JP3447785B2 - シマミミズ神経ペプチド - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な神経ペプチドに関
し、更に詳細にはシマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｏｅ
ｔｉｄａ）から得られる新規なオキシトシン様ペプチド
に関する。 【０００２】 【従来の技術】軟体動物や環形動物等の下等動物の神経
系は、高等動物の神経系に較べて単純であるので、神経
系のモデルとして広く研究されている。これらの下等動
物から得られた知見は、少なくともそれが細胞下レベル
の機構に関するものであれば、高等動物の神経系にも一
般化できると考えられている。その際、神経伝達物質の
探索が必要不可欠であり、古典的伝達物質に加えて、ペ
プチド性の伝達物質あるいはニューロモデュレーターの
探索が精力的に行われている。 【０００３】例えば、軟体動物であるムラサキイガイ
（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）から、本発明者等に
より、ＭＩＰと称する内因性神経ペプチドが報告されて
いる（特開平１−２２１３９２号公報参照）。この他に
も、軟体動物からは、Ｍｙｏｍｏｄｕｌｉｎ（Ｃｒｏｐ
ｐｅｒ，Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ，Ｋｏｌｋｓ，Ｋｕｐｆｅ
ｒｍａｎｎ，Ｗｅｉｓｓ， Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，５４８３〜５４８６ １９
８７）、ＣＡＲＰ（Ｃａｔｃｈ−Ｒｅｌａｘｉｎｇ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ：平田、久保田、高畠、桑原、宗岡 Ｂｒ
ａｉｎ Ｒｅｓ．，４４２ ３７３〜３７６）等の内因
性神経ペプチドが報告されている。 【０００４】一方、環形動物については、ヒルやミミズ
をはじめ多くの動物が神経生物学的な研究に用いられて
いる。またこれらの環形動物の神経系や体組織に含まれ
るペプチド性生理活性物質に関しても、多くの免疫組織
化学的な研究が報告されている。しかしそれらのペプチ
ド性生理活性物質に関しては、物質レベルでの研究は余
り進んでいないのが現状であり、例えば本発明者らによ
って、環形動物のアオゴカイ（Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ
ｖａｎｃａｕｒｉｃａ）から数種の神経ペプチド（第３
１回ペプチド化学討論会・明石市・平成５年１０月２７
〜２９日）および環形動物の近縁種であるユムシ（Ｕｒ
ｅｃｈｉｓ ｕｎｉｃｉｎｃｔｕｓ）からＡＬＴ（アラ
ニルロイシルスレオニン）およびその類縁ペプチド（Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，ｐ３１
５〜３２０，１９９２年）が報告されている程度に過ぎ
ない。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】神経ペプチドの構造−
活性相関、種特異性等の研究のために、さらに多くの神
経ペプチドを見出すことが必要とされている現状に鑑
み、充分に解明されていない環形動物について、新たな
神経ペプチドを単離し、神経ペプチドの発生学上の類似
点を究明する手段を与えると共に、医薬および農薬等へ
の新たなアプローチを与えることが、本発明が解決しよ
うとする課題である。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明者等は、約１ｋｇ
のシマミミズから、その消化管に対する自動収縮および
実体顕微鏡下での腎管収縮惹起活性を指標に、シマミミ
ズの内因性神経ペプチドを単離すべく鋭意研究を行い、
次のアミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （１） （本明細書中において、アミノ酸残基はＩＵＰＡＣおよ
びＩＵＢの定める３文字表記により表記する。式中ＮＨ
２はＣ末端がアミド化されていることを示す。）で表さ
れ、１番目のＣｙｓ残基と６番目のＣｙｓ残基との間に
ジスルフィド結合を有する新規ペプチドを分離、精製
し、その化学構造を決定すると共に、全合成によりその
構造を確認して、本発明を完成した。 【０００７】この新規ペプチドは、シマミミズの消化管
を収縮させる内因性神経ペプチドであり、シマミミズを
原料として、以下の方法により単離・精製することがで
きる。例えば、シマミミズを沸騰水を用いて抽出し、冷
却後遠心分離して粗抽出物を得る。次いでこの粗抽出物
を含水アルコール、例えば５０％エタノール水溶液で抽
出する。この抽出工程において抽出効率を高めるため、
抽出溶媒に４％程度の酢酸を加えて酸性下で抽出を行う
ことが好ましい。得られた抽出液は、逆相カートリッジ
（例えばＳｅｐｐａｋ Ｖａｃ １２ｃｃ：日本ミリポ
ア）に吸着させて、０．１％程度のトリフロロ酢酸（以
下ＴＦＡと略す）を含む５０％メタノールで溶出してペ
プチド区分を分取し、この画分を、イオン交換クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィー等に付し、目的と
するペプチドを分離・精製することができる。 【０００８】また本発明のペプチドは、分子内に１個の
ジスルフィド結合を有するノナペプチドであるため、通
常のペプチド合成機（例えばアプライドバイオシステム
社製ペプチド合成機４３１Ａ型）を用いた固相法によ
り、ジスルフィド結合を含まないペプチドを合成し、こ
れをＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィー等に付し
て精製した後、南竹の方法（南竹義春・京都大学薬学博
士論文，１９９１年）に従ってフェリシアン化カリウム
を用いて酸化することにより、分子内にジスルフィド結
合を導入して製造することができる。 【０００９】 【作用】本発明のペプチドは、後記評価例に示すように
シマミミズの消化管を収縮させる内因性神経ペプチドで
あり、また、実体顕微鏡下の観察では、腎管の収縮運動
惹起活性を示した。構造的には、（１）Ｎ末端にＣｙｓ
残基を有する。（２）１番目のＣｙｓ残基と６番目のＣ
ｙｓ残基との間に分子内にジスルフィド結合を有するノ
ナペプチドである。（３）−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−
の部分構造を有する。（４）Ｃ末端にグリシンアミドの
構造を有する等の点で、オキシトシンと類似性を有する
ことが判明した。これらのことから、本発明のペプチド
は、神経伝達系研究用の試薬としてだけでなく、医薬お
よび農薬等への新たなアプローチを与える有用な試薬と
して利用することができる。 【００１０】 【実施例】次に実施例によって本発明をさらに説明する
が、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではな
い。 【００１２】実施例１．シマミミズ神経ペプチドの精製 ａ．粗抽出 シマミミズ約１ｋｇ（釣餌業者より購入）を液体窒素中
で急速冷凍した後、粉砕した。これを沸騰している約４
リッターの４％酢酸中で１５分間抽出した後、冷却、濾
過して濾液を得た。この濾液に等量のエタノールを加
え、生じた沈澱を約５００ｍｌの４％酢酸／エタノール
（１：１）混液でホモジナイズ後、１０，０００×ｇで
３０分間遠心分離した。上清を集め、残った沈澱を再び
同条件でホモジナイズ後、遠心分離した。２回の操作で
得られた上清を集め、減圧下に約８０ｍｌに濃縮した
後、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して上清を集
めた。 【００１３】ｂ．逆相カートリッジへの吸着と溶出 ａ．で得られた粗抽出液を直列に連結した５個のＳｅｐ
ｐａｋ Ｖａｃ １２ｃｃカートリッジ（Ｃ１８，２ｇ
・日本ミリポア）に通液した。カートリッジを０．１％
ＴＦＡ次いで１０％メタノール／０．１％ＴＦＡで洗浄
した後、保持物質を５０％メタノール／０．１％ＴＦＡ
で溶出し、減圧濃縮後、ミリポアウルトラフリーフィル
ター Ｃ３−ＧＶ（日本ミリポア）で濾過した。 【００１４】ｃ．逆相カラムクロマトグラフィー（１） ｂ．で得られた溶出液を０．１％ＴＦＡに溶解し、Ｃａ
ｐｃｅｌｌＰａｋ Ｃ１８ ＳＧ１２０（資生堂、φ１
０×２５０ｍｍ）を用いたＣ−１８逆相高速液体カラム
クロマトグラフィーに付し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、１２０分間で０％か
ら６０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。
２ｍｌづつ分画し、生物検定により、アセトニトリル濃
度１２〜１５％で溶出された画分を分取した。 【００１５】ｄ．陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー（１） ｃ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東
ソー、φ７．５×７５ｍｍ）を用いた陽イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
で、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、７０分間
で０Ｍから０．７ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出し
た。１ｍｌずつ分画し、生物検定により、約０．１５Ｍ
のＮａＣｌ濃度で溶出された画分を分取した。 【００１６】ｅ．逆相カラムクロマトグラフィー（２） ｄ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔ
Ｍ（東ソー、φ４．６×１５０ｍｍ）を用いたＣ−１８
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速
０．５ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）
中、５０分間で１０％から１５％のアセトニトリルの直
線濃度勾配で溶出した。１ｍｌずつ分画し、生物検定に
より、アセトニトリル濃度約１３％に相当する画分を分
取した。 【００１７】ｆ．陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー（２） ｅ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東
ソー、φ７．５×７５ｍｍ）を用いた陽イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
で、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、７０分間
で０．１Ｍから０．３５ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で
溶出した。１ｍｌずつ分画し、生物検定により、約０．
１２ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された画分を分取した。 【００１８】ｇ．逆相カラムクロマトグラフィー（３） ｆ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔ
Ｍ（東ソー、φ４．６×１５０ｍｍ）を用いたＣ−１８
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速
０．３ｍｌ／ｍｉｎで、１３％アセトニトリルを含む
０．１％ＴＦＡでイソクラティックに溶出した。 【００１９】ｈ．逆相カラムクロマトグラフィー（４） ｇ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔ
Ｍ（東ソー、φ４．６×１５０ｍｍ）を用いたＣ−１８
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速
０．３ｍｌ／ｍｉｎで、１５％アセトニトリルを含む
０．１％ＴＦＡでイソクラティックに溶出した。２２０
ｎｍの紫外吸収でモニターしながらこの操作を３回繰り
返し、ほぼ単一の紫外吸収ピークを示すまで精製した。 【００２０】ｉ．陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー（３） ｈ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東
ソー、φ７．５×７５ｍｍ）を用いた陽イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
で、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、７０分間
で０．０７Ｍから０．１４ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配
で溶出した。２２０ｎｍの紫外吸収モニターでほぼ単一
の紫外吸収ピークを示した。 【００２１】ｊ．逆相カラムクロマトグラフィー（５） ｉ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔ
Ｍ（東ソー、φ４．６×１５０ｍｍ）を用いたＣ−１８
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速
０．３ｍｌ／ｍｉｎで、１５％アセトニトリルを含む
０．１％ＴＦＡでイソクラティックに溶出した。本発明
のペプチドは、〔図１〕に示す保持時間約３７分に溶出
される２２０ｎｍの紫外吸収単一ピークを分取すること
により得られた。 【００２２】実施例２ シマミミズ神経ペプチドの同定 本発明のペプチドのアミノ酸組成は、Ｗａｋｏｐａｋ
ＷＳ−ＰＴＣカラム（和光純薬）を用いたＰＴＣアミノ
酸分析システムにより〔表１〕のように測定された。 【００２３】 【表１】 【００２４】また、本発明のペプチドのアミノ酸配列
は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＰＳＱ−１型気相シークエンサ
ー（島津製作所製）による自動エドマン分解により、第
１サイクルおよび第６サイクルを除く全てのアミノ酸配
列が、〔表２〕のように同定された。また、このペプチ
ドを軒原らの方法（軒原ら．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ １９９０，１５９〜１６４頁，１９９１
年）に従って還元後ピリジルエチル化して同様にアミノ
酸配列を測定したところ、第１および第６サイクルにピ
リジルエチル化システインを検出した。 【００２５】 【表２】 【００２６】さらに、本発明のペプチドのＦＡＢ−ＭＳ
スペクトルは、ＪＭＳＨＸ−１１０／１１０Ａ型ＦＡＢ
質量分析機（日本電子製）により、（Ｍ＋Ｈ）＋＝９９
３．４ｍ／ｚと測定され、Ｃ４１Ｈ６４Ｏ１１Ｎ１４Ｓ
２（＝９９２．４４）の分子式が与えられた。これらの
ことから、本発明のペプチドは、アミノ酸配列式
（１）： Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （１） （式中ＮＨ２はＣ末端がアミド化されていることを示
す。）で表され、１番目のＣｙｓ残基と６番目のＣｙｓ
残基との間にジスルフィド結合を有するペプチド（配列
番号１）であることが明らかになった。 【００２７】実施例３ 固相法によるペプチドの合成 本発明のペプチドの合成は、アプライドバイオシステム
社の全自動ペプチド合成機４３１Ａ型を用い、Ｆａｓｔ
ＭｏｃＴＭの固相法により合成した。Ｆｍｏｃ−ａｍｉ
ｎｏｍｅｔｈｙｌ−ＳＡＬ樹脂（渡辺化学工業製）を担
体として、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ），Ｆｍｏｃ−Ａ
ｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏ
ｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆ
ｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）およびＦｍｏｃ−Ｖａｌを用
いた。（但し、Ｆｍｏｃ＝９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅ
ｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ，ＳＡＬ＝Ｓｕｐｅｒ Ａ
ｃｉｄ Ｌａｂｉｌｅ，Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８−
Ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ−６−ｓｕｌｆ
ｏｎｙｌ，Ｔｒｔ＝Ｔｒｉｔｙｌ，ｔＢｕ＝ｔ−Ｂｕｔ
ｙｌを示す。） 【００２８】反応終了後、ペプチド樹脂を室温で６．２
５％フェノール／２．１％１，２−エタンジチオール／
４．２％チオアニソール／４．２％水／８３．３％ＴＦ
Ａ試薬で処理して脱保護および切断を行い、エーテルを
加えてペプチドを沈澱させ、沈澱をエーテルで３回洗浄
した後にＴＦＡに溶解し、再びエーテルで沈澱させてペ
プチドを得た。 【００２９】得られたペプチドを、ホープら（Ｈｏｐ
ｅ，Ｍｕｒｔｉ，ｄｕ Ｖｉｇｎｅａｄ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２３７，１５６３−１５６６）の方法
を改良した南竹の方法（南竹義春・京都大学薬学博士論
文，１９９１年）に従ってフェリシアン化カリウムを用
いて酸化することにより、分子内にジスルフィド結合を
導入した後、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーで精
製した。この精製ペプチドは、〔図２〕のＡおよびＢに
示すように、実施例１−ｊに記載の条件下での逆相カラ
ムクロマトグラフィーおよび実施例１−ｉに記載の条件
下での陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにおい
て、保持時間が天然品と全く一致した。また、後述の評
価系において、天然品と全く同一の生理活性を示した。 【００３０】評価例１ シマミミズ消化管の収縮活性の
測定 シマミミズ消化管の収縮活性は、クックら（Ｃｏｏｋ
Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．，６１Ｃ：２９１−２９５ １９７８）の
方法に準じて実施した。すなわち、シマミミズの消化管
を摘出し、消化管の部分の両端を木綿の糸でしばり、一
端を試料添加用のチャンバー（容量２ｍｌ）に固定し、
他端をトランスデューサーにつないで検定の標本とし
た。検定すべき検体は、リンゲル液（１０２ｍＭＮａＣ
ｌ，１．６ｍＭＫＣｌ，１．８ｍＭＣａＣｌ２，５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）に溶解して、試料添加
用のチャンバーに添加し、収縮による長さの変化を記録
した。その結果を〔図３〕に示す。本発明のペプチド
は、シマミミズ消化管の自動収縮を増強した。 【００３１】評価例２ シマミミズ腎管の収縮運動惹起
活性の観察 シマミミズを腹位にピンで固定して背側から切開し、消
化管を除去した。次いで、体壁筋を腎管が付いたまま５
ｍｍ×５ｍｍの大きさに切り取り、小シャーレ（容量約
１．５ｍｌ）の底に敷いたゴム板の上にピンで固定し
て、腎管標本を作製した。検定すべき試料はリンゲル液
（組成は前記に同じ）に溶解し、注射針の先からエアレ
ーションしながら実体顕微鏡で腎管の収縮を観察した。
この方法により、本発明のペプチドはシマミミズ腎管の
収縮運動を惹起する活性を有することが明らかとなっ
た。 【００３２】 【発明の効果】本発明のシマミミズ神経ペプチドは、シ
マミミズ消化管の自発収縮を増強する他、腎管の収縮運
動を惹起する活性を有する神経ペプチドであり、神経伝
達系を解明するための生化学試薬として有用である。さ
らに本発明のペプチドは、オキシトシンと類似の構造を
有するペプチドであることから、分子レベルでの構造・
活性相関の研究を通じて、医薬および農薬への新たなア
プローチを与えるものである。 【配列表】 【００３３】配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：シマミミズ（Ｅｉｓｅｉｎｉａ ｆｏｅｔｉｄ
ａ） 配列の特徴： １−６ Ｅ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ 配列の特徴： 他の特徴：Ｃ末端アミド化 存在位置：９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列：
し、更に詳細にはシマミミズ（Ｅｉｓｅｎｉａ ｆｏｅ
ｔｉｄａ）から得られる新規なオキシトシン様ペプチド
に関する。 【０００２】 【従来の技術】軟体動物や環形動物等の下等動物の神経
系は、高等動物の神経系に較べて単純であるので、神経
系のモデルとして広く研究されている。これらの下等動
物から得られた知見は、少なくともそれが細胞下レベル
の機構に関するものであれば、高等動物の神経系にも一
般化できると考えられている。その際、神経伝達物質の
探索が必要不可欠であり、古典的伝達物質に加えて、ペ
プチド性の伝達物質あるいはニューロモデュレーターの
探索が精力的に行われている。 【０００３】例えば、軟体動物であるムラサキイガイ
（Ｍｙｔｉｌｕｓ ｅｄｕｌｉｓ）から、本発明者等に
より、ＭＩＰと称する内因性神経ペプチドが報告されて
いる（特開平１−２２１３９２号公報参照）。この他に
も、軟体動物からは、Ｍｙｏｍｏｄｕｌｉｎ（Ｃｒｏｐ
ｐｅｒ，Ｔｅｎｅｎｂａｕｍ，Ｋｏｌｋｓ，Ｋｕｐｆｅ
ｒｍａｎｎ，Ｗｅｉｓｓ， Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，５４８３〜５４８６ １９
８７）、ＣＡＲＰ（Ｃａｔｃｈ−Ｒｅｌａｘｉｎｇ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ：平田、久保田、高畠、桑原、宗岡 Ｂｒ
ａｉｎ Ｒｅｓ．，４４２ ３７３〜３７６）等の内因
性神経ペプチドが報告されている。 【０００４】一方、環形動物については、ヒルやミミズ
をはじめ多くの動物が神経生物学的な研究に用いられて
いる。またこれらの環形動物の神経系や体組織に含まれ
るペプチド性生理活性物質に関しても、多くの免疫組織
化学的な研究が報告されている。しかしそれらのペプチ
ド性生理活性物質に関しては、物質レベルでの研究は余
り進んでいないのが現状であり、例えば本発明者らによ
って、環形動物のアオゴカイ（Ｐｅｒｉｎｅｒｅｉｓ
ｖａｎｃａｕｒｉｃａ）から数種の神経ペプチド（第３
１回ペプチド化学討論会・明石市・平成５年１０月２７
〜２９日）および環形動物の近縁種であるユムシ（Ｕｒ
ｅｃｈｉｓ ｕｎｉｃｉｎｃｔｕｓ）からＡＬＴ（アラ
ニルロイシルスレオニン）およびその類縁ペプチド（Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９１，ｐ３１
５〜３２０，１９９２年）が報告されている程度に過ぎ
ない。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】神経ペプチドの構造−
活性相関、種特異性等の研究のために、さらに多くの神
経ペプチドを見出すことが必要とされている現状に鑑
み、充分に解明されていない環形動物について、新たな
神経ペプチドを単離し、神経ペプチドの発生学上の類似
点を究明する手段を与えると共に、医薬および農薬等へ
の新たなアプローチを与えることが、本発明が解決しよ
うとする課題である。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明者等は、約１ｋｇ
のシマミミズから、その消化管に対する自動収縮および
実体顕微鏡下での腎管収縮惹起活性を指標に、シマミミ
ズの内因性神経ペプチドを単離すべく鋭意研究を行い、
次のアミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （１） （本明細書中において、アミノ酸残基はＩＵＰＡＣおよ
びＩＵＢの定める３文字表記により表記する。式中ＮＨ
２はＣ末端がアミド化されていることを示す。）で表さ
れ、１番目のＣｙｓ残基と６番目のＣｙｓ残基との間に
ジスルフィド結合を有する新規ペプチドを分離、精製
し、その化学構造を決定すると共に、全合成によりその
構造を確認して、本発明を完成した。 【０００７】この新規ペプチドは、シマミミズの消化管
を収縮させる内因性神経ペプチドであり、シマミミズを
原料として、以下の方法により単離・精製することがで
きる。例えば、シマミミズを沸騰水を用いて抽出し、冷
却後遠心分離して粗抽出物を得る。次いでこの粗抽出物
を含水アルコール、例えば５０％エタノール水溶液で抽
出する。この抽出工程において抽出効率を高めるため、
抽出溶媒に４％程度の酢酸を加えて酸性下で抽出を行う
ことが好ましい。得られた抽出液は、逆相カートリッジ
（例えばＳｅｐｐａｋ Ｖａｃ １２ｃｃ：日本ミリポ
ア）に吸着させて、０．１％程度のトリフロロ酢酸（以
下ＴＦＡと略す）を含む５０％メタノールで溶出してペ
プチド区分を分取し、この画分を、イオン交換クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィー等に付し、目的と
するペプチドを分離・精製することができる。 【０００８】また本発明のペプチドは、分子内に１個の
ジスルフィド結合を有するノナペプチドであるため、通
常のペプチド合成機（例えばアプライドバイオシステム
社製ペプチド合成機４３１Ａ型）を用いた固相法によ
り、ジスルフィド結合を含まないペプチドを合成し、こ
れをＣ−１８逆相高速液体クロマトグラフィー等に付し
て精製した後、南竹の方法（南竹義春・京都大学薬学博
士論文，１９９１年）に従ってフェリシアン化カリウム
を用いて酸化することにより、分子内にジスルフィド結
合を導入して製造することができる。 【０００９】 【作用】本発明のペプチドは、後記評価例に示すように
シマミミズの消化管を収縮させる内因性神経ペプチドで
あり、また、実体顕微鏡下の観察では、腎管の収縮運動
惹起活性を示した。構造的には、（１）Ｎ末端にＣｙｓ
残基を有する。（２）１番目のＣｙｓ残基と６番目のＣ
ｙｓ残基との間に分子内にジスルフィド結合を有するノ
ナペプチドである。（３）−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−
の部分構造を有する。（４）Ｃ末端にグリシンアミドの
構造を有する等の点で、オキシトシンと類似性を有する
ことが判明した。これらのことから、本発明のペプチド
は、神経伝達系研究用の試薬としてだけでなく、医薬お
よび農薬等への新たなアプローチを与える有用な試薬と
して利用することができる。 【００１０】 【実施例】次に実施例によって本発明をさらに説明する
が、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではな
い。 【００１２】実施例１．シマミミズ神経ペプチドの精製 ａ．粗抽出 シマミミズ約１ｋｇ（釣餌業者より購入）を液体窒素中
で急速冷凍した後、粉砕した。これを沸騰している約４
リッターの４％酢酸中で１５分間抽出した後、冷却、濾
過して濾液を得た。この濾液に等量のエタノールを加
え、生じた沈澱を約５００ｍｌの４％酢酸／エタノール
（１：１）混液でホモジナイズ後、１０，０００×ｇで
３０分間遠心分離した。上清を集め、残った沈澱を再び
同条件でホモジナイズ後、遠心分離した。２回の操作で
得られた上清を集め、減圧下に約８０ｍｌに濃縮した
後、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して上清を集
めた。 【００１３】ｂ．逆相カートリッジへの吸着と溶出 ａ．で得られた粗抽出液を直列に連結した５個のＳｅｐ
ｐａｋ Ｖａｃ １２ｃｃカートリッジ（Ｃ１８，２ｇ
・日本ミリポア）に通液した。カートリッジを０．１％
ＴＦＡ次いで１０％メタノール／０．１％ＴＦＡで洗浄
した後、保持物質を５０％メタノール／０．１％ＴＦＡ
で溶出し、減圧濃縮後、ミリポアウルトラフリーフィル
ター Ｃ３−ＧＶ（日本ミリポア）で濾過した。 【００１４】ｃ．逆相カラムクロマトグラフィー（１） ｂ．で得られた溶出液を０．１％ＴＦＡに溶解し、Ｃａ
ｐｃｅｌｌＰａｋ Ｃ１８ ＳＧ１２０（資生堂、φ１
０×２５０ｍｍ）を用いたＣ−１８逆相高速液体カラム
クロマトグラフィーに付し、流速１ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、１２０分間で０％か
ら６０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。
２ｍｌづつ分画し、生物検定により、アセトニトリル濃
度１２〜１５％で溶出された画分を分取した。 【００１５】ｄ．陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー（１） ｃ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東
ソー、φ７．５×７５ｍｍ）を用いた陽イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
で、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、７０分間
で０Ｍから０．７ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出し
た。１ｍｌずつ分画し、生物検定により、約０．１５Ｍ
のＮａＣｌ濃度で溶出された画分を分取した。 【００１６】ｅ．逆相カラムクロマトグラフィー（２） ｄ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔ
Ｍ（東ソー、φ４．６×１５０ｍｍ）を用いたＣ−１８
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速
０．５ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）
中、５０分間で１０％から１５％のアセトニトリルの直
線濃度勾配で溶出した。１ｍｌずつ分画し、生物検定に
より、アセトニトリル濃度約１３％に相当する画分を分
取した。 【００１７】ｆ．陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー（２） ｅ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東
ソー、φ７．５×７５ｍｍ）を用いた陽イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
で、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、７０分間
で０．１Ｍから０．３５ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で
溶出した。１ｍｌずつ分画し、生物検定により、約０．
１２ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された画分を分取した。 【００１８】ｇ．逆相カラムクロマトグラフィー（３） ｆ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔ
Ｍ（東ソー、φ４．６×１５０ｍｍ）を用いたＣ−１８
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速
０．３ｍｌ／ｍｉｎで、１３％アセトニトリルを含む
０．１％ＴＦＡでイソクラティックに溶出した。 【００１９】ｈ．逆相カラムクロマトグラフィー（４） ｇ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔ
Ｍ（東ソー、φ４．６×１５０ｍｍ）を用いたＣ−１８
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速
０．３ｍｌ／ｍｉｎで、１５％アセトニトリルを含む
０．１％ＴＦＡでイソクラティックに溶出した。２２０
ｎｍの紫外吸収でモニターしながらこの操作を３回繰り
返し、ほぼ単一の紫外吸収ピークを示すまで精製した。 【００２０】ｉ．陽イオン交換カラムクロマトグラフィ
ー（３） ｈ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（東
ソー、φ７．５×７５ｍｍ）を用いた陽イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎ
で、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中、７０分間
で０．０７Ｍから０．１４ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配
で溶出した。２２０ｎｍの紫外吸収モニターでほぼ単一
の紫外吸収ピークを示した。 【００２１】ｊ．逆相カラムクロマトグラフィー（５） ｉ．で得られた画分をＴＳＫｇｅｌ ＯＤＳ８０Ｔ
Ｍ（東ソー、φ４．６×１５０ｍｍ）を用いたＣ−１８
逆相高速液体カラムクロマトグラフィーに付し、流速
０．３ｍｌ／ｍｉｎで、１５％アセトニトリルを含む
０．１％ＴＦＡでイソクラティックに溶出した。本発明
のペプチドは、〔図１〕に示す保持時間約３７分に溶出
される２２０ｎｍの紫外吸収単一ピークを分取すること
により得られた。 【００２２】実施例２ シマミミズ神経ペプチドの同定 本発明のペプチドのアミノ酸組成は、Ｗａｋｏｐａｋ
ＷＳ−ＰＴＣカラム（和光純薬）を用いたＰＴＣアミノ
酸分析システムにより〔表１〕のように測定された。 【００２３】 【表１】 【００２４】また、本発明のペプチドのアミノ酸配列
は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＰＳＱ−１型気相シークエンサ
ー（島津製作所製）による自動エドマン分解により、第
１サイクルおよび第６サイクルを除く全てのアミノ酸配
列が、〔表２〕のように同定された。また、このペプチ
ドを軒原らの方法（軒原ら．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ １９９０，１５９〜１６４頁，１９９１
年）に従って還元後ピリジルエチル化して同様にアミノ
酸配列を測定したところ、第１および第６サイクルにピ
リジルエチル化システインを検出した。 【００２５】 【表２】 【００２６】さらに、本発明のペプチドのＦＡＢ−ＭＳ
スペクトルは、ＪＭＳＨＸ−１１０／１１０Ａ型ＦＡＢ
質量分析機（日本電子製）により、（Ｍ＋Ｈ）＋＝９９
３．４ｍ／ｚと測定され、Ｃ４１Ｈ６４Ｏ１１Ｎ１４Ｓ
２（＝９９２．４４）の分子式が与えられた。これらの
ことから、本発明のペプチドは、アミノ酸配列式
（１）： Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （１） （式中ＮＨ２はＣ末端がアミド化されていることを示
す。）で表され、１番目のＣｙｓ残基と６番目のＣｙｓ
残基との間にジスルフィド結合を有するペプチド（配列
番号１）であることが明らかになった。 【００２７】実施例３ 固相法によるペプチドの合成 本発明のペプチドの合成は、アプライドバイオシステム
社の全自動ペプチド合成機４３１Ａ型を用い、Ｆａｓｔ
ＭｏｃＴＭの固相法により合成した。Ｆｍｏｃ−ａｍｉ
ｎｏｍｅｔｈｙｌ−ＳＡＬ樹脂（渡辺化学工業製）を担
体として、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ），Ｆｍｏｃ−Ａ
ｓｎ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），Ｆｍｏ
ｃ−Ｇｌｙ，Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ，Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ，Ｆ
ｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）およびＦｍｏｃ−Ｖａｌを用
いた。（但し、Ｆｍｏｃ＝９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅ
ｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ，ＳＡＬ＝Ｓｕｐｅｒ Ａ
ｃｉｄ Ｌａｂｉｌｅ，Ｐｍｃ＝２，２，５，７，８−
Ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍａｎ−６−ｓｕｌｆ
ｏｎｙｌ，Ｔｒｔ＝Ｔｒｉｔｙｌ，ｔＢｕ＝ｔ−Ｂｕｔ
ｙｌを示す。） 【００２８】反応終了後、ペプチド樹脂を室温で６．２
５％フェノール／２．１％１，２−エタンジチオール／
４．２％チオアニソール／４．２％水／８３．３％ＴＦ
Ａ試薬で処理して脱保護および切断を行い、エーテルを
加えてペプチドを沈澱させ、沈澱をエーテルで３回洗浄
した後にＴＦＡに溶解し、再びエーテルで沈澱させてペ
プチドを得た。 【００２９】得られたペプチドを、ホープら（Ｈｏｐ
ｅ，Ｍｕｒｔｉ，ｄｕ Ｖｉｇｎｅａｄ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２３７，１５６３−１５６６）の方法
を改良した南竹の方法（南竹義春・京都大学薬学博士論
文，１９９１年）に従ってフェリシアン化カリウムを用
いて酸化することにより、分子内にジスルフィド結合を
導入した後、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーで精
製した。この精製ペプチドは、〔図２〕のＡおよびＢに
示すように、実施例１−ｊに記載の条件下での逆相カラ
ムクロマトグラフィーおよび実施例１−ｉに記載の条件
下での陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにおい
て、保持時間が天然品と全く一致した。また、後述の評
価系において、天然品と全く同一の生理活性を示した。 【００３０】評価例１ シマミミズ消化管の収縮活性の
測定 シマミミズ消化管の収縮活性は、クックら（Ｃｏｏｋ
Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．，６１Ｃ：２９１−２９５ １９７８）の
方法に準じて実施した。すなわち、シマミミズの消化管
を摘出し、消化管の部分の両端を木綿の糸でしばり、一
端を試料添加用のチャンバー（容量２ｍｌ）に固定し、
他端をトランスデューサーにつないで検定の標本とし
た。検定すべき検体は、リンゲル液（１０２ｍＭＮａＣ
ｌ，１．６ｍＭＫＣｌ，１．８ｍＭＣａＣｌ２，５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）に溶解して、試料添加
用のチャンバーに添加し、収縮による長さの変化を記録
した。その結果を〔図３〕に示す。本発明のペプチド
は、シマミミズ消化管の自動収縮を増強した。 【００３１】評価例２ シマミミズ腎管の収縮運動惹起
活性の観察 シマミミズを腹位にピンで固定して背側から切開し、消
化管を除去した。次いで、体壁筋を腎管が付いたまま５
ｍｍ×５ｍｍの大きさに切り取り、小シャーレ（容量約
１．５ｍｌ）の底に敷いたゴム板の上にピンで固定し
て、腎管標本を作製した。検定すべき試料はリンゲル液
（組成は前記に同じ）に溶解し、注射針の先からエアレ
ーションしながら実体顕微鏡で腎管の収縮を観察した。
この方法により、本発明のペプチドはシマミミズ腎管の
収縮運動を惹起する活性を有することが明らかとなっ
た。 【００３２】 【発明の効果】本発明のシマミミズ神経ペプチドは、シ
マミミズ消化管の自発収縮を増強する他、腎管の収縮運
動を惹起する活性を有する神経ペプチドであり、神経伝
達系を解明するための生化学試薬として有用である。さ
らに本発明のペプチドは、オキシトシンと類似の構造を
有するペプチドであることから、分子レベルでの構造・
活性相関の研究を通じて、医薬および農薬への新たなア
プローチを与えるものである。 【配列表】 【００３３】配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：シマミミズ（Ｅｉｓｅｉｎｉａ ｆｏｅｔｉｄ
ａ） 配列の特徴： １−６ Ｅ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｂｏｎｄｓ 配列の特徴： 他の特徴：Ｃ末端アミド化 存在位置：９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列：
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明のペプチドの精製の最終段階
（実施例１−ｊ）での逆相クロマトグラフィーのクロマ
トグラムである。本発明のペプチドは、この条件では、
保持時間約３７分の箇所に単一ピークとして溶出され
る。 【図２】図２は、天然品（Ｎ）および合成品（Ｓ）のペ
プチドを、２種類のカラムクロマトグラフィーを用いて
同定したクロマトグラムであり、Ｎ＋Ｓは天然品のペプ
チドと合成品のペプチドを混合した試料のクロマトグラ
ムである。図２−Ａは、実施例１−ｊに記載の条件下で
の逆相カラムクロマトグラフィーでのクロマトグラムで
あり、図２−Ｂは実施例１−ｉに記載の条件下での陽イ
オン交換カラムクロマトグラフィーでのクロマトグラム
である。この２種類のカラムクロマトグラフィーにおい
て、天然品、合成品および天然品と合成品の混合試料が
同一の保持時間に単一ピークを示すことは、天然品と合
成品とが同一であることを示すものである。 【図３】図３は、実施例１で得られた本発明のペプチド
の１００分の１量を評価例１の試料添加用のチャンバー
に加えた時のアオゴカイ消化管の収縮を記載した図面で
ある。図中の上矢印は、試料添加のタイミングを示す。
本発明のペプチドは、アオゴカイ消化管の自発収縮を増
強する。
（実施例１−ｊ）での逆相クロマトグラフィーのクロマ
トグラムである。本発明のペプチドは、この条件では、
保持時間約３７分の箇所に単一ピークとして溶出され
る。 【図２】図２は、天然品（Ｎ）および合成品（Ｓ）のペ
プチドを、２種類のカラムクロマトグラフィーを用いて
同定したクロマトグラムであり、Ｎ＋Ｓは天然品のペプ
チドと合成品のペプチドを混合した試料のクロマトグラ
ムである。図２−Ａは、実施例１−ｊに記載の条件下で
の逆相カラムクロマトグラフィーでのクロマトグラムで
あり、図２−Ｂは実施例１−ｉに記載の条件下での陽イ
オン交換カラムクロマトグラフィーでのクロマトグラム
である。この２種類のカラムクロマトグラフィーにおい
て、天然品、合成品および天然品と合成品の混合試料が
同一の保持時間に単一ピークを示すことは、天然品と合
成品とが同一であることを示すものである。 【図３】図３は、実施例１で得られた本発明のペプチド
の１００分の１量を評価例１の試料添加用のチャンバー
に加えた時のアオゴカイ消化管の収縮を記載した図面で
ある。図中の上矢印は、試料添加のタイミングを示す。
本発明のペプチドは、アオゴカイ消化管の自発収縮を増
強する。
フロントページの続き
(72)発明者 南方 宏之
大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１
号 財団法人サントリー生物有機科学研
究所内
(72)発明者 野本 享資
大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１
号 財団法人サントリー生物有機科学研
究所内
(56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ.
262，Ｎｏ．33（1987）ｐ．15821−
15824
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 7/06
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】次のアミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ２ （１） （式中、アミノ酸残基はＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める
３文字表記により示し、ＮＨ２はＣ末端がアミド化され
ていることを示す。）で表され、１番目のＣｙｓ残基と
６番目のＣｙｓ残基との間にジスルフィド結合を有する
新規ペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32304493A JP3447785B2 (ja) | 1993-11-17 | 1993-11-17 | シマミミズ神経ペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32304493A JP3447785B2 (ja) | 1993-11-17 | 1993-11-17 | シマミミズ神経ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07138288A JPH07138288A (ja) | 1995-05-30 |
| JP3447785B2 true JP3447785B2 (ja) | 2003-09-16 |
Family
ID=18150489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32304493A Expired - Fee Related JP3447785B2 (ja) | 1993-11-17 | 1993-11-17 | シマミミズ神経ペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3447785B2 (ja) |
-
1993
- 1993-11-17 JP JP32304493A patent/JP3447785B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．３３（１９８７）ｐ．１５８２１−１５８２４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07138288A (ja) | 1995-05-30 |
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