JP3201867B2 - 核酸分析方法 - Google Patents
核酸分析方法Info
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- nucleic acid
- dna probe
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- acid analysis
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸、特にｍＲＮＡ（メ
ッセンジャーＲＮＡ）の種類と量を検出する方法に関す
る。
ッセンジャーＲＮＡ）の種類と量を検出する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】生体の活動の青写真はＤＮＡ中に書き込
まれている。生体は外部刺激等を受けて種々の生体活動
を行うが、その際その活動に関与するｍＲＮＡがまず増
加し、それに対応した蛋白が生成されて生体活動が実行
される。すなわち活動中の細胞は状況に応じて種々のｍ
ＲＮＡを作り出しており、細胞中のｍＲＮＡの種類と量
は細胞活動のフィンガープリントのようなもので、ｍＲ
ＮＡの種類と量を知ることにより細胞あるいは組織の状
態を把握することができる。また、種々の状態を支配し
ているｍＲＮＡ及びそれが作りだす蛋白質を知ることに
より、病気の治療や生体コントロールに関する知見を得
ることができ、応用の点からしてもｍＲＮＡの種類と量
を検出する方法を確立することは重要である。しかし、
活動中のｍＲＮＡを分析するのは手間がかかり大変な労
力を必要とする。
まれている。生体は外部刺激等を受けて種々の生体活動
を行うが、その際その活動に関与するｍＲＮＡがまず増
加し、それに対応した蛋白が生成されて生体活動が実行
される。すなわち活動中の細胞は状況に応じて種々のｍ
ＲＮＡを作り出しており、細胞中のｍＲＮＡの種類と量
は細胞活動のフィンガープリントのようなもので、ｍＲ
ＮＡの種類と量を知ることにより細胞あるいは組織の状
態を把握することができる。また、種々の状態を支配し
ているｍＲＮＡ及びそれが作りだす蛋白質を知ることに
より、病気の治療や生体コントロールに関する知見を得
ることができ、応用の点からしてもｍＲＮＡの種類と量
を検出する方法を確立することは重要である。しかし、
活動中のｍＲＮＡを分析するのは手間がかかり大変な労
力を必要とする。
【０００３】従来法では注目事象に関連する蛋白質を捉
え、これをコードするｍＲＮＡを調べる方法が取られて
いた。この方法によると、注目するｍＲＮＡにハイブリ
ダイズするＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）プローブを作製す
る。プローブには放射性標識が付けられている。そし
て、ｍＲＮＡが生体の種々の活動過程でどのように増減
するかを調べて、その役割を推定するが、ｍＲＮＡの検
出にはノーザンブロットが用いられる。すなわち、生体
から抽出したすべてのｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳
動で分離し、ナイロンフィルター等に分離したｍＲＮＡ
のパターンを転写する。次いで、特定のｍＲＮＡにハイ
ブリダイズする放射性標識されたＤＮＡプローブをふり
かけて目的とするｍＲＮＡにハイブリダイズさせ、その
ｍＲＮＡを標識する。その後、感光フィルムで覆って標
識ｍＲＮＡの位置を感光フィルムに転写し、それを調べ
ることにより目的とするｍＲＮＡの有無あるいは増減な
どを調べていた。
え、これをコードするｍＲＮＡを調べる方法が取られて
いた。この方法によると、注目するｍＲＮＡにハイブリ
ダイズするＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）プローブを作製す
る。プローブには放射性標識が付けられている。そし
て、ｍＲＮＡが生体の種々の活動過程でどのように増減
するかを調べて、その役割を推定するが、ｍＲＮＡの検
出にはノーザンブロットが用いられる。すなわち、生体
から抽出したすべてのｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳
動で分離し、ナイロンフィルター等に分離したｍＲＮＡ
のパターンを転写する。次いで、特定のｍＲＮＡにハイ
ブリダイズする放射性標識されたＤＮＡプローブをふり
かけて目的とするｍＲＮＡにハイブリダイズさせ、その
ｍＲＮＡを標識する。その後、感光フィルムで覆って標
識ｍＲＮＡの位置を感光フィルムに転写し、それを調べ
ることにより目的とするｍＲＮＡの有無あるいは増減な
どを調べていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】前記従来法は、ｍＲＮ
Ａの有無の調査をＤＮＡプローブがハイブリダイズした
か否かで行うため、一度に一種類のｍＲＮＡしか調べる
ことができなかった。しかし、生体中では種々のｍＲＮ
Ａがそれを基に生成される蛋白質を通して相互に影響し
ながら働いている。このため生体機能を理解し、病気の
治療指針や診断法を開発するには、各生活サイクルの中
で種々のｍＲＮＡの存在量を知る必要がある。すなわち
単一のｍＲＮＡだけなく数十あるいは数百のｍＲＮＡの
存在量の変化を同時に捉える必要があり、これを可能と
する手法の開発が望まれている。
Ａの有無の調査をＤＮＡプローブがハイブリダイズした
か否かで行うため、一度に一種類のｍＲＮＡしか調べる
ことができなかった。しかし、生体中では種々のｍＲＮ
Ａがそれを基に生成される蛋白質を通して相互に影響し
ながら働いている。このため生体機能を理解し、病気の
治療指針や診断法を開発するには、各生活サイクルの中
で種々のｍＲＮＡの存在量を知る必要がある。すなわち
単一のｍＲＮＡだけなく数十あるいは数百のｍＲＮＡの
存在量の変化を同時に捉える必要があり、これを可能と
する手法の開発が望まれている。
【０００５】本発明は、このような要請に応えてｍＲＮ
Ａの種類と存在量を同時に調べることができるｍＲＮＡ
分析方法を提供することを目的とする。なお、本明細書
ではｍＲＮＡとそのｃ−ＤＮＡ（相補ＤＮＡ）を共に含
む用語として「核酸」という用語を用いる。
Ａの種類と存在量を同時に調べることができるｍＲＮＡ
分析方法を提供することを目的とする。なお、本明細書
ではｍＲＮＡとそのｃ−ＤＮＡ（相補ＤＮＡ）を共に含
む用語として「核酸」という用語を用いる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明では、目的とする複数のｍＲＮＡまたはｃ−Ｄ
ＮＡ（相補ＤＮＡ）すなわち核酸の各々にハイブリダイ
ズさせるＤＮＡプローブの移動度を変化させ、電気泳動
により識別できるようにして、複数の核酸を識別し同時
分析する。ＤＮＡプローブの移動度を変化させる手段と
しては、プローブの長さをそれぞれ変えることによって
もよいし、プローブのリン酸基あるいは塩基部分、糖部
分の一部にアミノ基と反応する化学物質を結合させてプ
ローブ全体としての移動度を変化させることによっても
よいし、リンカー部分の長さを変えることによってもよ
い。
に本発明では、目的とする複数のｍＲＮＡまたはｃ−Ｄ
ＮＡ（相補ＤＮＡ）すなわち核酸の各々にハイブリダイ
ズさせるＤＮＡプローブの移動度を変化させ、電気泳動
により識別できるようにして、複数の核酸を識別し同時
分析する。ＤＮＡプローブの移動度を変化させる手段と
しては、プローブの長さをそれぞれ変えることによって
もよいし、プローブのリン酸基あるいは塩基部分、糖部
分の一部にアミノ基と反応する化学物質を結合させてプ
ローブ全体としての移動度を変化させることによっても
よいし、リンカー部分の長さを変えることによってもよ
い。
【０００７】核酸にハイブリダイズしたＤＮＡプローブ
だけを取りだし、複数の核酸の各々にハイブリダイズし
たＤＮＡプローブを複数の核酸の各々から昇温により核
酸から脱離（遊離）せしめた後、電気泳動させ移動度の
差によりＤＮＡプローブを分離検出し、これらＤＮＡプ
ローブの定量と定性分析を行うことにより核酸の種類と
存在量を調べる。
だけを取りだし、複数の核酸の各々にハイブリダイズし
たＤＮＡプローブを複数の核酸の各々から昇温により核
酸から脱離（遊離）せしめた後、電気泳動させ移動度の
差によりＤＮＡプローブを分離検出し、これらＤＮＡプ
ローブの定量と定性分析を行うことにより核酸の種類と
存在量を調べる。
【０００８】核酸は混合物のまま用いてもよいが、アガ
ロースゲル電気泳動で核酸を長さ分離して分画してから
ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせ、前記と同様の手
順で分析することもできる。また、それぞれ移動度の異
なる複数のＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた複数
の核酸をアガロースゲル電気泳動によって分離し、次い
で複数の核酸にハイブリダイズしたＤＮＡプローブを複
数の核酸の各々から昇温により遊離せしめた後、電気泳
動させ移動度の差によりＤＮＡプローブを分離検出する
ことにより、核酸のサイズとＤＮＡプローブのサイズに
よって２次元的に分析を行い、核酸の種類と存在量を調
べる。
ロースゲル電気泳動で核酸を長さ分離して分画してから
ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせ、前記と同様の手
順で分析することもできる。また、それぞれ移動度の異
なる複数のＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた複数
の核酸をアガロースゲル電気泳動によって分離し、次い
で複数の核酸にハイブリダイズしたＤＮＡプローブを複
数の核酸の各々から昇温により遊離せしめた後、電気泳
動させ移動度の差によりＤＮＡプローブを分離検出する
ことにより、核酸のサイズとＤＮＡプローブのサイズに
よって２次元的に分析を行い、核酸の種類と存在量を調
べる。
【０００９】各ＤＮＡプローブは放射性標識物、螢光
体、色素、化学発光物質等で標識される。電気泳動分離
されたＤＮＡプローブは、各ＤＮＡプローブに標識され
た標識物による放射線、蛍光、光吸収、化学発光等を検
出することによって検出、識別される。
体、色素、化学発光物質等で標識される。電気泳動分離
されたＤＮＡプローブは、各ＤＮＡプローブに標識され
た標識物による放射線、蛍光、光吸収、化学発光等を検
出することによって検出、識別される。
【００１０】
【作用】核酸の種類を識別するのにハイブリダイズした
ＤＮＡプローブの泳動速度の差を利用するので、数百の
プローブ、したがって数百の核酸を一度に分離検出する
ことができる。また、ＤＮＡプローブの標識を蛍光体で
行ない、蛍光体の種類を変えその発光波長を変化させる
ことにより、ＤＮＡプローブの長さと蛍光体の種類（蛍
光波長）の２つの要素の組合せで１０００近い数のＤＮ
Ａプローブを作ることができ、これら異なるＤＮＡプロ
ーブを目的とする複数の核酸の各々にハイブリダイズさ
せ、核酸にハイブリダイズしたＤＮＡプローブだけを取
りだし、昇温によりＤＮＡプローブを核酸から遊離させ
電気泳動によりＤＮＡプローブを一度に分離検出するの
で、核酸の種類と存在量とを同時に知ることができる。
ＤＮＡプローブの泳動速度の差を利用するので、数百の
プローブ、したがって数百の核酸を一度に分離検出する
ことができる。また、ＤＮＡプローブの標識を蛍光体で
行ない、蛍光体の種類を変えその発光波長を変化させる
ことにより、ＤＮＡプローブの長さと蛍光体の種類（蛍
光波長）の２つの要素の組合せで１０００近い数のＤＮ
Ａプローブを作ることができ、これら異なるＤＮＡプロ
ーブを目的とする複数の核酸の各々にハイブリダイズさ
せ、核酸にハイブリダイズしたＤＮＡプローブだけを取
りだし、昇温によりＤＮＡプローブを核酸から遊離させ
電気泳動によりＤＮＡプローブを一度に分離検出するの
で、核酸の種類と存在量とを同時に知ることができる。
【００１１】
【実施例】本発明の実施例を図１から図３を用いて説明
する。なお、以下の説明は分析対象をｍＲＮＡとして行
うが、分析対象がｃ−ＤＮＡであっても同様である。 〔実施例１〕ｍＲＮＡを細胞から取り出すにはポリチミ
ンオリゴマー（ｄＴ）nをもった磁気ビーズを使用す
る。その手順の詳細は、テクニカル ハンドブック、モ
レキュラ バイオロジィ（ダイナビィーズ バイオマグ
ネテック セパレーション システム）（Technical ha
ndbook, Molecular Biology（Dynabeads biomagnetic s
eparation system））、あるいはヌクレイック アシッ
ド リサーチ、第１８巻、３６６９頁、１９９０年〔Nu
cleic Acid Research １８，３６６９（１９９０）〕に
記載の通りである。また、ポリチミンオリゴマー（ｄ
Ｔ）nを表面に保持したマイクロタイタープレートを用
いてもよい〔ネーチャー、第３５７巻、５１９頁、１９
９２年（Nature ３５７，５１９（１９９２））〕図１
に、ｍＲＮＡ試料の調製フローを示す。図１に示すよう
に、ｍＲＮＡ１〜３は３’末端にポリアデニンオリゴマ
ー（ｄＡ）n 、４をもつ。生体試料中にポリチミンオリ
ゴマー（ｄＴ）n 鎖、６をもつ磁気ビーズ５を加えて混
合すると、アデニン鎖はチミン鎖とハイブリダイズする
ために、ｍＲＮＡは磁気ビーズ５と７〜９のように結合
する。この反応を溶液中で行った後、磁気ビーズ５をマ
グネット１２によって容器１０の一部に固定し、容器内
部を洗浄するとｍＲＮＡ以外のものを除去することがで
きる。こうして得られた溶液にはほとんどすべてのｍＲ
ＮＡが含まれており、それを試料として用いる。
する。なお、以下の説明は分析対象をｍＲＮＡとして行
うが、分析対象がｃ−ＤＮＡであっても同様である。 〔実施例１〕ｍＲＮＡを細胞から取り出すにはポリチミ
ンオリゴマー（ｄＴ）nをもった磁気ビーズを使用す
る。その手順の詳細は、テクニカル ハンドブック、モ
レキュラ バイオロジィ（ダイナビィーズ バイオマグ
ネテック セパレーション システム）（Technical ha
ndbook, Molecular Biology（Dynabeads biomagnetic s
eparation system））、あるいはヌクレイック アシッ
ド リサーチ、第１８巻、３６６９頁、１９９０年〔Nu
cleic Acid Research １８，３６６９（１９９０）〕に
記載の通りである。また、ポリチミンオリゴマー（ｄ
Ｔ）nを表面に保持したマイクロタイタープレートを用
いてもよい〔ネーチャー、第３５７巻、５１９頁、１９
９２年（Nature ３５７，５１９（１９９２））〕図１
に、ｍＲＮＡ試料の調製フローを示す。図１に示すよう
に、ｍＲＮＡ１〜３は３’末端にポリアデニンオリゴマ
ー（ｄＡ）n 、４をもつ。生体試料中にポリチミンオリ
ゴマー（ｄＴ）n 鎖、６をもつ磁気ビーズ５を加えて混
合すると、アデニン鎖はチミン鎖とハイブリダイズする
ために、ｍＲＮＡは磁気ビーズ５と７〜９のように結合
する。この反応を溶液中で行った後、磁気ビーズ５をマ
グネット１２によって容器１０の一部に固定し、容器内
部を洗浄するとｍＲＮＡ以外のものを除去することがで
きる。こうして得られた溶液にはほとんどすべてのｍＲ
ＮＡが含まれており、それを試料として用いる。
【００１２】本実施例では、０．１ｍｇのポリチミンオ
リゴマー（ｄＴ）25付きの磁気ビーズを用い生体試料中
のｍＲＮＡをハイブリダイズさせて分離したが、磁気ビ
ーズに付着するｍＲＮＡの量は高々約０．２μｇであ
る。ｍＲＮＡの平均鎖長を２Ｋ塩基とするとこれは約２
×１０11分子に相当する。この中に含まれる各ｍＲＮＡ
のコピー数は１０7−１０8分子以下である。
リゴマー（ｄＴ）25付きの磁気ビーズを用い生体試料中
のｍＲＮＡをハイブリダイズさせて分離したが、磁気ビ
ーズに付着するｍＲＮＡの量は高々約０．２μｇであ
る。ｍＲＮＡの平均鎖長を２Ｋ塩基とするとこれは約２
×１０11分子に相当する。この中に含まれる各ｍＲＮＡ
のコピー数は１０7−１０8分子以下である。
【００１３】次に図２に示すように、ｃ−ＤＮＡ（相補
ＤＮＡ）データベースから分析しようとするｍＲＮＡに
ハイブリダイズするＤＮＡプローブを選びだす。ＤＮＡ
プローブは、構成する塩基の長さやリンカーの長さを調
節し各ｍＲＮＡに対応してゲル電気泳動速度（移動度）
が異なるようにしてあり、電気泳動分離することによ
り、計測されたＤＮＡプローブがどのｍＲＮＡにハイブ
リダイズしたものか識別できるようにしてある。
ＤＮＡ）データベースから分析しようとするｍＲＮＡに
ハイブリダイズするＤＮＡプローブを選びだす。ＤＮＡ
プローブは、構成する塩基の長さやリンカーの長さを調
節し各ｍＲＮＡに対応してゲル電気泳動速度（移動度）
が異なるようにしてあり、電気泳動分離することによ
り、計測されたＤＮＡプローブがどのｍＲＮＡにハイブ
リダイズしたものか識別できるようにしてある。
【００１４】ＤＮＡプローブは32Ｐなど放射性同位元素
を用いて標識してもよいが、ここではＤＮＡプローブを
螢光体で標識する蛍光標識を例にとって説明する。例え
ば、ＤＮＡプローブの各々の５’末端にアミノ基を介し
て蛍光体ＦＩＴＣ（フルオレセイン イソチオシアネー
ト：発光波長５１５ｎｍ）を結合させる。ＤＮＡプロー
ブとして３００程使用したが、泳動速度が約２塩基分異
なる５０種のＤＮＡプローブからなるグループを６組作
製して用いた。ＤＮＡプローブの長さは２０塩基から１
２０塩基まであり、長くなるにつれイノシンなどを入れ
てハイブリドーマーの安定度が極端に異ならないように
工夫している。以後これらをプローブセット１〜プロー
ブセット６と呼ぶ。図２には、説明の簡略化のためプロ
ーブセット１を使用した場合についてのみ示した。
を用いて標識してもよいが、ここではＤＮＡプローブを
螢光体で標識する蛍光標識を例にとって説明する。例え
ば、ＤＮＡプローブの各々の５’末端にアミノ基を介し
て蛍光体ＦＩＴＣ（フルオレセイン イソチオシアネー
ト：発光波長５１５ｎｍ）を結合させる。ＤＮＡプロー
ブとして３００程使用したが、泳動速度が約２塩基分異
なる５０種のＤＮＡプローブからなるグループを６組作
製して用いた。ＤＮＡプローブの長さは２０塩基から１
２０塩基まであり、長くなるにつれイノシンなどを入れ
てハイブリドーマーの安定度が極端に異ならないように
工夫している。以後これらをプローブセット１〜プロー
ブセット６と呼ぶ。図２には、説明の簡略化のためプロ
ーブセット１を使用した場合についてのみ示した。
【００１５】ＤＮＡプローブセット中の各プローブの量
は１ｆｍｏｌ．（フェムトモル）とした。試料を図２の
ように６等分し、各分画にプローブセット１〜プローブ
セット６を加えてプローブをハイブリダイズさせる。次
いで磁石１２を用いて磁気ビーズとそれに付着したｍＲ
ＮＡ、さらにｍＲＮＡにハイブリダイズした蛍光標識Ｄ
ＮＡプローブを容器１０の一部に固定し余剰のＤＮＡプ
ローブを洗浄・除去する。この操作で１０１〜１０３の
ように磁気ビーズが捕捉したｍＲＮＡに蛍光標識プロー
ブが結合する。
は１ｆｍｏｌ．（フェムトモル）とした。試料を図２の
ように６等分し、各分画にプローブセット１〜プローブ
セット６を加えてプローブをハイブリダイズさせる。次
いで磁石１２を用いて磁気ビーズとそれに付着したｍＲ
ＮＡ、さらにｍＲＮＡにハイブリダイズした蛍光標識Ｄ
ＮＡプローブを容器１０の一部に固定し余剰のＤＮＡプ
ローブを洗浄・除去する。この操作で１０１〜１０３の
ように磁気ビーズが捕捉したｍＲＮＡに蛍光標識プロー
ブが結合する。
【００１６】次に図３のようにして、ｍＲＮＡに結合し
た長さの異なるプローブを電気泳動で分離分析する。ｍ
ＲＮＡにハイブリダイズしたＤＮＡプローブは、磁気ビ
ーズごと分離用のキャピラリーゲル２０１の上端部にの
せられる。ロート状のキャピラリー上部（試料添加部兼
負電極槽）２０２に試料液を注入すると、ＤＮＡプロー
ブは磁気ビーズ２１０と共にキャピラリー上端部に沈ん
でいく。磁石２０５を用いて磁気ビーズ２１０を上端部
に局在化させた後、この部分を加熱器２０６で９０〜１
００℃に加熱してＤＮＡプローブを脱離させる。キャピ
ラリーゲル２０１の両端には泳動電圧がかけられてお
り、脱離したＤＮＡプローブ５１〜５３は下方へ泳動し
ていくが、ＤＮＡプローブは対応するｍＲＮＡの種類に
応じて異なる泳動速度を有するので各プローブを分離す
ることができる。
た長さの異なるプローブを電気泳動で分離分析する。ｍ
ＲＮＡにハイブリダイズしたＤＮＡプローブは、磁気ビ
ーズごと分離用のキャピラリーゲル２０１の上端部にの
せられる。ロート状のキャピラリー上部（試料添加部兼
負電極槽）２０２に試料液を注入すると、ＤＮＡプロー
ブは磁気ビーズ２１０と共にキャピラリー上端部に沈ん
でいく。磁石２０５を用いて磁気ビーズ２１０を上端部
に局在化させた後、この部分を加熱器２０６で９０〜１
００℃に加熱してＤＮＡプローブを脱離させる。キャピ
ラリーゲル２０１の両端には泳動電圧がかけられてお
り、脱離したＤＮＡプローブ５１〜５３は下方へ泳動し
ていくが、ＤＮＡプローブは対応するｍＲＮＡの種類に
応じて異なる泳動速度を有するので各プローブを分離す
ることができる。
【００１７】分離に用いるゲルは架橋剤を３重量％含む
６重量％のポリアクリルアミド（６％Ｔ、３％Ｃ）で、
ＤＮＡ塩基配列決定に用いるのと同じものである〔アナ
リティカル ケミストリ、第６２巻、９００頁、１９９
０年（Analytical Chemistry６２，９００（１９９
０））〕。分離部のゲル長は２５ｃｍで４００塩基長ま
で１塩基の分離が可能である。ゲルキャピラリーの下端
あるいはシースフロー中にＤＮＡプローブを抜き出した
所をレーザー照射して発する蛍光を計測する。蛍光の測
光系は、例えば特願平３−２３４４２７号に記載のもの
を用いることができる。図３の実施例では、キャピラリ
ーゲル２０１から溶出した蛍光標識ＤＮＡプローブはシ
ース液によって下方の正電極槽２０９に運ばれるが、そ
の途中で紙面垂直方向からキャピラリーゲル２０１の末
端下方約０．５ｍｍの位置に照射されるレーザ光（図で
は簡単のため、レーザ２０７を紙面内に図示している）
によってプローブの標識蛍光体が励起される。標識蛍光
体から発せられた蛍光は、図示しないレンズ系、フィル
ター系を介して検出器２０８で検出される。検出された
蛍光強度は、そのＤＮＡプローブにハイブリダイズする
ｍＲＮＡの量に対応する。
６重量％のポリアクリルアミド（６％Ｔ、３％Ｃ）で、
ＤＮＡ塩基配列決定に用いるのと同じものである〔アナ
リティカル ケミストリ、第６２巻、９００頁、１９９
０年（Analytical Chemistry６２，９００（１９９
０））〕。分離部のゲル長は２５ｃｍで４００塩基長ま
で１塩基の分離が可能である。ゲルキャピラリーの下端
あるいはシースフロー中にＤＮＡプローブを抜き出した
所をレーザー照射して発する蛍光を計測する。蛍光の測
光系は、例えば特願平３−２３４４２７号に記載のもの
を用いることができる。図３の実施例では、キャピラリ
ーゲル２０１から溶出した蛍光標識ＤＮＡプローブはシ
ース液によって下方の正電極槽２０９に運ばれるが、そ
の途中で紙面垂直方向からキャピラリーゲル２０１の末
端下方約０．５ｍｍの位置に照射されるレーザ光（図で
は簡単のため、レーザ２０７を紙面内に図示している）
によってプローブの標識蛍光体が励起される。標識蛍光
体から発せられた蛍光は、図示しないレンズ系、フィル
ター系を介して検出器２０８で検出される。検出された
蛍光強度は、そのＤＮＡプローブにハイブリダイズする
ｍＲＮＡの量に対応する。
【００１８】ここでは蛍光体５０としてＦＩＴＣを用い
たが、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミン イソチオ
シアネート（発光波長５７５ｎｍ）や、スルフォローダ
ミン１０１（発光波長６１５ｎｍ）を用いてもよい。更
に、発光波長の異なる蛍光体による標識とＤＮＡプロー
ブ長を組み合わせて一度に数百のプローブを検出するこ
ともできる。
たが、ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミン イソチオ
シアネート（発光波長５７５ｎｍ）や、スルフォローダ
ミン１０１（発光波長６１５ｎｍ）を用いてもよい。更
に、発光波長の異なる蛍光体による標識とＤＮＡプロー
ブ長を組み合わせて一度に数百のプローブを検出するこ
ともできる。
【００１９】電気泳動に際してｍＲＮＡは、ＤＮＡプロ
ーブに比較しはるかに長い（平均２Ｋ塩基）ためゲルの
上端部近傍に留まっている。したがって、すべてのプロ
ーブが下端から溶出した後、逆方向にｍＲＮＡを泳動さ
せて再び磁気ビーズにトラップし、別のプローブセット
で再度検出を試みることもできる。この場合、少ない試
料で多くのｍＲＮＡを分析することができる。ここでは
ｍＲＮＡを直接調べたが、ｍＲＮＡをｍＲＮＡより安定
性のよいｃ−ＤＮＡに直して同様の分析を行うこともで
きる。すなわち、磁気ビーズに付着したポリチミンオリ
ゴマーをプライマーとして相補鎖合成を行い、磁気ビー
ズに付着したｃ−ＤＮＡを得た後に計測することもでき
る。
ーブに比較しはるかに長い（平均２Ｋ塩基）ためゲルの
上端部近傍に留まっている。したがって、すべてのプロ
ーブが下端から溶出した後、逆方向にｍＲＮＡを泳動さ
せて再び磁気ビーズにトラップし、別のプローブセット
で再度検出を試みることもできる。この場合、少ない試
料で多くのｍＲＮＡを分析することができる。ここでは
ｍＲＮＡを直接調べたが、ｍＲＮＡをｍＲＮＡより安定
性のよいｃ−ＤＮＡに直して同様の分析を行うこともで
きる。すなわち、磁気ビーズに付着したポリチミンオリ
ゴマーをプライマーとして相補鎖合成を行い、磁気ビー
ズに付着したｃ−ＤＮＡを得た後に計測することもでき
る。
【００２０】〔実施例２〕前記実施例ではｍＲＮＡは混
合物のまま用いたが、ｍＲＮＡを長さで分離してからＤ
ＮＡプローブをハイブリダイズさせて分析することもで
きる。すなわち、磁気ビーズで捕捉したｍＲＮＡを熱脱
離させた後、アガロースゲル電気泳動分離する。その
際、短いチューブ状のゲルを用いて溶出してくるｍＲＮ
Ａを分画するか、長いゲル中に分離した状態で保持し、
その後ゲルを切り出して長さの異なるｍＲＮＡ毎の分画
を作る。
合物のまま用いたが、ｍＲＮＡを長さで分離してからＤ
ＮＡプローブをハイブリダイズさせて分析することもで
きる。すなわち、磁気ビーズで捕捉したｍＲＮＡを熱脱
離させた後、アガロースゲル電気泳動分離する。その
際、短いチューブ状のゲルを用いて溶出してくるｍＲＮ
Ａを分画するか、長いゲル中に分離した状態で保持し、
その後ゲルを切り出して長さの異なるｍＲＮＡ毎の分画
を作る。
【００２１】このようにして作られた各分画をそれぞれ
試料とし、プローブセットを用いて前記実施例と同様の
方法で分析を行う。各分画にポリチミンオリゴマー（ｄ
Ｔ） nをもった磁気ビーズとＤＮＡプローブセットを加
えてハイブリダイズさせ、余剰のＤＮＡプローブ等を洗
浄して除去する。次に図３で説明したように、各分画に
含まれるＤＮＡプローブを加熱脱離させ、各分画毎に異
なる泳動路を用いてＤＮＡプローブを長さ分離する。
試料とし、プローブセットを用いて前記実施例と同様の
方法で分析を行う。各分画にポリチミンオリゴマー（ｄ
Ｔ） nをもった磁気ビーズとＤＮＡプローブセットを加
えてハイブリダイズさせ、余剰のＤＮＡプローブ等を洗
浄して除去する。次に図３で説明したように、各分画に
含まれるＤＮＡプローブを加熱脱離させ、各分画毎に異
なる泳動路を用いてＤＮＡプローブを長さ分離する。
【００２２】本実施例によると、ｍＲＮＡのサイズとＤ
ＮＡプローブのサイズを用いて２次元的に分析できるの
で、数千のｍＲＮＡの分析を一度に行うことができる。
このとき、１つのプローブが複数のｍＲＮＡとハイブリ
ダイズするようにしておくと、少ない数のプローブで多
くのｍＲＮＡを分析することができ、しかもプローブの
長さとメッセンジャーの長さの２つの情報からそのプロ
ーブがハイブリダイズしたｍＲＮＡを確定することがで
きるのである。
ＮＡプローブのサイズを用いて２次元的に分析できるの
で、数千のｍＲＮＡの分析を一度に行うことができる。
このとき、１つのプローブが複数のｍＲＮＡとハイブリ
ダイズするようにしておくと、少ない数のプローブで多
くのｍＲＮＡを分析することができ、しかもプローブの
長さとメッセンジャーの長さの２つの情報からそのプロ
ーブがハイブリダイズしたｍＲＮＡを確定することがで
きるのである。
【００２３】本実施例においては、分析のスループット
を上げるため、前記特願平３ー２３４４２７号に記載し
た複数のゲルキャピラリーを含むゲル電気泳動装置を用
いて複数の分画を同時に電気泳動させ、ラインセンサ
ー、イメージ増幅器付ダイオードアレー、あるいはＣＣ
Ｄ検出器等を用いて同時に蛍光測光するようにしてもよ
い。
を上げるため、前記特願平３ー２３４４２７号に記載し
た複数のゲルキャピラリーを含むゲル電気泳動装置を用
いて複数の分画を同時に電気泳動させ、ラインセンサ
ー、イメージ増幅器付ダイオードアレー、あるいはＣＣ
Ｄ検出器等を用いて同時に蛍光測光するようにしてもよ
い。
【００２４】〔実施例３〕前記実施例２ではｍＲＮＡを
サイズ分画したが、分画せずに２次元電気泳動で分離計
測することもできる。その手順を説明すると、まず図１
に示したように磁気ビーズを用いてｍＲＮＡを捕捉し、
精製する。次いで昇温してハイブリダイズしたアデニン
鎖−チミン鎖（ポリチミンオリゴマー−ポリアデニンオ
リゴマーハイブリダイゼーション）を解離し、磁気ビー
ズだけを除去してｍＲＮＡを得る。それにＤＮＡプロー
ブを加えてｍＲＮＡにハイブリダイズさせる。得られた
混合物を内径０．５〜１ｍｍ程度のキャピラリーゲル
（アガロース１％）中に注入する。
サイズ分画したが、分画せずに２次元電気泳動で分離計
測することもできる。その手順を説明すると、まず図１
に示したように磁気ビーズを用いてｍＲＮＡを捕捉し、
精製する。次いで昇温してハイブリダイズしたアデニン
鎖−チミン鎖（ポリチミンオリゴマー−ポリアデニンオ
リゴマーハイブリダイゼーション）を解離し、磁気ビー
ズだけを除去してｍＲＮＡを得る。それにＤＮＡプロー
ブを加えてｍＲＮＡにハイブリダイズさせる。得られた
混合物を内径０．５〜１ｍｍ程度のキャピラリーゲル
（アガロース１％）中に注入する。
【００２５】キャピラリーゲルの注入口の上を長さ１０
ｍｍのポリアクリルアミドゲル（８％Ｔ、３％Ｃ）ある
いは半透膜で封じて、まず泳動分離と逆方向（ポリアク
リルアミドゲルあるいは半透膜側）に電気泳動させる。
すると、ハイブリダイズしたＤＮＡプローブとフリーの
ＤＮＡプローブでは後者の方が１桁近く速く泳動するの
で、フリーのＤＮＡプローブは１〜５分でポリアクリル
アミドゲルあるいは半透膜を通過し、除去される。しか
しハイブリダイズしたＤＮＡプローブとｍＲＮＡはゲル
表面あるいはゲル内に残る。そこで電界を通常の分離方
向としてハイブリドマーを分離する。
ｍｍのポリアクリルアミドゲル（８％Ｔ、３％Ｃ）ある
いは半透膜で封じて、まず泳動分離と逆方向（ポリアク
リルアミドゲルあるいは半透膜側）に電気泳動させる。
すると、ハイブリダイズしたＤＮＡプローブとフリーの
ＤＮＡプローブでは後者の方が１桁近く速く泳動するの
で、フリーのＤＮＡプローブは１〜５分でポリアクリル
アミドゲルあるいは半透膜を通過し、除去される。しか
しハイブリダイズしたＤＮＡプローブとｍＲＮＡはゲル
表面あるいはゲル内に残る。そこで電界を通常の分離方
向としてハイブリドマーを分離する。
【００２６】一定時間だけ電気泳動させた後、チューブ
ゲルを抜取り、ポリアクリルアミド平板ゲル上に乗せて
２次元目の分離を行う。この２次元目の分離は、米国特
許第４３０５７９９号明細書に記載された装置と類似の
装置で行うことができる。すなわち、チューブ状ゲル部
を加熱し、ＤＮＡプローブをｍＲＮＡから脱離せしめた
後、ＤＮＡプローブをチューブゲルと直角方向に泳動さ
せ、長さ分離する。ＤＮＡプローブの長さとｍＲＮＡの
大きさ横方向の位置からＤＮＡプローブがハイブリダイ
ズしたｍＲＮＡの種類がわかり、検出されたＤＮＡプロ
ーブ量からｍＲＮＡの量がわかる。
ゲルを抜取り、ポリアクリルアミド平板ゲル上に乗せて
２次元目の分離を行う。この２次元目の分離は、米国特
許第４３０５７９９号明細書に記載された装置と類似の
装置で行うことができる。すなわち、チューブ状ゲル部
を加熱し、ＤＮＡプローブをｍＲＮＡから脱離せしめた
後、ＤＮＡプローブをチューブゲルと直角方向に泳動さ
せ、長さ分離する。ＤＮＡプローブの長さとｍＲＮＡの
大きさ横方向の位置からＤＮＡプローブがハイブリダイ
ズしたｍＲＮＡの種類がわかり、検出されたＤＮＡプロ
ーブ量からｍＲＮＡの量がわかる。
【００２７】以上の各実施例では蛍光標識を使用する場
合について説明したが、銀染色等の色素による標識、32
Ｐ等の放射性元素による標識、パーオキシダーゼとルミ
ノールあるいはDigoxigen等の化学発光材料による標識
も使用できる。標識として色素を用いる場合の検出手段
としては光吸収が利用され、放射性元素あるいは化学発
光材料を用いる場合には、分離したＤＮＡプローブをゲ
ル中に保持し、化学発光材料の場合は発光試薬を添加し
て、感光フィルムにパターンを転写するなどの手法が用
いられる。
合について説明したが、銀染色等の色素による標識、32
Ｐ等の放射性元素による標識、パーオキシダーゼとルミ
ノールあるいはDigoxigen等の化学発光材料による標識
も使用できる。標識として色素を用いる場合の検出手段
としては光吸収が利用され、放射性元素あるいは化学発
光材料を用いる場合には、分離したＤＮＡプローブをゲ
ル中に保持し、化学発光材料の場合は発光試薬を添加し
て、感光フィルムにパターンを転写するなどの手法が用
いられる。
【００２８】
【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、ｍＲ
ＮＡにハイブリダイズするＤＮＡプローブの泳動速度を
異ならせることにより、多数のＤＮＡプローブを同時に
分析し、それによって複数のｍＲＮＡの種類と量を同時
に計測することができる。
ＮＡにハイブリダイズするＤＮＡプローブの泳動速度を
異ならせることにより、多数のＤＮＡプローブを同時に
分析し、それによって複数のｍＲＮＡの種類と量を同時
に計測することができる。
【図１】ｍＲＮＡ試料の調整を示すフロー図。
【図２】磁気ビーズに捕捉したｍＲＮＡと結合する標識
プローブを得るフロー図。
プローブを得るフロー図。
【図３】電気泳動による各プローブの分離分析を説明す
る概念図。
る概念図。
１，２，３…ｍＲＮＡ、４…ポリアデニン、５…磁気ビ
ーズ、６…ポリチミンオリゴマー、７，８，９…磁気ビ
ーズに捕捉されたｍＲＮＡ、１０…容器、１１…反応
液、１２…磁石、１３…磁気ビーズ、５０…蛍光体、５
１，５２，５３…脱離した蛍光標識プローブ、１０１，
１０２，１０３…磁気ビーズが捕捉したｍＲＮＡに結合
した蛍光標識プローブ、２０１…キャピラリーゲル、２
０２…ロート状の試料添加部兼負電極槽、２０５…磁
石、２０６…加熱器、２０７…レーザー発振器、２０８
…検出器、２０９…正電極槽、２１０…磁気ビーズ、２
１１…反応液。
ーズ、６…ポリチミンオリゴマー、７，８，９…磁気ビ
ーズに捕捉されたｍＲＮＡ、１０…容器、１１…反応
液、１２…磁石、１３…磁気ビーズ、５０…蛍光体、５
１，５２，５３…脱離した蛍光標識プローブ、１０１，
１０２，１０３…磁気ビーズが捕捉したｍＲＮＡに結合
した蛍光標識プローブ、２０１…キャピラリーゲル、２
０２…ロート状の試料添加部兼負電極槽、２０５…磁
石、２０６…加熱器、２０７…レーザー発振器、２０８
…検出器、２０９…正電極槽、２１０…磁気ビーズ、２
１１…反応液。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 古山 宏子 東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地 株式会社 日立製作所 中央研究所内 (56)参考文献 特開 平６−317586（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−267898（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−229365（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−128000（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−75958（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−122956（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−258168（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−162752（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−256059（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−214752（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−189796（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−153996（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−153998（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−43159（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/447 G01N 33/50 G01N 33/58 C12Q 1/68
Claims (16)
- 【請求項１】（１）複数種類の核酸の種類毎に移動度が
異なるＤＮＡプローブをハイブリダイズさせる工程と、 （２）遊離している前記ＤＮＡプローブを除去する工程
と、 （３）前記核酸にハイブリダイズした前記ＤＮＡプロー
ブを遊離させる工程と、 （４）工程（３）で遊離させた前記ＤＮＡプローブを前
記移動度の差により分離して検出する工程とを有するこ
とを特徴とする核酸分析方法。 - 【請求項２】請求項１に記載の核酸分析方法において、
前記核酸は電気泳動により異なる長さに分画して得られ
たものであることを特徴とする核酸分析方法。 - 【請求項３】請求項１又は２に記載の核酸分析方法にお
いて、工程（４）で前記ＤＮＡプローブの分離を電気泳
動により行なうことを特徴とする核酸分析方法。 - 【請求項４】請求項１〜３の何れか１項に記載の核酸分
析方法において、前記ＤＮＡプローブの長さを変化させ
るか、又は、前記ＤＮＡプローブを化学的に修飾する物
質を変化させることにより前記移動度を異ならせること
を特徴とする核酸分析方法。 - 【請求項５】請求項１〜４の何れか１項に記載の核酸分
析方法において、工程（３）で前記ＤＮＡプローブを昇
温により遊離させることを特徴とする核酸分析方法。 - 【請求項６】請求項１〜５の何れか１項に記載の核酸分
析方法において、前記ＤＮＡプローブは、放射性元素、
蛍光体、色素、化学発光物質の何れかで標識されてお
り、前記放射性元素からの放射線、前記蛍光体からの蛍
光、前記色素による光吸収、前記化学発光物質からの化
学発光の何れかの検出により前記ＤＮＡプローブを検出
することを特徴とする核酸分析方法。 - 【請求項７】（１）複数種類の核酸の種類毎に移動度が
異なるＤＮＡプローブをハイブリダイズさせる工程と、 （２）遊離している前記ＤＮＡプローブを除去する工程
と、 （３）工程（２）で得られる前記ＤＮＡプローブがハイ
ブリダイズした前記核酸を電気泳動媒体を用いて第１の
電気泳動により分離する工程と、 （４）前記第１の電気泳動により分離され前記ＤＮＡプ
ローブがハイブリダイズした前記核酸から前記ＤＮＡプ
ローブを遊離させる工程と、 （５）工程（４）で遊離させた前記ＤＮＡプローブを前
記移動度の差に基づいて第２の電気泳動により分離して
検出する工程とを有することを特徴とする核酸分析方
法。 - 【請求項８】請求項７に記載の核酸分析方法において、
前記電気泳動媒体がアガロースであることを特徴とする
核酸分析方法。 - 【請求項９】請求項７に記載の核酸分析方法において、
前記第２の電気泳動に用いる電気泳動媒体がポリアクリ
ルアミドであることを特徴とする核酸分析方法。 - 【請求項１０】請求項７〜９の何れか１項に記載の核酸
分析方法において、前記ＤＮＡプローブの長さを変化さ
せるか、又は、前記ＤＮＡプローブを化学的に修飾する
物質を変化させることにより前記移動度を異ならせるこ
とを特徴とする核酸分析方法。 - 【請求項１１】請求項７〜１０の何れか１項に記載の核
酸分析方法において、工程（４）で前記ＤＮＡプローブ
を昇温により遊離させることを特徴とする核酸分析方
法。 - 【請求項１２】請求項７〜１１の何れか１項に記載の核
酸分析方法において、前記ＤＮＡプローブは、放射性元
素、蛍光体、色素、化学発光物質の何れかで標識されて
おり、前記放射性元素からの放射線、前記蛍光体からの
蛍光、前記色素による光吸収、前記化学発光物質からの
化学発光の何れかの検出により前記ＤＮＡプローブを検
出することを特徴とする核酸分析方法。 - 【請求項１３】（１）複数種類の核酸の種類毎に移動度
が異なるＤＮＡプローブをハイブリダイズさせる工程
と、 （２）前記ＤＮＡプローブがハイブリダイズした前記核
酸と遊離している前記ＤＮＡプローブとを電気泳動分離
して前記ＤＮＡプローブを電気泳動媒体から除去する工
程と、 （３）工程（２）に続いて、前記泳動媒体中で前記ＤＮ
Ａプローブがハイブリダイズした前記核酸を泳動分離す
る工程と、 （４）第２の電気泳動に先立って、前記泳動媒体中の、
前記ＤＮＡプローブがハイブリダイズした前記核酸から
前記ＤＮＡプローブを遊離させる工程と、 （５）工程（４）で遊離させた前記ＤＮＡプローブを前
記移動度の差に基づいて前記第２の電気泳動により分離
して検出する工程とを有することを特徴とする核酸分析
方法。 - 【請求項１４】請求項１３に記載の核酸分析方法におい
て、前記ＤＮＡプローブの長さを変化させるか、又は、
前記ＤＮＡプローブを化学的に修飾する物質を変化させ
ることにより前記移動度を異ならせることを特徴とする
核酸分析方法。 - 【請求項１５】請求項１３又は１４に記載の核酸分析方
法において、工程（４）で前記ＤＮＡプローブを昇温に
より遊離させることを特徴とする核酸分析方法。 - 【請求項１６】請求項１３〜１５の何れか１項に記載の
核酸分析方法において、前記ＤＮＡプローブは、放射性
元素、蛍光体、色素、化学発光物質の何れかで標識され
ており、前記放射性元素からの放射線、前記蛍光体から
の蛍光、前記色素による光吸収、前記化学発光物質から
の化学発光の何れかの検出により前記ＤＮＡプローブを
検出することを特徴とする拡散分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08443393A JP3201867B2 (ja) | 1993-04-12 | 1993-04-12 | 核酸分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP08443393A JP3201867B2 (ja) | 1993-04-12 | 1993-04-12 | 核酸分析方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06294796A JPH06294796A (ja) | 1994-10-21 |
| JP3201867B2 true JP3201867B2 (ja) | 2001-08-27 |
Family
ID=13830457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08443393A Expired - Fee Related JP3201867B2 (ja) | 1993-04-12 | 1993-04-12 | 核酸分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3201867B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5605798A (en) | 1993-01-07 | 1997-02-25 | Sequenom, Inc. | DNA diagnostic based on mass spectrometry |
| AU1811197A (en) * | 1996-02-25 | 1997-09-10 | Precision System Science Co., Ltd. | Method for treating biopolymers, microorganisms or materials by using more than one type of magnetic particles |
| US6133436A (en) * | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
| WO1998051823A1 (en) | 1997-05-16 | 1998-11-19 | Mosaic Technologies | Electrophoretic analysis of molecules using immobilized probes |
| JP4514482B2 (ja) * | 2004-03-09 | 2010-07-28 | 日本ソフトウェアマネジメント株式会社 | 目的塩基配列の検出方法 |
| EP4330427A1 (en) * | 2021-04-29 | 2024-03-06 | Translate Bio, Inc. | Methods for measuring poly a tail length |
-
1993
- 1993-04-12 JP JP08443393A patent/JP3201867B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06294796A (ja) | 1994-10-21 |
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