JP3318323B2 - 組換肝実質細胞増殖因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は肝実質細胞増殖活性
を有するポリペプチド、さらに詳しくは、生体外(in vi
tro)で肝実質細胞の維持、増殖を可能にする生理活性を
有する新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコードす
るＤＮＡ、組換発現ベクター、形質転換体および該ポリ
ペプチドの製造法に関するものである。本発明のポリペ
プチドは肝実質細胞培養試薬、肝再生促進剤、肝機能の
基礎的研究、肝実質細胞に対する各種ホルモンや薬剤の
作用の研究、肝癌の発癌研究用、さらに該ポリペプチド
に対する抗体を用いる臨床診断試薬、肝疾患治療薬など
への利用が期待出来る。

【０００２】

【従来の技術】従来、細胞増殖活性を有するポリペプチ
ドとして、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増
殖因子（ＦＧＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、血小
板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子
（ＥＣＧＦ）などが知られている。これらの細胞増殖因
子の他に、生体外において肝実質細胞増殖活性を有する
ポリペプチドが１９８４年に中村らによって再生肝ラッ
ト血清より部分精製され、肝実質細胞増殖因子（以下Ｈ
ＧＦと略す）と命名された。このＨＧＦの発見まで肝実
質細胞は、各種の株化細胞が活発に増殖する哺乳動物血
清の存在下でも該細胞の増殖が全く認められず、通常約
１週間で培養容器の壁からの脱落が起こり、生体外での
長期培養は不可能であった。ところが、このＨＧＦの存
在下において肝細胞は極めて良好に増殖し、該細胞の培
養が可能となった(Biochem. Biophys. Res. Commun., 1
22, 1450, 1984)。他の研究者によっても、このＨＧＦ
活性は、肝部分切除手術後の血中、劇症肝炎患者の血中
にも存在することが確認された。その後、多くの研究者
によって精製法、化学的性質、生物学的性質が明らかに
されたが、このＨＧＦあるいはＨＧＦと同様の肝細胞増
殖活性を有するポリペプチドのアミノ酸構造を同定する
までには至らなかった。このような状況の下で、本発明
者らは、先にラット血小板などの組織からＨＧＦを分離
精製して研究を重ね、この血小板由来のＨＧＦは、２種
のサブユニットからなり、このＨＧＦは生体外において
肝実質細胞を極めて良好に増殖させることを見出すとと
もにＨＧＦに含有される一部のアミノ酸配列２７残基を
同定することに成功した（特願昭６３−３１１８６６
号）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】生体内ＨＧＦは、肝
臓、脳、肺臓、骨髄、ひ臓、胎盤、腎臓などの臓器ある
いは血小板や白血球など血液細胞などから極微量分泌さ
れるポリペプチドであるため、原材料組織の入手、ＨＧ
Ｆの収量、安定供給など問題点が多い。このＨＧＦを肝
実質細胞の培養や肝細胞の研究用として利用するために
は、その構造を明らかにしＨＧＦあるいはＨＧＦと同様
な活性を有するポリペプチトを遺伝子組換技術を応用し
て大量に供給することが望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ラット肝臓ｍＲＮ
Ａより調製したｃＤＮＡライブラリーより、ラット血小
板由来のＨＧＦのアミノ酸配列に基づいて合成したオリ
ゴヌクレオチドをプローブとして用い、ラットＨＧＦβ
鎖ポリペプチドをコードする塩基配列を含有するｃＤＮ
Ａが得られることを見い出した。さらに、ラット由来の
該ｃＤＮＡの全部あるいはその一部をプローブとして、
ヒト肝臓ｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡライブラリー
よりヒトＨＧＦポリペプチドをコードする塩基配列を含
有するｃＤＮＡが得られることを見出した。また、ヒト
の肝臓以外の臓器や血液細胞のｃＤＮＡライブラリーよ
りヒトＨＧＦｃＤＮＡが得られることも見出した。さら
に、該ｃＤＮＡを含有する組換発現ベクターによって形
質転換された形質転換体、該形質転換体を培養してヒト
ＨＧＦ遺伝子が発現することを見出し、本発明を完成さ
せるに至った。すなわち、本発明は組換ヒト肝実質細胞
増殖因子、ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配
列を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを発現し得る組換発現ベ
クター、該組換発現ベクターで形質転換された形質転換
体および該形質転換体を培養し、該培養物から組換ヒト
肝実質細胞増殖因子を採取・製造する方法である。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明のヒト肝実質細胞増殖因子
をコードするＤＮＡ、組換発現ベクター、および形質転
換体は、例えば次のようにして調製される。すなわち、
(1)ラット肝細胞やラット巨核球などの動物組織よりｍ
ＲＮＡまたは染色体ＤＮＡを単離し、常法に従ってｃＤ
ＮＡライブラリーまたは染色体ＤＮＡライブラリーを作
製し、(2)合成オリゴヌクレオチドプローブ、あるいは
抗体を用いて動物、例えばラットのＨＧＦのｃＤＮＡま
たは染色体ＤＮＡを単離するため、上記動物、例えばラ
ット由来のｃＤＮＡライブラリーまたは染色体ライブラ
リーのスクリーニングを行い、単離されたクローンより
目的とするｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを抽出し、この
動物、例えばラット由来のＨＧＦのｃＤＮＡまたは染色
体ＤＮＡをプローブとして、ヒトの臓器あるいは血液細
胞などのｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリーの
スクリーニングを行い、単離されたクローンより目的と
するヒト由来ＨＧＦのｃＤＮＡを抽出する。また、本発
明によって明らかにされたＤＮＡ配列あるいはヒトや動
物のＨＧＦのアミノ酸配列に基づいて合成されたオリゴ
ヌクレオチドや本発明により得られたヒトＨＧＦｃＤＮ
ＡやヒトＨＧＦ染色体ＤＮＡなどをプローブに用い、ま
たヒトまたは動物のＨＧＦに対する抗体を用いて、直接
ヒトの臓器あるいは血液細胞などから抽出したｍＲＮＡ
より調製したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを
行い、単離されたクローンより目的とするヒト由来のＨ
ＧＦのｃＤＮＡを抽出することもできる。(3)このヒト
由来ＨＧＦのｃＤＮＡよりヒトＨＧＦをコードするｃＤ
ＮＡ断片を制限酵素を用いて切り出し発現用ベクターに
組み込み、(4)得られた組換発現ベクターにより宿主細
胞を形質転換して形質転換体を得、(5)この形質転換細
胞を培養して、その培養上清から本発明のヒトＨＧＦを
採取・製造することが出来る。さらに形質転換細胞中の
組換発現ベクターから制限酵素処理によって本発明のヒ
トＨＧＦをコードする塩基配列を含有するＤＮＡを得る
ことが出来る。

【０００６】以下、本発明の各工程について詳細に説明
する。 (1)ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーの調製：動
物、例えばラットまたはヒトのＨＧＦをコードするｍＲ
ＮＡはラットなどの動物またはヒトの肝臓、腎臓、ひ
臓、肺臓、脳、骨髄、胎盤などの臓器あるいは白血球、
巨核球やリンパ球などの血液細胞などから各々得ること
が出来る。例えば、Biochemistry, 18, 5294, (1979)に
記載されているJ. M. Chirgvinらの方法によって、ラッ
トなどの動物またはヒトの臓器あるいは血液細胞のグア
ニジンチオシアン酸溶液から得たＲＮＡをさらにオリゴ
（ｄＴ）セルロースカラムを用いる液体クロマトグラフ
ィに付すことによって該ｍＲＮＡを調製することが可能
である。また、ヒト肝、脳、胎盤、白血球などのｍＲＮ
Ａのような動物細胞や動物組織などの各種ｍＲＮＡは、
市販品としてクロンテック社などから購入して利用する
ことも出来る。

【０００７】これらのｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素
やポリメラーゼ・チェーン・リアクション法（ＰＣＲ）
を用いて、例えばH. Okayamaらの方法(Mol. Cell. Bio
l., 2, 161, 1982、およびMol. Cell. Biol., 3, 280,
1983)あるいはU. Gublerらの方法(Gene, 25, 263, 198
3)あるいはM. A. Frohmanらの方法(Proc. Natl. Acad.S
ci. USA, 85, 8998, 1988)に従ってｃＤＮＡを合成し、
このｃＤＮＡをプラスミドやファージなどに組み込むこ
とによりｃＤＮＡライブラリーを調製することが出来
る。ｃＤＮＡを組み込むプラスミドベクターとしては、
大腸菌由来のｐＢＲ３２２（東洋紡績）、ｐＵＣ１８お
よびｐＵＣ１９（東洋紡績）、枯草菌由来のｐＵＢ１１
０（シグマ社）などがある。またｃＤＮＡを組み込むフ
ァージベクターとしては、λｇｔ１０およびλｇｔ１１
（東洋紡績）などがある。これらのベクターは、宿主細
胞内に保持されて複製、増幅されるものであれば、ここ
に例示したものに限定されるものではない。ｍＲＮＡを
鋳型として合成されたｃＤＮＡをプラスミドまたはファ
ージに組み込んでｃＤＮＡライブラリーを調製する方法
として、T. Maniatisの方法(Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1982, P. 239)またはT. V.
Hyunhらの方法(DNA Cloning: A Practical Approach,
1, 49, 1985)を各々例示することが出来る。また、ｍＲ
ＮＡと同様に各種のｃＤＮＡライブラリーを市販品とし
てクロンテック社などから購入することが出来るのでそ
れらを利用することも出来る。

【０００８】(2)ｃＤＮＡライブラリーのクローニン
グ：ｃＤＮＡライブラリーとして得られたプラスミドや
ファージなどの組換発現ベクターは、大腸菌のような適
切な宿主細胞に保持される。宿主となり得る大腸菌とし
ては、例えば、Escherichia coli ＮＭ５１４，Ｃ６０
０（ストラタジーン社）、ＮＭ５２２，ＪＭ１０１（フ
ァルマシア社）などを例示することが出来る。ｃＤＮＡ
のベクターがプラスミドの場合、塩化カルシウム法、塩
化カルシウム・塩化ルビジウム法などを用いて、またｃ
ＤＮＡのベクターがファージの場合、インビトロパッケ
ージング法などを用いてあらかじめ増殖させた宿主細胞
に保持させることが出来る(Molecular Cloning, Cold S
pring Harbor Labratory, 1982, p. 249)。このように
して得られた形質転換体から、ラットなどの動物または
ヒトの肝実質細胞増殖因子の部分のアミノ酸配列をコー
ドするオリゴヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレ
オチドを³²Ｐ標識して、プローブとして用いてコロニー
ハイブリダイゼーション法(Gene, 10, 63, 1980)、プラ
ークハイブリダイゼーション法(Scienc, 196, 180, 197
7)などによってｃＤＮＡクローンを釣り上げることが出
来る。また、目的とするポリペプチドに対する抗体を用
いて、標識抗体法(DNACloning: A Practical Approach,
1, 49, 1985)によって、ｃＤＮＡクローンをクローニ
ングすることも可能である。このようにしてクローン化
された形質転換体は、ラットなどの動物またはヒト由来
のＨＧＦの全アミノ酸配列あるいはその部分のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を有するｃＤＮＡを含有して
いる。

【０００９】次に該形質転換体から常法(Molecular Clo
ning, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yor, 198
2)に従ってプラスミドやファージなどの組換ＤＮＡを単
離し、そのまま、あるいは制限酵素で消化してからｃＤ
ＮＡ塩基配列が決定される。最初に得られた該ラットな
どの動物またはヒト由来のｃＤＮＡをプローブとして、
同様の方法によってヒトの臓器あるいは血液細胞由来の
ｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリーのクロー
ニングを行うことが出来る。ここで用いられるハイブリ
ダイゼーションの方法及び条件は、例えば、Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor L
aboratory, 1st ed. (1982)等に記載の方法及び条件を
参照することが出来る。得られたラットなどの動物ある
いはヒト由来のＨＧＦのｃＤＮＡの塩基配列は、マクサ
ムとギルバートの化学法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74, 560, 1977)やサンガーのジデオキシ法(Proc. Nat
l.Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977)などによって決定
される。さらに、必要が有れば、記述のｍＲＮＡと塩基
配列の決定されたｃＤＮＡの一部あるいはそのｃＤＮＡ
の一部の配列を合成したＤＮＡをプライマーにしてプラ
イマーエクステンション法(Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 76, 731, 1979)によって新たにｃＤＮＡを合成し、
上記と同様にしてｃＤＮＡライブラリーから、すでに得
られた第１のｃＤＮＡに連結しうる第２のｃＤＮＡを含
有するプラスミドやファージなどの組換ＤＮＡをクロー
ニングすることが可能である。このプライマーエクステ
ンションとクローニングの工程は、必要により複数回繰
り返される。

【００１０】(3)ヒトＨＧＦ組換発現ベクターの構築：
クローン化されたヒトＨＧＦのアミノ酸配列の全部ある
いはその一部をコードするｃＤＮＡを含有する数種のプ
ラスミドやファージなどの組換ベクターから制限酵素に
よってｃＤＮＡを切り出し、ヒトＨＧＦの発現に適した
ベクターのプロモーターの下流に制限酵素とＤＮＡリガ
ーゼを用いて再結合して組換発現ベクターを作製するこ
とが出来る。より詳しくは、本発明のヒトＨＧＦを効率
良く発現させるために組換発現ベクターは転写の下流方
向に順番に必要により(1)プロモーター、(2)リボソーム
結合部位、(3)開始コドン、(4)本発明のヒトＨＧＦをコ
ードする塩基配列を含有するＤＮＡ、(5)終止コドン、
(6)ターミネーターを含むように構築される。本発明で
用いることが出来るＤＮＡのベクターとして、大腸菌由
来のプラスミドｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８（東洋紡
績）、枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ１１０（シグマ
社）、酵母由来のプラスミドｐＲＢ１５（ＡＴＣＣ３７
０６２）、バクテリオファージλｇｔ１０、λｇｔ１１
（ストラタジーン社）、ウイルスＳＶ４０（ＢＲＬ
社）、ＢＰＶ（ＡＴＣＣ ＶＲ−７０３）、レトロウイ
ルスの遺伝子由来のベクターなどが列挙できるが宿主内
で複製・増幅可能なベクターであれば特に限定はない。
特に、本発明のヒトＨＧＦを簡便に発現させるには、Ｓ
Ｖ４０のようなウイルスの遺伝子由来のベクターを用い
るのが好ましい。例えば、前述のクローン化されたヒト
ＨＧＦをコードするＤＮＡをＳＶ４０ベクターの後期領
域に結合した組換発現ベクターは、ＣＯＳ細胞(Cell, 2
3, 175,1981)と呼ばれるサル細胞株に導入して発現させ
ることが可能である。

【００１１】プロモーターおよびターミネーターに関し
ても、目的とするヒトＨＧＦをコードする塩基配列の発
現に用いられる宿主に対応したものであれば特に限定は
ない。例えば、プロモーターとして、宿主が大腸菌であ
る場合、ｔｒｐプロモーター、１ａｃプロモーターなど
を、宿主が枯草菌である場合、ＳＰ０１プロモーター、
ＳＰ０２プロモーターなどを、宿主が酵母である場合、
ＧＡＰプロモーター、ＰＧＫプロモーターななどを、宿
主がマウス線維芽細胞やチャイニーズハムスター卵巣細
胞のような動物細胞の場合、ウイルス由来のＳＶ４０プ
ロモーターやＨＳＶ１ ＴＫプロモーターあるいはメタ
ロチオネインプロモーターやヒートショックプロモータ
ーなどを例示することが出来る。またターミネーターと
しては、宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐターミネーター、
１ｐｐターミネーターなどを、宿主が枯草菌の場合、ａ
ｍｙＦターミネーターなどを、宿主が酵母の場合、ＣＹ
Ｃ１ターミネーターなどを、宿主が動物細胞の場合、Ｓ
Ｖ４０ターミネーター、ＨＳＶ１ＴＫターミネーターな
どを例示することが出来る。これらのプロモーターとタ
ーミネーターは用いる宿主に応じて適切に組み合わされ
る。

【００１２】本発明のヒトＨＧＦをコードする塩基配列
を含有するＤＮＡは、そのＤＮＡが発現されるポリペプ
チドが、肝実質細胞増殖活性を有するならば特に制限は
なく、例えば後述する配列番号１（図５〜図８）に示し
た塩基配列が例示され、さらには上記塩基配列の一部が
置換、欠損、挿入、あるいはこれらが組み合わされた塩
基配列を有するＤＮＡであってもよい。同様に配列番号
２（図５〜図８）に示したアミノ酸配列に関しても、当
該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置
換、欠失及び／又は付加されていてもよい。上記のアミ
ノ酸配列の置換、欠失及び／又は付加は、本願優先日前
に周知の技術である部位特異的突然変異誘発法等により
実施することができ、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 81, 4662-5666, 1984; Nucleic Acid Res.10, 64
87-6500, 1982; WO85/00817; Nature 316, 601-605, 19
85などに記載の方法に準じて行うことができる。なお、
１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加
とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により
置換、欠失及び／又は付加できる程度の数のアミノ酸が
置換、欠失及び／又は付加されることを意味する。この
ような置換、欠失及び／又は付加により得られるもの
は、例えば、後述の活性測定方法によって容易に評価で
きる。本発明のヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含有
する該ＤＮＡの翻訳開始コドンとしてＡＴＧ、翻訳終止
コドンとしてＴＡＡ、ＴＧＡ、あるいはＴＡＧを有して
もよい。また必要に応じて開始コドン、あるいは終始コ
ドンを１つ以上組み合わせたり、他のコドンと組み合わ
せて配列してもよく、これらに特に限定はない。さら
に、この組換発現ベクターで形質転換した宿主の選択マ
ーカーとなり得るアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシ
ン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子など１種または２種以上
が該ベクターの適切な位置に含有されていることが好ま
しい。

【００１３】(4)宿主細胞の形質転換とその培養：この
ようにして構築されたヒトＨＧＦ組換発現ベクターは、
コンピテント細胞法(J. Mol. Biol., 53, 154, 1970)、
プロトプラスト法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1
929, 1978)、リン酸カルシウム法(Science, 221, 551,
1983)、ＤＥＡＥデキストラン法(Science, 215, 166, 1
982)、電気パルス法(Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 81,
7161, 1984)、インビトロパッケージング法(Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 72, 581, 1975)、ウイルスベクター
法(Cell, 37, 1053, 1984)、またはマイクロインジェク
ション法(Exp. Cell. Res., 153, 347, 1984)などによ
って宿主に導入され、形質転換体が作製される。このと
き、宿主として既述の大腸菌の他に、枯草菌、酵母、動
物細胞などが用いられる。特にマウス線維芽細胞Ｃ１２
７(J. Virol., 26, 191, 1978)やチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞ＣＨＯ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4
216, 1980)などの哺乳動物由来の宿主細胞を用いるのが
好適である。

【００１４】得られた形質転換体は、目的とする組換ヒ
トＨＧＦを産生させるためにその宿主に応じた適切な培
地中で培養される。培地中には該形質転換体の生育に必
要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および薬
剤などが含有される。培地の１例としては、形質転換体
の宿主が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培
地(J. Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laborat
ory, New York, 1972,p.431)などを、宿主が酵母の場
合、ＹＥＰＤ培地(Genetic Engineering, vol.1, Plenu
m Press, New York, 1979, p.117)などを、宿主が動物
細胞の場合、２０％以下のウシ胎児血清を含有するＭＥ
Ｍ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製
薬）などを挙げることが出来る。形質転換体の培養は、
通常２０℃〜４５℃、pHは５〜８の範囲で行われ、必要
に応じて通気、撹拌が行われる。また、宿主が接着性の
動物細胞などの場合は、ガラスビーズ、コラーゲンビー
ス、あるいはアセチルセルロースフォローファイバーな
どの担体が用いられる。これら以外の培地組成あるいは
培養条件下でも形質転換体が生育すれば実施でき、これ
らに限定されるものではない。

【００１５】(5)ヒトＨＧＦの精製：このようにして形
質転換体の培養上清中または形質転換体中に生成した組
換ヒトＨＧＦは、公知の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、
限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマ
トグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマ
トグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどを組み
合わせて分離精製することが出来る。特に、硫酸アンモ
ニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマト
グラフィ、ヘパリンセファロースアフィニティクロマト
グラフィ、およびフェニルセファロース逆相クロマトグ
ラフィの組み合せ、あるいは硫酸アンモニウムによる塩
析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィ、およ
び抗ＨＧＦ抗体セファロースアフィニティクロマトグラ
フィの組み合わせなどが好ましく有効な精製法である。
以上述べた方法によって得られた新規な組換ヒトＨＧＦ
は、ラット肝およびラット血小板由来ＨＧＦと同様にラ
ット肝実質細胞の増殖を顕著に促進する活性を示した。

【００１６】ＨＧＦ活性の測定 ＨＧＦ活性は、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7229
(1983)に記載の方法に準じて次のように測定した。ウ
イスター系ラットからコラーゲナーゼ還流法によって肝
実質細胞を分離精製した。得られたラット肝実質細胞を
５％ウシ血清、２×１０^-9Ｍインスリンおよび２×１０
^-9Ｍデキサメサゾンを添加したウイリアムスＥ培地（フ
ローラボラトリー社）に懸濁し、２４ウエルマルチプレ
ートに１．２５×１０⁵個／ウエルの濃度で播いた。５
％ＣＯ_２および３０％Ｏ_２および６５％Ｎ_２の存在下、
３７℃で２０時間培養後、０．１μｇ／ｍｌのアプロチ
ニンを添加したウイリアムスＥ培地に交換すると同時に
所定量の被験試料を添加した。１５時間後、１５μＣｉ
／ｍｌの¹²⁵Ｉデオキシウリジン１０μｌ／ウエルを添
加した。コントロール群には、¹²⁵Ｉデオキシウリジン
添加の１５分前に５μｇ／ｍｌのアフィディコリンを添
加した。さらに６時間培養して¹²⁵Ｉでラベルした。細
胞をpH7.4のＰＢＳで２回洗浄後、冷１０％トリクロロ
酢酸水溶液（ＴＣＡ）で固定した。細胞を１ウエル当た
り０．５ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で可溶化
し、その放射能をガンマカウンターにより測定した。ま
た放射能測定後の試料の一部をとってローリー法(J. Bi
ol. Chem., 193, 265, 1951)に従い蛋白量を測定した。
被験試料を添加したとき肝実質細胞に取り込まれた¹²⁵
Ｉの量をコントロールとのカウントの差として求め、こ
れをラット肝実質細胞蛋白質１ｍｇ当たりに換算して、
ＤＮＡ合成活性（ｄｐｍ／ｍｇ蛋白質）とした。被験試
料のＨＧＦ活性は、同一試験において上皮細胞成長因子
（ＥＧＦ）１０ｎｇ／ｍｌを用いた時の肝実質細胞のＤ
ＮＡ合成活性の５０％に相当する活性を１単位と定義し
て表示した。

【００１７】

【発明の効果】本発明によれば、肝実質細胞の生体外で
の増殖を可能とする新規な生理活性ペプチドが提供され
る。本発明の組換ヒトＨＧＦは、臨床診断試薬や肝疾患
治療薬として有用である。さらに本発明の組換ヒトＨＧ
Ｆの作用により増殖維持される肝実質細胞は、例えば肝
機能の基礎的研究用、肝実質細胞に対する各種ホルモン
や薬剤の作用の研究用、肝癌の発癌研究用、あるいは肝
炎ウイルスの生体外培養のための宿主細胞として極めて
有用である。

【００１８】

【実施例】以下、本発明を実施例により、さらに詳しく
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。 実施例１ (1)ラット肝臓ｍＲＮＡの単離：ラット肝臓ｍＲＮＡ
は、グアニジンチオシアン酸法(Biochemistry, 18, 529
4,1979)によって抽出し、オリゴｄＴセルロースカラム
クロマトグラフィ法(Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 69,
1408, 1972)によって精製して調製した。市販食用植物
油で希釈した２０％四塩化炭素をＳＤラット１００ｇ当
たり１ｍｌを腹腔内投与した。四塩化炭素投与の１０時
間後、肝臓を摘出した。得られたラット肝臓０．９０ｇ
に５．５Ｍグアニジウム溶液（５．５Ｍグアニジンチオ
シアン酸、２５ｍＭクエン酸、０．５％ラウリルザルコ
シンナトリウムからなるpH7.0の溶液)１６ｍｌを加えて
ホモジナイズした。０．１Ｍ ＥＤＴＡを含むセシウム
トリフロロ酢酸溶液（１ｇ／ｍｌ）１７ｍｌに上記のラ
ット肝分散液１６ｍｌを重層し、ベックマン超遠心機、
Ｌ８−５５型によって８５０００ｇ、２０時間、２０℃
の条件下で遠心分離した。ＤＮＡ層を除去した後、沈降
したＲＮＡ層を１ｍｌの滅菌した蒸留水に溶解した。こ
のＲＮＡ水溶液から冷エタノール沈殿によって６．２４
ｍｇのＲＮＡを得た。得られたＲＮＡを１ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.5)(以後、ＴＥ
緩衝液と略する）０．５ｍｌに溶解し、６５℃、５分加
熱処理した後、１Ｍ ＮａＣｌ溶液０．５ｍｌを加え
た。０．１ＮＮａＯＨで活性化した後、０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌおよび１ｍＭ ＥＴＤＡを含む１０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ＳＴＥ緩衝液と略す）で平衡化したオリゴｄＴ
セルロースカラムにＲＮＡ溶液０．５ｍｌを注入した。
約５ｍｌのＳＴＥ緩衝液で洗浄後、ＴＥ緩衝液で吸着し
たポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。このポリ（Ａ）ＲＮＡ
溶液５００μｌから冷エタノール沈殿で得られたポリ
（Ａ）ＲＮＡは、再びＴＥ緩衝液に溶解し、１μｇ／μ
ｌの濃度に調製した。

【００１９】(2)ラット肝由来のｃＤＮＡライブラリー
の作製：上記(1)で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ、５μｌ
を鋳型としてｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマシャ
ム社）を用いてGublerらの方法(Gene, 25, 263, 1983)
に準じてｃＤＮＡを合成した。１本鎖ｃＤＮＡの収量
は、１０１８ｎｇ、２本鎖ｃＤＮＡの収量は、１７２９
ｎｇであった。この２本鎖ｃＤＮＡは、フェノール／ク
ロロホルム（１：１，ｖ／ｖ）抽出とエタノール沈殿に
よって精製した後、ＳＴＥ緩衝液に溶解し、約０．７μ
ｇ／２０μｌの濃度に調整してから使用するまで−２０
℃で保存した。このｃＤＮＡは、ｃＤＮＡクローニング
システムλｇｔ１０（アマシャム社）を用いてHuynhら
の方法(DNA Cloning I, A Practical Approach, 1, 49,
1982)に準じ、次のようにλｇｔ１０のＥｃｏＲＩ部位
にクローニングした。ＥｃｏＲＩメチラーゼを用いて上
記のｃＤＮＡ溶液の２０μｌをメチル化した後、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いてｃＤＮＡの両端末にＥｃｏＲＩリ
ンカーを付加した。過剰のリンカーをＥｃｏＲＩ消化
し、約１００μｌの反応液を得た。ＳＴＥ緩衝液で平衡
化したｃＤＮＡ精製用ゲル濾過カラムに上記反応液１０
０μｌを注入した。ＳＴＥ緩衝液で溶出してｃＤＮＡ画
分５００μｌを集めた。常法によってエタノール沈殿を
２回繰り返した後、滅圧乾燥してリンカー付加ｃＤＮＡ
を得た。再び、ＳＴＥ緩衝液に溶解して５０ｎｇ／μｌ
のリンカー付加ｃＤＮＡ２６μｌを調製した。あらかじ
め準備されたλｇｔ１０アーム１μｇにリンカー付加ｃ
ＤＮＡ０．１μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて挿入し
た。この反応液は冷エタノール処理した後、軽く乾燥
し、得られた組換ＤＮＡの全量を５μｌのＴＥ緩衝液に
溶解した。この組換ＤＮＡをインビトロパッケージング
反応に供し、λｇｔ１０組換ファージを得た。ファージ
プレーティング用大腸菌を用いたタイトレーションによ
り測定したｃＤＮＡ１μｇから得られた組換ファージ数
は、５．０×１０⁶個であった。このようにして作製し
たｃＤＮＡライブラリーは、使用するまで少量のクロロ
ホルムを加えたＳＥ緩衝液（100ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍ
Ｍ ＭｇＳＯ_４および0.01％ゼラチンを含む２０ｍＭト
リス塩酸緩衝液、pH7.5)中、４℃で保存した。

【００２０】(3)ＤＮＡプローブの合成：本発明者が見
出した下記ラットＨＧＦβ鎖Ｎ末端アミノ酸配列１５個 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ｖ−Ｖ−Ｎ−Ｇ−Ｉ−Ｐ−Ｔ−Ｑ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ｍ−Ｖ （式中、Ｖはバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはグリシ
ン、Ｉはイソロイシン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニ
ン、Ｑはグルタミン、Ｗはトリプトファン、Ｍはメチオ
ニンを示す）をコードする塩基配列を推定し、オリゴヌ
クレオチド⁵'ＡＣＣＡＴＣＣＡＩＣＣＩＡＣＩＧＴＩＧ
ＴＩＴＧＩＧＴＩＧＧＩＡＴＩＣＣＩＴＴＩＡＣＩＡＣ
³'（Ｉはイノシンを表す）をＤＮＡシンセサイザー３８
１Ａ（アプライドバイオシステムズ社）により合成し
た。得られたオリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（東洋紡績）を用いて［γ³²Ｐ］ＡＴＰ（ア
マシャム社）により標識してＤＮＡプローブを作製し
た。

【００２１】(4)ラットＨＧＦ遺伝子ＤＮＡの部分単離
とその塩基配列の決定：上記(2)で得られた約５×１０⁵
個の組換ファージを３７℃で１５分間約８×１０⁹個の
大腸菌ＮＭ５１４（ストラタジーン社）に感染させた
後、約５０℃に加温した０．７％の寒天を含むＬＢ培地
２７０ｍｌに添加し、２３cm×２３cmのＬＢ寒天培地プ
レート６枚に均一に流延した。空気中、３７℃で１２時
間培養後、プラークの生じたプレート上にニトロセルロ
ースフィルターを約３０秒間密着させた。このニトロセ
ルロースフィルターを１．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１
Ｎ ＮａＯＨからなるアルカリ溶液に５分間浸漬し、さ
らに０．２Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.5)、２５ｍＭリン
酸緩衝液(pH7.5)、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび２×ＳＳＣ緩
衝液からなる中性溶液に１５分間浸漬した。風乾後、８
０℃、２時間熱処理してニトロセルロースフィルターに
各プラークのＤＮＡを固定化した。得られたニトロセル
ロースフィルターは、６×ＳＳＣ緩衝液、５×デンハー
ト溶液、５０ｍＭＰＩＰＥＳ、および１００ｍＭリン酸
緩衝液、pH7.0、からなるハイブリダイゼーション溶液
に浸漬し、６５℃で５時間前処理した。１００℃で５分
間熱処理した上記(3)の³²Ｐ標識合成オリゴヌクレオチ
ド（約３×１０⁸ｃｐｍ）プローブとサケ精巣ＤＮＡ(0.
1mg/ml)の混合溶液を添加し、４５℃で１６時間ハイブ
リダイゼーション反応を行った。反応後、ニトロセルロ
ースフィルターは５０℃で０．１％ＳＤＳを含む６×Ｓ
ＳＣ緩衝液によって３回洗浄してから風乾した。このニ
トロセルロースフィルターを増感スクリーン、ライトニ
ングプラス（デュポン社）とＸ線フィルム、ＲＸ（富士
写真フィルム）に密着させ、−８０℃で３０時間露光し
た。得られた３個の陽性プラーク採取し、上記と同じ方
法によって２次スクリーニングを行い、得られた１個の
陽性クローンをＲＢＣ１と命名した。このＲＢＣ１ファ
ージを常法により増殖させ、ＲＢＣ１ｃＤＮＡを単離精
製した。得られたｃＤＮＡの塩基配列は、シーケネース
（ユナイテッド ステート バイオケミカル社）を用いて
ジデオキシ法によって決定した。図１にＲＢＣ１ｃＤＮ
Ａの全塩基配列を示す。ＲＢＣ１ｃＤＮＡは、ラットＨ
ＧＦβ鎖をコードする塩基配列（第１番目から６９９番
目）を含有する。

【００２２】(5)ヒトＨＧＦ遺伝子ＤＮＡの単離と塩基
配列の決定：ヒト正常肝臓ｍＲＮＡ（クロンテック社）
５μｇを鋳型にして上記(2)と同様にしてヒト肝由来の
ｃＤＮＡを合成した。１本鎖ｃＤＮＡの収量は、１１０
０ｎｇであった。得られたｃＤＮＡの２００ｎｇをアガ
ロース電気泳動に供し、分画した４〜７ｋｂのｃＤＮＡ
をジーンクリーン（バイオ １０１社）で抽出した後、
上記(2)と同様にしてｃＤＮＡライブラリー（Ｉ）を調
製した。ｃＤＮＡ１μｇから２×１０⁵個の組換ファー
ジを得た。マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシ
ャム社）を用いて［α³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識したＲＢＣ
１ｃＤＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーション
反応温度および洗浄温度を６０℃、洗浄液は０．１％Ｓ
ＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液とした以外は(4)と同様
に、ヒト肝由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｉ）の１次スク
リーニングおよび２次スクリーニングを行い、陽性クロ
ーンＨＢＣ２５を得た。ＨＢＣ２５ファージから常法に
より単離、精製したＨＢＣ２５ｃＤＮＡを塩基配列解析
および制限酵素切断解析に供した。図２(a)にＨＢＣ２
５ｃＤＮＡの制限酵素地図、図３にＨＢＣ２５ｃＤＮＡ
の塩基配列の一部を示す。次にＨＢＣ２５ｃＤＮＡに含
有する⁵'ＴＣＡＴＡＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧＴＣＴ³'の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイ
ザー３８１Ａ（アプライドバイオシステムズ社）により
合成した。この合成ＤＮＡ０．７５μｇをプライマーと
し、ヒト肝ｍＲＮＡ２０μｇを鋳型としてｃＤＮＡ０．
４μｇを合成し、同様にしてｃＤＮＡライブラリー（I
I）を調製した。このｃＤＮＡライブラリー（II）から
［α³²Ｐ］ｄＣＴＰで標識したＨＢＣ２５ｃＤＮＡの
０．７ｋｂＥｃｏＲＩ断片をプローブして陽性クローン
ＨＡＣ１９を得た。図２(b)にＨＡＣ１９ｃＤＮＡの制
限酵素地図、図４にＨＡＣ１９ｃＤＮＡの塩基配列の一
部を示す。このようにして得られたＨＢＣ２５ｃＤＮＡ
およびＨＡＣ１９ｃＤＮＡの塩基配列を組み合わせたヒ
トＨＧＦコード領域の全塩基配列およびその塩基配列か
ら演繹されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１およ
び配列番号２並びに図５〜図８に示す。

【００２３】ヒトＨＧＦの全ｃＤＮＡ塩基配列から、ヒ
トＨＧＦの翻訳開始コドンは１番目のＡＴＧであり、終
止コドンは２１８５番目のＴＡＧと推定される。これら
の開始および終止コドンの間のヒトＨＧＦのｃＤＮＡ塩
基配列は７２８アミノ酸残基からなるポリペプチドをコ
ードし、１番目のＭｅｔに続くアミノ酸配列はＬｅｕに
富み、３１番目のＧｌｙまでがＨＧＦ分泌のためのシグ
ナル配列であった。同様にヒトＨＧＦβ鎖のＮ末端は、
４９５番目のＶａｌと推定される。また、ヒトＨＧＦの
糖鎖の結合部位は、Ａｓｎ−ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのアミ
ノ酸配列を有する２９４番目、４０２番目、５６６番
目、および６５３番目のＡｓｎと推定される。配列番号
２に示すヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコンピューターに
よりホモロジー検索を行った結果、ヒトＨＧＦはプラス
ミノーゲン、プラスミン、カリキュレインや凝固因子Ｘ
ＩＩなどのセリンプロテアーゼとホモロジーをもつこと
が見出された。即ち、ヒトＨＧＦはそのα−鎖にクリン
グル構造と推定される配列を４箇所持っており、またそ
のβ−鎖は上記セリンプロテアーゼのプロテアーゼ領域
に類似している。しかし、セリンプロテアーゼの活性中
心と推定されているＳｅｒとＨｉｓがヒトＨＧＦのβ−
鎖ではＴｙｒ（６７３番目）とＧｌｎ（５３４番目）に
それぞれ置換されている。

【００２４】(6)サルＣＯＳ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベク
ターの構築：サルＣＯＳ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクター
ｐＥＵＫ［ｈＨＧＦＩ］の構築図を、図９に示す。上記
(5)で得られたＨＡＣ１９ファージＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩとＳｃａＩで消化し、アガロース電気泳動によ
り０．９ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。同様にＨ
ＢＣ２５ファージＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩとＳｍａＩ
で消化し、２．１ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。
これらのＤＮＡ断片をあらかじめ制限酵素ＢａｍＨＩと
ＳｍａＩで消化したブルースクリプトＫＳＭ１３＋（ス
トラタジーン社）と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合
してプラスミドｐＢＳ［ｈＨＧＦＩ］を得た。得られた
ｐＢＳ［ｈＨＧＦＩ］を制限酵素ＸｂａＩとＳｍａＩで
消化した。制限酵素ＸｂａＩとＳｍａＩであらかじめ消
化したＣＯＳ細胞用発現ベクターｐＥＵＫ−Ｃ１（クロ
ンテック社）と３．０ｋｂＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合してヒトＨＧＦ発現ベクターｐＥＵ
Ｋ［ｈＨＧＦＩ］を得た。

【００２５】(7)サルＣＯＳ細胞の形質転換とヒトＨＧ
Ｆ遺伝子の発現：得られたｐＥＵＫ［ｈＨＧＦＩ］プラ
スミドをエタノール沈殿した後、１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝
液に溶解し、２０μｇ／ｍｌに調製した。次に、１０％
ウシ胎児血清（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（日水製
薬）中で増殖させた対数増殖期のＣＯＳ−１細胞（ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ−１６５０）を１０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液で２
回洗浄した後トリプシン処理した。同緩衝液で３回洗浄
後、細胞濃度２×１０^７個／ｍｌになるように再び同緩
衝液に浮遊化した。先に調製したプラスミド溶液２５０
μｌと細胞浮遊液２５０μｌを混合し、氷冷下で１０分
間放置した。この氷冷したプラスミド・細胞混液に高電
圧パルス遺伝子導入装置ＺＡ−１２００（ＰＤＳ社）を
用いて、印加電圧４ｋＶ／ｃｍ、パルス時間２０ミリ秒
の条件下で高電圧パルスをかけた。得られた細胞を上記
の培地で希釈し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下にて３日間
培養した。培養３日目の培養上清中のＨＧＦ活性を前述
のラット肝実質細胞を用いて測定したところ、５０単位
／ｍｌであった。一方、ＨＧＦｃＤＮＡを挿入していな
い発現ベクター，ｐＥＵＫ−Ｃ１を同じ方法によりＣＯ
Ｓ−１細胞に導入して培養したが、その培養上清中に
は、ＨＧＦ活性を認めなかった。

【００２６】実施例２ (1)マウスＣ１２７細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターの構
築：マウスＣ１２７細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢ
ＰＭＴ［ｈＨＧＦII］の構築図は、図１０に示す。実施
例１で得られたＨＡＣ１９ファージＤＮＡを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩとＳｃａＩで消化し、アガロース電気泳動によ
り０．９ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。同様にＨ
ＢＣ２５ファージＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩとＰｓｔＩ
で消化し、２．１ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。
これらのＤＮＡ断片をあらかじめ制限酵素ＢａｍＩとＰ
ｓｔＩで消化したブルースクリプトＫＳII＋（ストラタ
ジーン社）と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してプ
ラスミドｐＢＳ［ｈＨＧＦII］（微工研菌寄第１１０５
０号）を得た。プラスミドｐＢＰＭＴを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＶで消化後、細菌性アルカリフォスファターゼ（ＢＡ
Ｐ)でリン酸基を除去した部位に、プラスミドｐＢＳ
［ｈＨＧＦII］(微工研菌寄第１１０５０号)を制限酵素
ＸｂａＩとＳａｌＩとＮａｅＩで消化しＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼで平滑末端とした後、アガロース電気泳動によ
り分離・精製した３．０ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼにより挿入した。得られたヒトＨＧＦ発現ベク
ターｐＢＰＭＴ［ｈＨＧＦII］は、ＭＴ−１プロモータ
ーとＳＶ４０初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの間
にヒトＨＧＦ遺伝子を有し、この発現ベクターによるマ
ウスＣ１２７細胞の形質転換は、ウシパピロマウイルス
（ＢＰＶ）遺伝子により行われる。また形質転換された
細胞の選択は、トランスポゾンＴｎ５のｎｅｏ遺伝子(G
ene, 19, 327, 1982)にヘルペスシンプレックスウイル
スタイプ１のチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１ ＴＫ）遺
伝子由来のプロモーターとポリ（Ａ）付加シグナルを連
結したｎｅｏキメラ遺伝子によっても可能となる。

【００２７】(2)マウスＣ１２７細胞の形質転換とヒト
ＨＧＦ遺伝子の発現：ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭ
Ｔ［ｈＨＧＦII］は、Wiglerらの方法(Cell,11, 223, 1
977)によりマウスＣ１２７細胞へ導入した。上記(1)で
得られた２０μｇのｐＢＰＭＴ［ｈＨＧＦII］プラスミ
ドを０．５Ｍ 塩化カルシウム ２４０μｌに溶解し、２
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣｌおよび１．５
ｍＭ リン酸ナトリウムからなる２×ＨＥＰＥＳ緩衝液
(pH7.1), ２４０μｌを撹拌しながら加えた。室温で３
０分撹拌を続けプラスミドとリン酸カルシウムの共沈殿
を形成させた。あらかじめ、１０％ウシ胎児血清（ギブ
コ社）および１０ｍＭグルタミンを添加したＤＭＥＭ培
地(日水製薬)を用いて５×10^５個のＣ１２７細胞を５％
ＣＯ_２の存在下で３７℃、２４時間培養した。培地交換
した後、プラスミドとリン酸カルシウム共沈殿を加え、
室温で２０分放置した。さらに、３７℃で４時間インキ
ュベートした後、培地を除去し、１５％グリセリンを添
加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え室温で５分放置し
た。培地で細胞を洗浄した後、培地交換し、さらに３７
℃で２日間インキュベートした。細胞を１０倍に希釈し
て１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ社）を含む同培地を
用いて５％ＣＯ_２の存在下で３７℃、７日間培養して形
質転換細胞を得た。得られた細胞株から培養上清中のＨ
ＧＦ活性の高い細胞を限界希釈法でスクリーニングしヒ
トＨＧＦ高産生株ＢＰＨ８９を得た。この細胞の培養上
清中のＨＧＦ産生能は、２．３万単位／ｌ／日であっ
た。

【００２８】実施例３ (1)チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒトＨＧＦの
発現ベクターの構築：チャイニーズハムスターＣＨＯ細
胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＶＥ［ｈＨＧＦI
I］の構築図は、図１１に示す。プラスミドｐＥＶＳＶ
Ｅを制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後、細菌性アルカリフォ
スファターゼ（ＢＡＰ）でリン酸基を除去した部位に、
実施例２で得られたプラスミドｐＢＳ［ｈＨＧＦII］
（微工研菌寄第１１０５０号）を制限酵素ＸｂａＩとＳ
ａｌＩとＮａｅＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで
平滑末端とした後、アガロース電気泳動により分離・精
製した３．０ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼに
より挿入した。得られたヒトＨＧＦ発現ベクターｐＥＶ
ＳＶＥ［ｈＨＧＦII］は、ＳＶ４０初期プロモーターと
ＳＶ４０の初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの間に
ヒトＨＧＦ遺伝子を有する。また、形質転換された細胞
の選択は、マウスＤＨＦＲ遺伝子にＳＶ４０初期プロモ
ーターとポリ（Ａ）付加シグナルを連結したＤＨＦＲキ
メラ遺伝子により可能となる。

【００２９】(2)チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞の
形質転換とヒトＨＧＦ遺伝子の発現：ヒトＨＧＦ発現ベ
クターｐＥＶＳＶＥ［ｈＨＧＦII］は、実施例２と同様
にしてチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のジヒドロ葉
酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ ＤＵＫＸ細胞に導
入した。得られた細胞株は、リボヌクレオシドとデオキ
シヌクレオシドを含まず、透析した１０％ウシ胎児血清
（キブコ社）と１％グルタミンと５０ｎＭメソトレキセ
ートを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を
用いて培養した。発生したコロニーは、安定なヒトＨＧ
Ｆ高産生株を得るために、同培地において１８世代まで
増殖させた。得られた細胞株は、安定にヒトＨＧＦを産
生し、ＣＨＯ−１と名付けた。この細胞のヒトＨＧＦ産
生能は、３．１万単位／ｌ／日であった。

【００３０】実施例４ 実施例２で得られたヒトＨＧＦ産生マウスＣ１２７組換
細胞株ＢＰＨ８９の培養上清液より組換ヒトＨＧＦを精
製した。 (1)陽イオン交換クロマトグラフィー ＢＰＨ８９株の培養液４００ｍｌに、終濃度0.01％とな
るようにTween ８０を添加し、ステリベクスＨＶフィル
ター（日本ミリポア・リミテッド）により濾過した。こ
の濾液に１／２０容の１Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（pH8.5）
緩衝液を加え、緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣ
ｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、0.01％Tween ８０、pH8.5）で平衡化し
たＳ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製、カラムサ
イズ内径1.6 cm、高さ5 cm）に添加した。緩衝液Ａで未
吸着物質を洗浄後、０．１５Ｍから１．０ＭのＮａＣｌ
による直線濃度勾配（全量１００ｍｌ）で、吸着物を溶
出した。クロマトパターンを図１２に示す。ＨＧＦ活性
をもつ画分を集め、Ｓ−セファロース溶出液とした。

【００３１】(2)アフィニティクロマトグラフィー：Ｓ
−セファロース溶出液を１Ｎ酢酸でpH7.5に調整後、２
倍容の0.01％Tween８０を含む蒸留水で希釈し、緩衝液
Ｂ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．３ＭＮａＣｌ、
0.01％Tween ８０、pH7.5）で平衡化したヘパリン・セ
ファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製、カラムサイ
ズ内径1 cm、高さ3 cm）に添加した。緩衝液Ｂでカラム
を洗浄後、０．３Ｍから２．０ＭのＮａＣｌによる直線
勾配（全量３０ｍｌ）により溶出した。そのクロマトパ
ターンを図１３に示す。ＨＧＦ活性をもつ画分を集め、
ヘパリン溶出液とした。

【００３２】(3)逆相ＨＰＬＣ：０．１％ＴＦＡ（トリ
フルオロ酢酸、ｖ／ｖ％）を含む蒸留水で平衡化したＣ
４ ＲＰ−３０４カラム（バイオラッド社製、内径4.6 m
m、高さ250 mm）にヘパリン溶出液を添加し、０．１％
ＴＦＡを含む０％から９０％へのアセトニトリルの濃度
勾配により溶出を行った。組換ヒトＨＧＦは約４０％の
アセトニトリル濃度にて溶出させた。そのクロマトグラ
ムを図１４に示す。精製された組換ヒトＨＧＦの収量は
約２５μｇであり、培養上清液からの活性回収率は約２
５％であった。

【００３３】(4)ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動：前記３段のクロマトグラフィーで精製された組換ヒ
トＨＧＦを２−メルカプトエタノール還元下及び非還元
下ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけた。結果
を図１５に示す。精製組換ＨＧＦは、非還元条件（２−
ＭＥ（−））では分子量７万〜９万の単一バンドを示
し、還元条件下（２−ＭＥ（＋））では、分子量６万〜
７．５万のα鎖と分子量３万〜４万のβ鎖に分かれた。
即ち、組換ＨＧＦはα鎖とβ鎖からなるヘテロダイマー
であることが示された。またβ鎖が２本のバンドに分離
し、β鎖に付加される糖鎖の本数に差のあることを示し
た。

【００３４】(5)α鎖およびβ鎖のＮ末端アミノ酸配
列：精製組換ＨＧＦのα鎖とβ鎖を分離し、それぞれの
Ｎ末端アミノ酸配列を調べた。精製標品を４Ｍグアニジ
ン存在下にて６０℃、３０分間処理し、２−メルカプト
エタノールにて還元した。次いで、モノヨード酢酸ナト
リウムを添加してＳＨ基をアルキル化し、反応液をマイ
クロボンダスフェアーＣ４カラム（ウォーターズ社）に
よる逆相ＨＰＬＣにかけ、α鎖とβ鎖を分離した。溶出
は０．１％ＴＦＡを含む水とアセトニトリルによった。
このようにして得られたα鎖とβ鎖をプロティンシーク
エンサーにかけた結果、下記に示すアミノ酸配列が得ら
れた。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 α鎖 His Lys Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala 16 17 18 19 20 Lys Thr Thr Leu Ile 1 2 3 4 5 6 7 β鎖 Val Val Asn Gly Ile Pro Thr これらの配列は配列番号１（図５〜図８）のＨＧＦコー
ド領域の全塩基配列より推定されたアミノ酸配列（配列
番号２）の３２〜５１番目および４９５〜５０１番目に
一致した。

【００３５】(6)アミノ酸組成および糖組成：精製組換
ＨＧＦを０．２％フェノールを含む６Ｎ ＨＣｌにて１
１０℃、２４時間処理して加水分解し、アミノ酸分析機
にかけ、アミノ酸組成を調べた。その結果は下表に示し
たように、ＤＮＡ塩基配列より推定したアミノ酸組成値
と精製組換標品による実測値は非常によく一致した。

【００３６】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 蛋白質１mol当りの各アミノ酸数 ━━━━━━━━━━━━━━━━━ アミノ酸 ＤＮＡ配列の計算値 実測値 ━━━━ ━━━━━━━━━ ━━━ Lys ４７ ４６ His ２４ ２４ Arg ４３ ４２ Asp ８５ ８０ Thr ４１ ３８ Ser ３９ ３８ Glu ６０ ５６ Pro ４５ ４３ Gly ５７ ５７ Ala ２２ ２２ Cys ４０ （ ） Val ３３ ３５ Met １５ １７ Ile ４０ ３７ Leu ３８ ３８ Tyr ３２ ３１ Phe １８ １９ Trp １８ （ ） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ （実測値の（ ）はこの分析方法では測定できないことを意味する。）

【００３７】さらに精製組換ＨＧＦを２．５Ｎ ＴＦＡ
中で、１１０℃、６時間加熱処理し、陰イオン交換樹脂
を用いたＨＰＬＣにて糖分析を行った。その結果、アス
パラギン配糖体特有のマンノース、ガラクトース、フコ
ース、Ｎ−アセチルガラクトサミンが検出され、組換Ｈ
ＧＦは糖蛋白質であることが確認された。

【００３８】(7)組換ヒトＨＧＦの肝細胞増殖活性：ラ
ット初代培養肝実質細胞は、現在知られているin vitro
の系の中では最もinvivoに近い肝機能を持つ系である。
「ＨＧＦ活性の測定法」に記述した方法に従って得たラ
ット肝実質細胞に対し、精製した組換ヒトＨＧＦを添加
したところ、１ｎｇ／ｍｌの濃度で強い細胞増殖を誘起
し、１０ｎｇ／ｍｌでその効果は最大に達した。この培
養系に増殖活性を示す因子は他にもインスリンやＥＧＦ
があるが、組換ヒトＨＧＦは単独で両者よりも強い活性
を有し、かつこれら３者の共存下では相加的な作用を示
した。従って、組換ヒトＨＧＦは現在知られている因子
のなかでは、生体外肝細胞に対し最も強力な増殖活性を
もつ物質ということができる。

【００３９】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２１８７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源：ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー 配列 ATG TGG GTG ACC AAA CTC CTG CCA GCC CTG CTG CTG CAG CAT GTC CTC 48 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 5 10 15 CTG CAT CTC CTC CTG CTC CCC ATC GCC ATC CCC TAT GCA GAG GGA CAT 96 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly His 20 25 30 AAG AAA AGA AGA AAT ACA ATT CAC GAA TTC AAA AAA TCA GCA AAG ACT 144 Lys Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 ACC CTA ATC AAA ATA GAT CCA GCA CTG AAG ATA AAA ACC AAA AAA GTG 192 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 AAT ACT GCA GAC CAA TGT GCT AAT AGA TGT ACT AGG AAT AAT GGA CTT 240 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Asn Gly Leu 65 70 75 80 CCA TTC ACT TGC AAG GCC TTT GTT TTT GAT AAA GCG AGA AAA CAA TGC 288 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 CTC TGG TTC CCC TTC AAT AGC ATG TCA AGT GGA GTG AAG AAA GAA TTT 336 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 GGC CAT GAA TTT GAC CTC TAT GAA AAC AAA GAC TAC ATT AGA AAC TGC 384 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 ATC ATC GGT AAA GGA CGC AGC TAC AAG GGA ACA GTA TCT ATC ACT AAG 432 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 AGT GGC ATC AAA TGT CAG CCC TGG AGT TCC ATG ATA CCA CAC GAA CAC 480 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 AGC TTT TTG CCT TCG AGC TAT CGG GGT AAA GAC CTA CAG GAA AAC TAC 528 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 TGT CGA AAT CCT CGA GGG GAA GAA GGG GGA CCC TGG TGT TTC ACA AGC 576 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 AAT CCA GAG GTA CGC TAC GAA GTC TGT GAC ATT CCT CAG TGT TCA GAA 624 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 GTT GAA TGC ATG ACC TGC AAT GGG GAG AGT TAT CGA GGT CTC ATG GAT 672 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 CAT ACA GAA TCA GGC AAG ATT TGT CAG CGC TGG GAT CAT CAG ACA CCA 720 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 CAC CGG CAC AAA TTC TTG CCT GAA AGA TAT CCC GAC AAG GGC TTT GAT 768 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 GAT AAT TAT TGC CGC AAT CCC GAT GGC CAG CCG AGG CCA TGG TGC TAT 816 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 ACT CTT GAC CCT CAC ACC CGC TGG GAG TAC TGT GCA ATT AAA ACA TGC 864 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 GCT GAC AAT ACT GTA AAT GAT ACT GAT GTT CCT ATG GAA ACA ACT GAA 912 Ala Asp Asn Thr Val Asn Asp Thr Asp Val Pro Met Glu Thr Thr Glu 290 295 300 TGC ATC CAA GGT CAA GGA GAA GGC TAC AGG GGC ACT GCC AAT ACC ATT 960 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Ala Asn Thr Ile 305 310 315 320 TGG AAT GGA ATT CCA TGT CAG CGT TGG GAT TCT CAG TAT CCT CAC AAG 1008 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Lys 325 330 335 CAT GAC ATG ACT CCT GAA AAT TTC AAG TGC AAG GAC CTA CGA GAA AAT 1056 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 TAC TGC CGA AAT CCA GAT GGG TCT GAA TCA CCC TGG TGT TTT ACC ACT 1104 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 GAT CCA AAC ATC CGA GTT GGT TAC TGC TCC CAA ATT CCA AAC TGT GAT 1152 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 ATG TCA AAT GGA CAA GAT TGT TAT CGT GGG AAT GGC AAA AAT TAT ATG 1200 Met Ser Asn Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 GGC AAC TTA TCC CAA ACA AGA TCT GGA CTA ACG TGT TCA ATG TGG AAC 1248 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asn 405 410 415 AAG AAC ATG GAA GAC TTA CAC CGT CAT ATC TTC TGG GAA CCA GAT GCA 1296 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 AGT AAG CTG AAT GAG AAT TAC TGC CGA AAT CCA GAT GAT GAT GCT CAT 1344 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 GGA CCC TGG TGC TAC ACG GGA AAT CCA CTC ATT CCT TGG GAT TAT TGC 1392 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 CCT ATT TCT CGT TGT GAA GGT GAT ACC ACA CCT ACA ATA GTC AAT TTA 1440 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 GAC CAT CCT GTA ATA TCT TGC GCC AAA ACG AAA CAA CTG CGA GTT GTA 1488 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 AAT GGG ATT CCA ACA CGA ACA AAT GTA GGA TGG ATG ATT AGT TTG AGA 1536 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Val Gly Trp Met Ile Ser Leu Arg 500 505 510 TAC AGA AAT AAA CAT ATC TGC GGA GGA TCA TTG ATA AAG GAA AGT TGG 1584 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 GTT CTT ACT GCA CGA CAG TGT TTC CCT TCT CGA GAC TTG AAA GAT TAT 1632 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 GAG GCT TGG CTT GGA ATT CAT GAT GTC CAT GGA AGA GGA GAG GAG AAA 1680 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Glu Glu Lys 545 550 555 560 CGC AAA CAG GTT CTC AAT GTT TCC CAG CTG GTA TAT GGC CCT GAA GGA 1728 Arg Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 TCA GAT CTG GTT TTA ATG AAG CTT GCC AGA CCT GCT GTC CTG GAT GAT 1776 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 TTT GTT AAT ACA ATT GAT TTA CCT AAT TAT GGA TGC ACA ATT CCT GAA 1824 Phe Val Asn Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 AAG ACC AGT TGC AGT GTT TAT GGC TGG GGC TAC ACT GGA TTG ATC AAC 1872 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 TAT GAT GGT CTA TTA CGA GTG GCA CAT CTC TAT ATA ATG GGA AAT GAG 1920 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 AAA TGC AGC CAG CAT CAC CGA GGG AAG GTG ACT CTG AAT GAG TCT GAA 1968 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 ATA TGT GCT GGG GCT GAG AAG ATT GGA TCA GGA CCA TGT GAG GGG GAT 2016 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 TAT GGT GGC CCA CTT GTT TGT GAG CAA CAT AAA ATG AGA ATG GTT CTT 2064 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 GGT GTC ATT GTT CCC GGC CGT GGA TGC GCC ATT CCA AAT CGT CCT GGT 2112 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 ATT TTT GTC CGA GTA GCA TAT TAT GCA AAA TGG ATA CAC AAA ATT ATT 2160 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 TTA ACA TAT AAG GTA CCA CAG TCA TAG 2187 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725

【００４０】 配列番号：２ 配列の長さ：７２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly His 20 25 30 Lys Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Asn Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His 145 150 155 160 Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr 165 170 175 Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser 180 185 190 Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu 195 200 205 Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp 210 215 220 His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro 225 230 235 240 His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp 245 250 255 Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr 260 265 270 Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys 275 280 285 Ala Asp Asn Thr Val Asn Asp Thr Asp Val Pro Met Glu Thr Thr Glu 290 295 300 Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Ala Asn Thr Ile 305 310 315 320 Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Lys 325 330 335 His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn 340 345 350 Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr 355 360 365 Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp 370 375 380 Met Ser Asn Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met 385 390 395 400 Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asn 405 410 415 Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala 420 425 430 Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His 435 440 445 Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys 450 455 460 Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu 465 470 475 480 Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val 485 490 495 Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Val Gly Trp Met Ile Ser Leu Arg 500 505 510 Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp 515 520 525 Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr 530 535 540 Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Glu Glu Lys 545 550 555 560 Arg Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly 565 570 575 Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp 580 585 590 Phe Val Asn Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu 595 600 605 Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn 610 615 620 Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu 625 630 635 640 Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu 645 650 655 Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp 660 665 670 Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu 675 680 685 Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly 690 695 700 Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile 705 710 715 720 Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser 725

【図面の簡単な説明】

【図１】ＲＢＣ１ｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。

【図２】ＨＢＣ２５ｃＤＮＡの制限酵素地図(a)および
ＨＡＣ１９ｃＤＮＡの制限酵素地図(b)を示す図であ
る。

【図３】ＨＢＣ２５ｃＤＮＡの塩基配列の一部を示す図
である。

【図４】ＨＡＣ１９ｃＤＮＡの塩基配列の一部を示す図
である。

【図５】ヒトＨＧＦコード領域の塩基配列（塩基番号１
〜６２４）とそのアミノ酸配列を示す図である。

【図６】ヒトＨＧＦコード領域の塩基配列（塩基番号６
２５〜１２４８）とそのアミノ酸配列を示す図である。

【図７】ヒトＨＧＦコード領域の塩基配列（塩基番号１
２４９〜１８７２）とそのアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図８】ヒトＨＧＦコード領域の塩基配列（塩基番号１
８７３〜２１８７）とそのアミノ酸配列を示す図であ
る。

【図９】サルＣＯＳ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターの構
築図である。

【図１０】マウスＣ１２７細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクタ
ーの構築図である。

【図１１】チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒトＨ
ＧＦ発現ベクターの構築図である。

【図１２】Ｓ−セファロース溶出液のフラクションと溶
出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係
を示す線図である。

【図１３】ヘパリン溶出液のフラクションと溶出成分の
吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線
図である。

【図１４】逆相ＨＰＬＣにおいて、通液したアセトニト
リル濃度と、溶出した成分の吸光度との関係を示す線図
である。

【図１５】精製組換ＨＧＦの還元下および非還元下での
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/36 (72)発明者 下西 学 滋賀県大津市桜野町１丁目20番36号 グ リーンベル西大津Ａ−203 (72)発明者 清水 伸 京都市左京区高野東開町１−23 27棟 303号 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ．342（Ｎｏｖ. 1989），ｐ．440−443 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 14/52 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)〜(e) (a）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質をコードするＤＮＡ (b)アミノ酸配列(a)において１若しくは複数のアミノ酸
   が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からな
   り、かつ肝実質細胞増殖活性を有するタンパク質をコー
   ドするＤＮＡ (c)配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ (d)(c)の塩基配列からなるＤＮＡと６０℃、６×ＳＳＣ
   緩衝液、５×デンハート溶液、５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、
   １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及びサケ精巣Ｄ
   ＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の条件下でハイブリダイズ
   し、かつ肝実質細胞増殖活性を有するタンパク質をコー
   ドするＤＮＡ (e)遺伝子コドンの縮重のため、(c)及び(d)に示される
   ＤＮＡとハイブリッド形成しないが、(c)又は(d)に示さ
   れるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ
   酸配列を持つタンパク質をコードするＤＮＡの何れかの
   ＤＮＡからなる遺伝子を含有する組換発現ベクターによ
   り、マウスＣ１２７細胞、チャイニーズハムスターＣＨ
   Ｏ細胞又はサルＣＯＳ細胞を形質転換して得られる形質
   転換体を培養し、発現される組換肝実質細胞増殖因子を
   単離精製することにより得られる、マウスＣ１２７細
   胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞又はサルＣＯＳ
   細胞由来の肝実質細胞増殖因子とは異なる組換肝実質細
   胞増殖因子。