JPH0464678B2 - - Google Patents
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- JPH0464678B2 JPH0464678B2 JP63108337A JP10833788A JPH0464678B2 JP H0464678 B2 JPH0464678 B2 JP H0464678B2 JP 63108337 A JP63108337 A JP 63108337A JP 10833788 A JP10833788 A JP 10833788A JP H0464678 B2 JPH0464678 B2 JP H0464678B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vitamin
- manufactured
- ultraviolet absorption
- elution
- liquid chromatography
- Prior art date
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- Expired
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
産業上の利用分野
本発明は、ヒドロキシビタミンＤ類の微生物を
利用する製造方法に関する。 従来の技術 有機化学的方法によりビタミンＤ類の1α及
び／又は25位に直接水酸基を導入することは極め
て困難で、その例は未だ報告されていない。 また、微生物を用いた酵素化学的方法によりビ
タミンＤ類に直接水酸基を導入する方法も、これ
までに報告されていない。 一方、動物臓器を用いた酵素化学的方法により
原料のビタミンＤ類の1α及び／又は25位に直接
水酸基を導入することは、従来から可能であつ
た。すなわち、1α位に直接水酸基を導入する場
合、ニワトリなどの動物の腎のホモジネートやミ
トコンドリア画分を用いる方法〔ネーチヤー
（Nature）、第230巻、第228頁（1971年）、ジヤー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.
Biolog.Chem.）、第247巻、第7528頁（1972年）、
バイオケミストリー（Biochemistry）、第25巻、
第5512頁（1986年）など〕が知られている。ま
た、25位に直接水酸基を導入する場合、ラツトな
どの動物の単離した肝臓にビタミンＤ類を含む溶
液を潅流させる方法〔ジヤーナル オブ クリニ
カルインベステイゲーシヨン（J.Clin.Invest.）、
第48巻、第2032頁（1969年）、バイオケミカル
アンド バイオフイジカル リサーチ コミユニ
ケーシヨン（Biochem.Biophys.Res.Commun.）
第66巻、第632頁（1975年）〕やラツトなどの動物
の肝のホモジネートを用いる方法〔バイオケミカ
ル アンド バイオフイジカル リサーチ コミ
ユニケーシヨン（Biochem.Biophys.Res.
Commun.）、第36巻、第251頁（1969年）〕が知ら
れている。 発明が解決しようとする課題 しかしながら、動物臓器を用いた酵素化学的方
法では、多量の動物の腎又は肝が必要であり、し
かもその調製に手間がかかり、非効率的で実用的
製造法ではない。 本発明は、より容な操作による1α−及び／又
は25−ヒドロキシビタミンＤ類を得る方法を提供
することを目的とする。 課題を解決するための手段 本発明者らは、特定の微生物を利用することに
より、ビタミンＤ類の1α及び／又は25位に直接
水酸基を導入できることを見出し、本発明を完成
した。 本発明は、ビタミンＤ類を水酸基するストレプ
トマイセス属もしくはノカルジア属に属する放線
菌又はその産生する酵素を含有する溶液中に1α
又は25位に水素原子を有するビタミンＤ類を加え
て、それぞれその水素原子を水酸基に変換するこ
とをを特徴とする1α−ヒドロキシビタミンＤ類
又は25−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法、並
びにビタミンＤ類を水酸化する放線菌菌体又はそ
の産生する酵素を含有する溶液中に1α及び25位
に水素原子を有するビタミンＤ類を加えて、その
水素原子を水酸基に変換することを特徴とする25
−ヒドロキシビタミンＤ類又は1α，25−ジヒド
ロキシビタミンＤ類の製造方法である。すなわ
ち、本発明によれば、1α位又は25位に水素原子
を有するビタミンＤ類は、それぞれその水素原子
が水酸基に変換され、1α及び25位に水素原子を
有するビタミンＤ類は、まずその25位水素原子が
水酸基に変換され、次いで、1α位が水酸基に変
換される。 本発明の製造方法は、ビタミンＤ類の1α及
び／又は25位に直接、１工程で水酸基を導入する
方法であり、1α又は25位以外にいずれの置換基
を有していてもよい。従つて、本発明においてビ
タミンＤ類とは、たとえば、ビタミンD2系及び
ビタミンD3系の化合物であり、その17位側鎖の
水素原子又は水酸基がフツ素などのハロゲン原
子、水酸基、低級アルキル基などで置換されてい
てもよい。原料のビタミンＤ類の1α又は25位は、
これが水素原子以外のときは水酸基であることが
好ましい。それらは、たとえば、ビタミンD2、
ビタミンD3、1α−ヒドロキシビタミンD3、1α，
24−ジヒドロキシビタミンD3、25−ヒドロキシ
ビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2、24，
25−ジヒドロキシビタミンD3、23，25−ジヒド
ロキシビタミンD3、25，26−ジヒドロキシビタ
ミンD3、23，24，25−トリヒドロキシビタミン
D3、24，25−ジフルオロ−25−ヒドロキシ−26，
27−ジメチルビタミンD3、、25−ヒドロキシ−
26，26，26，27，27，27−ヘキサフルオロビタミ
ンD3などである。 本発明に使用される放線菌としては、たとえ
ば、本発明者らが埼玉県大宮市の土壌より新たに
分離した菌株であり、微生物の名称及び記号「ス
トレプトマイセス・スクレロチアラスＴ−JS1
（Streptomyces sclerotialus Ｔ−JS1）」及び
「微生物の保管受託番号第1370号（FERM BP−
1370）」として工業技術院微生物工業研究所に寄
託されているもの、本発明者らが山梨県都留郡鳥
沢村の土壌より新たに分離した菌株であり、微生
物の名称「ストレプトマイセス・ロゼオスポラス
Ａ−5797（Streptomyces roseosporus Ａ−
5797）」及び「微生物の保管受託番号第1574号
（FERM BP−1574）」として工業技術院微生物
工業研究所に寄託されているもの、又は、本発明
者らが埼玉県大宮市の土壌より新たに分離した菌
株であり、微生物の名称「ノカルジア・オウトト
ロヒカＮ−102（Nocardia autotrophica Ｎ−
102）」及び「微生物の保管受託番号第1573号
（FERM BP−1573）」として工業技術院微生物
工業研究所に寄託されているものがある。 これらの菌株の菌学的性状を以下に示す。 ａ ストレプトマイセス・スクレロチアラス Ｔ
−JS1 １） 形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地にお
いて分岐しながらよく発達する。気菌糸はイース
ト麦芽寒天培地、オートミール寒天培地、スター
チ無機寒天培地、グリセリン・アスペラギン寒天
培地でわずかに形成される。胞子形成菌糸の分岐
方法は単純分岐で螺旋状の胞子連鎖形態を呈す
る。胞子は通常10個以上の連鎖が認められ表面は
平滑である。胞子の形状は楕円形で、その大きさ
は0.57〜1.0×0.64〜1.4μｍである。螺旋状の胞子
連鎖はスターチ・無機塩寒天培地で最もよく発達
する。栄養菌糸には菌核が観察される。また、イ
ースト麦芽寒天培地で２週間培養した場合には胞
子のうに類似した形態を呈する胞子の集束が観察
される。べん毛胞子は観察されない。 ２） 培地上での生育状態 各種培地で28℃、14日間培養したときの肉眼的
観察結果を第１表に示す。
利用する製造方法に関する。 従来の技術 有機化学的方法によりビタミンＤ類の1α及
び／又は25位に直接水酸基を導入することは極め
て困難で、その例は未だ報告されていない。 また、微生物を用いた酵素化学的方法によりビ
タミンＤ類に直接水酸基を導入する方法も、これ
までに報告されていない。 一方、動物臓器を用いた酵素化学的方法により
原料のビタミンＤ類の1α及び／又は25位に直接
水酸基を導入することは、従来から可能であつ
た。すなわち、1α位に直接水酸基を導入する場
合、ニワトリなどの動物の腎のホモジネートやミ
トコンドリア画分を用いる方法〔ネーチヤー
（Nature）、第230巻、第228頁（1971年）、ジヤー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.
Biolog.Chem.）、第247巻、第7528頁（1972年）、
バイオケミストリー（Biochemistry）、第25巻、
第5512頁（1986年）など〕が知られている。ま
た、25位に直接水酸基を導入する場合、ラツトな
どの動物の単離した肝臓にビタミンＤ類を含む溶
液を潅流させる方法〔ジヤーナル オブ クリニ
カルインベステイゲーシヨン（J.Clin.Invest.）、
第48巻、第2032頁（1969年）、バイオケミカル
アンド バイオフイジカル リサーチ コミユニ
ケーシヨン（Biochem.Biophys.Res.Commun.）
第66巻、第632頁（1975年）〕やラツトなどの動物
の肝のホモジネートを用いる方法〔バイオケミカ
ル アンド バイオフイジカル リサーチ コミ
ユニケーシヨン（Biochem.Biophys.Res.
Commun.）、第36巻、第251頁（1969年）〕が知ら
れている。 発明が解決しようとする課題 しかしながら、動物臓器を用いた酵素化学的方
法では、多量の動物の腎又は肝が必要であり、し
かもその調製に手間がかかり、非効率的で実用的
製造法ではない。 本発明は、より容な操作による1α−及び／又
は25−ヒドロキシビタミンＤ類を得る方法を提供
することを目的とする。 課題を解決するための手段 本発明者らは、特定の微生物を利用することに
より、ビタミンＤ類の1α及び／又は25位に直接
水酸基を導入できることを見出し、本発明を完成
した。 本発明は、ビタミンＤ類を水酸基するストレプ
トマイセス属もしくはノカルジア属に属する放線
菌又はその産生する酵素を含有する溶液中に1α
又は25位に水素原子を有するビタミンＤ類を加え
て、それぞれその水素原子を水酸基に変換するこ
とをを特徴とする1α−ヒドロキシビタミンＤ類
又は25−ヒドロキシビタミンＤ類の製造方法、並
びにビタミンＤ類を水酸化する放線菌菌体又はそ
の産生する酵素を含有する溶液中に1α及び25位
に水素原子を有するビタミンＤ類を加えて、その
水素原子を水酸基に変換することを特徴とする25
−ヒドロキシビタミンＤ類又は1α，25−ジヒド
ロキシビタミンＤ類の製造方法である。すなわ
ち、本発明によれば、1α位又は25位に水素原子
を有するビタミンＤ類は、それぞれその水素原子
が水酸基に変換され、1α及び25位に水素原子を
有するビタミンＤ類は、まずその25位水素原子が
水酸基に変換され、次いで、1α位が水酸基に変
換される。 本発明の製造方法は、ビタミンＤ類の1α及
び／又は25位に直接、１工程で水酸基を導入する
方法であり、1α又は25位以外にいずれの置換基
を有していてもよい。従つて、本発明においてビ
タミンＤ類とは、たとえば、ビタミンD2系及び
ビタミンD3系の化合物であり、その17位側鎖の
水素原子又は水酸基がフツ素などのハロゲン原
子、水酸基、低級アルキル基などで置換されてい
てもよい。原料のビタミンＤ類の1α又は25位は、
これが水素原子以外のときは水酸基であることが
好ましい。それらは、たとえば、ビタミンD2、
ビタミンD3、1α−ヒドロキシビタミンD3、1α，
24−ジヒドロキシビタミンD3、25−ヒドロキシ
ビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2、24，
25−ジヒドロキシビタミンD3、23，25−ジヒド
ロキシビタミンD3、25，26−ジヒドロキシビタ
ミンD3、23，24，25−トリヒドロキシビタミン
D3、24，25−ジフルオロ−25−ヒドロキシ−26，
27−ジメチルビタミンD3、、25−ヒドロキシ−
26，26，26，27，27，27−ヘキサフルオロビタミ
ンD3などである。 本発明に使用される放線菌としては、たとえ
ば、本発明者らが埼玉県大宮市の土壌より新たに
分離した菌株であり、微生物の名称及び記号「ス
トレプトマイセス・スクレロチアラスＴ−JS1
（Streptomyces sclerotialus Ｔ−JS1）」及び
「微生物の保管受託番号第1370号（FERM BP−
1370）」として工業技術院微生物工業研究所に寄
託されているもの、本発明者らが山梨県都留郡鳥
沢村の土壌より新たに分離した菌株であり、微生
物の名称「ストレプトマイセス・ロゼオスポラス
Ａ−5797（Streptomyces roseosporus Ａ−
5797）」及び「微生物の保管受託番号第1574号
（FERM BP−1574）」として工業技術院微生物
工業研究所に寄託されているもの、又は、本発明
者らが埼玉県大宮市の土壌より新たに分離した菌
株であり、微生物の名称「ノカルジア・オウトト
ロヒカＮ−102（Nocardia autotrophica Ｎ−
102）」及び「微生物の保管受託番号第1573号
（FERM BP−1573）」として工業技術院微生物
工業研究所に寄託されているものがある。 これらの菌株の菌学的性状を以下に示す。 ａ ストレプトマイセス・スクレロチアラス Ｔ
−JS1 １） 形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地にお
いて分岐しながらよく発達する。気菌糸はイース
ト麦芽寒天培地、オートミール寒天培地、スター
チ無機寒天培地、グリセリン・アスペラギン寒天
培地でわずかに形成される。胞子形成菌糸の分岐
方法は単純分岐で螺旋状の胞子連鎖形態を呈す
る。胞子は通常10個以上の連鎖が認められ表面は
平滑である。胞子の形状は楕円形で、その大きさ
は0.57〜1.0×0.64〜1.4μｍである。螺旋状の胞子
連鎖はスターチ・無機塩寒天培地で最もよく発達
する。栄養菌糸には菌核が観察される。また、イ
ースト麦芽寒天培地で２週間培養した場合には胞
子のうに類似した形態を呈する胞子の集束が観察
される。べん毛胞子は観察されない。 ２） 培地上での生育状態 各種培地で28℃、14日間培養したときの肉眼的
観察結果を第１表に示す。
【表】
３） 生理的性質
(1) 生育温度範囲
スターチ・無機塩寒天培地上において25〜
35℃の範囲で良好に生育する。 10℃以下、45℃以上の温度範囲では生育し
ない。 (2) 生化学的性質 ａ） 好気性、嫌気性の区別； 好気性 ｂ） ゼラチンの液化； 陽性 ｃ） 脱脂乳の凝固； 陰性 ｄ） 脱脂乳のペプトン化； 陽性 ｅ） スターチの加水分解； 陽性 ｆ） メラニン様色素生成； 陰性 (3) 炭素源の利用 （プリドハム・ゴドリーブ寒天培地） 以下の炭素源すべてを利用する。 Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、 イノシトール、ガラクトース、スターチ、 シユクロース、ラムノース、 Ｄ−マンニツト、Ｌ−アラビノース、 Ｄ−キシロース、ラフイノース 以上の性状から本菌株が放線菌に属すること
は明らかであり、上記諸性状をI.S.P.「インターナ
シヨナル・ストレプトマイセス・プロジエクト」、
バージー著「マニユアル・オブ・デイターミナテ
イブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）及び
ワツクスマン著「ジ・アクチノミセテス」第２巻
（1961年）に報告されている多くの既知菌種と比
較した結果、本菌株はストレプトマイセス・スク
レロチアラスに最も近い性状を示していた。 以上の結果より、本菌株はストレプトマイセ
ス・スクレロチアラスと種を同じくするものと判
断し、本菌株はストレプトマイセス・スクレロチ
アラスＴ−JS1と命名した。 ｂ ストレプトマイセス・ロゼオスポラス Ａ−
5797 １） 形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地にお
いてよく発達し、不規則的に分岐する。また隔壁
は認められない。胞子はグリセリン・アスパラギ
ン寒天培地、スターチ無機塩寒天培地及びオート
ミール寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡
で観察すると胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐
で胞子は直鎖状に形成される。胞子は通常10個以
上の連鎖が認められ、培養の後期には長い鎖状を
呈し、表面は平滑である。胞子の形状は楕円形
で、その大きさは0.67〜0.75×1.30〜1.58μｍであ
る。菌核、胞子のう、べん毛胞子は観察されな
い。 ２） 培地上での生育状態 各種培地で30℃、14日間培養したときの肉眼的
観察結果を第２表に示す。
35℃の範囲で良好に生育する。 10℃以下、45℃以上の温度範囲では生育し
ない。 (2) 生化学的性質 ａ） 好気性、嫌気性の区別； 好気性 ｂ） ゼラチンの液化； 陽性 ｃ） 脱脂乳の凝固； 陰性 ｄ） 脱脂乳のペプトン化； 陽性 ｅ） スターチの加水分解； 陽性 ｆ） メラニン様色素生成； 陰性 (3) 炭素源の利用 （プリドハム・ゴドリーブ寒天培地） 以下の炭素源すべてを利用する。 Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、 イノシトール、ガラクトース、スターチ、 シユクロース、ラムノース、 Ｄ−マンニツト、Ｌ−アラビノース、 Ｄ−キシロース、ラフイノース 以上の性状から本菌株が放線菌に属すること
は明らかであり、上記諸性状をI.S.P.「インターナ
シヨナル・ストレプトマイセス・プロジエクト」、
バージー著「マニユアル・オブ・デイターミナテ
イブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）及び
ワツクスマン著「ジ・アクチノミセテス」第２巻
（1961年）に報告されている多くの既知菌種と比
較した結果、本菌株はストレプトマイセス・スク
レロチアラスに最も近い性状を示していた。 以上の結果より、本菌株はストレプトマイセ
ス・スクレロチアラスと種を同じくするものと判
断し、本菌株はストレプトマイセス・スクレロチ
アラスＴ−JS1と命名した。 ｂ ストレプトマイセス・ロゼオスポラス Ａ−
5797 １） 形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地にお
いてよく発達し、不規則的に分岐する。また隔壁
は認められない。胞子はグリセリン・アスパラギ
ン寒天培地、スターチ無機塩寒天培地及びオート
ミール寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡
で観察すると胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐
で胞子は直鎖状に形成される。胞子は通常10個以
上の連鎖が認められ、培養の後期には長い鎖状を
呈し、表面は平滑である。胞子の形状は楕円形
で、その大きさは0.67〜0.75×1.30〜1.58μｍであ
る。菌核、胞子のう、べん毛胞子は観察されな
い。 ２） 培地上での生育状態 各種培地で30℃、14日間培養したときの肉眼的
観察結果を第２表に示す。
【表】
【表】
３） 生理的性質
(1) 生育温度範囲
オートミール寒天培地上において20〜30℃の
範囲で良好に生育する。 10℃以下、40℃以上の温度範囲では生育しな
い。 (2) 生化学的性質 ａ） 好気性、嫌気性の区別； 好気性 ｂ） ゼラチンの液化； 陽性 ｃ） 脱脂乳の凝固； 陰性 ｄ） 脱脂乳のペプトン化； 陽性 ｅ） スターチの加水分解； 陽性 ｆ） メラニン様色素生成； 陰性 ｇ） 細胞源タイプ； Ｉ型 (3) 炭素源の利用 （プリドハム・ゴドリーブ寒天培地） 利用する：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース わずかに利用する：Ｄ−フラクトース、ラムノ
ース 利用しない：シユクロース、イノシトール、ラ
フイノース、Ｄ−マンニツト 以上の性状から本菌株が放線菌に属すること
は明らかであり、上記諸性状をI.S.P.「インターナ
シヨナル・ストレプトマイセス・プロジエクト」、
バージー著「マニユアル・オブ・デイターミナテ
イブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）及び
ワツクスマン著「ジ・アクチノミセテス」第２巻
（1961年）に報告されている多くの既知菌種と比
較した結果、本菌株はストレプトマイセス・ロゼ
オスポラスに最も近い性状を示していた。 以上の結果より、本菌株はストレプトマイセ
ス・ロゼオスプポラスと種を同じくするものと判
断し、本菌株はストレプトマイセス・ロゼオスポ
ラスＡ−5797と命名した。 c.ノカルジア・オウトトロヒカＮ−102 １） 形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地にお
いてよく発達し、不規則的に分岐する。また隔壁
は認められない。胞子はグリセリン・アスパラギ
ン寒天培地及びスターチ無機寒天培地などで良好
に形成される。顕微鏡で観察すると胞子形成菌糸
の分岐方法は単純分岐で胞子は直鎖状に形成され
る。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ、培養
の後期には長い鎖状を呈し、表面は平滑である。
胞子の形状は円筒形で、その大きさは0.5〜0.8×
2.5〜4.3μｍである。菌核、胞子のう、べん毛胞
子は観察されない。 ２） 培地上での生育状態 各種培地で30℃、14日間培養したときの肉眼的
観察結果を第３表に示す。
範囲で良好に生育する。 10℃以下、40℃以上の温度範囲では生育しな
い。 (2) 生化学的性質 ａ） 好気性、嫌気性の区別； 好気性 ｂ） ゼラチンの液化； 陽性 ｃ） 脱脂乳の凝固； 陰性 ｄ） 脱脂乳のペプトン化； 陽性 ｅ） スターチの加水分解； 陽性 ｆ） メラニン様色素生成； 陰性 ｇ） 細胞源タイプ； Ｉ型 (3) 炭素源の利用 （プリドハム・ゴドリーブ寒天培地） 利用する：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース わずかに利用する：Ｄ−フラクトース、ラムノ
ース 利用しない：シユクロース、イノシトール、ラ
フイノース、Ｄ−マンニツト 以上の性状から本菌株が放線菌に属すること
は明らかであり、上記諸性状をI.S.P.「インターナ
シヨナル・ストレプトマイセス・プロジエクト」、
バージー著「マニユアル・オブ・デイターミナテ
イブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）及び
ワツクスマン著「ジ・アクチノミセテス」第２巻
（1961年）に報告されている多くの既知菌種と比
較した結果、本菌株はストレプトマイセス・ロゼ
オスポラスに最も近い性状を示していた。 以上の結果より、本菌株はストレプトマイセ
ス・ロゼオスプポラスと種を同じくするものと判
断し、本菌株はストレプトマイセス・ロゼオスポ
ラスＡ−5797と命名した。 c.ノカルジア・オウトトロヒカＮ−102 １） 形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地にお
いてよく発達し、不規則的に分岐する。また隔壁
は認められない。胞子はグリセリン・アスパラギ
ン寒天培地及びスターチ無機寒天培地などで良好
に形成される。顕微鏡で観察すると胞子形成菌糸
の分岐方法は単純分岐で胞子は直鎖状に形成され
る。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ、培養
の後期には長い鎖状を呈し、表面は平滑である。
胞子の形状は円筒形で、その大きさは0.5〜0.8×
2.5〜4.3μｍである。菌核、胞子のう、べん毛胞
子は観察されない。 ２） 培地上での生育状態 各種培地で30℃、14日間培養したときの肉眼的
観察結果を第３表に示す。
【表】
【表】
３） 生理的性質
(1) 生育温度範囲
栄養寒天培地において20〜30℃の範囲で良好
に生育する。 10℃以下、40℃以上の温度範囲では生育しな
い。 (2) 生化学的性質 ａ） 好気性、嫌気性の区別；好気性 ｂ） ゼラチンの液化；陰性 ｃ） 脱脂乳の凝固；陰性 ｄ） 脱脂乳のペプトン化；陰性 ｅ） スターチの加水分解；陰性 ｆ） メラニン様色素生成；陰性 ｇ） 硝酸還元能；陰性 (3) 炭素源の利用 （プリドハム・ゴドリーブ寒天培地） 利用する；Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノー
ス、シユクロース、Ｄ−キシロー
ス、Ｌ−イノシトール、Ｄ−マニト
ース、Ｄ−フラクトース、ラムノー
ス わずかに利用する：ラフイノース 以上の性状から本菌株が放線図に属することは
明らかであり、上記諸性状をI.S.P.「インターナシ
ヨナル・ストレプトマイセス・プロジエクト」、
バージー著「マニユアル・オブ・デイターミナテ
イブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）及び
ワツクスマン著「ジ・アクチノミセテス」第２巻
（1961年）に報告されている多くの既知菌種と比
較した結果、本菌株はノカルジア・オウトトロヒ
カに最も近い性状を示していた。 以上の結果より、本菌株はノカルジア・オウト
トロヒカと種を同じくするものと判断し、本菌株
はノカルジア・オウトトロヒカＮ−102と命名し
た。 本発明の方法は、放線図の菌体又はその産生す
る酵素を含有する溶液中で、基質ビタミンＤ類を
好気的条件下で反応させることによつて行うもの
である。 反応に必要な放線図の菌体を得るためには、好
気条件下で本菌の培養を培地中で行う。 培地は主として液体培地を用い、炭素源として
グルコース、マルトース、デキストロース、スタ
ーチ、アラビノース、キシロースを単独又は混合
して用いる。窒素源としては、ポリペプトン、カ
ザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コーンスチー
プリカー及びソイビーンミールなどを単独又は混
合して用いる。その他、本菌株の生育を助け、
1α−及び／又は25−ヒドロキシビクミンＤ類の
生産を促進する有機物及び無機塩を必要により添
加することができる。培養方法は振とう培養、通
気撹拌培養などの好気培養が適しており、PH６〜
7.4、28〜30℃で２〜８日間培養する。 この培養により得られた菌体を含有する溶液
を、1α−及び／又は25−ヒドロキシビタミンＤ
類を生産する反応に用いる。すなわち、培養中の
菌体を含む培養液をそのまま用いるか、培養終了
後、遠心分離又は濾過により分離した菌体を懸濁
した溶液を用いる。また、培養後に得られた菌体
を破砕後、遠心分離などにより菌体を除いた溶液
を用いる。さらにまた、菌体は光架橋性樹脂プレ
ポリマー、たとえばENT3400〔商品名；関西ペイ
ント(株)製〕などや、ウレタン・プレポリマー、た
とえばPU−９〔商品名；東洋ゴム(株)製〕などやｋ
−カラギナンなどの多糖類に固定化してから溶液
に添加してもよい。 また、前記菌体の凍結乾燥したものを上記と同
様に用いることもできる。 本発明において用いられる溶液は、前記培地で
あるか、あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、
コハク酸ナトリウム−コハク酸、コハク酸カリウ
ム−コハク酸、クエン酸ナトリウム−クエン酸、
リン酸ナトリウム−リン酸、リン酸カリウム−リ
ン酸、カコジル酸ナトリウム−塩酸、イミダゾー
ル−塩酸、ホウ酸−ホウ砂などの緩衡液を単独又
は混合したものである。その他、緩衡液には、目
的のビクミンＤ類の生産を促進する界面活性剤、
有機物及び無機塩を必要により添加することがで
きる。 本発明の製造方法は、前記菌体を含有する溶液
中で振とう操作、通気撹拌操作などに付して好気
条件下で行うことが適しており、PH５〜８、20〜
37℃で５分間〜96時間撹拌振とうする。また、酸
素気流下で反応することができる。基質のビタミ
ンＤ類は撹拌振とう開始時に適量添加する。 また、培養中の菌体を含む培養液を用いる場合
は、基質ビタミンＤ類を添加後、更に同条件下で
24〜96時間培養して本反応を行う。 なお、1α及び25位に水素原子を有するビタミ
ンＤ類を原料とする場合、後記の高速液体クロマ
トグラフイー等で生成物を確認して反応時間をき
め、25−ヒドロキシビタミンＤ類又は1α，25−
ジヒドロキシビタミンＤ類をそれぞれ製造するこ
とができる。 これらの反応により製造されたビタミンＤ類を
単離するには、血液中からビタミンＤ類を採取す
る一般的な方法に準じて行えばよい。たとえば、
反応終了後、反応液を有機溶媒により抽出し、濃
縮乾固する。これを２−プロパノール−ｎ−ヘキ
サンなどの適当な溶媒に溶解し、遠心分離により
不溶物を除いた後、シリカゲル順層カラム（たと
えば、ゾルバツクスSIL、米国デユポン社製）を
用いた高速液体クロマトグラフイー又はシリカゲ
ル逆層カラム（たとえば、ゾルバツクスODS、
米国デユポン社製）を用いた高速液体クロマトグ
ラフイーに付すことにより目的のヒドロキシビタ
ミンＤ類を単離することができる。 発明の効果 本発明の方法により、ビタミンＤ類の1α及
び／又は25位へ直接水酸基を導入することが可能
になつた。すなわち、本発明の微生物を用いる方
法では、微生物や反応溶液などの調製に手間がか
からず、しかも１段階で短時間に行うことがで
き、極めて容易かつ能率的である。 実施例 以下、実施例及び試験例をあげて本発明をさら
に詳細に説明する。 実施例 １ スターチ１％、マルトース１％、デキストリン
１％、ソイビーンミール1.5％、肉エキス0.3％、
カザミノ酸0.5％、炭酸カルシウム0.4％、PH7.0の
無菌液体培地50mlの入つた500mlの三角フラスコ
５本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレロ
チアラスＴ−JS1を１白金耳ずつ接種し、30℃で
48時間撹拌振とう培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め、この菌前を15mMト
リス−酢酸、25mMコハハク酸ナトリウム、
2mM酢酸マグネシウム及び200mMシユクロース
からなるPH7.4の緩衝液（以下、緩衝液Ａと略す）
200mlに懸濁し、再びこの懸濁液を遠心分離して
菌体を集めた。この菌体をさらに緩衝液A200ml
に充分撹拌して懸濁し、500mlの三角フラスコ５
本にそれぞれ40mlずつ分注し、30℃で５分間保温
した。その三角フラスコ５本のそれぞれに400μ
のエタノールに溶解した400μgの基質25−ヒド
ロキシビタミンD3を添加し、30℃で45分間撹拌
振とうした。各三角フラスコの反応液を集め、塩
化メチレン１で抽出し、塩化メチレン層を40℃
以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ
−ヘキサン＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、−
20℃で３時間放置した。これを遠心分離し不溶性
画分を除き、上清液を得た。この上清液を40℃以
下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフイー
〔ゾルバツクスSIL、米国デユポン社製〕に付し
た。 溶出溶媒；２−プロパノール；ｎ−ヘキサン＝
カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、、溶出速度；15ml／分、、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定した。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ：4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出温度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒド
ロキシビタミンD3を200μg得た。これは市販の
1α，25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社
製、オランダ）の標品と液体クロマトグラフイー
の保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全
に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265mm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287，269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 ２ 実施例１と同様にして、24，25−ジヒドロキシ
ビタミンD3から1α，24，25−トリヒドロキシビ
タミンD3を得た。 これは従来の技術記載の方法、すなわちニワト
リ腎ホモジネートと24，25−ヒドロキシビタミン
D3（デユフアー社製、オランダ）を反応して得ら
れた1α，24，25−トリヒドロキシビタミンD3の
標品と液体クロマトグラフイーの保持時間、紫外
線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パター
ンが完全に一致した。 実施例１と同条件の高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL〕における保持時間は、
29.4分であつた。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 432（M+）、414（M+−H2O）、396（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、116、
59 実施例 ３ 実施例１と同様にして、25−ヒドロキシビタミ
ンD2から1α，25−ジヒドロキシビタミンD2を得
た。 これは市販の1α，25−ジヒロキシビタミンD3
（デユフアー社製、オランダ）の標品と液体クロ
マトグラフイーの保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、
紫外線吸収スペクトラム、マスススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。 実施例１と同条件の高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL〕における保持時間は、
14.4分であつた。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 428（M+）、410（M+−H2O）、392（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、116、
59 実施例 ４ 実施例１と同様にして、24，24−ジフルオロ−
25−ヒドロキシ−26，27−ジメチルビタミンD3
から1α，25−ジヒドロキシ−24，24−ジフルオ
ロ−26，27−ジメチルビタミンD3を得た。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 480（M+）、287、269、251、152、134、116 実施例 ５ 実施例１と同様にして、25−ヒドロキシ−26，
26，27，27，27−ヘキサフルオロビタミンD3か
ら1α，25−ジヒドロキシ−26，26，26，27，27，
27−ヘキサフルオロビタミンD3を得た。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 524（M+）、287、269、251、152、134、116 実施例 ６ グルコース1.5％、ソイビーンミミール1.5％、
コーンスチーブリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、炭酸カルシウム0.2％、PH7.0の無菌液体培地
50mlの入つた500ml三角フラスコ５本のそれぞれ
にストレプロマイセス・ロゼオスポラスＡ−5797
を１白金耳ずつ接種し、30℃で48時間撹拌振とう
培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌
体を集め、この菌体を15mMトリス−酢酸、
25mMコハク酸ナトリウム及び2mM酢酸マグネ
シウムからなるPH7.4の緩衝液（以下、緩衝液Ｂ
と略す）200mlに懸濁し、ストレプトマイセス・
ロゼオスポラスＡ−5797の菌懸濁液を調製した。
この菌懸濁液を再び遠心分離して菌体をを集め
た。この菌体をさらに緩衝液B200mlに充分撹拌
して懸濁し、500mlの三角フラスコ５本にそれぞ
れ40mlずつ分注し、30℃で５分間保温した。その
三角フラスコ５本のそれぞれに100μのエタノ
ールに溶解した200μgの基質25−ヒドロキシビタ
ミンD3を添加し、30℃で90分間撹拌振とうした。
各三角フラスコの反応液を集め、塩化化メチレン
１で抽出し、塩化メチレン層を40℃以下で減圧
乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ−ヘキサン
＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、−20℃で３時
間放置した。これを遠心分離し不溶性画分を除
き、上清液を得た。この上清液を40℃以下で減圧
下濃縮し、高速液体クロマトグラフイー〔ゾルバ
ツクスSIL、米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ：4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度：40℃、溶出速度：1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒド
ロキシビタミンD3を200μg得た。これは市販の
1α，25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社
製、オランダ）の標品と液体クロマトグラフイー
の保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収ス
ペクトラム、、マススペクトル開裂パターンが完
全に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 １ グルコース1.5％、ソイビーンミール1.5％、コ
ーンスチープリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、炭酸カルシウム0.2％、PH7.0の無菌或体培地
50mlの入つた500mlの三角フラスコ５本のそれぞ
れにノカルジア・オウトトロヒカＮ−102を１白
金耳ずつ接種し、30℃で48時間撹拌振とう培養し
た。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集
め、この菌体を緩衝液B200mlに懸濁し、ノカル
ジア・オウトトロヒカＮ−102の菌懸濁液を調製
した。この菌懸濁液を再び遠心分離して菌体を集
めた。この菌体をさらに緩衝液B200mlに充分撹
拌して懸濁し、500mlの三角フラスコ５本にそれ
ぞれ40mlずつ分注し、30℃で５分間保温した。そ
の三角フラスコ５本のそれぞれに100μのエタ
ノールに溶解した200μgの基質25−ヒドロキシビ
タミンD3を添加し、30℃で45分間撹拌振とうし
た。各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチレ
ン１で抽出し、塩化メチレン層を40℃以下で減
圧乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ−ヘキサ
ン＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、−20℃で３
時間放置した。これを遠心分離して不溶性画分を
除き、上清液を得た。この上清液を40℃以下で減
圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフイー〔ゾル
バツクスSIL、米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキキン＝
１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製〕で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固するとにより、1α，25−ジヒドロ
キシビタミンD3を100μg得た。これは市販の1α，
25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社製、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフイーの保
持時間〔ゾルバツクスIL〕、紫外線吸収スペクト
ラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致
した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、395（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 ８ スターチ１％、マルトース１％、デキストリン
１％、ソイビーンミール1.5％、肉エキス0.3％、
カザミノ酸0.5％、炭酸カルシウム0.4％、PH7.0の
無菌液体培地50mlの入つた500mlの三角フラスコ
５本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレロ
チアラスＴ−JS1を１白金耳ずつ接種し、30℃で
48時間撹拌振とう培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め、この菌体を緩衝液
A200mlに懸濁し、再びこの懸濁液を遠心分離し
て菌体を集めた。この菌体をさらに緩衝液B200
mlに充分撹拌して懸濁し、500mlの三角フラスコ
５本にそれぞれ400mlずつ分注し、３℃で５分間
保温した。その三角フラスコ５本のそれぞれに
100μのエタノールに溶解した200μgの基質1α−
ヒドロキシビタミンD3を加し、30℃で90分間撹
拌振とうした。各三角フラスコの反応液を集め、
塩化メチレン１で抽出し、塩化メチレン層を40
℃以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール：
ｎ−ヘキサン＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、
−20℃で３時間放置した。これを遠心分離し不溶
性画分を除き、上清液を得た。この上清液を40℃
以下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL、米国デユポン社製〕に付
した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒドロ
キシビタミンD3を20μg得た。これは市販の1α，
25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社製、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフイーの保
持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収スペク
トラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一
致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 ９ グルコース1.5％、ソイイビーンミール1.5％、
コーンスチーブリカー0.5％、塩化ナトリウ0.5
％、炭酸カルシウム0.2％、PH7.0の無菌液体培地
50mlの入つた500mlの三角フラスコ５本のそれぞ
れにストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ−
5797を１白金耳ずつ接種し、30℃で48時間撹拌振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し
て菌体を集め、この菌体を緩衝液200mlに懸濁し、
ストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ−5797の
菌懸濁液を調製した。この菌懸濁液を再び遠心分
離して菌体を集めた。この菌体をさらに緩衝液
B200mlに充分撹拌し、500mlの三角フラスコ５本
にそれぞれ400mlずつ分注し、30℃で５分間保温
した。その三角フラスコ５本のそれぞれに100μ
のエタノールに溶解した200μgの基質1α−ヒド
ロキシビタミンD3を添加し、30℃で180分間撹拌
振とうした。各三角フラスコの反応液を集め、塩
化メチレン１で抽出し、押化メチレン層を40℃
以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ
−ヘキサン＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、−
20℃で３時間放置した。これを遠心分離し不溶性
画分を除き、上清液を得た。この上清液を40℃以
下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフイー
〔ゾルバツクスSIL、米国デユポン社製〕に付し
た。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒド
ロキシビタミンD3を50μg得た。これは市販の1α，
25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社製、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフイーの保
持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収スペク
トラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一
致した。 最大紫外部吸収：： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 10 グルコース1.5％、ソイビーンミール1.5％、コ
ーンスチープリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、炭酸カルシウム0.2％、PH7.0の無菌液体培地
50ml合の入つた500mlの三角フラスコ５本のそれ
ぞれにノカルジア・オウトトロヒカＮ−102を１
白金耳ずつ接種し、３℃で48時間撹振と培養し
た。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集
め、この菌体を緩衝液B200mlに懸濁し、ノカル
ジア・オウトトロヒヒカＮ−102の菌懸濁液を調
製した。この菌懸濁液を再び遠心分離して菌体を
集めた。この菌体をさらに緩衝液B200mlに充分
撹拌して懸濁し、500mlの三角フラスコ５本にそ
れぞれ40mlずつ分注し、30℃で５分間保温した。
その三角フラスコ５本のそれぞれに100μのエ
タノールに溶解した200μgの基質1α−ヒドロキシ
ビタミンD3を添加し、30℃で900分間撹拌振とう
した。各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチ
レン１で抽出し、塩化化メチレン層を40℃以下
で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ−ヘ
キサン＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、−20℃
で３時間放置した。これを遠心分離し不溶性画分
を除き、上清液を得た。この上清液を40℃以下で
減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフイー〔ゾ
ルバツクスSIL、米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダオードアレイ検出器（MCPD 3500、
大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部糾吸収パターン
と一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を
集めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速
液体クロマトトグラフイー〔ゾルバツクスODS、
米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出速度；10ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒド
ロキシビタミンD3を350μg得た。これは市販の
1α，25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社
製、オランダ）の標品と液体クロマトグラフイー
の保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全
に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 11 実施例８と同様にして、1α，25−ジヒドロキ
シビタミンD3から1α，24，25−トリヒドロキシ
ビタミンD3を得た。 これは従来の技術記載の方法、すなわちニワト
リ腎ホモジネートと24，25−ヒドロキシビタミン
D3（デユフアー社製、オランダ）を反応して得ら
れた1α，24，25−トリヒドロキシビタミンD3の
標品と液体クロマトグラフイーの保持時間、紫外
線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パター
ンが完全に一致した。 実施例１と同条件の高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL〕における保持時間は、
29.4分であつた。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 432（M+）、414（M+−H2O）、396（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、116、
59 実施例 12 ノカルジア・オウトトロヒカＮ−102を、グル
コース1.5％、ソイビーンムミール1.5％、コーン
スチーブリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5％、炭
酸カルシウム0.2％、PH7.0の無菌液体培地50mlの
入つた500mlの三角フラスコ１本に１白金耳接種
し、30℃で48時間撹拌振とう培養した。対数増殖
期中にあるノカルジア・オウトトロヒカＮ−102
の培養液中に250mlのエタノールに溶解した基質
ビタミンD35mg及び0.5mlのツイーン80を添加し、
これを再び30℃で48時間撹拌振とう培養した。培
養終了後、この培養液を塩化メチレン200mlで抽
出し、塩化メチレン層を40℃以下で減圧乾固後、
直ちに２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝１：９
の混合溶媒３mlに溶解し、−20℃で３時間放置し
た。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液
を得た。この上清液を40℃以下で減圧下濃縮し、
高速液体クロマトグラフイー〔ゾルバツクス
SIL、米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
３：22、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（ウオーターズ
M990、日本ウオーターズ社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間4.0分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（ウオーターズ
M990、日本ウオーターズ社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間8.0分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、25−ヒドロキシビ
タミンD3を500μg得た。これは市販の25−ヒドロ
キシビタミンD3（デユフアー社製、オランダ）の
標品と液体クロマトグラフイーの保持時間〔ゾル
バツクスSIL〕、紫外線吸収スペクトラム、マス
スペクトル開裂パターンが完全に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 400（M+）、382（M+−H2O）、271、253、
136、118、59 実施例 13 ノカルジア・オウトトロヒカＮ−102を、グル
コース1.5％、ソイビーンミール1.5％、コーンス
チーブリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5％、炭酸
カルシウム0.2％、硫酸マグネシウム0.05％、PH
7.0の無菌液体培地50mlの入つた500mlの三角フラ
スコ１本に１白金耳接種し、30℃で48時間撹拌振
とう培養した。対数増殖期中にあるノカルジア・
オウトトロヒカＮ−102の培養液中に250μのエ
タノールに溶解した基質ビタミンD35mg及び0.05
mlのツイーン80を添加し、これを再30℃で60時間
撹拌振とう培養した。培養終了後、この培養液を
塩化メチレン200mlで抽出し、塩化メチレン層を
40℃以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノー
ル：ｎ−ヘキサン＝１：９の混合溶媒３mlに溶解
し、−20℃で３時間放置した。これを遠心分離し
不溶性画分を除き、上清液を得た。この上清液を
40℃以下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラ
フイー〔ゾルバツクスSIL、米国デユポン社製〕
に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
３：22、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（ウオーターズ
M990、日本ウオーターズ社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間14.5分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（ウオーターズ
M990、日本ウオーターズ社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒド
ロキシビタミンD3を50μg得た。これは市販のα，
25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社製、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフイーの保
持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収スペク
トラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一
致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（MM+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 14 実施例１と同様にして、ビタミンD2から25−
ヒドロキシビタミンD2を得た。 これは25−ヒドロキシビタミンD2（半井(株)社
製）の標品と液体クロマトグラフイーの保持時
間、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開
裂パターンが完全に致した。 実施例12と同条件の高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL〕における保持時間は、3.9
分であつた。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 412（M+）、394（M+−H2O）、271、253、
136、118、59 実施例 15 実施例13と同様にして、ビタミンD2から1α，
25−ジヒドロキシビタミンD2を得た。 実施例13と同条件の高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL〕における保持時間は、
13.8分であつた。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 428（M+）、410（M+−H2O）、392（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、116、
59 実施例 16 (1) ノカルジア・オウトトロヒカＮ−102を、グ
ルコース1.5％、ソイビーンミール1.5％、コー
ンスチープリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、炭酸カルシウム0.5％、PH7.0の無菌液体培
地50mlの入つた500mlの三角フラスコ１本に１
白金耳接種し、28℃で96時間撹拌振とう培養し
た。 (2) 以下の操作は２℃ないし８℃の間で行つた。
(1)で得られた菌体を10mMトリス−酢酸、
2mM酢酸マグネシウム、7mM2−メルカプト
エタノール及び20％グリセリンからなるPH7.4
の緩衝液（以下、緩衝液Ｃと略す）200mlに懸
濁し菌懸濁液としてこれを遠心分離して得られ
た菌体を再び100mlの緩衝液Ｃに懸濁して菌懸
濁液とした。この懸濁液をデイスバーザー
（ULTRA−TUR−RAX ：商品名、IKA−
WERX社製）で２分間処理して菌体を破砕し、
菌体破砕液とし、次にこれを遠心分離してその
上清液を得た。得られた上清液にポリエチレン
グリコール6000を終濃度25％になるように撹拌
しながら少しづつ加えてこれを溶解した後、30
分間４℃で放置した。次に、この溶液を遠心分
離し、上清液を捨てた後、粗酵素沈殿物を得
た。 (3) (2)で得られた沈殿物の約500mg蛋白質含量に
相当する粗酵素を含む20mMトリス−酢酸、
70mMニコチンアミド、2mM酢酸マグネシウ
ム、100mM NADP、5mM ATP、6mMゲル
コース−６−リン酸、PH7.4から成る酵素反応
溶液15mlにグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ５ユニツト及び150μのエタノールに
溶かしたビタミンD33mgを加え、28℃で30分間
撹拌振とうし、酵素反応を行なつた。 (4) クロロホルム：メタノール＝１：２の混合溶
媒45mlを(3)の酵素反応溶液に加え、反応を停止
させた後、反応生成物をブライ・アンド・ダイ
ヤー（bligh ＆ deyer）法で抽出した。抽出
後、得られたクロロホルム画分を40℃以下で減
圧乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ−ヘキ
サン＝１：９の混合溶媒250μに溶解し、こ
れを高速液体クロマトグラフイー〔ゾルバツク
スSIL、米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
３：22、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 (5) (4)の高速液体クロマトグラフイーの溶出後、
ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間4.0分付近のピークの画分を集めた。
次にこれを40℃以で減圧濃縮し、高速液体クロ
マトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米国デ
ユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長
さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターン
と一致する保持時間8.0分付近のピークの画分
を集めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換し
ながら減圧濃縮乾固することにより、25−ヒド
ロキシビタミンD3を116μg得た。これは市販の
25−ヒドロキシビタミンD3（デユフアー社製、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフイーの
保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完
全に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI＝MS(m/z)： 400（M+）、382（M+−H2O）、271、253、
136、118、59 (6) (4)の高速液体クロマトグラフイーの溶出後、
ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保寺時間14.5分付近のピークの画分を集めた。
次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液体ク
ロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米国
デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長
さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターン
と一致する保持時間5.6分付近のピークの画分
を集めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換し
ながら減圧濃縮乾固することにより、1α，25
−ジヒドロキシビタミンD3を20μ得た。これは
市販の1α，25−ジヒドロキシビタミンD3（デユ
フアー社製、オランダ）の標品と液体クロマト
グラフイーの保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、
紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 試験例 1α，25−ジヒドロキシビタミンD3のインビト
トロ薬理活性試験〔ラジオリセプターアツセイ
法〕 本試験は、臨床検査、第１号、第26巻、第７〜
18ページ（1982年）記載の方法に従つて実施し
た。ニワトリの胎児の腸管より調製された1α，
25−ジヒドロキシビタミンD3リセプター〔ヤマ
サ醤油(株)〕を10mMトリス−塩酸、0.5mM
EDTA、1mMジチオスレイトール、10mMモリ
ブデン酸ナトリウム、PH7.4の緩衝液に懸濁させ、
これをリセプター溶液（プロテイン約0.5mg／ml）
として使用した。 このリセプター溶液に、50％エタノールに溶解
した被検薬〔1α，25−ジヒドロキシビタミンD3
の標品（デユフアー社製、オランダ）〕及び実施
例１で得られた1α，25−ジヒドロキシビタミン
D3を３又は10μ、10-9〜10-5Mになるように添
加した。次いで3H−1α，25−ジヒドロキシビタ
ミンD3（約0.4μM）を添加し、０℃で３時間イン
キユベーシヨンして反応を行つた。リセプター結
合物と非結合物の分離はデキストラン−チヤコー
ル溶液（ヤマサ醤油(株)社製）を用いた。特異的結
合量は、上記反応より得られる総結合量から
10μMの1α，25−ジヒドロキシビタミンD3存在に
得られる非特異的結合量を差し引いて求めた。被
検薬の結合能は、リセプターへの3H−1α，25−
ジヒドロキシビタミンD3の結合を50％阻害する
濃度（IC50）で示した。
に生育する。 10℃以下、40℃以上の温度範囲では生育しな
い。 (2) 生化学的性質 ａ） 好気性、嫌気性の区別；好気性 ｂ） ゼラチンの液化；陰性 ｃ） 脱脂乳の凝固；陰性 ｄ） 脱脂乳のペプトン化；陰性 ｅ） スターチの加水分解；陰性 ｆ） メラニン様色素生成；陰性 ｇ） 硝酸還元能；陰性 (3) 炭素源の利用 （プリドハム・ゴドリーブ寒天培地） 利用する；Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノー
ス、シユクロース、Ｄ−キシロー
ス、Ｌ−イノシトール、Ｄ−マニト
ース、Ｄ−フラクトース、ラムノー
ス わずかに利用する：ラフイノース 以上の性状から本菌株が放線図に属することは
明らかであり、上記諸性状をI.S.P.「インターナシ
ヨナル・ストレプトマイセス・プロジエクト」、
バージー著「マニユアル・オブ・デイターミナテ
イブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）及び
ワツクスマン著「ジ・アクチノミセテス」第２巻
（1961年）に報告されている多くの既知菌種と比
較した結果、本菌株はノカルジア・オウトトロヒ
カに最も近い性状を示していた。 以上の結果より、本菌株はノカルジア・オウト
トロヒカと種を同じくするものと判断し、本菌株
はノカルジア・オウトトロヒカＮ−102と命名し
た。 本発明の方法は、放線図の菌体又はその産生す
る酵素を含有する溶液中で、基質ビタミンＤ類を
好気的条件下で反応させることによつて行うもの
である。 反応に必要な放線図の菌体を得るためには、好
気条件下で本菌の培養を培地中で行う。 培地は主として液体培地を用い、炭素源として
グルコース、マルトース、デキストロース、スタ
ーチ、アラビノース、キシロースを単独又は混合
して用いる。窒素源としては、ポリペプトン、カ
ザミノ酸、酵母エキス、肉エキス、コーンスチー
プリカー及びソイビーンミールなどを単独又は混
合して用いる。その他、本菌株の生育を助け、
1α−及び／又は25−ヒドロキシビクミンＤ類の
生産を促進する有機物及び無機塩を必要により添
加することができる。培養方法は振とう培養、通
気撹拌培養などの好気培養が適しており、PH６〜
7.4、28〜30℃で２〜８日間培養する。 この培養により得られた菌体を含有する溶液
を、1α−及び／又は25−ヒドロキシビタミンＤ
類を生産する反応に用いる。すなわち、培養中の
菌体を含む培養液をそのまま用いるか、培養終了
後、遠心分離又は濾過により分離した菌体を懸濁
した溶液を用いる。また、培養後に得られた菌体
を破砕後、遠心分離などにより菌体を除いた溶液
を用いる。さらにまた、菌体は光架橋性樹脂プレ
ポリマー、たとえばENT3400〔商品名；関西ペイ
ント(株)製〕などや、ウレタン・プレポリマー、た
とえばPU−９〔商品名；東洋ゴム(株)製〕などやｋ
−カラギナンなどの多糖類に固定化してから溶液
に添加してもよい。 また、前記菌体の凍結乾燥したものを上記と同
様に用いることもできる。 本発明において用いられる溶液は、前記培地で
あるか、あるいはトリス−酢酸、トリス−塩酸、
コハク酸ナトリウム−コハク酸、コハク酸カリウ
ム−コハク酸、クエン酸ナトリウム−クエン酸、
リン酸ナトリウム−リン酸、リン酸カリウム−リ
ン酸、カコジル酸ナトリウム−塩酸、イミダゾー
ル−塩酸、ホウ酸−ホウ砂などの緩衡液を単独又
は混合したものである。その他、緩衡液には、目
的のビクミンＤ類の生産を促進する界面活性剤、
有機物及び無機塩を必要により添加することがで
きる。 本発明の製造方法は、前記菌体を含有する溶液
中で振とう操作、通気撹拌操作などに付して好気
条件下で行うことが適しており、PH５〜８、20〜
37℃で５分間〜96時間撹拌振とうする。また、酸
素気流下で反応することができる。基質のビタミ
ンＤ類は撹拌振とう開始時に適量添加する。 また、培養中の菌体を含む培養液を用いる場合
は、基質ビタミンＤ類を添加後、更に同条件下で
24〜96時間培養して本反応を行う。 なお、1α及び25位に水素原子を有するビタミ
ンＤ類を原料とする場合、後記の高速液体クロマ
トグラフイー等で生成物を確認して反応時間をき
め、25−ヒドロキシビタミンＤ類又は1α，25−
ジヒドロキシビタミンＤ類をそれぞれ製造するこ
とができる。 これらの反応により製造されたビタミンＤ類を
単離するには、血液中からビタミンＤ類を採取す
る一般的な方法に準じて行えばよい。たとえば、
反応終了後、反応液を有機溶媒により抽出し、濃
縮乾固する。これを２−プロパノール−ｎ−ヘキ
サンなどの適当な溶媒に溶解し、遠心分離により
不溶物を除いた後、シリカゲル順層カラム（たと
えば、ゾルバツクスSIL、米国デユポン社製）を
用いた高速液体クロマトグラフイー又はシリカゲ
ル逆層カラム（たとえば、ゾルバツクスODS、
米国デユポン社製）を用いた高速液体クロマトグ
ラフイーに付すことにより目的のヒドロキシビタ
ミンＤ類を単離することができる。 発明の効果 本発明の方法により、ビタミンＤ類の1α及
び／又は25位へ直接水酸基を導入することが可能
になつた。すなわち、本発明の微生物を用いる方
法では、微生物や反応溶液などの調製に手間がか
からず、しかも１段階で短時間に行うことがで
き、極めて容易かつ能率的である。 実施例 以下、実施例及び試験例をあげて本発明をさら
に詳細に説明する。 実施例 １ スターチ１％、マルトース１％、デキストリン
１％、ソイビーンミール1.5％、肉エキス0.3％、
カザミノ酸0.5％、炭酸カルシウム0.4％、PH7.0の
無菌液体培地50mlの入つた500mlの三角フラスコ
５本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレロ
チアラスＴ−JS1を１白金耳ずつ接種し、30℃で
48時間撹拌振とう培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め、この菌前を15mMト
リス−酢酸、25mMコハハク酸ナトリウム、
2mM酢酸マグネシウム及び200mMシユクロース
からなるPH7.4の緩衝液（以下、緩衝液Ａと略す）
200mlに懸濁し、再びこの懸濁液を遠心分離して
菌体を集めた。この菌体をさらに緩衝液A200ml
に充分撹拌して懸濁し、500mlの三角フラスコ５
本にそれぞれ40mlずつ分注し、30℃で５分間保温
した。その三角フラスコ５本のそれぞれに400μ
のエタノールに溶解した400μgの基質25−ヒド
ロキシビタミンD3を添加し、30℃で45分間撹拌
振とうした。各三角フラスコの反応液を集め、塩
化メチレン１で抽出し、塩化メチレン層を40℃
以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ
−ヘキサン＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、−
20℃で３時間放置した。これを遠心分離し不溶性
画分を除き、上清液を得た。この上清液を40℃以
下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフイー
〔ゾルバツクスSIL、米国デユポン社製〕に付し
た。 溶出溶媒；２−プロパノール；ｎ−ヘキサン＝
カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、、溶出速度；15ml／分、、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定した。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ：4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出温度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒド
ロキシビタミンD3を200μg得た。これは市販の
1α，25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社
製、オランダ）の標品と液体クロマトグラフイー
の保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全
に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265mm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287，269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 ２ 実施例１と同様にして、24，25−ジヒドロキシ
ビタミンD3から1α，24，25−トリヒドロキシビ
タミンD3を得た。 これは従来の技術記載の方法、すなわちニワト
リ腎ホモジネートと24，25−ヒドロキシビタミン
D3（デユフアー社製、オランダ）を反応して得ら
れた1α，24，25−トリヒドロキシビタミンD3の
標品と液体クロマトグラフイーの保持時間、紫外
線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パター
ンが完全に一致した。 実施例１と同条件の高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL〕における保持時間は、
29.4分であつた。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 432（M+）、414（M+−H2O）、396（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、116、
59 実施例 ３ 実施例１と同様にして、25−ヒドロキシビタミ
ンD2から1α，25−ジヒドロキシビタミンD2を得
た。 これは市販の1α，25−ジヒロキシビタミンD3
（デユフアー社製、オランダ）の標品と液体クロ
マトグラフイーの保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、
紫外線吸収スペクトラム、マスススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。 実施例１と同条件の高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL〕における保持時間は、
14.4分であつた。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 428（M+）、410（M+−H2O）、392（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、116、
59 実施例 ４ 実施例１と同様にして、24，24−ジフルオロ−
25−ヒドロキシ−26，27−ジメチルビタミンD3
から1α，25−ジヒドロキシ−24，24−ジフルオ
ロ−26，27−ジメチルビタミンD3を得た。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 480（M+）、287、269、251、152、134、116 実施例 ５ 実施例１と同様にして、25−ヒドロキシ−26，
26，27，27，27−ヘキサフルオロビタミンD3か
ら1α，25−ジヒドロキシ−26，26，26，27，27，
27−ヘキサフルオロビタミンD3を得た。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 524（M+）、287、269、251、152、134、116 実施例 ６ グルコース1.5％、ソイビーンミミール1.5％、
コーンスチーブリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、炭酸カルシウム0.2％、PH7.0の無菌液体培地
50mlの入つた500ml三角フラスコ５本のそれぞれ
にストレプロマイセス・ロゼオスポラスＡ−5797
を１白金耳ずつ接種し、30℃で48時間撹拌振とう
培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌
体を集め、この菌体を15mMトリス−酢酸、
25mMコハク酸ナトリウム及び2mM酢酸マグネ
シウムからなるPH7.4の緩衝液（以下、緩衝液Ｂ
と略す）200mlに懸濁し、ストレプトマイセス・
ロゼオスポラスＡ−5797の菌懸濁液を調製した。
この菌懸濁液を再び遠心分離して菌体をを集め
た。この菌体をさらに緩衝液B200mlに充分撹拌
して懸濁し、500mlの三角フラスコ５本にそれぞ
れ40mlずつ分注し、30℃で５分間保温した。その
三角フラスコ５本のそれぞれに100μのエタノ
ールに溶解した200μgの基質25−ヒドロキシビタ
ミンD3を添加し、30℃で90分間撹拌振とうした。
各三角フラスコの反応液を集め、塩化化メチレン
１で抽出し、塩化メチレン層を40℃以下で減圧
乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ−ヘキサン
＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、−20℃で３時
間放置した。これを遠心分離し不溶性画分を除
き、上清液を得た。この上清液を40℃以下で減圧
下濃縮し、高速液体クロマトグラフイー〔ゾルバ
ツクスSIL、米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ：4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度：40℃、溶出速度：1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒド
ロキシビタミンD3を200μg得た。これは市販の
1α，25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社
製、オランダ）の標品と液体クロマトグラフイー
の保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収ス
ペクトラム、、マススペクトル開裂パターンが完
全に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 １ グルコース1.5％、ソイビーンミール1.5％、コ
ーンスチープリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、炭酸カルシウム0.2％、PH7.0の無菌或体培地
50mlの入つた500mlの三角フラスコ５本のそれぞ
れにノカルジア・オウトトロヒカＮ−102を１白
金耳ずつ接種し、30℃で48時間撹拌振とう培養し
た。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集
め、この菌体を緩衝液B200mlに懸濁し、ノカル
ジア・オウトトロヒカＮ−102の菌懸濁液を調製
した。この菌懸濁液を再び遠心分離して菌体を集
めた。この菌体をさらに緩衝液B200mlに充分撹
拌して懸濁し、500mlの三角フラスコ５本にそれ
ぞれ40mlずつ分注し、30℃で５分間保温した。そ
の三角フラスコ５本のそれぞれに100μのエタ
ノールに溶解した200μgの基質25−ヒドロキシビ
タミンD3を添加し、30℃で45分間撹拌振とうし
た。各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチレ
ン１で抽出し、塩化メチレン層を40℃以下で減
圧乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ−ヘキサ
ン＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、−20℃で３
時間放置した。これを遠心分離して不溶性画分を
除き、上清液を得た。この上清液を40℃以下で減
圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフイー〔ゾル
バツクスSIL、米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキキン＝
１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製〕で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固するとにより、1α，25−ジヒドロ
キシビタミンD3を100μg得た。これは市販の1α，
25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社製、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフイーの保
持時間〔ゾルバツクスIL〕、紫外線吸収スペクト
ラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一致
した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、395（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 ８ スターチ１％、マルトース１％、デキストリン
１％、ソイビーンミール1.5％、肉エキス0.3％、
カザミノ酸0.5％、炭酸カルシウム0.4％、PH7.0の
無菌液体培地50mlの入つた500mlの三角フラスコ
５本のそれぞれにストレプトマイセス・スクレロ
チアラスＴ−JS1を１白金耳ずつ接種し、30℃で
48時間撹拌振とう培養した。培養終了後、培養液
を遠心分離して菌体を集め、この菌体を緩衝液
A200mlに懸濁し、再びこの懸濁液を遠心分離し
て菌体を集めた。この菌体をさらに緩衝液B200
mlに充分撹拌して懸濁し、500mlの三角フラスコ
５本にそれぞれ400mlずつ分注し、３℃で５分間
保温した。その三角フラスコ５本のそれぞれに
100μのエタノールに溶解した200μgの基質1α−
ヒドロキシビタミンD3を加し、30℃で90分間撹
拌振とうした。各三角フラスコの反応液を集め、
塩化メチレン１で抽出し、塩化メチレン層を40
℃以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール：
ｎ−ヘキサン＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、
−20℃で３時間放置した。これを遠心分離し不溶
性画分を除き、上清液を得た。この上清液を40℃
以下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL、米国デユポン社製〕に付
した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒドロ
キシビタミンD3を20μg得た。これは市販の1α，
25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社製、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフイーの保
持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収スペク
トラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一
致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 ９ グルコース1.5％、ソイイビーンミール1.5％、
コーンスチーブリカー0.5％、塩化ナトリウ0.5
％、炭酸カルシウム0.2％、PH7.0の無菌液体培地
50mlの入つた500mlの三角フラスコ５本のそれぞ
れにストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ−
5797を１白金耳ずつ接種し、30℃で48時間撹拌振
とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し
て菌体を集め、この菌体を緩衝液200mlに懸濁し、
ストレプトマイセス・ロゼオスポラスＡ−5797の
菌懸濁液を調製した。この菌懸濁液を再び遠心分
離して菌体を集めた。この菌体をさらに緩衝液
B200mlに充分撹拌し、500mlの三角フラスコ５本
にそれぞれ400mlずつ分注し、30℃で５分間保温
した。その三角フラスコ５本のそれぞれに100μ
のエタノールに溶解した200μgの基質1α−ヒド
ロキシビタミンD3を添加し、30℃で180分間撹拌
振とうした。各三角フラスコの反応液を集め、塩
化メチレン１で抽出し、押化メチレン層を40℃
以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ
−ヘキサン＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、−
20℃で３時間放置した。これを遠心分離し不溶性
画分を除き、上清液を得た。この上清液を40℃以
下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフイー
〔ゾルバツクスSIL、米国デユポン社製〕に付し
た。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒド
ロキシビタミンD3を50μg得た。これは市販の1α，
25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社製、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフイーの保
持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収スペク
トラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一
致した。 最大紫外部吸収：： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 10 グルコース1.5％、ソイビーンミール1.5％、コ
ーンスチープリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、炭酸カルシウム0.2％、PH7.0の無菌液体培地
50ml合の入つた500mlの三角フラスコ５本のそれ
ぞれにノカルジア・オウトトロヒカＮ−102を１
白金耳ずつ接種し、３℃で48時間撹振と培養し
た。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集
め、この菌体を緩衝液B200mlに懸濁し、ノカル
ジア・オウトトロヒヒカＮ−102の菌懸濁液を調
製した。この菌懸濁液を再び遠心分離して菌体を
集めた。この菌体をさらに緩衝液B200mlに充分
撹拌して懸濁し、500mlの三角フラスコ５本にそ
れぞれ40mlずつ分注し、30℃で５分間保温した。
その三角フラスコ５本のそれぞれに100μのエ
タノールに溶解した200μgの基質1α−ヒドロキシ
ビタミンD3を添加し、30℃で900分間撹拌振とう
した。各三角フラスコの反応液を集め、塩化メチ
レン１で抽出し、塩化化メチレン層を40℃以下
で減圧乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ−ヘ
キサン＝１：９の混合溶媒7.5mlに溶解し、−20℃
で３時間放置した。これを遠心分離し不溶性画分
を除き、上清液を得た。この上清液を40℃以下で
減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラフイー〔ゾ
ルバツクスSIL、米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダオードアレイ検出器（MCPD 3500、
大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部糾吸収パターン
と一致する保持時間15.4分付近のピークの画分を
集めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速
液体クロマトトグラフイー〔ゾルバツクスODS、
米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出速度；10ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒド
ロキシビタミンD3を350μg得た。これは市販の
1α，25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社
製、オランダ）の標品と液体クロマトグラフイー
の保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完全
に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 11 実施例８と同様にして、1α，25−ジヒドロキ
シビタミンD3から1α，24，25−トリヒドロキシ
ビタミンD3を得た。 これは従来の技術記載の方法、すなわちニワト
リ腎ホモジネートと24，25−ヒドロキシビタミン
D3（デユフアー社製、オランダ）を反応して得ら
れた1α，24，25−トリヒドロキシビタミンD3の
標品と液体クロマトグラフイーの保持時間、紫外
線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂パター
ンが完全に一致した。 実施例１と同条件の高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL〕における保持時間は、
29.4分であつた。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 432（M+）、414（M+−H2O）、396（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、116、
59 実施例 12 ノカルジア・オウトトロヒカＮ−102を、グル
コース1.5％、ソイビーンムミール1.5％、コーン
スチーブリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5％、炭
酸カルシウム0.2％、PH7.0の無菌液体培地50mlの
入つた500mlの三角フラスコ１本に１白金耳接種
し、30℃で48時間撹拌振とう培養した。対数増殖
期中にあるノカルジア・オウトトロヒカＮ−102
の培養液中に250mlのエタノールに溶解した基質
ビタミンD35mg及び0.5mlのツイーン80を添加し、
これを再び30℃で48時間撹拌振とう培養した。培
養終了後、この培養液を塩化メチレン200mlで抽
出し、塩化メチレン層を40℃以下で減圧乾固後、
直ちに２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝１：９
の混合溶媒３mlに溶解し、−20℃で３時間放置し
た。これを遠心分離し不溶性画分を除き、上清液
を得た。この上清液を40℃以下で減圧下濃縮し、
高速液体クロマトグラフイー〔ゾルバツクス
SIL、米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
３：22、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（ウオーターズ
M990、日本ウオーターズ社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間4.0分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（ウオーターズ
M990、日本ウオーターズ社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間8.0分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、25−ヒドロキシビ
タミンD3を500μg得た。これは市販の25−ヒドロ
キシビタミンD3（デユフアー社製、オランダ）の
標品と液体クロマトグラフイーの保持時間〔ゾル
バツクスSIL〕、紫外線吸収スペクトラム、マス
スペクトル開裂パターンが完全に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 400（M+）、382（M+−H2O）、271、253、
136、118、59 実施例 13 ノカルジア・オウトトロヒカＮ−102を、グル
コース1.5％、ソイビーンミール1.5％、コーンス
チーブリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5％、炭酸
カルシウム0.2％、硫酸マグネシウム0.05％、PH
7.0の無菌液体培地50mlの入つた500mlの三角フラ
スコ１本に１白金耳接種し、30℃で48時間撹拌振
とう培養した。対数増殖期中にあるノカルジア・
オウトトロヒカＮ−102の培養液中に250μのエ
タノールに溶解した基質ビタミンD35mg及び0.05
mlのツイーン80を添加し、これを再30℃で60時間
撹拌振とう培養した。培養終了後、この培養液を
塩化メチレン200mlで抽出し、塩化メチレン層を
40℃以下で減圧乾固後、直ちに２−プロパノー
ル：ｎ−ヘキサン＝１：９の混合溶媒３mlに溶解
し、−20℃で３時間放置した。これを遠心分離し
不溶性画分を除き、上清液を得た。この上清液を
40℃以下で減圧下濃縮し、高速液体クロマトグラ
フイー〔ゾルバツクスSIL、米国デユポン社製〕
に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
３：22、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（ウオーターズ
M990、日本ウオーターズ社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間14.5分付近のピークの画分を集
めた。次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液
体クロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米
国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（ウオーターズ
M990、日本ウオーターズ社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと
一致する保持時間5.6分付近のピークの画分を集
めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換しながら
減圧濃縮乾固することにより、1α，25−ジヒド
ロキシビタミンD3を50μg得た。これは市販のα，
25−ジヒドロキシビタミンD3（デユフアー社製、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフイーの保
持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収スペク
トラム、マススペクトル開裂パターンが完全に一
致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（MM+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 実施例 14 実施例１と同様にして、ビタミンD2から25−
ヒドロキシビタミンD2を得た。 これは25−ヒドロキシビタミンD2（半井(株)社
製）の標品と液体クロマトグラフイーの保持時
間、紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開
裂パターンが完全に致した。 実施例12と同条件の高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL〕における保持時間は、3.9
分であつた。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 412（M+）、394（M+−H2O）、271、253、
136、118、59 実施例 15 実施例13と同様にして、ビタミンD2から1α，
25−ジヒドロキシビタミンD2を得た。 実施例13と同条件の高速液体クロマトグラフイ
ー〔ゾルバツクスSIL〕における保持時間は、
13.8分であつた。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 428（M+）、410（M+−H2O）、392（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、116、
59 実施例 16 (1) ノカルジア・オウトトロヒカＮ−102を、グ
ルコース1.5％、ソイビーンミール1.5％、コー
ンスチープリカー0.5％、塩化ナトリウム0.5
％、炭酸カルシウム0.5％、PH7.0の無菌液体培
地50mlの入つた500mlの三角フラスコ１本に１
白金耳接種し、28℃で96時間撹拌振とう培養し
た。 (2) 以下の操作は２℃ないし８℃の間で行つた。
(1)で得られた菌体を10mMトリス−酢酸、
2mM酢酸マグネシウム、7mM2−メルカプト
エタノール及び20％グリセリンからなるPH7.4
の緩衝液（以下、緩衝液Ｃと略す）200mlに懸
濁し菌懸濁液としてこれを遠心分離して得られ
た菌体を再び100mlの緩衝液Ｃに懸濁して菌懸
濁液とした。この懸濁液をデイスバーザー
（ULTRA−TUR−RAX ：商品名、IKA−
WERX社製）で２分間処理して菌体を破砕し、
菌体破砕液とし、次にこれを遠心分離してその
上清液を得た。得られた上清液にポリエチレン
グリコール6000を終濃度25％になるように撹拌
しながら少しづつ加えてこれを溶解した後、30
分間４℃で放置した。次に、この溶液を遠心分
離し、上清液を捨てた後、粗酵素沈殿物を得
た。 (3) (2)で得られた沈殿物の約500mg蛋白質含量に
相当する粗酵素を含む20mMトリス−酢酸、
70mMニコチンアミド、2mM酢酸マグネシウ
ム、100mM NADP、5mM ATP、6mMゲル
コース−６−リン酸、PH7.4から成る酵素反応
溶液15mlにグルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ５ユニツト及び150μのエタノールに
溶かしたビタミンD33mgを加え、28℃で30分間
撹拌振とうし、酵素反応を行なつた。 (4) クロロホルム：メタノール＝１：２の混合溶
媒45mlを(3)の酵素反応溶液に加え、反応を停止
させた後、反応生成物をブライ・アンド・ダイ
ヤー（bligh ＆ deyer）法で抽出した。抽出
後、得られたクロロホルム画分を40℃以下で減
圧乾固後、直ちに２−プロパノール：ｎ−ヘキ
サン＝１：９の混合溶媒250μに溶解し、こ
れを高速液体クロマトグラフイー〔ゾルバツク
スSIL、米国デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；２−プロパノール：ｎ−ヘキサン＝
３：22、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長さ） カラム温度；25℃、溶出速度；1.5ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 (5) (4)の高速液体クロマトグラフイーの溶出後、
ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保持時間4.0分付近のピークの画分を集めた。
次にこれを40℃以で減圧濃縮し、高速液体クロ
マトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米国デ
ユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長
さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターン
と一致する保持時間8.0分付近のピークの画分
を集めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換し
ながら減圧濃縮乾固することにより、25−ヒド
ロキシビタミンD3を116μg得た。これは市販の
25−ヒドロキシビタミンD3（デユフアー社製、
オランダ）の標品と液体クロマトグラフイーの
保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、紫外線吸収ス
ペクトラム、マススペクトル開裂パターンが完
全に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI＝MS(m/z)： 400（M+）、382（M+−H2O）、271、253、
136、118、59 (6) (4)の高速液体クロマトグラフイーの溶出後、
ビタミンＤ類の紫外部吸収パターンと一致する
保寺時間14.5分付近のピークの画分を集めた。
次にこれを40℃以下で減圧濃縮し、高速液体ク
ロマトグラフイー〔ゾルバツクスODS、米国
デユポン社製〕に付した。 溶出溶媒；水：メタノール＝１：９、 カラムの大きさ；4.6mm（内径）×25cm（長
さ） カラム温度；40℃、溶出速度；1.0ml／分、 フオトダイオードアレイ検出器（MCPD
3500、大塚電子社製）で測定。 溶出後、ビタミンＤ類の紫外部吸収パターン
と一致する保持時間5.6分付近のピークの画分
を集めた。これを40℃以下で、窒素ガス置換し
ながら減圧濃縮乾固することにより、1α，25
−ジヒドロキシビタミンD3を20μ得た。これは
市販の1α，25−ジヒドロキシビタミンD3（デユ
フアー社製、オランダ）の標品と液体クロマト
グラフイーの保持時間〔ゾルバツクスSIL〕、
紫外線吸収スペクトラム、マススペクトル開裂
パターンが完全に一致した。 最大紫外部吸収： λnax＝265nm（エタノール） EI−MS(m/z)： 416（M+）、398（M+−H2O）、380（M+−
2H2O）、287、269、251、152、134、129、
116、111、59 試験例 1α，25−ジヒドロキシビタミンD3のインビト
トロ薬理活性試験〔ラジオリセプターアツセイ
法〕 本試験は、臨床検査、第１号、第26巻、第７〜
18ページ（1982年）記載の方法に従つて実施し
た。ニワトリの胎児の腸管より調製された1α，
25−ジヒドロキシビタミンD3リセプター〔ヤマ
サ醤油(株)〕を10mMトリス−塩酸、0.5mM
EDTA、1mMジチオスレイトール、10mMモリ
ブデン酸ナトリウム、PH7.4の緩衝液に懸濁させ、
これをリセプター溶液（プロテイン約0.5mg／ml）
として使用した。 このリセプター溶液に、50％エタノールに溶解
した被検薬〔1α，25−ジヒドロキシビタミンD3
の標品（デユフアー社製、オランダ）〕及び実施
例１で得られた1α，25−ジヒドロキシビタミン
D3を３又は10μ、10-9〜10-5Mになるように添
加した。次いで3H−1α，25−ジヒドロキシビタ
ミンD3（約0.4μM）を添加し、０℃で３時間イン
キユベーシヨンして反応を行つた。リセプター結
合物と非結合物の分離はデキストラン−チヤコー
ル溶液（ヤマサ醤油(株)社製）を用いた。特異的結
合量は、上記反応より得られる総結合量から
10μMの1α，25−ジヒドロキシビタミンD3存在に
得られる非特異的結合量を差し引いて求めた。被
検薬の結合能は、リセプターへの3H−1α，25−
ジヒドロキシビタミンD3の結合を50％阻害する
濃度（IC50）で示した。
【表】
以上、実施例１、６、７、８、13及び16で得ら
れた1α，25−ジヒドロキシビタミンD3は、ラジ
オリセプターアツセイ法によるインビトロ薬理試
験において、市販の標品と同一の活性を示した。
れた1α，25−ジヒドロキシビタミンD3は、ラジ
オリセプターアツセイ法によるインビトロ薬理試
験において、市販の標品と同一の活性を示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ビタミンＤ類を水酸化するストレプトマイセ
ス属もしくはノカルジア属に属する放線菌又はそ
の産生する酵素を含有する溶液中に1α又は25位
に水素原子を有するビタミンＤ類を加えて、それ
ぞれその水素原子を水酸基に変換することを特徴
とする1α−ヒドロキシビタミンＤ類又は25−ヒ
ドロキシビタミンＤ類の製造方法。 ２ ビタミンＤ類を水酸化するストレプトマイセ
ス属もしくはノカルジア属に属する放線菌又はそ
の産生する酵素を含有する溶液中に1α及び25位
に水素原子を有するビタミンＤ類を加えて、その
水素原子を水酸基に変換することを特徴とする25
−ヒドロキシビタミンＤ類又は1α，25−ジヒド
ロキシビタミンＤ類の製造方法。 ３ 放線菌がストレプトマイセス・スクレロチア
ラスＴ−JS1（Streptomyces sclerotialus Ｔ−
JS1）である請求項１又は２に記載の製造方法。 ４ 放線菌がストレプトマイセス・ロゼオスポラ
スＡ−5797（Streptomces roseosporus Ａ−
5797）である請求項１又は２に記載の製造方法。 ５ 放線菌がノカルジア・オウトトロヒカＮ−
102（Nocardia autotrophica Ｎ−102）である請
求項１又は２に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63108337A JPH02469A (ja) | 1987-07-08 | 1988-04-30 | ビタミンｄ類の製造方法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62-170669 | 1987-07-08 | ||
| JP17066987 | 1987-07-08 | ||
| JP62-331323 | 1987-12-26 | ||
| JP63108337A JPH02469A (ja) | 1987-07-08 | 1988-04-30 | ビタミンｄ類の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02469A JPH02469A (ja) | 1990-01-05 |
| JPH0464678B2 true JPH0464678B2 (ja) | 1992-10-15 |
Family
ID=26448256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63108337A Granted JPH02469A (ja) | 1987-07-08 | 1988-04-30 | ビタミンｄ類の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02469A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2138516A1 (en) * | 1992-06-25 | 1994-01-06 | Hiroyuki Kawauchi | Gene for vitamin d hydroxylase |
| WO2007138894A1 (ja) | 2006-05-31 | 2007-12-06 | Mercian Corporation | 水酸化酵素遺伝子及びその用途 |
| CN100465134C (zh) * | 2007-02-09 | 2009-03-04 | 上海大学 | 低温无压烧结制备致密Ti3AlC2陶瓷的方法 |
-
1988
- 1988-04-30 JP JP63108337A patent/JPH02469A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02469A (ja) | 1990-01-05 |
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