JP3535535B2 - 糸状菌の形質転換用プラスミドおよびそれを用いた糸状菌の育種法 - Google Patents
糸状菌の形質転換用プラスミドおよびそれを用いた糸状菌の育種法Info
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- JP3535535B2 JP3535535B2 JP06264493A JP6264493A JP3535535B2 JP 3535535 B2 JP3535535 B2 JP 3535535B2 JP 06264493 A JP06264493 A JP 06264493A JP 6264493 A JP6264493 A JP 6264493A JP 3535535 B2 JP3535535 B2 JP 3535535B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規形質転換プラスミ
ドおよびそれを用いたペニシリウム・カマンベルチィー
（Penicillium camembertii）の形質転換法に関するも
のである。
ドおよびそれを用いたペニシリウム・カマンベルチィー
（Penicillium camembertii）の形質転換法に関するも
のである。
【０００２】本発明により、ペニシリウム・カマンベル
チィーを遺伝子工学上の宿主として利用することが可能
となり、形質転換体を用いて本菌の生産する各種有用蛋
白質およびペプチドの生産性を向上させること、異種の
有用蛋白質およびペプチドを生産すること、あるいはま
た遺伝子破壊技術により目的の遺伝子の機能を消失せし
めることが可能となった。
チィーを遺伝子工学上の宿主として利用することが可能
となり、形質転換体を用いて本菌の生産する各種有用蛋
白質およびペプチドの生産性を向上させること、異種の
有用蛋白質およびペプチドを生産すること、あるいはま
た遺伝子破壊技術により目的の遺伝子の機能を消失せし
めることが可能となった。
【０００３】
【従来の技術】糸状菌は、デンプン、蛋白質、脂質、セ
ルロース等を加水分解する各種加水分解酵素をはじめ多
くの有用酵素を菌体外に多量に分泌するため、古くより
これら有用酵素の給源として利用されてきた。従って、
糸状菌に関する培養法、生成物蛋白質の分離精製法など
の発酵技術の古い歴史と研究成果の裏付けがあり、多く
の菌株の安全性が広く認知されている。また、真核生物
であるが故、哺乳動物などの高等生物と同様に蛋白質の
糖鎖付加機構を有している。
ルロース等を加水分解する各種加水分解酵素をはじめ多
くの有用酵素を菌体外に多量に分泌するため、古くより
これら有用酵素の給源として利用されてきた。従って、
糸状菌に関する培養法、生成物蛋白質の分離精製法など
の発酵技術の古い歴史と研究成果の裏付けがあり、多く
の菌株の安全性が広く認知されている。また、真核生物
であるが故、哺乳動物などの高等生物と同様に蛋白質の
糖鎖付加機構を有している。
【０００４】これらの理由により糸状菌を遺伝子工学の
宿主として利用すること、あるいは遺伝子工学的手法に
より分子育種することが期待されてきた。しかしなが
ら、大腸菌などの細菌や酵母などと異なり糸状菌におい
ては、自律複製型のプラスミドがほとんど知られていな
いことや、多くの糸状菌が多核細胞であることなどの理
由により、その形質転換技術の開発は難しいのが現状で
あった。
宿主として利用すること、あるいは遺伝子工学的手法に
より分子育種することが期待されてきた。しかしなが
ら、大腸菌などの細菌や酵母などと異なり糸状菌におい
ては、自律複製型のプラスミドがほとんど知られていな
いことや、多くの糸状菌が多核細胞であることなどの理
由により、その形質転換技術の開発は難しいのが現状で
あった。
【０００５】糸状菌の形質転換を行った例としては、基
礎分子遺伝学上重要なアスペルギルス・ニドランス［Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 1470（1984）］、ノ
イロスポラ・クラッサ［Mol. Cel. Biol., 4, 117（198
4）］、産業上重要なアスペルギルス・オリゼ［Agrc. B
iol. Chem., 51, 323（1987）］、アスペルギルス・ニ
ガー［Curr. Genetics, 11, 499（1987）］、トリコデ
ルマ・リーセイ［Gene,61, 155（1987）］、ペニシリウ
ム・クリソゲナム［Gene, 51, 97（1987）］を用いたも
のなどが知られているが、産業上重要なリパーゼ生産菌
として知られている［Appl. Microbiol. Biotechnol.,
34, 720 (1991)］ペニシリウム・カマンベルチィーを形
質転換させ得るプラスミドは、現在までのところ見いだ
されていないのが現状であった。
礎分子遺伝学上重要なアスペルギルス・ニドランス［Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 1470（1984）］、ノ
イロスポラ・クラッサ［Mol. Cel. Biol., 4, 117（198
4）］、産業上重要なアスペルギルス・オリゼ［Agrc. B
iol. Chem., 51, 323（1987）］、アスペルギルス・ニ
ガー［Curr. Genetics, 11, 499（1987）］、トリコデ
ルマ・リーセイ［Gene,61, 155（1987）］、ペニシリウ
ム・クリソゲナム［Gene, 51, 97（1987）］を用いたも
のなどが知られているが、産業上重要なリパーゼ生産菌
として知られている［Appl. Microbiol. Biotechnol.,
34, 720 (1991)］ペニシリウム・カマンベルチィーを形
質転換させ得るプラスミドは、現在までのところ見いだ
されていないのが現状であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、新規に
構築したプラスミドによりペニシリウム・カマンベルチ
イーを形質転換せしめることに成功し、さらにこの形質
転換系を用いて、遺伝子投与によるモノおよびジアシル
グリセロールリパーゼ生産性の増強および遺伝子破壊に
よるモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ生産性消
去など、ペニシリウム・カマンベルチィーの分子育種に
も成功し、本発明を完成するに至った。
構築したプラスミドによりペニシリウム・カマンベルチ
イーを形質転換せしめることに成功し、さらにこの形質
転換系を用いて、遺伝子投与によるモノおよびジアシル
グリセロールリパーゼ生産性の増強および遺伝子破壊に
よるモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ生産性消
去など、ペニシリウム・カマンベルチィーの分子育種に
も成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の、糸状菌の新規
形質転換用プラスミドは、プロモーターとして、ペニシ
リウム・カマンベルチイーもしくはその近縁の菌株由来
のＤＮＡ断片を有し、選択マーカーとして、糸状菌由来
の蛋白質のＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片
を有する融合薬剤耐性遺伝子を有し、ターミネーターを
有し、大腸菌で複製および選択可能なＤＮＡ領域を有す
るプラスミドである。
形質転換用プラスミドは、プロモーターとして、ペニシ
リウム・カマンベルチイーもしくはその近縁の菌株由来
のＤＮＡ断片を有し、選択マーカーとして、糸状菌由来
の蛋白質のＮ末端アミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片
を有する融合薬剤耐性遺伝子を有し、ターミネーターを
有し、大腸菌で複製および選択可能なＤＮＡ領域を有す
るプラスミドである。
【０００８】プロモーターとしては、糸状菌において機
能するものであればよく特に制限されないが、具体的に
は糸状菌由来の３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリ
セルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、
エノラーゼ等の解糖系酵素遺伝子、オルニチンカルバモ
イルトランスフェラーゼ、トリプトファンシンターゼ等
のアミノ酸合成系酵素遺伝子、α−アミラーゼ、グルコ
アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ア
セトアミダーゼ等の加水分解酵素遺伝子、あるいはナイ
トレートレダクターゼ、オロチジン−５’−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の
酸化還元酵素遺伝子のプロモーターのいずれか挙げられ
る。より好ましくは、ペニシリウム・カマンベルチィー
のモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のプ
ロモーターが挙げられる。
能するものであればよく特に制限されないが、具体的に
は糸状菌由来の３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリ
セルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、
エノラーゼ等の解糖系酵素遺伝子、オルニチンカルバモ
イルトランスフェラーゼ、トリプトファンシンターゼ等
のアミノ酸合成系酵素遺伝子、α−アミラーゼ、グルコ
アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ア
セトアミダーゼ等の加水分解酵素遺伝子、あるいはナイ
トレートレダクターゼ、オロチジン−５’−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の
酸化還元酵素遺伝子のプロモーターのいずれか挙げられ
る。より好ましくは、ペニシリウム・カマンベルチィー
のモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子のプ
ロモーターが挙げられる。
【０００９】また融合薬剤耐性遺伝子のＮ末端アミノ酸
配列は、糸状菌の蛋白質もしくはペプチド由来であれば
何れでもよいが、具体的には糸状菌由来の３−ホスホグ
リセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ等の解糖系酵素、
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、トリプト
ファンシンターゼ等のアミノ酸合成系酵素、α−アミラ
ーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セ
ルラーゼ等の加水分解酵素、あるいはナイトレートレダ
クターゼ、オロチジン−５’−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアミダー
ゼ、ペニシリウム・カマンベルチィーのモノおよびジア
シルグリセロールリパーゼのＮ末端アミノ酸配列が挙げ
られる。より好ましくは、ペニシリウム・カマンベルチ
ィーのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ由来の
薬剤耐性遺伝子のＮ末端配列が挙げられる。
配列は、糸状菌の蛋白質もしくはペプチド由来であれば
何れでもよいが、具体的には糸状菌由来の３−ホスホグ
リセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ等の解糖系酵素、
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、トリプト
ファンシンターゼ等のアミノ酸合成系酵素、α−アミラ
ーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セ
ルラーゼ等の加水分解酵素、あるいはナイトレートレダ
クターゼ、オロチジン−５’−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアミダー
ゼ、ペニシリウム・カマンベルチィーのモノおよびジア
シルグリセロールリパーゼのＮ末端アミノ酸配列が挙げ
られる。より好ましくは、ペニシリウム・カマンベルチ
ィーのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ由来の
薬剤耐性遺伝子のＮ末端配列が挙げられる。
【００１０】薬剤耐性遺伝子については、具体的には大
腸菌由来のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子またはストレプトアロテイカス・ヒンダスタナ
ス由来のフレオマイシン耐性遺伝子が挙げられ、より好
ましくは、大腸菌由来のハイグロマイシンＢホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
腸菌由来のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラー
ゼ遺伝子またはストレプトアロテイカス・ヒンダスタナ
ス由来のフレオマイシン耐性遺伝子が挙げられ、より好
ましくは、大腸菌由来のハイグロマイシンＢホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００１１】ターミネーターは、プロモーターほど厳密
に選択されるものではないが、具体的にはペニシリウム
・カマンベルチィーのモノおよびジアシルグリセロール
リパーゼ遺伝子のターミネーターが好適に利用できる。
に選択されるものではないが、具体的にはペニシリウム
・カマンベルチィーのモノおよびジアシルグリセロール
リパーゼ遺伝子のターミネーターが好適に利用できる。
【００１２】さらに詳細に示すと、本発明は図１の制限
酵素地図で表されるプラスミドpH１に関するものであ
る。本プラスミドは、糸状菌において機能するプロモー
ター、それに続く糸状菌由来の蛋白質のＮ末端アミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列を有する融合型の薬剤耐性
遺伝子、さらにそれに続く糸状菌由来のターミネーター
および大腸菌で複製および選択が可能なＤＮＡ領域より
なる。
酵素地図で表されるプラスミドpH１に関するものであ
る。本プラスミドは、糸状菌において機能するプロモー
ター、それに続く糸状菌由来の蛋白質のＮ末端アミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列を有する融合型の薬剤耐性
遺伝子、さらにそれに続く糸状菌由来のターミネーター
および大腸菌で複製および選択が可能なＤＮＡ領域より
なる。
【００１３】本プラスミドの構築は例えば以下の様にし
て行うことが出来る。大腸菌ベクターにクローニングさ
れた糸状菌の蛋白質もしくはペプチド遺伝子の蛋白質の
Ｎ末端領域をコードする領域および終止コドンの下流に
部位特異的変異導入法［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A., 82, 488（1985）］により適当な制限酵素認識部位
を導入する。この２ヶ所の制限酵素部位に挟まれたＤＮ
Ａ領域を「領域Ａ」とする。
て行うことが出来る。大腸菌ベクターにクローニングさ
れた糸状菌の蛋白質もしくはペプチド遺伝子の蛋白質の
Ｎ末端領域をコードする領域および終止コドンの下流に
部位特異的変異導入法［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A., 82, 488（1985）］により適当な制限酵素認識部位
を導入する。この２ヶ所の制限酵素部位に挟まれたＤＮ
Ａ領域を「領域Ａ」とする。
【００１４】一方、薬剤耐性遺伝子の蛋白質のＮ末端領
域をコードする領域、終止コドンの下流にも適当な制限
酵素認識部位を導入し、Ｎ末端領域の欠失した薬剤耐性
遺伝子の蛋白質コード領域をＤＮＡ断片として単離す
る。このＤＮＡ断片を糸状菌の蛋白質もしくはペプチド
遺伝子を有するプラスミドの「領域Ａ」と置き換える。
この際、生じた融合薬剤耐性遺伝子のＮ末端領域の接合
部においてアミノ酸の読み取りフレームが合致するよう
予めデザインされるべきである。他にも例えば下記の実
施例１のごとくＰＣＲ法［Science, 230, 1350（198
5）］を用いて構築することも可能である。
域をコードする領域、終止コドンの下流にも適当な制限
酵素認識部位を導入し、Ｎ末端領域の欠失した薬剤耐性
遺伝子の蛋白質コード領域をＤＮＡ断片として単離す
る。このＤＮＡ断片を糸状菌の蛋白質もしくはペプチド
遺伝子を有するプラスミドの「領域Ａ」と置き換える。
この際、生じた融合薬剤耐性遺伝子のＮ末端領域の接合
部においてアミノ酸の読み取りフレームが合致するよう
予めデザインされるべきである。他にも例えば下記の実
施例１のごとくＰＣＲ法［Science, 230, 1350（198
5）］を用いて構築することも可能である。
【００１５】本発明は、さらに糸状菌における遺伝子投
与効果による各種有用蛋白質およびペプチドの生産性増
強、あるいは目的の遺伝子の機能を消失せしめることを
企図した遺伝子破壊などの分子育種法をも開示するもの
である。以下に実施例を用いて、本発明を詳細に説明す
る。尚、本明細書においては、遺伝子操作手法は特に記
載しない限り成書（例えば「モレキュラー・クローニン
グ」第２版、サンブルック、フリッシュ、マニアチス
編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ
出版、1989）に従って行った。
与効果による各種有用蛋白質およびペプチドの生産性増
強、あるいは目的の遺伝子の機能を消失せしめることを
企図した遺伝子破壊などの分子育種法をも開示するもの
である。以下に実施例を用いて、本発明を詳細に説明す
る。尚、本明細書においては、遺伝子操作手法は特に記
載しない限り成書（例えば「モレキュラー・クローニン
グ」第２版、サンブルック、フリッシュ、マニアチス
編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ
出版、1989）に従って行った。
【００１６】
実施例１ 形質転換プラスミドpH1の構築
ペニシリウム・エスピーU-150株（FERM P-10452：本菌
株は寄託後ペニシリウム・カマンベルチィーと同定され
た。以後ペニシリウム・カマンベルチィーと示す）のモ
ノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子、2.0-kb
HindIII断片を大腸菌ベクターpUC19［東洋紡社製：Gen
e, 33, 103（1985）］のHindIII部位に挿入したプラス
ミドpLGG300およびpLGG100［Gene, 103, 61（1991）］
を材料に用いた。これら両プラスミドは、約2.0-kb Hin
dIII断片が互いに逆方向に挿入されている。このモノお
よびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子は、ペニシリ
ウム・カマンベルチィーより公知の方法［Gene, 103, 6
1（1991）］により取得することが可能である。また薬
剤耐性マーカー遺伝子としては大腸菌のハイグロマイシ
ンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミ
ドpHph0（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いた。
株は寄託後ペニシリウム・カマンベルチィーと同定され
た。以後ペニシリウム・カマンベルチィーと示す）のモ
ノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子、2.0-kb
HindIII断片を大腸菌ベクターpUC19［東洋紡社製：Gen
e, 33, 103（1985）］のHindIII部位に挿入したプラス
ミドpLGG300およびpLGG100［Gene, 103, 61（1991）］
を材料に用いた。これら両プラスミドは、約2.0-kb Hin
dIII断片が互いに逆方向に挿入されている。このモノお
よびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子は、ペニシリ
ウム・カマンベルチィーより公知の方法［Gene, 103, 6
1（1991）］により取得することが可能である。また薬
剤耐性マーカー遺伝子としては大腸菌のハイグロマイシ
ンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミ
ドpHph0（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いた。
【００１７】モノおよびジアシルグリセロールリパーゼ
遺伝子のプロモーター領域および翻訳開始コドンから７
アミノ酸残基目までを含むＤＮＡ断片は、pLGG300を鋳
型としてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応のための
上流プライマーとして、
遺伝子のプロモーター領域および翻訳開始コドンから７
アミノ酸残基目までを含むＤＮＡ断片は、pLGG300を鋳
型としてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ反応のための
上流プライマーとして、
【００１８】
LGP-a: 5'-CAAGCTTCCGGGAGTAAATTTTC-3'
下流プライマーとして、
LGP-b: 5'-TGTCGACCTGTGAAGAAAGAGAGACGCAT-3'
【００１９】をサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジ
ェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反
応は、Gene AmpTM kit（パーキンエルマージャパン社
製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅
装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りであ
る。
ェン・バイオサーチ社製）を用いて合成した。ＰＣＲ反
応は、Gene AmpTM kit（パーキンエルマージャパン社
製）を用い、同社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ増幅
装置）により行った。反応溶液の組成は以下の通りであ
る。
【００２０】
H2O 62.5 μl
[10x] Reaction buffer 10.0 μl
dNTPs, Mix., 1.25 mM 16.0 μl
上流プライマーLGP-a, 20 μM 5.0 μl
下流プライマーLGP-b, 20 μM 5.0 μl
pLGG300, 2 ng/μl 1.0 μl
AmpliTaqTMDNAポリメラーゼ 0.5 μl
【００２１】サーマル・サイクラーの条件は、以下の通
りである。 93 ℃ 1.0 分 55 ℃ 1.0 分 72 ℃ 1.0 分
りである。 93 ℃ 1.0 分 55 ℃ 1.0 分 72 ℃ 1.0 分
【００２２】この条件下で反応を50サイクル行った後、
さらに72℃で7分間インキュベートした。
さらに72℃で7分間インキュベートした。
【００２３】反応液を1.0％低融点アガロース電気泳動
に供し、増幅された約0.6-kbのＤＮＡ断片を単離・精製
した。このＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIおよびSalIで
処理し、同じく両酵素で処理したpUC19にクローニング
し、pP2を得た。
に供し、増幅された約0.6-kbのＤＮＡ断片を単離・精製
した。このＤＮＡ断片を制限酵素HindIIIおよびSalIで
処理し、同じく両酵素で処理したpUC19にクローニング
し、pP2を得た。
【００２４】次にターミネーター領域を、以下のように
してpHph0のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子の下流にクローニングした。
してpHph0のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子の下流にクローニングした。
【００２５】pLGG100を制限酵素DraIおよびHincIIで処
理後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に
供し、ターミネーター領域である約0.48-kb DraI/HincI
I断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をのpHph0のSm
aI部位にクローニングし、pT6を得た。
理後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に
供し、ターミネーター領域である約0.48-kb DraI/HincI
I断片を単離・精製した。このＤＮＡ断片をのpHph0のSm
aI部位にクローニングし、pT6を得た。
【００２６】次にモノおよびジアシルグリセロールリパ
ーゼ遺伝子のプロモーター領域および翻訳開始コドンか
ら７アミノ酸残基目までを含むＤＮＡ断片を、以下のよ
うにしてpT6のハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子中の蛋白質のＮ末端コーディング領域に存
在する制限酵素部位にクローニングした。
ーゼ遺伝子のプロモーター領域および翻訳開始コドンか
ら７アミノ酸残基目までを含むＤＮＡ断片を、以下のよ
うにしてpT6のハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ遺伝子中の蛋白質のＮ末端コーディング領域に存
在する制限酵素部位にクローニングした。
【００２７】pP2を制限酵素HinndIIIおよびSalIで処理
後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供
し、約0.57-kb HindIII/SalI断片を単離・精製した。こ
のＤＮＡ断片を同じく制限酵素HindIIIおよびSalIで処
理したpT6にクローニングし、pH1を得た（図２）。
後、分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供
し、約0.57-kb HindIII/SalI断片を単離・精製した。こ
のＤＮＡ断片を同じく制限酵素HindIIIおよびSalIで処
理したpT6にクローニングし、pH1を得た（図２）。
【００２８】この様にして得られたpH1は、pHph0がコー
ドしていたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラー
ゼ蛋白質の翻訳開始コドンから10残基目までのアミノ酸
配列が、モノおよびジアシルグリセロールリパーゼの翻
訳開始コドンから７残基目までのアミノ酸配列と置き変
わった融合型のハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ蛋白質をコードするＤＮＡを有している。そして
この融合型のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ蛋白質をコードするＤＮＡの上流および下流にペニ
シリウム・カマンベルチィーのモノおよびジアシルグリ
セロールリパーゼ遺伝子のプロモーター、ターミネータ
ーがそれぞれ配置されている。
ドしていたハイグロマイシンＢホスホトランスフェラー
ゼ蛋白質の翻訳開始コドンから10残基目までのアミノ酸
配列が、モノおよびジアシルグリセロールリパーゼの翻
訳開始コドンから７残基目までのアミノ酸配列と置き変
わった融合型のハイグロマイシンＢホスホトランスフェ
ラーゼ蛋白質をコードするＤＮＡを有している。そして
この融合型のハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ蛋白質をコードするＤＮＡの上流および下流にペニ
シリウム・カマンベルチィーのモノおよびジアシルグリ
セロールリパーゼ遺伝子のプロモーター、ターミネータ
ーがそれぞれ配置されている。
【００２９】実施例２ プラスミドpH1によるペニシリ
ウム・カマンベルチィーの形質転換 ペニシリウム・カマンベルチィーの胞子懸濁液（２×10
8/ml）100μlを100mlのぶどう糖・ペプトン培地（栄研
化学社製）に接種し30℃で48時間振とう培養後、培養物
をろ過し菌体を集めた。この菌体を10 mlのプロトプラ
スト化バッファー［0.8M NaCl、10mM りん酸緩衝液（pH
6.0）］に懸濁しろ過することにより、洗浄菌体を集め
た。
ウム・カマンベルチィーの形質転換 ペニシリウム・カマンベルチィーの胞子懸濁液（２×10
8/ml）100μlを100mlのぶどう糖・ペプトン培地（栄研
化学社製）に接種し30℃で48時間振とう培養後、培養物
をろ過し菌体を集めた。この菌体を10 mlのプロトプラ
スト化バッファー［0.8M NaCl、10mM りん酸緩衝液（pH
6.0）］に懸濁しろ過することにより、洗浄菌体を集め
た。
【００３０】この洗浄菌体を、５mg/mlのライジング・
エンザイム（Sigma Product numberL-2265、シグマ社
製）を含むプロトプラスト化バッファーに懸濁し、30℃
で２時間振とう後、ガラスフィルター3G2でろ過し、ろ
液を2000rpm、5分の遠心分離に供し、プロトプラストを
沈澱物として得た。この沈澱物を10mlのソルビトール溶
液［1.2M ソルビトール、50mM CaCl2、10mM トリス塩酸
緩衝液（pH7.5）］に懸濁し、2000rpm、５分の遠心分離
し沈澱物を集めた。
エンザイム（Sigma Product numberL-2265、シグマ社
製）を含むプロトプラスト化バッファーに懸濁し、30℃
で２時間振とう後、ガラスフィルター3G2でろ過し、ろ
液を2000rpm、5分の遠心分離に供し、プロトプラストを
沈澱物として得た。この沈澱物を10mlのソルビトール溶
液［1.2M ソルビトール、50mM CaCl2、10mM トリス塩酸
緩衝液（pH7.5）］に懸濁し、2000rpm、５分の遠心分離
し沈澱物を集めた。
【００３１】この操作を再度繰り返した後、沈澱物を２
×108/mlとなるようソルビトール溶液に懸濁し、プロト
プラスト溶液を得た。次にプロトプラスト溶液50μl
に、4μlのpH1溶液（１μg/μl）、6.75μlのPEG溶液
［50％ PEG4000、50mM CaCl2、10mM トリス塩酸緩衝液
（pH7.5）］を加え混合後、氷上に30分静置した。次に
0.5mlのPEG溶液を加え混合し、さらに1.0mlのソルビト
ール溶液を加え混合した。
×108/mlとなるようソルビトール溶液に懸濁し、プロト
プラスト溶液を得た。次にプロトプラスト溶液50μl
に、4μlのpH1溶液（１μg/μl）、6.75μlのPEG溶液
［50％ PEG4000、50mM CaCl2、10mM トリス塩酸緩衝液
（pH7.5）］を加え混合後、氷上に30分静置した。次に
0.5mlのPEG溶液を加え混合し、さらに1.0mlのソルビト
ール溶液を加え混合した。
【００３２】この混合液300μlを、17mlの1.5％アガロ
ースを含むPDS［0.25％ 大豆油、0.25％ モノオレイ
ン、1.2M ソルビトール、2.4％ ポテト・デキストロー
ス・ブロス（Difco社製）］からなるプレート上に載
せ、さらに予め48℃に保温しておいた0.7％アガロース
を含むPDS 3.0mlを注ぎ、混合後固化させた。30℃で24
時間放置後、613μg/mlのハイグロマイシンＢ（シグマ
社製）、0.7％アガロースを含むPDS 3.0mlを重層し、30
℃で４日間放置し、プレート上に出現したコロニー10株
を、ポテト・デキストロース寒天培地に植え継ぎ形質転
換株として保存した。
ースを含むPDS［0.25％ 大豆油、0.25％ モノオレイ
ン、1.2M ソルビトール、2.4％ ポテト・デキストロー
ス・ブロス（Difco社製）］からなるプレート上に載
せ、さらに予め48℃に保温しておいた0.7％アガロース
を含むPDS 3.0mlを注ぎ、混合後固化させた。30℃で24
時間放置後、613μg/mlのハイグロマイシンＢ（シグマ
社製）、0.7％アガロースを含むPDS 3.0mlを重層し、30
℃で４日間放置し、プレート上に出現したコロニー10株
を、ポテト・デキストロース寒天培地に植え継ぎ形質転
換株として保存した。
【００３３】これらの株はいずれも、160μg/mlのハイ
グロマイシンＢを含む培地においても良好に生育したの
に対し、元株であるペニシリウム・カマンベルチィー
は、40μg/ml以上のハイグロマイシンＢを含む培地で生
育不能であった。この形質転換体が獲得したハイグロマ
イシンＢ耐性の形質は、４回の単胞子分離後も安定に保
持されていた。
グロマイシンＢを含む培地においても良好に生育したの
に対し、元株であるペニシリウム・カマンベルチィー
は、40μg/ml以上のハイグロマイシンＢを含む培地で生
育不能であった。この形質転換体が獲得したハイグロマ
イシンＢ耐性の形質は、４回の単胞子分離後も安定に保
持されていた。
【００３４】さらにこれらの形質転換株および元株ペニ
シリウム・カマンベルチィーより公知の方法［Anal. Bi
ochem., 135, 416-422（1983）］で染色体ＤＮＡを単離
し制限酵素HindIIIで分解したＤＮＡに対し、pH1中のハ
イグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼのコード領
域を含む約1.2-kb BamHI断片をプローブとしてサザン・
ハイブリダイゼーション解析を行ったところ、いずれの
形質転換株においても用いたＤＮＡプローブとハイブリ
ダイズするバンドが検出されたのに対し、元株ペニシリ
ウム・カマンベルチィーにおいては検出されなかった。
これら結果は形質転換株において、プラスミドpH1が導
入されその結果ハイグロマイシンＢ耐性の形質を獲得し
たことを示すものである。
シリウム・カマンベルチィーより公知の方法［Anal. Bi
ochem., 135, 416-422（1983）］で染色体ＤＮＡを単離
し制限酵素HindIIIで分解したＤＮＡに対し、pH1中のハ
イグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼのコード領
域を含む約1.2-kb BamHI断片をプローブとしてサザン・
ハイブリダイゼーション解析を行ったところ、いずれの
形質転換株においても用いたＤＮＡプローブとハイブリ
ダイズするバンドが検出されたのに対し、元株ペニシリ
ウム・カマンベルチィーにおいては検出されなかった。
これら結果は形質転換株において、プラスミドpH1が導
入されその結果ハイグロマイシンＢ耐性の形質を獲得し
たことを示すものである。
【００３５】実施例３ ペニシリウム・カマンベルチイ
ーのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ生産性増
強株の取得 ペニシリウム・カマンベルチィーへ、既にクローニング
されているモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺
伝子を新たに導入し遺伝子投与効果によるモノおよびジ
アシルグリセロールリパーゼ生産性増強株の取得を行っ
た。
ーのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ生産性増
強株の取得 ペニシリウム・カマンベルチィーへ、既にクローニング
されているモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺
伝子を新たに導入し遺伝子投与効果によるモノおよびジ
アシルグリセロールリパーゼ生産性増強株の取得を行っ
た。
【００３６】まずpH1へのモノおよびジアシルグリセロ
ールリパーゼ遺伝子の挿入を容易にするため、以下のよ
うにしてpH1を改変し、pH3およびpH4を作製した。pH1を
制限酵素HindIIIで処理後、分解混合液を1.0％低融点ア
ガロース電気泳動に供し、融合薬剤耐性遺伝子を含む約
2.2-kb HindIII断片を単離・精製した。
ールリパーゼ遺伝子の挿入を容易にするため、以下のよ
うにしてpH1を改変し、pH3およびpH4を作製した。pH1を
制限酵素HindIIIで処理後、分解混合液を1.0％低融点ア
ガロース電気泳動に供し、融合薬剤耐性遺伝子を含む約
2.2-kb HindIII断片を単離・精製した。
【００３７】このＤＮＡ断片をＤＮＡブランチング・キ
ット（宝酒造社製）を用いて両末端を平滑化した後、pU
C19の制限酵素SmaI部位にサブクローニングし、pH3およ
びpH4を得た（図３）。
ット（宝酒造社製）を用いて両末端を平滑化した後、pU
C19の制限酵素SmaI部位にサブクローニングし、pH3およ
びpH4を得た（図３）。
【００３８】これら両プラスミドは、約2.2-kb HindIII
断片が互いに逆方向に挿入されている。またpH1におい
て２ヶ所存在した制限酵素HindIII部位が１ヶ所になっ
ている。
断片が互いに逆方向に挿入されている。またpH1におい
て２ヶ所存在した制限酵素HindIII部位が１ヶ所になっ
ている。
【００３９】次にpLGG300を制限酵素HindIIIで処理後、
分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供し、
モノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子である
約2.0-kb HindIII断片を単離・精製した。このＤＮＡ断
片をpH4のHindIII部位にクローニングし、pHLGG4を得た
（図３）。
分解混合液を1.0％低融点アガロース電気泳動に供し、
モノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子である
約2.0-kb HindIII断片を単離・精製した。このＤＮＡ断
片をpH4のHindIII部位にクローニングし、pHLGG4を得た
（図３）。
【００４０】このpHLGG4を用いて、ペニシリウム・カマ
ンベルチィー U-150株を実施例２の方法で形質転換し
た。選択培地に生育してきた形質転換体15株（L-1〜L-1
5）をランダムにピック・アップし、それぞれ100mlの大
豆油培地（３％大豆油、0.5％酵母エキス、0.3％ NaN
O3、0.1％ K2HPO4、0.05％ KCl、0.05％ MgSO4・7H2O、
0.001％ FeSO4・12H20）に接種し、30℃で7日間振とう培
養し、得られた培養物をろ過し菌体を除去した。
ンベルチィー U-150株を実施例２の方法で形質転換し
た。選択培地に生育してきた形質転換体15株（L-1〜L-1
5）をランダムにピック・アップし、それぞれ100mlの大
豆油培地（３％大豆油、0.5％酵母エキス、0.3％ NaN
O3、0.1％ K2HPO4、0.05％ KCl、0.05％ MgSO4・7H2O、
0.001％ FeSO4・12H20）に接種し、30℃で7日間振とう培
養し、得られた培養物をろ過し菌体を除去した。
【００４１】得られた培養液について、公知の方法［Ap
pl. Microbiol. Biotechnol., 34,720-725（1991）］で
モノおよびジアシルグリセロールリパーゼ活性を測定し
た結果を表１に示す。
pl. Microbiol. Biotechnol., 34,720-725（1991）］で
モノおよびジアシルグリセロールリパーゼ活性を測定し
た結果を表１に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】尚、ここでH-1株は、形質転換ベクターpH4
を用いて得られた形質転換体である。
を用いて得られた形質転換体である。
【００４４】この様に、pH4による形質転換体は宿主ペ
ニシリウム・カマンベルチィーと変わらないモノおよび
ジアシルグリセロールリパーゼ生産性を示したのに対
し、pHLGG4による形質転換体15株すべてにおいて、モノ
およびジアシルグリセロールリパーゼ生産性が増強され
ていることがわかる。最も生産性の高い株は、これまで
のモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ生産菌の約
12倍の生産性を示した。
ニシリウム・カマンベルチィーと変わらないモノおよび
ジアシルグリセロールリパーゼ生産性を示したのに対
し、pHLGG4による形質転換体15株すべてにおいて、モノ
およびジアシルグリセロールリパーゼ生産性が増強され
ていることがわかる。最も生産性の高い株は、これまで
のモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ生産菌の約
12倍の生産性を示した。
【００４５】また、これらの形質転換体の培養ろ液につ
いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、モ
ノおよびジアシルグリセロールリパーゼと同様の分子量
の蛋白質の量が明かに増大していることを確認した。さ
らにウエスタン・ブロッティング解析により、この蛋白
質がモノおよびジアシルグリセロールリパーゼに対する
抗体と反応することを確認した。
いて、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、モ
ノおよびジアシルグリセロールリパーゼと同様の分子量
の蛋白質の量が明かに増大していることを確認した。さ
らにウエスタン・ブロッティング解析により、この蛋白
質がモノおよびジアシルグリセロールリパーゼに対する
抗体と反応することを確認した。
【００４６】実施例４ ペニシリウム・カマンベルチィ
ーのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子破
壊株の取得 pH1由来の約2.2-kb HindIII断片を用いて、ペニシリウ
ム・カマンベルチィーを実施例１の方法で形質転換し
た。得られた形質転換株７株について実施例３の方法で
培養し、培養液中のモノおよびジアシルグリセロールリ
パーゼ活性を測定したところ、６株は元株ペニシリウム
・カマンベルチィーとほぼ同様のモノおよびジアシルグ
リセロールリパーゼ活性を示したのに対し、１株（H1-2
株）はほとんど活性が検出されなかった。
ーのモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺伝子破
壊株の取得 pH1由来の約2.2-kb HindIII断片を用いて、ペニシリウ
ム・カマンベルチィーを実施例１の方法で形質転換し
た。得られた形質転換株７株について実施例３の方法で
培養し、培養液中のモノおよびジアシルグリセロールリ
パーゼ活性を測定したところ、６株は元株ペニシリウム
・カマンベルチィーとほぼ同様のモノおよびジアシルグ
リセロールリパーゼ活性を示したのに対し、１株（H1-2
株）はほとんど活性が検出されなかった。
【００４７】またウエスタン・ブロッティング解析によ
り、H1-2株はモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ
に対する抗体と反応する蛋白質を生産していないことを
確認した。さらにpLGG300由来のモノおよびジアシルグ
リセロールリパーゼ遺伝子のコード領域の大部分を含む
約0.95-kb PstI/DraI断片をプローブとしたサザン・ハ
イブリダイゼーション解析を行ったところ、H1-2株の
み、いかなるバンドも検出されなかった。
り、H1-2株はモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ
に対する抗体と反応する蛋白質を生産していないことを
確認した。さらにpLGG300由来のモノおよびジアシルグ
リセロールリパーゼ遺伝子のコード領域の大部分を含む
約0.95-kb PstI/DraI断片をプローブとしたサザン・ハ
イブリダイゼーション解析を行ったところ、H1-2株の
み、いかなるバンドも検出されなかった。
【００４８】pH1中のハイグロマイシンＢホスホトラン
スフェラーゼのコード領域を含む約1.2-kb SalI/BamHI
断片をプローブとしたサザン・ハイブリダイゼーション
解析では、H1-2株は他の形質転換株同様ハイブリダイズ
するバンドが検出された。
スフェラーゼのコード領域を含む約1.2-kb SalI/BamHI
断片をプローブとしたサザン・ハイブリダイゼーション
解析では、H1-2株は他の形質転換株同様ハイブリダイズ
するバンドが検出された。
【００４９】これらの結果は、H1-2株が、導入したpH1
由来の約2.2-kb HindIII断片が染色体に組み込まれる際
染色体上のモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺
伝子のプロモーターとターミネーター領域内のそれぞれ
１ヶ所の位置で相同的組換えが生じた、いわゆる遺伝子
置換による遺伝子破壊株であることを示すものである
（図４）。
由来の約2.2-kb HindIII断片が染色体に組み込まれる際
染色体上のモノおよびジアシルグリセロールリパーゼ遺
伝子のプロモーターとターミネーター領域内のそれぞれ
１ヶ所の位置で相同的組換えが生じた、いわゆる遺伝子
置換による遺伝子破壊株であることを示すものである
（図４）。
【００５０】
【発明の効果】本発明によれば、産業上有用な糸状菌を
形質転換することが可能になり、遺伝子工学上の宿主と
して糸状菌を利用することが可能となった。また、形質
転換体を用いて糸状菌の生産する各種有用蛋白質及びペ
プチドの生産性を向上させること、あるいはまた遺伝子
破壊技術により目的の遺伝子の機能を消失せしめること
など、糸状菌の分子育種が可能となった。
形質転換することが可能になり、遺伝子工学上の宿主と
して糸状菌を利用することが可能となった。また、形質
転換体を用いて糸状菌の生産する各種有用蛋白質及びペ
プチドの生産性を向上させること、あるいはまた遺伝子
破壊技術により目的の遺伝子の機能を消失せしめること
など、糸状菌の分子育種が可能となった。
【図１】プラスミドpH１の制限酵素地図を示す。
【図２】プラスミドpH１の構築手順を示す。
【図３】プラスミドpHLGG4の構築手順を示す。
【図４】H1-2株の遺伝子置換による遺伝子破壊株の形成
を示す。
を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00
ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (5)
- 【請求項１】ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子のＮ末端部分を、ペニシリウム・カマンベル
チイー由来のモノ及びジグリセロールリパーゼ遺伝子の
プロモーター領域及びプロプレ配列の一部で置き換えて
なる融合型遺伝子の下流にペニシリウム・カマンベルチ
イー由来のモノ及びジグリセロールリパーゼ遺伝子のタ
ーミネータ領域を配置せしめ、さらにペニシリウム・カ
マンベルチイー由来のモノ及びジグリセロールリパーゼ
遺伝子を連結させてなる大腸菌で複製可能なＤＮＡ領域
を有するモノ及びジグリセロールリパーゼ発現用プラス
ミド。 - 【請求項２】請求項１記載のモノ及びジグリセロールリ
パーゼ発現用プラスミドにより形質転換されたペニシリ
ウム・カマンベルチイー。 - 【請求項３】請求項２記載の形質転換されたペニシリウ
ム・カマンベルチイーを栄養培地で培養し、培養物中に
モノ及びジグリセロールリパーゼを蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするモノ及びジグリセロールリパ
ーゼの製造法。 - 【請求項４】形質転換されたペニシリウム・カマンベル
チイーが、ペニシリウム・カマンベルチイー L-12(pHLGG
4 ）株である請求項３記載のモノ及びジグリセロールリ
パーゼの製造法。 - 【請求項５】形質転換されたペニシリウム・カマンベル
チイーが、ペニシリウム・カマンベルチイー L-11(pHLGG
4 ）株である請求項３記載のモノ及びジグリセロールリ
パーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06264493A JP3535535B2 (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | 糸状菌の形質転換用プラスミドおよびそれを用いた糸状菌の育種法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06264493A JP3535535B2 (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | 糸状菌の形質転換用プラスミドおよびそれを用いた糸状菌の育種法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06245776A JPH06245776A (ja) | 1994-09-06 |
| JP3535535B2 true JP3535535B2 (ja) | 2004-06-07 |
Family
ID=13206252
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06264493A Expired - Fee Related JP3535535B2 (ja) | 1993-02-26 | 1993-02-26 | 糸状菌の形質転換用プラスミドおよびそれを用いた糸状菌の育種法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3535535B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2372983A1 (en) * | 1999-05-06 | 2000-11-16 | Aventis Animal Nutrition S.A. | Recombinant penicillium funiculosum for homologous and heterologous protein production |
| US8192959B2 (en) * | 2002-04-22 | 2012-06-05 | Genencor International Inc | Promoter and plasmid system for genetic engineering |
-
1993
- 1993-02-26 JP JP06264493A patent/JP3535535B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１０３， Ｎｏ．１， ｐｐ．６１−６８ （１９９１） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06245776A (ja) | 1994-09-06 |
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