PL185414B1

PL185414B1 - Sposób przemysłowego wytwarzania preparatu, zawierającego rekonstytuowane cząstki lipoproteinowe

Info

Publication number: PL185414B1
Application number: PL94306575A
Authority: PL
Inventors: Peter Lerch; Gerhard Hodler; Vreni Förtsch
Original assignee: Zlb Bioplasma Ag
Priority date: 1993-12-31
Filing date: 1994-12-29
Publication date: 2003-05-30
Also published as: ATE220072T1; FI946199A0; JPH07242699A; NO316762B1; EP0663407A1; CZ283620B6; KR950018039A; DK0663407T3; EP0663407B1; CZ329994A3; TW434253B; PL306575A1; CA2138925C; US5652339A; NO945101L; JP3553669B2; CA2138925A1; HU9403830D0; ES2179064T3; FI946199L

Abstract

1. Sposób przemyslowego wytwarzania preparatu, korzystnie w postaci liofilizatu, zawie- rajacego rekonstytuowane czastki lipoproteinowe i przy zawartosci protein równej 20 ± 2 g/l wykazujacego w temperaturze 20°C ± 2°C metnosc mniejsza od 40 NTU, przez zmieszanie lipoprotein z lipidami i detergentami oraz oddzielenie detergenta, znamienny tym, ze wodny roztwór apolipoproteinowy, wolny od rozpuszczalników organicznych, o stezeniu 1-40 g protein/l miesza sie z wodnym roztworem lipid-detergent, przy czym stosunek mo- lowy lipidu do detergenta miesci sie w zakresie od 1:0,5 do 1:4,0 a stosunek wagowy apo- lipoproteiny do lipidu miesci sie w zakresie od 1:1,5 do 1:5,0, otrzymana mieszanine apo- lipoproteina-lipid-detergent inkubuje sie nastepnie w wodzie w temperaturze z zakresu obejmujacego temperature przemiany fazowej lipidu ± 10°C, detergent oddziela sie droga zatrzymywania czastek wedlug wielkosci lub droga adsorpcji na adsorbencie na tyle, zeby tworzyly sie czastki proteina-lipid o srednicy 5-50 nm i o masie czasteczkowej 50000- 1000000, i ze otrzymuje sie ciekly produkt, który przy zawartosci protein równej 20 ± 2 g/l i w temperaturze 20°C ± 2°C wykazuje metnosc mniejsza od 40 NTU, i ten zawarty pro- dukt ewentualnie stabilizuje sie na drodze liofilizacji w obecnosci stabilizatora wybranego ze zbioru weglowodanów. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób przemysłowego wytwarzania preparatu, korzystnie w postaci liofilizatu, zawierającego rekonstytuowane cząstki lipoproteinowe (reconstituted High Density Lipoproteins; rHDL) i przy zawartości protein równej 20 ± 2 g/l wykazującego w temperaturze 20°C ± 2°C mętność mniejsza od 40 NTU, przez zmieszanie lipoprotein z lipidami i detergentami oraz oddzielenie detergenta. Te rHDL wykazują taką właściwość, że mogą one wiązać, przenosić lipidy i substancje lipidopodobne w ustroju i wywierać wpływ na ich aktywność. rHDL są zatem przydatne w rozmaite] profilaktyce i terapii chorób związanych z lipidami i substancjami lipopodobnymi.

Lipoproteiny z ludzkiej krwi mogą wypełniać szereg różnych funkcji. Dobrze zbadaną i znaną funkcją lipoprotein jest transport lipidów. Lipoproteiny mają właściwość wychwytywania lipidów nierozpuszczalnych w wodzie, przenoszenia ich w środowisku wodnym i dostarczania do ich miejsca docelowego. Od dłuższego czasu bada się bliżej poszczególne klasy lipoprotein w związku z zaburzeniami przemiany lipidowej. W większości zachodnich krajów można było za pomocą studiów epidemiologicznych wykazać pozytywną korelację między niedomogami krążenia wieńcowego a wysokim poziomem cholesterolu w osoczu lub wysokim poziomem LDL-cholesterolu (Low Density Lipoprotein - cholesterol) i negatywną korelację do wysokiego poziomu HDL lub wysokiego poziomu HDL-cholesterolu. Chociaż na rynku jest dostępny cały szereg medykamentów, wykazujących działanie obniżające poziom lipidów, to jednak do pomyślenia są pewne sytuacje, w których wskazane jest zastąpienie odpowiednich lipoprotein. W takich przypadkach wchodzą przede wszystkim w rachubę „dobre” lipoproteiny, takie jak HDL, albo cząstki HDL-podobne, takie jak z wyodrębnionych apolipoprotein i odpowiednich lipidów rekonstytuowane HDL (rHDL).

Obok lipidów, które wchłania się z pokarmem, mogą przez lipoproteiny być transportowane lub wiązane także inne lipidy lub substancje lipidopodobne. Dla przykładu mogą składniki obumarłych komórek zostać związane z lipoproteiną i wprowadzone w nową funkcję. Z lipoproteiną mogą związać się również lipidopodobne substancje, takie jak lipopolisacharyd (LPS). Lipopolisacharydy lub endotoksyny są składnikami błon bakterii Gramujemnych. W razie dostania się dostatecznie dużych ilości endotoksyn do krążenia może prowadzić to do wstrząsu posoczniczego lub nawet do zejścia. W następstwie związania LPS z lipoproteiną można zmodulować funkcję lub aktywność tego LPS. Na aktywność LPS można in vivo i in vitro wywierać poważny wpływ dodając lipoproteiny lub cząstki lipoproteinopodobne. I tak można wykazać, że in vivo dodanie rekonstytuowanego HDL może zahamować tworzenie się czynnika TNF (Tumomekrosisfaktor), ważnego mediatora posocznicy. In vivo można byłoby zatem na drodze dodawania HDL lub rHDL poważnie zmniejszyć objawy wstrząsu.

185 414

Oprócz wzajemnych oddziaływań lipoprotein lub rekonstytuowanych lipoprotein z lipidami lub substancjami lipidopodobnymi opisano też wzajemne oddziaływania lipoprotein z proteinami:

- lipoproteiny mogą wchodzić we wzajemne oddziaływania z poszczególnymi składnikami układu dopełniacza i dzięki temu wywierać wpływ na ich aktywność;

- znane są również składniki układu krzepnięcia, które można znaleźć we frakcji lipoprotein, tzn. są złączone z określonymi lipoproteinami;

- proteiny faz ostrych, takie jak surowica Amyloid A (SAA) zostały znalezione we frakcji HDL;

- i nadto można na drodze wstępnego traktowania lipoproteinami wywierać wpływ na adsorpcję pewnych protein na powierzchniach.

Drogą swoistego lub nieswoistego związania z komórkami lipoproteiny mogą jednak też wywierać wpływ na ich aktywność:

- zdolność aktywacji płytek można zmniejszyć drogą związania przez HDL lub stymulować drogą dodania LDL;

- monocyty i makrofagi mają również receptory dla lipoprotein;

związanie lub przyjęcie lipoprotein może prowadzić do zmian aktywności tych komórek;

- aktywność dalszych komórek układu immunologicznego, takich jak granulocyty obojętnochłonne, można zmodyfikować lub zmodulować również na drodze związania lipoprotein;

- nadto można też dzięki lipoproteinom wywierać wpływ na komórkowy wzrost komórek nowotworowych, ukazany na przykładzie komórek glyoblastoma.

W literaturze fachowej można jeszcze znaleźć doniesienia, które opisują wzajemne oddziaływania lipoprotein z czynnikami chorobotwórczymi (patogenami), dla przykładu lipoproteinom przypisuje się czynność przeciwmikrobową. Wykazano, że wirusy można dezaktywować za pomocą lipoprotein, albo na przykładzie świdrowców można wywierać wpływ bądź hamować pasożyty.

Przykłady te ukazują wielorakie możliwości zastosowania li-poprotein lub rHDL w profilaktyce i terapii.

Lipoproteiny dzieli się na 4 klasy główne: chylomikrony, są to cząstki, które głównie składają się z trój glicerydów i zwykle pojawiają się w dużych ilościach w osoczu tylko po posiłkach zawierających tłuszcz; pre-beta lipoproteiny (Very Low Density Lipoproteins, VLDL); beta-lipoproteiny (Low Density Lipoproteins, LDL); alfa-lipoproteiny (High Density Lipoproteins, HDL). Nazewnictwo wywodzi się z wyodrębniania tych lipoprotein za pomocą ultrawirowania. Metodą tą wyodrębnia się lipoproteiny tradycyjnie w gradiencie gęstości. Można stosować tę metodę tylko w skali laboratoryjnej, gdyż wymaga ona wielkich nakładów czasowych i aparaturowych. W najlepszym razie można tą drogą w ciągu kilku dni otrzymać kilka setek mg lipoprotein lub apolipoprotein. Inne metody wyodrębniania apolipoprotein lub lipoprotein są również od dawna znane; bazują one wielokroć na skracaniu za pomocą dwuwartościowych kationów i/lub np. glikolu polietylenowego lub dekstranu. Dalszą możliwością wyodrębniania apolipoprotein jest strącanie za pomocą frakcjonowania alkoholowego, takie jakie opisano w opisie patentowym nr EP 0 329 605 B1. Za pomocą tej ostatniej metody możliwe jest wyodrębnianie większych ilości apolipoproteiny A-I (apoA-I) lub frakcji wzbogaconych w apoA-I i postawienie do dyspozycji dla zastosowań terapeutycznych. Za pomocą tak wyodrębnionego apoA-I lub proteinowych frakcji wzbogaconych w apoA-I przeprowadzono szereg prób zarówno na zwierzętach jak i na ludziach. Na podstawie tych prób można było po pierwsze wykazać bezpieczeństwo tych produktów odnośnie wirusów, a także to, że apoA-I w stosowanej postaci nie prowadzi do jakichkolwiek znaczących reakcji ubocznych u ludzi i zwierząt. Za pomocą prób in vitro zresztą nie można było stwierdzić żadnej z żądanych aktywności, takich jak przenoszenie cholesterolu lub działanie apoA-I na takie komórki, jak granulocyty obojętnochłonne, makrofagi, monocyty lub płytki. W przypadku prób in vivo zarówno u zwierząt jak i u ludzi zaobserwowano bardzo krótki okres półtrwania apoA-I w osoczu. Z uwagi na masę cząsteczkową wolnej apoA-I (równą 28000) istnieje możliwość, że apoA-I będzie wydalane przez nerki. Istotnie można było w moczu królików stwierdzić obecność apoA-I. Wyniki te oznaczają, że tak wprowadzana apoA-I w dużej ilości nie

185 414 rozdziela się na żądaną frakcję lipoproteiny. Stąd też apoA-I będzie z powodu swego krótkiego okresu półtrwania in vivo mógł oddziaływać co najwyżej w ciągu bardzo krótkiego czasu. Odpowiedniejszą formą dawkowania jest zatem wprowadzanie apoA-I w lipoproteinie lub w cząstce lipoproteino-podobnej.

Metody wytwarzania rekonstytuowanych lipoprotein są opisane w literaturze fachowej, zwłaszcza dla apolipoprotein A-I, A-II, A-1 V, apoC i apoE (A. Jonas, Methods in Enzymology 128, 553-582 (1986)). Najczęstszym lipidem stosowanym do rekonstytucji jest fosfatydylocholina, wyekstrahowana z jaj lub z soi. Stosuje się również inne fosfolipidy, tak samo lipidy jak i trójglicerydy lub cholesterol. W celu rekonstytucji lipidy najpierw rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, który następnie odparowuje się w atmosferze azotu. W tym postępowaniu lipid wiąże się cienką błoną na ściance szklanej. Następnie dodaje się apolipoproteinę i detergent, zwykle cholan sodowy, i miesza się. Dodany cholan sodowy powoduje zdyspergowanie lipidów. Po upływie odpowiedniego czasu inkubacji mieszaninę w obecności dużych ilości buforu poddaje się dializie w ciągu dłuższego okresu; przy tym po pierwsze usuwa się większą część cholanu sodowego i równocześnie lipidy i apolipoproteiny samorzutnie zbijają się w lipoproteiny lub w tak zwane rekonstytuowane lipiproteiny. Alternatywą dla dializy są hydrofobowe adsorbenty, które mogą adsorbować specyficzne detergenty (BioBeads sM-2, Bio Rad; Amberlite XAD-2, firmy Rohm & Haas) (E.A. Bonomo, J.B. Swaney, J.Lipid Res. 29, 380-384 (1988)), albo oddzielanie detergentów za pomocą chromatografii żelowej. Lipoproteiny można też wytwarzać bez detergentów, przykładowo na drodze inkubacji wodnej zawiesiny odpowiedniego lipidu z apolipoproteinami, dodawania lipidu, rozpuszczonego w rozpuszczalniku organicznym, do apolipoprotein, z lub bez dodatkowego ogrzewania tej mieszaniny, albo na drodze traktowania mieszaniny apoA-I/lipid ultradźwiękami. Metodami tymi można z wyjściowych np. apoA-I i fosfatydylocholiny otrzymywać cząstki w postaci krążków, które odpowiadają lipoproteinom in statu nascendi. Po tej inkubacji zwykle niezwiązane apolipoproteiny i wolny lipid następnie oddziela się za pomocą odwirowania lub chromatografii żelowej w celu wyodrębnienia jednorodnych cząstek rekonstytuowanej lipoproteiny.

W opisie US-A-5 128 318 omówiono sposób wytwarzania rekonstytuowanego HDL, w którym fosfatydylocholinę za pomocą rozpuszczalnika organicznego przeprowadza się w roztwór.

Omówione wyżej metody wytwarzania rekonstytuowanych lipo-protein są odpowiednie w skali laboratoryjnej tylko dla mniejszych ilości rzędu od kilku miligramów do co najwyżej paru gramów:

- wysokie rozcieńczenia roztworów w produktach pośrednich uniemożliwiają przeróbkę tych mieszanin w żądanym czasie;

- zwykle nie istnieje infrastruktura dla tych dużych objętości;

- stosowane rozpuszczalniki organiczne są tylko warunkowo nieszkodliwe dla środowiska;

- produkty końcowe nie nadają się do składowania:

- stężenie produktów końcowych jest zbyt małe, objętości wprowadzane pacjentom byłyby zbyt duże;

- produkty te muszą zwykle być oczyszczane dalej, przykładowo drogą chromatografii żelowej w celu oddzielenia lipidu lub niezwiązanej proteiny od cząstki rHDL.

Nadto przez A. Hubsch'a i współpracowników w Circulatory Shock 40, 14-23 (1993) jest opisany sposób wytwarzania rekonstytuowanych lipoprotein, w którym stosuje się relację apolipoproteiny do lipidu równą 1:200. Następstwem tego postępowania jest to, że otrzymany produkt wykazuje znaczną część wolnego lipidu, co niekorzystnie wypływa na możliwość jego terapeutycznego stosowania.

W celu terapeutycznego lub profilaktycznego zastosowania rHDL u ludzi są na dawkę niezbędne ilości rHDL rzędu grama, by osiągnąć wyraźne zwiększenie poziomu-apoA-I lub HDL w osoczu. Opłacalna produkcja rHDL dla zastosowań klinicznych w skali kilogramów lub w skali jeszcze większej nie jest za pomocą wyżej omówionych metod możliwa.

Celem wynalazku jest zatem opracowanie takiego sposobu wytwarzania preparatu, zawierającego rHDL, który byłby wolny od wyżej omówionych uciążliwości i którego produkt

185 414 w szczególności nie zawierałby żadnych większych udziałów wolnego lipidu lub wolnej apoA-I. Zamierzeniem jest postawienie do dyspozycji sposobu, który mógłby być przeprowadzany bez dodawania rozpuszczalników organicznych.

Stwierdzono, że rekonstytuowane HDL (rHDL) można z apolipoprotein i lipidów wytwarzać nieskomplikowanym i szybkim sposobem nadającym się do stosowania w skali przemysłowej.

Sposób przemysłowego wytwarzania preparatu, korzystnie w postaci liofilizatu, zawierającego rekonstytuowane cząstki lipoproteinowe i przy zawartości protein równej 20 ± 2 g/l wykazującego w temperaturze 20°C ± 2°C mętność mniejszą od 40 NTU (Nephelo-metric Turbidity Unit + nefelometryczna jednostka mętności), przez zmieszanie lipoprotein z lipidami i detergentami oraz oddzielenie detergenta, polega według wynalazku na tym, że wodny roztwór apolipoproteinowy, wolny od rozpuszczalników organicznych, o stężeniu 1-40 g protein/l miesza się z wodnym roztworem lipid-detergent, przy czym stosunek molowy lipidu do detergenta mieści się w zakresie od 1:0,5 do 1:4,0 a stosunek wagowy apolipoproteiny do lipidu mieści się w zakresie od 1:1,5 do 1:5,0, otrzymaną mieszaninę apolipoproteina-lipiddetergent inkubuje się następnie w wodzie w temperaturze z zakresu obejmującego temperaturę przemiany fazowej lipidu ±10°C, detergent oddziela się drogą zatrzymywania cząstek według wielkości lub drogą adsorpcji na adsorbencie na tyle, żeby tworzyły się cząstki proteinalipid o średnicy 5-50 nm i o masie cząsteczkowej 50000-1000000, i że otrzymuje się ciekły produkt, który przy zawartości protein równej 20 ± 2 g/l i w temperaturze 20°C i 2°C wykazuje mętność mniejszą od 40 NTU, i ten zawarty produkt ewentualnie stabilizuje się na drodze liofilizacji w obecności stabilizatora wybranego ze zbioru węglowodanów, takiego jak sacharoza lub mannit.

Korzystnie oddzielanie detergenta poprzez zatrzymywanie cząstek według wielkości następuje drogąultrafiltracji, przy czym stosuje się co najwyżej 2 l buforu na 1 g proteiny.

Po inkubacji mieszaniny lipid-apolipoproteina-detergent korzystnie wiąże się detergent za pomocą adsorpcji na hydrofobowym adsorbencie albo drogą okresowej adsorpcji albo drogą postępowania kolumnowego.

Jako adsorbent hydrofobowy korzystnie stosuje się nierozpuszczalny, usieciowany kopolimer polistyrenowy.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się roztwór lipid-detergent, zawierający fosfolipidy, cholesterol, estry cholesterolu, kwasy tłuszczowe i/lub trójglicerydy.

Jako apolipoproteinę korzystnie stosuje się wzbogaconą w apolipoproteinę A-I frakcję ludzkiego osocza, którą traktowano na drodze co najmniej jednego etapu dezaktywacji wirusów, za pomocą inkubacji w wodnym roztworze substancji chaotropowej i koleino następującego przebuforowania w roztwór o mocy jonowej mniejszej niż 50 mmoli/l, po czym więcej niż 70% wagowych lipoproteiny występuje w postaci monomerycznej.

Korzystnie stosuje się roztwór lipid-detergent, zawierający jako składnik lipidowy fosfolipidy.

Jako fosfolipid korzystnie stosuje się syntetyczną fosfatydylocholinę.

Jako fosfolipid też korzystnie stosuje się naturalny fosfolipid, korzystnie fosfolipid wyekstrahowany z soi lub jaj.

Dalej jako fosfolipid korzystnie stosuje się fosfatydylocholinę sojową, a inkubację mieszaniny apolipoproteina-lipid-detergent prowadzi się w temperaturze 0-15°C.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się detergent wybrany ze zbioru obejmującego kwasy żółciowe lub z jednej z ich soli.

Jako detergent korzystnie stosuje się sól sodową kwasu cholowego lub sól sodową kwasu dezoksycholowego.

Poza tym w sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się wodny roztwór apolipoproteinowy, który jako apolipoproteiny zawiera rekombinantowe apolipoproteiny, apolipoproteiny ze wzbogaconej w apolipoproteinę A-I frakcji osocza ludzkiego, fragmenty apolipoprotein albo odpowiednie naturalne, syntetyczne lub rekombinantowe polipeptydy o właściwościach amfipatycznych.

185 414

Po inkubacji mieszaniny lipid-apolipoproteina-detergent korzystnie obniża się zawartość detergenta za pomocą dializy lub diafiltracji do stężenia poniżej 0,5 g detergenta na 1 g proteiny.

Przed lub po oddzieleniu detergenta korzystnie podwyższa się stężenie proteiny za pomocą diafiltracji do 10-50 g/l.

Wodny roztwór apolipoproteinowy lub roztwór lipid-detergent korzystnie poddaje się działaniu buforu przy wartości pH w zakresie pH=6-9.

Wodny roztwór apolipoproteinowy lub roztwór lipid-detergent szczególnie korzystnie poddaje się działaniu buforu przy wartości pH w zakresie pH=7,5-8,5.

W przypadku wytwarzania liofilizatu produkt korzystnie nastawia się na stężenie protein równe 5-50 g/l, a liofilizację roztworu w celu stabilizacji produktu prowadzi się w obecności 5-15% wagowych dwusacharydu, takiego jak sacharoza, lub 2-10% wagowych monosacharydu, takiego jak mannit.

Stosowanymi apolipoproteinami są rekombinantowe apolipoproteiny, apolipoproteiny ze wzbogaconej w apolipoproteine A-I frakcji osocza ludzkiego, fragmenty apolipoprotein albo odpowiednie naturalne, syntetyczne lub rekombinantowe polipeptydy o właściwościach amfipatycznych. Fragmenty apolipoprotein są otrzymywane drogą chemicznej lub enzymatycznej reakcji fragmentacji naturalnych lub syntetycznych apolipoprotein. Przykładem chemicznej reakcji fragmentacji jest traktowanie bromocyjanem. W enzymatycznym rozszczepianiu stosuje się przykładowo trypsynę lub chymotrypsynę.

Stosowany w sposobie według wynalazku roztwór lipid-detergent zawiera jako lipid przykładowo fosfolipid, który może pochodzić z soi lub z jaj, cholesterol, estry cholesterolu, kwasy tłuszczowe lub trój glicerydy. Detergentami są korzystnie kwasy żółciowe lub ich sole, np. sól sodowa kwasu cholowego lub sól sodowa kwasu dezoksycholowego. W celu solubilizacji lipidów nie są przy tym potrzebne żadne rozpuszczalniki organiczne.

Podana w opisie wynalazku wartość temperatury 20 ± 2°C obejmuje wszystkie wartości mieszczące się w zakresie od 18°C do 22°C. Zawartość protein 20 ± 2 g/l obejmuje wszystkie stężenia w zakresie od 18 g/l do 22 g/l. Określenie „temperatura przemiany fazowej ± ^0°C” obejmuje wszystkie wartości temperatury, które mieszczą się w przedziale wyznaczonym przez temperaturę niższą o 10°C od temperatury przemiany fazowej odpowiedniego lipidu w środowisku wodnym i przez temperaturę wyższą o 10°C od tej wartości charakterystycznej dla lipidu. Wartości te mieszczą się w zakresie od -5°C do 50°C.

Korzystnym materiałem wyjściowym są lipoproteiny, pochodzące z osocza ludzkiego, które za pomocą odpowiednich metod są pod względem wirusów zdezaktywowane, np. są pasteryzowane. Powstające w tym procesie, zdenaturowane proteiny (agregaty) poddaje się następnie renaturacji na drodze inkubacji wobec odczynu o słabo zasadowym pH i w lekko podwyższonej temperaturze w obecności składnika chaotropowego, takiego jak mocznik lub chlorowodorek guanidyny, tak więc po przebuforowaniu proteiny do 10 mM NaCl występuje > 70% apoA-I w postaci monomerycznej (oznaczanie za pomocą analitycznej Size Exclusion Chromatography: 40 g apoA-I wprowadzano na kolumnę TSK G3000SW Ultropac (LKB), w 10 mM fosforanu sodowego, 0,029: azydku sodowego, pH=7,5, wobec napływu 0,4 ml/min; pomiar eluatu przy 280 run).

W dalszym sposobie lipoproteiny o wysokim stężeniu, zmieszane z roztworem lipidów (fosfolipidów, takich jak fosfatydylocholina, cholesterolu, trójglicerydu itd.) miesza się w roztworze kwasów żółciowych lub ich soli (np. cholanu, dezoksycholanu, ur-sodezoksycholanu), przy czym można zrezygnować ze stosowania rozpuszczalników organicznych. W przeciwieństwie do prac Hubsch'a i współpracowników (porównaj Circulatory Shock 40, 14-23 (1993)), dobiera się stosunek apolipoprotein do lipidu tak, żeby w produkcie końcowym nie znalazły się ani większe ilości wolnego lipidu ani wolna apolipoproteina, tak więc żeby można było zrezygnować z dalszego oczyszczania rHDL. W szczególności zmniejsza się stosunek apoA-I:PC, który zasadniczo plasuje się poniżej 1:200 (M:M; stosunek wagowy około 1:5,5), mianowicie do stosunku w zakresie od 1:50 do 1:180, korzystnie od 1:100 do 1:150 (stosunek molowy; odpowiada stosunkowi wagowemu od 1:2,8 do 1:4,2 dla apoA-I i PC (fosfatydylocholiny) z soi). To, połączone z metodą diafiltracji, prowadzi do produktu

185 414 o mniejszej zawartości lipidów (kwantyfikowanego za pomocą Size Exclusion Chromatography; chromatografia żelowa za pomocą Superose 6; patrz niżej), i równocześnie do poważnie niższego stężenia kwasów żółciowych w produkcie końcowym; oba: wysokie stężenie kwasu żółciowego i wysoka zawartość wolnej PC mogą in vitro i in vivo prowadzić do uszkodzeń komórek i dlatego muszą być dokładnie kontrolowane. Stężenie cholanu po pierwsze optymalizuje się ze względu na stosunek apoA-I:PC i na wszelki wypadek dopasowuje się równocześnie do dalszych dodatków lipidu, zwłaszcza cholesterolu. Również tu optymalne stężenie określano przez możliwie mały udział wolnego lipidu i wolnej apoA-I w produkcie końcowym; dla preparatu-rHDL o stosunku apoA-I:PC równym 1:150 znaleziono stosunek molowy cholanu sodowego równy 1:200 (tzn. apoA-I:PC:cholan sodowy = 1:150:200 (M:M:M), podczas niżej omówionej inkubacji). Po inkubacji w ciągu 4-16 godzin w temperaturze 0-2°C (dla PC z soi) obniża się stężenie kwasu żółciowego za pomocą diafiltracji z membraną ultrafiltracyjnąo wielkości porów dla protein globulamych o masie cząsteczkowej 1000-100000, korzystnie poniżej 30000. Potrzebny w tym celu bufor wykazuje niską moc jonową poniżej 100 mmolEl, korzystnie poniżej 10 mmoli/l, przy pH powyżej 6, korzystnie przy pH=7,5-9, i zawartość cukru przykładowo 1% sacharozy; w warunkach tych wystarcza od 1 do co najwyżej 2 litrów buforu na 1 g wprowadzonej proteiny, aby osiągnąć po pierwsze potrzebne niskie stężenie detergenta, a po drugie żądany podział wielkości cząstek; te objętości buforu są wielokrotnie (10-200x) mniejsze niż we wcześniej opisanych metodach. W razie potrzeby stężenie detergenta w dodatkowym etapie adsorpcji za pomocą żywicy jonowymiennej o nazwie Amberlite nastawia się na żądane stężenie. Za pomocą wyżej wspomnianej technologii diafiltracji produkt nastawia się na wysokie stężenie 10-50 g proteiny/l i następnie w obecności stabilizatora, takiego jak sacharoza, przetwarza się do postaci stabilnego, nadającego się do składowania produktu końcowego (ciekłego lub liofilizowanego). Liofilizat ten przed zastosowaniem rozcieńcza się wodą, przy czym otrzymuje się klarowny, ewentualnie opalizujący roztwór, który w zależności od zawartości lipidów jest zabarwiony słabo żółto. W roztworze tym można było cząstki rHDL (dyski, krążki), zmierzone po wytwarzaniu, ponownie wykryć w praktycznie niezmienionej postaci; za pomocą chromatografii żelowej (Size Exclusion Chromatography) stwierdza się udział <10% agregatów (największa część wolnego lipidu) i udział < 5% wolnej apolipoproteiny. Mętność, oznaczona w ciekłym produkcie przed lub po liofilizacji, plasuje się przy stężeniu protein równym 20 g/l poniżej 40 NTU (Nephelometric Turbidity Unit -nerelometryczna jednostka mętności). Zawartość cholanu, zmierzona enzymatycznym testem barwnym, jest mniejsza od 0,5 g cholanu sodowego/g proteiny (oznaczanie kwasu żółciowego następuje poprzez utworzenie NADH w obecności NAD' za pomocą dehydrogenazy tego 3-a-hydroksysteroidu; utworzony NADH reaguje z błękitem nitrotetrazoliowym wobec katalitycznego działania diaforazy, tworząc błękitną pochodną formazanową, którą oznacza się fotometrycznie).

Liofilizowane rHDL w przypadku obserwacji w mikroskopie elektronowym po wywołaniu w odpowiedniej objętości rozpuszczalnika, korzystnie wody, występują jako cząstki o postaci krążków, analogicznie do HDL in statu nascendi, wykazujące średnicę 5-50 nm, zwykle 8-20 nm, i grubość 2-6 nm. Według analitycznych metod oznaczania wielkości cząstek i ich relatywnego podziału, przykładowo według chromatografii żelowej (Size Exclusion Chromatography) w fizjologicznym buforze w kolumnie Superose 6 HR 10/30 (firmy Pharmacia Biotech) więcej niż 80% tych cząstek występuje w przedziale masy cząsteczkowej 100000-1000000. Również przy więcej niż 80% cząstek, w oparciu o gradientową elektroforezę żelową (metoda według A.V. Nichols' a i współpracowników, Methods in Enzymology 128, 417-431(1986)), występuje podział masy cząsteczkowej w zakresie 50000-1000000.

Figura przedstawiona na rysunku służy lepszemu zrozumieniu wynalazku i uzasadnieniu powyższych wywodów; ukazuje ona wykres elucji (diagram absorpcja-czas elucji) chromatografii żelowej cząstek rHDL, wytworzonych dzięki zastosowaniu różnych stosunków apoA-I do fosfatydylocholiny (stosunków apolipoproteiny do lipidu). [High Performance Exclusion Chromatography cząstek apoA-I i rHDL; rozdzielanie 200 g rHDL w 100 l 0,9% NaCl w kolumnie Superose 6 HR 10/30 (firmy Pharmacia Biotech) w PBS (10 mM fosforanu sodowego, 150 mM NaCl, pH=7,4) z napływem 0,5 ml/min]. Absorpcję eluatu z kolumny

185 414 mierzono przy 280 nm (L.L. Rudel, C.A. Marzetta i F.L. Johnson, Methods in Enzymology 129,45-57(1986)); dla określenia zawartości poszczególnych frakcji na chromatogramie oblicza się powierzchnie pod krzywą. W przypadku krzywej elucji produktu-1: 200 jest widoczne, że na początku elucji wymywa się wolne lipidy, natomiast nie zachodzi to w przypadku produktów-1:100 i -1:150. Dla porównania podano również krzywą czystej apolipoproteiny (apoA-I).

Podane niżej przykłady objaśniają bliżej sposób według wynalazku, nie ograniczając jego zakresu.

Przykład I. 1kg apoA-I rozpuszczono w 500 l 0,15 mol/l NaCl. Roztwór lipidowy sporządzono odrębnie w następujący sposób: fosfatydylocholinę z soi (o nazwie Phospholipon 90, firmy Natterman, Kolonia) rozpuszczono w buforze, składającym się z 10 mmoli/l Tris/HCl, 150 mmoli/l NaCl, 1 mmoli/1 EDTA, pH-8,0. 2,8 kg fosfatydylocholiny i 2,325 g soli sodowej kwasu cholowego rozpuszczono w tym buforze, tworząc objętość 100 l. Dalej mieszano w ciągu 1-2 godzin, i w razie potrzeby podgrzano do około 10°C, aż roztwór stał się klarowny. Następnie ochłodzono do temperatury 4°C i 100 l tego roztworu lipid-cholan zmieszano z 1 kg apoA-I w 500 l. Mieszaninę tę w temperaturze 2-4°C wolno mieszano w ciągu nocy. Po tej inkubacji przesączono sterylnie i w temperaturze 4°C poddano diafiltracji w układzie ultrafiltracyjnym o nazwie Pellicon, firmy Millipore, za pomocą filtracyjnych kaset-PTGC [nominał molecular weight limit (NMWL)= 10000], dalej za pomocą 4 objętości 5 mmoli/1 wodorowęglanu sodowego i następnie za pomocą 2 objętości 10% sacharozy, przy czym utrzymywano stałą objętość produktu. Stężenie następnie podwyższano powoli, aż osiągnięto stężenie proteiny 20 g/l. Roztwór ten ponownie przesączono sterylnie i napełniono nim flakony, po czym poddano liofilizacji. Podczas całego procesu zważano na to, żeby zwłaszcza roztwór lipidowy był zabezpieczony przed powietrzem, światłem i zbyt wysoką temperaturą. Produkt końcowy, rozpuszczony w odpowiedniej ilości wody, dał w wyniku stężenie protein równe 20 2 g/l, wykazał molowy stosunek apoA-I do fosfatydylocholiny równy 1:100 (mol:mol) oraz mniej niż 5% wolnego lipidu, nie wykrywalna zawartość wolnej proteiny i mętność mniejszą niż 40 NTU.

Przykład II. 10 kg apoA-I rozprowadzono w 2000 l 10 mmoli/l NaCl. 1,38 kg cholesterolu i 29,9 kg soli sodowej kwasu cholowego mieszano w 200 l buforu, zawierającego 10 mmoli/l Tris-HCl, 150 mmoli/l chlorku sodowego i 1 mmol/l EDTA, przy pH=8,0. Temperaturę podwyższono do 65 °C i mieszaninę tę mieszano w ciągu 2 godzin, aż roztwór stał się klarowny. Następnie ochłodzono do temperatury 20°C i dodano 27,9 kg fosfatydylocholiny. Roztwór ten ochłodzono do temperatury 4°C i mieszano w ciągu 2 godzin. Mieszaninę tę dodano do roztworu proteinowego, mieszano, po czym przesączono sterylnie. Przesącz powoli mieszano w temperaturze 4°C w ciągu nocy (co najmniej 16 godzin). Następnie prowadzono diafiltrację za pomocą 4 objętości 50 mmoli/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA przy pH 7,5 w ciągu 24 godzin. Dalszą diafiltrację prowadzono za pomocą 2 objętości 10% sacharozy. Roztwór ten zatężono następnie do stężenia protein równego 20 g/l, przesączono sterylnie, napełniono nim flakony i poddano liofilizacji. Flakony zamknięto pod próżnią i przechowywano w temperaturze 4°C w ciemności. Za pomocą tej metody otrzymano rHDL o stosunku molowym apoAI:fosfatydylocholina:cholesterol równym 1:100:1.

Przykład III. Wytwarzanie rHDL o stosunku apoA-L:fosfatydylocholina równym

1:150

3,08 kg cholanu sodowego rozpuszczono w 25 l buforu, składającego się z 10 mmoli/l Tris-HCl, 10 mmoli/l NaCl i 1 mmol/l EDTA, przy pH=8,0. W tym w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej rozpuszczono dalej 4,2 kg fosfatydylocholiny. Następnie dodano 1 kg apoA-I w 200 i 10 mmoli/l NaCl i mieszaninę tę inkubowano w ciągu nocy w temperaturze 0-4°C. Po tym przy stałej objętości produkt poddano diafiltracji wobec 2 objętości 1% sacharozy. Wreszcie zatężono do stężenia protein 20 g/l. Stężenie sacharozy podwyższono do 10%, dodając stałą sacharozę. Roztwór przesączono sterylnie i poddano liofilizacji.

Przykład IV. Wytwarzanie rHDL o stosunku apoA-I:fosfatydylocholina: cholesterol równym 1:100:10

185 414

4,61 kg cholanu sodowego rozpuszczono w 25 l buforu, zawierającego 10 mmoli/l TrisHCl, 10 mmoli/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, przy pH=8,0. 138 g cholesterolu rozpuszczono w temperaturze 65°C w ciągu 2 godzin w tej mieszaninie cholan-bufor. Następnie ochłodzono do temperatury pokojowej i w tym w ciągu 1 godziny rozpuszczono 2,8 kg fosfatydylocholiny. Dodano 1 kg apoA-I w 200 l 10 mmoli/l NaCl. Inkubację, diafiltrację i zatężanie przeprowadzono analogicznie do poprzedniego przykładu.

Przykład V. Produkt o stosunku apoA-I:PC:cholesterol równym 1:150:10

5,38 kg cholanu sodowego rozpuszczono w buforze, analogicznie do przykładów III i IV.W tym rozpuszczono 180 g cholesterolu w temperaturze 65°C w ciągu 2 godzin. Następnie dodano 4,2 kg PC i rozpuszczono w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszaninę tę dodano do 200 l roztworu o stężeniu 5 g apoA-I na 1 litr w 10 mmoli/l NaCl i inkubowano w temperaturze 4°C w ciągu nocy. Diafiltrację i wytwarzanie produktu końcowego przeprowadzono analogicznie do przykładów III i IV.

Przykład VI. Wytwarzanie rHDL o niskiej zawartości cholanu sodowego

Wytwarzanie rHDL przeprowadzono analogicznie do przykładów I-V. Po diafiltracji i zatężeniu zmieszano 1 objętość roztworu z żywica jonowymienną na osnowie polimerycznej o nazwie Amberlite XAD-2 firmy Rohm & Haas (2 objętości) i mieszaninę tę w warunkach ostrożnego poruszania inkubowano w ciągu 1 godziny w temperaturze 4°C. Po tej inkubacji rHDL odsączono, przesączono sterylnie i poddano liofilizacji analogicznie do przykładów I-V.

Przykład VII. 400 g apoA-I w 80 ml 10 mmoli/l NaCl zmieszano z roztworem lipidowym, składającym się z 1,66 kg fosfatydylocholiny, 1,23 kg cholanu sodowego w buforze, analogicznie do przykładów III-VI. Mieszaninę tę inkubowano w ciągu 16 godzin w temperaturze 0-2°C. Następnie przeprowadzono diafiltrację za pomocą 4 objętości EDTA (0,1 mmoli/l), po czym za pomocą 2-4 objętości sacharozy (1%) i wreszcie zatężono do stężenia proteiny równego 21-25 g/l. Roztwór-rHDL nastawiono na końcowe stężenie 10 sacharozy i 20 g/l proteiny. Przesączono go sterylnie, napełniono nim porcje po 50 g (1 g rHDL w 100 ml flakonie) i poddano liofilizacji.

Przykład VIII. Z 980 kg ze strącania wstępnego IV (Kistler, P., Nitschman, H.; Vox Sang. 7, 414-424 (1962)) uzyskano na drodze etanolowego strącania 11,2 kg osadu apoA-I. Przeprowadzono go w stan zawiesiny w trzykrotnej ilości 4 molowego roztworu chlorowodorku guanidyny. Odczyn nastawiono na pH=5,2 i poddano pasteryzacji w ciągu 10 godzin w temperaturze 60°C. Przy pH=7,5 w temperaturze 45°C proteina przeszła do roztworu. Po filtrowaniu klarującym nastąpiła za pomocą 10 mM roztworu chlorku sodowego zmiana buforu na drodze chromatografii żelowej (Sephadex G25, firmy Pharmacia Biotech). Otrzymano 160 kg roztworu-apoA-I o łącznie 1040 g ApoA-I. Ten roztwór proteinowy inkubowano wraz z roztworem lipidowym w ciągu 2-16 godzin w temperaturze 0-2°C. Roztwór lipidowy wytworzono odrębnie w temperaturze pokojowej w sposób omówiony niżej.

Fosfatydylocholinę z oleju sojowego rozpuszczono w buforze, składającym się z 10 mmoii/1 Tris-HCl, 10 mmoli/l NaCl, 1 mmol/l H eDtA, pH=8,0. W 26 kg tego buforu rozpuszczono 3203 g cholanu sodowego i 4460 g fosfatydylocholiny. Podczas kolejno następującej diafiltracji (NMWL= 10000) zatężono najpierw mieszaninę proteina-lipid do zawartości proteiny równej 7 g/l. Po tym przeprowadzono diafiltrację wobec 1%o-owego roztworu sacharozy, aż do osiągnięcia zawartości cholanu mniejszej niż 4 g/l. Przy tym zawsze utrzymywano odczyn o wartości pH co najmniej 7,5. Ostatecznie roztwór zatężono do wartości 25 g/l proteiny i stabilizowano sacharozą. Produkt końcowy zawierał 20 g/l apoA-I i 100 g/l sacharozy. W próbie Size Exclusion Chromatography znaleziono mniej niż 5% wolnego lipidu i mniej niż 1% wolnej apoA-I. Mieszaninę proteina-lipid przesączono sterylnie, napełniono nią porcje po 50 ml i poddano liofilizacji. Produkt końcowy, rozpuszczony w odpowiedniej ilości wody wykazywał stosunek molowy apoA-I:fosfatydylocholina równy 1:140 (mokmol) i zawartość soli sodowej kwasu cholowego 0,25 g/g proteiny.

185 414

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 60 egz Cena 4.00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób przemysłowego wytwarzania preparatu, korzystnie w postaci liofilizatu, zawierającego rekonstytuowane cząstki lipoproteinowe i przy zawartości protein równej 20 ± 2 g/l wykazującego w temperaturze 20°C ± 2°C mętność mniejszą od 40 NTU, przez zmieszanie lipoprotein z lipidami i detergentami oraz oddzielenie detergenta, znamienny tym, że wodny roztwór apolipoproteinowy, wolny od rozpuszczalników organicznych, o stężeniu 1-40 g protein/l miesza się z wodnym roztworem lipid-detergent, przy czym stosunek molowy lipidu do detergenta mieści się w zakresie od 1:0,5 do 1:4,0 a stosunek wagowy apolipoproteiny do lipidu mieści się w zakresie od 1:1,5 do 1:5,0, otrzymaną mieszaninę apolipoproteina-lipiddetergent inkubuje się następnie w wodzie w temperaturze z zakresu obejmującego temperaturę przemiany fazowej lipidu ± 10°C, detergent oddziela się drogą zatrzymywania cząstek według wielkości lub drogą adsorpcji na adsorbencie na tyle, żeby tworzyły się cząstki proteinalipid o średnicy 5-50 nm i o masie cząsteczkowej 50000-1000000, i że otrzymuje się ciekły produkt, który przy zawartości protein równej 20 ± 2 g/l i w temperaturze 20°C ± 2°C wykazuje mętność mniejszą od 40 NTU, i ten zawarty produkt ewentualnie stabilizuje się na drodze liofilizacji w obecności stabilizatora wybranego ze zbioru węglowodanów'.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oddzielanie detergenta poprzez zatrzymywanie cząstek według wielkości następuje drogąultrafiltracji, przy czym stosuje się co najwyżej 2 l buforu na 1 g proteiny.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po inkubacji mieszaniny lipidapolipoproteina-detergent wiąże się detergent za pomocą adsorpcji na hydrofobowym adsorbencie albo drogą okresowej adsorpcji albo drogą postępowania kolumnowego.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako adsorbent hydrofobowy stosuje się nierozpuszczalny usieciowany kopolimer polistyrenowy.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roztwór lipid-detergent, zawierający fosfolipidy, cholesterol, estry cholesterolu, kwasy tłuszczowe i/lub trójglicerydy.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako apolipoproteinę stosuje się wzbogaconą w apolipoproteinę A-I frakcję ludzkiego osocza, którą traktowano na drodze co najmniej jednego etapu dezaktywacji wirusów, za pomocą inkubacji w wodnym roztworze substancji chaotropowej i kolejno następującego przebuforowania w roztwór o mocy jonowej mniejszej niż 50 mmoli/l, po czym więcej niż 70% wagowych lipoproteiny występuje w postaci monomerycznej.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roztwór lipid-detergent, zawierający jako składnik lipidowy fosfolipidy.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako fosfolipid stosuje się syntetyczną fosfatydylocholinę.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako fosfolipid stosuje się naturalny fosfolipid, korzystnie fosfolipid wyekstrahowany z soi lub jaj.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako fosfolipid stosuje się fosfatydylocholinę sojową, a inkubację mieszaniny apoli-poproteina-lipid-detergent prowadzi się w temperaturze 0-15°C.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się detergent wybrany ze zbioru obejmującego kwasy żółciowe lub z jednej z ich soli.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako detergent stosuje się sól sodową kwasu cholowego lub sól sodową kwasu dezoksycholowego.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się wodny roztwór apolipoproteinowy, który jako apolipoproteiny zawiera rekombinantowe apolipoproteiny, apolipoproteiny ze wzbogaconej w apolipoproteinę A-I frakcji osocza ludzkiego, fragmenty apolipo185 414 protein albo odpowiednie naturalne, syntetyczne lub rekombinantowe polipeptydy o właściwościach amfipatycznych.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po inkubacji mieszaniny hipidapolipoproteina-detergent obniża się zawartość detergenta za pomocą dializy lub diafiltracji do stężenia poniżej 0,5 g detergenta na 1 g proteiny.
15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed lub po oddzieleniu detergenta podwyższa się stężenie proteiny za pomocą diafiltracji do 10-50 g/l.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wodny roztwór apolipoproteinowy lub roztwór lipid-detergent poddaje się działaniu buforu przy wartości pH w zakresie pH=6-9.
17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wodny roztwór apolipoproteinowy lub roztwór lipid-detergent poddaje się działaniu buforu przy wartości pH w zakresie pH=7,5-8,5.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania liofilizatu produkt nastawia się na stężenie protein równe 5-50 g/l, a liofilizację roztworu w celu stabilizacji produktu prowadzi się w obecności 5-15% wagowych dwusacharydu, takiego jak sacharoza, lub 2-10% wagowych monosacharydu, takiego jak mannit.