JP3524092B2 - ラットのプロバシン遺伝子のｄｎａ配列によるアンドロゲン制御 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、（１）アンドロゲン性または抗アンドロゲ
ン性物質の検定、（２）前立腺疾患のための非ヒト遺伝
子導入眞該動物モデル、（３）前立腺疾患のための培養
細胞モデル、および（４）遺伝子治療法によるヒト良性
前立腺過形成およびヒト前立腺癌の治療を可能にする新
規なDNA分子およびそのフラグメントに関する。本発明
は、アンドロゲン作用をもたらすアンドロゲンの受容体
または代謝経路の作動剤または拮抗剤の検定、前立腺癌
誘導物質の検定、前立腺疾患に対する医薬および遺伝子
治療または前立腺細胞に対する保護物質の検定を可能に
するものである。

背景技術 アンドロゲン活性：アンドロゲン受容体（AR）機能の
検定が臨床的に必要となるのは、アンドロゲン代謝機能
に欠陥があると思われるような場合である。例えば、AR
の突然変異は、アンドロゲン不感性症候群、AIS,（Kaze
mi−Esfarjaniら、1993;Brinkmannら、1991;Brinkmann
ら、1992a;Brinkmannら、1992b;De Bellisら、1992;Fre
nchら、1990;Imperato−McGinleyら、1990;Lubahnら、1
989;Quigleyら、1992;Ris−Stalpersら、1990;Ris−Sta
lpersら、1991;Simentalら、1992）または睾丸性女性化
動物（Yarbroughら、1990;Heら、1991）、ケネディー症
候群（La Spadaら、1991）、前立腺癌（Newmarkら、199
2;Brinkmannら、1991;Veldscholteら、1992b;Veldschol
teら、1992a;Veldscholteら、1990）および乳癌（Woost
erら、1992）の生物活性に影響を及ぼす。受容体におけ
る直接的突然変異以外にも、ステロイド受容体で報告さ
れているように（Powerら、1991;Shemshediniら、1992;
Kuiperら、1993）、非アンドロゲン性ステロイド受容体
活性化機構に欠陥が起こり得る。これらの欠陥の程度を
測定する検定法は、欠陥性受容体を活性化する新規物質
を試験する手段を提供し、治療の基礎を形成する。

アンドロゲン受容体は、大きく分けて核受容体の一員
であり、主として特異的なDNA配列のホルモン感応性因
子（HRE）およびそれに関連した要因との結合を介して
遺伝子活性を制御する転写要因として機能すると信じら
れている（Allenら、1991;Smithら、1993;Evans、1988;
Beato、1989）。一般に、これらのHREは倒立反復コンセ
ンサス配列の２つのカテゴリーに分けられる。その１つ
はエステロゲン、レチノイン酸および甲状腺ホルモン反
応を仲介するTGACCモチーフであり（Klein−Hitpass
ら、1986;Umesonoら、1988）、他方はグルココルチコイ
ド、プロゲスチンおよびアンドロゲンによる制御を与え
るTGTTCT配列である（Scheidereitら、1986;Shrahle
ら、1987;Hamら、1988）。アンドロゲン受容体反応性因
子をこの後者のグループに含めるのは、主としてアンド
ロゲン受容体がマウスの乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）DNA
のグルココルチコイド反応性因子（GRE）（Hamら、198
8;Rocheら、1992;Darbreら、1986;Catoら、1987）およ
びチロシン アミノトランスフェラーゼ（TAT）遺伝子
（Denisonら、1989）と結合するという知見に基づくも
のである。

前立腺のステロイド−結合性タンパクのポリペプチド
成分をコード化したC3（１）遺伝子のアンドロゲン制御
が、研究されている（Heynsら、1978;Hurstら、1983;Pa
rkerら、1988;Parkerら、1980）。C3（１）遺伝子のプ
ロモータ領域ならびに第１イントロン内における配列は
アンドロゲン受容体に対する結合親和性が高い（Perry
ら、1985;Claessensら、1993;De Vosら、1991;Rushmers
ら、1990）が、相同性または非相同性プロモータ−受容
体系にアンドロゲン制御を与えるためにこれらの配列を
使用する試みはほとんど成功せず（Parkerら、1985;Par
kerら、1988）、これらのフラグメントで弱いアンドロ
ゲン誘導が認められているに過ぎない（Claessensら、1
993;Tanら、1992;De Vosら、1991;Rushmareら、1990;Cl
aessensら、1990b;Claessensら、1990a;Claessensら、1
990b;Claessensら、1990a）。最近のDNアーゼＩフート
プリント実験で、アンドロゲン受容体のDNA結合ドメイ
ンがこのイントロンフラグメントに存在するグルココル
チコイド反応性因子（GRE）に結合することが認められ
ている（De Voaら、1991;Claessensら、1993）。この遺
伝子に完全なGREが存在することは、前立腺結合タンパ
クのC1成分の表現に対してグルココルチコイドの影響が
認められることと一致する（Rennieら、1989）。ヒト前
立腺特異性抗体（PSA）遺伝子は、ヒト前立腺腫瘍およ
び培養細胞においてアンドロゲンにより制御される（Ri
egmanら、1991;Montgomeryら、1992;Youngら、1992;Mur
phyら、1992;Armbruster、1993）。構成したPSA DNAプ
ロモータは、アンドロゲンに対して反応するGRE様配列
を示す（Riegmanら、1991）。Slp遺伝子は、GRE様配列
を介して特異的アンドロゲン制御を示す（Adlerら、199
2;Adlerら、1991）。前立腺からのその他のアンドロゲ
ン制御遺伝子、例えばSVS II（Doddら、1983;Doddら、1
986;Harrisら、1990）、20kDaタンパク（Hoら、198
9）、DP1（Hoら、1992）がクローン化されているが、ア
ンドロゲン制御性配列はいまもって同定されていない。

遺伝子導入動物：生殖系の１細胞または胚発育の初期
の段階で遺伝子を導入すると、その遺伝子を含み、かつ
次世代に伝達する遺伝子導入動物が得られる。組織の遺
伝子特異的表現は、組織のDNA特異性因子によって制限
することができる。前立腺の導入遺伝子特異的表現はほ
とんど成功がみられず、しばしば前立腺に限られない。
例えば、5'−フランキング配列の4.3kbおよび3'−フラ
ンキング配列の2.2kbを含むラットの完全C3（１）遺伝
子は、遺伝子導入マウスに前立腺特異性表現を与える
（Allisonら、1989）が、5'−フランキングC3（１）の6
kbのみを使用すると前立腺、精嚢、および精巣を標的と
した遺伝子導入系が得られる（Buttyanら、1993）。int
−２に共役したMMTVでは、アンドロゲン制御前立腺上皮
細胞過形成を発症する遺伝子導入マウスが得られるが、
このようにして得られたマウスは不妊である（Muller
ら、1990;Leder、1990;Tutroneら、1993）。その他の系
統の雄マウスは導入遺伝子の前立腺における表現の他
に、精嚢、輸精管および唾液腺にint−２遺伝子を表現
し、一方雌は乳腺にこの遺伝子を表現し、乳腺過形成を
発症する（Leder、1990）。しかし、MMTVを標的にする
と、精巣に表現が現れ、不妊となる（Lucchiniら、199
2）。SV−40ウイルスの先頭領域にリンクしたgp91−pho
x遺伝子プロモータ（通常、前立腺に表現されない遺伝
子）を用いると、神経芽細胞腫と同定される病変が前立
腺に現れた（Skalnikら、1991） 遺伝子導入動物における前立腺を標的とした遺伝子
は、前立腺の発達および機能に変化をもたらす可能性が
ある。前立腺の過形成または癌の発達に関連した癌遺伝
子および腫瘍抑制遺伝子（Flemingら、1986;Matusik
ら、1987;Doddら、1990;Hockenbery、1992;Buttyanら、
1993;Carterら、1990a;Carterら、1990b;Tutroneら、19
93;Booksteinら、1993;Thompsonら、1993;Peehl、1993;
Doddら、1993;McNicolら、1991;McNicolら、1990a;McNi
colら、1990b）ならびに成長要因（Morrisら、1990;Ich
ikawaら、1992;Isaacsら、1991a;Isaacsら、1991b;Cart
erら、1990a;Pientaら、1991;Mortonら、1990）が出発
点であると思われる。さらに、遺伝子導入動物において
標的とした場合内分泌腺に容易に癌を誘導する巨大Ｔ抗
原等の遺伝子が、好適な候補である（Anonymous、1991;
Stefaneanuら、1992;Hanahan、1986;Rindiら、1991;Ham
aguchiら、1990）。

組織得意的または非特異的に導入遺伝子を表現する遺
伝子導入動物は、新しいモデルと成りうる。例えば、組
織非特異的表現は多くの組織に病的状態をもたらし、一
方標的遺伝子の組織特異的表現は以下のように標的臓器
に病的状態をもたらす。癌モデル（Burckら、1988;Yama
mura、1989;Folkmanら、1989;reynoldsら、1988;Anonym
ous、1992;Bautch、1989;Hanahan、1986;Lucchiniら、1
992;Anonynous、1988）、乳腺腺癌（Mullerら、1988;Mu
ller、1991;Pawson、1987;Callahanら、1989;Muller、1
991;Strangeら、1990）、過形成および異形成（Mayo
ら、1988;Borrelliら、1992;Evaら、1991;Linら、1992;
Matsuiら、1990）、神経芽細胞腫（Dalemansら、199
0）、肝臓癌（Butelら、1990;Duboisら、1991;Sandgren
ら、1993;Sandgrenら、1989）、生殖腺腫瘍（Schechter
ら、1992;Matsukら、1992）、胸腺間葉腫瘍（Sinkovic
s、1991）および白血病（Knightら、1988;Adamsら、198
5）。さらに、標的遺伝子は、要因または発癌性物質に
よる形質変換に対する感受性を付与することによって、
腫瘍形成を促進するように作用する（Langdonら、1989;
Breuerら、1989;Mougneauら、1989）。メタロチオネイ
ン（MT）等のプロモータは、しばしば多くに臓器におけ
る一般的な表現をもたらし（Dyerら、1989;Iwamotoら、
1991）、一方MMTVプロモータはそのHREのために表現を
内分泌系に限定する（Hamら、1988;Rocheら、1992;Darb
reら、1986;Catoら、1987）。一般的プロモータを用い
ても、表現された要因が特定の組織を標的とする場合に
は特異的効果が得られ、例えば成長ホルモン放出要因
（Mayoら、1988）または異所性神経成長要因（Borrelli
ら、1992）では遺伝子導入マウスで下垂体の過形成がみ
られる。

遺伝子治療：遺伝子治療によるヒトの疾患または非ヒ
ト眞核動物の疾患の治療は、単遺伝子性欠陥を正すこと
を目標にして開始された。その後、癌等の後天的疾患の
治療を目的とした研究にまで発展した（Davies、1993;A
nderson、1992;Mulligan、1993;Culotta、1993;Felgne
r、1993;Tolstoshevら、1993）。承認された臨床試験
で、優れた結果が得られつつある。実際上の問題は、正
しい細胞種に移し、表現させることのできる効果的で、
特異的なアプローチの開発であった。これらのアプロー
チは、遺伝子のウイルス的または非ウイルス的転移法に
分けられる。治療的アプローチのなかには、患者の培養
細胞に遺伝子を転移させ、ついで同じ個体に戻す方法も
ある（Fenjvesら、1989）。その他の試みは、遺伝子を
ヒトの組織に直接転移させるものである。例えば、DNA
とリボソームの複合体を気系に導入し、遺伝子導入マウ
スにおける嚢胞性繊維症を治療する（Hydeら、1993）。
DNA:カチオン性リポソームによって遺伝子をマウス成獣
に直接転移させると、ほとんどの臓器に効果的な転移と
表現が起こる（Zhuら、1993）。遺伝子が安定的に統合
されると欠陥は修正され、一方もし遺伝子が一時的表現
されると疾患の軽減も一時的であると思われる。しか
し、癌等の場合には目的が癌細胞を殺すことにあるの
で、表現された遺伝子に毒性がある場合には、一時的な
表現でも十分である（Shortら、1990;Culverら、199
2）。アプローチには、腫瘍抑制遺伝子の表現（Friedma
nn、1992）または表現された癌遺伝子を阻害する遺伝子
の表現（Mukhopadhyayら、1991）が含まれる。

発明の概要 本発明は、一側面において、ラットのプロバシン遺伝
子の5'−フランキング領域からなり、少なくとも１つの
アンドロゲン反応性因子、好ましくは２つの因子を含む
単離DNA分子を提供する。DNA分子は図１に示す配列（SE
Q ID No:1）またはストリンジェント条件下で交雑化さ
れた配列（SEQ ID No:2はDNA分子のアミノ酸コード化タ
ンパクのために得られたアミノ酸を示す）を有すること
が好ましい。

本発明の別の側面は、ラットのプロバシン遺伝子のア
ンドロゲン反応性因子またはアンドロゲン活性を保持し
たその突然変異からなる単離DNA分子、好ましくは図１
に示したように−241〜−223のニュクレオチドおよび／
または−140〜−117のニュクレオチドからなるDNA、ま
たはアンドロゲン活性を保持したその突然変異を提供す
る。１実施例において、−130〜−127のニュクレオチド
はTACT（SEQ ID No:3）またはGTCT（SEQ ID No:4）ニュ
クレオチドで置換される。

本発明は単離、精製されたPBニュクレオチド配列のみ
ならず、（１）アンドロゲン性または抗アンドロゲン性
物質の検定、（２）前立腺疾患のための非ヒト遺伝子導
入眞核動物モデル、（３）前立腺疾患のための培養細胞
モデル、および（４）当該DNA配列を用いたヒト良性前
立腺過形成およびヒト前立腺癌の治療を含む。本発明
は、アンドロゲン作用をもたらすアンドロゲンの受容体
または代謝経路の作動剤または拮抗剤の検定、前立腺癌
誘導物質の検定、前立腺疾患に対する医薬、遺伝子治療
または前立腺細胞に対する保護物質の検定を可能にする
ものである。

まず、図および表について説明する。特記しない限
り、PB構成概念の生物検定は適当なステロイド受容体表
現ベクターの同時移入を有するPC−３細胞で行った（Re
nnieら、1993;Kazemi−Esfarjaniら、1993）。

図面の簡単な説明 図１は、PBラットゲノムの−426〜＋28bp配列（SEQ I
D No:1）を示す。転写の開始はＶで示し、直後に始まる
数字を＋１で示す。負の数字は、いずれも転写開始位置
に対する比である。＋28を越える配列は、PBの別のリー
ダー配列および最初のエクソンのアミノ酸配列を定義す
るものである。配列の相同性によって、GRE様配列（ARE
−１）、CAATボックス（SEQ ID No:5）およびTATAAボッ
クス（SEQ ID No:6）はアンダーラインで表示する。

図２は、それぞれrARまたはrGR表現ベクター＋DHT
（黒丸）またはDEX（黒三角）と一緒にPC−３細胞中に
移入させたPB−CATにおけるPB5'−フランキング配列
（−426,−346,−307,−286,−244,−235,−157bp）の
欠失マップ化を示す。rAR（白丸）またはrGR（白三角）
表現ベクターを有するCATのホルモンを添加しなかった
ときの活性を基線（下段）とした。

図３は、ARE−１（mut １）またはARE−２（mut
２）における単一塩基突然変異（陰影卵形）に比較した
−244 PB−CATの野生型（wt）ARE（白抜卵形）のCAT活
性を示す。活性は、それぞれPC−３細胞中に対応ステロ
イド受容体を有するDHTおよびDEXについて、基線に対す
る誘導倍率として示す。

図４は、バリン−865をメチオニン（V865M）またはロ
イシン（V865L）で置換してそれぞれ完全または部分的
なAISとしたときに比較した野生型ヒトARの生物検定を
示す。

表の簡単な説明 表Ｉは、DHT、DEXおよびプロゲスチンを有するHeLaお
よびPC−３細胞におけるPB−CATのホルモン誘導を示
す。

表IIは、特異的／タイトなAR結合が、ARE部位ならび
に隣接DNA配列の両方に依存することを示している。

表IIIは、ARの生物活性および特異性がAREならびに隣
接DNA配列の両方に依存することを示している。

表IVは、野生型−286 PB−CATと−286 PB−ARE2^＊C
ATを、野生型ARおよびAISにおいてバリン−865をメチオ
ニンまたはロイシンで置換したときと比較した生物活性
を示す。

表Ｖは、リピート−244〜−96がTK−Lucに隣接してい
るときのアンドロゲン誘導に対する生物検定効果を示
す。

表VIは、リピートがｎ＝３である場合、グルココルチ
コイドDEXに比較し、アンドロゲンでは低レベルであっ
ても感受性が増加することを示している。

表VIIは、リピートがｎ＝３のとき感受性が増加し、A
IS試料から野生型ヒトARの差を検出できることを示して
いる。

表VIIIは、遺伝子導入系＃4248の前立腺葉でPB−CAT
活性が高いことを示している。

表IXは、PB−CAT遺伝子導入系＃4248とラットの内在P
B遺伝子の表現の比較を示す。側葉における表現を100％
とし、その他の組織における表現をそれに対する比で表
示する。

表Ｘは、去勢後、およびアンドロゲンまたはグルココ
ルチコイド置換後のPB−CAT遺伝子導入系＃4248の表現
を示す。

選択実施例の説明 １）アンドロゲン性または抗アンドロゲン性物質の検定 本発明者は、前立腺葉に特異的に表現され、精嚢で検
出される（Matusikら、1986）ラットのプロバシン（P
B）遺伝子の5'−フランキングDNAを単離し、配列を決定
した（図１）。プロバシン遺伝子は、in vivoおよびin
vitroでアンドロゲンで制御される（Doddら、1983;Re
nnieら、1993）分泌核タンパクをコード化している（Sp
enceら、1989）。

ゲノミック プロバシン クローンの単離 PB遺伝子の5'−フランキングDNA、pM−40（Doddら、1
983）を単離するために、PBコード化領域の全領域を含
むcDNAクローン（Spenceら、1989）を用い、ラットのゲ
ノムライブラリーをスクリーニングした。最初に４種類
の陽性クローンを単離し、制限および交雑分析で同一で
あることを確認した。pUC119にサブクローン化し、その
ゲノミッククローンを両方向的な配列決定を行った。−
426〜＋28塩基対（bp）の範囲にあるPBの5'−フランキ
ングDNAの配列を図１に示す。エクソン１の5'境界は、
プライマー拡張およびS1ニュクレアーゼマッピング（Sp
enceら、1989）によって決定した。主要転写開始位置
（位置０）の4bp下流に、ナイナーな開始位置が続いて
いる。正準CAATおよびTATAAボックスは、図１に下線で
示すように、それぞれ−48および−27に存在していた。
同様なCAATボックスが、−101、−95、−82および−75
の４カ所で認められる。

DNアーゼＩによるフットプリント分析 DNアーゼＩによるフットプリント分析は、基本的に文
献にそって行った（Von der Aheら、1993;Rennieら、19
93）。タンパクを100μｌのDNA結合緩衝液中で20,000cp
mの標識DNAとともに20℃で30分間インキュベーションし
た。試料をMgCl₂4mMおよびCaCl₂ 2.5mMに調整した後、
5ngのDNアーゼを添加し、20℃で２分間DNAを消化させ
た。停止緩衝液（SDS 0.25％,EGTA 0.3Mおよびプロテ
イナーゼＫ 500μg/ml）を100μｌ添加して反応を停止
しさせ、37℃で１時間インキュベーションした。試料を
フェノール−クロロホルムで抽出し、0.2Mの酢酸ナトリ
ウム、キャリアーtRNA 85μg/mlおよび２倍量のエタノ
ールを添加して沈殿させ、ホルムアミド染色液３μｌに
溶解させた。70℃で10分間加熱した後、氷上で急速に冷
却し、プリン梯子を得るためのＡ＋Ｇ Mxam−Gilbert
配列反応液とともに試料を７％ポリアクリルアミド／尿
素ゲル（アクリルアミド:bis,30:1）に載せ、展開した
（Rennieら、1993）。ゲルを乾燥させ、オートラジオグ
ラフィーの用意をした。

アンドロゲン反応性因子（ARE）は、−241〜−223（A
RE−１）および−140〜−117（ARE−２）に存在してい
る。5'−フランキングPB DNA中のARE−１およびARE−２
の配列は、アンドロゲン受容体のDNA−結合性ドメイン
を含むペプチドを用いたDNアーゼＩフットプリントおよ
びその後の感応ドメインの生物検定で測定した。ラット
のアンドロゲン受容体のDNA−およびステロイド−結合
性ドメイン（GST−AR1）およびDNA−結合性ドメインお
よびヒンジ領域のみ（GST−AR2）を、グルタチオン−Ｓ
−トランスフェラーゼとの溶融タンパクとして大腸菌に
表現させ、グルタチオンアフィチティークロマトグラフ
ィーで精製した（Rennieら、1993）。GST−AR1およびGS
T−AR2は定性的にほぼ同じようなDNアーゼＩフットプリ
ントパターンを示し、２カ所の結合部位が存在すること
が認められ、１つは−236と−244の間に存在し（5'−欠
失マッピングにより、−244に伸びるDNA塩基が生物活性
に必須であることが認められた）、もう一方は−140と
−117の間（ARE−２）に存在していた。両アンドロゲン
受容体結合部位は、保全された5'GTTCTを有するグルコ
コルチコイド反応性因子（GRE）とほぼ同じであり、合
成AREオリゴマーはグルココルチコイド反応性因子（GR
E、弱い競合体）またはエステロゲン反応性因子（ERE、
競合不活性体）に相当するもの（Rennieら、1993）に比
較してプロバシンDNAに対する結合のバンドシフトにお
ける競合体としての効率がはるかに高かった。さらに、
GREに対する相同性によって、PB ARE−１は−241〜−2
23（ATAGCATCTTGTTCTTAGT−SEQ ID No:7）と決定し、一
方ARE−２は−140〜−117にGRE様配列含む（GTAAAGTACT
CCAAGAACCTATTT−SEQ ID No:8）。

キメラCAT遺伝子の構築 Hind III部位（−426bp）に始まるPB 5'−フランキ
ング配列、エクソン１、およびPst I部位に終わるイン
トロンＡの一部を含むプラスミッド、pPH 1.4をSac Iで
消化して、エクソン１およびイントロンＡのコード化部
位を除去した（Rennieら、1993）。Sac I部位をKlenow
のDNAポリメラーゼで鈍端化し、Bam H Iリンカーに結紮
した。大腸菌に形質転化させ、適当なクローンをスクリ
ーニングした後、ベクターpU119中のプラスミッドpBH
500を得た。ｐ−109TKのBam H I/Bgl消化によって調製
した細菌のクロラムフェニコール アセチルトランスフ
ェラーゼ（CAT）遺伝子をpBH500のBam H I部位に挿入し
てCATに隣接した−426〜＋28 PB配列を作り出すことに
より、PB−CATキメラ遺伝子を構築した。この構成概念
は、3'イントロン、ポリデニル化および分裂シグナルを
提供するSV40配列も含む。大腸菌に形質転化させ、スク
リーニングして、−426 PB−CATと表示したプラスミッ
ドを含む適当なコローンを単離した。−426 PB−CATの
欠失体は、Hind III消化後、Bal 31エキソニュクレア
ーゼによる経時的処理（15、30、45、60および75秒間）
により調製した。Hind IIIリンカーに結紮することによ
り、Hind III部位を再度構築した。大腸菌に形質転化さ
せた後、欠失突然変異を含むクローンをスクリーニング
し、それらのプラスミッドDNAをHind IIIおよびEco R I
で消化して、1.5％アガロースゲルを用いた電気泳動で
フラグメントの大きさを測定した。この酵素消化ふるい
分けによって、一定範囲の欠失突然変異体を集めた。つ
いで、もとのクローンをHind IIIおよびBam H Iによっ
て二重消化し、低融点アガロースゲルを用いた電気泳動
によって挿入物を単離した。ついで、Hind III/Bam H I
フラグメントを非欠失pUC119プラスミッドベクターのHi
nd IIIおよびBam H I部位中にサブクローン化した。各
構成概念におけるPB bpの量（図２）は、図１に示した
配列からの負または正の数字で標識した。構成概念のニ
ュクレオチド配列は、ジデオキシ配列分析により確認し
た。

さらに、PB−CATキメラ構成概念は、内在PBプロモー
タをTK遺伝子プロモータで置換することにより行った。
PBフラグメントは、適当な制限酵素消化によって得た。
5'末端にHind III部位を含む１個のプライマーと3'末端
にXba Ｉ部位を含む別のプライマーを用いて、−244〜
−96領域のPCR増幅を行い、１構成概念を得た（Rennie
ら、1993）。このポリメラーゼ側鎖（PCR）増幅フラグ
メントをHind III/Xba I TKCAT中にサブクローン化され
るように方向付けし、キメラプラスミッド−243/−96PB
−TKCATを得た。Muta−Gene Phagmid in vitro突然
変異キット（Bio−Rad,Mississauga,Ontario,Canada）
を用いて、突然変異を起こさせた。各構成概念のニュク
レオチド配列は、ジデオキシ配列分析法によって確認し
た。

細胞培養および移行 HeLa細胞は、10％仔牛血清（FCS）または５％FCSと５
％牛血清を添加したダルベコー改良イーグル培地（DME
M）に、2x10⁶/100mmシャーレの初期密度で播種した。PC
−３細胞は、10％FCSを添加した最少栄養培地（MEM）
に、8x10⁵/100mmシャーレの初期密度で播種した。プラ
スミッドDNAを有するHeLa細胞は、リン酸カルシウム/DN
A沈殿法（Cattiniら、1986）を用いて一時的に移行させ
た。移行後６時間で、細胞を20％グリセロール/DMEMで
２分間処理し、その後ジヒドロテストステロン（DHT）
またはデキサメタゾン（DEX）存在下または非存在下でD
MEM＋１％炭末縞状FCS（STR−FCS）で24時間または40時
間培養し、細胞を収穫した。PC−３細胞の一時的移行は
HeLa細胞と同様に行ったが、PC−３細胞の培養はMEM＋
５％ STR−FCSで行った。

CAT検定 一時的移行をさせた細胞は、1mMのEDTAを含むリン酸
緩衝生理食塩水中に収穫した。室温で４分間、2000xgで
遠心分離した後、0.1M トリス−HCl/0.1％Triton Ｘ
−100（pH7.8）中で氷冷しながら15分間細胞溶融を行っ
た。４℃で、15分間、14,500xgで遠心分離して不溶性物
質を除去した。細胞抽出物中のCAT活性は、２相フロル
拡散検定法（Nachtigalら、1989）によって測定した。
さらに、DNAを不溶性物質から単離し、２μｇの試料２
点を採り、スロット−ブロット装置を用いてニトロセル
ロース膜に載せ、³²P−標識CAT挿入DNAでプローブし
た。オートラジオグラムをデンシトメータで分析し、全
てのCAT活性データを移行効率に対する割合に変換し
た。遺伝子導入マウスでは、各組織の全細胞抽出物を用
いてCAT活性を測定した。

アンドロゲン作用機構の特性 ニュクレオチド−426〜＋28からなるPB DNA配列（図
１）は、以下に示すように、アンドロゲン制御を得るた
めに必要な情報を含む。PB−CAT構成概念、欠失体、お
よびその突然変異体を用いて、ARE−１およびARE−２の
機能上の意義を検討した。

アンドゲン受容体および／または前立腺起源のもを含
む適当な細胞株がなかったので、一連の細胞株を試験し
た。ヒト前立腺細胞LNCaPはアンドゲンが制御するPB−C
ATを表現するが、一方HeLa、前立腺DU−145およびPC−
３細胞はアンドゲン制御にあたってアンドロゲン受容体
表現ベクターを同時に移行させる必要がある。標準的な
検定法として、PB−CATハイブリッドを一時的に移行さ
せ、ラットのアンドロゲン受容体表現ベクターを同時に
移行させたPC−３ヒト前立腺癌細胞株と、ジヒドロテス
トステロン（DHT）またはR1881（合成アンドロゲン）を
用いた。合成グルココルチコイドのデキサメタゾン（DE
X）について、グルココルチコイド受容体（GR）の表現
ドクターを同時にPC−３細胞に移行させて試験した。

PB−CAT DNAの一連の5'欠失体を構築し、PC−３細胞
に移行させた。−426〜−286の間でPB 5'−フランキン
グDNAが欠失すると、正味のアンドロゲン誘導性CAT活性
が増加した（図２）。GR表現ベクターを移行させ、DEX
で処理した細胞でも同様なことが認められた（図２）。
欠失が−286まででは活性が増加することから、上流にc
is−作動性サイレンサーが存在すると考えられる。−28
6PB−CATでは、アンドロゲン誘導CAT活性の絶対正味レ
ベル（4605dpm/分/mgタンパク）ならびに基線からの42
倍増加は、DEXで認められた正味活性（496dpm/分/mgタ
ンパク）および29倍の誘導に比べて高かった。位置−24
4までさらに欠失させると、CAtのステロイド誘導活性が
減少した。ヒナのプロゲステロン表現ベクターの同時移
行でプロゲステロン処理すると、−286PB−CATに対する
活性がほとんどみられなかった。PB AREはグルココル
チコイドよりもアンドロゲンに対して選択的に反応し、
PC−３およびHeLa細胞におけるプロゲステロンには反応
性が低い（表Ｉ）ことから、PB AREはアンドロゲン受
容体に対して寛大なGREとしてよりもむしろ明瞭なアン
ドロゲン反応性因子として機能すると考えられる。

さらに、5'および3'PBフランキング領域を分析したと
ころ、アンドロゲン受容体に結合する２種類のcis−作
動性DNA因子、ARE−１およびARE−２ともアンドロゲン
誘導CAT活性を要求することが確認された（Rennieら、1
993）。これは、ARE−１において−231塩基（Ｇ）をＡ
に変化させ（Mut １）、またはARE−２で−123塩基
（Ｃ）をＡに変化させた突然変異（Mut ２）を起こさ
せることによって実証された（図３）。また、その他の
データから、選択的アンドロゲン作用は２倍位における
特異的／密接なAR結合のみならず隣接するDNA配列とタ
ンパクとの相互作用を要求すると考えられる。これは、
さらに協力的にAR結合を仲介し、ARによる選択的誘導を
もたらす。この２カ所のAR部位は、協力してARの結合を
促進する（表II）。60ngの合成GST−AR2で起こったフッ
トプリントによって実証されるように、ARE−１およびA
RE−２が内在PBプロモータ（−286〜＋28bp）とともに
存在するとき、ARは強固に結合する。ARE−１（−157〜
＋28bp）またはARE−２（−426〜−134bp）を除去する
と、その他の残った部位に対するGST−AE2の結合が減少
する（表II）。ARE−１（Mut １）またはARE−２（Mut
２）に単一塩基突現変異が起こると、ステロイド誘導
CAT生物活性が＞95％ほど減少し（図３）、両AREに対す
るGST−AR2の結合が減少する（表II）。内在PBプロモー
タを除去する（チミジンキナーゼプロモータ、TKで置換
することによって）と、高濃度のARにのみ結合する構成
概念が得られる（表II）ので、これらの２部位は選択的
アンドロゲン制御を与えるためにフランキングDNA配列
を要求し、ここで合成グルココルチコイド、DEXによっ
て同じ程度に誘導される（表III）。また、ARE−１とAR
E−２の間のDNA配列を除去する（構成物は、内在PBプロ
モータを含むPB位置−128bpに隣接した位置に存在するA
RE−１を含む）ことによって、DEXが強力な刺激とな
り、21倍高いCAT活性が誘導され、DHT誘導の16倍とほぼ
等しくなることが認められた（表III）。

われわれは、−286PB−CAT遺伝子のAREが、アンドロ
ゲン不感性症候群でみられるアンドロゲン受容体欠陥の
生物検定に使用できることを実証した（図４）（Kazemi
−Esfarjaniら、1993）。野生型ARとAIS ARの差はアン
ドロゲンの濃度が低いとき（1nMまたはそれ以下）で最
も明瞭に認められ、高濃度（10nM）では野生型ARとV865
Lで同じ程度の反応が認められた。本発明の検定法は、
あらゆるアンドロゲン活性と競合させるために添加した
抗アンドロゲン物質の作用の測定にも使用できる。生物
検定の感度および特異性を向上させるために、さらに２
つの改良を行った。

１）−286 PB−ARE2^＊CAT:CCAAから−130〜−127の
４つの塩基を−130〜−127のTACTまたはGTCTで置換する
ことによりARE−２内の配列を変え、ARE2^＊を得た（図
１参照）。これらの構成概念はアンドロゲンに対する反
応の増加を示し、36倍の誘導を示した野生型−286PB−C
ATに比較して100倍増加した。さらに、このARE2^＊で
は、9.6倍の増加を示した野生型−286PB−CATに比べ、D
EXに対する反応が19倍増加した。また、−286PB−ARE2
^＊CATは、さらにアンドロゲン特異性をグルココルチコ
イド誘導効果から切り離すことができ、それによって生
物活性が増加し、感受性が向上することを実証した。例
えば、アンドロゲン＋アンドロゲン受容体または＋AIS
にみられるような欠陥を有するアンドロゲン受容体は、
野生型の−286 PB−CATに比較した場合、ARE2^＊に対す
る反応性に大きな差がある（表IV）。

２）（−244/−96）nPB−TK:DHTとDEXは同じように機
能し、PBプロモータ領域（−96/＋28）をTK（−109bpま
たは−81bpのTK）で置換することによりアンドロゲン特
異性が失われるが、TKプロモータは試験したいずれの細
胞においても機能するという生物検定上の利点がある。
TKプロモータを保存し、アンドロゲン特異性を再獲得さ
せるために、リピートが−109または−81TKに隣接する
ように−244/−96を5'から3'に配置したところ、両TKプ
ロモータは同等に機能するが、−81TKの基本活性はきわ
めて低いところから始まった。CAT遺伝子は、ルシフェ
ラーゼ（Luc）リポータで置換すると、検定の感度が増
加する（De Wetら、1987）。構成概念は（−244/−96）
nPB−81TKLucであり、ｎはリピートの数に等しい。ｎ＝
２またはｎ＝３のとき、強力なアンドロゲン反応が得ら
れ、ｎがそれ以上増加してもDNA構成物５μｇを移行さ
せたときわずかに増加したに過ぎない（表Ｖ）。これら
の構成概念は、アンドロゲン受容体の活性、きわめて低
濃度のアンドロゲン（表VI）およびAISにみられるよう
なARの欠陥（表VII）を測定する場合に感度の増加を示
す。

定常的に、３リピート（−244/−96）でアンドロゲン
に対する反応に300倍以上の増加が得られ（表VIおよびV
II）、ステロイド濃度がきわめて低い場合にはDEXに対
するアンドロゲンの特異性が認められ、ステロイドの濃
度が高い場合にはDHTおよびDEXとも同じ程度の活性を示
した（表VI）。これは、本発明にかかわる検定法は、ア
ンドロゲンにみならずその他のステロイドでも濃度が高
ければ（＞1nM）測定が可能であることを示している。A
RE2^＊について記載したように、−244/−96 PBの各リ
ピートにおける４種類の塩基の置換を組み合わせれば、
ステロイドに対する感度がさらに増加すると考えられ
る。

２）前立腺疾患のための遺伝子導入非ヒト眞核動物モデ
ル 前立腺癌および良性前立腺過形成のための新しい動物
モデルを確立するために、PB配列（図１）を用い、前立
腺を標的としたあらゆる遺伝子を利用することができ
る。本発明者らは、PBが細菌のCAT遺伝子の前立腺に特
異的な表現を指令する（Greenbergら、1992a;Greenberg
ら、1992b;Greenbergら、1993;Greenbergら、1993）を
証明し、PB 5'−フランキング領域が遺伝子導入マウス
において前立腺を標的にするために必要な配列を含んで
いることを実証した。PB標的遺伝子の遺伝子導入動物に
おける前立腺特異的表現およびアンドロゲン制御につい
て記載する。

In vivo試験で、PBプロモータが遺伝子導入マウスに
おいて前立腺特異的表現を標的にすることが実証され
た。導入遺伝子として−426/＋28 PB−CAT構成を用
い、ミクロ注入後生まれた仔動物21匹中５匹（雄４匹、
雌１匹）がPB−CAT導入遺伝子を有することをPCRで確認
した。これらの動物を遺伝子導入マウスの原種として系
統を確立し、同じパターンのPB−CAT表現がその後の世
代の前立腺に受け継がれることを確認した。遺伝子導入
系統の雄３匹で、前立腺−特異的CAT表現が認められ、
雄１匹および雌ではいずれのそしきでもCAT活性が認め
られなかった。遺伝子導入＃4248系（表VIII）では前立
腺に高レベルのCAT活性が認められ、＃4217系ではCAT活
性レベルは最も低かったが同じような前立腺−特異的表
現が認められた。３匹目のおすでは、中程度のCAT活性
が認められた。系統内での遺伝子導入CAT表現の強さに
おける変動がみとめられ、また雄原種１匹で表現が認め
られなかったことは、導入遺伝子の取込み部位によるも
のと考えられる。高い表現を認めた遺伝子導入系（＃42
48系）についてさらに特性を検討したところ、側葉でき
わめて高いCAT活性が認められた（わずか５μｇの組織
抽出物を用いた場合には基質の21％がアセチル化され、
通常用いられる25μｇの組織抽出物を用いた場合には基
質の89％がアセチル化された）。このようにPB遺伝子の
プロモータが好ましい機能を示すのは、前立腺側葉にお
ける内在PB遺伝子の表現レベルが高いこと（総mRNAの８
％）と一致する。遺伝子導入マウスの雄副臓器における
CAT活性の分布（３系統とも、表IXには＃4248系を示
す）は、報告されているラットの内在PB mRNAのレベル
（Matusikら、1986）と密接な平行関係が認められる。
さらに、CATのin situハイブリッド化および免疫組織
化学的分析で、PBCAT遺伝子は、PB mRNAおよびタンパ
クで報告されている（Spenceら、1989;Sweetlandら、19
88）ように上皮細胞に表現されることが明らかとなっ
た。

さらに、PBCAT遺伝子は、発育にともなったアンドロ
ゲン制御の表現を示した。５匹の原種マウス（雄４匹、
雌１匹）のうち雄３匹では、７週齢までにCAT遺伝子が
前立腺の側葉、背葉および腹葉に選択的に表現された。
また、動物の加齢にともなって（23週齢まで）、前立腺
前葉および精嚢でもきわめて低レベルが検出されたが、
いずれの系統でも脳、腎臓、脾臓、肺、心臓、胸腺、肝
臓、または精巣ではCAT活性は検出されなかった。しか
し、＃4248系では動物の加齢にともなって、PB−CATの
表現が前立腺腹葉では最終検査時点（23週）まで増加
し、側葉では減少し、背葉ではほとんど変化がみられな
かった。前立腺におけるCAT活性は、表現の高いマウス
の系統と表現の低い系統で対数で数倍の開きがあり、導
入遺伝子の取込み部位によるものと考えられる。この表
現のパターンは４世代にわたって引き継がれた。表現の
高い雄原種系＃4248は３週齢から７週齢までで前立腺CA
T活性が70倍も増加し、性成熟に対応していた。アンド
ロゲンを除去すると（成熟雄の去勢、＃4248系）、７日
後までに前立腺CAT活性が低下し（表Ｘ）、アンドロゲ
ンを投与すると誘導されたが、DEXには誘導作用がなか
った（表Ｘ）。その後の試験で、PB−CATをヒナのリゾ
ザイム遺伝子マトリックス領域、MAR、（McKnightら、1
992）およびMARとPB−CATの複合体と同時に注射したと
ころ、検査した３系統とも背側前立腺−特異的CAT表現
が認められた。MARの添加では、遺伝子導入マウスで腹
葉に表現は認められなかった。

これは、遺伝子導入非ヒト眞核動物におけるCATリポ
ータ導入遺伝子によるPB 5'−フランキング配列の特異
性およびアンドロゲン制御を示している。アンドロゲン
制御を促進するためには、−244/−96 PBのリピートの
ARE2^＊および／または−244/−96のリピートに挿入した
ARE2^＊を−426/＋28 PBプロモータに加えてもよい。Zn
およびCd等の金属イオンに反応するプロモータを作るた
めには、遺伝子導入動物に使用されているようなMT誘導
性因子（Dyerら、1989;Iwamotoら、1992;Liら、1989;Ru
ssoら、1988;Mayoら、1988;Iwamotoら、1991）を加え、
またそれにグルココルチコイドに対する反応性をもたす
ためには、MMTVプロモータにみられるようなGRE（Stamp
ら、1992;Linら、1992;Lucchiniら、1992;Bouchardら、
1989;Mullerら、1988;Lederら、1986）を加えてもよ
い。PB 5'−フランキング配列は、前立腺を標的とした
あらゆる遺伝子を用い、前立腺の機能、成長または腫瘍
形成要因を変化させるために使用することができる。標
的遺伝子は、巨大Ｔ、TRPM−２、bcl−２、p53変異株、
myc、ras、bFGF、TGF−β１、アクチビン、アクチビン
受容体、AR、RXR、ｃ−fos、IGF類、IGFBP類、PSA、お
よびint−２を含む。さらに、異なったPB−標的遺伝子
を持った遺伝子導入系を交配して、腫瘍の発現頻度およ
び種類が異なる新しい系統を開発することも可能であ
る。このようにして、前立腺の腫瘍の成長に重要な遺伝
子を同定することができる。さらに、PB−標的遺伝子は
他の内在遺伝子または新たに活性化した遺伝子と組み合
わせて、腫瘍の成長を誘導させることも可能である。PB
遺伝子導入モデルは、これら遺伝子の同定を可能にす
る。

３）前立腺疾患のための培養細胞モデル 開発した遺伝子導入マウスモデルは、in vivoにおい
て起こる腫瘍形成の多様なプロセスの研究および切り離
しを可能にする。これらの研究によって、動物体全体と
しての既知の遺伝子導入表現型との組織学的および病理
学的関連が得られる。しかし、動物体全体を用いた試験
は、成長速度、分化、転移性および表現型の表現等に影
響するホルモン、成長因子、吸着要因およびサイトカイ
ン等各種要因の相互作用を記述するには必ずしも適当で
はない。これらのパラメータに到達するためには、簡易
なin vitro検定モデルが確立されなければならない。P
B標的遺伝子で作出し、前立腺の過剰成長または腫瘍形
成を示す遺伝子導入動物系を組織供給源とし、複製培養
細胞（累代培養細胞）を確立するための細胞を分離する
ことができる。遺伝子導入動物から採り、移動性をもた
ない細胞を用い、培養細胞株の確立が成功している（La
rueら、1993;Hammangら、1990;Martinez de la Escaler
aら、1992;Mellonら、1992;von Deimlingら、1990;Wind
leら、1990;Dalemansら、1990;Galianaら、1990;Vaux
ら、1988;Efratら、1988;Anonymous、1991;Talら、199
2）。

４）ヒト良性前立腺過形成およびヒト前立腺癌の治療 遺伝子治療法によるヒトの疾患の治療は、前立腺細胞
に毒素を標的化させるプロバシンの能力を利用して、ヒ
ト良性前立腺過形成（hBPH）、前立腺癌（CaP）、およ
び前立腺のあらゆる病的状態に適用できる。本発明に記
載したわれわれの試験で、PBは遺伝子導入動物の前立腺
に対する表現を指令し、PBはヒト前立腺癌細胞の培養株
における表現を指令することが実証された。プロバシン
プロモータに共役した導入遺伝子は前立腺細胞に特異的
に表現するように標的化されているので、他の細胞に対
する治療の副作用は限られている。CaPでは、目的が癌
細胞を殺すことにあるので、患者のクロモソームDNA中
にPB−標的導入遺伝子を安定的に組み込む必要はない。
hBPHの治療は、過形成細胞を殺すか、PB−標的導入遺伝
子を組み込んで過形成性増殖を正すか、減少させるよう
に設計することができる。

開示の要約 本発明を要約すると、本発明は、アンドロゲン性およ
び抗アンドロゲン性物質の検定法、遺伝子導入動物、お
よび前立腺の治療のための遺伝子治療法の確立を可能に
する新規なDNA配列を提供する。

ここに、記載し、これによって提供される本発明の特
徴は、以下の通りである。

1.受容体遺伝子に共役したPB配列を一時的に移行または
安定的に移行させることにより、培養細胞におけるアン
ドロゲン性物質の検定を行うことができる。アンドロゲ
ン性物質は、アンドロゲン受容体のリガンドに限定する
ものではなく、アンドロゲン作用をもたらす非ステロイ
ド経路、アンドロゲン作用に重要なタンパク、DNAおよ
びRNA配列を含む。

2.特徴１にあげた遺伝子導入細胞は、アンドロゲン性物
質を用いた競合性試験によって抗アンドロゲン性物質の
生物検定に使用することができる。抗アンドロゲン性物
質は、受容体リガンド、タンパク、DNAおよびRNA配列、
リン酸化状態を変える物質およびアンドロゲン作用の経
路を変える物質を含む。抗アンドロゲン性物質は、リガ
ンドとステロイド受容体との直接結合によってアンドロ
ゲン作用の経路を阻害する。リガンドはステロイド受容
体またはPB DNA配列に直接結合することによって、受
容体のDNA、RNAおよび／またはタンパクとの結合を阻害
するか、アンドロゲン作用の経路における物質の修飾に
影響をおよぼす。

3.アンドロゲン受容体とPB DNA配列またはPB DNA配列
に結合したアンドロゲン受容体を有するタンパク複合体
に対するアンドロゲン性および抗アンドロゲン性物質の
影響を測定することによって、アンドロゲン性および抗
アンドロゲン性物質を検定することができる。

4.遺伝子導入非ヒト眞核動物において、PB配列は遺伝子
を雄の泌尿生殖管を標的とさせ、前立腺細胞に高レベル
の表現が起こる。遺伝子は、胚子期に導入することによ
って動物の染色体に組み込まれる。

5.非ヒト眞核動物において、生体的または非生体的方法
でDNAを注入した後、PB配列は遺伝子を雄の泌尿生殖を
標的とさせ、前立腺細胞に高レベルの表現が起こる。

6.特徴４および５の動物において、PBプロモータは遺伝
子の表現を制御する。PBプロモータを介した転写は、さ
らにDNAの促進因子、誘導因子または抑制因子を加える
ことによって制御することができる。

7.特徴４および５の動物において、標的遺伝子はモデル
として使用できる前立腺炎、過形成、尿道閉塞および前
立腺癌を誘導することができる。

8.特徴７の動物の前立腺組織から細胞を分離して、培養
細胞株を確立することができる。

9.特徴４および５の動物または特徴８の培養細胞株を用
いて、遺伝子治療の新しいアプローチを含む新規薬剤を
開発するための治療法を試験することができる。

10.あらかじめ前立腺疾患を起こさせた特徴４または５
の動物または特徴８の培養細胞株を用いて、前立腺疾患
の発現または進展を防止できる物質の試験が可能とな
る。薬剤の防御効果は、前立腺腫瘍の発現頻度の低下に
よって判定することができる。

11.特徴４又は５の動物または特徴８の培養細胞株に前
立腺疾患を起こさせることによって、物質の発癌性を測
定する場合の感度が増加する。遺伝子導入動物系または
培養細胞株から前立腺腫瘍発現感度の低い系統を選抜
し、ある用量範囲で発癌性物質を処置する。さらに、急
速に腫瘍が発現する系統は、弱い発癌性物質の試験感度
が増加する。発癌性物質は、対照と比較して腫瘍の発現
または進展が増加する。

12.動物（遺伝子導入ならびに非遺伝子導入）におい
て、毒素を表現または薬物を毒性物質に変換する遺伝子
を正常な前立腺、過形成、および癌細胞に組み込むこと
によって、PB配列は新規な遺伝子治療法を開発するため
のモデルとして使用することができる。

13.ヒトにおいて、男性泌尿生殖管、良性前立腺過形
成、および前立腺癌を標的とした遺伝子を使用し、PB配
列を遺伝子治療に用いることができる。標的遺伝子は毒
素を表現するか、または薬物を毒性物質に変換し、それ
によって前立腺細胞の成長を阻害するか、細胞を殺す。

本発明の範囲で改良が可能である。

配列表 配列番号第１の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ:556塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）ストランド化：単一 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノミック） （ix）特徴 （Ａ）名称／検索:CDS （Ｂ）位置:467..547 （xi）配列の記載：配列番号第1: 配列番号第２の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ:27アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子のタイプ：タンパク （xi）配列の記載：配列番号第2: 配列番号第３の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ:4塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）ストランド化：単一 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノミック） （xi）配列の記載：配列番号第3: 配列番号第４の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ:4塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）ストランド化：単一 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノミック） （xi）配列の記載：配列番号第4: 配列番号第５の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ:4塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）ストランド化：単一 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノミック） （xi）配列の記載：配列番号第5: 配列番号第６の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ:5塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）ストランド化：単一 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノミック） （xi）配列の記載：配列番号第6: 配列番号第７の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ:19塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）ストランド化：単一 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノミック） （xi）配列の記載：配列番号第7: 配列番号第８の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ:24塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）ストランド化：単一 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ii）分子のタイプ:DNA（ゲノミック） （xi）配列の記載：配列番号第8:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 5/00 C12Q 1/68 A61K 48/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (17)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ラットのプロバシン遺伝子の5'−フランキ
   ング領域の下記配列： 内の、アンドロゲン反応性因子としての配列であるATAG
   CATCTTGTTCTTAGT（ARE1）及びGTAAAGTACTCCAAGAACCTATT
   T（ARE2）の両方を含むアンドロゲン反応性のDNA配列、
   または、該DNA配列の有するARE2のCCAAがTACTまたはGTC
   Tで置換された変異配列を含む単離DNA分子。
2. 【請求項２】前記ARE1及びARE2の配列の両方を含むDNA
   配列が、下記のラットのプロバシン遺伝子の5'−フラン
   キング領域の−426〜＋28bpの配列： である請求項１に記載のDNA分子。
3. 【請求項３】前記ARE1及びARE2の配列の両方を含むDNA
   配列が、下記のラットのプロバシン遺伝子の5'−フラン
   キング領域の−426〜＋1bpの配列： である請求項１に記載のDNA分子。
4. 【請求項４】保存配列5'−GTTCTを含む２つのアンドロ
   ゲン反応性因子を含む請求項１に記載のDNA分子。
5. 【請求項５】請求項２〜４のいずれかに記載のDNA分子
   の有するプロバシンプロモーター領域（−95〜＋28）を
   TKプロモータで置換したものであることを特徴とするDN
   A分子。
6. 【請求項６】TKプロモータにリンクした5'フランキング
   領域の反復（−244〜−96）領域の下記配列： からなるDNA分子。
7. 【請求項７】ラットのプロバシン遺伝子の5'−フランキ
   ング領域を含む配列番号第１の配列内の、アンドロゲン
   反応性因子としての配列であるATAGCATCTTGTTCTTAGT（A
   RE1）及びGTAAAGTACTCCAAGAACCTATTT（ARE2）の両方を
   少なくとも有するアンドロゲン反応性のDNA配列、また
   は該DNA配列の有するARE2のCCAAがTACTまたはGTCTで置
   換された変異配列を含む単離DNA分子。
8. 【請求項８】請求項１に記載したDNA分子のゲノム組込
   みを有し、アンドロゲン制御下で前立腺−特異的異質遺
   伝子の発現が可能な遺伝子導入非ヒト真核動物。
9. 【請求項９】プロバシンプロモータを介した転写がDNA
   促進、誘導及び／または制御因子の存在によりさらに制
   御されることを特徴とする請求項８に記載の遺伝子導入
   動物。
10. 【請求項１０】前記DNA因子がプロバシン配列にリンク
    したMT−および／またはGRE−誘導性因子からなること
    を特徴とする請求項９に記載の遺伝子導入動物。
11. 【請求項１１】請求項１に記載したDNA分子を、ウイル
    スを使うかまたは使わずに投与し、前立腺由来細胞また
    は当該動物の前立腺細胞に発現させた非ヒト真核動物。
12. 【請求項１２】前記DNA分子が請求項３に記載したDNA分
    子であることを特徴とする請求項９または11に記載した
    遺伝子導入動物。
13. 【請求項１３】請求項９または11に記載した非ヒト真核
    動物に由来する培養前立腺組織からなる培養細胞株。
14. 【請求項１４】請求項１に記載のDNA分子で遺伝子に標
    的をもたせることにより前立腺疾患を起こさせた前記の
    真核動物細胞の前立腺組織に由来する非ヒト真核動物ま
    たは培養細胞株。
15. 【請求項１５】アンドロゲン性及び抗アンドロゲン性物
    質の生物検定用試薬であって、アンドロゲン反応性因子
    としての配列であるATAGCATCTTGTTCTTAGT（ARE1）及びG
    TAAAGTACTCCAAGAACCTATTT（ARE2）の両方を少なくとも
    有するラットのプロバシン遺伝子の5'−フランキング領
    域からなるアンドロゲン反応性のDNA配列をレポータ遺
    伝子と共役させたDNA分子を含む試薬。
16. 【請求項１６】前記アンドロゲン性及び抗アンドロゲン
    性物質の試験を前記のDNA分子の一時的移行によって行
    うための請求項15に記載の試薬。
17. 【請求項１７】細胞に安定的に組み込んだ前記のDNA分
    子を用いて前記の物質の試験を行うための請求項15に記
    載の試薬。