濃
度を測定するための標準的な方法として世界的に受け入
れられている。

【００２０】シアンメトヘモグロビン方法によって形成
された化合物は、一旦形成されると非常に安定な物質で
あるけれども、酸化試薬を用いたヘモグロビンの酸化
は、ドラブキンズ（Drabkins）試薬を用いて酸化を完了
させるのに比べて約１０分長くかかる。更に、赤血球の
溶解、ヘモグロビンの放出、および赤血球膜および血小
板膜の溶解は、自動手段に要求される場合よりも遅い。

【００２１】自動血液分析手段の時間的要求に応じて、
従来技術の方法は、溶血試薬を用いいるが、この試薬は
シアン化物イオンを含み、このシアン化物イオンは、安
定したヘモクロゲンを形成し、かつシアノメトヘモグロ
ビンに類似した吸収スペクトルを有する。

【００２２】また、溶血試薬は、細胞溶解、ヘモグロビ
ン溶解および細胞膜溶解に必要な時間を減少させる。更
に、水溶液を例えば次亜塩素酸ナトリウムを用いたり、
非常に骨の折れる作業が掛かる特有な方法で解毒し、か
つ処理しまければならない。

【００２３】このような理由から、また、オキシヘモグ
ロビン方法として知られた別法が用いられている。この
オキシヘモグロビン方法おいては、赤血球を非イオン性
界面活性剤を用いて溶血させているが、この非イオン性
界面活性剤は赤血球を溶解し、そしてヘモグロビンを放
出させるために用いられている。このヘモグロビンは、
オキシヘモグロビン（HbO ₂）として放出され、かつ測
定される。

【００２４】オキシヘモグロビンの吸光度は、所定の波
長で測定される。シアン化物がオキシヘモグロビン方法
で用いられない理由は、試薬を扱う危険性がなく、しか
も水溶液を処理する厄介な操作を行う必要がないからで
ある。

【００２５】しかしながら、この従来のオキシヘモグロ
ビン方法は、溶解試薬が赤血球を溶解するばかりでな
く、白血球のサイズを非常に小さいサイズに縮小すると
いう欠点を有する。このことは、白血球による光の分散
を最小にするので、吸光度測定器を目的とするためには
有利であるが、その一方で溶解試薬を用いた白血球の２
個の母集団より多くを測定することが非常に困難にな
る。

【００２６】この問題を解決するために、オキシヘモグ
ロビン方法を用いた自動血液分析器は、一方がヘモグロ
ビン測定で、他方が白血球測定である２個の検知部分を
とうして試料を通過させることによってヘモグロビンお
よび白血球の試料を分離して調製する。

【００２７】しかしながら、この方法は、２個の分離し
た検知部分が必要になるばかりでなく、２個の流動管が
測定するために試料を調製することが要求されるという
理由から、高価でしかも複雑な装置が要求されるという
欠点がある。

【００２８】更に、このオキシヘモグロビン方法では、
メトヘモグロビンがすぐにオキシヘモグロビンに転換し
ないので、高いメトヘモグロビン含有量を有する血液試
料を正確に測定することができない。メトヘモグロビン
含有量は、標準血液を用いる場合に特に重要である。標
準血液は、自動血液分析器の分析精度を管理するために
用いる。この標準血液は、通常、冷却状態に貯蔵され、
長期間安定したヘモグロビン濃度を示す。

【００２９】しかしながら、周囲温度より高い温度で貯
蔵すると、血液中のヘモグロビンが徐々にメトヘモグロ
ビンに転換される。それゆえ、２２℃より高い温度で貯
蔵した標準血液をオキシヘモグロビン方法によって測定
した場合には、メトヘモグロビンに転換されるヘモグロ
ビンの部分は、ヘモグロビンの測定値は７日間を超える
と最初の測定値よりも徐々に低下するので、測定するこ
とができなくなる。

【００３０】この問題に対する対策としては、中性緩衝
液（ｐＨ７．２）中に、ドデシル硫酸塩ナトリウムまた
は等量のラウリル硫酸塩ナトリウム（ＳＬＳ）、陰イオ
ン性界面活性剤、およびトリトンＸ−１００、非イオン
性界面活性剤を含有するヘモグロビン測定用試薬を用い
ている。このことは、臨床生化学（Clinical Biochemis
try ）Ｖｏｌ．１５，８３（１９８２）にOshiroらによ
って報告されている。

【００３１】この方法においては、赤血球はＳＬＳおよ
びトリトンＸ−１００の作用によって溶血される。そし
て、溶出したヘモグロビンは、ＳＬＳヘモグロビンに転
換される。結果的に、血液中のヘモグロビン濃度は、メ
トヘモグロビンによって影響されることなく測定するこ
とができ、シアン化物が存在するための無駄な溶液の処
理を行う特殊な工程が不必要である。

【００３２】しかしながら、この方法では、同様に処理
された血液試料から白血球の区別およびヘモグロビン濃
度を測定することは不可能である。溶出されたヘモグロ
ビンをＳＬＳヘモグロビンに転換させることに要求され
るＳＬＳの濃度において、白血球が溶解され、同時測定
とヘモグロビン測定とが阻害される。

【００３３】これらの問題を解決するための他の対策と
しては、米国特許明細書第５，２５０，４３７号および
５，２４２，８３２号によって報告されている。これら
の公報には、ヘモグロビン濃度を測定することが報告さ
れている。この公報には、適切な溶血剤を用いて、赤血
球中のヘモグロビンを溶解させる第４アンモニウム塩が
主として作用することによって赤血球を選択的に溶血さ
せることを報告している。溶出されたヘモグロビンは変
性され、言い換えれば、ほとんど同時に立体構造に変形
され、そしてヘモグロビン中のヘムフェラム（Hemeferr
um）が、試薬中に溶解された酸素によって酸化され、二
価鉄から三価鉄に変換してメトヘモグロビンとなる。

【００３４】米国特許明細書第５，２５０，４３７号に
おいては、適量の陽イオン界面活性剤、非イオン性界面
活性剤および両性界面活性剤を溶血剤に加えてヘモグロ
ビンの変性の程度を調製して安定なヘモグロビンを得て
いる。メトヘモグロビンを安定化する機構は明らかにさ
れていないが、ヘモグロビンに対する異なる分子構造を
有する複数の界面活性剤の作用は、おそらく変性の程度
を維持し、または所定水準にメトヘモグロビンの立体構
造を変化させると仮定される。

【００３５】米国特許明細書第５，２４２，８３２号で
は、ヘモグロビン安定剤を添加することによって米国特
許明細書第５，２５０，４３７号に記載した試薬を改良
している。ヘモグロビン安定剤の作用機構は明らかでは
ないが、ヘモグロビン安定剤の分子構造中の窒素原子の
孤立電子対またはフェノール性ヒドロキシ基中の酸素原
子の孤立電子対は、メトヘモグロビンを安定化するメト
ヘモグロビン中のヘムフェラムとキレート化できると仮
定される。

【００３６】更に、別の対策としては、米国特許明細書
第４，８５３，３３８号に開示されている。この公報
は、陰イオン性界面活性剤を使用することを示唆してい
るが、この界面活性剤は、ｐＨが少なくとも１１．３を
有し、総ヘモグロビン量を決定することができる。陰イ
オン界面活性剤は塩基として働くことができるし、また
はその代わりに、界面活性剤の強塩基を組成中に含める
ことができ、アルカリヘマチン反応に対して要求される
ｐＨを与えることができる。

【００３７】要求されるｐＨを与えることのできる適切
な界面活性剤としては、長鎖アルキルトリメチルアンモ
ニウム水酸化物を含む。要求されるｐＨを与えるため
に、別個の適切な成分を組み合わせた適当な界面活性剤
としては、両性イオン界面活性剤および陽イオン性第４
アンモニウムハロゲン化物を含めることができる。更
に、この公報は、アルキル硫酸塩のアルキルメタルなど
の陰イオン性界面活性剤を使用できることを示唆してい
る。しかしながら、アルカリヘマチンのｐＨのため、こ
の方法は望ましくない。

【００３８】また、他の対策としては、米国特許明細書
第４，６５６，１３９号および４，６１７，２７５号に
開示されている。これらの公報には、オキシヘモグロビ
ン方法が開示されているが、この公報中でヘモグロビン
はメトヘモグロビンに変化することを妨げることが記載
されている。ヘモグロビンをメトヘモグロビンに変化す
るのを妨げるために、ホウ酸緩衝液溶液に防腐剤として
（２−ピリドイルチオ−１−オキシド）ナトリウムを添
加したものを用いた。更に、試薬系にキレート試薬とし
てＥＤＴＡ−２Ｋを用いた。この試薬系はｐＨ６〜８、
および浸透圧２４０〜３１０ｍＯｓｍ／Ｋｇを有する。

【００３９】更に、他の対策としては、米国特許明細書
第３，８７４，８５２号に開示されている。この公報
は、試薬を用いて血液中の白血球およびヘモグロビンを
測定することが開示されているが、この試薬には、赤血
球および血小板細胞を溶解するのに十分な量であると共
に、測定するためにヘモグロビンを色原体に変換するの
に十分な量であって、第４アンモニウムイオンおよびシ
アン化物イオンを含むフェリシアン化物イオンを含まな
い水溶液を含んでいる。

【００４０】別の対策としては、米国特許明細書第４，
１８５，９６４号に開示されている。この公報には、白
血球を急速に破壊する血液分析器に使用するための溶解
剤が開示されている。この試薬は、ヘモグロビンと反応
または錯体化して、十分な安定性を有する色原体を形成
し、ヘモグロビンの分光光度測定を可能とする。

【００４１】また、別の対策が、米国特許明細書第４，
８００，１６７号に開示されている。この公報には、約
８より大きいｐＨで約１０，０００〜約３６０，０００
の分子量のポリビニルピロリドンの水溶液を含有する全
血のヘモグロビン含有量を測定するための試薬系が開示
され、この試薬系は、全血に存在するヘモグロビンを変
性して、約５７５ｎｍの波長で測定される安定した産物
を形成する。

【００４２】

【発明が解決しようとする課題】上記で論議した従来技
術の教示にもかかわらず、１または２個以上の次の特性
を有するヘモグロビンを測定するために有用な他の試薬
を開発する必要性がのこされている。即ち、毒性がな
く、ヘモグロビン安定性にあまり影響を与えない等張の
希釈液を用いた場合に安定した色原体を生産し、かつ白
血球数および白血球の区別などの他の血液測定値に応用
されるべきである。

【００４３】

【課題を解決するための手段】本発明は、シアン化物イ
オンまたはフェリシアン化物を含まない試薬組成物およ
び血液試料中のヘモグロビン濃度の測定方法に関する。
この試薬組成物は、赤血球を適切に溶解させ、かつヘモ
グロビンを放出させるのに効果的な量中で、第４アンモ
ニウム塩、ピリジニウム塩およびこれらの組み合わせか
ら成る群から選ばれた少なくとも１種を含む溶解剤、お
よび放出したヘモグロビンをヘモクロゲンに転化させる
のに効果的な量中に酸化防止剤を含む。

【００４４】一般的に、この試薬組成物は、溶解剤およ
び酸化防止剤を混合した場合に約６〜約７．５のｐＨを
有する。この試薬組成物は、５〜１１．５のｐＨ、好ま
しくは９〜１１のｐＨ、最も好ましくは９．５〜１０．
５のｐＨの範囲で適切に赤血球を溶解させ、かつヘモグ
ロビンを放出させるのに効果的である。５〜１１．５の
範囲のｐＨを得るために、ｐＨ調製剤をこの試薬組成物
に加えることができる。

【００４５】また、本発明は、血液試料と試薬組成物
（シアン化物イオンまたはフェリシアン化物を含まない
試薬組成物であって、この試薬組成物が、（１）赤血球
を適切に溶解させ、かつヘモグロビンを放出させるのに
効果的な量中で、第４アンモニウム塩、ピリジニウム塩
およびこれらの組み合わせから成る群から選ばれた少な
くとも１種の溶解剤、および（２）放出したヘモグロビ
ンをヘモクロゲンに転化させて反応生成物を形成させる
のに効果的な量中に酸化防止剤を含む）とを反応させる
工程、および前記血液試料中のヘモクロゲン濃度を定量
するために前記反応生成物の吸光度を測定する工程を含
むことを特徴とするヘモクロゲン濃度の測定方法に関す
る。

【００４６】一般的に、この試薬組成物は、溶解剤およ
び酸化防止剤を混合した場合に約６〜約７．５のｐＨを
有する。この試薬組成物は、５〜１１．５のｐＨ、好ま
しくは９〜１１のｐＨ、最も好ましくは９．５〜１０．
５の範囲のｐＨで適切に赤血球を溶解させ、かつヘモグ
ロビンを放出させるのに効果的である。５〜１１．５の
範囲のｐＨを得るために、ｐＨ調製剤をこの試薬組成物
に加えることができる。

【００４７】更に、本発明は、同じ血液試料および同じ
試薬反応生成物からヘモグロビン濃度の定量および白血
球の区別を可能にする試薬組成物および方法に関する。
この試薬組成物は、赤血球を適切に溶解させ、かつヘモ
グロビンを放出させるのに効果的な量中で、第４アンモ
ニウム塩、ピリジニウム塩およびこれらの組み合わせか
ら成る群から選ばれた少なくとも１種を含む溶解剤、お
よび放出したヘモグロビンをヘモクロゲンに転化させて
反応生成物を形成させるのに効果的な量中で酸化防止剤
を含む。一般的に、この試薬組成物は、溶解剤および酸
化防止剤を混合した場合に約６〜約７．５の範囲のｐＨ
を有する。この試薬組成物は、５〜１１．５のｐＨ、好
ましくは９〜１１のｐＨ、最も好ましくは９．５〜１
０．５の範囲のｐＨで適切に赤血球を溶解させ、かつヘ
モグロビンを放出させるのに効果的である。５〜１１．
５の範囲のｐＨを得るために、ｐＨ調製剤をこの試薬組
成物に加えることができる。

【００４８】血液中のヘモグロビン濃度を測定すると共
に、少なくとも２個の白血球の母集団を区別する方法に
おいて、その改良点は、血液試料と本発明の試薬組成物
とを反応させて得られる反応生成物色原体の吸光度を測
定し、かつ前記反応生成物から少なくとも２個の異なる
白血球母集団を区別することを含む。

【００４９】図１は、フロリダ州、マイアミにあるクー
ルター株式会社によって製造されたクールターカウン
ターモデルエス−プラス IV ジフ計量器（以
下、COULTER COUNTER Model S-Plus IV diff instrumen
t という）を用いて、正常な全血の異なる試料中のヘモ
グロビン濃度の測定値の相関図を示す。ｘ軸には、商
品：LYSE S（登録商標）III diff溶解剤（フロリダ州、
マイアミにあるクールター株式会社の登録商標）を用い
たが、この溶解剤はクールター株式会社によって製造さ
れた。ｙ軸には、LYSE S 4として図中に示される実施例
１の試薬を用いた。

【００５０】図２は、COULTER COUNTER Model S-Plus I
V diff instrument を用いて、不正常な全血の異なる試
料中のヘモグロビン濃度の測定値の相関図を示す。ｘ軸
には、商品：LYSE S III diff溶解剤を用い、ｙ軸に
は、LYSE S 4として図中に示される実施例１の試薬を用
いた。

【００５１】図３は、実施例２の方法およびCOULTER CO
UNTER Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正
常な全血の試料中の白血球〔white blood cells （ＷＢ
Ｃ）〕の測定値の相関図を示す。ｘ軸には、商品：LYSE
S III diff溶解剤を用い、ｙ軸には、LYSE S 4として
図中に示される実施例１の試薬を用いた。

【００５２】図４は、実施例２の方法およびCOULTER CO
UNTER Model S-Plus IV diff instrument を用いて、不
正常な全血の試料中の白血球（ＷＢＣ）の測定値の相関
図を示す。ｘ軸には、商品：LYSE S III diff溶解剤を
用い、ｙ軸には、LYSE S 4として図中に示される実施例
１の試薬を用いた。

【００５３】図５は、実施例２の方法およびCOULTER CO
UNTER Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正
常な全血の試料中の白血球のリンパ球母集団の測定値の
相関図を示す。ｘ軸には、商品：LYSE S III diff溶解
剤を用い、ｙ軸には、LYSE S4として図中に示される実
施例１の試薬を用いた。

【００５４】図６は、実施例２の方法およびCOULTER CO
UNTER Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正
常な全血の試料中の白血球の単核球の母集団を測定した
相関図を示す。ｘ軸には、商品：LYSE S III diff溶解
剤を用い、ｙ軸には、LYSE S4として図中に示される実
施例１の試薬を用いた。

【００５５】図７は、実施例２の方法およびCOULTER CO
UNTER Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正
常な全血の試料中の白血球の顆粒球の母集団の測定値の
相関図を示す。ｘ軸には、商品：LYSE S III diff溶解
剤を用いたが、この試薬はクールター株式会社によって
製造され、ｙ軸には、LYSE S 4として図中に示される実
施例１の試薬を用いた。

【００５６】本発明は、試薬組成物がシアン化物イオン
またはフェリシアン化物イオンを含まない血液中のヘモ
グロビン濃度を定量するための新規な試薬組成物および
その方法を提供する。好ましくは、この試薬組成物およ
び方法は、血液試料および試薬組成物反応生成物を用い
ることによってヘモグロビンの測定および少なくとも２
個の母集団の白血球の区別を可能とする。

【００５７】この試薬組成物は、赤血球溶解剤および酸
化防止剤を含み、かつシアン化物イオンなどの有毒な物
質を含まない。上記した測定が行われる流体試料は、血
液分析学の特有の機能を検量し、確認するために用いら
れる全血、準備された血液検体（calibraitor ）および
血液コントロールを含む。血液検体およびコントロール
は、ヒトまたは動物から得ることができる。

【００５８】溶解剤は、第４アンモニウム塩、ピリジウ
ム塩およびこれらの組み合わせから成る群から選ばれた
少なくとも１種を含む。第４アンモニウム塩が次式：

【化１】（式中、Ｒ₁はＣ₈〜Ｃ₂₀のアルキル基、アルケニル基
またはアルケニル族を示し、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は、
Ｃ₁〜Ｃ₈のアルキル基、アルケニル基またはアルケニ
ル族を示し、およびＸ^-はＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＰＯ₄およ
びＣＨ₃ＳＯ₄などのイオン基を形成する塩を示す。好
ましくは、Ｒ₁は少なくともＣ₁₂のアルキル基を示し、
Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄はＣ₁〜Ｃ₆のアルキル基を示
す）で表される。ピリジウム塩は次式：

【化２】（式中、ｎは７〜１９の整数を示し、Ｘ^-は陰イオン基
を示す）で表される。

【００５９】好ましい溶解剤としては、少なくとも２個
の異なる第４アンモニウム化合物の組み合わせを用い
る。特に、好ましい溶解剤としては、少なくとも１個の
第４アンモニウム化合物（式中、Ｒ₁はＣ₁₂を有するア
ルキル基を示す）および少なくとも１種の第４アンモニ
ウム塩（Ｒ₁はＣ₁₄〜Ｃ₁₆を有するアルキル基、または
これらの混合物）の混合物から成ることができる。最も
好ましくは、溶解剤はドデシルトリメチルアンモニウム
塩化物およびテトラデシルトリメチルアンモニウム臭化
物を含む。他の第４アンモニウム塩としては、ヘキサデ
シルトリメチルアンモニウム臭化物またはヘキサデシル
ジメチルエチルアンモニウム臭化物とドデシルトリメチ
ルアンモニウム塩化物とを含むことで効果的な結果が得
られる。

【００６０】試薬組成物は、赤血球から適切にヘモグロ
ビンを放出させるのに効果的な量中に溶解剤を含む。好
ましくは、試薬組成物は５〜８０ｇ／ｌの範囲で溶解剤
を含む。更に、好ましくは、この範囲は１５〜３５ｇ／
ｌである。

【００６１】ヘモグロビンは、溶解剤によって赤血球か
ら放出される。そして、この放出したヘモグロビンは、
酸化防止剤と反応させる。酸化防止剤は、放出したヘモ
グロビンをヘモクロモゲンに転化させる。用いられる酸
化防止剤の量は、放出したヘモグロビンをヘモクロモゲ
ンに転化させるのに効果的な量である。酸化防止剤の使
用量が不十分な場合には、ヘモグロビンをヘモクロモゲ
ンへの転化は、COULTER COUNTER Model S-Plus IV di
ff instrument に商品：LYSE S III diff 溶解剤を用
いて対照にしたとき、正確なヘモグロビン濃度を定量す
るのに適切でない。好ましくは、酸化防止剤は、０．１
〜１０ｇ／ｌの範囲、より好ましくは１〜３ｇ／ｌの範
囲である。これらの範囲は、血液試料量に対する酸化防
止剤量の比率が血液試料に添加された希釈剤の量および
血液試料に添加された溶解剤の量に依存しているので、
変化させることができる。

【００６２】酸化防止剤は、還元剤、例えばアスコルビ
ン酸、亜燐酸、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリ
ウム、重硫化ナトリウム、チオ硫酸ナトチウム、硫黄酸
化数＋２〜＋４までの還元特性を有する硫黄のオキシ酸
の他のアルカリ金属塩およびこれらの組み合わせを含
む。好ましくは、酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウム、メ
タ重亜硫酸ナトリウム、重硫化ナトリウムおよびこれら
の組み合わせを含む。最も好ましくは、酸化防止剤は亜
硫酸ナトリウムを含む。

【００６３】一般的に、試薬組成物は溶解剤および酸化
防止剤と組み合わせた場合には、約６〜７．５のｐＨを
有する。試薬組成物のｐＨは、約５〜１１．５の範囲、
好ましくは９〜１１の範囲、最も好ましくは９．５〜１
０．５の範囲である。試薬組成物にこの範囲のｐＨ値を
得るために、ｐＨ調製剤を添加すべきである。

【００６４】ｐＨ調製剤の実例としては、要求されるｐ
Ｈを適切に与えるために、塩酸などの強酸およびアルキ
ル金属水酸化物などの強塩基を含む。適切なアルキル金
属水酸化物の実例としては、水酸化ナトリウムおよび水
酸化カリウムを含む。あまり好ましくない実例として
は、例えば水酸化テトラブチルアンモニウムなどのアル
キル基としてＣ₁〜Ｃ₄炭素原子を有することができる
ような水酸化テトラアルキルアンモニウムを含む。

【００６５】ｐＨが５未満で測定すると、商品：LYSE S
III diff 溶解剤を用いて対照にしたとき、正確なヘ
モグロビン濃度値を得るのに重大な問題を生ずる。ｐＨ
が９未満になると、試薬組成物の安定性が低下する。

【００６６】試薬組成物は、その試薬組成物を使用しよ
うとする目的に適合させるために他の特性を有するべき
である。そのような特性としては、約２２０〜約３７０
ミリオスモルの重量オスモル濃度および約３〜約１１シ
ーメンス（Siemens ）の導電性が含まれる。

【００６７】溶解剤および酸化防止剤を混合して、７０
℃で７日間保存した水溶液を用いた場合には、測定した
ヘモグロビン濃度は、溶解剤および酸化防止剤の水溶液
の新鮮な混合物を用いて得られる測定値と異なることが
明らかにされた。溶解剤および酸化防止剤の水溶液の新
鮮な混合物を用いるヘモグロビン濃度の測定は、LYSES
III diff 溶解剤を用いて得られる測定値に匹敵す
る。特に、溶解剤および酸化防止剤を高い温度で保存し
た場合には、測定したヘモグロビン濃度値は、LYSE S
III diff 溶解剤を用いて対照とした場合に得られるヘ
モグロビン濃度値よりも著しく低い。この問題を解決す
るため、ヘモグロビンを測定する前に直ちに試薬を混合
する。

【００６８】好ましくは、試薬安定性を得るために酸化
防止剤を試薬組成物に添加する。酸化防止安定剤を効果
的な量中に加えて試薬組成物の安定性を得る。試薬組成
物の安定性は、長期間に亙たって保存した後に正確にヘ
モグロビン濃度の測定をすることができる試薬を含む。
特に、本発明の試薬組成物を少なくとも６週間保存し、
更に高い温度で保存した場合には、ヘモグロビン濃度の
測定値は、LYSE S IIIdiff 溶解剤が同一の保存条件で
受ける場合に得られる測定値と一致している。

【００６９】適切な酸化防止安定剤は、エチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ）誘導体、クエン酸、酒石酸、グル
コン酸、糖酸およびこれらの組み合わせである。好まし
くは、酸化防止安定剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウム、エチ
レングリコール−ビス−（３−アミノ−エチルエーテ
ル）Ｎ−Ｎ′−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、グルコン酸、
Ｎ−（２−アセトアミノ）−イミノジ酢酸（ＡＤＡ）お
よびこれらの組み合わせから選ばれる。最も好ましい安
定剤は、ＥＤＴＡである。好ましくは、試薬組成物は、
０．１〜１０ｇ／ｌの範囲、更に好ましくは１〜５ｇ／
ｌの範囲、最も好ましくは２〜４ｇ／ｌの範囲で酸化防
止安定剤を含む。

【００７０】酸化防止安定剤の有効性を検証するため
に、試薬組成物間で比較を行った。試薬１は、ＥＤＴＡ
二ナトリウムを添加しない実施例１の試薬である。試薬
２は、実施例１の試薬である。これらの試薬組成物は、
７０℃で７日間保存した。下記表１に、酸化防止安定剤
を含む試薬組成物が従来のLYSE S III diff 溶解剤と
比較したヘモグロビン測定値を示す。

【００７１】

【表１】

【００７２】ヘモグロビン濃度の測定方法は、血液試料
と本発明の試薬組成物と反応させて得られるクロモゲン
の検出を含む。ヘモグロビン濃度の測定方法は、血液試
料と試薬組成物（シアン化物イオンを含まない試薬組成
物であって、この試薬組成物が赤血球を適切に溶解さ
せ、かつヘモグロビンを放出させるのに効果的な量中
に、第４アンモニウム塩、ピリジニウム塩およびこれら
の組み合わせから成る群から選ばれた少なくとも１種を
含む溶解剤、放出したヘモグロビンをヘモクロモゲンに
転化させるのに効果的な量中に含まれる酸化防止剤、お
よび５〜１１．５の範囲のｐＨで反応生成物を形成させ
るアルカリ性溶液を含む）とを反応させる工程、および
前記血液試料中の前記ヘモグロビン濃度を定量するため
に前記反応生成物の吸光度を測定する工程を含む。

【００７３】反応生成物クロモゲンは、５００〜６００
ｎｍで測定される再現性がある吸収スペクトルを有す
る。

【００７４】図１は、COULTER COUNTER Model S-Plus I
V diff instrumentを用いて、正常な全血の３６個の異
なる試料中のヘモグロビン濃度の測定値の相関図を示
す。ｘ軸には、商品：LYSE S III diff溶解剤を用い、
ｙ軸には、LYSE S 4として図中に示される実施例１の試
薬を用いた。テストされた血液試料数は、３６個であっ
た。正常な血液試料は、既知の病気を全く有さないヒト
から採取された血液試料に限定した。

【００７５】相関係数：ｒ＝０．９９４０および回帰
線：ｙ＝１．０１１５ｘ−０．１６７１は、許容できる
相関と偏りを示している。

【００７６】図２は、COULTER COUNTER Model S-Plus I
V diff instrument を用いて、不正常な全血の８２個
の異なる試料中のヘモグロビン濃度の測定値の相関図を
示す。ｘ軸には、商品：LYSE S III diff溶解剤を用
い、ｙ軸には、LYSE S 4として図中に示される実施例１
の試薬を用いた。これらの不正常な全血試料は、貧血
病、白血病および不正常な血液細胞数などの１または２
以上の病気を有するヒトから得た。

【００７７】相関係数：ｒ＝０．９９９４および回帰
線：ｙ＝１．０２４９ｘ−０．２５６は、許容できる相
関と偏りを示している。

【００７８】

【実施例】

実施例１次の組成の試薬を室温より高い温度で構成成分を混合し
て調製した。分量（ｇ／ｌ）ドデシルトリメチルアンモニウム塩化物２８テトラデシルトリメチルアンモニウム臭化物４亜硫酸ナトリウム２ＥＤＴＡ二ナトリウム２．５プルロニック２５Ｒ８プリル１ｐＨ調製剤１０．０

【００７９】更に、本発明の試薬組成物は、同一の血液
試料および同一の試薬組成物反応生成物からヘモグロビ
ン濃度の定量および白血球の区別を可能にするという利
点を有する。好ましくは、少なくとも２個の母集団の白
血球をヘモグロビン測定によって区別することができ
る。これらの２個の母集団は、リンパ球および顆粒球を
含む。更に好ましくは、少なくとも３個の母集団の白血
球を区別することができる。これらの３個の母集団は、
リンパ球、単核球および顆粒球を含む。

【００８０】ヘモグロビン濃度および白血球区別の両者
を測定する場合には、ヘモグロビン濃度および白血球区
別の測定を同一の反応生成物から行うことができるの
で、白血球にあまり影響を与えないように赤血球を適切
に溶解することができる効果的な量中で溶解剤を調製し
た。第４アンモニウム化合物を用いた場合には、溶解剤
が５〜８０ｇ／ｌの範囲にあることがこの効果的な量で
ある。更に好ましくは、この範囲は１５〜３５ｇ／ｌで
ある。

【００８１】溶解剤は、白血球にあまり影響を与えない
で赤血球を溶解する。しかし、支質溶解（stromatolyze
d ）された赤血球の細胞破片のある程度の量が溶解され
た血液試料中に白血球と共に留まる。この細胞破片は、
白血球を区別する際に背景雑音（background noise）を
引き起こしたり、細胞塊（cell clogs）を生ずることが
ある。任意に、界面活性剤を効果的な量中で試薬組成物
に含めることができ、細胞性微粒子物またはたんぱく質
残差を溶解することによって干渉物を除去することがで
きる。この界面活性剤の濃度は、０．１〜２．５ｇ／ｌ
の範囲であり、好ましくは０．５〜１．５ｇ／ｌの範囲
である。適切な陰イオン性界面活性剤としては、プルロ
ニックＦ、プルロニックＬ、プルロニックＰ、プルロニ
ックＲ（プルロニック界面活性剤は、ＢＡＳＦ株式会社
によって製造されている。パルシパニイ，ニュウジャー
ニィ州）およびポリオキシエチル化されたアルキルフェ
ノールを挙げることができる。好ましい界面活性剤とし
ては、プルロニック２５Ｒ８プリルおよびプルロニック
Ｆ１２７が挙げられ、最も好ましくは、プルロニック２
５Ｒ８プリルである。

【００８２】ヘモグロビンの濃度および白血球の区別の
両者を測定する場合には、酸化防止剤の濃度は効果的な
量中に含むことができ、放出したヘモグロビンをヘモク
ロモゲンに転化する。酸化防止剤を過剰に用いた場合に
は、修復（recovered ）した白血球数が低下する。

【００８３】好ましくは、酸化防止剤は、０．１〜１０
ｇ／ｌの範囲であり、より好ましくは、１〜３ｇ／ｌの
範囲である。これらの範囲は、血液試料量に対する酸化
防止剤量の比率が血液試料に添加された希釈剤の量およ
び血液試料に添加された溶解剤の量に依存しているの
で、変化させることができる。

【００８４】ヘモグロビン濃度および白血球区別の両者
を測定する場合には、溶解剤および酸化防止剤を組み合
わせたときに、試薬組成物は約６〜約７．５のｐＨを有
する。試薬組成物は約５〜約１１．５の範囲にあるｐＨ
であることができ、好ましくは９〜１１の範囲、最も好
ましくは、９．５〜１０．５の範囲である。このｐＨ値
の範囲内で試薬組成物のためのｐＨ値を得るためには、
ｐＨ調製剤を添加すべきである。ｐＨが１１．５を超え
ると、商品：LYSE S III diff溶解剤を用いた場合に得
られる値に相当する値がヘモグロビン濃度で得られると
いう重大な問題が生ずる。

【００８５】ヘモグロビン濃度および白血球区別の両者
を測定するに際しては、効果的な量中で安定剤の濃度を
調製して、試薬組成物に安定性を付加する。特に、本発
明の試薬組成物は、少なくとも６週間保存し、かつ高い
保存温度で保存した場合には、白血球区別およびヘモグ
ロビン濃度の測定値は、LYSE SIII diff溶解剤が同一の
保存条件で受ける場合に得られた測定値に匹敵する。ヘ
モグロビン濃度の定量および白血球の区別の両者には、
同一の酸化防止安定剤を用いた。好ましくは、試薬組成
物は、０．１〜１０ｇ／ｌの範囲、より好ましくは１〜
５ｇ／ｌの範囲、最も好ましくは２〜４ｇ／ｌの範囲に
ある酸化防止安定剤を含む。

【００８６】血液試料中のヘモグロビン濃度の定量方法
および少なくとも２個の母集団を区別する方法において
は、本発明は、血液試料と本発明の試薬組成物とを反応
させて生ずる反応生成物クロモゲンの測定手段および前
記反応生成物から少なくとも２個の異なる白血球の母集
団を区別する手段を含む。

【００８７】特に、本発明の方法は、血液試料と試薬組
成物（シアン化物イオンを含まない試薬組成物であっ
て、この試薬組成物が赤血球を適切に溶解させ、かつヘ
モグロビンを放出させるのに効果的な量中に、第４アン
モニウム塩、ピリジニウム塩およびこれらの組み合わせ
から成る群から選ばれた少なくとも１種の溶解剤、およ
び放出したヘモグロビンをヘモクロモゲンに転化させて
反応生成物を形成させるのに効果的な量中に酸化防止剤
を含む）とを反応させる工程、前記血液試料中の前記ヘ
モグロビン濃度を定量するために前記反応生成物の吸光
度を測定する工程、および少なくとも２個の母集団を反
応生成物から区別する工程を含む。

【００８８】通常、この方法においては、試薬組成物
は、溶解剤および酸化防止剤を組み合わせた場合に、約
６〜約７．５のｐＨを有する。試薬組成物のｐＨは、約
５〜約１１．５の範囲とすることができ、好ましくは、
９〜１１の範囲、最も好ましくは、９．５〜１０．５の
範囲である。試薬組成物に対してｐＨ値がこの範囲とな
るようにするために、ｐＨ調製剤を添加する。本発明の
技術分野における当業者は、白血球の区別が本発明にお
いて知られた技術によってなし遂げられることを認める
であろう。ハミルによる米国特許明細書３，８７４，８
５２号、レジスらによる４，４８５，１７５号およびカ
ーターらによる４，５２８，２７４号は上記教義を例示
している。

【００８９】実施例２希釈剤を所定のｐＨおよび重量オスモル濃度に調製し
て、全血液試料を等張に平衡化した希釈剤で所定の濃度
に希釈した。得られた希釈血液と本発明の試薬組成物と
を白血球の母集団の少なくとも１種の個々の血液細胞の
体積変形（the volumetric modification ）を生ずるよ
うな方法で混合し、その間に少なくとも２個の白血球の
母集団の区別が可能となる。更に、白血球数が測定され
る。

【００９０】図３は、実施例２の方法およびCOULTER CO
UNTER Model S-Plus IV diff instrumentを用いて、正
常な全血の３６個の異なる試料中の白血球（ＷＢＣ）を
測定した相関図を示す。ｘ軸には、商品：LYSE S III
diff溶解剤を用い、ｙ軸には、LYSE S 4として図中に示
される実施例１の試薬を用いた。正常な血液試料は、既
知の病気を有しないヒトから得られた血液試料に限定し
た。相関係数：ｒ＝０．９９８９および回帰線：ｙ＝
０．９８９９ｘ＋０．００７４は、許容できる相関と偏
りを示している。

【００９１】図４は、実施例２の方法およびCOULTER CO
UNTER Model S-Plus IV diff instrument を用いて、不
正常な全血の８２個の異なる試料中の白血球（ＷＢＣ）
を測定した相関図を示す。ｘ軸には、商品：LYSE S II
I diff溶解剤を用い、ｙ軸には、LYSE S 4として図中に
示される実施例１の試薬を用いた。相関係数：ｒ＝０．
９９９６および回帰線：ｙ＝０．９９６２ｘ−０．０２
５１は、高い相関と著しく低い偏りを示している。

【００９２】本発明の試薬組成物の別の利点としては、
従来の測定方法を用いて、血液試料中の白血球数を測定
するための試薬として有用であるということである。白
血球数の測定のために用いる場合には、本発明の試薬組
成物を形成する試薬は、ヘモグロビン濃度の定量および
白血球の区別をするために用いる試薬と同一である。こ
のことは、同一の試薬組成物および血液試料と本発明の
試薬組成物との反応から生ずる同一の反応生成物を用い
て、ヘモグロビン濃度の定量、白血球の区別および白血
球の数量を可能とする別の利点を有することを意味す
る。

【００９３】図５は、実施例２の方法およびCOULTER CO
UNTER Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正
常な全血の２０４個の異なる試料中の白血球の母集団を
測定した相関図を示す。ｘ軸には、商品：LYSE S III
diff溶解剤を用い、ｙ軸には、LYSE S 4として図中に示
される実施例１の試薬を用いた。相関係数：ｒ＝０．９
８８５および回帰線：ｙ＝０．９７６１ｘ−０．７２９
０は、許容できる相関と偏りを示している。

【００９４】図６は、実施例２の方法およびCOULTER CO
UNTER Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正
常な全血の２２４個の異なる試料中の白血球の単核球の
母集団を測定した相関図を示す。ｘ軸には、商品：LYSE
S III diff溶解剤を用い、ｙ軸には、LYSE S 4として
図中に示される実施例１の試薬を用いた。相関係数：ｒ
＝０．８５２８および回帰線：ｙ＝０．９１４７ｘ＋
１．３８０５は、許容できる相関と偏りを示している。

【００９５】図７は、実施例２の方法およびCOULTER CO
UNTER Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正
常な全血の２２３個の異なる試料中の白血球の顆粒球の
母集団を測定した相関図を示す。ｘ軸には、商品：LYSE
S III diff溶解剤を用い、ｙ軸には、LYSE S 4として
図中に示される実施例１の試薬を用いた。相関係数：ｒ
＝０．９８５１および回帰線：ｙ＝０．９７６ｘ＋２．
０７１１は、許容できる相関と偏りを示している。

【００９６】本発明の詳細な説明を例示の目的として明
細書中に示した。当業者は、本発明の真意および範囲を
逸脱しないで、得られた説明を変化させることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、COULTER COUNTER Model S-Plus IV di
ff instrument を用いて、正常な全血の異なる試料中の
ヘモグロビン濃度の測定値の相関図を示す。

【図２】図２は、COULTER COUNTER Model S-Plus IV di
ff instrument を用いて、不正常な全血の異なる試料中
のヘモグロビン濃度の測定値の相関図を示す。

【図３】図３は、実施例２の方法およびCOULTER COUNTE
R Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正常な
全血の試料中の白血球〔white blood cells （ＷＢ
Ｃ）〕の測定値の相関図を示す。

【図４】図４は、実施例２の方法およびCOULTER COUNTE
R Model S-Plus IV diff instrument を用いて、不正常
な全血の試料中の白血球（ＷＢＣ）の測定値の相関図を
示す。

【図５】図５は、実施例２の方法およびCOULTER COUNTE
R Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正常な
全血の試料中の白血球のリンパ球の母集団の測定値の相
関図を示す。

【図６】図６は、実施例２の方法およびCOULTER COUNTE
R Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正常な
全血の２２４個の異なる試料中の白血球の単核球の母集
団を測定した相関図を示す。

【図７】図７は、実施例２の方法およびCOULTER COUNTE
R Model S-Plus IV diff instrument を用いて、正常な
全血の試料中の白血球の顆粒球の母集団の測定値の相関
図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者キャロルジェイヤングアメリカ合衆国フロリダ州 33176 マイアミエスダブリューワンハンドレッドナインティーフィフステラース 9801 (56)参考文献特開平３−137566（ＪＰ，Ａ) 国際公開96／2841（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/72 G01N 33/49

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ．赤血球を適切に溶解させ、かつヘモグ
ロビンを溶出させるのに有効的な量の、第４アンモニウ
ム塩、ピリジニウム塩およびこれらの組み合わせから成
る群から選ばれた少なくとも１種を含む、溶解剤、およ
び、ｂ．放出されたヘモグロビンをヘモクロモゲンに還元さ
せるのに有効的な量の、亜燐酸、亜硫酸ナトリウム、メ
タ重亜硫酸ナトリウム、重硫化ナトリウム、チオ硫酸ナ
トリウム、硫黄酸化数＋２〜＋４までの還元特性を有す
る硫黄のオキシ酸の他のアルカリ金属塩およびこれらの
組み合わせからなる群から選択される酸化防止剤、を含むことを特徴とする血液試料中のヘモグロビン濃度
を測定するためのシアン化物イオンを含まない試薬組成
物。
【請求項２】ａ．赤血球を適切に溶解させ、かつヘモグ
ロビンを溶出させ、しかも少なくとも２個の母集団の白
血球を測定することができるように体積によって白血球
を識別することができるのに有効的な量の、第４アンモ
ニウム塩、ピリジニウム塩およびこれらの組み合わせか
ら成る群から選ばれた少なくとも１種を含む溶解剤、お
よびｂ．放出されたヘモグロビンをヘモクロモゲンに還元さ
せるのに有効的な量の、亜燐酸、亜硫酸ナトリウム、メ
タ重亜硫酸ナトリウム、重硫化ナトリウム、チオ硫酸ナ
トリウム、硫黄酸化数＋２〜＋４までの還元特性を有す
る硫黄のオキシ酸の他のアルカリ金属塩およびこれらの
組み合わせからなる群から選択される酸化防止剤を含む
ことを特徴とする血液試料中のヘモグロビン濃度の測定
および白血球の母集団を区別ためにシアン化物イオンを
含まない試薬組成物。
【請求項３】溶解剤が２個の異なる第４アンモニウム
塩を含有することを特徴とする請求項１または２記載の
試薬組成物。
【請求項４】ｐＨを５〜１１．５の範囲に調製するため
のｐＨ調製剤を含むことを特徴とする請求項１または２
記載の試薬組成物。
【請求項５】試薬組成物の安定性を維持するために有効
的な量の、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチ
レンジアミン四酢酸(EDTA)塩、エチレングリコール−ビ
ス−(3−アミノ−エチルエーテル)N-N’−テトラ酢酸(E
GTA)、N−(２−アセトアミノ)−イミノジ酢酸(ADA)、ク
エン酸、酒石酸、グルコン酸、糖酸およびこれらの組み
合わせから成る群から選ばれる酸化防止安定剤を含むこ
とを特徴とする請求項１または２記載の試薬組成物。
【請求項６】ａ．血液試料とシアン化物イオンを含まな
い前記試薬組成物とを反応させる工程、及び、ｂ. 前記血液試料中の前記ヘモグロビン濃度を定量する
ために前記反応生成物の吸光度を測定する工程、を含む
ヘモグロビン濃度の測定方法であって、該試薬組成物が、 (1)赤血球を適切に溶解させ、かつヘモグロビンを溶出
させるのに効果的な量中に、第４アンモニウム塩、ピリ
ジニウム塩およびこれらの組み合わせから成る群から選
ばれた少なくとも１種を含む溶解剤と、および (2)放出されたヘモグロビンをヘモクロモゲンに還元さ
せて反応生成物を形成させるのに有効的な量の、亜燐
酸、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、重硫
化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫黄酸化数＋２〜
＋４までの還元特性を有する硫黄のオキシ酸の他のアル
カリ金属塩およびこれらの組み合わせからなる群から選
択される酸化防止剤とを含むことを特徴とするヘモグロ
ビン濃度の測定方法。
【請求項７】ａ．血液試料とシアン化物イオンを含まな
い前記試薬組成物とを反応させる工程、ｂ．前記血液試料中の前記ヘモグロビン濃度を定量する
ために前記反応生成物の吸光度を測定する工程、およびｃ．少なくとも２個の母集団の白血球を反応生成物から
区別する工程、を含む、ヘモグロビン濃度の測定方法及び白血球の母集
団を区別する方法であって、該試薬組成物が、（１）赤血球を適切に溶解させ、かつ
ヘモグロビンを溶出させ、しかも少なくとも２個の白血
球の母集団を測定することができるように体積によって
白血球を識別することができるのに有効的な量の、第４
アンモニウム塩、ピリジニウム塩およびこれらの組み合
わせから成る群から選ばれた少なくとも１種を含む溶解
剤、および（２）放出されたヘモグロビンをデオキシヘ
モグロビンに転化させ、かつ該デオキシヘモグロビンを
ヘモクロモゲンに還元させて反応生成物を形成させるの
に有効的な量の、亜燐酸、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜
硫酸ナトリウム、重硫化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウ
ム、硫黄酸化数＋２〜＋４までの還元特性を有する硫黄
のオキシ酸の他のアルカリ金属塩およびこれらの組み合
わせからなる群から選択される酸化防止剤を含むことを
特徴とする血液試料中のヘモグロビン濃度の測定方法お
よび白血球の母集団を区別する方法。
【請求項８】溶解剤が２個の異なる第４アンモニウム塩
を含むことを特徴とする請求項６または７記載の方法。
【請求項９】ｐＨを５〜１１．５の範囲に調製するため
のｐＨ調製剤を含むことを特徴とする請求項６または７
記載の方法。
【請求項１０】組成物が該試薬組成物の安定性を維持
するために有効的な量の、エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)塩、エチレン
グリコール−ビス−(3−アミノ−エチルエーテル)N-N’
−テトラ酢酸(EGTA)、N−(２−アセトアミノ)−イミノ
ジ酢酸(ADA)、クエン酸、酒石酸、グルコン酸、糖酸お
よびこれらの組み合わせから成る群から選ばれる酸化防
止安定剤を含むことを特徴とする請求項６または７記載
の方法。
【請求項１１】５００〜６００ｎｍの範囲で反応混合物
の吸光度を測定することを特徴とする請求項７記載の方
法。
【請求項１２】少なくとも３個の母集団の白血球が反応
生成物から区別されることを特徴とする請求項１１記載
の方法。
【請求項１３】ａ．赤血球を適切に溶解させ、かつヘモ
グロビンを溶出させ、しかも少なくとも２個の白血球の
母集団を測定することができるように体積によって白血
球を識別することができるのに有効的な量の、第４アン
モニウム塩、ピリジニウム塩およびこれらの組み合わせ
から成る群から選ばれた少なくとも１種を含む溶解剤、
およびｂ．放出されたヘモグロビンをヘモクロモゲンに還元さ
せるのに効果的な量中の、亜燐酸、亜硫酸ナトリウム、
メタ重亜硫酸ナトリウム、重硫化ナトリウム、チオ硫酸
ナトリウム、硫黄酸化数＋２〜＋４までの還元特性を有
する硫黄のオキシ酸の他のアルカリ金属塩およびこれら
の組み合わせからなる群から選択される酸化防止剤、ｃ．試薬組成物の安定性を維持するために効果的な量中
の酸化防止安定剤、を含むことを特徴とする血液試料中のヘモグロビン濃度
を測定し、白血球の母集団を区別するためのシアン化物
イオンを含まない試薬組成物。
【請求項１４】溶解剤が２個の異なる第４アンモニウム
塩を含むことを特徴とする請求項１３記載の試薬組成
物。
【請求項１５】酸化防止安定剤が、エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)塩、
エチレングリコール−ビス−(3−アミノ−エチルエーテ
ル)N-N’−テトラ酢酸(EGTA)、N−(２−アセトアミノ)
−イミノジ酢酸(ADA)、クエン酸、酒石酸、グルコン
酸、糖酸およびこれらの組み合わせから成る群から選ば
れることを特徴とする請求項１３記載の試薬組成物。
【請求項１６】溶解剤がドデシルトリメチルアンモニウ
ム塩化物及びテトラデシルトリメチルアンモニウム臭化
物を含むことを特徴とする請求項１３記載の試薬組成
物。