JP3577110B2 - ACAT inhibitor - Google Patents

Description

【００１０】
で表されるオストールであることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち本発明は、オストールを有効成分とするＡＣＡＴ阻害剤に係るものである。
【００１２】
また、本発明は、蛇床子の抽出エキスを有効成分とするＡＣＡＴ阻害剤に係るものである。
【００１３】
本発明に使用されるオストールとしては、その由来に特に制限はなく、天然由来、全合成品、半合成品を問わずいずれも利用できる。
【００１４】
オストール起源として植物を利用する場合、オストールを含有する植物としては、例えばセリ科ハマゼリ属の植物が挙げられ、特に中国産オカゼリ（蛇床：Ｃｎｉｄｉｕｍ ｍｏｎｎｉｅｒｉ）の果実（蛇床子）が好適に用いられる。
【００１５】
オカゼリ（蛇床）は中国東北部原産でモンゴル、シベリア、ウスリー、朝鮮半島に分布する越年草であり、その果実を採取して乾燥したものを蛇床子と呼んでいる。蛇床子は消炎、収れん、強精等の目的で古来用いられている漢方薬であり、そのエキスには抗トリコモナス作用、性ホルモン様作用等が報告されている。しかし、そのＡＣＡＴ阻害作用については全く報告されていない。
【００１６】
蛇床子からの抽出エキスないしオストールの採取は、例えば以下のようにして行われる。まず抽出エキスは、蛇床子をメタノール、エタノール、アセトン等の極性有機溶媒で抽出し、得られた抽出液を減圧濃縮することにより得られる。ここで、この抽出エキスをそのままＡＣＡＴ阻害剤に使用することもできるが、必要に応じて以下のように精製し、各段階の精製物をＡＣＡＴ阻害剤に使用することもできる。抽出エキスの精製は、例えばまず抽出エキスをエーテルと水とで振り分け、このエーテル層を濃縮してシリカゲルカラムに重層し、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（１：１）、酢酸エチル、メタノールの４種の溶媒で順次溶出することによって活性成分の分画を行う。次いで、溶出液の活性画分を減圧乾固することにより粗活性物質が得られる。これを高速液体クロマトグラフィーを用いた逆相Ｃ_１８カラムによりアセトニトリル：水（８０：５０）の溶媒系から分離精製することによりオストールが得られる。また、必要に応じて分取薄層クロマトグラフィーによる精製を行うことができる。
【００１７】
このようにして得られるオストール又は蛇床子抽出エキスは、小腸、肝臓及びマクロファージのＡＣＡＴの活性を特異的に阻害する。このため、これらを有効成分とする本発明ＡＣＡＴ阻害剤は、コレステロール吸収抑制剤、又は動脈硬化症もしくはこれに起因する動脈硬化性病変の予防・治療剤として有用である。
【００１８】
また、蛇床子は従来漢方薬として用いられているものであり、オストールはその成分であるので、本発明ＡＣＡＴ阻害剤は安全性の点で問題はない。
【００１９】
オストール又は蛇床子抽出エキスは、単独で又は薬理的に許容される担体等とともに、経口的に投与するのが好ましい。経口製剤としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、トローチ剤、シロップ剤等が挙げられる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、トローチ剤等の固型製剤においては、オストール又は蛇床子抽出エキス以外にデンプン、ラクトース、カルボキシメチルセルロース、沈降炭酸カルシウム等の賦形剤；アラビアゴム、トラガントゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の結合剤、アルギン酸、コーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、含水二酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸等の滑沢剤、サッカロース等の甘味剤、メントール等のフレーバー剤等を配合することができる。シロップ剤など液状製剤においては、オストール又は蛇床子抽出エキス以外にソルビトール、ゼラチン、メチルセルロース、植物油、乳化剤等のほか甘味剤、フレーバー剤、着色剤等を配合することができる。これらの製剤中には１〜９５重量％のオストールを配合するのが望ましい。
【００２０】
【作用】
（１）ラット由来ＡＣＡＴに対する阻害作用
オストールのＡＣＡＴ活性に対する影響を、ラット肝臓のミクロゾーム蛋白画分より調製した粗酵素を用い、^１４Ｃ−オレオイルＣｏＡを基質に、内因性のコレステロールから^１４Ｃ−コレステリルオレエートを生成させる反応をインビトロで行うことにより調べた。
【００２１】
反応液組成は、２０μｌのミクロゾーム蛋白（１．８３ｍｇ／ｍｌ）、２０μｌの^１４Ｃ−オレオイルＣｏＡ（５μＣｉ／ｍｌ、ＢＳＡ：９６ｎｍｏｌ／ｍｌ）、１０６μｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（５ｍＭのジチオスレイトールを含む、ｐＨ７．４）、及び４μｌのメタノールあるいはジメチルスルホキシドに溶解したオストールの合計１５０μｌとした。
【００２２】
反応は３７℃で行い、所定の反応時間（通常１８分間）経過後、５．６５ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）を添加して反応を停止した後、０．０４Ｎの塩酸水溶液０．９８ｍｌ及びキャリアーとしてコレステリルオレエートを加え、２０分間振盪機で抽出した後、１晩冷暗所に放置した。翌日、分離したクロロホルム下層全量を抜き取り、これを窒素気流下に乾燥させ、残った上層にホルチの分配溶液下層５．６５ｍｌを加えて再度抽出した。これを１晩暗所に放置した後、下層全量を抜き取り、先に乾固したクロロホルム下層画分と合わせて乾固した。
【００２３】
次に、これを２００μｌのクロロホルムに溶解し、シリカゲル薄層クロマトグラフィー Ｇ６０プレート（アルミニウムシート）に全量塗布した。これをジエチルエーテル：石油エーテル（１０：１９０）で１０ｃｍ展開した後、オートラジオグラフィーを行い、生成した^１４Ｃ−コレステリルオレエートを確認した。次にこの部分を切りとって、トルエン中で各試料共５分間の液体シンチレーションカウンティングあるいはベータスコープ（ベータ・ジェン社製）によって３０分間放射活性を測定した。本酵素を５０％阻害する濃度を測定した結果、オストールのＩＣ_５０値は２０μＭであった。
【００２４】
（２）マクロファージに対するコレステロールエステル蓄積抑制作用
オストールのマクロファージに対するコレステロールエステル蓄積抑制作用を、マウスのマクロファージ樹立細胞であるＪ７７１．４株を用いて調べた。
【００２５】
内皮細胞や平滑筋細胞におけるＬＤＬの代謝は細胞内の過剰の遊離コレステロールによって、ＬＤＬレセプターのダウンレギュレーションがかかるが、マクロファージにおいては変性ＬＤＬの取り込みは、スカベンジャーレセプター経由による。この経路はレギャレーションがかからないためコレステロールエステルが無制限に蓄積してゆく。
【００２６】
そこで、^１４Ｃでラベルしたコレステロールとホスファチジルコリンからなるリポソームをマクロファージ細胞に取り込ませ、粗面小胞体に存在するＡＣＡＴに作用させることにより、オストールが細胞内コレステロールエステルの蓄積を抑制するか否かを調べた。
【００２７】
マクロファージ細胞を１０％牛胎児血清、ペニシリン５０Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを加えたＲＰＭＩ １６４０培地（日水製薬社製）にて、２日間、５％ＣＯ_２の条件にてインキュベートした。次いで、トリプシン処理を行い、ウェルの底面に付着している細胞を剥がして細胞懸濁液とした後、細胞を上記新鮮培地で洗浄し、２４穴のマルチプルウェルプレート（コーニング社製２５８２０−２４）に１ウェル当たり２×１０^６個／ｍｌの細胞溶液７５０μｌを播種した。３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で３７時間培養した後に前記新鮮培地と交換し、更に８０μｇのコレステロール（０．４μＣｉの^３Ｈ−コレステロールを含む）と１６０μｇのホスファチジルコリンを含んだ０．３Ｍのグルコース溶液４０μｌ、及びオストールを溶解したメタノール溶液１０μｌを添加して、１２時間培養した。これらの操作は無菌的に行った。
【００２８】
培養終了後、血清を含まないＲＰＭＩ １６４０培地を使用して底面に付着している細胞を５回駒込ピペットで洗浄した後、１ｍｌの２−プロパノールを添加して細胞内のコレステロール及び生成したコレステロールエステルを抽出した。この抽出液をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（メルク社製Ａｒｔ．５５５３）に全量塗布し、ヘキサン：エーテル：ギ酸（８０：２０：２）にて展開した後、オートラジオグラフィーを行った。次に、^３Ｈでラベルされたコレステロールエステル及びコレステロール部分を切り取り、液体シンチレーションカウンターにて放射活性を測定し、対照と比較してコレステロールエステル蓄積抑制率を得た。その結果、オストールのＩＣ_５０値は２０μＭであった。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
製造例１
５００ｇの蛇床子を、１０リットルのメタノールを用いて１週間室温で冷浸抽出した。抽出液を濾過した後、減圧濃縮及び乾固して３８．４ｇの粗抽出物を得た。次にこの粗抽出物をエーテルと水とで振り分けた。このエーテル層を濃縮してシリカゲルカラム（内径５ｃｍ，長さ９０ｃｍ）に重層し、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル（１：１）、酢酸エチル、メタノールの４種の溶媒各１リットルで順次溶出し、活性成分の分画を行った。
【００３１】
溶出した液を１５０ｍｌずつ分取し、活性画分を減圧乾固して粗活性物質４．８５ｇを取得した。次に、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（５ｃｍφ×６０ｃｍ）に全粗抽出物を積層し、６００ｍｌのクロロホルムにて溶出した後、９５％クロロホルム：メタノール、９０％クロロホルム：メタノール、及び８０％クロロホルム：メタノールそれぞれ６００ｍｌにて順次溶出することにより、活性画分を回収した。得られた粗活性物質は３．５ｇであった。
【００３２】
次に、この粗活性物質全量をクロロホルム：メタノール（９０：１０）を溶出液としたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５ｃｍφ×１００ｃｍ）にて再度クロマトグラフィー分画を行った。溶出液は１５０ｍｌずつ分取し、活性画分を減圧乾固して２．６ｇの粗活性画分を取得した。
【００３３】
この内の１ｇを高速液体クロマトグラフィー（ウォーターズ社製システム６００Ｅ）を用い、逆相Ｃ_１８カラムを使用して、アセトニトリル：水（８０：２０）の溶媒系により分離精製した結果、０．５３ｇの粗活性画分を得た。
【００３４】
このＡＣＡＴ阻害活性を示す成分は、更にｎ−ヘキサン：酢酸エチル（３：１）を展開溶媒とした分取薄層クロマトグラフィー（メルク社製：シリカゲル６０Ｆ_２５４，Ａｒｔ．５７１７）によって精製を行った。最後に活性成分をヘキサン−酢酸エチル中で再結晶させることにより、無色柱状の結晶２６７ｍｇを得た。その純度は高速液体クロマトグラフィーによる分析で９５％以上であった。
【００３５】
以上のようにして得られた活性物質の理化学的性状は、以下に示す通りであった。
（１）分子式：Ｃ_１５Ｈ_１６Ｏ_３
（２）分子量：２４４（マススペクトルによりｍ／ｚ２４４（Ｍ^＋）が観察された。）
（３）紫外線吸収スペクトル（エタノール中）：第１図の通り。
（４）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ中）：第２図の通り。
（５）溶媒に対する溶解性：メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、ベンゼンに可溶、水に不溶。
（６）塩基性、酸性、中性の区別：中性。
（７）物質の色、形状：白色、粉末。
（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル：第３図の通り。
^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６，４００ＭＨｚ，３７ｃ）δ：１．６７（３Ｈ，ｓ）， １．８４（３Ｈ，ｓ）， ３．５４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）， ３．９２（３Ｈ，ｓ）， ５．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ）， ６．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）， ６．８３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）， ７．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ）， ７．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ）．
（９）化学構造：
【００３６】
【化３】

【００３７】
以上より、本活性物質はオストールと同定された。
【００３８】
実施例１ 錠剤
オストール ４０ｇ
ラクトース ３６０ｇ
ステアリン酸タルク ４０ｇ
デンプン ６０ｇ
以上を混合機で混和し、打錠して０．５ｇの錠剤１０００個を得た。
【００３９】
【発明の効果】
オストールは、小腸、肝臓及びマクロファージのＡＣＡＴの活性を特異的に阻害する。従って、これを有効成分とする本発明ＡＣＡＴ阻害剤は、コレステロールの吸収抑制剤又は動脈硬化症もしくはこれに起因する動脈硬化性病変の予防・治療剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】蛇床子より抽出されたＡＣＡＴ阻害活性を示す物質（オストール）の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
【図２】蛇床子より抽出されたＡＣＡＴ阻害活性を示す物質（オストール）の赤外線吸収スペクトルを示す図である。
【図３】蛇床子より抽出されたＡＣＡＴ阻害活性を示す物質（オストール）のプロトン核磁気共鳴スペクトルを示す図である。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to an acyl coenzyme A: cholesterol acyl transferase (ACAT) inhibitor, and more particularly, to an ACAT inhibitor containing ostol as an active ingredient contained in the fruit of okazeri (snakebed).
[0002]
Problems to be solved by the prior art and the invention
With the westernization of dietary habits, the incidence of ischemic heart disease in Japan has increased significantly. A number of epidemiological studies have shown the relationship between elevated blood cholesterol levels and arteriosclerosis following a Western diet. That is, there is a significant correlation between the serum cholesterol level and the frequency of occurrence of ischemic heart disease, and it is said that treating hypercholesterolemia prevents arteriosclerosis. Atherosclerosis is a lesion characterized by intimal thickening due to lipid accumulation in blood vessels.In recent years, in atherosclerotic lesions, foams in which macrophage-derived cells store cholesterol esters as lipid droplets. Endothelial cells have been observed and are presumed to be deeply involved in the development of the lesion.
[0003]
On the other hand, acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase (ACAT) is a fatty acid esterifying enzyme of cholesterol, and an inhibitor of this enzyme is expected as a therapeutic drug for arteriosclerosis (Drago R. et al., Tips 194). , (12), 1991). That is, it has been reported that ACAT activity is high in the blood vessel wall at the site of atherosclerotic lesion, and cholesterol ester is accumulated in the blood vessel wall. Therefore, if a substance having an ACAT activity inhibitory effect is used, cholesterol esterification can be inhibited, and free cholesterol present in cells is removed from the site of deposition by high-density lipoprotein (HDL) and transported to the liver. Since the cholesterol ester is accumulated and metabolized at the lesion site, it is possible to obtain a direct anti-atherosclerotic effect.
[0004]
In addition, cholesterol contained in food is esterified by ACAT in small intestinal mucosal cells and then released into the bloodstream as a chylomicron component. Therefore, when an ACAT inhibitor is used, blood cholesterol can be reduced by inhibiting absorption of food cholesterol by small intestinal epithelial cells, and as a result, arteriosclerosis can be suppressed.
[0005]
In addition, cholesterol esters carried to the liver by chylomicrons are decomposed into free cholesterol by cholesterol esterase, then converted to cholesterol esters again by ACAT together with free cholesterol synthesized in the liver, and converted to very low density lipoprotein (VLDL). It is incorporated and released into the blood. Therefore, if the esterification of cholesterol is inhibited by the ACAT inhibitor, the amount of free cholesterol in the liver increases, the cholesterol synthesis system is suppressed, and 7α- which is the rate-limiting enzyme in the process of converting cholesterol to bile acids. Hydroxylase activity is enhanced, and the catabolic excretion of cholesterol to bile acids is increased.
[0006]
Thus, the use of an ACAT inhibitor lowers blood cholesterol by inhibiting the absorption of cholesterol in the food from the small intestine, suppressing cholesterol re-esterification in the liver, and promoting the catabolism and excretion of cholesterol. be able to.
[0007]
Heretofore, as an ACAT inhibitor derived from nature, several substances produced by microorganisms are known, but an ACAT inhibitor derived from a plant has not been found yet.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
Under such circumstances, the present inventors continued to search for active ingredients having an ACAT activity regulating action in the components of the plant, and as a result, it was found that the fruits of Okazeri (Snake bed: Cndium monnieri) belonging to the genus Hamazeri in plants of the Umbelliferae family ( It has been found that the alcohol extract of Snake bed has ACAT inhibitory action. Further, a substance having ACAT inhibitory activity was isolated and purified from the extract, and as a result, the active substance was represented by the following formula (1)
[0009]
Embedded image

[0010]
The present inventors have found that this is an ostole represented by the formula, and completed the present invention.
[0011]
That is, the present invention relates to an ACAT inhibitor containing ostol as an active ingredient.
[0012]
Further, the present invention relates to an ACAT inhibitor containing an extract of snail bed as an active ingredient.
[0013]
The ostole used in the present invention is not particularly limited in its origin, and any of natural origin, totally synthetic product and semi-synthetic product can be used.
[0014]
When a plant is used as a source of ostole, examples of a plant containing ostole include a plant belonging to the genus Apiaceae, and particularly the fruit of a Chinese okazeri (Cnium monnieri) is preferably used. .
[0015]
Okazeri is a perennial grass native to northeastern China and distributed in Mongolia, Siberia, Ussuri, and the Korean Peninsula, and its dried fruit is called snakebed. Snakebed is a traditional Chinese medicine used for antiphlogistic, astringent, tonic, and other purposes, and its extract has been reported to have anti-trichomonas action, sex hormone-like action, and the like. However, its ACAT inhibitory activity has not been reported at all.
[0016]
The extraction extract or ostole is collected from the snake bed, for example, as follows. First, the extracted extract is obtained by extracting snake bed with a polar organic solvent such as methanol, ethanol, and acetone, and concentrating the obtained extract under reduced pressure. Here, the extracted extract can be used as it is as an ACAT inhibitor. However, if necessary, the extract can be purified as follows, and the purified product in each step can be used as an ACAT inhibitor. For purification of the extract, for example, the extract is first divided between ether and water, the ether layer is concentrated and layered on a silica gel column, and n-hexane, n-hexane: ethyl acetate (1: 1), ethyl acetate, The active ingredient is fractionated by eluting sequentially with four solvents of methanol. Next, the active fraction of the eluate is dried under reduced pressure to obtain a crude active substance. This is separated and purified from a solvent system of acetonitrile: water (80:50) by a reversed phase _C18 column using high performance liquid chromatography to obtain ostole. Further, if necessary, purification by preparative thin-layer chromatography can be performed.
[0017]
The thus-obtained ostitol or snail bed extract specifically inhibits the activity of ACAT in the small intestine, liver and macrophages. Therefore, the ACAT inhibitor of the present invention containing these as active ingredients is useful as a cholesterol absorption inhibitor or an agent for preventing or treating arteriosclerosis or arteriosclerotic lesions caused by the same.
[0018]
Moreover, since snakebed is conventionally used as a Chinese medicine, and ostol is a component thereof, the ACAT inhibitor of the present invention has no problem in terms of safety.
[0019]
It is preferable to administer the ostole or snake bed extract extract orally, alone or together with a pharmacologically acceptable carrier or the like. Examples of the oral preparation include tablets, capsules, granules, powders, troches, syrups and the like. In solid preparations such as tablets, capsules, granules, powders, and lozenges, excipients such as starch, lactose, carboxymethylcellulose, precipitated calcium carbonate and the like in addition to ostole or snake bean extract extract; gum arabic, gum tragacanth, Binders such as gelatin, methylcellulose and carboxymethylcellulose; disintegrants such as alginic acid and corn starch; lubricants such as magnesium stearate, hydrous silicon dioxide, light anhydrous silicic acid, sweeteners such as saccharose, and flavoring agents such as menthol. Can be blended. In liquid preparations such as syrups, sorbitol, gelatin, methylcellulose, vegetable oils, emulsifiers, etc., as well as sweeteners, flavoring agents, coloring agents, etc. can be added in addition to ostitol or snakebed extract. It is desirable to add 1 to 95% by weight of ostole in these preparations.
[0020]
[Action]
(1) Inhibitory effect on ACAT derived from rat The effect of ostole on ACAT activity was determined using ¹⁴ C-oleoyl-CoA as a substrate and ¹⁴ C- The reaction to produce cholesteryl oleate was investigated by performing in vitro.
[0021]
The composition of the reaction solution was 20 μl of microsomal protein (1.83 mg / ml), 20 μl of ¹⁴ C-oleoyl CoA (5 μCi / ml, BSA: 96 nmol / ml), and 106 μl of 100 mM phosphate buffer (5 mM dithiothreitol). , PH 7.4), and a total of 150 μl of ostol dissolved in 4 μl of methanol or dimethylsulfoxide.
[0022]
The reaction was carried out at 37 ° C. After a predetermined reaction time (usually 18 minutes), the reaction was stopped by adding 5.65 ml of chloroform: methanol (2: 1), and then 0.98 ml of a 0.04 N hydrochloric acid aqueous solution was added. Cholesteryl oleate was added as a carrier, and extracted with a shaker for 20 minutes, and then left overnight in a cool dark place. On the next day, the whole separated chloroform lower layer was withdrawn, dried under a nitrogen stream, and the remaining upper layer was mixed with 5.65 ml of the lower layer of Forchi distribution solution and extracted again. After leaving this to stand in the dark overnight, the entire lower layer was extracted and dried together with the chloroform lower layer fraction previously dried.
[0023]
Next, this was dissolved in 200 μl of chloroform, and the whole was applied to a silica gel thin-layer chromatography G60 plate (aluminum sheet). After developing this with diethyl ether: petroleum ether (10: 190) for 10 cm, autoradiography was performed to confirm the generated ¹⁴ C-cholesteryl oleate. Next, this portion was cut out, and radioactivity was measured for 30 minutes by liquid scintillation counting or beta scope (manufactured by Beta Gen) in toluene for 5 minutes for each sample. As a result of measuring the concentration that inhibits the enzyme by 50%, the IC ₅₀ value of ostol was 20 μM.
[0024]
(2) Inhibition of cholesterol ester accumulation on macrophages The inhibitory effect of ostol on cholesterol ester accumulation on macrophages was examined using mouse macrophage-established cells, strain J771.4.
[0025]
LDL metabolism in endothelial cells and smooth muscle cells is down-regulated by LDL receptor due to excessive intracellular free cholesterol, but in macrophages, uptake of denatured LDL is via scavenger receptor. This pathway is free of reregulation and allows cholesterol esters to accumulate indefinitely.
[0026]
Therefore, it was investigated whether ostole suppresses the accumulation of intracellular cholesterol ester by incorporating liposome composed of cholesterol and phosphatidylcholine labeled with ¹⁴ C into macrophage cells and acting on ACAT present in the rough endoplasmic reticulum. Was.
[0027]
The macrophage cells were incubated in RPMI 1640 medium (Nissui Pharmaceutical) supplemented with 10% fetal calf serum, 50 U / ml penicillin and 50 μg / ml streptomycin for 2 days at 5% CO ₂ . Next, trypsin treatment is performed to remove cells adhering to the bottom surface of the well to form a cell suspension. The cells are then washed with the above fresh medium, and a 24-well multiple well plate (Corning's 25820-24) is used. Was seeded with 750 μl of 2 × 10 ⁶ cells / ml cell solution per well. After culturing at 37 ° C. and 5% CO ₂ for 37 hours, the medium was replaced with the fresh medium, and 0.3 M of cholesterol (containing 0.4 μCi of ³ H-cholesterol) and 160 μg of phosphatidylcholine containing 160 μg of phosphatidylcholine was further added. 40 μl of a glucose solution and 10 μl of a methanol solution in which ostol was dissolved were added, and the cells were cultured for 12 hours. These operations were performed aseptically.
[0028]
After completion of the culture, the cells adhering to the bottom surface were washed five times with a Komagome pipette using a serum-free RPMI 1640 medium, and then 1 ml of 2-propanol was added thereto to add intracellular cholesterol and the formed cholesterol ester. Was extracted. The whole amount of this extract was applied to silica gel thin-layer chromatography (Art. 5553, manufactured by Merck), developed with hexane: ether: formic acid (80: 20: 2), and then subjected to autoradiography. Next, the cholesterol ester and the cholesterol portion labeled with ³ H were cut off, and the radioactivity was measured with a liquid scintillation counter, and the cholesterol ester accumulation inhibition rate was obtained as compared with the control. As a result, the IC ₅₀ value of Ostol was 20 μM.
[0029]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
[0030]
Production Example 1
500 g of snake bed was subjected to cold immersion extraction at room temperature for one week using 10 liters of methanol. The extract was filtered, concentrated under reduced pressure and dried to obtain 38.4 g of a crude extract. Next, the crude extract was separated with ether and water. The ether layer was concentrated and layered on a silica gel column (inner diameter 5 cm, length 90 cm), and then mixed with 1 liter of each of four solvents, n-hexane, n-hexane: ethyl acetate (1: 1), ethyl acetate, and methanol. Elution was performed sequentially, and the active components were fractionated.
[0031]
The eluted liquid was collected in 150 ml portions, and the active fraction was dried under reduced pressure to obtain 4.85 g of a crude active substance. Next, the whole crude extract was layered on silica gel column chromatography (5 cmφ × 60 cm), eluted with 600 ml of chloroform, and then 95% chloroform: methanol, 90% chloroform: methanol, and 80% chloroform: methanol were each 600 ml. The active fractions were collected by sequentially eluting with. The obtained crude active substance was 3.5 g.
[0032]
Next, the whole amount of the crude active substance was chromatographed again by silica gel column chromatography (5 cmφ × 100 cm) using chloroform: methanol (90:10) as an eluent. The eluate was collected in 150 ml portions, and the active fraction was dried under reduced pressure to obtain 2.6 g of a crude active fraction.
[0033]
As a result of separating and purifying 1 g of the above using acetonitrile: water (80:20) solvent system using high-performance liquid chromatography (System 600E manufactured by Waters Corporation) using a reversed-phase _C18 column, 0.53 g was obtained. A crude active fraction was obtained.
[0034]
Component representing the ACAT inhibitory activity, further n- hexane: ethyl acetate (3: 1) fractionated as a developing solvent thin layer chromatography (Merck: silica gel _60F 254, Art.5717) was purified by . Finally, the active ingredient was recrystallized in hexane-ethyl acetate to obtain 267 mg of colorless columnar crystals. Its purity was 95% or more as analyzed by high performance liquid chromatography.
[0035]
The physicochemical properties of the active substance obtained as described above were as shown below.
(1) Molecular formula: C ₁₅ H ₁₆ O ₃
(2) Molecular weight: 244 (m / z 244 (M ⁺ ) was observed by mass spectrum)
(3) Ultraviolet absorption spectrum (in ethanol): as shown in FIG.
(4) Infrared absorption spectrum (in KBr): as shown in FIG.
(5) Solubility in solvent: soluble in methanol, ethanol, acetonitrile, ethyl acetate, chloroform, benzene, and insoluble in water.
(6) Basic, acidic and neutral distinction: neutral.
(7) Color and shape of the substance: white, powder.
(8) Proton nuclear magnetic resonance spectrum: as shown in FIG.
¹ H-NMR (DMSO-d ₆ , 400 MHz, 37c) δ: 1.67 (3H, s), 1.84 (3H, s), 3.54 (2H, d, J = 8 Hz), 3.92 (3H, s), 5.22 (1H, t, J = 8 Hz), 6.22 (1H, d, J = 8 Hz), 6.83 (1H, d, J = 8 Hz), 7.28 (1H) , D, J = 12 Hz), 7.60 (1 H, d, J = 12 Hz).
(9) Chemical structure:
[0036]
Embedded image

[0037]
Based on the above, the present active substance was identified as ostol.
[0038]
Example 1 Tablet Ostol 40g
Lactose 360g
Talc stearate 40g
60g starch
The above mixture was mixed with a mixer and tabletted to obtain 1,000 0.5 g tablets.
[0039]
【The invention's effect】
Ostol specifically inhibits the activity of ACAT in the small intestine, liver and macrophages. Therefore, the ACAT inhibitor of the present invention containing it as an active ingredient is useful as an agent for suppressing cholesterol absorption or an agent for preventing or treating arteriosclerosis or arteriosclerotic lesions caused by the same.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing an ultraviolet absorption spectrum of a substance (Ostol) having an ACAT inhibitory activity extracted from snake bed.
FIG. 2 is a view showing an infrared absorption spectrum of a substance (Ostol) having ACAT inhibitory activity extracted from snake bed.
FIG. 3 is a diagram showing a proton nuclear magnetic resonance spectrum of a substance (Ostol) having ACAT inhibitory activity extracted from snake bed.

Claims (4)

The following equation (1)

An ACAT inhibitor containing ostol as an active ingredient. An ACAT inhibitor containing an extract of snake bed as an active ingredient. A cholesterol absorption inhibitor comprising the ACAT inhibitor according to claim 1 or 2. An agent for preventing or treating arteriosclerosis, comprising the ACAT inhibitor according to claim 1 or 2.

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