JP3553669B2 - 再構成リポタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、アポリポタンパク質と脂質からの再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）を工業的規模で製造する方法に関する。ｒＨＤＬは、生体中で脂質及びリポイド物質を結合し、そしてそれらを輸送し、活性に影響することできる性質がある。したがって、ｒＨＤＬは、脂質及びリポイド物質に関連する疾病の種々の予防及び治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト血液のリポタンパク質は、一連の種々の役割を果たすことができる。十分研究され周知のように、リポタンパク質の役割は、脂質の輸送にある。リポタンパク質は、不溶性脂質と結合して水性環境に輸送し、目的地に連れていく。一時期、個々のリポタンパク質が、脂質代謝障害との関連でさらに綿密に検討されてきた。主要西洋諸国では、心臓血管系疾病と高血漿コレステロール又は低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬコレステロール）との間の陽性相関及び高ＨＤＬ又は高ＨＤＬコレステロールに対する陰性相関が疫学的研究によって示された。脂質低下効果を有することが示された全範囲の薬剤は、市販されているけれども、場合によっては、適当なリポタンパク質置換が望ましいことが考えられる。このような場合には、適当なものは、まず第一に単離アポリポタンパク質と適当な脂質から得た再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）のようなＨＤＬ又はＨＤＬ様粒子等の「良好」なリポタンパク質である。
【０００３】
食物から摂取される脂質の他に、他の脂質又はリポイド物質由来のリポタンパク質を、輸送又は結合できる。例えば、死細胞の成分をリポタンパク質に結合させて、新規な機能を付与できる。また、リポイド物質を、例えばリポ多糖類（ＬＰＳ）等のリポタンパク質に結合させることもできる。リポ多糖類又はエンドトキシンは、グラム陰性菌の膜成分である。もし十分に多量のエンドトキシンが心臓血管系に入ることがあると、敗血症性ショックを生じるか、死に到ることもある。ＬＰＳをリポタンパク質に結合させると、ＬＰＳの機能又は活性を調整できる。ＬＰＳの活性は、リポタンパク質又はリポタンパク質様粒子の添加により生体内又は生体外でかなり変化させることができる。したがって、生体内において、再構成ＨＤＬの添加により敗血症性の重要な媒介物質である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の形成を阻害することを示すことができた。また、生体内において、ＨＤＬ又はｒＨＤＬの投与によってショックの症状を大きく減少させることができた。
【０００４】
リポタンパク質又は再構成リポタンパク質と脂質又はリポイド物質との相互作用の他に、リポタンパク質とタンパク質との相互作用も記載されている：
−リポタンパク質は、補体系の個々の成分と相互作用し、したがって、それらの活性に影響することがある；
−リポタンパク質分画に見られる、即ち、ある種のリポタンパク質と関連している凝固系の成分も、同様に公知である；
−血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）等の急性期タンパク質がＨＤＬ分画に見られる；
【０００５】
−さらに、ある種タンパク質の表面吸着が、リポタンパク質での予備処理により影響される。
細胞に対する特異的又は非特異的結合を介して、リポタンパク質も細胞活性に影響することがある：
−血漿の活性化される能力は、ＨＤＬの結合により減少することがあるか、ＬＤＬの添加により刺激されることがある；
−単核細胞及びマクロファージも同様にリポタンパク質に対する受容体を有し；リポタンパク質の結合又は取り込みは、これらの細胞の活性の変化を生じることがある；
−好中球等の宿主防御系に関与する他の細胞の活性も、リポタンパク質の結合により同様に変更又は調整できる；
−さらに、一例としてグリオブラストーマ細胞を用いて示されている腫瘍細胞の成長も、リポタンパク質を介して影響されることがある。
【０００６】
科学文献では、さらにリポタンパク質と病原体との相互作用が報告され；例えば、抗菌活性がリポタンパク質に起因するとしている。また、ウイルスもリポタンパク質により不活性化できること、即ち、一例としてトリパノソーマを用いたとき、寄生菌に影響するか、それぞれ阻害できることが判明した。
これらの例は、リポタンパク質、即ち、ｒＨＤＬが予防及び治療用途に多様に使用される可能性を示している。
リポタンパク質は主に４種に分類される：
【０００７】
主にトリグリセリドからなり通常脂肪に富んだ食事の後にのみ血漿中に多量に出現する粒子であるカイロミクロン、ＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質）、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）及びＨＤＬ（高密度タンパク質）。命名は、限外濾過によるリポタンパク質の単離に由来する。古典的には、リポタンパク質は、濃度勾配で単離される。この方法は、特殊な装置を必要とし且つ非常に時間がかかるので、実験室規模でのみ適用できる。この方法を用いても、数日かかって製造されるリポタンパク質又はアポリポタンパク質の量は、せいぜい数百ｍｇでしかない。アポリポタンパク質又はリポタンパク質を単離する他の方法も、公知であるが、これらの方法は、多くの場合、例えば、二価陽イオン及び／又はポリエチレングリコール若しくはデキストランによる沈澱析出に基づいている。アポリポタンパク質を単離できる可能性のあるさらなる方法は、ヨーロッパ特許第０３２９６０５Ｂ１号に記載されているようなアルコール分別による沈澱析出である。この最後に述べた方法を用いて、より多量のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）又はアポＡ−Ｉが濃縮された分画を単離し、それらを治療用途に利用できるようにすることが可能である。このように単離されたアポＡ−Ｉ又はアポＡ−Ｉが濃縮されたタンパク質分画を用いて、動物とヒトの両方について一連の実験が行われた。これらの実験に基づいて、ウイルスに関するこれらの生成物の安全性が示すことができ、また、使用された形態でのアポＡ−Ｉは、ヒトや動物で顕著な副作用を生じない。それにもかかわらず、生体外試験では、例えば、コレステロール輸送や、好中球、マクロファージ、単核細胞又は血小板等の細胞に対するアポＡ−Ｉの影響等の所望の活性が見られない。動物とヒトの両方における生体内試験では、血漿でのアポＡ−Ｉの半減期は、極めて短かった。遊離アポＡ−Ｉ（２８，０００ダルトン）の分子量に起因して、アポＡ−Ｉが腎臓により排除される可能性がある。アポＡ−Ｉは、ウサギの尿中に検出された。これらの結果は、多量に注入されるアポＡ−Ｉは所望のリポタンパク質分画に分配されないことを示している。その半減期が短いことから、アポＡ−Ｉは、極めて短時間で生体内でその効果を示すことができる。その結果、リポタンパク質又はリポタンパク質様粒子にアポＡ−Ｉを注入することにより、より適当な形態の投与が達成される。
【０００８】
再構成リポタンパク質、とりわけアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、アポＣ及びアポＥ（Ａ．Ｊｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２８、５５３〜５８２（１９８６））の製造方法が、科学文献に記載されている。再構成に最も通常使用される脂質は、卵又は大豆から抽出されるホスファチジルコリンである。また、リン脂質も使用され、トリグリセリドやコレステロール等の脂質も使用される。再構成のために、脂質をまず有機溶媒に溶解し、その後窒素下で蒸発する。この方法では、脂質を薄膜としてガラス壁に結合させる。その後、アポリポタンパク質及び洗浄剤、通常コール酸ナトリウムを添加し混合する。添加したコール酸ナトリウムにより、脂質が分散される。適当なインキュベーション期間の後、混合物を多量の緩衝液に対して長時間透析する。これによりほとんどのコール酸ナトリウムが除去され、同時に脂質とアポリポタンパク質は、自体リポタンパク質、即ち、いわゆる再構成リポタンパク質となる。透析に代わる方法としては、洗浄剤を吸着できる疎水性吸着剤が利用できる（Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ ＳＭ−２、Ｂｉｏ Ｒａｄ；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２、Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ）（Ｅ．Ａ．Ｂｏｎｏｍｏ、Ｊ．Ｂ． Ｓｗａｎｅｙ、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２９、３８０〜３８４（１９８８））。また、洗浄剤は、ゲルクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により除去できる。また、リポタンパク質は、洗浄剤なしでも、例えば、適当な脂質の水性懸濁液をアポリポタンパク質とともにインキュベーションすることにより製造できる。この際、有機溶媒に溶解した脂質をアポリポタンパク質に添加し、得られた混合物をさらに加熱するか加熱しないで用いる。また、アポＡ−Ｉ−脂質−混合物の超音波処理によっても製造できる。これらの方法の場合、例えば、アポＡ−Ｉとホスファチジルコリンを出発物質として用いると、発生期状態のリポタンパク質に相当する円板状粒子を得ることができる。通常、インキュベーションに続いて、未結合アポリポタンパク質及び遊離脂質を、遠心分離又はゲルクロマトグラフィーにより分離して、均一な再構成リポタンパク質粒子を単離する。
【０００９】
ＵＳ−Ａ−５，１２８，３１８には、ホスファチジルコリンを有機溶媒を用いた溶液に溶解する再構成ＨＤＬの製造方法が記載されている。
上記公報に記載されている再構成リポタンパク質の製造方法は、実験室規模でのより少量、即ち、数ｍｇ〜せいぜい数ｇの量の場合にのみ適当である：
−中間生成物での溶液を高倍率希釈すると、必要時間内での混合物の処理が不可能となる；
−大容積について必要なインフラストラクチャーが通常役に立たない；
−使用される有機溶媒は、環境的に許容されない；
−最終生成物は、保存できない；
−最終生成物の濃度が低すぎて、患者に注入される容積が大きすぎるであろう；
−生成物は、通常、例えばゲルクロマトグラフィーによりさらに精製して、所望のｒＨＤＬ粒子から残留遊離脂質及び／又は遊離タンパク質を分離する必要がある。
【００１０】
さらに、Ａ．Ｈｕｂｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ Ｓｈｏｃｋ ４０、１４〜２３（１９９３）には、アポリポタンパク質の脂質に対する比を１：２００として使用する再構成リポタンパク質の製造方法が記載されている。この操作の結果、得られる生成物は、治療上の利用可能性に悪影響を及ぼす遊離脂質をかなりの割合で有している。
【００１１】
ｒＨＤＬをヒトにおいて治療又は予防用途に使用する場合、血漿中のアポＡ−Ｉ又はＨＤＬを顕著に増加させるためには、ｒＨＤＬをグラムオーダーので投与することが必要である。このように、臨床目的のためにｋｇ以上の規模でｒＨＤＬを経済的に製造することは、上記した方法では可能ではない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、上記した欠点を有さないｒＨＤＬの製造方法であって、特にその生成物が遊離脂質又は遊離アポＡ−Ｉを大きな割合で有していないｒＨＤＬを提供することにある。本発明のさらなる目的は、有機溶媒を添加せずに実施することができる方法を提供することにある。再構成リポタンパク質、とりわけ再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）は、アポリポタンパク質と脂質から簡単で迅速で工業的に適用できる手段を用いて製造できることが判明した。
【００１３】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明の要旨は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びフォスファチジルコリンから再構成され、タンパク質含量２０±２ｇ／リットルで温度２０°Ｃ±２°Ｃで測定した濁り度（比濁度単位）が４０ＮＴＵ未満である再構成リポタンパク質粒子を含有する製剤の工業的製造方法において、濃度１〜４０ｇタンパク質／リットルのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ水溶液を有機溶媒を添加することなくフォスファチジルコリン−洗浄剤水溶液と混合するが、その際フォスファチジルコリンの洗浄剤に対するモル比が１：０．５〜１：４．０、アポリポタンパク質Ａ−Ｉのフォスファチジルコリンに対する重量比が１：１．５〜１：５．０であり、その後得られたアポリポタンパク質Ａ−Ｉ−フォスファチジルコリン−洗浄剤混合物を、水中での前記フォスファチジルコリンの相変化温度±１０°Ｃの範囲の温度でインキュベーションし、さらに精製しなくとも前記使用したタンパク質の９５％以上及び総フォスファチジルコリンの９０％以上が結合している直径５〜５０ｎｍで質量５０，０００〜１，０００，０００ダルトンのタンパク質−フォスファチジルコリン粒子状物が形成されるまで、前記洗浄剤をサイズ排除又は吸着剤による吸着により除去することを特徴とする再構成リポタンパク質を含有する製剤の工業的製造方法にある。
【００１４】
また、本発明の要旨は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びフォスファチジルコリンから得た再構成リポタンパク質粒子を含有する安定凍結乾燥物の工業的製造方法において、濃度１〜４０ｇタンパク質／リットルのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ水溶液を、有機溶媒を意図的に添加することなくフォスファチジルコリン−洗浄剤水溶液と混合するが、その際フォスファチジルコリンの洗浄剤に対するモル比が１：０．５〜１：４．０、アポリポタンパク質Ａ−Ｉのフォスファチジルコリンに対する重量比が１：１．５〜１：５．０であり、その後得られたアポリポタンパク質Ａ−Ｉ−フォスファチジルコリン−洗浄剤混合物を水中での前記フォスファチジルコリンの相変化温度±１０°Ｃの温度範囲でインキュベーションし、さらに精製しなくとも前記使用したタンパク質の９５％以上及び総フォスファチジルコリンの９０％以上が結合している直径５〜５０ｎｍで質量５０，０００〜１，０００，０００ダルトンのタンパク質−フォスファチジルコリン粒子状物が形成されるまで、前記洗浄剤をサイズ排除又は吸着剤による吸着により除去してタンパク質含量２０±２ｇ／リットルで温度２０°Ｃ±２°Ｃで測定した濁り度が４０ＮＴＵ未満である液体生成物を得、得られた生成物を、例えば、ショ糖又はマンニトール等の炭水化物からなる群から選択される安定化剤の存在下で凍結乾燥して安定化させることを特徴とする安定凍結乾燥物の工業的製造方法にある。
【００１５】
使用されるアポリポタンパク質は、例えば、組み換えアポリポタンパク質、ヒト血漿由来のアポリポタンパク質Ａ−Ｉの濃縮分画から得たアポリポタンパク質、アポリポタンパク質の断片又は両親媒性を有する天然、合成若しくは組み換えポリペプチドである。アポリポタンパク質の断片は、天然又は合成アポリポタンパク質の化学的又は酵素的断片形成により得ることができる。化学的断片形成の一例としては、臭化シアンでの処理が挙げられ、酵素的開裂の場合、例えば、トリプシン等のプロテアーゼでの処理が挙げられる。
【００１６】
本発明で使用される脂質−洗浄剤溶液は、脂質として、例えば、大豆由来又は卵由来でよいリン脂質、コレステロール、コレステロール−エステル、脂肪酸類又はトリグリセリド類を含有する。洗浄剤は、好ましくは胆汁酸類又はそれらの塩類、例えば、コール酸ナトリウム塩又はデオキシコール酸ナトリウムが好ましい。
【００１７】
本明細書に記載の温度２０±２°Ｃは、１８°Ｃ〜２２°Ｃの範囲内の全てを包含する。タンパク質含量２０±２ｇ／リットルは、１８ｇ／リットル〜２２ｇ／リットルの範囲内の全ての濃度を包含する。また、「相転移温度±１０°Ｃ」は、対応脂質の水性環境中における相転移温度よりも１０°Ｃ低い温度と脂質の相転移温度よりも１０°Ｃ高い温度との間の全ての温度を包含する。これらの値は、溶液の凝固点と５０°Ｃとの間の範囲を包含するが、２５°Ｃ未満の温度が好ましい。
【００１８】
出発物質として好ましいものは、例えば、低温殺菌等の適当な手段を用いてウイルス不活性化したヒト血漿から精製されるリポタンパク質である。この操作をにより得られる変性タンパク質（凝集物）を、続いて例えば、尿素又はグアニジン塩酸塩等のカオトロピック成分の存在下で弱アルカリ性ｐＨ及びわずかに温度を上昇させてインキュベーションにより再変性して、１０ｍＭＮａＣｌ中でのタンパク質の緩衝液交換後のアポＡ−Ｉの７０％を超える割合を単一形態（分析的サイズ排除クロマトグラフィーにて測定：アポＡ−Ｉ４０μｇを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４、流量０．４ｍｌ／分の条件でＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ Ｕｌｔｒｏｐａｃ ｃｏｌｕｍｎ（ＬＫＢ）カラムに附し、溶出液を２８０ｎｍで測定）とする。
【００１９】
さらなる処理において、リポタンパク質を高濃度で、有機溶媒を用いずに、胆汁酸類又はそれらの塩類（例えば、コーレート、デオキシコーレート、ウルソデオキシコーレート）の溶液中で脂質（ホスファチジルコリン、コレステロール、トリグリセリド等のリン脂質）溶液と混合する。Ｈｕｂｓｃｈ等（Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ Ｓｈｏｃｋ４０、１４〜２３（１９９３）に記載の研究とは対照的に、アポリポタンパク質の脂質に対する比を、多量の遊離脂質や多量の遊離アポリポタンパク質が最終生成物に見られず、その結果、ｒＨＤＬの更なる精製を省略できるように選択する。特に、アポＡ−Ｉ：ＰＣ比を減少させ、この比を１：２００（Ｍ：Ｍ；重量比約１：５．５）よりかなり下、即ち、１：５０〜１：１８０の範囲、好ましくは１：１００〜１：１５０（モル比；アポＡ−Ｉと大豆由来ＰＣについて重量比１：２．８〜１：４．２に相当）である。これをダイアフィルトレーション法と組み合わせて、遊離脂質含量（サイズ排除クロマトグラフィー；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６によるゲル濾過により定量化；以下参照）を著しく減少させると同時に、最終生成物中の胆汁酸濃度をかなり低くさせる。高胆汁酸濃度と高遊離ＰＣ含量の両方とも、生体外及び生体内での細胞の損傷を生じるので、精密に制御しなければならない。コーレート濃度をアポＡ−Ｉ：ＰＣ比に対して最適化する一方で、同時に、必要に応じて、脂質、とりわけコレステロールをさらに添加して調和させる。ここでも、最適濃度は、最終生成物中の遊離脂質及び遊離アポＡ−Ｉの割合をできるだけ小さくする濃度として決定する。アポＡ−Ｉ：ＰＣ比が１：１５０であるｒＨＤＬ製剤の場合、コール酸ナトリウムのモル比は１：２００（即ち、以下に記載するインキュベーション中アポＡ−Ｉ：ＰＣ：Ｎａ−コール酸＝１：１５０：２００（Ｍ：Ｍ：Ｍ）である。）（大豆由来ＰＣの場合）０°Ｃ〜２°Ｃで４〜１６時間インキュベーション後、胆汁酸濃度を、１，０００〜１００，０００、好ましくは３０，０００ダルトン未満の球状タンパク質孔サイズを有する限外濾過膜を用いたダイアフィルトレーションにより減少させる。必要な緩衝液は、したがって、ｐＨが６を超え、好ましくは７．５〜９で１００ｍｍｏｌ／リットル未満、好ましくは１０ｍｍｏｌ／リットル未満の低イオン強度を有し、そして低濃度の炭水化物、例えば、１％ショ糖を含有するものである。これらの条件下では、使用されるタンパク質１ｇ当たり緩衝液１リットル〜最大２リットルは、一方では必要な低洗浄剤濃度を得るに十分であり、他方では粒子サイズの所望の分布を得るに十分である。これらの緩衝液容積は、上記した方法よりも何倍（１０〜２００倍）も小さい。必要に応じて、アンバーライトＸＡＤ−２を用いたさらなる吸着工程で洗浄剤濃度を所望の濃度まで低下させる。上記したダイアフィルトレーションの技術を用いて、生成物を高濃度１０〜５０ｇタンパク質／リットルに調整し、続いてショ糖等の安定化剤の存在下で処理して安定で貯蔵可能な最終生成物（液体又は凍結乾燥物）とする。使用前に凍結乾燥物を水で溶解して透明でわずかに乳光の溶液（脂質含量によっては淡黄色である）とする。この溶液では、処理後の測定でｒＨＤＬ粒子（円板）は、ここでも実質的に変化してない形態で検出されることができた。サイズ排除クロマトグラフィーを行った結果、凝集物が１０％未満（ほとんどが遊離脂質）及び遊離アポリポタンパク質５％未満であった。凍結乾燥前後で測定した液体最終生成物の濁度は、タンパク質濃度２０ｇ／リットルで、４０ＮＴＵ未満であった。酵素的変色試験で測定したコール酸塩含量は、通常０．５ｇコール酸ナトリウム塩／ｇタンパク質未満である。胆汁酸類の検出は、３−α−ヒドロキシステロイド−デヒドロゲナーゼを用いてＮＡＤ＋の存在下でＮＡＤＨを形成することにより行い、生成したＮＡＤＨはジアホラーゼの触媒作用下でニトロテトラゾリウム青と反応して光度的に検出される青色ホルマザン誘導体を形成する。
適当な容積の溶媒、好ましくは水に溶解後電子顕微鏡により観察すると、凍結乾燥したｒＨＤＬは、直径が５〜５０ｎｍ、通常８〜２０ｎｍで厚さが２〜６ｎｍで発生期のＨＤＬに類似した円板状粒子として存在する。例えば、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて生理緩衝液でゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィー）して粒子サイズとそれらの相対分布を測定する分析法で分析すると、８０％を超える粒子が、分子量１００，０００〜１，０００，０００ダルトンの範囲である。さらに、８０％を超える粒子は、勾配ゲル電気泳動により測定した分子量分布が５０，０００〜１，０００，０００ダルトンの範囲である（Ａ．Ｖ．Ｎｉｃｈｏｌｓ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２８、４１７〜４３１（１９８６）。
【００２０】
図１は、本発明をよりよく理解するためのものであり、上記実施態様を支持している。即ち、図１は、アポＡ−Ｉのホスファチジルコリンに対する比（アポリポタンパク質：脂質比）を変えて用いて製造したｒＨＤＬ粒子のゲル濾過溶出曲線（時間についての吸収−溶出曲線）である。〔アポＡ−Ｉ及びｒＨＤＬ粒子の高性能サイズ排除クロマトグラフィー；ｒＨＤＬ２００μｇの０．９％ＮａＣｌ１００μｌ溶液を、ＳｕｐｅｒｏｓｅＲ６ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、流量０．５ｍｌ／分の条件で分離〕。カラムからの溶出液の吸収を、２８０ｎｍ（Ｌ．Ｌ．Ｒｕｄｅｌ、Ｃ．Ａ．Ｍａｒｚｅｔｔａ及びＦ．Ｌ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２９、４５〜５７（１９８６）で測定した。クロマトグラムにおける個々の分画の含量求めるために、曲線下の面積を算出する。１：２００の生成物の溶出曲線では、溶出の初めに遊離脂質が洗浄除去されているが、１：１００〜１：１５０の生成物ではこれがない。比較のために、純粋なアポリポタンパク質（アポＡ−Ｉ）についての曲線も示す。
【００２１】
【実施例】
以下実施例により本発明をさらに説明するが、本発明を限定するものであると理解されるべきではない。
実施例１
アポＡ−Ｉ１ｋｇを、０．１５ｍｏｌ／リットルＮａＣｌ５００リットルに溶解した。これとは別に、脂質溶液を以下のようにして調製した：大豆油由来ホスファチジルコリン（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０（登録商標）；ドイツ国ケルンにあるＮａｔｔｅｒｍａｎｎ社製）を、１０ｍｍｏｌ／リットルＴＲＩＳ／ＨＣｌと、１５０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌと、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡとからなるｐＨ８．０の緩衝液に溶解し、ホスファチジルコリン２．８ｋｇとコール酸ナトリウム塩２．３２５ｋｇを上記の緩衝液に溶解し溶液を１００リットルとした。この溶液を１〜２時間撹拌し、必要に応じて約４０°Ｃに加熱して透明溶液を得た。続いて、溶液を４°Ｃまで冷却し、この脂質−クロレート溶液１００リットルを上記アポＡ−Ｉ１ｋｇ５００リットル溶液と混合した。得られた混合物を２〜４°Ｃでゆっくりと一晩撹拌した。上記インキュベーション後、濾過滅菌し、ＰＴＧＣカセット付Ｐｅｌｌｉｃｏｎを用いて４°Ｃでダイアフィルトレーションした（公称分子量限界（ＮＭＷＬ）＝１０，０００ダルトン）。この際、まず５ｍｍｏｌ／リットル重炭酸ナトリウム４容積を用い、続いて１０％ショ糖２容積を用いたが、生成物の容積は一定レベルに維持した。次に、タンパク質濃度が２０ｇ／リットルに到達するまで濃度をゆっくりと上昇させた。この溶液を再び濾過滅菌し、バイアルに入れ、続いて凍結乾燥した。上記の操作全体を通じて、特に脂質溶液を空気、光及び過度の高温から保護するよう留意した。適量の水に溶解してタンパク質濃度２０±１ｇ／リットルとした最終生成物は、アポＡ−Ｉのホスファチジルコリンに対するモル比が１：１００（モル：モル）、遊離脂質が５％未満、濁度が４０ＮＴＵ未満であった。
【００２２】
実施例２
アポＡ−Ｉ１０ｋｇを１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ２０００リットルに溶解した。コレステロール１．３８ｋｇ及びコール酸ナトリウム塩２９．９ｋｇを、１０ｍｍｏｌ／リットルＴＲＩＳ−ＨＣｌと、１５０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌと、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡとからなりｐＨ８．０である緩衝液２００リットルに添加し撹拌した。温度を６５°Ｃに上昇させ、この混合物を２時間撹拌して透明溶液を得た。次に、溶液を２０°Ｃまで冷却し、ホスファチジルコリン２７．９ｋｇを添加した。次に、溶液を４°Ｃまで冷却し、再び２時間撹拌した。この混合物をタンパク質溶液に添加し、混合後、濾過滅菌した。得られた濾液を、４°Ｃでゆっくりと一晩（少なくとも１６時間）撹拌した。次に、この生成物を一定容積に保ちながら、５０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を４容積用いて２〜４時間ダイアフィルトレーションした後、１０％ショ糖を別に２容積用いてダイアフィルトレーションした。次に、溶液濃度を、タンパク質濃度２０ｇ／リットルまで上昇させた。この溶液を、次に濾過滅菌し、ガラスバイアルに入れ、凍結乾燥した。これらのバイアルを真空密封し、４°Ｃで暗所に保存した。この方法を用いて、アポＡ−Ｉ：ホスファチジルコリン：コレステロールモル比１：１００：１０でｒＨＤＬを得た。
【００２３】
実施例３
アポＡ−Ｉのホスファチジルコリンに対する比を１：１５０としてｒＨＤＬを製造した。コール酸ナトリウム３．０８ｋｇを、１０ｍｍｏｌ／リットルＴＲＩＳ−ＨＣｌと、１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌと、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡとからなりｐＨ８．０である緩衝液２５リットルに溶解した。この溶液に、ホスファチジルコリン４．２ｋｇをさらに室温で２時間かけて溶解した。次に、アポＡ−Ｉ１ｋｇを１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ２００リットルに溶解した溶液を加え、得られた混合物を０〜４°Ｃで一晩インキュベーションした。その後、５０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を４容積用いて、一定容積で４時間ダイアフィルトレーションを行い、さらに１％ショ糖２容積を用いてダイアフィルトレーションした。最後に、濃度を２０ｇ／リットルタンパク質まで増加させた。さらに固体ショ糖を添加してショ糖濃度を１０％に上昇させた。この溶液を濾過滅菌し、凍結乾燥した。
【００２４】
実施例４
アポＡ−Ｉとホスファチジルコリンとコレステロールとの比を１：１００：１０としてｒＨＤＬを製造した：コール酸ナトリウム４．６１ｋｇを、１０ｍｍｏｌ／リットルＴＲＩＳ−ＨＣｌと、１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌと、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡとからなりｐＨ８．０である緩衝液２５リットルに溶解した。この緩衝液−コール酸塩混合物に、コレステロール１３８ｇを６５°Ｃで２時間かけて溶解した。次に、この混合物を室温まで冷却し、これにホスファチジルコリン２．８ｋｇを１時間かけて溶解した。これに、アポＡ−Ｉ１ｋｇを１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ２００リットルに溶解して調製した溶液を添加した。この混合物を前述の実施例と同様にインキュベーションし、同様にダイアフィルトレーションを行い、上記のようにして濃度を上昇させた。
【００２５】
実施例５
アポＡ−Ｉとホスファチジルコリンとコレステロールとの比を１：１５０：１０として製造を行った。コール酸ナトリウム５．３８ｋｇを実施例３に記載の緩衝液に溶解し、得られた溶液に、コレステロール４．１８０ｋｇを６５°Ｃで２時間かけて溶解した。次に、ＰＣ４．２ｋｇを添加し、室温で１時間溶解した。この混合物を、アポＡ−Ｉ溶液２００リットル（１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ溶液１リットル当たり５ｇ）に添加し、４°Ｃで一晩インキュベーションした。ダイアフィルトレーションと最終生成物の製造を上記と同様にして行った。
【００２６】
実施例６
低コール酸ナトリウム含量のｒＨＤＬを製造した。ｒＨＤＬは実施例１〜５と同様にして製造した。ダイアフィルトレーション及び濃度の上昇後、ｒＨＤＬ溶液１容積をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２（２容積）と混合し、得られた混合物を、十分に撹拌しながら４°Ｃで１時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、実施例１〜５と同様にしてｒＨＤＬを濾去し、濾過滅菌し、凍結乾燥した。
【００２７】
実施例７
アポＡ−Ｉ４００ｇを１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ８０ミリリットルに溶解した溶液を、実施例３〜６に記載の緩衝液にホスファチジルコリン１．６６ｋｇとコール酸ナトリウム１．２３ｋｇとを溶解して調製した脂質溶液と混合した。この混合物を、０〜２°Ｃで１６時間インキュベーションした。その後、ＥＤＴＡ（０．１ｍｍｏｌ／リットル）４容積及びその後ショ糖（１％）２〜４容積を用いてダイアフィルトレーションした後、最後に、タンパク質濃度を２１〜２５ｇ／リットルまで上昇させた。続いて、このｒＨＤＬ溶液を調整して、最終濃度１０％ショ糖及び２０ｇ／リットルタンパク質とした。これを濾過滅菌し、５０ｇ（５０ｍｌバイアルにｒＨＤＬ１ｇ）づつ入れ、凍結乾燥した。
【００２８】
実施例８
沈澱物ＩＶ（Ｋｉｓｔｌｅｒ、Ｐ．Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ、Ｈ．；Ｖｏｘ Ｓａｎｇ７、４１４〜４２４（１９８２））９８０ｋｇから、アルコール沈澱によりアポＡ−Ｉ沈澱物１１．２ｋｇを得た。これを、３倍溶の４モル濃度グアニジン塩酸塩溶液に懸濁した。ｐＨを５．２に調整し、溶液を６０°Ｃで１０時間低温殺菌した。タンパク質を、ｐＨ７．５、４５°Ｃで可溶化した。濾過後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でゲル濾過して、１０ｍＭＮａＣｌ溶液と緩衝液交換した。これにより、アポＡ−Ｉを合計１０４０ｇ含有するアポＡ−Ｉ溶液１６０ｋｇを得た。このタンパク質溶液を、脂質溶液とともに０〜２°Ｃで２〜１６時間インキュベーションした。この脂質溶液は、別途室温で以下のようにして調製したものである。大豆油由来のホスファチジルコリンを実施例３〜７に記載の緩衝液に溶解した。この緩衝液２６ｋｇに、コール酸ナトリウム３２０３ｇとホスファチジルコリン４４６０ｇとを溶解した。続いて、ダイアフィルトレーション（ＮＭＷＬ＝１０，０００ダルトン）を行い、まずタンパク質−脂質混合物の濃度を７ｇタンパク質／リットルに上昇させた。コール酸塩含量が４ｇ／リットル未満となるまで１％ショ糖溶液に対してダイアフィルトレーションした。この際、ｐＨを常に少なくとも７．５に保った。最後に、溶液濃度を２５ｇ／リットルタンパク質に増加し、ショ糖で安定化した。この最終生成物を調整してタンパク質濃度２０ｇアポＡ−Ｉ／リットル及び１００ｇショ糖／リットルとし、滅菌濾過した。サイズ排除クロマトグラフィーを行ったところ、遊離脂質が５％未満で、遊離アポＡ−Ｉが１％未満であった。タンパク質−脂質混合物を５０ｍｌづつ充填し、凍結乾燥した。適当量の水に溶解した最終生成物は、アポＡ−Ｉ：ホスファチジルコリンモル比が１：１４０〔モル：モル〕であった。
【００２９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法によれば、遊離脂質又は遊離アポＡ−Ｉを大きな割合で有していないｒＨＤＬを提供できる。また、本発明の方法では、、有機溶媒を添加せずに実施することができる。さらに、本発明の方法では、再構成リポタンパク質、とりわけ再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）を、アポリポタンパク質と脂質から簡単に迅速に工業的に製造できる。ｒＨＤＬは、脂質及びリポイド物質と関連した疾病の種々の予防及び治療に有用であり、本発明の方法は、工業的及び薬学的に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】アポＡ−Ｉのホスファチジルコリンに対する比（アポリポタンパク質：脂質比）を変えて用いて製造したｒＨＤＬ粒子のゲル濾過溶出曲線（時間についての吸収−溶出曲線）を示すグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、アポリポタンパク質と脂質からの再構成高密度リポタンパク質（ｒＨＤＬ）を工業的規模で製造する方法に関する。ｒＨＤＬは、生体中で脂質及びリポイド物質を結合し、そしてそれらを輸送し、活性に影響することできる性質がある。したがって、ｒＨＤＬは、脂質及びリポイド物質に関連する疾病の種々の予防及び治療に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト血液のリポタンパク質は、一連の種々の役割を果たすことができる。十分研究され周知のように、リポタンパク質の役割は、脂質の輸送にある。リポタンパク質は、不溶性脂質と結合して水性環境に輸送し、目的地に連れていく。一時期、個々のリポタンパク質が、脂質代謝障害との関連でさらに綿密に検討されてきた。主要西洋諸国では、心臓血管系疾病と高血漿コレステロール又は低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬコレステロール）との間の陽性相関及び高ＨＤＬ又は高ＨＤＬコレステロールに対する陰性相関が疫学的研究によって示された。脂質低下効果を有することが示された全範囲の薬剤は、市販されているけれども、場合によっては、適当なリポタンパク質置換が望ましいことが考えられる。このような場合には、適当なものは、まず第一に単離アポリポタンパク質と適当な脂質から得た再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）のようなＨＤＬ又はＨＤＬ様粒子等の「良好」なリポタンパク質である。
【０００３】
食物から摂取される脂質の他に、他の脂質又はリポイド物質由来のリポタンパク質を、輸送又は結合できる。例えば、死細胞の成分をリポタンパク質に結合させて、新規な機能を付与できる。また、リポイド物質を、例えばリポ多糖類（ＬＰＳ）等のリポタンパク質に結合させることもできる。リポ多糖類又はエンドトキシンは、グラム陰性菌の膜成分である。もし十分に多量のエンドトキシンが心臓血管系に入ることがあると、敗血症性ショックを生じるか、死に到ることもある。ＬＰＳをリポタンパク質に結合させると、ＬＰＳの機能又は活性を調整できる。ＬＰＳの活性は、リポタンパク質又はリポタンパク質様粒子の添加により生体内又は生体外でかなり変化させることができる。したがって、生体内において、再構成ＨＤＬの添加により敗血症性の重要な媒介物質である腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の形成を阻害することを示すことができた。また、生体内において、ＨＤＬ又はｒＨＤＬの投与によってショックの症状を大きく減少させることができた。
【０００４】
リポタンパク質又は再構成リポタンパク質と脂質又はリポイド物質との相互作用の他に、リポタンパク質とタンパク質との相互作用も記載されている：
−リポタンパク質は、補体系の個々の成分と相互作用し、したがって、それらの活性に影響することがある；
−リポタンパク質分画に見られる、即ち、ある種のリポタンパク質と関連している凝固系の成分も、同様に公知である；
−血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）等の急性期タンパク質がＨＤＬ分画に見られる；
【０００５】
−さらに、ある種タンパク質の表面吸着が、リポタンパク質での予備処理により影響される。
細胞に対する特異的又は非特異的結合を介して、リポタンパク質も細胞活性に影響することがある：
−血漿の活性化される能力は、ＨＤＬの結合により減少することがあるか、ＬＤＬの添加により刺激されることがある；
−単核細胞及びマクロファージも同様にリポタンパク質に対する受容体を有し；リポタンパク質の結合又は取り込みは、これらの細胞の活性の変化を生じることがある；
−好中球等の宿主防御系に関与する他の細胞の活性も、リポタンパク質の結合により同様に変更又は調整できる；
−さらに、一例としてグリオブラストーマ細胞を用いて示されている腫瘍細胞の成長も、リポタンパク質を介して影響されることがある。
【０００６】
科学文献では、さらにリポタンパク質と病原体との相互作用が報告され；例えば、抗菌活性がリポタンパク質に起因するとしている。また、ウイルスもリポタンパク質により不活性化できること、即ち、一例としてトリパノソーマを用いたとき、寄生菌に影響するか、それぞれ阻害できることが判明した。
これらの例は、リポタンパク質、即ち、ｒＨＤＬが予防及び治療用途に多様に使用される可能性を示している。
リポタンパク質は主に４種に分類される：
【０００７】
主にトリグリセリドからなり通常脂肪に富んだ食事の後にのみ血漿中に多量に出現する粒子であるカイロミクロン、ＶＬＤＬ（超低密度リポタンパク質）、ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）及びＨＤＬ（高密度タンパク質）。命名は、限外濾過によるリポタンパク質の単離に由来する。古典的には、リポタンパク質は、濃度勾配で単離される。この方法は、特殊な装置を必要とし且つ非常に時間がかかるので、実験室規模でのみ適用できる。この方法を用いても、数日かかって製造されるリポタンパク質又はアポリポタンパク質の量は、せいぜい数百ｍｇでしかない。アポリポタンパク質又はリポタンパク質を単離する他の方法も、公知であるが、これらの方法は、多くの場合、例えば、二価陽イオン及び／又はポリエチレングリコール若しくはデキストランによる沈澱析出に基づいている。アポリポタンパク質を単離できる可能性のあるさらなる方法は、ヨーロッパ特許第０３２９６０５Ｂ１号に記載されているようなアルコール分別による沈澱析出である。この最後に述べた方法を用いて、より多量のアポリポタンパク質Ａ−Ｉ（アポＡ−Ｉ）又はアポＡ−Ｉが濃縮された分画を単離し、それらを治療用途に利用できるようにすることが可能である。このように単離されたアポＡ−Ｉ又はアポＡ−Ｉが濃縮されたタンパク質分画を用いて、動物とヒトの両方について一連の実験が行われた。これらの実験に基づいて、ウイルスに関するこれらの生成物の安全性が示すことができ、また、使用された形態でのアポＡ−Ｉは、ヒトや動物で顕著な副作用を生じない。それにもかかわらず、生体外試験では、例えば、コレステロール輸送や、好中球、マクロファージ、単核細胞又は血小板等の細胞に対するアポＡ−Ｉの影響等の所望の活性が見られない。動物とヒトの両方における生体内試験では、血漿でのアポＡ−Ｉの半減期は、極めて短かった。遊離アポＡ−Ｉ（２８，０００ダルトン）の分子量に起因して、アポＡ−Ｉが腎臓により排除される可能性がある。アポＡ−Ｉは、ウサギの尿中に検出された。これらの結果は、多量に注入されるアポＡ−Ｉは所望のリポタンパク質分画に分配されないことを示している。その半減期が短いことから、アポＡ−Ｉは、極めて短時間で生体内でその効果を示すことができる。その結果、リポタンパク質又はリポタンパク質様粒子にアポＡ−Ｉを注入することにより、より適当な形態の投与が達成される。
【０００８】
再構成リポタンパク質、とりわけアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−ＩＩ、Ａ−ＩＶ、アポＣ及びアポＥ（Ａ．Ｊｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １２８、５５３〜５８２（１９８６））の製造方法が、科学文献に記載されている。再構成に最も通常使用される脂質は、卵又は大豆から抽出されるホスファチジルコリンである。また、リン脂質も使用され、トリグリセリドやコレステロール等の脂質も使用される。再構成のために、脂質をまず有機溶媒に溶解し、その後窒素下で蒸発する。この方法では、脂質を薄膜としてガラス壁に結合させる。その後、アポリポタンパク質及び洗浄剤、通常コール酸ナトリウムを添加し混合する。添加したコール酸ナトリウムにより、脂質が分散される。適当なインキュベーション期間の後、混合物を多量の緩衝液に対して長時間透析する。これによりほとんどのコール酸ナトリウムが除去され、同時に脂質とアポリポタンパク質は、自体リポタンパク質、即ち、いわゆる再構成リポタンパク質となる。透析に代わる方法としては、洗浄剤を吸着できる疎水性吸着剤が利用できる（Ｂｉｏ−Ｂｅａｄｓ ＳＭ−２、Ｂｉｏ Ｒａｄ；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２、Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ）（Ｅ．Ａ．Ｂｏｎｏｍｏ、Ｊ．Ｂ． Ｓｗａｎｅｙ、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．、２９、３８０〜３８４（１９８８））。また、洗浄剤は、ゲルクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により除去できる。また、リポタンパク質は、洗浄剤なしでも、例えば、適当な脂質の水性懸濁液をアポリポタンパク質とともにインキュベーションすることにより製造できる。この際、有機溶媒に溶解した脂質をアポリポタンパク質に添加し、得られた混合物をさらに加熱するか加熱しないで用いる。また、アポＡ−Ｉ−脂質−混合物の超音波処理によっても製造できる。これらの方法の場合、例えば、アポＡ−Ｉとホスファチジルコリンを出発物質として用いると、発生期状態のリポタンパク質に相当する円板状粒子を得ることができる。通常、インキュベーションに続いて、未結合アポリポタンパク質及び遊離脂質を、遠心分離又はゲルクロマトグラフィーにより分離して、均一な再構成リポタンパク質粒子を単離する。
【０００９】
ＵＳ−Ａ−５，１２８，３１８には、ホスファチジルコリンを有機溶媒を用いた溶液に溶解する再構成ＨＤＬの製造方法が記載されている。
上記公報に記載されている再構成リポタンパク質の製造方法は、実験室規模でのより少量、即ち、数ｍｇ〜せいぜい数ｇの量の場合にのみ適当である：
−中間生成物での溶液を高倍率希釈すると、必要時間内での混合物の処理が不可能となる；
−大容積について必要なインフラストラクチャーが通常役に立たない；
−使用される有機溶媒は、環境的に許容されない；
−最終生成物は、保存できない；
−最終生成物の濃度が低すぎて、患者に注入される容積が大きすぎるであろう；
−生成物は、通常、例えばゲルクロマトグラフィーによりさらに精製して、所望のｒＨＤＬ粒子から残留遊離脂質及び／又は遊離タンパク質を分離する必要がある。
【００１０】
さらに、Ａ．Ｈｕｂｓｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ Ｓｈｏｃｋ ４０、１４〜２３（１９９３）には、アポリポタンパク質の脂質に対する比を１：２００として使用する再構成リポタンパク質の製造方法が記載されている。この操作の結果、得られる生成物は、治療上の利用可能性に悪影響を及ぼす遊離脂質をかなりの割合で有している。
【００１１】
ｒＨＤＬをヒトにおいて治療又は予防用途に使用する場合、血漿中のアポＡ−Ｉ又はＨＤＬを顕著に増加させるためには、ｒＨＤＬをグラムオーダーので投与することが必要である。このように、臨床目的のためにｋｇ以上の規模でｒＨＤＬを経済的に製造することは、上記した方法では可能ではない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、上記した欠点を有さないｒＨＤＬの製造方法であって、特にその生成物が遊離脂質又は遊離アポＡ−Ｉを大きな割合で有していないｒＨＤＬを提供することにある。本発明のさらなる目的は、有機溶媒を添加せずに実施することができる方法を提供することにある。再構成リポタンパク質、とりわけ再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）は、アポリポタンパク質と脂質から簡単で迅速で工業的に適用できる手段を用いて製造できることが判明した。
【００１３】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明の要旨は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びフォスファチジルコリンから再構成され、タンパク質含量２０±２ｇ／リットルで温度２０°Ｃ±２°Ｃで測定した濁り度（比濁度単位）が４０ＮＴＵ未満である再構成リポタンパク質粒子を含有する製剤の工業的製造方法において、濃度１〜４０ｇタンパク質／リットルのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ水溶液を有機溶媒を添加することなくフォスファチジルコリン−洗浄剤水溶液と混合するが、その際フォスファチジルコリンの洗浄剤に対するモル比が１：０．５〜１：４．０、アポリポタンパク質Ａ−Ｉのフォスファチジルコリンに対する重量比が１：１．５〜１：５．０であり、その後得られたアポリポタンパク質Ａ−Ｉ−フォスファチジルコリン−洗浄剤混合物を、水中での前記フォスファチジルコリンの相変化温度±１０°Ｃの範囲の温度でインキュベーションし、さらに精製しなくとも前記使用したタンパク質の９５％以上及び総フォスファチジルコリンの９０％以上が結合している直径５〜５０ｎｍで質量５０，０００〜１，０００，０００ダルトンのタンパク質−フォスファチジルコリン粒子状物が形成されるまで、前記洗浄剤をサイズ排除又は吸着剤による吸着により除去することを特徴とする再構成リポタンパク質を含有する製剤の工業的製造方法にある。
【００１４】
また、本発明の要旨は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びフォスファチジルコリンから得た再構成リポタンパク質粒子を含有する安定凍結乾燥物の工業的製造方法において、濃度１〜４０ｇタンパク質／リットルのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ水溶液を、有機溶媒を意図的に添加することなくフォスファチジルコリン−洗浄剤水溶液と混合するが、その際フォスファチジルコリンの洗浄剤に対するモル比が１：０．５〜１：４．０、アポリポタンパク質Ａ−Ｉのフォスファチジルコリンに対する重量比が１：１．５〜１：５．０であり、その後得られたアポリポタンパク質Ａ−Ｉ−フォスファチジルコリン−洗浄剤混合物を水中での前記フォスファチジルコリンの相変化温度±１０°Ｃの温度範囲でインキュベーションし、さらに精製しなくとも前記使用したタンパク質の９５％以上及び総フォスファチジルコリンの９０％以上が結合している直径５〜５０ｎｍで質量５０，０００〜１，０００，０００ダルトンのタンパク質−フォスファチジルコリン粒子状物が形成されるまで、前記洗浄剤をサイズ排除又は吸着剤による吸着により除去してタンパク質含量２０±２ｇ／リットルで温度２０°Ｃ±２°Ｃで測定した濁り度が４０ＮＴＵ未満である液体生成物を得、得られた生成物を、例えば、ショ糖又はマンニトール等の炭水化物からなる群から選択される安定化剤の存在下で凍結乾燥して安定化させることを特徴とする安定凍結乾燥物の工業的製造方法にある。
【００１５】
使用されるアポリポタンパク質は、例えば、組み換えアポリポタンパク質、ヒト血漿由来のアポリポタンパク質Ａ−Ｉの濃縮分画から得たアポリポタンパク質、アポリポタンパク質の断片又は両親媒性を有する天然、合成若しくは組み換えポリペプチドである。アポリポタンパク質の断片は、天然又は合成アポリポタンパク質の化学的又は酵素的断片形成により得ることができる。化学的断片形成の一例としては、臭化シアンでの処理が挙げられ、酵素的開裂の場合、例えば、トリプシン等のプロテアーゼでの処理が挙げられる。
【００１６】
本発明で使用される脂質−洗浄剤溶液は、脂質として、例えば、大豆由来又は卵由来でよいリン脂質、コレステロール、コレステロール−エステル、脂肪酸類又はトリグリセリド類を含有する。洗浄剤は、好ましくは胆汁酸類又はそれらの塩類、例えば、コール酸ナトリウム塩又はデオキシコール酸ナトリウムが好ましい。
【００１７】
本明細書に記載の温度２０±２°Ｃは、１８°Ｃ〜２２°Ｃの範囲内の全てを包含する。タンパク質含量２０±２ｇ／リットルは、１８ｇ／リットル〜２２ｇ／リットルの範囲内の全ての濃度を包含する。また、「相転移温度±１０°Ｃ」は、対応脂質の水性環境中における相転移温度よりも１０°Ｃ低い温度と脂質の相転移温度よりも１０°Ｃ高い温度との間の全ての温度を包含する。これらの値は、溶液の凝固点と５０°Ｃとの間の範囲を包含するが、２５°Ｃ未満の温度が好ましい。
【００１８】
出発物質として好ましいものは、例えば、低温殺菌等の適当な手段を用いてウイルス不活性化したヒト血漿から精製されるリポタンパク質である。この操作をにより得られる変性タンパク質（凝集物）を、続いて例えば、尿素又はグアニジン塩酸塩等のカオトロピック成分の存在下で弱アルカリ性ｐＨ及びわずかに温度を上昇させてインキュベーションにより再変性して、１０ｍＭＮａＣｌ中でのタンパク質の緩衝液交換後のアポＡ−Ｉの７０％を超える割合を単一形態（分析的サイズ排除クロマトグラフィーにて測定：アポＡ−Ｉ４０μｇを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７．４、流量０．４ｍｌ／分の条件でＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷ Ｕｌｔｒｏｐａｃ ｃｏｌｕｍｎ（ＬＫＢ）カラムに附し、溶出液を２８０ｎｍで測定）とする。
【００１９】
さらなる処理において、リポタンパク質を高濃度で、有機溶媒を用いずに、胆汁酸類又はそれらの塩類（例えば、コーレート、デオキシコーレート、ウルソデオキシコーレート）の溶液中で脂質（ホスファチジルコリン、コレステロール、トリグリセリド等のリン脂質）溶液と混合する。Ｈｕｂｓｃｈ等（Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ Ｓｈｏｃｋ４０、１４〜２３（１９９３）に記載の研究とは対照的に、アポリポタンパク質の脂質に対する比を、多量の遊離脂質や多量の遊離アポリポタンパク質が最終生成物に見られず、その結果、ｒＨＤＬの更なる精製を省略できるように選択する。特に、アポＡ−Ｉ：ＰＣ比を減少させ、この比を１：２００（Ｍ：Ｍ；重量比約１：５．５）よりかなり下、即ち、１：５０〜１：１８０の範囲、好ましくは１：１００〜１：１５０（モル比；アポＡ−Ｉと大豆由来ＰＣについて重量比１：２．８〜１：４．２に相当）である。これをダイアフィルトレーション法と組み合わせて、遊離脂質含量（サイズ排除クロマトグラフィー；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６によるゲル濾過により定量化；以下参照）を著しく減少させると同時に、最終生成物中の胆汁酸濃度をかなり低くさせる。高胆汁酸濃度と高遊離ＰＣ含量の両方とも、生体外及び生体内での細胞の損傷を生じるので、精密に制御しなければならない。コーレート濃度をアポＡ−Ｉ：ＰＣ比に対して最適化する一方で、同時に、必要に応じて、脂質、とりわけコレステロールをさらに添加して調和させる。ここでも、最適濃度は、最終生成物中の遊離脂質及び遊離アポＡ−Ｉの割合をできるだけ小さくする濃度として決定する。アポＡ−Ｉ：ＰＣ比が１：１５０であるｒＨＤＬ製剤の場合、コール酸ナトリウムのモル比は１：２００（即ち、以下に記載するインキュベーション中アポＡ−Ｉ：ＰＣ：Ｎａ−コール酸＝１：１５０：２００（Ｍ：Ｍ：Ｍ）である。）（大豆由来ＰＣの場合）０°Ｃ〜２°Ｃで４〜１６時間インキュベーション後、胆汁酸濃度を、１，０００〜１００，０００、好ましくは３０，０００ダルトン未満の球状タンパク質孔サイズを有する限外濾過膜を用いたダイアフィルトレーションにより減少させる。必要な緩衝液は、したがって、ｐＨが６を超え、好ましくは７．５〜９で１００ｍｍｏｌ／リットル未満、好ましくは１０ｍｍｏｌ／リットル未満の低イオン強度を有し、そして低濃度の炭水化物、例えば、１％ショ糖を含有するものである。これらの条件下では、使用されるタンパク質１ｇ当たり緩衝液１リットル〜最大２リットルは、一方では必要な低洗浄剤濃度を得るに十分であり、他方では粒子サイズの所望の分布を得るに十分である。これらの緩衝液容積は、上記した方法よりも何倍（１０〜２００倍）も小さい。必要に応じて、アンバーライトＸＡＤ−２を用いたさらなる吸着工程で洗浄剤濃度を所望の濃度まで低下させる。上記したダイアフィルトレーションの技術を用いて、生成物を高濃度１０〜５０ｇタンパク質／リットルに調整し、続いてショ糖等の安定化剤の存在下で処理して安定で貯蔵可能な最終生成物（液体又は凍結乾燥物）とする。使用前に凍結乾燥物を水で溶解して透明でわずかに乳光の溶液（脂質含量によっては淡黄色である）とする。この溶液では、処理後の測定でｒＨＤＬ粒子（円板）は、ここでも実質的に変化してない形態で検出されることができた。サイズ排除クロマトグラフィーを行った結果、凝集物が１０％未満（ほとんどが遊離脂質）及び遊離アポリポタンパク質５％未満であった。凍結乾燥前後で測定した液体最終生成物の濁度は、タンパク質濃度２０ｇ／リットルで、４０ＮＴＵ未満であった。酵素的変色試験で測定したコール酸塩含量は、通常０．５ｇコール酸ナトリウム塩／ｇタンパク質未満である。胆汁酸類の検出は、３−α−ヒドロキシステロイド−デヒドロゲナーゼを用いてＮＡＤ＋の存在下でＮＡＤＨを形成することにより行い、生成したＮＡＤＨはジアホラーゼの触媒作用下でニトロテトラゾリウム青と反応して光度的に検出される青色ホルマザン誘導体を形成する。
適当な容積の溶媒、好ましくは水に溶解後電子顕微鏡により観察すると、凍結乾燥したｒＨＤＬは、直径が５〜５０ｎｍ、通常８〜２０ｎｍで厚さが２〜６ｎｍで発生期のＨＤＬに類似した円板状粒子として存在する。例えば、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）６ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて生理緩衝液でゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィー）して粒子サイズとそれらの相対分布を測定する分析法で分析すると、８０％を超える粒子が、分子量１００，０００〜１，０００，０００ダルトンの範囲である。さらに、８０％を超える粒子は、勾配ゲル電気泳動により測定した分子量分布が５０，０００〜１，０００，０００ダルトンの範囲である（Ａ．Ｖ．Ｎｉｃｈｏｌｓ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２８、４１７〜４３１（１９８６）。
【００２０】
図１は、本発明をよりよく理解するためのものであり、上記実施態様を支持している。即ち、図１は、アポＡ−Ｉのホスファチジルコリンに対する比（アポリポタンパク質：脂質比）を変えて用いて製造したｒＨＤＬ粒子のゲル濾過溶出曲線（時間についての吸収−溶出曲線）である。〔アポＡ−Ｉ及びｒＨＤＬ粒子の高性能サイズ排除クロマトグラフィー；ｒＨＤＬ２００μｇの０．９％ＮａＣｌ１００μｌ溶液を、ＳｕｐｅｒｏｓｅＲ６ＨＲ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、流量０．５ｍｌ／分の条件で分離〕。カラムからの溶出液の吸収を、２８０ｎｍ（Ｌ．Ｌ．Ｒｕｄｅｌ、Ｃ．Ａ．Ｍａｒｚｅｔｔａ及びＦ．Ｌ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２９、４５〜５７（１９８６）で測定した。クロマトグラムにおける個々の分画の含量求めるために、曲線下の面積を算出する。１：２００の生成物の溶出曲線では、溶出の初めに遊離脂質が洗浄除去されているが、１：１００〜１：１５０の生成物ではこれがない。比較のために、純粋なアポリポタンパク質（アポＡ−Ｉ）についての曲線も示す。
【００２１】
【実施例】
以下実施例により本発明をさらに説明するが、本発明を限定するものであると理解されるべきではない。
実施例１
アポＡ−Ｉ１ｋｇを、０．１５ｍｏｌ／リットルＮａＣｌ５００リットルに溶解した。これとは別に、脂質溶液を以下のようにして調製した：大豆油由来ホスファチジルコリン（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ ９０（登録商標）；ドイツ国ケルンにあるＮａｔｔｅｒｍａｎｎ社製）を、１０ｍｍｏｌ／リットルＴＲＩＳ／ＨＣｌと、１５０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌと、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡとからなるｐＨ８．０の緩衝液に溶解し、ホスファチジルコリン２．８ｋｇとコール酸ナトリウム塩２．３２５ｋｇを上記の緩衝液に溶解し溶液を１００リットルとした。この溶液を１〜２時間撹拌し、必要に応じて約４０°Ｃに加熱して透明溶液を得た。続いて、溶液を４°Ｃまで冷却し、この脂質−クロレート溶液１００リットルを上記アポＡ−Ｉ１ｋｇ５００リットル溶液と混合した。得られた混合物を２〜４°Ｃでゆっくりと一晩撹拌した。上記インキュベーション後、濾過滅菌し、ＰＴＧＣカセット付Ｐｅｌｌｉｃｏｎを用いて４°Ｃでダイアフィルトレーションした（公称分子量限界（ＮＭＷＬ）＝１０，０００ダルトン）。この際、まず５ｍｍｏｌ／リットル重炭酸ナトリウム４容積を用い、続いて１０％ショ糖２容積を用いたが、生成物の容積は一定レベルに維持した。次に、タンパク質濃度が２０ｇ／リットルに到達するまで濃度をゆっくりと上昇させた。この溶液を再び濾過滅菌し、バイアルに入れ、続いて凍結乾燥した。上記の操作全体を通じて、特に脂質溶液を空気、光及び過度の高温から保護するよう留意した。適量の水に溶解してタンパク質濃度２０±１ｇ／リットルとした最終生成物は、アポＡ−Ｉのホスファチジルコリンに対するモル比が１：１００（モル：モル）、遊離脂質が５％未満、濁度が４０ＮＴＵ未満であった。
【００２２】
実施例２
アポＡ−Ｉ１０ｋｇを１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ２０００リットルに溶解した。コレステロール１．３８ｋｇ及びコール酸ナトリウム塩２９．９ｋｇを、１０ｍｍｏｌ／リットルＴＲＩＳ−ＨＣｌと、１５０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌと、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡとからなりｐＨ８．０である緩衝液２００リットルに添加し撹拌した。温度を６５°Ｃに上昇させ、この混合物を２時間撹拌して透明溶液を得た。次に、溶液を２０°Ｃまで冷却し、ホスファチジルコリン２７．９ｋｇを添加した。次に、溶液を４°Ｃまで冷却し、再び２時間撹拌した。この混合物をタンパク質溶液に添加し、混合後、濾過滅菌した。得られた濾液を、４°Ｃでゆっくりと一晩（少なくとも１６時間）撹拌した。次に、この生成物を一定容積に保ちながら、５０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を４容積用いて２〜４時間ダイアフィルトレーションした後、１０％ショ糖を別に２容積用いてダイアフィルトレーションした。次に、溶液濃度を、タンパク質濃度２０ｇ／リットルまで上昇させた。この溶液を、次に濾過滅菌し、ガラスバイアルに入れ、凍結乾燥した。これらのバイアルを真空密封し、４°Ｃで暗所に保存した。この方法を用いて、アポＡ−Ｉ：ホスファチジルコリン：コレステロールモル比１：１００：１０でｒＨＤＬを得た。
【００２３】
実施例３
アポＡ−Ｉのホスファチジルコリンに対する比を１：１５０としてｒＨＤＬを製造した。コール酸ナトリウム３．０８ｋｇを、１０ｍｍｏｌ／リットルＴＲＩＳ−ＨＣｌと、１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌと、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡとからなりｐＨ８．０である緩衝液２５リットルに溶解した。この溶液に、ホスファチジルコリン４．２ｋｇをさらに室温で２時間かけて溶解した。次に、アポＡ−Ｉ１ｋｇを１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ２００リットルに溶解した溶液を加え、得られた混合物を０〜４°Ｃで一晩インキュベーションした。その後、５０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を４容積用いて、一定容積で４時間ダイアフィルトレーションを行い、さらに１％ショ糖２容積を用いてダイアフィルトレーションした。最後に、濃度を２０ｇ／リットルタンパク質まで増加させた。さらに固体ショ糖を添加してショ糖濃度を１０％に上昇させた。この溶液を濾過滅菌し、凍結乾燥した。
【００２４】
実施例４
アポＡ−Ｉとホスファチジルコリンとコレステロールとの比を１：１００：１０としてｒＨＤＬを製造した：コール酸ナトリウム４．６１ｋｇを、１０ｍｍｏｌ／リットルＴＲＩＳ−ＨＣｌと、１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌと、１ｍｍｏｌ／リットルＥＤＴＡとからなりｐＨ８．０である緩衝液２５リットルに溶解した。この緩衝液−コール酸塩混合物に、コレステロール１３８ｇを６５°Ｃで２時間かけて溶解した。次に、この混合物を室温まで冷却し、これにホスファチジルコリン２．８ｋｇを１時間かけて溶解した。これに、アポＡ−Ｉ１ｋｇを１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ２００リットルに溶解して調製した溶液を添加した。この混合物を前述の実施例と同様にインキュベーションし、同様にダイアフィルトレーションを行い、上記のようにして濃度を上昇させた。
【００２５】
実施例５
アポＡ−Ｉとホスファチジルコリンとコレステロールとの比を１：１５０：１０として製造を行った。コール酸ナトリウム５．３８ｋｇを実施例３に記載の緩衝液に溶解し、得られた溶液に、コレステロール４．１８０ｋｇを６５°Ｃで２時間かけて溶解した。次に、ＰＣ４．２ｋｇを添加し、室温で１時間溶解した。この混合物を、アポＡ−Ｉ溶液２００リットル（１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ溶液１リットル当たり５ｇ）に添加し、４°Ｃで一晩インキュベーションした。ダイアフィルトレーションと最終生成物の製造を上記と同様にして行った。
【００２６】
実施例６
低コール酸ナトリウム含量のｒＨＤＬを製造した。ｒＨＤＬは実施例１〜５と同様にして製造した。ダイアフィルトレーション及び濃度の上昇後、ｒＨＤＬ溶液１容積をＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２（２容積）と混合し、得られた混合物を、十分に撹拌しながら４°Ｃで１時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、実施例１〜５と同様にしてｒＨＤＬを濾去し、濾過滅菌し、凍結乾燥した。
【００２７】
実施例７
アポＡ−Ｉ４００ｇを１０ｍｍｏｌ／リットルＮａＣｌ８０ミリリットルに溶解した溶液を、実施例３〜６に記載の緩衝液にホスファチジルコリン１．６６ｋｇとコール酸ナトリウム１．２３ｋｇとを溶解して調製した脂質溶液と混合した。この混合物を、０〜２°Ｃで１６時間インキュベーションした。その後、ＥＤＴＡ（０．１ｍｍｏｌ／リットル）４容積及びその後ショ糖（１％）２〜４容積を用いてダイアフィルトレーションした後、最後に、タンパク質濃度を２１〜２５ｇ／リットルまで上昇させた。続いて、このｒＨＤＬ溶液を調整して、最終濃度１０％ショ糖及び２０ｇ／リットルタンパク質とした。これを濾過滅菌し、５０ｇ（５０ｍｌバイアルにｒＨＤＬ１ｇ）づつ入れ、凍結乾燥した。
【００２８】
実施例８
沈澱物ＩＶ（Ｋｉｓｔｌｅｒ、Ｐ．Ｎｉｔｓｃｈｍａｎｎ、Ｈ．；Ｖｏｘ Ｓａｎｇ７、４１４〜４２４（１９８２））９８０ｋｇから、アルコール沈澱によりアポＡ−Ｉ沈澱物１１．２ｋｇを得た。これを、３倍溶の４モル濃度グアニジン塩酸塩溶液に懸濁した。ｐＨを５．２に調整し、溶液を６０°Ｃで１０時間低温殺菌した。タンパク質を、ｐＨ７．５、４５°Ｃで可溶化した。濾過後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でゲル濾過して、１０ｍＭＮａＣｌ溶液と緩衝液交換した。これにより、アポＡ−Ｉを合計１０４０ｇ含有するアポＡ−Ｉ溶液１６０ｋｇを得た。このタンパク質溶液を、脂質溶液とともに０〜２°Ｃで２〜１６時間インキュベーションした。この脂質溶液は、別途室温で以下のようにして調製したものである。大豆油由来のホスファチジルコリンを実施例３〜７に記載の緩衝液に溶解した。この緩衝液２６ｋｇに、コール酸ナトリウム３２０３ｇとホスファチジルコリン４４６０ｇとを溶解した。続いて、ダイアフィルトレーション（ＮＭＷＬ＝１０，０００ダルトン）を行い、まずタンパク質−脂質混合物の濃度を７ｇタンパク質／リットルに上昇させた。コール酸塩含量が４ｇ／リットル未満となるまで１％ショ糖溶液に対してダイアフィルトレーションした。この際、ｐＨを常に少なくとも７．５に保った。最後に、溶液濃度を２５ｇ／リットルタンパク質に増加し、ショ糖で安定化した。この最終生成物を調整してタンパク質濃度２０ｇアポＡ−Ｉ／リットル及び１００ｇショ糖／リットルとし、滅菌濾過した。サイズ排除クロマトグラフィーを行ったところ、遊離脂質が５％未満で、遊離アポＡ−Ｉが１％未満であった。タンパク質−脂質混合物を５０ｍｌづつ充填し、凍結乾燥した。適当量の水に溶解した最終生成物は、アポＡ−Ｉ：ホスファチジルコリンモル比が１：１４０〔モル：モル〕であった。
【００２９】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明の方法によれば、遊離脂質又は遊離アポＡ−Ｉを大きな割合で有していないｒＨＤＬを提供できる。また、本発明の方法では、、有機溶媒を添加せずに実施することができる。さらに、本発明の方法では、再構成リポタンパク質、とりわけ再構成ＨＤＬ（ｒＨＤＬ）を、アポリポタンパク質と脂質から簡単に迅速に工業的に製造できる。ｒＨＤＬは、脂質及びリポイド物質と関連した疾病の種々の予防及び治療に有用であり、本発明の方法は、工業的及び薬学的に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】アポＡ−Ｉのホスファチジルコリンに対する比（アポリポタンパク質：脂質比）を変えて用いて製造したｒＨＤＬ粒子のゲル濾過溶出曲線（時間についての吸収−溶出曲線）を示すグラフである。
Claims (21)
- アポリポタンパク質Ａ−Ｉとフォスファチジルコリンから再構成され、タンパク質含量２０±２ｇ／リットルで温度２０°Ｃ±２°Ｃで測定した濁り度が４０ＮＴＵ未満である再構成リポタンパク質粒子を含有する製剤の工業的製造方法において、濃度１〜４０ｇタンパク質／リットルのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ水溶液をフォスファチジルコリン−洗浄剤水溶液と混合するが、その際フォスファチジルコリンの洗浄剤に対するモル比が１：０．５〜１：４．０、アポリポタンパク質Ａ−Ｉのフォスファチジルコリンに対する重量比が１：１．５〜１：５．０であり、その後得られたアポリポタンパク質Ａ−Ｉ−フォスファチジルコリン−洗浄剤混合物を、水中での前記フォスファチジルコリンの相変化温度±１０°Ｃの範囲の温度でインキュベーションし、さらに精製しなくとも前記使用したタンパク質の９５％以上及び総フォスファチジルコリンの９０％以上が結合している直径５〜５０ｎｍで質量５０，０００〜１，０００，０００ダルトンのタンパク質−フォスファチジルコリン粒子状物が得られるまで、前記洗浄剤をサイズ排除又は吸着剤による吸着により除去することを特徴とする再構成リポタンパク質を含有する製剤の工業的製造方法。
- 前記フォスファチジルコリン−洗浄剤水溶液が実質的に有機溶媒を含有しない請求項１に記載の方法。
- 前記洗浄剤の除去をタンパク質１ｇ当たり２リットル以下の緩衝液を用いた限外濾過によるサイズ排除により行う請求項１に記載の方法。
- フォスファチジルコリン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ−洗浄剤混合物をインキュベーションした後、前記洗浄剤をバッチ吸着かカラム法による疎水性吸着剤への吸着により結合させる請求項１に記載の方法。
- 前記疎水性吸着剤が不溶性架橋ポリスチレン共重合体である請求項４に記載の方法。
- 前記フォスファチジルコリン−洗浄剤溶液がリン脂質、コレステロール、コレステロールエステル類、脂肪酸類及び／又はトリグリセリド類を含有する請求項１に記載の方法。
- カオトロピック成分含有溶液中でのインキュベーション後、イオン強度５０ｍｍｏｌ／リットル未満の溶液中で緩衝液を変化させてインキュベーションすることにより７０％を超えるリポタンパク質が単一形態となる、少なくとも一つのウイルス不活性化工程で処理されたアポリポタンパク質Ａ−Ｉに富んだヒト血漿由来の分画を、アポリポタンパク質Ａ−Ｉとして使用する請求項１に記載の方法。
- 前記フォスファチジルコリン−洗浄剤溶液が前記フォスファチジルコリン成分として実質的にリン脂質を含有する請求項１に記載の方法。
- 前記リン脂質が合成ホスファチジルコリンである請求項８に記載の方法。
- 前記リン脂質が天然リン脂質、好ましくは大豆又は卵から抽出したリン脂質である請求項１に記載の方法。
- 前記リン脂質が大豆ホスファチジルコリンであり、前記アポリポタンパク質Ａ−Ｉ−フォスファチジルコリン−洗浄剤混合物のインキュベーションを０〜１５°Ｃの温度で行う請求項１０に記載の方法。
- 前記洗浄剤として、胆汁酸類又はその塩類から選択されるものを使用する請求項１に記載の方法。
- 前記洗浄剤がコール酸ナトリウム塩又はデオキシコール酸ナトリウムである請求項１２に記載の方法。
- 前記アポリポタンパク質Ａ−Ｉ水溶液が、アポリポタンパク質Ａ−Ｉとして組み換えアポリポタンパク質、ヒト血漿由来のアポリポタンパク質Ａ−Ｉの濃縮画分から得たアポリポタンパク質、アポリポタンパク質の断片又は両親媒性の適当な天然、合成若しくは組み換えポリペプチドを含有する請求項１に記載の方法。
- 前記フォスファチジルコリン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ−洗浄剤混合物をインキュベーションした後、洗浄剤含量を透析又はダイアフィルトレーションによりタンパク質１ｇ当たり洗浄剤０．５ｇ未満の濃度まで減少させる請求項１に記載の方法。
- 前記洗浄剤を分離する前又は後に、タンパク質濃度をダイアフィルトレーションにより１０〜５０ｇ／リットルに増加させる請求項１に記載の方法。
- 前記アポリポタンパク質Ａ−Ｉ水溶液又は前記フォスファチジルコリン−洗浄剤溶液をｐＨ６〜９の範囲で緩衝剤処理する請求項１に記載の方法。
- 前記アポリポタンパク質Ａ−Ｉ水溶液又は前記フォスファチジルコリン−洗浄剤溶液をｐＨ７．５〜８．５の範囲で緩衝剤処理する請求項１７に記載の方法。
- アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びフォスファチジルコリンから得た再構成リポタンパク質粒子を含有する安定凍結乾燥物の工業的製造方法において、濃度１〜４０ｇタンパク質／リットルのアポリポタンパク質Ａ−Ｉ水溶液をフォスファチジルコリン−洗浄剤水溶液と混合するが、その際フォスファチジルコリンの洗浄剤に対するモル比が１：０．５〜１：４．０、アポリポタンパク質Ａ−Ｉのフォスファチジルコリンに対する重量比が１：１．５〜１：５．０であり、その後得られたアポリポタンパク質Ａ−Ｉ−フォスファチジルコリン−洗浄剤混合物を、水中での前記フォスファチジルコリンの相変化温度±１０°Ｃの温度範囲でインキュベーションし、さらに精製しなくとも前記使用したタンパク質の９５％以上及び総フォスファチジルコリンの９０％以上が結合している直径５〜５０ｎｍで質量５０，０００〜１，０００，０００ダルトンのタンパク質−フォスファチジルコリン粒子状物が形成されるまで、前記洗浄剤をサイズ排除又は吸着剤による吸着により除去してタンパク質含量２０±２ｇ／リットルで温度２０°Ｃ±２°Ｃで測定した濁り度が４０ＮＴＵ未満である液体生成物を得、得られた生成物を炭水化物からなる群から選択される安定化剤の存在下で凍結乾燥して安定化させることを特徴とする安定凍結乾燥物の工業的製造方法。
- 前記フォスファチジルコリン−洗浄剤水溶液が実質的に有機溶媒を含有しない請求項１９に記載の方法。
- 前記生成物のタンパク質濃度を５〜５０ｇ／リットルに調整し、前記生成物を安定化させる凍結乾燥を５〜１５％のショ糖等の二糖類又は２〜１０％のマンニトール等の単糖類の存在下で行う請求項１９に記載の方法。
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| US20060060520A1 (en) * | 2001-06-25 | 2006-03-23 | Bomberger David C | Systems and methods using a solvent for the removal of lipids from fluids |
| WO2003000381A1 (en) * | 2001-06-25 | 2003-01-03 | Lipid Sciences, Inc. | Hollow fiber contactor systems for removal of lipids from fluids |
| CA2496831A1 (en) * | 2002-08-26 | 2004-03-04 | Lipid Sciences, Inc. | Treating alzheimers using delipidated protein particles |
| WO2004073684A2 (en) | 2003-02-14 | 2004-09-02 | Children's Hospital & Research Center At Oakland | Lipophilic drug delivery vehicle and methods of use thereof |
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| US7393826B2 (en) * | 2003-07-03 | 2008-07-01 | Lipid Sciences, Inc. | Methods and apparatus for creating particle derivatives of HDL with reduced lipid content |
| JP2007527387A (ja) * | 2003-07-03 | 2007-09-27 | リピッド サイエンシーズ，インコーポレイテッド | 脂質含量の低下したｈｄｌの粒子誘導体を製造するための方法及び装置 |
| US6960803B2 (en) * | 2003-10-23 | 2005-11-01 | Silicon Storage Technology, Inc. | Landing pad for use as a contact to a conductive spacer |
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| WO2006069371A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-29 | Baylor College Of Medicine | A method of plasma lipidation to prevent, inhibit and/or reverse atherosclerosis |
| US7759315B2 (en) * | 2005-03-09 | 2010-07-20 | Csl Behring Ag | Treatment of inflammatory conditions of the intestine |
| WO2007149355A2 (en) * | 2006-06-16 | 2007-12-27 | Lipid Sciences, Inc. | Novel peptides that promote lipid efflux |
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| US7956035B2 (en) * | 2007-03-01 | 2011-06-07 | Csl Limited | Treatment of endothelial dysfunction in diabetic patients |
| ES2442594T3 (es) | 2007-03-01 | 2014-02-12 | Csl Limited | Tratamiento de la disfunción endotelial en pacientes diabéticos |
| US20090110739A1 (en) * | 2007-05-15 | 2009-04-30 | University Of North Texas Health Science Center At Forth Worth | Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles |
| US8324366B2 (en) | 2008-04-29 | 2012-12-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for delivering RNAI using lipoproteins |
| US8734853B2 (en) | 2008-11-17 | 2014-05-27 | University Of North Texas Health Science Center At Fort Worth | HDL particles for delivery of nucleic acids |
| US8975389B2 (en) | 2009-03-02 | 2015-03-10 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid chemical modifications |
| CN101928739B (zh) * | 2009-06-22 | 2014-02-05 | 吉林圣元科技有限责任公司 | 一种重组高密度脂蛋白的制备及其应用 |
| WO2011006994A1 (en) | 2009-07-16 | 2011-01-20 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Hdl comprising a therapeutic agent and use in therapy |
| US12419839B2 (en) | 2009-10-09 | 2025-09-23 | Signablok, Inc. | Methods and compositions for targeted delivery of protein fragments |
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| WO2012028524A2 (en) * | 2010-08-30 | 2012-03-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for producing a lipid particle, the lipid particle itself and its use |
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Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE456136B (sv) * | 1985-06-17 | 1988-09-12 | Oncholab Ab | Forfarande for framstellning av en med ett lipofilt biologiskt aktivt emne bemengd berare pa basis av rekonstituerat ldl (lagdensitetslipoprotein) |
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| US5128318A (en) * | 1987-05-20 | 1992-07-07 | The Rogosin Institute | Reconstituted HDL particles and uses thereof |
| DE3854940T2 (de) * | 1987-05-20 | 1996-07-11 | Rogosin Inst | Rekonstituierte hdl-teilchen und ihre verwendung |
| CA1335077C (en) * | 1988-02-08 | 1995-04-04 | Henri Isliker | Process for the manufacture of apolipoproteins from human blood plasma or serum |
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