JP3201411B2 - ビタミンｄ類の生物学的製造方法 - Google Patents
ビタミンｄ類の生物学的製造方法Info
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- JP3201411B2 JP3201411B2 JP33428390A JP33428390A JP3201411B2 JP 3201411 B2 JP3201411 B2 JP 3201411B2 JP 33428390 A JP33428390 A JP 33428390A JP 33428390 A JP33428390 A JP 33428390A JP 3201411 B2 JP3201411 B2 JP 3201411B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はビタミンＤ類より25−ヒドロキシビタミンＤ
類および１α,25−ジヒドロキシビタミンＤ類を生物学
的に製造する方法に関する。
類および１α,25−ジヒドロキシビタミンＤ類を生物学
的に製造する方法に関する。
［発明の背景］ ビタミンＤ類は体内でのカルシウムの吸収、骨のカル
シウム代謝促進に関係する重要なビタミンであり、その
活性は肝臓で25位、腎臓で１α位に水酸化を受けて発揮
されることが知られている（エイチ・エフ・デルカおよ
びエイチ・ケー・ジョーンズ：アニュアル レビュー
オブ バイオケミストリー（Ann.Rev.Biochem.），第52
巻,411頁（1983年））。ところが、25−ヒドロキシビタ
ミンD3は肝機能障害を持つ患者では、生体内での生成量
が不足している。従って、この様な患者に対する25−ヒ
ドロキシビタミンD3の授与は、生体内での不足分を補う
という観点から有効である。また、１α,25−ジヒドロ
キシビタミンD3は特に活性が強く、上記と同様な意味で
腎不全患者には著効を表わす。１α,25−ジヒドロキシ
ビタミンD3は25−ヒドロキシビタミンD3を原料として微
生物、酵素化学的に変換生成されることが知られている
（特開平２−469号および特開平２−231089号）。従っ
て、25−ヒドロキシビタミンD3および１α,25−ジヒド
ロキシビタミンD3の安価な製造法は工業上極めて有益で
ある。
シウム代謝促進に関係する重要なビタミンであり、その
活性は肝臓で25位、腎臓で１α位に水酸化を受けて発揮
されることが知られている（エイチ・エフ・デルカおよ
びエイチ・ケー・ジョーンズ：アニュアル レビュー
オブ バイオケミストリー（Ann.Rev.Biochem.），第52
巻,411頁（1983年））。ところが、25−ヒドロキシビタ
ミンD3は肝機能障害を持つ患者では、生体内での生成量
が不足している。従って、この様な患者に対する25−ヒ
ドロキシビタミンD3の授与は、生体内での不足分を補う
という観点から有効である。また、１α,25−ジヒドロ
キシビタミンD3は特に活性が強く、上記と同様な意味で
腎不全患者には著効を表わす。１α,25−ジヒドロキシ
ビタミンD3は25−ヒドロキシビタミンD3を原料として微
生物、酵素化学的に変換生成されることが知られている
（特開平２−469号および特開平２−231089号）。従っ
て、25−ヒドロキシビタミンD3および１α,25−ジヒド
ロキシビタミンD3の安価な製造法は工業上極めて有益で
ある。
［従来の技術］ ビタミンＤ類の１α位および／または25位に水酸基を
直接導入する有機化学的合成方法は知られていない。
直接導入する有機化学的合成方法は知られていない。
動物臓器を用いた方法（バイオケミカル アンド バ
イオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.），第36巻,251頁（1969
年））は知られていたが工業的に実用的な方法ではなか
った。最近、微生物を用いた酵素化学的方法によりビタ
ミンＤ類の１α位および／または25位を水酸化する方法
が開示された（特開平２−469号および特開平２−23108
9号）。
イオフィジカル リサーチ コミュニケーション（Bioc
hem.Biophys.Res.Commun.），第36巻,251頁（1969
年））は知られていたが工業的に実用的な方法ではなか
った。最近、微生物を用いた酵素化学的方法によりビタ
ミンＤ類の１α位および／または25位を水酸化する方法
が開示された（特開平２−469号および特開平２−23108
9号）。
［発明が解決しようとする課題］ しかし、上記微生物を用いた酵素化学的方法によるビ
タミンＤ類からの25−ヒドロキシビタミンＤ類および１
α,25−ジヒドロキシビタミンＤ類の製造は、開示され
た方法（特開平２−469号および特開平２−231089号）
によれば、例えば基質ビタミンD3から25−ヒドロキシビ
タミンD3、あるいはビタミンD3から１α,25−ジヒドロ
キシビタミンD3への変換率は十分なものではなかった。
さらに基質の仕込み濃度が低く、従って目的物の生成量
のわりには、大きな製造設備を要するなど工業的製造法
として解決すべき問題があった。
タミンＤ類からの25−ヒドロキシビタミンＤ類および１
α,25−ジヒドロキシビタミンＤ類の製造は、開示され
た方法（特開平２−469号および特開平２−231089号）
によれば、例えば基質ビタミンD3から25−ヒドロキシビ
タミンD3、あるいはビタミンD3から１α,25−ジヒドロ
キシビタミンD3への変換率は十分なものではなかった。
さらに基質の仕込み濃度が低く、従って目的物の生成量
のわりには、大きな製造設備を要するなど工業的製造法
として解決すべき問題があった。
従って、本発明は従来の微生物あるいは酵素を用いた
生物学的な方法を改善し、ビタミンＤ類から25−ヒドロ
キシビタミンＤ類、あるいは１α,25−ジヒドロキシビ
タミンＤ類への変換効率を飛躍的に増大させる製造方法
を提供することを目的とする。
生物学的な方法を改善し、ビタミンＤ類から25−ヒドロ
キシビタミンＤ類、あるいは１α,25−ジヒドロキシビ
タミンＤ類への変換効率を飛躍的に増大させる製造方法
を提供することを目的とする。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、微生物を用いたビタミンＤ類から25−
ヒドロキシビタミンＤ類、あるいは１α,25−ジヒドロ
キシビタミンＤ類への変換において、その変換効率を増
大させることを目的として鋭意研究を重ねた結果、反応
液中にシクロデキストリン類を共存させることにより変
換効率が飛躍的に増大することを見出し本発明を完成し
た。
ヒドロキシビタミンＤ類、あるいは１α,25−ジヒドロ
キシビタミンＤ類への変換において、その変換効率を増
大させることを目的として鋭意研究を重ねた結果、反応
液中にシクロデキストリン類を共存させることにより変
換効率が飛躍的に増大することを見出し本発明を完成し
た。
すなわち、本発明はビタミンＤ類の25位および１α位
を水酸化し得る微生物または酵素を含有する反応液中
に、従来法と比較して数倍の濃度のビタミンＤ類および
シクロデキストリン類を加えてビタミンＤ類の25位およ
び１α位の水酸化効率を飛躍的に増大させた25−ヒドロ
キシビタミンＤ類および１α,25−ジヒドロキシビタミ
ンＤ類の生物学的製造方法である。
を水酸化し得る微生物または酵素を含有する反応液中
に、従来法と比較して数倍の濃度のビタミンＤ類および
シクロデキストリン類を加えてビタミンＤ類の25位およ
び１α位の水酸化効率を飛躍的に増大させた25−ヒドロ
キシビタミンＤ類および１α,25−ジヒドロキシビタミ
ンＤ類の生物学的製造方法である。
本発明に用いられるビタミンＤ類の水酸化能を有する
微生物としては、例えば特開平２−469号および特開平
２−231089号に挙げられているノカルディア・オウトト
ロヒカ Ｎ−102（Nocardia autotrophica N−102）、
ストレプトマイセス・ロゼオスポラス Ａ−5797（Stre
ptomyces roseosporus A−5797）、ストレプトマイセス
・スクレロチアラス Ｔ−JSI（Streptomyces scleroti
alus T−JSI）、アミコラータ・サツルネア FERM BP
−2307（Amycolata saturnea FERM BP−2307）が挙げら
れる。
微生物としては、例えば特開平２−469号および特開平
２−231089号に挙げられているノカルディア・オウトト
ロヒカ Ｎ−102（Nocardia autotrophica N−102）、
ストレプトマイセス・ロゼオスポラス Ａ−5797（Stre
ptomyces roseosporus A−5797）、ストレプトマイセス
・スクレロチアラス Ｔ−JSI（Streptomyces scleroti
alus T−JSI）、アミコラータ・サツルネア FERM BP
−2307（Amycolata saturnea FERM BP−2307）が挙げら
れる。
さらに、特開平２−231089号に挙げられている「アミ
コラータに属する微生物」として、アミコラータ・サツ
ルネア IFO 14499（Amycolata saturnea IFO 1449
9）、アミコラータ・オウトトロヒカ ATCC 19727（Amy
colata auto−trophica ATCC 19727）、アミコラータ・
オウトトロヒカ ATCC 13181（Amycolata auto−trophi
ca ATCC 13181）、アミコラータ・オウトトロヒカ ATC
C 33794（Amycolata auto−trophica ATCC 33794）、ア
ミコラータ・オウトトロヒカ ATCC 33795（Amycolata
auto−trophica ATCC 33795）、アミコラータ・オウト
トロヒカ ATCC 33796（Amycolata auto−trophica ATC
C 33796）、アミコラータ・オウトトロヒカ ATCC 3379
7（Amycolata auto−trophica ATCC 33797）、アミコラ
ータ・オウトトロヒカ JCM 4010（Amycolata autotrop
hica JCM 4010）、アミコラータ・ヒドロカルボンオキ
シダンス IFO 14498（Amycolata hydro−carbonoxidan
s IFO 14498）などが挙げられる。
コラータに属する微生物」として、アミコラータ・サツ
ルネア IFO 14499（Amycolata saturnea IFO 1449
9）、アミコラータ・オウトトロヒカ ATCC 19727（Amy
colata auto−trophica ATCC 19727）、アミコラータ・
オウトトロヒカ ATCC 13181（Amycolata auto−trophi
ca ATCC 13181）、アミコラータ・オウトトロヒカ ATC
C 33794（Amycolata auto−trophica ATCC 33794）、ア
ミコラータ・オウトトロヒカ ATCC 33795（Amycolata
auto−trophica ATCC 33795）、アミコラータ・オウト
トロヒカ ATCC 33796（Amycolata auto−trophica ATC
C 33796）、アミコラータ・オウトトロヒカ ATCC 3379
7（Amycolata auto−trophica ATCC 33797）、アミコラ
ータ・オウトトロヒカ JCM 4010（Amycolata autotrop
hica JCM 4010）、アミコラータ・ヒドロカルボンオキ
シダンス IFO 14498（Amycolata hydro−carbonoxidan
s IFO 14498）などが挙げられる。
本発明で用いられるシクロデキストリン類にはα−シ
クロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シク
ロデキストリン、β−ジメチルシクロデキストリン、β
−トリメチルシクロデキストリン、部分メチル化シクロ
デキストリン（以下、PMCDと略記することがある。）、
分枝シクロデキストリンなどがある。これらのシクロデ
キストリン類は単独で用いてもよいし、あるいは２種以
上を混合したものを用いてもよい。
クロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シク
ロデキストリン、β−ジメチルシクロデキストリン、β
−トリメチルシクロデキストリン、部分メチル化シクロ
デキストリン（以下、PMCDと略記することがある。）、
分枝シクロデキストリンなどがある。これらのシクロデ
キストリン類は単独で用いてもよいし、あるいは２種以
上を混合したものを用いてもよい。
本発明では、シクロデキストリン類と同時に界面活性
剤を共存させることが有効な手段である。界面活性剤と
しては、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレ
ン・ソルビタン脂肪酸エステル（例えばTween 80（シグ
マ社製））、ソルビタン脂肪酸エステル（例えばSpan 8
5（シグマ社製））、ポリオキシエチレンエーテル（例
えばBrij 96（シグマ社製））やTriton X−100（シグマ
社製）、ノニルフェノール（例えばノニポール45（三洋
化成工業（株））製）、酸化エチレン−酸化プロピレン
のブロック共重合物（例えばPluronic L−61（旭電化工
業（株））製）、および陰イオン性界面活性剤としてダ
イレックス（日本油脂（株）製）、トラックス（日本油
脂（株）製）などを用いることができる。
剤を共存させることが有効な手段である。界面活性剤と
しては、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレ
ン・ソルビタン脂肪酸エステル（例えばTween 80（シグ
マ社製））、ソルビタン脂肪酸エステル（例えばSpan 8
5（シグマ社製））、ポリオキシエチレンエーテル（例
えばBrij 96（シグマ社製））やTriton X−100（シグマ
社製）、ノニルフェノール（例えばノニポール45（三洋
化成工業（株））製）、酸化エチレン−酸化プロピレン
のブロック共重合物（例えばPluronic L−61（旭電化工
業（株））製）、および陰イオン性界面活性剤としてダ
イレックス（日本油脂（株）製）、トラックス（日本油
脂（株）製）などを用いることができる。
本発明で微生物学的水酸化の対象となるビタミンＤ類
とは、１α位および／または25位に水素原子を有するビ
タミンＤ化合物、例えば、ビタミンD2誘導体、ビタミン
D3誘導体、ビタミンD4誘導体、ビタミンD5誘導体、ビタ
ミンD6誘導体、ビタミンD7誘導体をいい、それらの17位
側鎖の水素原子、または水酸基がフッ素等のハロゲン原
子、水酸基、低級アルキル基などで置換されているもの
でもよい。
とは、１α位および／または25位に水素原子を有するビ
タミンＤ化合物、例えば、ビタミンD2誘導体、ビタミン
D3誘導体、ビタミンD4誘導体、ビタミンD5誘導体、ビタ
ミンD6誘導体、ビタミンD7誘導体をいい、それらの17位
側鎖の水素原子、または水酸基がフッ素等のハロゲン原
子、水酸基、低級アルキル基などで置換されているもの
でもよい。
本発明で基質となり得るものは、具体的には、ビタミ
ンD2、ビタミンD3、ビタミンD4、ビタミンD5、ビタミン
D6、ビタミンD7、24−オキソビタミンD3、１α−ヒドロ
キシビタミンD2、１α−ヒドロキシビタミンD3、１α−
ヒドロキシビタミンD4、１α−ヒドロキシビタミンD5、
１α−ヒドロキシビタミンD6、１α−ヒドロキシビタミ
ンD7、１α−ヒドロキシ−24−オキソビタミンD3、１
α,24−ジヒドロキシビタミンD3、24−ヒドロキシビタ
ミンD3、23−ヒドロキシビタミンD3、23−ヒドロキシビ
タミンD4、１α,23−ジヒドロキシビタミンD3、１α,23
−ジヒドロキシビタミンD4、26−ヒドロキシビタミン
D2、26−ヒドロキシビタミンD3、26−ヒドロキシビタミ
ンD4、１α,26−ジヒドロキシビタミンD2、１α,26−ジ
ヒドロキシビタミンD3、１α,26−ジヒドロキシビタミ
ンD4、23,24−ジヒドロキシビタミンD3、23,26−ジヒド
ロキシビタミンD3、23,26−ジヒドロキシビタミンD4、
ビタミンD3 26,23−ラクトン、１α−ヒドロキシビタ
ミンD3 26,23−ラクトン、24,24−ジフルオロビタミン
D3、24,24−ジクロロビタミンD3、26,26,26,27,27,27−
ヘキサフルオロビタミンD3、24,24−ジフルオロ−25−
ヒドロキシ−26,27−ジメチルビタミンD3、25−ヒドロ
キシビタミンD2、25−ヒドロキシビタミンD3、25−ヒド
ロキシビタミンD4、25−ヒドロキシビタミンD5、25−ヒ
ドロキシビタミンD6、25−ヒドロキシビタミンD7、24−
オキソ−25−ヒドロキシビタミンD3、24,25−ジヒドロ
キシビタミンD3、23,25−ジヒドロキシビタミンD3、23,
25−ジヒドロキシビタミンD4、25,26−ジヒドロキシビ
タミンD2、25,26−ジヒドロキシビタミンD3、25,26−ジ
ヒドロキシビタミンD4、25−ヒドロキシビタミンD3−2
6,23−ラクトンなどがある。
ンD2、ビタミンD3、ビタミンD4、ビタミンD5、ビタミン
D6、ビタミンD7、24−オキソビタミンD3、１α−ヒドロ
キシビタミンD2、１α−ヒドロキシビタミンD3、１α−
ヒドロキシビタミンD4、１α−ヒドロキシビタミンD5、
１α−ヒドロキシビタミンD6、１α−ヒドロキシビタミ
ンD7、１α−ヒドロキシ−24−オキソビタミンD3、１
α,24−ジヒドロキシビタミンD3、24−ヒドロキシビタ
ミンD3、23−ヒドロキシビタミンD3、23−ヒドロキシビ
タミンD4、１α,23−ジヒドロキシビタミンD3、１α,23
−ジヒドロキシビタミンD4、26−ヒドロキシビタミン
D2、26−ヒドロキシビタミンD3、26−ヒドロキシビタミ
ンD4、１α,26−ジヒドロキシビタミンD2、１α,26−ジ
ヒドロキシビタミンD3、１α,26−ジヒドロキシビタミ
ンD4、23,24−ジヒドロキシビタミンD3、23,26−ジヒド
ロキシビタミンD3、23,26−ジヒドロキシビタミンD4、
ビタミンD3 26,23−ラクトン、１α−ヒドロキシビタ
ミンD3 26,23−ラクトン、24,24−ジフルオロビタミン
D3、24,24−ジクロロビタミンD3、26,26,26,27,27,27−
ヘキサフルオロビタミンD3、24,24−ジフルオロ−25−
ヒドロキシ−26,27−ジメチルビタミンD3、25−ヒドロ
キシビタミンD2、25−ヒドロキシビタミンD3、25−ヒド
ロキシビタミンD4、25−ヒドロキシビタミンD5、25−ヒ
ドロキシビタミンD6、25−ヒドロキシビタミンD7、24−
オキソ−25−ヒドロキシビタミンD3、24,25−ジヒドロ
キシビタミンD3、23,25−ジヒドロキシビタミンD3、23,
25−ジヒドロキシビタミンD4、25,26−ジヒドロキシビ
タミンD2、25,26−ジヒドロキシビタミンD3、25,26−ジ
ヒドロキシビタミンD4、25−ヒドロキシビタミンD3−2
6,23−ラクトンなどがある。
本発明の方法は微生物の菌体または酵素を含有する溶
液中でシクロデキストリン類またはシクロデキストリン
類と界面活性剤を共存させることによりその反応速度、
反応効率を上げる方法であり、当該能力のある微生物を
培養する培地は主として液体培地を用い、炭素源として
グルコース、マルトース、シュークロース、デキストリ
ン、澱粉、アラビノース、キシロース、グリセリド、植
物油脂、動物油脂を単独もしくは混合して用いる。窒素
源としては大豆粉、綿実粕、グルテンミール、カゼイ
ン、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コ
ーンスターチプリカー等を単独または混合して用いる。
その他生育に必要な、あるいは25位および１α位水酸化
酵素の生産を促進する有機物及び無機物を必要に応じて
添加することができる。
液中でシクロデキストリン類またはシクロデキストリン
類と界面活性剤を共存させることによりその反応速度、
反応効率を上げる方法であり、当該能力のある微生物を
培養する培地は主として液体培地を用い、炭素源として
グルコース、マルトース、シュークロース、デキストリ
ン、澱粉、アラビノース、キシロース、グリセリド、植
物油脂、動物油脂を単独もしくは混合して用いる。窒素
源としては大豆粉、綿実粕、グルテンミール、カゼイ
ン、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コ
ーンスターチプリカー等を単独または混合して用いる。
その他生育に必要な、あるいは25位および１α位水酸化
酵素の生産を促進する有機物及び無機物を必要に応じて
添加することができる。
培養方法は振盪培養、通気撹拌培養などの好気培養が
適している。
適している。
培養温度は20〜33℃、好ましくは25〜30℃で行い、培
養12〜96時間後、好ましくは24〜48時間後に基質となる
ビタミンＤ類とシクロデキストリン類、および所望によ
り界面活性剤を添加する。ビタミンＤ類の添加量は培地
中10〜1000μg/ml、好ましくは50〜500μg/mlが好適で
あり、シクロデキストリン類の添加量は0.1〜15重量％
（ビタミンＤ類１モルに対して１〜1000モル）、好まし
くは0.1〜２重量％（ビタミンＤ類１モルに対して５〜1
40モル）が好適である。培養のpHは５〜９、好ましくは
６〜８が好適である。
養12〜96時間後、好ましくは24〜48時間後に基質となる
ビタミンＤ類とシクロデキストリン類、および所望によ
り界面活性剤を添加する。ビタミンＤ類の添加量は培地
中10〜1000μg/ml、好ましくは50〜500μg/mlが好適で
あり、シクロデキストリン類の添加量は0.1〜15重量％
（ビタミンＤ類１モルに対して１〜1000モル）、好まし
くは0.1〜２重量％（ビタミンＤ類１モルに対して５〜1
40モル）が好適である。培養のpHは５〜９、好ましくは
６〜８が好適である。
界面活性剤の添加量は、培地中0.01〜５重量％、好ま
しくは0.05〜0.5重量％が好適である。
しくは0.05〜0.5重量％が好適である。
本発明の製造方法では、培養液中あるいは培養菌体あ
るいは酵素を含有する溶液中で振盪あるいは通気撹拌す
ることが適しており、基質であるビタミンＤ類、シクロ
デキストリン類、および所望により界面活性剤を添加後
１〜130時間好気的に撹拌を行う。好気的条件を得るた
めに培養器内の圧力を上げたり酵素気流下で反応を行う
ことも有効である。
るいは酵素を含有する溶液中で振盪あるいは通気撹拌す
ることが適しており、基質であるビタミンＤ類、シクロ
デキストリン類、および所望により界面活性剤を添加後
１〜130時間好気的に撹拌を行う。好気的条件を得るた
めに培養器内の圧力を上げたり酵素気流下で反応を行う
ことも有効である。
シクロデキストリン類および界面活性剤の添加方法
は、基質であるビタミンＤ類と予め混合しておく方法、
ビタミンＤ類を先に添加し、つづいてシクロデキストリ
ン類と界面活性剤を添加する方法、シクロデキストリン
類と界面活性剤を先に添加しておき、後からビタミンＤ
類を添加する方法のいずれでも可能である。
は、基質であるビタミンＤ類と予め混合しておく方法、
ビタミンＤ類を先に添加し、つづいてシクロデキストリ
ン類と界面活性剤を添加する方法、シクロデキストリン
類と界面活性剤を先に添加しておき、後からビタミンＤ
類を添加する方法のいずれでも可能である。
これらの反応により製造されたビタミンＤ類を単離す
るには有機溶剤による抽出、カラムクロマトグラフィー
等の方法が採られる。例えば反応終了後、反応液を塩化
メチレンにより抽出し濃縮、乾固する。これを２−プロ
パノール、ｎ−ヘキサン等の適当な溶媒に溶解し、ろ
過、遠心分離などにより不溶物を除いた後シリカゲルカ
ラム、例えばゾルバックスSIL（米国デュポン社製）、
シムパックODS（島津製作所製）等を用いた高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）を行なうことにより25−ヒド
ロキシビタミンＤ類および１α,25−ジヒドロキシビタ
ミンＤ類の単離を行なうことができる。
るには有機溶剤による抽出、カラムクロマトグラフィー
等の方法が採られる。例えば反応終了後、反応液を塩化
メチレンにより抽出し濃縮、乾固する。これを２−プロ
パノール、ｎ−ヘキサン等の適当な溶媒に溶解し、ろ
過、遠心分離などにより不溶物を除いた後シリカゲルカ
ラム、例えばゾルバックスSIL（米国デュポン社製）、
シムパックODS（島津製作所製）等を用いた高速液体ク
ロマトグラフィー（HPLC）を行なうことにより25−ヒド
ロキシビタミンＤ類および１α,25−ジヒドロキシビタ
ミンＤ類の単離を行なうことができる。
［発明の効果］ 本発明の方法により微生物菌体またはその生産する酵
素を用いて、ビタミンＤ類の活性型である25−ヒドロキ
シビタミンＤ類および１α,25−ジヒドロキシビタミン
Ｄ類を高効率で製造することができる。
素を用いて、ビタミンＤ類の活性型である25−ヒドロキ
シビタミンＤ類および１α,25−ジヒドロキシビタミン
Ｄ類を高効率で製造することができる。
［実施例］ 以下実施例により本発明を詳細に説明するがこれによ
って本発明が限定されるものではない。なお、下記の例
中の％は特にことわらないかぎり重量基準による。
って本発明が限定されるものではない。なお、下記の例
中の％は特にことわらないかぎり重量基準による。
実施例１ バクトソイトン（ディフコ社製）1.5％、コーンスチ
ープリカー0.5％、グルコース1.5％、NaCl 0.5％、CaCO
3 0.2％（pH7.2）からなる培地（BG培地）100mlを500ml
容三角フラスコに入れ120℃、20分間加圧滅菌する。こ
れにノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102（FERM BP
−1573）を一白金耳接種し28℃、230rpmで振盪培養す
る。一方、ビタミンD3 25mgを0.15％の部分メチル化シ
クロデキストリン（PMCD）を含む0.01Mリン酸バッファ
ー（pH7.0）50mlに加え（ビタミンD3 1モルに対してPMC
D17モルの割合）、よく撹拌した後、不溶物をろ過によ
り除去し、その10mlを先の培養液（48時間培養）に加
え、さらに48時間培養を続ける。この培養液1mlを共栓
付き遠心沈澱管にとり、メタノール2ml、クロロホルム1
mlを加え10分間撹拌し、さらにクロロホルム1mlおよび
蒸留水1ml加え撹拌する。これを3,000rpm、５分間遠心
分離し下層をとる。上層はもう１度クロロホルム1.5ml
を加え抽出する。クロロホルム層を合併し、エタノール
0.1mlを加えて減圧下にて濃縮乾固した後、ｎ−ヘキサ
ン:2−プロパノール（86:14）の溶媒200μに溶解し、
HPLCの試料液とする。HPLCはゾルバックスSIL（4.6mm×
25cm）のカラムを用い、ｎ−ヘキサン:2−プロパノール
（86:14）を移動層として流速1.5ml/minで分析を行なっ
た。
ープリカー0.5％、グルコース1.5％、NaCl 0.5％、CaCO
3 0.2％（pH7.2）からなる培地（BG培地）100mlを500ml
容三角フラスコに入れ120℃、20分間加圧滅菌する。こ
れにノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102（FERM BP
−1573）を一白金耳接種し28℃、230rpmで振盪培養す
る。一方、ビタミンD3 25mgを0.15％の部分メチル化シ
クロデキストリン（PMCD）を含む0.01Mリン酸バッファ
ー（pH7.0）50mlに加え（ビタミンD3 1モルに対してPMC
D17モルの割合）、よく撹拌した後、不溶物をろ過によ
り除去し、その10mlを先の培養液（48時間培養）に加
え、さらに48時間培養を続ける。この培養液1mlを共栓
付き遠心沈澱管にとり、メタノール2ml、クロロホルム1
mlを加え10分間撹拌し、さらにクロロホルム1mlおよび
蒸留水1ml加え撹拌する。これを3,000rpm、５分間遠心
分離し下層をとる。上層はもう１度クロロホルム1.5ml
を加え抽出する。クロロホルム層を合併し、エタノール
0.1mlを加えて減圧下にて濃縮乾固した後、ｎ−ヘキサ
ン:2−プロパノール（86:14）の溶媒200μに溶解し、
HPLCの試料液とする。HPLCはゾルバックスSIL（4.6mm×
25cm）のカラムを用い、ｎ−ヘキサン:2−プロパノール
（86:14）を移動層として流速1.5ml/minで分析を行なっ
た。
検出は265nmの吸収を計ることによって行なった。そ
の結果、25−ヒドロキシビタミンD3は25.7μg/ml生成し
ており原料からの変換率は51.4％であった。
の結果、25−ヒドロキシビタミンD3は25.7μg/ml生成し
ており原料からの変換率は51.4％であった。
実施例２ 実施例１で用いたBG培地（100ml/500ml容三角フラス
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％PMCD溶液
（0.01Mリン酸バッファー、pH7.0）10mlおよび２％ビタ
ミンD3のエタノール溶液1ml（ビタミンD3 1モルに対し
てPMCD7モルの割合）を添加する。さらに培養を続け、2
4時間、48時間、72時間、96時間、120時間の各時期にお
ける25−ヒドロキシビタミンD3の量を実施例１の方法で
調べ、それぞれ21.5μg/ml、57.6μg/ml、79.2μg/ml、
92.0μg/ml、125μg/ml（変換率62.5％）の値を得た。
なお、このときPMCD無添加の実験区では96時間で僅か1.
69μg/ml（変換率6.8％）の25−ヒドロキシビタミンD3
が生成したのみであった。
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％PMCD溶液
（0.01Mリン酸バッファー、pH7.0）10mlおよび２％ビタ
ミンD3のエタノール溶液1ml（ビタミンD3 1モルに対し
てPMCD7モルの割合）を添加する。さらに培養を続け、2
4時間、48時間、72時間、96時間、120時間の各時期にお
ける25−ヒドロキシビタミンD3の量を実施例１の方法で
調べ、それぞれ21.5μg/ml、57.6μg/ml、79.2μg/ml、
92.0μg/ml、125μg/ml（変換率62.5％）の値を得た。
なお、このときPMCD無添加の実験区では96時間で僅か1.
69μg/ml（変換率6.8％）の25−ヒドロキシビタミンD3
が生成したのみであった。
実施例３ 実施例１で用いたBG培地（100ml/500ml容三角フラス
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％PMCD溶液
（0.01Mリン酸バッファー、pH7.0）10mlおよび２％ビタ
ミンD3のエタノール溶液を1ml加え（ビタミンD3 1モル
に対してPMCD7モルの割合）さらに96時間培養を続け
た。培養終了後、フラスコに塩化メチレン200mlを加え
抽出を行なった。塩化メチレン層を減圧下濃縮し乾固後
直ちに２−ロパノール:n−ヘキサン（1:9）の混合溶媒3
mlに溶解し−20℃で２時間放置し、生じた不溶成分を遠
心分離によって除去した。この上澄液を減圧下濃縮しHP
LC（カラムはゾルバックスSIL（4.6mm×25cm）、移動層
はｎ−ヘキサン:2−プロパノール（86:14）、流速は1.5
ml/min）を行ない、3.8分のピークの画分を集めた。こ
れを40℃以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固し
た。このものは市販の25−ヒドロキシビタミンD3（デュ
ファー社製、オランダ）の標品と比較することによりHP
LCの保持時間、紫外部吸収スペクトル、マススペクトル
開裂パターンが完全に一致することを認めた。
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％PMCD溶液
（0.01Mリン酸バッファー、pH7.0）10mlおよび２％ビタ
ミンD3のエタノール溶液を1ml加え（ビタミンD3 1モル
に対してPMCD7モルの割合）さらに96時間培養を続け
た。培養終了後、フラスコに塩化メチレン200mlを加え
抽出を行なった。塩化メチレン層を減圧下濃縮し乾固後
直ちに２−ロパノール:n−ヘキサン（1:9）の混合溶媒3
mlに溶解し−20℃で２時間放置し、生じた不溶成分を遠
心分離によって除去した。この上澄液を減圧下濃縮しHP
LC（カラムはゾルバックスSIL（4.6mm×25cm）、移動層
はｎ−ヘキサン:2−プロパノール（86:14）、流速は1.5
ml/min）を行ない、3.8分のピークの画分を集めた。こ
れを40℃以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固し
た。このものは市販の25−ヒドロキシビタミンD3（デュ
ファー社製、オランダ）の標品と比較することによりHP
LCの保持時間、紫外部吸収スペクトル、マススペクトル
開裂パターンが完全に一致することを認めた。
紫外部最大吸収：λmax＝265nm（エタノール） マススペクトル:400（M+）、382（M+−H2O）、271、2
53、136、118、59。
53、136、118、59。
実施例４ 実施例１で用いたBG培地（100ml/500ml容三角フラス
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％PMCD溶液
（0.01Mリン酸バッファー、pH7.0）10mlおよび２％ビタ
ミンD2のエタノール溶液1ml（ビタミンD2 1モルに対し
てPMCD7モルの割合）を添加する、さらに培養を続け、2
4時間、48時間、72時間、96時間、120時間の各時期にお
ける25−ヒドロキシビタミンD2の量を実施例１で述べた
方法により抽出分析し、それぞれ0.5μg/ml、55.6μg/m
l、81.2μg/ml、93.0μg/ml、128.5μg/ml（変換率64
％）の値を得た。なお、このときPMCD無添加の実験区で
は96時間で僅か1.8μg/ml（変換率0.9％）の25−ヒドロ
キシビタミンD2が生成したのみであった。25−ヒドロキ
シビタミンD2のHPLC保持時間は3.7分である。
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％PMCD溶液
（0.01Mリン酸バッファー、pH7.0）10mlおよび２％ビタ
ミンD2のエタノール溶液1ml（ビタミンD2 1モルに対し
てPMCD7モルの割合）を添加する、さらに培養を続け、2
4時間、48時間、72時間、96時間、120時間の各時期にお
ける25−ヒドロキシビタミンD2の量を実施例１で述べた
方法により抽出分析し、それぞれ0.5μg/ml、55.6μg/m
l、81.2μg/ml、93.0μg/ml、128.5μg/ml（変換率64
％）の値を得た。なお、このときPMCD無添加の実験区で
は96時間で僅か1.8μg/ml（変換率0.9％）の25−ヒドロ
キシビタミンD2が生成したのみであった。25−ヒドロキ
シビタミンD2のHPLC保持時間は3.7分である。
実施例５ 実施例１で用いたBG培地（100ml/500ml容三角フラス
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％PMCD溶液
（0.01Mリン酸バッファー、pH7.0）10mlおよび0.1％の
１α−ヒドロキシビタミンD3のエタノール溶液1ml（１
α−ヒドロキシビタミンD3 1モルに対してPMCD140モル
の割合）を添加する。さらに培養を２時間行なった後フ
ラスコに塩化メチレンを加え、実施例３に示した方法に
より分析を行なった。保持時間12分のピークの画分を集
め40℃以下で減圧濃縮し、ゾルバックスODS（米国デュ
ポン社製）を用いたHPLCを行なった。移動層として水：
メタノール（1:9）を用い、流速1.0ml/minで行なった。
溶出後保持時間5.6分のピークの画分を集め40℃以下で
窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固し、１α,25−ジヒ
ドロキシビタミンD3を650μｇ（変換率65％）得た。PMC
Dを添加しない場合には収得量は350μｇ（変換率35％）
であった。
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％PMCD溶液
（0.01Mリン酸バッファー、pH7.0）10mlおよび0.1％の
１α−ヒドロキシビタミンD3のエタノール溶液1ml（１
α−ヒドロキシビタミンD3 1モルに対してPMCD140モル
の割合）を添加する。さらに培養を２時間行なった後フ
ラスコに塩化メチレンを加え、実施例３に示した方法に
より分析を行なった。保持時間12分のピークの画分を集
め40℃以下で減圧濃縮し、ゾルバックスODS（米国デュ
ポン社製）を用いたHPLCを行なった。移動層として水：
メタノール（1:9）を用い、流速1.0ml/minで行なった。
溶出後保持時間5.6分のピークの画分を集め40℃以下で
窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固し、１α,25−ジヒ
ドロキシビタミンD3を650μｇ（変換率65％）得た。PMC
Dを添加しない場合には収得量は350μｇ（変換率35％）
であった。
実施例６ ノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を実施例１
で用いたBG培地（100ml/500ml容三角フラスコ）にて28
℃、72時間振盪培養した。培養液を遠心分離し菌体を集
めpH7.4の0.01Mトリス酢酸バッファー（2mM酢酸マグネ
シウム、7mM 2−メルカプトエタノール、20％グリセリ
ン含有）で１回洗浄後、同じバッファー100mlに懸濁し
た。この懸濁液を超音波（20kHz、50W、２分間）破砕
し、遠心分離（10,000×ｇ、15分間）して上澄液を得
た。この上澄液にポリエチレングリコール6000を最終濃
度25％になるように少しずつ加えて溶解した後、４℃で
10分間放置した。遠心分離により粗酵素沈澱物を得た。
この粗酵素沈澱物の湿重量1gをpH7.4のトリス酢酸バッ
ファー（70mMニコチンアミド、2mM酢酸マグネシウム、1
00mM NADP、5mM ATP、6mMグルコース−６−リン酸を含
む）10mlに懸濁し、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ ５ユニット、20mg/mlのビタミンD3エタノール
溶液0.1mlおよび５％PMCD溶液1ml（ビタミンD3 1モルに
対してPMCD7モルの割合）を加え28℃で１時間撹拌、振
盪して酵素反応を行なった。対照として５％PMCD溶液を
添加しないで同じ操作を行なった。反応終了後メタノー
ル20ml、クロロホルム10mlを加え実施例１と同じ方法で
25−ヒドロキシビタミンD3を定量した。その結果PMCD添
加区では反応液中に25−ヒドロキシビタミンD3が21.0μ
g/ml（変換率10.5％）生成しており、PMCD無添加区では
7.6μg/ml（変換率3.8％）生成していた。
で用いたBG培地（100ml/500ml容三角フラスコ）にて28
℃、72時間振盪培養した。培養液を遠心分離し菌体を集
めpH7.4の0.01Mトリス酢酸バッファー（2mM酢酸マグネ
シウム、7mM 2−メルカプトエタノール、20％グリセリ
ン含有）で１回洗浄後、同じバッファー100mlに懸濁し
た。この懸濁液を超音波（20kHz、50W、２分間）破砕
し、遠心分離（10,000×ｇ、15分間）して上澄液を得
た。この上澄液にポリエチレングリコール6000を最終濃
度25％になるように少しずつ加えて溶解した後、４℃で
10分間放置した。遠心分離により粗酵素沈澱物を得た。
この粗酵素沈澱物の湿重量1gをpH7.4のトリス酢酸バッ
ファー（70mMニコチンアミド、2mM酢酸マグネシウム、1
00mM NADP、5mM ATP、6mMグルコース−６−リン酸を含
む）10mlに懸濁し、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ ５ユニット、20mg/mlのビタミンD3エタノール
溶液0.1mlおよび５％PMCD溶液1ml（ビタミンD3 1モルに
対してPMCD7モルの割合）を加え28℃で１時間撹拌、振
盪して酵素反応を行なった。対照として５％PMCD溶液を
添加しないで同じ操作を行なった。反応終了後メタノー
ル20ml、クロロホルム10mlを加え実施例１と同じ方法で
25−ヒドロキシビタミンD3を定量した。その結果PMCD添
加区では反応液中に25−ヒドロキシビタミンD3が21.0μ
g/ml（変換率10.5％）生成しており、PMCD無添加区では
7.6μg/ml（変換率3.8％）生成していた。
実施例７ バクトソイトン（ディフコ社製）1.5％、コーンスチ
ープリカー0.5％、グルコース1.5％、NaCl 0.5％、CaCO
3 0.2％（pH7.2）からなる培地（BG培地）100mlを500ml
容三角フラスコに入れ120℃、20分間加圧滅菌する。こ
れにノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102（FERM BP
−1573）を一白金耳接種し28℃、230rpmで振盪培養す
る。培養48時間後、５％のβ−シクロデキストリン水溶
液10ml、およびビタミンD3 2％を含む20％ Tween 80の
エタノール溶液を添加し、さらに48時間培養を続ける。
この培養液1mlを共栓付き遠心沈澱管にとり、メタノー
ル2ml、クロロホルム1mlを加え10分間撹拌し、さらにク
ロロホルム1mlおよび蒸留水1ml加え撹拌する。これを3,
000rpm、５分間遠心分離し下層をとる。上層はもう１度
クロロホルム1.5mlを加え抽出する。クロロホルム層を
合併し、エタノール0.1mlを加えて減圧下にて濃縮乾固
した後、ｎ−ヘキサン:2−プロパノール（86:14）の溶
媒200μに溶解し、HPLCの試料液とする。HPLCはゾル
バックスSIL（4.6mm×25cm）のカラムを用い、ｎ−ヘキ
サン:2−プロパノール（86:14）を移動層として流速1.5
ml/minで分析を行なった。
ープリカー0.5％、グルコース1.5％、NaCl 0.5％、CaCO
3 0.2％（pH7.2）からなる培地（BG培地）100mlを500ml
容三角フラスコに入れ120℃、20分間加圧滅菌する。こ
れにノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102（FERM BP
−1573）を一白金耳接種し28℃、230rpmで振盪培養す
る。培養48時間後、５％のβ−シクロデキストリン水溶
液10ml、およびビタミンD3 2％を含む20％ Tween 80の
エタノール溶液を添加し、さらに48時間培養を続ける。
この培養液1mlを共栓付き遠心沈澱管にとり、メタノー
ル2ml、クロロホルム1mlを加え10分間撹拌し、さらにク
ロロホルム1mlおよび蒸留水1ml加え撹拌する。これを3,
000rpm、５分間遠心分離し下層をとる。上層はもう１度
クロロホルム1.5mlを加え抽出する。クロロホルム層を
合併し、エタノール0.1mlを加えて減圧下にて濃縮乾固
した後、ｎ−ヘキサン:2−プロパノール（86:14）の溶
媒200μに溶解し、HPLCの試料液とする。HPLCはゾル
バックスSIL（4.6mm×25cm）のカラムを用い、ｎ−ヘキ
サン:2−プロパノール（86:14）を移動層として流速1.5
ml/minで分析を行なった。
検出は265nmの吸収を計ることによって行なった。そ
の結果、25−ヒドロキシビタミンD3は54.8μg/ml生成し
ており原料からの変換率は約27％であった。
の結果、25−ヒドロキシビタミンD3は54.8μg/ml生成し
ており原料からの変換率は約27％であった。
この培養終了液100mlに塩化メチレン200mlを加え抽出
を行なった。塩化メチレン層を減圧下濃縮し乾固後直ち
に２−プロパノール:n−ヘキサン（1:9）の混合溶媒3ml
に溶解し−20℃で２時間放置し、生じた不溶成分を遠心
分離によって除去した。この上澄液を減圧下濃縮しHPLC
（カラムはゾルバックスSIL（4.6mm×25cm）、移動層は
ｎ−ヘキサン:2−プロパノール（86:14）、流速は1.5ml
/min）を行ない、3.8分のピークの画分を集めた。これ
を40℃以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固した。
このものは市販の25−ヒドロキシビタミンD3（デュファ
ー社製、オランダ）の標品と比較することによりHPLCの
保持時間、紫外部吸収スペクトル、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致することを認めた。
を行なった。塩化メチレン層を減圧下濃縮し乾固後直ち
に２−プロパノール:n−ヘキサン（1:9）の混合溶媒3ml
に溶解し−20℃で２時間放置し、生じた不溶成分を遠心
分離によって除去した。この上澄液を減圧下濃縮しHPLC
（カラムはゾルバックスSIL（4.6mm×25cm）、移動層は
ｎ−ヘキサン:2−プロパノール（86:14）、流速は1.5ml
/min）を行ない、3.8分のピークの画分を集めた。これ
を40℃以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮乾固した。
このものは市販の25−ヒドロキシビタミンD3（デュファ
ー社製、オランダ）の標品と比較することによりHPLCの
保持時間、紫外部吸収スペクトル、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致することを認めた。
紫外部最大吸収：λmax＝265nm（エタノール） マススペクトル:400（M+）、382（M+−H2O）、271、2
53、136、118、59。
53、136、118、59。
実施例８ 実施例１で用いたBG培地を用いて、ノカルディア・オ
ウトトロヒカ Ｎ−102（FERM BP−1573）を実施例１と
同様に48時間培養した後、５％のα−シクロデキストリ
ン水溶液10mlおよびビタミンD3 2％を含む20％ Tween
80のエタノール溶液1mlを添加し、さらに48時間培養を
行なった。この培養液1mlを共栓付き遠心沈澱管にと
り、実施例１と同じ方法で25−ヒドロキシビタミンD3を
定量したところ51.5μg/ml（変換率25.8％）が得られ
た。
ウトトロヒカ Ｎ−102（FERM BP−1573）を実施例１と
同様に48時間培養した後、５％のα−シクロデキストリ
ン水溶液10mlおよびビタミンD3 2％を含む20％ Tween
80のエタノール溶液1mlを添加し、さらに48時間培養を
行なった。この培養液1mlを共栓付き遠心沈澱管にと
り、実施例１と同じ方法で25−ヒドロキシビタミンD3を
定量したところ51.5μg/ml（変換率25.8％）が得られ
た。
実施例９ 実施例１で用いたβ−シクロデキストリンの代わりに
β−ジメチルシクロデキストリン、β−トリメチルシク
ロデキストリン（以上、東進ケミカル社製）、分枝β−
シクロデキストリン（日研化学社製）、部分メチル化シ
クロデキストリン（メルシャン（株）製）、あるいはγ
−シクロデキストリンを用い、Tween 80 0.2重量％を含
む培養液中で、ビタミンD3から25−ヒドロキシビタミン
D3への変換を行なったところ、第１表に示す結果が得ら
れた。
β−ジメチルシクロデキストリン、β−トリメチルシク
ロデキストリン（以上、東進ケミカル社製）、分枝β−
シクロデキストリン（日研化学社製）、部分メチル化シ
クロデキストリン（メルシャン（株）製）、あるいはγ
−シクロデキストリンを用い、Tween 80 0.2重量％を含
む培養液中で、ビタミンD3から25−ヒドロキシビタミン
D3への変換を行なったところ、第１表に示す結果が得ら
れた。
実施例10 実施例７におけるビタミンD3から25−ヒドロキシビタ
ミンD3への変換反応において、Tween 80の代わりにPlur
onic L−62（旭電化（株）製）を用いて実施した結果、
25−ヒドロキシビタミンD3が51.5μg/ml（変換率25.8
％）が得られた。
ミンD3への変換反応において、Tween 80の代わりにPlur
onic L−62（旭電化（株）製）を用いて実施した結果、
25−ヒドロキシビタミンD3が51.5μg/ml（変換率25.8
％）が得られた。
実施例11 実施例７におけるビタミンD3から25−ヒドロキシビタ
ミンD3への変換反応において、Tween 80の代わりにダイ
レックス（日本油脂（株）製）を用いて実施した結果、
25−ヒドロキシビタミンD3が42.5μg/ml（変換率21.2
％）が得られた。
ミンD3への変換反応において、Tween 80の代わりにダイ
レックス（日本油脂（株）製）を用いて実施した結果、
25−ヒドロキシビタミンD3が42.5μg/ml（変換率21.2
％）が得られた。
実施例12 実施例１で用いたBG培地（100ml/500ml容三角フラス
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％ β−シク
ロデキストリン水溶液10mlおよび２％ビタミンD2の20％
Tween 80エタノール溶液1mlを添加し、さらに48時間培
養を続けた。培養終了後、25−ヒドロキシビタミンD2の
量を実施例１で述べた方法により抽出、分析した結果、
55.8μg/ml（変換率27.9％）であった。なお、β−シク
ロデキストリンおよびTween 80の無添加培養では25−ヒ
ドロキシビタミンD2は1.8μg/ml（変換率0.9％）であっ
た。25−ヒドロキシビタミンD2のHPLC保持時間は3.7分
である。
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％ β−シク
ロデキストリン水溶液10mlおよび２％ビタミンD2の20％
Tween 80エタノール溶液1mlを添加し、さらに48時間培
養を続けた。培養終了後、25−ヒドロキシビタミンD2の
量を実施例１で述べた方法により抽出、分析した結果、
55.8μg/ml（変換率27.9％）であった。なお、β−シク
ロデキストリンおよびTween 80の無添加培養では25−ヒ
ドロキシビタミンD2は1.8μg/ml（変換率0.9％）であっ
た。25−ヒドロキシビタミンD2のHPLC保持時間は3.7分
である。
実施例13 実施例１で用いたBG培地（100ml/500ml容三角フラス
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％ β−シク
ロデキストリン溶液（0.01Mリン酸バッファー、pH7.0）
10mlおよび0.1％の１α−ヒドロキシビタミンD3のエタ
ノール溶液1ml（１α−ヒドロキシビタミンD3 1モルに
対してβ−シクロデキストリン140モルの割合）および2
0％Tween 80のエタノール溶液1mlを添加する。さらに培
養を２時間行なった後フラスコに塩化メチレンを加え、
実施例１に示した方法により分析を行なった。保持時間
12分のピークの画分を集め40℃以下で減圧濃縮し、ゾル
バックスODS（米国デュポン社製）を用いたHPLCを行な
った。移動層として水：メタノール（1:9）を用い、流
速1.0ml/minで行なった。溶出後保持時間5.6分のピーク
の画分を集め40℃以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮
乾固し、１α,25−ジヒドロキシビタミンD3を645μｇ
（変換率64.5％）得た。β−シクロデキストリンを添加
しない場合には収得量は350μｇ（変４換率35％）であ
った。
コ）にてノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を28
℃、48時間好気培養し、この培養液中に５％ β−シク
ロデキストリン溶液（0.01Mリン酸バッファー、pH7.0）
10mlおよび0.1％の１α−ヒドロキシビタミンD3のエタ
ノール溶液1ml（１α−ヒドロキシビタミンD3 1モルに
対してβ−シクロデキストリン140モルの割合）および2
0％Tween 80のエタノール溶液1mlを添加する。さらに培
養を２時間行なった後フラスコに塩化メチレンを加え、
実施例１に示した方法により分析を行なった。保持時間
12分のピークの画分を集め40℃以下で減圧濃縮し、ゾル
バックスODS（米国デュポン社製）を用いたHPLCを行な
った。移動層として水：メタノール（1:9）を用い、流
速1.0ml/minで行なった。溶出後保持時間5.6分のピーク
の画分を集め40℃以下で窒素ガス置換しながら減圧濃縮
乾固し、１α,25−ジヒドロキシビタミンD3を645μｇ
（変換率64.5％）得た。β−シクロデキストリンを添加
しない場合には収得量は350μｇ（変４換率35％）であ
った。
実施例14 ノカルディア・オウトトロヒカ Ｎ−102を実施例１
で用いたBG培地（100ml/500ml容三角フラスコ）にて28
℃、72時間振盪培養した。培養液を遠心分離し菌体を集
めpH7.4の0.01Mトリス酢酸バッファー（2mM酢酸マグネ
シウム、7mM 2−メルカプトエタノール、20％グリセリ
ン含有）で１回洗浄後、同じバッファー100mlに懸濁し
た。この懸濁液を超音波（20kHz、50W、２分間）破砕
し、遠心分離（10,000×ｇ、15分間）して上澄液を得
た。この上澄液にポリエチレングリコール6000を最終濃
度25％になるように少しずつ加えて溶解した後、４℃で
10分間放置した。遠心分離により粗酵素沈澱物を得た。
この粗酵素沈澱物の湿重量1gをpH7.4のトリス酢酸バッ
ファー（70mMニコチンアミド、2mM酢酸マグネシウム、1
00mM NADP、5mM ATP、6mMグルコース−６−リン酸を含
む）10mlに懸濁し、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ ５ユニット、20mg/mlのビタミンD3エタノール
溶液0.1mlおよび５％ β−シクロデキストリン溶液1ml
（ビタミンD3 1モルに対してβ−シクロデキストリン７
モルの割合）および20％ Tween 80のエタノール溶液1m
lを加え28℃で１時間撹拌、振盪して酵素反応を行なっ
た。対照として５％ β−シクロデキストリン溶液を添
加しないで同じ操作を行なった。反応終了後メタノール
20ml、クロロホルム10mlを加え実施例１と同じ方法で25
−ヒドロキシビタミンD3を定量した。その結果、β−シ
クロデキストリン添加区では反応液中に25−ヒドロキシ
ビタミンD3が21.0μg/ml（変換率10.5％）生成してお
り、β−シクロデキストリン無添加区では7.6μg/ml
（変換率3.8％）生成していた。
で用いたBG培地（100ml/500ml容三角フラスコ）にて28
℃、72時間振盪培養した。培養液を遠心分離し菌体を集
めpH7.4の0.01Mトリス酢酸バッファー（2mM酢酸マグネ
シウム、7mM 2−メルカプトエタノール、20％グリセリ
ン含有）で１回洗浄後、同じバッファー100mlに懸濁し
た。この懸濁液を超音波（20kHz、50W、２分間）破砕
し、遠心分離（10,000×ｇ、15分間）して上澄液を得
た。この上澄液にポリエチレングリコール6000を最終濃
度25％になるように少しずつ加えて溶解した後、４℃で
10分間放置した。遠心分離により粗酵素沈澱物を得た。
この粗酵素沈澱物の湿重量1gをpH7.4のトリス酢酸バッ
ファー（70mMニコチンアミド、2mM酢酸マグネシウム、1
00mM NADP、5mM ATP、6mMグルコース−６−リン酸を含
む）10mlに懸濁し、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ ５ユニット、20mg/mlのビタミンD3エタノール
溶液0.1mlおよび５％ β−シクロデキストリン溶液1ml
（ビタミンD3 1モルに対してβ−シクロデキストリン７
モルの割合）および20％ Tween 80のエタノール溶液1m
lを加え28℃で１時間撹拌、振盪して酵素反応を行なっ
た。対照として５％ β−シクロデキストリン溶液を添
加しないで同じ操作を行なった。反応終了後メタノール
20ml、クロロホルム10mlを加え実施例１と同じ方法で25
−ヒドロキシビタミンD3を定量した。その結果、β−シ
クロデキストリン添加区では反応液中に25−ヒドロキシ
ビタミンD3が21.0μg/ml（変換率10.5％）生成してお
り、β−シクロデキストリン無添加区では7.6μg/ml
（変換率3.8％）生成していた。
実施例15 実施例１で用いたBG培地にて、ノルカディア・オウト
トロヒカ Ｎ−102（FERM BP−1573）を生育させ、その
1mlをTM−１培地（グルコース２％、酵母エキス0.2％、
ペプトン（極東製薬工業（株）製）0.5％、コーンスチ
ープリカー（粉末）0.5％、脱脂大豆粉1.0％、K2HPO4
0.04％、NaCl 0.4％、pH7.0）25mlを入れた250ml容三角
フラスコに植菌し、28℃で48時間培養した。このフラス
コ中に２％ ビタミンD3のエタノール溶液0.25ml、およ
び界面活性剤Pluronic L−62および５％ シクロデキス
トリン類0.5〜1.0mlを加え、さらに90時間振盪培養を行
ない、培養液中に生成した1a,25−ジヒドロキシビタミ
ンD3を実施例５に示した方法で分析し、第２表に示す結
果を得た。
トロヒカ Ｎ−102（FERM BP−1573）を生育させ、その
1mlをTM−１培地（グルコース２％、酵母エキス0.2％、
ペプトン（極東製薬工業（株）製）0.5％、コーンスチ
ープリカー（粉末）0.5％、脱脂大豆粉1.0％、K2HPO4
0.04％、NaCl 0.4％、pH7.0）25mlを入れた250ml容三角
フラスコに植菌し、28℃で48時間培養した。このフラス
コ中に２％ ビタミンD3のエタノール溶液0.25ml、およ
び界面活性剤Pluronic L−62および５％ シクロデキス
トリン類0.5〜1.0mlを加え、さらに90時間振盪培養を行
ない、培養液中に生成した1a,25−ジヒドロキシビタミ
ンD3を実施例５に示した方法で分析し、第２表に示す結
果を得た。
実施例16 アミコラータ・オウトトロヒカ ATCC 19727、ATCC 1
3181、ATCC 33794、ATCC 33795、ATCC 33796、ATCC 337
97、JMC 4010、アミコラータ・ヒドロカルボンオキシダ
ンス IFO 14498、アミコラータ・サツルネア FERM B
P−2307およびIFO 14499をそれぞれ実施例15で用いたTM
−１培地（50ml/500ml容三角フラスコ）にて28℃で48時
間培養した。このフラスコ中に２％ビタミンD3のエタノ
ール溶液0.5ml、および界面活性剤Pluronic Ｌ−62お
よび５％β−シクロデキストリン1.0mlを加え、さらに7
2時間振盪培養を行なった。培養液中に生成した、25−
ヒドロキシビタミンD3および１α,25−ジヒドロキシビ
タミンD3を実施例１および５に示した方法で分析し、第
３表に示す結果を得た。なお、対照群（シクロデキスト
リン無添加群）の結果を第４表に挙げる。
3181、ATCC 33794、ATCC 33795、ATCC 33796、ATCC 337
97、JMC 4010、アミコラータ・ヒドロカルボンオキシダ
ンス IFO 14498、アミコラータ・サツルネア FERM B
P−2307およびIFO 14499をそれぞれ実施例15で用いたTM
−１培地（50ml/500ml容三角フラスコ）にて28℃で48時
間培養した。このフラスコ中に２％ビタミンD3のエタノ
ール溶液0.5ml、および界面活性剤Pluronic Ｌ−62お
よび５％β−シクロデキストリン1.0mlを加え、さらに7
2時間振盪培養を行なった。培養液中に生成した、25−
ヒドロキシビタミンD3および１α,25−ジヒドロキシビ
タミンD3を実施例１および５に示した方法で分析し、第
３表に示す結果を得た。なお、対照群（シクロデキスト
リン無添加群）の結果を第４表に挙げる。
実施例17 アミコラータ・オウトトロヒカ ATCC 33797を実施例
15で用いたTM−１培地（50ml/100ml容三角フラスコ）に
て28℃、48時間培養した。このフラスコ中に２％ビタミ
ンD3のエタノール溶液0.5ml、および界面活性剤Pluroni
c Ｌ−62および５％シクロデキストリン類の単独また
は混合したものを1.0〜2.0ml加え、さらに96時間振盪培
養を行なった。培養液中に生成した、25−ヒドロキシビ
タミンD3および１α,25−ジヒドロキシビタミンD3を実
施例１および５に示した方法で分析し、第５表に示す結
果を得た。
15で用いたTM−１培地（50ml/100ml容三角フラスコ）に
て28℃、48時間培養した。このフラスコ中に２％ビタミ
ンD3のエタノール溶液0.5ml、および界面活性剤Pluroni
c Ｌ−62および５％シクロデキストリン類の単独また
は混合したものを1.0〜2.0ml加え、さらに96時間振盪培
養を行なった。培養液中に生成した、25−ヒドロキシビ
タミンD3および１α,25−ジヒドロキシビタミンD3を実
施例１および５に示した方法で分析し、第５表に示す結
果を得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡本 六郎 神奈川県藤沢市花の木２―18 (72)発明者 佐々木 冗二 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正 製薬株式会社内 (72)発明者 安達 孝 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正 製薬株式会社内 (72)発明者 大村 貞文 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正 製薬株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 1/00 - 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (12)
- 【請求項１】ビタミンＤ類を水酸化する能力を有する放
線菌菌体またはその産生する酵素を含有する溶液中に、
25位に水素原子を有するビタミンＤ類を添加して該水素
原子を水酸基を変換することによる25−ヒドロキシビタ
ミンＤ類の製造方法において、前記溶液中にシクロデキ
ストリン類を共存させることにより水酸基への変換効率
を高めたことを特徴とする25−ヒドロキシビタミンＤ類
の生物学的製造方法。 - 【請求項２】ビタミンＤ類を水酸化する能力を有する放
線菌菌体またはその産生する酵素を含有する溶液中に、
１α位および25位に水素原子を有するビタミンＤ類を添
加して前記１α位および25位の水素原子を水酸基を変換
することによる１α,25−ジヒドロキシビタミンＤ類の
製造方法において、前記溶液中にシクロデキストリン類
を共存させることにより水酸基への変換効率を高めたこ
とを特徴とする１α,25−ジヒドロキシビタミンＤ類の
生物学的製造方法。 - 【請求項３】ビタミンＤ類を水酸化する能力を有する放
線菌菌体またはその産生する酵素を含有する溶液中に、
１α位に水素原子を有する25−ヒドロキシビタミンＤ類
を添加して該水素原子を水酸基を変換することによる１
α,25−ジヒドロキシビタミンＤ類の製造方法におい
て、前記溶液中にシクロデキストリン類を共存させるこ
とにより水酸基への変換効率を高めたことを特徴とする
１α,25−ジヒドロキシビタミンＤ類の生物学的製造方
法。 - 【請求項４】シクロデキストリン類溶液とビタミンＤ類
を混合した後、これを基質としてビタミンＤ類を水酸化
する放線菌菌体またはその産生する酵素を含有する溶液
中に加える請求項第１項、第２項または第３項記載の製
造方法。 - 【請求項５】ビタミンＤ類の生物学的変換反応の開始
前、開始時または開始後にシクロデキストリン類を反応
液に加える請求項第１項、第２項または第３項記載の製
造方法。 - 【請求項６】シクロデキストリン類がシクロデキストリ
ンの混合物である請求項第５項に記載の製造方法。 - 【請求項７】ビタミンＤ類の生物学的反応液中に界面活
性剤を共存させる請求項第１項、第２項または第３項記
載の製造方法。 - 【請求項８】ビタミンＤ類の生物学的反応液中に共存さ
せるシクロデキストリン類の量が、ビタミンＤ類１モル
に対して１〜1000モルである請求項第１項、第２項また
は第３項記載の製造方法。 - 【請求項９】ビタミンＤ類の生物学的反応液中に共存さ
せる界面活性剤が培地中0.01〜５重量％である請求項第
１項、第２項または第３項記載の製造方法。 - 【請求項１０】ビタミンＤ類としてビタミンD3を使用
し、25−ヒドロキシビタミンD3を得る請求項第１項およ
び第４項ないし第９項のいずれかの項に記載の製造方
法。 - 【請求項１１】ビタミンＤ類としてビタミンD3を使用
し、１α,25−ジヒドロキシビタミンD3を得る請求項第
２項および第４項ないし第９項のいずれかの項に記載の
製造方法。 - 【請求項１２】ビタミンＤ類として25−ヒドロキシビタ
ミンD3を使用し、１α,25−ジヒドロキシビタミンD3を
得る請求項第３項ないし第９項のいずれかの項に記載の
製造方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33428390A JP3201411B2 (ja) | 1990-06-15 | 1990-11-30 | ビタミンｄ類の生物学的製造方法 |
| US07/711,988 US5474923A (en) | 1990-06-15 | 1991-06-07 | Method for the biological preparation of hydroxyvitamin D compounds |
| TW080104561A TW234147B (ja) | 1990-06-15 | 1991-06-11 | |
| CA002044550A CA2044550C (en) | 1990-06-15 | 1991-06-13 | Method for the biological preparation of hydroxyvitamin d compounds |
| EP91305415A EP0461921B1 (en) | 1990-06-15 | 1991-06-14 | Method for the biological preparation of hydroxyvitamin D compounds |
| ES91305415T ES2079573T3 (es) | 1990-06-15 | 1991-06-14 | Metodo para la preparacion biologica de compuestos hidroxivitamina d. |
| DE69112716T DE69112716T2 (de) | 1990-06-15 | 1991-06-14 | Verfahren zur biologischen Herstellung einer Hydroxyvitamin-D-Verbindung. |
| AT91305415T ATE127523T1 (de) | 1990-06-15 | 1991-06-14 | Verfahren zur biologischen herstellung einer hydroxyvitamin-d-verbindung. |
| KR1019910009817A KR100190412B1 (ko) | 1990-06-15 | 1991-06-14 | 히드록시 비타민 d화합물의 생물학적 제조방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-157054 | 1990-06-15 | ||
| JP15705490 | 1990-06-15 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04166090A JPH04166090A (ja) | 1992-06-11 |
| JP3201411B2 true JP3201411B2 (ja) | 2001-08-20 |
Family
ID=26484632
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| EP (1) | EP0461921B1 (ja) |
| JP (1) | JP3201411B2 (ja) |
| KR (1) | KR100190412B1 (ja) |
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| CA (1) | CA2044550C (ja) |
| DE (1) | DE69112716T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2007105773A1 (ja) | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Mercian Corporation | インデン誘導体の製造方法およびその製造中間体 |
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| AU4357493A (en) * | 1992-06-25 | 1994-01-24 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | Vitamin d hydroxylase gene |
| US6146844A (en) * | 1995-08-28 | 2000-11-14 | Mercian Corporation | Process for producing hydroxylated cholesterols and dihydroxycholesterols using amycolata |
| EP1172442A4 (en) * | 1999-04-14 | 2004-10-13 | Mercian Corp | VITAMIN D DERIVATIVES AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
| MXPA04005260A (es) * | 2001-12-03 | 2005-03-23 | Novacea Inc | Composiciones farmaceuticas que comprenden compuestos activos de vitamina d. |
| US20040058895A1 (en) * | 2002-09-18 | 2004-03-25 | Bone Care International, Inc. | Multi-use vessels for vitamin D formulations |
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| WO2005073223A1 (ja) * | 2004-01-29 | 2005-08-11 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | マクロライド系化合物の安定化方法 |
| BRPI0922462B8 (pt) * | 2008-12-19 | 2021-05-25 | Ildong Pharm Co Ltd | composição tampão para catalisar a preparação de calcitriol ou calcifediol e método para a preparação de calcitriol ou calcifediol usando a mesma |
| WO2020166962A2 (ko) | 2019-02-12 | 2020-08-20 | 아주대학교산학협력단 | 적포도잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 이명의 예방 또는 치료용 조성물 |
| CN117625566A (zh) * | 2023-12-01 | 2024-03-01 | 四川润格生物科技有限公司 | 一种提高酶催化效率的制剂及其应用 |
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|---|---|---|---|---|
| US4307025A (en) * | 1981-02-17 | 1981-12-22 | Wisconsin Alumni Research Foundation | 1α, 25-dihydroxy-2β-fluorovitamin D3 |
| JPH0717686B2 (ja) * | 1986-08-08 | 1995-03-01 | メルシャン株式会社 | 部分メチル化シクロデキストリン及びその製造方法 |
| US4892821A (en) * | 1987-07-08 | 1990-01-09 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | Method for preparing vitamin D compounds |
| JP2663294B2 (ja) * | 1989-03-04 | 1997-10-15 | メルシャン株式会社 | ビタミンｄ類の製造方法 |
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-
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-
1991
- 1991-06-07 US US07/711,988 patent/US5474923A/en not_active Expired - Lifetime
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- 1991-06-14 ES ES91305415T patent/ES2079573T3/es not_active Expired - Lifetime
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