JP3650397B2 - フォンヒッペルーリンダウ（ＶＨＬ）病遺伝子および対応するｃＤＮＡおよびＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法 - Google Patents
フォンヒッペルーリンダウ（ＶＨＬ）病遺伝子および対応するｃＤＮＡおよびＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3650397B2 JP3650397B2 JP52573994A JP52573994A JP3650397B2 JP 3650397 B2 JP3650397 B2 JP 3650397B2 JP 52573994 A JP52573994 A JP 52573994A JP 52573994 A JP52573994 A JP 52573994A JP 3650397 B2 JP3650397 B2 JP 3650397B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- vhl
- nucleic acid
- sequence
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncogenic proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【技術分野】
本発明は腫瘍サプレッサー遺伝子の分野である。特に、本発明はフォンヒッペルーリンダウ（VHL）病遺伝子およびその対応するcDNAおよびそのcDNAから誘導されるプローブを用いたVHL病遺伝子保有者の検出法に関する。
【発明の背景】
フォンヒッペルーリンダウ（VHL）病は家族性癌症候群である。この病気は常染色体性優性遺伝病であり、VHL病遺伝子での突然変異に対してヘテロ接合性である患者は種々の癌（最も頻繁であるのは中枢神経系の血管芽腫および網膜、腎細胞癌（RCC）および褐色細胞腫）の素因を持っている。この病気の多機構特性から（各々の標的器官で多様な腫瘍が形成されるであろうことを合わせて）患者の平均余命を49歳に減少させることにより示されるようにかなりの発病率および死亡率が報告されている（McKusick,V.A.,Mendelian Inheritance in Man（1983）Johns Hopkins University Press,Baltimore and London,p534−535）。VHL病の罹患率は36,000人に１人であるが、その晩発性のためほとんどの人は遺伝性VHL病を持っていることを認識する前に子供をもうけている。多年に渡ってこの病気の症状発現前または出生前診断の唯一の方法は、VHL家族のすべての無症候性構成員の目、脳および腹部の定期的な検査であった。都合の悪いことに、単一の器官に限定される病気であっても、病気の検出を確かなものにするにはすべての標的器官の試験が必要となる。これらの試験の不便さおよびその費用に加え、それらからは決定的な診断情報が得られられないであろうというさらなる欠点を持っている。従って、危険性を持っている個体のVHL病の確実な診断を可能にする方法を開発するため研究者はVHL病遺伝子を同定および単離することに努力を集中させてきた。
これらの研究の結果からVHL病遺伝子は腫瘍サプレッサー遺伝子のファミリーの一員であること（Tory,K J.ら、Natl.Canc.Inst.（1989）81:1097−1101;Maher,E.R.ら、J.Med.Genet.（1990）27:311−314）およびそれがヒト癌発生のヌッソン理論に従って振る舞うこと（Knudson,A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1971）68:816−823）が示されている。さらに、VHL病遺伝子に固く連結されたDNAマーカーの同定によりヒト染色体3p25−p26にVHL病遺伝子が位置していることが示された（Hosoe,S.ら、Genomics（1990）8:634−640;Maher,E.R.ら、Genomics（1990）8:957−960;Glenn,G.M.ら、Hum.Genet.（1990）8:207−210,Latif,F.ら、Am J.Hum.Genet.（1992）51（suppl）A63;Tory,K.ら、Genomics（1992）13:275−286;Richards,F.M.ら、J.Med.Genet.（1993）30:104−107;Seizinger,B.R.ら、Nature（1988）332:268−269;Seizinger,B.R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1991）88:2864−2868およびVance J.M.ら、Am J.Hum.Genet.（1993）51:203−209）。最近、Glennら（Glenn,G.M.JAMA（1992）1226−1231）はVHL病の危険性を持つ家族の構成員である人から単離されたDNAの制限酵素断片多型分析によりVHL病遺伝子への連結を検出するため、VHL病遺伝子に隣接するDNAマーカーをプローブとして使用した。このDNA多型法はVHL病遺伝子の保有者の同定の正確さを増加させるが、DNA多型分析がVHL病遺伝子それ自身を検出しない場合は本来的に無効である。さらに最近、VHL領域に位置する遺伝子がクローン化された（Latif,F.ら、Cancer Res.（1993）63:861−867）。しかしながら、この遺伝子はVHL患者の突然変異を検出することができないことが見いだされ、それ故VHL病遺伝子保有者を100％の精度で同定できる方法に利用することは現在のところできない。しかし、最近同定および単離されたVHL病遺伝子（Latif,F.ら、Science、印刷中、”フォンヒッペルーリンダウ病腫瘍サプレッサー遺伝子の同定”）およびその対応するcDNAはVHL病遺伝子の保有者の確実な検出を提供する診断法の開発を可能にするにちがいない。
【発明の開示】
発明の要約
本発明はフォンヒッペルーリンダウ（VHL）病遺伝子およびその対応するcDNAに関する。
本発明はまたVHL病遺伝子保有者の検出法にも関する。第一の方法はVHL病に付随するVHL病遺伝子の突然変異について被験者のDNAを分析することを含んでいる。
第二の方法はVHL病に付随するVHL特異的mRNAの突然変異または変化について被験者のRNAを分析することを含んでいる。
第三の方法はVHL病に付随するVHL蛋白質発現の変化について被験者の蛋白質を分析する方法を含んでいる。
本発明はまた、VHLcDNAから誘導される組換え体VHL蛋白質、および該VHL蛋白質またはそれらから誘導されるペプチドに対する抗体も含んでいる。
本発明はまた、野生型VHL遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターを保有者に投与することからなるVHL病遺伝子の保有者の処置法にも関する。
本発明はまた、VHL病遺伝子の保有者を検出する診断キットを提供する。本キットはVHL病に付随するVHL病遺伝子の突然変異についてDNAまたはRNAを分析する際にPCRプライマーとして有用な精製され単離された核酸配列を含んでいる。
図の説明
図１（パネルＡ）はVHL遺伝子を含んでいる染色体3p領域の遺伝的および物理的地図を示している。選択されたマーカー間の遺伝的および物理的距離は各々センチモルガンおよびキロ塩基で示されている。選択された交差の位置は十字により示されている。図１（パネルＢ）はVHL領域をおおう160kbコスミドおよびファージのクローン整列群を示している。cos3、cos11、およびファージp191の拡大された制限地図は、cos11の動原体末端からの保存7kb断片でλgt11奇形癌cDNAライブラリーをスクリーニングにより単離されたg7cDNAの位置を詳述している。最も小さい構造欠失の始まりはアステリスクおよび線で示されている。制限酵素部位:B、Bam H1;E、Eco RI;N、Not I;Nr、Nru I;M、Mlu Ｉ。
図2Aおよび2Bは種々のヒト組織中のg7cDNAにより表示された遺伝子発現のノーザンブロット分析を示している。図２（Ａ）は２μｇのポリA+mRNAを含む低分解能ブロットを示しており、組織はレーンの上に示されている。図２（Ｂ）は１μｇのポリA+mRNA形を含む高分解能ブロットを示している：レーン１、胎児脳；レーン２、成人脳；レーン３、胎児腎臓；レーン４、成人腎臓；レーン５、小脳；レーン６、成人副腎；レーン７、前立腺。転写体の大きさは28Sおよび18S rRNAバンドの位置から決定された。
図3A−3Eはプローブとしてg7 cDNAを用いたVHL患者の構造DNA転移突然変異のサザンブロッティング分析による検出を示している。（図3A）７人の非相関VHL患者のリンパ芽球様細胞株からのDNAがEcoR Iで消化され、標準ブロッティング法により分析された。正常不変バンドは約20から22kbであり、多分遺伝子内欠失により生じる異常型バンドの大きさは４から25kbである。患者コード番号はレーンの上に示されている。（図3B）新しい突然変異家族（"S"と略号をつけた）の家系のメンバーのリンパ芽球様細胞株からのDNAがDra I、Hind IIIおよびPst Iで消化された。疾患を持つ（点を付けた丸）および予想される（平行線を付けた丸）人の位置を示した家系図が表示されている（図3C）。男性は四角、および女性は丸で表されている。普通のVHL家族（"P"と略号をつけた）における突然変異体対立遺伝子（異常バンド）の遺伝的伝達。DNAはEcoR Iで消化され、サザンブロッティングにより分析された（図3D）；家系図が示されている（図3E）。
図４はVHL患者のゲノムDNAのサザンブロット分析を示している（各々の患者の頭文字のみが与えられている）。DNAはEcoR Iで消化されg7の異なった領域のプローブが用いられた。パネルA:全g7cDNAプローブ；パネルB:5'末端プローブ、ヌクレオチド３−146;パネルC:3'末端プローブ、ヌクレオチド1277−1600。
図5Aおよび5Bは8bp挿入突然変異を持つVHL患者（表１）のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応ー一本鎖コンホメーション分析（PCR−SSCP）の結果を示している。DNA配列決定ゲルの一部が示されており、正常（図5A）および714挿入TTGTCCGT突然変異配列（図5B）が示されている。DNA配列はアンチセンス鎖のものであり；従って挿入された塩基は5'ACGGACAA3'である。シークエンシングラダーの横に挿入の位置、および配列から予想される挿入物の種類が示されている。
図６は推定VHL遺伝子の進化的保存を示す”動物園”ブロットの結果を示している。g7cDNAは哺乳類、鳥類、ハエおよびウニからのDNAに交差種相同性を示した。レーン:1、ヒト（ホモ サピエンス）;2、チンパンジー（パン トログロダイテス）;3、マカク（マカカ ファシキュラリス）;4、ウシ（ボビス ドメスチカス）;5、ラット（ラッタス ノルビジカス）;6、マウス（ムス ムスキュラス）;7、ニワトリ（ガルラス ドメスチカス）;8、カエル（ゼノパス ラエビス）;9、ハエ（ドロソフィラ メラノガスター）;10、ウニ（ストロンジロセトロタス プルプラタス）；および11、酵母（サッカロマイセス セリビゼエ）。
発明の詳細な説明
本発明はVHL病遺伝子およびその対応するcDNAに関する。最近、酵母人工染色体（YACS）を用いる遺伝子歩行によりVHL病遺伝子を含むヒト染色体３の領域がクローン化され、クローン化DNAは染色体３特異的ライブラリーからコスミドで回収された（Latifら、Science、印刷中）。VHL病遺伝子を含むファージ191は1993年５月13日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）（12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852）に寄託されている（登録番号69311）。このVHL病遺伝子は野生型VHL遺伝子を表しており、ここで野生型とはVHL病を起こさない遺伝子を意味している。
本発明はまたVHL病遺伝子に関連するcDNAにも関している。このcDNA配列は（g7と名付けられた）配列ID番号:1として下に示されており、1993年５月13日にAmerican Type Culture Collectionに寄託された（登録番号69312）。このcDNAはまたGenBank登録番号L15409をも持っている。
ヌクレオチドに使用された略号は本分野で標準的に使用されるものである。
g7cDNAから演繹されるアミノ酸配列が下記の配列ID番号:2として示されており、配列ID番号:1のヌクレオチド１から出発して851ヌクレオチドまで伸びている。
配列ID番号:1に示したcDNA配列内で変異が企図され、それは配列ID番号:2に示した蛋白質の類似体の産生を指示することができるDNA配列を生じさせるであろう。前に示したDNA配列は本発明の好適な実施態様を表していることに注意するべきである。遺伝コードは縮重しているため、このVHL蛋白質またはその類似体の産生を指示することができるDNA配列に至る多数のヌクレオチドの選択がなされるであろうことを理解しなければならない。そのように、前に示した配列と機能的に等価である、または前に示したアミノ酸配列に従って産生されるVHL蛋白質の類似体の産生を指示するであろう配列と機能的に等価であるDNA配列は本発明の範囲に含まれるべきことが意図されている。
術語、類似体にはここに特に示した配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を持つ任意の蛋白質またはポリペプチドが含まれ、その中では一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されており、ここに記載したようなVHL蛋白質の機能的特徴を示している。保存的置換の例には、例えば一つのイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような非極性（即ち疎水性）残基の別のものへの置換；アルギニンおよびリジン間、グルタミンおよびアスパラギン間またはグリシンおよびセリン間のような一つの極性（即ち親水性）残基の別のものへの置換；リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような一つの塩基性残基の別のものへの置換；またはアスパラギン酸またはグルタミン酸のような一つの酸性残基の別のものへの置換が含まれている。
句、保存的置換はまた、もし得られた蛋白質またはペプチドが必要な機能活性を示すならば非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化した残基の使用を含んでいてもよい。
化学誘導体とは機能的側基の反応により化学的に誘導体化された一つまたはそれ以上の残基を持つVHL蛋白質またはポリペプチドを表している。そのような誘導体化分子の例には、遊離アミノ基が誘導体化されて例えば、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチロキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基が形成されているような分子が含まれるが、それらに制限されるわけではない。遊離カルボキシル基は塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の型のエステルまたはヒドラジドを形成するように誘導化されていてもよい。遊離ヒドロキシル基はＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化されていてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素はＮ−im−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化されていてもよい。20の標準アミノ酸の一つまたはそれ以上の天然に存在するアミノ酸を含む蛋白質またはポリペプチドのような化学誘導体も含まれる。例えば、プロリンが４−ヒドロキシプロリンに置換されてもよいし；リジンが５−ヒドロキシリジンに置換されてもよいし；ヒスチジンが３−メチルヒスチジンに置換されてもよいし；リジンがオルニチンに置換されてもよい。本発明のVHL蛋白質またはポリペプチドにはまた、必要とされる活性が保持されている限り、その配列がここに示されているような蛋白質またはポリペプチドの配列に関して一つまたはそれ以上の残基の付加および／または欠失を持つ蛋白質またはポリペプチドも含まれている。
本発明はまた、VHL病遺伝子の保有者を検出する方法にも関している。
本発明で開示される検出法は胎児をスクリーンするために出生前に、または彼／彼女の家族歴を通して危険性をもつ被験者をスクリーンするために発症前に使用できることが当業者には理解されるであろう。さらに、これらの方法は腎臓、肺および膀胱癌のような他のヒトの悪性腫瘍にVHL病遺伝子が含まれているかどうかの決定に使用することができる。
本発明の一つの実施態様において、VHL病遺伝子の保有者を検出する方法はVHL病に付随するVHL病遺伝子の突然変異について被験者のDNAを分析すること含んでいる。
本発明の目的のための被験者とは哺乳類を意味しており、突然変異とはVHL病遺伝子の逆位、転座、挿入、欠失または点突然変異を意味している。
DNAの分析のためには、生物学的試料が被験者から得られる。本発明で使用するために得られるであろう生物学的試料の例には組織生検試料、全血、尿、便または病気の診断に通常試験されるその他の試料が含まれるが、それらに制限されるわけではない。好適な生物学的試料は全血または尿である。
いつも必要とされるわけではないが、分析前に生物学的試料からDNAを少なくとも部分的に精製するのが好ましい。例えば、試料中の細胞を破壊した後、試料のフェノール抽出により夾雑する細胞破片および他の蛋白質物質から核酸を抽出できる。フェノール抽出において、水性試料は約等容量の再蒸留フェノールと混合され、遠心分離により二層に分離される。核酸を含む水相をとり、エタノールで沈殿させるとフェノールを含まない核酸が得られる。もしくは、DNAはSidransky,D.ら（Science（1992）256:102−105）またはGlennらの方法（Glenn,G.M.らJAMA（1992）267:1226−1231）に従って生物学的試料から精製できる。分析されるべきDNAは一本鎖でも二本鎖でもよい。
VHL病遺伝子の突然変異についてDNAを分析する方法には、適当な制限酵素で消化した後のサザンブロッティング（制限酵素断片長多型、RFLP）（Bostein,D.Amer.J.Hum.Genet.（1980）69:201−205）、変性勾配電気泳動技術（Myers,R.M.,Nature（1985）313:495−498）、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（Conner,R.ら、EMBO J.（1984）3:13321−1326）、プローブRNAおよび標的DNA間のデュープレックスのRNアーゼ消化（Winter,E.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（1985）82:7575−7579）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Saiki,P.K.ら、Science（1988）239:487−491;米国特許第4,683,195号および第4,683,202号）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（欧州特許出願第0,320,308号および0,439,182号）PCR−一本鎖コンホメーション分析（PCR−SSCP）（Orita,M.ら、Genomics（1989）5:874−879;Dean,M.ら、Cell（1990）61:863−871）が含まれる。一つの好適な実施態様において、DNAはサザン分析により分析される。
サザン分析により分析されるべきDNAは一つまたはそれ以上の制限酵素により消化される。本発明で使用されるべき制限酵素はその認識部位の存在または不在がVHL病に結びつくような酵素である。好適な制限酵素にはEcoR I、Hind III、Pst I、Dra I、BamH I、Bgl I、およびPvu IIが含まれる。制限酵素消化に続いて、生じるDNA断片はゲル電気泳動により分離され、断片は標識核酸プローブによるハイブリダイゼーションにより検出される（Southern,E.M.,J.Mol.Biol（1975）98:503−517）。
サザン分析にプローブとして使用される核酸配列は一本鎖または二本鎖の形で標識できる。核酸配列の標識は当業者には既知の技術により実施できる。そのような標識技術で放射性標識および酵素を含ませることができる（Sambrook,J.ら（1989）、”モレキュラークローニング、実験室手引き"Cold Spring Harbor Press,Plainview,New York）。さらに、ピリミジンおよびプリン環へ化学基を結合させる方法（Dale,R.N.K.ら（1973）Pro c.Natl.Acad.Sci.,70:2238−2242;Heck,R.F.（1968）J. Am.Chem.Soc.,90:5518−5523）、化学発光により検出を可能にする方法（Barton,S.K.ら（1992）J.Am.Chem.So c.,114:8736−8740）およびビオチニル化核酸プローブを利用する方法（Johnson,T.K.ら（1983）Anal.Bioche m.,133:126−131;Erickson,P.F.ら（1982）J.of Immun ology Methods,51:241−249;Matthaei,F.S.ら（1986）Anal.Biochem.,157:123−128）および市販品として利用可能な製品を用いて蛍光により検出を可能にする方法を含む信号増幅のための非放射性技術が知られている。プローブの大きさは約200ヌクレオチドから約数千塩基の範囲が可能である。好適なプローブの大きさは約500から約2000ヌクレオチドである。サザン分析でプローブとして使用される各々の核酸は配列ID番号:1に示したcDNA配列の対応する部分と実質的に相同である。”実質的に相同”とはプローブとして使用される核酸と配列ID番号:1に示された対応する配列間の相同性のレベルを意味している。相同性のレベルが70％を超えることが好ましく、最も好ましくは80％を超え、核酸配列が配列ID番号:1に示した配列と90％を超える相同性を持っているのが特に好適である。分離されたDNA断片が標識核酸プローブへハイブリダイズされたら、制限酵素消化パターンはオートラジオグラフィーにより可視化でき、VHL病に付随する制限酵素断片長多型（RFLP）の存在または不在を検討する。
第二の好適な実施態様において、PCR−SSCP（Oritaら（1989）、Deanら（1990））によりVHL病遺伝子内の突然変異についてDNAが分析される。この方法においてPCRで使用するために選択されたプライマー対の各々はVHL病遺伝子内の配列にハイブリダイズするように設計されており、増幅生成物中の突然変異の増幅および続いての検出を可能にするために遺伝子内で適当な距離だけ離れている（少なくとも約50ヌクレオチド）。そのようなVHL遺伝子配列に特異的にハイブリダイズできるプライマー対はVHL遺伝子配列から誘導できる。好適な実施態様において、プライマーは配列ID番号:1に示したcDNA配列から誘導される。対のプライマーの各々は二本鎖標的配列の一つの鎖の3'末端の配列と相同であり、約15から約50塩基長の一本鎖オリゴヌクレオチドである。各々の対は二つのそのようなプライマーを含んでおり、その一つは相補的3'末端であり、他方は標的配列の他の3'末端と相補的である。標的配列は一般的に約100から約300塩基対長であるが、500−600塩基対の大きさにまでなることがある。VHL病遺伝子への十分な特異的ハイブリダイゼーションを得る増幅反応の最適化は本分野ではよく知られており、好適にはアニーリング温度を調節することにより達成される。
本発明はまた、VHL遺伝子内の突然変異についてのDNAの分析に使用するための精製され単離されたプライマーの対も提供する。これらのプライマーの核酸配列は下記配列ID番号３−８に示されている。
配列ID番号:3
配列ID番号:4
配列ID番号:5
配列ID番号:6
配列ID番号:7
配列ID番号:8
ここで配列ID番号:3および配列ID番号:4はプライマーの一つの対を表しており；配列ID番号:5および配列ID番号:6はプライマーの第二の対を表しており；および配列ID番号:7および配列ID番号:8はプライマーの第三の対を表している。
本発明のプライマーはオリゴヌクレオチド合成の既知の方法を使用して合成でき（例えば、Agarwalら（1972、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.11:451）のホスホジエステル法、Hsiungら（1979、Nucleic Acids Res.6:1371）のホスホトリエステル法またはBeuacageら（1981、Tetrahedron Letters 22:1859−1862）の自動化ジエチルホスホロアミダイト法）、または天然に存在するかまたはクローン化DNAの単離断片であってもよい。さらに、当業者はオリゴヌクレオチドは種々の製造元から販売されている自動化装置により合成できるか、または会社に注文して製造できることを知っているであろう。一つの実施例において、プライマー伸長生成物の検出および／または同定に適した検出可能な標識（例えば、ビオチン、アビジンまたは放射性標識dNTP）を含むように、または増幅生成物の単離の助けとなる物質（例えば、ビオチンまたはアビジン）で誘導体化できる。一つの好適な実施態様において、配列ID番号:3から配列ID番号:8は合成オリゴヌクレオチドである。
別の実施態様において、プライマー対はHVL病遺伝子の突然変異体形にハイブリダイズするように選択できる。野生型VHL遺伝子配列への非特異的ハイブリダイゼーションが突然変異遺伝子配列の増幅生成物の同定を妨げないように、選択されたプライマー対は突然変異した遺伝子配列へ十分特異的にハイブリダイズするであろう。VHL遺伝子配列内の突然変異にハイブリダイズするプライマー対は生物学的試料のDNA内に存在する特異的突然変異体遺伝子配列の増幅に使用できるであろう。
PCRの増幅生成物は直接的または間接的に検出できる。PCR−SSCP法においては、増幅生成物の直接検出がプライマーの対の標識により行われる。本発明のプライマーを標識するのに適した標識は当業者には既知であり、放射活性標識、ビオチン、アビジン、酵素および蛍光性分子が含まれる。誘導された標識は増幅反応を実施する前にプライマー内に取り込ませることができる。好適な標識法では、放射標識ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを利用する（Sambrook,J.ら（1989）”モレキュラークローニング、実験室手引き"Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY）。もしくは、所望の標識は増幅反応の間に一つまたはそれ以上の標識されたdNTPの形でプライマー伸長生成物内へ取り込ませることができる。本発明において、標識された増幅PCR生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりPCR生成物を分離して、またはPCR生成物の直接配列決定によりVHL病遺伝子に付随するVHL遺伝子の突然変異を分析できる。
さらに別の実施態様においては、サザンブロットまたはドットブロットにおいて、放射性標識した、またはビオチン標識した核酸プローブとのハイブリダイゼーションによりVHL病遺伝子の突然変異について非標識増幅生成物が分析できる。この実施態様で有用な核酸プローブは前にサザン分析で記載したようなものである。
第二の実施態様において、VHL病遺伝子の保有者を検出する方法はVHL病に付随するVHLー特異的mRNAの突然変異または変化について被験者のRNAを分析することを含んでいる。
この方法によるRNAの分析のためには、血液または腫瘍生験試料に由来するRNAが該被験者から得られる（該腫瘍には目、脳、肝臓、腎臓、膵臓および褐色細胞腫が含まれているが、それらに制限されるわけではない）。
分析されるべきRNAは血液または腫瘍生験試料から全細胞RNAまたはポリ（Ａ）+RNAとして単離できる。全細胞RNAは当業者には既知の方法により単離できる。そのような方法には分別沈澱によるRNAの抽出（Birnbiom,H.C.（1988）Nucleic Acids Res.,16:1487−1497），有機溶媒によるRNAの抽出（Chomczynski,P.ら（1987）Anal.Biochem.,162:156−159）および強い変性剤によるRNAの抽出（Chirgwin,J.M.ら（1979）Biochemisry,18:5294−5299）が含まれる。ポリ（Ａ）+RNAはオリゴｄ（Ｔ）カラムによるアフィニティクロマトグラフィーにより全細胞RNAから選択される（Aviv,H.（1972）Proc.Natl.Acad.Sci.,69:1408−1412）。RNAを単離する好適な方法は全細胞RNAからの酸ーフェノールによる抽出である（Chomczynski,P.1987）。
VHL病に連動するVHL特異的mRNA発現のパターンまたはレベルについてRNAを分析する方法には、ノーザンブロッティング（Alwine,J.C.ら（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.,74:5350−5354）、ドットおよびスロットハイブリダイゼーション（Kafatos,F.C.ら（1979）Nucleic Acids Res.,7:1541−1522）、フィルターハイブリダイゼーション（Hollander,M.C.ら（1990）Biotechniques,9:174−179）RNアーゼ保護（Sambrook,J.ら（1989）”モレキュラークローニング、実験室手引き"Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY）および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）（Watson,J.D.ら（1992）”組換え体DNA"第二版、W.H.Freeman and Company,New York）が含まれる。一つの好適な方法はノーザンブロッティングである。
VHL特異的mRNA発現を検出するためのプローブとして使用される核酸配列は配列ID番号:1と実質的に相同である。”実質的に相同”とは核酸と配列ID番号:1のcDNA配列間の相同性のレベルを意味している。相同性のレベルが70％を超えることが好ましく、より好ましくは80％を超え、特に好適な核酸配列は配列ID番号:1に示したcDNA配列と90％を超える相同性を持っている。
最も好適な方法は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）であり、ここでRNAの逆転写により産生されるcDNAの増幅に使用されるプライマーは配列ID番号:1に示したcDNA配列から誘導される。これらのプライマーは前に記載したように標識でき、RT−PCR生成物の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、またはRT−PCRの生成物の直接的配列決定によりVHL病に付随するVHL遺伝子の突然変異についてRT−PCR生成物が分析できる。
本発明はまた、配列ID番号:1に示したcDNAから誘導される組換え体蛋白質および前記蛋白質（VHL蛋白質と称される）の抗体も含んでいる。組換え体VHL蛋白質は当業者には既知である組換えDNA方法論により産生できる。例えば、配列ID番号:2に示されているアミノ酸配列の全部または一部を含む蛋白質をコードできる核酸配列はベクター内にクローン化でき宿主内へ移され、その中で複製される。本発明の目的に適した核酸配列は配列ID番号:1に示されている配列である。適した発現ベクターにはワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスおよび大腸菌pTRCHIS（Invitrogen Co.San Diego）が含まれるがそれらに制限されるわけではない。適した発現ベクター中でVHL蛋白質の合成を指示できる核酸配列の挿入により産生された組換え体発現ベクターは当業者には既知である方法により大腸菌または適した真核細胞系内へ移すことができる。
発現された組換え体VHL蛋白質を含む細胞、組換え体発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からの細胞溶解物または発現された組換え体VHL蛋白質を含む培養上清液は哺乳類においての抗ーVHL抗体の産生を惹起する免疫源として使用できる。もしくは、配列ID番号:2に示されているアミノ酸配列から免疫源として使用するための合成ペプチドを発生させることができる。免疫源として使用するために好適なペプチド配列が以下に示されている：
配列ID番号:9
配列ID番号:10
免疫源を哺乳類に純粋なまたは実質的に純粋な形で投与することは可能であるが、医薬組成物、処方または調製品として存在させるのが好適である。免疫化に適した哺乳類はマウス、ウサギなどである。本発明の抗ーVHL抗体は典型的には哺乳類を免疫学的に有効量の本発明の合成ペプチドで免疫することにより産生される。そのようなペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の調製は本分野ではよく知られている（Standtら（1988）J.Exp.Med.157:687−704）。組換え体VHL蛋白質で哺乳類を免疫することにより誘導された抗ーVHLペプチド抗体分子を哺乳類から集め、例えばイムノクロマトグラフィーのようなよく知られた技術によりそれらのVHL蛋白質に対する免疫特異性を所望の程度まで上げる。
第三の実施態様においては、VHL病遺伝子の保有者を検出する方法はVHL病によるVHL蛋白質発現の変化について被験者の蛋白質を分析することを含んでいる。
この方法による蛋白質の分析のためには、蛋白質は腫瘍生験試料および尿などの生物学的試料から得られる。蛋白質は粗溶解物として得ることもできるが、当業者には既知の方法により（Sambrook,J.ら（1989）”モレキュラークローニング、実験室手引き"Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY）さらに精製することもできる。
粗蛋白質溶解物は抗ーVHL抗体を用いてイムノアッセイによりVHL蛋白質について分析できる。
本発明のイムノアッセイはラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイなどであろう。ELISAとして本分野で知られている標準的な技術は、Method in Immunodiagnosis，第二版,RoseおよびBigazz編,John Wiley and Sons,1980およびCampbellらによるMethods of Immunology,W.A.Benjamin,Inc.,1964に記載されており、両方ともここに参照文献として含まれている。そのようなアッセイは本分野において記載されているような直接、間接、競合的または非競合的イムノアッセイであろう。（Oellerich,M.1984,J.Clin.Chem.Clin.Biochem.22:895−904）。
形成されたVHL蛋白質抗ーVHL抗体複合体の検出は、複合体と標識抗ーウサギ抗体のような第二の抗体との反応により達成できる。標識は複合体を適当な蛍光性または発色性試薬の存在下でインキュベートすることにより検出されるような酵素であろう。放射性標識、コロイド金などのような他の検出可能な標識も使用することができる。標識されたVHL蛋白質ー抗ーVHL抗体複合体は次にオートラジオグラフィーにより可視化される。
本発明はまた、VHL病遺伝子の保有者の処置のための方法にも関しており、野生型VHL遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターが保有者に投与される。野生型VHL遺伝子を表す核酸配列は配列ID番号:1に示されている。そのような核酸配列は当業者には既知である方法により適当な発現ベクター内へ挿入される（実施例５）。インビボで高い効率の遺伝子輸送を行うために適している発現ベクターにはレトロウイルス、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスベクターが含まれる。
野生型VHL遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターは静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内または経口で投与できる。好適な投与経路は静脈内である。
本発明はまたVHL病遺伝子の保有者を検出するための診断キットを提供する。この診断キットは精製および単離された配列ID番号:3から配列ID番号:8による核酸配列、VHL病に結びついたVHL病遺伝子の突然変異についてDNAを分析する際にPCRプライマーとして有用な前記配列を含んでいる。
ここに参照した文献および特許はここにすべて参照文献として含まれている。以下の実施例は本発明の種々の態様を例示するものであり、本発明の範囲を制限することを意図しているものではない。
材料
以下の実施例で分析された被験者は米国、欧州およびカナダの眼科医、泌尿器科医、医学遺伝学者および神経外科医により同質と同定された。家族の構成員はルイジアナ、テネシー、ミシシッピ−、バージニア、ペンシルバニア、ニューヨーク、ミシガン、ケベック、ノバスコチア、英国およびオランダに居住している。病気に冒されていることが知られている各々の家族構成員の医学的記録は再検討された。無症候性の家族構成員および診断に不確かさがある家族構成員はNational Institute of Healthの臨床センターで病気の潜在性についてインフォームドコンセントを実施した後試験された。試験は病歴および健康診断からなっている。VHL家族の無症候性の構成員は一つまたはそれ以上の下記の病気の徴候が検出されたら病気に冒されていると考えられた：網膜血管腫、脊髄または小脳の血管芽腫、褐色細胞腫、多発性膵嚢胞および腎細胞癌腫に伴う多発性両側性腎嚢胞。病気の診断は制限酵素断片長多型（RFLP）状態の知識なしで行われた。
制限酵素はBethsda Research Laboratory（BRL）（Bethesda,MD）、New England Biolabs（Beverly,MA）およびBoehringer Mannheim（Indianapolis,IN）から得られ、使用説明書に従って使用された。δ−32PdCTP（約3000iu/ミリモル）はAmersham（Arlington Heights,IL）からのものである。ノーザンブロッティングに使用された種々のヒト組織ポリアデニル化RNAは、成人腎臓二本鎖相補的DNA試料としてClonetech（Palo Alto,CA）から購入された。PCRおよびRT−PCR用品はPerkin Elmer/Cetus（Norwalk,CT）から；デオキシヌクレオチド三リン酸および蛍光標識ジデオキシヌクレオチドはApplied Biosystems,Inc（Foster City,CA）から得られた。ナイロン膜はMSI,Inc.（Westlor,MA）から購入された。
方法
サザンおよびノーザンブロッティング、フィルターハイブリダイゼーションおよびプローブ標識はランダムプライミングにより、標準プロトコールにより実施された（Sambrook,J.ら（1989））。DNA挿入物はGeneClean（Bio101）（BioRad,Richmond,CA）プロトコールに従って精製され、サブクローニングまたは標識に使用された。PCRおよびRT−PCRでプライマーとしてまたはシークエンシングのために使用されたオリゴヌクレオチドはApplied Biosystems,Incモデル392DNA/RNA合成機にて使用説明書に従って合成された。パルスフィールドゴール電気泳動はCHEF−DRIIまたはCHEFマッパーXAシステムを用い、所望の分解能を得るために最適の条件下、説明書（BioRad）に記載されているように実施された。
PCRは１μＭの各々のプライマー、250μＭの各々のデオキシヌクレオチド三リン酸、５μｌの10X PCR緩衝液（500MM KCl;120MMトリスーHCl、pH8.0;1.5MM MgCl2;および0.1％ゼラチン）および1.25単位のAmpTaq（Cetus）DNAポリメラーゼを含む混合物を50μｌの反応液量で、第一世代自動熱サイクラー（Perkin Elmer/Cetus）中で実施された。PCR条件は、94℃で１分間変性、特定の温度（55−65℃）で１分間アニーリングおよび72℃で４分間の伸長を40サイクル行い続いて72℃の最終伸長７分間からなっていた。
RNA調製およびノーザンブロッティング−全細胞RNAは標準プロトコールに従って（Sambrook,J.ら（1989））病気に冒されたVHL患者のリンパ芽球様細胞株またはグアニジンチオシアネート中の腎臓組織から抽出され、次に5.7M CsCeクッションを通しての遠心分離により単離された。RNA試料は2.2Mホルムアミドを含む１％アガロースゲルでの電気泳動により分離され、ナイロン膜へ移されてg7cDNAプローブにハイブリダイズされた（Sambrook,J.ら（1989））。
RT−PCR−約５μｇの全細胞RNAがVHL患者のリンパ芽球様細胞株または腎臓組織から単離され、2.5ngの正常成人腎臓二本鎖相補的DNA試料の発現がPerkin Elmer/CetusからのRT−PCTキット用いて分析された。プライマーは配列ID番号:1に示されたg7cDNAから誘導されたものであり、反応は種々のアニーリング温度を用いて行われた。反応生成物はゲル電気泳動およびサザンブロッティングにより分析された（Sambrook,J.ら（1989））。
実施例
実施例 １
VHL病遺伝子の単離
VHL病遺伝子の単離は、以前に疾病遺伝子の単離に使用されたポジショナルクローニング戦略（Latifら、Cancer Res.（1993）63:861−867;Trofatterら,Cell（1993）72:791−800およびハンチントン病共同研究グループ;Cell（1993）72:971−983）により行われ、Latifら（Science,印刷中、”フォンヒッペルーリンダウ病腫瘍サプレッサー遺伝子の単離”）により記載されている。VHL遺伝子を含む染色体3p領域の遺伝的および物理的地図は図１に示されている。多点連結分析および減数分裂地図作製（Toryら、1989）により地図上のVHL座位が位置決定され（図１、パネルＡ）；選択された交差の位置は十字により示されている。
YACライブラリースクリーニングおよびYACの分析 WUおよびCEPHYACのコピーは各々Craig Chinault博士（Baylor Institute of Genetics,Houston,Texas）およびDaniel Cohen博士（Centre d'Etude du Polymorphisme Humain,Paris）から入手した。WUおよびCEPHライブラリーはPYAC4ベクター内に構築された全ヒトゲノムライブラリーである（Burke,D.T.ら、Science（1987）236:806−812;Anand,R.ら、Nucleic Acids Res.（1990）18:1951−1956）。これらのライブラリーは、VHL領域中のD3S601、D3S587およびD3S18座位のためのプライマーを使用し、PCRに基づく技術を用いるsib選択（Greene,E.D.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（1990）87:1213−1217）によりスクリーニングされた（図１）。YAC、Y52A10、YA101D4、Y132F2、およびY70D2の同定に有効に使用されたプライマーの配列は配列ID番号:11から配列ID番号:16に示されている：
染色体３コスミドライブラリーのスクリーニングおよび コスミドベクター整列群の組立 染色体３コスミドラブラリーはLermanら（Lerman,M.I.ら、Hum.Genet.（1991）86:567−577）により記載されているように構築された。このライブラリーをBaxendaleら（Baxendale,S.ら、Nucl.Acids Res.（1991）19:6651）により記載されているようなYAC DNA挿入物をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション（Sambrook,J.ら（1989）によりスクリーニングを行った。32P−dCTPで標識後、プローブは1000倍過剰のせん断ヒトDNAと前もって会合させた。コスミドベクター配列群は、全コスミドをプローブとして用い、EcoR I消化コスミドのサザンブロットの重なりあったバンドを見つけだすことにより構築された。コスミドベクター配列群の隙間は挿入末端断片プローブ（制限酵素地図作製および制限ゲノムDNAへのハイブリダイゼーションにより同定された）を用いる染色体歩行により閉じられた。これらの挿入末端断片プローブは各々の歩行工程に使用された。図１はVHL領域をおおう160kbコスミドおよびファージのクローン整列群を示している。ファージT42は前記のように全ゲノムファージライブラリーのYAC DNA挿入物でのスクリーニングにより単離された。VHL病遺伝子を含むファージp191はスリーーヒットP1ファージゲノムライブラリー（GenomeSystem,Inc.St.Louis,MO）を配列ID番号:1に示したg7cDNAのエクソン内から選ばれたプライマーでスクリーニングすることにより単離された。ファージp191は1993年５月13日にATCCに寄託された。
実施例２
VHL病遺伝子に対応するcDNAの単離
cDNAライブラリーのスクリーニング λgt11奇形癌ライブラリー（Maxine Singer博士、National Cancer Institute、から寄贈された）は４×104pfu/150mmフィルターの密度の10゜フィルター固定化cDNAファージクローンへのプラークハイブリダイゼーションにより（Sambrook,J.ら（1989））スクリーニングされた。図１（パネルＢ）λgt11奇形癌cDNAライブラリーをcos11の動原体末端保存的7kb断片をスクリーニングのプローブとして用いたスクリーニングにより単離されたg7cDNAの位置を示している。g7cDNAの配向は配列決定およびベクターの整列群への制限酵素地図作製により確立された。最も小さい構造欠失の始まりはアステリスクおよび線で示されている。制限酵素部位:B、BamH I;E、EcoR I;N、Not I;Nr、Nru I;M、Mlu I。
cDNA配列および配列分析 g7cDNAクローンはブルースクリプトKS（＋）プラスミド（Stratagene,La Jolla,CA）内へサブクローニングされた。Tag Dye Deoxyターミネーターサイクルシークエンシングキット（Applied Biosystems,Inc）で実施された配列決定反応には二本鎖プラスミドDNAが使用された。全ての配列が反応をABI373A自動シークエンシングシステム（Applied Biosystems,Inc）で行うことにより得られた。最初のシークエンシングはT3およびT7プライマーで実施され、次にシークエンシングを続けるために”歩行”プライマーが構築された。cDNAクローンは一つの向きまたは両方の向きで複数回配列決定された。データベース検索、配列編集、配列組立および配列分析はウィスコンシン大学Genetics Computer Group配列分析ソフトウェアーパッケージ、バージョン7.0（Devereax、J.ら、Nucl.Acids Res.（1984）12:387−395）で実施された。g7cDNAの配列は配列ID番号:1に示されている。このcDNAは1993年５月13日にATCCに寄託された。cDNAは284アミノ酸の読み枠（ORF）を明らかにし、残りはmRNAの3'非翻訳領域の一部を表すことを示している。このORFは高い確率で（＞90％）蛋白質コード配列であることを示している（Fickett,J.W.,Nucl.Acids Res.（1982）10:5303）。ヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列のどちらもデータベースの遺伝子または蛋白質と有意の相同性を示さなかった。
実施例３
標的組織でのg7特異的mRNA発現の検出
RNA調製およびノーザンブロッティング分析 VHL遺伝子を同定するためにg7遺伝子座が評価され、それは標的組織での発現を分析することにより行われた。
g7遺伝子の発現パターンはノーザン（RNA）ブロッティングにより試験された。図2Aは低分解能ブロットを示しており、各々のレーンは：レーン１、胎児脳；レーン２、成人脳；レーン３、胎児腎臓；レーン４、成人腎臓；レーン５、小脳；レーン６、成人副腎；レーン７、前立腺からのポリA+mRNA（２μｇ）を含んでおり、一方図2Bは図2Aに示したような組織からの１μｇのポリA+mRNAの高分解能ブロットを示している。転写体の大きさは同一のゲルで行われた全RNAの28Sおよび18S rRNAバンドの位置から決定された。転写体は二つの異なった大きさであり（６および6.5kb）、組織特異的におよび発育により選択的様式で発現された；即ち胎児脳および胎児腎臓では6kbまたは6.5kb種のみが発現されたが、一方成人組織では両方が発現されていた。二つの転写体はg7mRNAの別のスプライス形を表しているのであろう。
実施例４
VHL病に付随するVHL病遺伝子の突然変異の検出
遺伝子発現のRT−PCR研究
家系図中の病気に冒された患者および新しい突然変異患者の構成DNAの突然変異を検出するため、突然変異（即ち、小さな遺伝子内および非重複欠失または挿入）に対する精力的な研究が実行され、221人の非相関VHL患者からの構成DNA中の機能の消失型が検討された。７人の患者の血液から単離され、EcoR Iで消化されたゲノムDNAのサザンブロット分析（Sambrook,J.ら（1989））が図3Aに示されている。このブロットはg7cDNAをプローブとして用い、このプローブはCentre d'Etude du Polymorphisme Humain（CEPH）により提供された100以上の非相関DNA試料での前もっての試験で決定されているように、正常DNAの単一不変20−22kbEcoR I断片を検出することが示されている。異常型バンドの高い発生率（≧12％）が観察され、そのバンドは４から25kbの大きさ（図3A）であり、これらのVHL患者は新しい突然変異と分類された。
20−22kb不変断片に由来する単一異常型バンドがこの断片内の欠失または挿入であることを決定するため、EcoR I以外のいくつかの他の制限酵素分解（BamH I、Bgl I、Bal II、Dra I、EcoR V、Hind III、Pst IおよびPvu II）でサザンブロット分析が実施された。いくつかのこれらの酵素でのサザン分析の結果は図3Bに示されている。これらの結果は突然変異が疾患とともに伝搬されていることを示している（図3C）。図3Dは普通のVHL家族（"P"と略号を付けた）から単離されEcoR Iで消化されたDNAのサザンブロッティング分析の結果を示している。この結果はこのVHL家族における突然変異体対立遺伝子（異常型バンド）の伝搬を明らかに示している（図3Dおよび3E）。
実施例５
VHL病遺伝子の欠失の検出および地図作製
欠失の存在を証明するためおよびそれらの正確な地図作製のため、PCRにより発生されたg7cDNAの領域を表す副断片が、VHL患者の血液から単離されEcoR Iで消化されたゲノムDNAのサザンブロッティング分析のプローブとして使用された。（図４、各々のパネルで使用されたプローブは：図4A、全g7cDNA;図4B、g7cDNAのヌクレオチド３−146;および図4C、g7cDNAのヌクレオチド1277−1600である）。この結果は、cDNAの一部は各々の患者の新規バンドが検出できなかったが、18の再配列は欠失であったことを確実に示している（図４）。
これらの欠失は表１に示したように３つの群に分類できた。
ND＝欠失されていない
D ＝欠失されている
同一のcDNA内で３つの重複欠失が見られたことはg7cDNAをVHL遺伝子と同定する強い証拠を提供する。
実施例６
PCR−SSCPおよびRT−PCRによる遺伝子内欠失または挿入 の検出
遺伝子内欠失または挿入を発見するため、VHL患者リンパ芽球細胞株（リンパ芽球様細胞は標準プロトコール（Nilison,K.ら、Adv.Cancer Res.（1982）37:319−380）に従ってエプスタインーバールウイルスで形質転換され固定されている）から単離されたゲノムDNAが、配列ID番号:3から配列ID番号:8に示したプライマーを用いるPCR−一本鎖コンホメーション多型（PCR−SSCP）により変化が分析され、および特発性腎細胞癌腫（RCC）細胞株（Anglard,P.ら、Cancer Res.（1992）％2:348−356）から単離されたRNAは逆転写ーポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）により分析された。RCC細胞株のRT−PCRに使用されるプライマーは配列ID番号:17から配列ID番号:20として示されている：
配列ID番号:17
配列ID番号:18
配列ID番号:19
配列ID番号:20
ここで配列ID番号:17および配列ID番号:18はプライマーの一つの対であり、配列ID番号:1および配列ID番号:19はプライマーの第二の対である。これらの分析の結果は表２に示されている。
ヌッソンの説によると（Knudson（1971））特発性癌は同一の悪性腫瘍の遺伝性形に冒された同一の遺伝子座の突然変異に付随するべきであるのでRCCが選ばれた。異常パターンが５つのRCC細胞株で同定され、その４つはフレームシフト突然変異を作る小さな（１から10bp）欠失および蛋白質の切り捨てが証明された（表２）。細胞株UMRC5およびRCC"UOK118"は終止コドンが続く28の新規アミノ酸を作る同一の1bp欠失をヌクレオチド737、アミノ酸246に持っている。付随的に、この欠失は新規EcoR I部位を作り、サザンブロットで２つの異常バンドを与えることになる（示されてはいない）。株UMRC6は10bp欠失を持っており（ヌクレオチド715から724）、フレームシフトを作りそのため新規終止コドンの前に32の新規アミノ酸が存在する。最後に、株A498は5bp欠失を持っており（ヌクレオチド638から642）新規62のアミノ酸後に前成熟終止となる。５番目のRCC細胞株（UOK151）において変化はノンセンス突然変異であり、ヌクレオチド761でＣからＡのトランスバージョンが起こり（TCG→TAG）、アミノ酸が切り捨てられる。これらのデータはVHL病遺伝子は特発性腎臓癌に重要な役割を果たしていることを示唆している。そのため、本出願に記載されているようなRT−PCRまたはPCR−SSCPは原発性腎臓腫瘍と他の組織または器官から広がった腫瘍を区別するおよび腎臓腫瘍の異なった組織学的型を区別する診断法として使用できる。
VHL患者に由来するVHLリンパ芽球様細胞株のDNAにおいて、疾病によるSSCP異常バンドの分離が配列ID番号:3から配列ID番号:8に示したプライマーを用いて検出された。１つ（患者"VA"）はヌクレオチド714の後に8bp（TTGTCCGT）が挿入されたのが観察された。この挿入は読み枠のシフトを生じ、蛋白質が切り捨てられた。第二の患者（"CS"）は読み枠内に3bpの欠失を持っており、アミノ酸146（イソロイシン）が除去された。最後に、患者"E"は読み枠内に9bpの欠失（ヌクレオチド456から464）を持っており、153−155位の３つのアミノ酸が除去された。これらの結果を合わせると、g7遺伝子はVHLおよび特発性RCC腫瘍サプレッサー遺伝子を表すという結論が強く支持される。
実施例７
種間でのg7cDNAの保存
g7cDNAが哺乳類からドロソフィラおよびウニの範囲の種の間で高度に保存されているかを決定するためにヒト（ホモ サピエンス）、チンパンジー（パン トログロダイテス）、マカク（マカカ ファシキュラリス）、ウシ（ボビスドメスチカス）、ラット（ラッタス ノルビジカス）、マウス（ムス ムスキュラス）、ニワトリ（ガルラス ドメスチカス）、カエル（ゼノパス ラエビス）、ハエ（ドロソフィラ メラノガスター）、ウニ（ストロンジロセトロタス プルプラタス）および酵母（サッカロマイセス セリビゼエ）（すべてBIOSLaboratories（New Haven,CT,USA）から購入された）から単離されたDNAに対しg7cDNAをプローブとして動物園ブロッティングが実施された。（プリ）ハイブリダイゼーションはチャーチ緩衝液（G.M.ChurchおよびW.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,1991（1984））中、65℃で18時間行った。ブロットは0.1xチャーチ緩衝液中、60℃で60分間洗浄した。動物園ブロットの結果は図６に示されている。結果は広範囲の進化的保存を示しており、そのことはg7が基本的生命機能に役だっていること、およびg7が腫瘍抑制の役割も持っていることを暗示している。
全ての引例（即ち、雑誌、論文、および特許など）の内容はここに参照文献として含まれている。
ここに記載した実施例および実施態様は例示の目的のためであり、当業者には明白な種々の修正および変更は本出願の精神および範囲および付随する請求の範囲内に含まれることが理解されよう。
配列表
（２）配列ID番号:1
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:1816塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:2
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:284アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
配列
（２）配列ID番号:3
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:37塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:4
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:5
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:6
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:7
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:8
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:9
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:14アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
配列
（２）配列ID番号:10
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:13アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
配列
（２）配列ID番号:11
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:12
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:13
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:21塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:14
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:21塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:15
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:23塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:16
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:21塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:17
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:18
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:19
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（２）配列ID番号:20
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:24塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
本発明は腫瘍サプレッサー遺伝子の分野である。特に、本発明はフォンヒッペルーリンダウ（VHL）病遺伝子およびその対応するcDNAおよびそのcDNAから誘導されるプローブを用いたVHL病遺伝子保有者の検出法に関する。
【発明の背景】
フォンヒッペルーリンダウ（VHL）病は家族性癌症候群である。この病気は常染色体性優性遺伝病であり、VHL病遺伝子での突然変異に対してヘテロ接合性である患者は種々の癌（最も頻繁であるのは中枢神経系の血管芽腫および網膜、腎細胞癌（RCC）および褐色細胞腫）の素因を持っている。この病気の多機構特性から（各々の標的器官で多様な腫瘍が形成されるであろうことを合わせて）患者の平均余命を49歳に減少させることにより示されるようにかなりの発病率および死亡率が報告されている（McKusick,V.A.,Mendelian Inheritance in Man（1983）Johns Hopkins University Press,Baltimore and London,p534−535）。VHL病の罹患率は36,000人に１人であるが、その晩発性のためほとんどの人は遺伝性VHL病を持っていることを認識する前に子供をもうけている。多年に渡ってこの病気の症状発現前または出生前診断の唯一の方法は、VHL家族のすべての無症候性構成員の目、脳および腹部の定期的な検査であった。都合の悪いことに、単一の器官に限定される病気であっても、病気の検出を確かなものにするにはすべての標的器官の試験が必要となる。これらの試験の不便さおよびその費用に加え、それらからは決定的な診断情報が得られられないであろうというさらなる欠点を持っている。従って、危険性を持っている個体のVHL病の確実な診断を可能にする方法を開発するため研究者はVHL病遺伝子を同定および単離することに努力を集中させてきた。
これらの研究の結果からVHL病遺伝子は腫瘍サプレッサー遺伝子のファミリーの一員であること（Tory,K J.ら、Natl.Canc.Inst.（1989）81:1097−1101;Maher,E.R.ら、J.Med.Genet.（1990）27:311−314）およびそれがヒト癌発生のヌッソン理論に従って振る舞うこと（Knudson,A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1971）68:816−823）が示されている。さらに、VHL病遺伝子に固く連結されたDNAマーカーの同定によりヒト染色体3p25−p26にVHL病遺伝子が位置していることが示された（Hosoe,S.ら、Genomics（1990）8:634−640;Maher,E.R.ら、Genomics（1990）8:957−960;Glenn,G.M.ら、Hum.Genet.（1990）8:207−210,Latif,F.ら、Am J.Hum.Genet.（1992）51（suppl）A63;Tory,K.ら、Genomics（1992）13:275−286;Richards,F.M.ら、J.Med.Genet.（1993）30:104−107;Seizinger,B.R.ら、Nature（1988）332:268−269;Seizinger,B.R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1991）88:2864−2868およびVance J.M.ら、Am J.Hum.Genet.（1993）51:203−209）。最近、Glennら（Glenn,G.M.JAMA（1992）1226−1231）はVHL病の危険性を持つ家族の構成員である人から単離されたDNAの制限酵素断片多型分析によりVHL病遺伝子への連結を検出するため、VHL病遺伝子に隣接するDNAマーカーをプローブとして使用した。このDNA多型法はVHL病遺伝子の保有者の同定の正確さを増加させるが、DNA多型分析がVHL病遺伝子それ自身を検出しない場合は本来的に無効である。さらに最近、VHL領域に位置する遺伝子がクローン化された（Latif,F.ら、Cancer Res.（1993）63:861−867）。しかしながら、この遺伝子はVHL患者の突然変異を検出することができないことが見いだされ、それ故VHL病遺伝子保有者を100％の精度で同定できる方法に利用することは現在のところできない。しかし、最近同定および単離されたVHL病遺伝子（Latif,F.ら、Science、印刷中、”フォンヒッペルーリンダウ病腫瘍サプレッサー遺伝子の同定”）およびその対応するcDNAはVHL病遺伝子の保有者の確実な検出を提供する診断法の開発を可能にするにちがいない。
【発明の開示】
発明の要約
本発明はフォンヒッペルーリンダウ（VHL）病遺伝子およびその対応するcDNAに関する。
本発明はまたVHL病遺伝子保有者の検出法にも関する。第一の方法はVHL病に付随するVHL病遺伝子の突然変異について被験者のDNAを分析することを含んでいる。
第二の方法はVHL病に付随するVHL特異的mRNAの突然変異または変化について被験者のRNAを分析することを含んでいる。
第三の方法はVHL病に付随するVHL蛋白質発現の変化について被験者の蛋白質を分析する方法を含んでいる。
本発明はまた、VHLcDNAから誘導される組換え体VHL蛋白質、および該VHL蛋白質またはそれらから誘導されるペプチドに対する抗体も含んでいる。
本発明はまた、野生型VHL遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターを保有者に投与することからなるVHL病遺伝子の保有者の処置法にも関する。
本発明はまた、VHL病遺伝子の保有者を検出する診断キットを提供する。本キットはVHL病に付随するVHL病遺伝子の突然変異についてDNAまたはRNAを分析する際にPCRプライマーとして有用な精製され単離された核酸配列を含んでいる。
図の説明
図１（パネルＡ）はVHL遺伝子を含んでいる染色体3p領域の遺伝的および物理的地図を示している。選択されたマーカー間の遺伝的および物理的距離は各々センチモルガンおよびキロ塩基で示されている。選択された交差の位置は十字により示されている。図１（パネルＢ）はVHL領域をおおう160kbコスミドおよびファージのクローン整列群を示している。cos3、cos11、およびファージp191の拡大された制限地図は、cos11の動原体末端からの保存7kb断片でλgt11奇形癌cDNAライブラリーをスクリーニングにより単離されたg7cDNAの位置を詳述している。最も小さい構造欠失の始まりはアステリスクおよび線で示されている。制限酵素部位:B、Bam H1;E、Eco RI;N、Not I;Nr、Nru I;M、Mlu Ｉ。
図2Aおよび2Bは種々のヒト組織中のg7cDNAにより表示された遺伝子発現のノーザンブロット分析を示している。図２（Ａ）は２μｇのポリA+mRNAを含む低分解能ブロットを示しており、組織はレーンの上に示されている。図２（Ｂ）は１μｇのポリA+mRNA形を含む高分解能ブロットを示している：レーン１、胎児脳；レーン２、成人脳；レーン３、胎児腎臓；レーン４、成人腎臓；レーン５、小脳；レーン６、成人副腎；レーン７、前立腺。転写体の大きさは28Sおよび18S rRNAバンドの位置から決定された。
図3A−3Eはプローブとしてg7 cDNAを用いたVHL患者の構造DNA転移突然変異のサザンブロッティング分析による検出を示している。（図3A）７人の非相関VHL患者のリンパ芽球様細胞株からのDNAがEcoR Iで消化され、標準ブロッティング法により分析された。正常不変バンドは約20から22kbであり、多分遺伝子内欠失により生じる異常型バンドの大きさは４から25kbである。患者コード番号はレーンの上に示されている。（図3B）新しい突然変異家族（"S"と略号をつけた）の家系のメンバーのリンパ芽球様細胞株からのDNAがDra I、Hind IIIおよびPst Iで消化された。疾患を持つ（点を付けた丸）および予想される（平行線を付けた丸）人の位置を示した家系図が表示されている（図3C）。男性は四角、および女性は丸で表されている。普通のVHL家族（"P"と略号をつけた）における突然変異体対立遺伝子（異常バンド）の遺伝的伝達。DNAはEcoR Iで消化され、サザンブロッティングにより分析された（図3D）；家系図が示されている（図3E）。
図４はVHL患者のゲノムDNAのサザンブロット分析を示している（各々の患者の頭文字のみが与えられている）。DNAはEcoR Iで消化されg7の異なった領域のプローブが用いられた。パネルA:全g7cDNAプローブ；パネルB:5'末端プローブ、ヌクレオチド３−146;パネルC:3'末端プローブ、ヌクレオチド1277−1600。
図5Aおよび5Bは8bp挿入突然変異を持つVHL患者（表１）のゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応ー一本鎖コンホメーション分析（PCR−SSCP）の結果を示している。DNA配列決定ゲルの一部が示されており、正常（図5A）および714挿入TTGTCCGT突然変異配列（図5B）が示されている。DNA配列はアンチセンス鎖のものであり；従って挿入された塩基は5'ACGGACAA3'である。シークエンシングラダーの横に挿入の位置、および配列から予想される挿入物の種類が示されている。
図６は推定VHL遺伝子の進化的保存を示す”動物園”ブロットの結果を示している。g7cDNAは哺乳類、鳥類、ハエおよびウニからのDNAに交差種相同性を示した。レーン:1、ヒト（ホモ サピエンス）;2、チンパンジー（パン トログロダイテス）;3、マカク（マカカ ファシキュラリス）;4、ウシ（ボビス ドメスチカス）;5、ラット（ラッタス ノルビジカス）;6、マウス（ムス ムスキュラス）;7、ニワトリ（ガルラス ドメスチカス）;8、カエル（ゼノパス ラエビス）;9、ハエ（ドロソフィラ メラノガスター）;10、ウニ（ストロンジロセトロタス プルプラタス）；および11、酵母（サッカロマイセス セリビゼエ）。
発明の詳細な説明
本発明はVHL病遺伝子およびその対応するcDNAに関する。最近、酵母人工染色体（YACS）を用いる遺伝子歩行によりVHL病遺伝子を含むヒト染色体３の領域がクローン化され、クローン化DNAは染色体３特異的ライブラリーからコスミドで回収された（Latifら、Science、印刷中）。VHL病遺伝子を含むファージ191は1993年５月13日にAmerican Type Culture Collection（ATCC）（12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852）に寄託されている（登録番号69311）。このVHL病遺伝子は野生型VHL遺伝子を表しており、ここで野生型とはVHL病を起こさない遺伝子を意味している。
本発明はまたVHL病遺伝子に関連するcDNAにも関している。このcDNA配列は（g7と名付けられた）配列ID番号:1として下に示されており、1993年５月13日にAmerican Type Culture Collectionに寄託された（登録番号69312）。このcDNAはまたGenBank登録番号L15409をも持っている。
g7cDNAから演繹されるアミノ酸配列が下記の配列ID番号:2として示されており、配列ID番号:1のヌクレオチド１から出発して851ヌクレオチドまで伸びている。
術語、類似体にはここに特に示した配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を持つ任意の蛋白質またはポリペプチドが含まれ、その中では一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されており、ここに記載したようなVHL蛋白質の機能的特徴を示している。保存的置換の例には、例えば一つのイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような非極性（即ち疎水性）残基の別のものへの置換；アルギニンおよびリジン間、グルタミンおよびアスパラギン間またはグリシンおよびセリン間のような一つの極性（即ち親水性）残基の別のものへの置換；リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような一つの塩基性残基の別のものへの置換；またはアスパラギン酸またはグルタミン酸のような一つの酸性残基の別のものへの置換が含まれている。
句、保存的置換はまた、もし得られた蛋白質またはペプチドが必要な機能活性を示すならば非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化した残基の使用を含んでいてもよい。
化学誘導体とは機能的側基の反応により化学的に誘導体化された一つまたはそれ以上の残基を持つVHL蛋白質またはポリペプチドを表している。そのような誘導体化分子の例には、遊離アミノ基が誘導体化されて例えば、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチロキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基が形成されているような分子が含まれるが、それらに制限されるわけではない。遊離カルボキシル基は塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の型のエステルまたはヒドラジドを形成するように誘導化されていてもよい。遊離ヒドロキシル基はＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成するように誘導体化されていてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素はＮ−im−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化されていてもよい。20の標準アミノ酸の一つまたはそれ以上の天然に存在するアミノ酸を含む蛋白質またはポリペプチドのような化学誘導体も含まれる。例えば、プロリンが４−ヒドロキシプロリンに置換されてもよいし；リジンが５−ヒドロキシリジンに置換されてもよいし；ヒスチジンが３−メチルヒスチジンに置換されてもよいし；リジンがオルニチンに置換されてもよい。本発明のVHL蛋白質またはポリペプチドにはまた、必要とされる活性が保持されている限り、その配列がここに示されているような蛋白質またはポリペプチドの配列に関して一つまたはそれ以上の残基の付加および／または欠失を持つ蛋白質またはポリペプチドも含まれている。
本発明はまた、VHL病遺伝子の保有者を検出する方法にも関している。
本発明で開示される検出法は胎児をスクリーンするために出生前に、または彼／彼女の家族歴を通して危険性をもつ被験者をスクリーンするために発症前に使用できることが当業者には理解されるであろう。さらに、これらの方法は腎臓、肺および膀胱癌のような他のヒトの悪性腫瘍にVHL病遺伝子が含まれているかどうかの決定に使用することができる。
本発明の一つの実施態様において、VHL病遺伝子の保有者を検出する方法はVHL病に付随するVHL病遺伝子の突然変異について被験者のDNAを分析すること含んでいる。
本発明の目的のための被験者とは哺乳類を意味しており、突然変異とはVHL病遺伝子の逆位、転座、挿入、欠失または点突然変異を意味している。
DNAの分析のためには、生物学的試料が被験者から得られる。本発明で使用するために得られるであろう生物学的試料の例には組織生検試料、全血、尿、便または病気の診断に通常試験されるその他の試料が含まれるが、それらに制限されるわけではない。好適な生物学的試料は全血または尿である。
いつも必要とされるわけではないが、分析前に生物学的試料からDNAを少なくとも部分的に精製するのが好ましい。例えば、試料中の細胞を破壊した後、試料のフェノール抽出により夾雑する細胞破片および他の蛋白質物質から核酸を抽出できる。フェノール抽出において、水性試料は約等容量の再蒸留フェノールと混合され、遠心分離により二層に分離される。核酸を含む水相をとり、エタノールで沈殿させるとフェノールを含まない核酸が得られる。もしくは、DNAはSidransky,D.ら（Science（1992）256:102−105）またはGlennらの方法（Glenn,G.M.らJAMA（1992）267:1226−1231）に従って生物学的試料から精製できる。分析されるべきDNAは一本鎖でも二本鎖でもよい。
VHL病遺伝子の突然変異についてDNAを分析する方法には、適当な制限酵素で消化した後のサザンブロッティング（制限酵素断片長多型、RFLP）（Bostein,D.Amer.J.Hum.Genet.（1980）69:201−205）、変性勾配電気泳動技術（Myers,R.M.,Nature（1985）313:495−498）、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（Conner,R.ら、EMBO J.（1984）3:13321−1326）、プローブRNAおよび標的DNA間のデュープレックスのRNアーゼ消化（Winter,E.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（1985）82:7575−7579）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Saiki,P.K.ら、Science（1988）239:487−491;米国特許第4,683,195号および第4,683,202号）、リガーゼ連鎖反応（LCR）（欧州特許出願第0,320,308号および0,439,182号）PCR−一本鎖コンホメーション分析（PCR−SSCP）（Orita,M.ら、Genomics（1989）5:874−879;Dean,M.ら、Cell（1990）61:863−871）が含まれる。一つの好適な実施態様において、DNAはサザン分析により分析される。
サザン分析により分析されるべきDNAは一つまたはそれ以上の制限酵素により消化される。本発明で使用されるべき制限酵素はその認識部位の存在または不在がVHL病に結びつくような酵素である。好適な制限酵素にはEcoR I、Hind III、Pst I、Dra I、BamH I、Bgl I、およびPvu IIが含まれる。制限酵素消化に続いて、生じるDNA断片はゲル電気泳動により分離され、断片は標識核酸プローブによるハイブリダイゼーションにより検出される（Southern,E.M.,J.Mol.Biol（1975）98:503−517）。
サザン分析にプローブとして使用される核酸配列は一本鎖または二本鎖の形で標識できる。核酸配列の標識は当業者には既知の技術により実施できる。そのような標識技術で放射性標識および酵素を含ませることができる（Sambrook,J.ら（1989）、”モレキュラークローニング、実験室手引き"Cold Spring Harbor Press,Plainview,New York）。さらに、ピリミジンおよびプリン環へ化学基を結合させる方法（Dale,R.N.K.ら（1973）Pro c.Natl.Acad.Sci.,70:2238−2242;Heck,R.F.（1968）J. Am.Chem.Soc.,90:5518−5523）、化学発光により検出を可能にする方法（Barton,S.K.ら（1992）J.Am.Chem.So c.,114:8736−8740）およびビオチニル化核酸プローブを利用する方法（Johnson,T.K.ら（1983）Anal.Bioche m.,133:126−131;Erickson,P.F.ら（1982）J.of Immun ology Methods,51:241−249;Matthaei,F.S.ら（1986）Anal.Biochem.,157:123−128）および市販品として利用可能な製品を用いて蛍光により検出を可能にする方法を含む信号増幅のための非放射性技術が知られている。プローブの大きさは約200ヌクレオチドから約数千塩基の範囲が可能である。好適なプローブの大きさは約500から約2000ヌクレオチドである。サザン分析でプローブとして使用される各々の核酸は配列ID番号:1に示したcDNA配列の対応する部分と実質的に相同である。”実質的に相同”とはプローブとして使用される核酸と配列ID番号:1に示された対応する配列間の相同性のレベルを意味している。相同性のレベルが70％を超えることが好ましく、最も好ましくは80％を超え、核酸配列が配列ID番号:1に示した配列と90％を超える相同性を持っているのが特に好適である。分離されたDNA断片が標識核酸プローブへハイブリダイズされたら、制限酵素消化パターンはオートラジオグラフィーにより可視化でき、VHL病に付随する制限酵素断片長多型（RFLP）の存在または不在を検討する。
第二の好適な実施態様において、PCR−SSCP（Oritaら（1989）、Deanら（1990））によりVHL病遺伝子内の突然変異についてDNAが分析される。この方法においてPCRで使用するために選択されたプライマー対の各々はVHL病遺伝子内の配列にハイブリダイズするように設計されており、増幅生成物中の突然変異の増幅および続いての検出を可能にするために遺伝子内で適当な距離だけ離れている（少なくとも約50ヌクレオチド）。そのようなVHL遺伝子配列に特異的にハイブリダイズできるプライマー対はVHL遺伝子配列から誘導できる。好適な実施態様において、プライマーは配列ID番号:1に示したcDNA配列から誘導される。対のプライマーの各々は二本鎖標的配列の一つの鎖の3'末端の配列と相同であり、約15から約50塩基長の一本鎖オリゴヌクレオチドである。各々の対は二つのそのようなプライマーを含んでおり、その一つは相補的3'末端であり、他方は標的配列の他の3'末端と相補的である。標的配列は一般的に約100から約300塩基対長であるが、500−600塩基対の大きさにまでなることがある。VHL病遺伝子への十分な特異的ハイブリダイゼーションを得る増幅反応の最適化は本分野ではよく知られており、好適にはアニーリング温度を調節することにより達成される。
本発明はまた、VHL遺伝子内の突然変異についてのDNAの分析に使用するための精製され単離されたプライマーの対も提供する。これらのプライマーの核酸配列は下記配列ID番号３−８に示されている。
配列ID番号:3
本発明のプライマーはオリゴヌクレオチド合成の既知の方法を使用して合成でき（例えば、Agarwalら（1972、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.11:451）のホスホジエステル法、Hsiungら（1979、Nucleic Acids Res.6:1371）のホスホトリエステル法またはBeuacageら（1981、Tetrahedron Letters 22:1859−1862）の自動化ジエチルホスホロアミダイト法）、または天然に存在するかまたはクローン化DNAの単離断片であってもよい。さらに、当業者はオリゴヌクレオチドは種々の製造元から販売されている自動化装置により合成できるか、または会社に注文して製造できることを知っているであろう。一つの実施例において、プライマー伸長生成物の検出および／または同定に適した検出可能な標識（例えば、ビオチン、アビジンまたは放射性標識dNTP）を含むように、または増幅生成物の単離の助けとなる物質（例えば、ビオチンまたはアビジン）で誘導体化できる。一つの好適な実施態様において、配列ID番号:3から配列ID番号:8は合成オリゴヌクレオチドである。
別の実施態様において、プライマー対はHVL病遺伝子の突然変異体形にハイブリダイズするように選択できる。野生型VHL遺伝子配列への非特異的ハイブリダイゼーションが突然変異遺伝子配列の増幅生成物の同定を妨げないように、選択されたプライマー対は突然変異した遺伝子配列へ十分特異的にハイブリダイズするであろう。VHL遺伝子配列内の突然変異にハイブリダイズするプライマー対は生物学的試料のDNA内に存在する特異的突然変異体遺伝子配列の増幅に使用できるであろう。
PCRの増幅生成物は直接的または間接的に検出できる。PCR−SSCP法においては、増幅生成物の直接検出がプライマーの対の標識により行われる。本発明のプライマーを標識するのに適した標識は当業者には既知であり、放射活性標識、ビオチン、アビジン、酵素および蛍光性分子が含まれる。誘導された標識は増幅反応を実施する前にプライマー内に取り込ませることができる。好適な標識法では、放射標識ATPおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼを利用する（Sambrook,J.ら（1989）”モレキュラークローニング、実験室手引き"Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY）。もしくは、所望の標識は増幅反応の間に一つまたはそれ以上の標識されたdNTPの形でプライマー伸長生成物内へ取り込ませることができる。本発明において、標識された増幅PCR生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりPCR生成物を分離して、またはPCR生成物の直接配列決定によりVHL病遺伝子に付随するVHL遺伝子の突然変異を分析できる。
さらに別の実施態様においては、サザンブロットまたはドットブロットにおいて、放射性標識した、またはビオチン標識した核酸プローブとのハイブリダイゼーションによりVHL病遺伝子の突然変異について非標識増幅生成物が分析できる。この実施態様で有用な核酸プローブは前にサザン分析で記載したようなものである。
第二の実施態様において、VHL病遺伝子の保有者を検出する方法はVHL病に付随するVHLー特異的mRNAの突然変異または変化について被験者のRNAを分析することを含んでいる。
この方法によるRNAの分析のためには、血液または腫瘍生験試料に由来するRNAが該被験者から得られる（該腫瘍には目、脳、肝臓、腎臓、膵臓および褐色細胞腫が含まれているが、それらに制限されるわけではない）。
分析されるべきRNAは血液または腫瘍生験試料から全細胞RNAまたはポリ（Ａ）+RNAとして単離できる。全細胞RNAは当業者には既知の方法により単離できる。そのような方法には分別沈澱によるRNAの抽出（Birnbiom,H.C.（1988）Nucleic Acids Res.,16:1487−1497），有機溶媒によるRNAの抽出（Chomczynski,P.ら（1987）Anal.Biochem.,162:156−159）および強い変性剤によるRNAの抽出（Chirgwin,J.M.ら（1979）Biochemisry,18:5294−5299）が含まれる。ポリ（Ａ）+RNAはオリゴｄ（Ｔ）カラムによるアフィニティクロマトグラフィーにより全細胞RNAから選択される（Aviv,H.（1972）Proc.Natl.Acad.Sci.,69:1408−1412）。RNAを単離する好適な方法は全細胞RNAからの酸ーフェノールによる抽出である（Chomczynski,P.1987）。
VHL病に連動するVHL特異的mRNA発現のパターンまたはレベルについてRNAを分析する方法には、ノーザンブロッティング（Alwine,J.C.ら（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.,74:5350−5354）、ドットおよびスロットハイブリダイゼーション（Kafatos,F.C.ら（1979）Nucleic Acids Res.,7:1541−1522）、フィルターハイブリダイゼーション（Hollander,M.C.ら（1990）Biotechniques,9:174−179）RNアーゼ保護（Sambrook,J.ら（1989）”モレキュラークローニング、実験室手引き"Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY）および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）（Watson,J.D.ら（1992）”組換え体DNA"第二版、W.H.Freeman and Company,New York）が含まれる。一つの好適な方法はノーザンブロッティングである。
VHL特異的mRNA発現を検出するためのプローブとして使用される核酸配列は配列ID番号:1と実質的に相同である。”実質的に相同”とは核酸と配列ID番号:1のcDNA配列間の相同性のレベルを意味している。相同性のレベルが70％を超えることが好ましく、より好ましくは80％を超え、特に好適な核酸配列は配列ID番号:1に示したcDNA配列と90％を超える相同性を持っている。
最も好適な方法は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）であり、ここでRNAの逆転写により産生されるcDNAの増幅に使用されるプライマーは配列ID番号:1に示したcDNA配列から誘導される。これらのプライマーは前に記載したように標識でき、RT−PCR生成物の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、またはRT−PCRの生成物の直接的配列決定によりVHL病に付随するVHL遺伝子の突然変異についてRT−PCR生成物が分析できる。
本発明はまた、配列ID番号:1に示したcDNAから誘導される組換え体蛋白質および前記蛋白質（VHL蛋白質と称される）の抗体も含んでいる。組換え体VHL蛋白質は当業者には既知である組換えDNA方法論により産生できる。例えば、配列ID番号:2に示されているアミノ酸配列の全部または一部を含む蛋白質をコードできる核酸配列はベクター内にクローン化でき宿主内へ移され、その中で複製される。本発明の目的に適した核酸配列は配列ID番号:1に示されている配列である。適した発現ベクターにはワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスおよび大腸菌pTRCHIS（Invitrogen Co.San Diego）が含まれるがそれらに制限されるわけではない。適した発現ベクター中でVHL蛋白質の合成を指示できる核酸配列の挿入により産生された組換え体発現ベクターは当業者には既知である方法により大腸菌または適した真核細胞系内へ移すことができる。
発現された組換え体VHL蛋白質を含む細胞、組換え体発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からの細胞溶解物または発現された組換え体VHL蛋白質を含む培養上清液は哺乳類においての抗ーVHL抗体の産生を惹起する免疫源として使用できる。もしくは、配列ID番号:2に示されているアミノ酸配列から免疫源として使用するための合成ペプチドを発生させることができる。免疫源として使用するために好適なペプチド配列が以下に示されている：
配列ID番号:9
第三の実施態様においては、VHL病遺伝子の保有者を検出する方法はVHL病によるVHL蛋白質発現の変化について被験者の蛋白質を分析することを含んでいる。
この方法による蛋白質の分析のためには、蛋白質は腫瘍生験試料および尿などの生物学的試料から得られる。蛋白質は粗溶解物として得ることもできるが、当業者には既知の方法により（Sambrook,J.ら（1989）”モレキュラークローニング、実験室手引き"Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY）さらに精製することもできる。
粗蛋白質溶解物は抗ーVHL抗体を用いてイムノアッセイによりVHL蛋白質について分析できる。
本発明のイムノアッセイはラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイなどであろう。ELISAとして本分野で知られている標準的な技術は、Method in Immunodiagnosis，第二版,RoseおよびBigazz編,John Wiley and Sons,1980およびCampbellらによるMethods of Immunology,W.A.Benjamin,Inc.,1964に記載されており、両方ともここに参照文献として含まれている。そのようなアッセイは本分野において記載されているような直接、間接、競合的または非競合的イムノアッセイであろう。（Oellerich,M.1984,J.Clin.Chem.Clin.Biochem.22:895−904）。
形成されたVHL蛋白質抗ーVHL抗体複合体の検出は、複合体と標識抗ーウサギ抗体のような第二の抗体との反応により達成できる。標識は複合体を適当な蛍光性または発色性試薬の存在下でインキュベートすることにより検出されるような酵素であろう。放射性標識、コロイド金などのような他の検出可能な標識も使用することができる。標識されたVHL蛋白質ー抗ーVHL抗体複合体は次にオートラジオグラフィーにより可視化される。
本発明はまた、VHL病遺伝子の保有者の処置のための方法にも関しており、野生型VHL遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターが保有者に投与される。野生型VHL遺伝子を表す核酸配列は配列ID番号:1に示されている。そのような核酸配列は当業者には既知である方法により適当な発現ベクター内へ挿入される（実施例５）。インビボで高い効率の遺伝子輸送を行うために適している発現ベクターにはレトロウイルス、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスベクターが含まれる。
野生型VHL遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターは静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内または経口で投与できる。好適な投与経路は静脈内である。
本発明はまたVHL病遺伝子の保有者を検出するための診断キットを提供する。この診断キットは精製および単離された配列ID番号:3から配列ID番号:8による核酸配列、VHL病に結びついたVHL病遺伝子の突然変異についてDNAを分析する際にPCRプライマーとして有用な前記配列を含んでいる。
ここに参照した文献および特許はここにすべて参照文献として含まれている。以下の実施例は本発明の種々の態様を例示するものであり、本発明の範囲を制限することを意図しているものではない。
材料
以下の実施例で分析された被験者は米国、欧州およびカナダの眼科医、泌尿器科医、医学遺伝学者および神経外科医により同質と同定された。家族の構成員はルイジアナ、テネシー、ミシシッピ−、バージニア、ペンシルバニア、ニューヨーク、ミシガン、ケベック、ノバスコチア、英国およびオランダに居住している。病気に冒されていることが知られている各々の家族構成員の医学的記録は再検討された。無症候性の家族構成員および診断に不確かさがある家族構成員はNational Institute of Healthの臨床センターで病気の潜在性についてインフォームドコンセントを実施した後試験された。試験は病歴および健康診断からなっている。VHL家族の無症候性の構成員は一つまたはそれ以上の下記の病気の徴候が検出されたら病気に冒されていると考えられた：網膜血管腫、脊髄または小脳の血管芽腫、褐色細胞腫、多発性膵嚢胞および腎細胞癌腫に伴う多発性両側性腎嚢胞。病気の診断は制限酵素断片長多型（RFLP）状態の知識なしで行われた。
制限酵素はBethsda Research Laboratory（BRL）（Bethesda,MD）、New England Biolabs（Beverly,MA）およびBoehringer Mannheim（Indianapolis,IN）から得られ、使用説明書に従って使用された。δ−32PdCTP（約3000iu/ミリモル）はAmersham（Arlington Heights,IL）からのものである。ノーザンブロッティングに使用された種々のヒト組織ポリアデニル化RNAは、成人腎臓二本鎖相補的DNA試料としてClonetech（Palo Alto,CA）から購入された。PCRおよびRT−PCR用品はPerkin Elmer/Cetus（Norwalk,CT）から；デオキシヌクレオチド三リン酸および蛍光標識ジデオキシヌクレオチドはApplied Biosystems,Inc（Foster City,CA）から得られた。ナイロン膜はMSI,Inc.（Westlor,MA）から購入された。
方法
サザンおよびノーザンブロッティング、フィルターハイブリダイゼーションおよびプローブ標識はランダムプライミングにより、標準プロトコールにより実施された（Sambrook,J.ら（1989））。DNA挿入物はGeneClean（Bio101）（BioRad,Richmond,CA）プロトコールに従って精製され、サブクローニングまたは標識に使用された。PCRおよびRT−PCRでプライマーとしてまたはシークエンシングのために使用されたオリゴヌクレオチドはApplied Biosystems,Incモデル392DNA/RNA合成機にて使用説明書に従って合成された。パルスフィールドゴール電気泳動はCHEF−DRIIまたはCHEFマッパーXAシステムを用い、所望の分解能を得るために最適の条件下、説明書（BioRad）に記載されているように実施された。
PCRは１μＭの各々のプライマー、250μＭの各々のデオキシヌクレオチド三リン酸、５μｌの10X PCR緩衝液（500MM KCl;120MMトリスーHCl、pH8.0;1.5MM MgCl2;および0.1％ゼラチン）および1.25単位のAmpTaq（Cetus）DNAポリメラーゼを含む混合物を50μｌの反応液量で、第一世代自動熱サイクラー（Perkin Elmer/Cetus）中で実施された。PCR条件は、94℃で１分間変性、特定の温度（55−65℃）で１分間アニーリングおよび72℃で４分間の伸長を40サイクル行い続いて72℃の最終伸長７分間からなっていた。
RNA調製およびノーザンブロッティング−全細胞RNAは標準プロトコールに従って（Sambrook,J.ら（1989））病気に冒されたVHL患者のリンパ芽球様細胞株またはグアニジンチオシアネート中の腎臓組織から抽出され、次に5.7M CsCeクッションを通しての遠心分離により単離された。RNA試料は2.2Mホルムアミドを含む１％アガロースゲルでの電気泳動により分離され、ナイロン膜へ移されてg7cDNAプローブにハイブリダイズされた（Sambrook,J.ら（1989））。
RT−PCR−約５μｇの全細胞RNAがVHL患者のリンパ芽球様細胞株または腎臓組織から単離され、2.5ngの正常成人腎臓二本鎖相補的DNA試料の発現がPerkin Elmer/CetusからのRT−PCTキット用いて分析された。プライマーは配列ID番号:1に示されたg7cDNAから誘導されたものであり、反応は種々のアニーリング温度を用いて行われた。反応生成物はゲル電気泳動およびサザンブロッティングにより分析された（Sambrook,J.ら（1989））。
実施例
実施例 １
VHL病遺伝子の単離
VHL病遺伝子の単離は、以前に疾病遺伝子の単離に使用されたポジショナルクローニング戦略（Latifら、Cancer Res.（1993）63:861−867;Trofatterら,Cell（1993）72:791−800およびハンチントン病共同研究グループ;Cell（1993）72:971−983）により行われ、Latifら（Science,印刷中、”フォンヒッペルーリンダウ病腫瘍サプレッサー遺伝子の単離”）により記載されている。VHL遺伝子を含む染色体3p領域の遺伝的および物理的地図は図１に示されている。多点連結分析および減数分裂地図作製（Toryら、1989）により地図上のVHL座位が位置決定され（図１、パネルＡ）；選択された交差の位置は十字により示されている。
YACライブラリースクリーニングおよびYACの分析 WUおよびCEPHYACのコピーは各々Craig Chinault博士（Baylor Institute of Genetics,Houston,Texas）およびDaniel Cohen博士（Centre d'Etude du Polymorphisme Humain,Paris）から入手した。WUおよびCEPHライブラリーはPYAC4ベクター内に構築された全ヒトゲノムライブラリーである（Burke,D.T.ら、Science（1987）236:806−812;Anand,R.ら、Nucleic Acids Res.（1990）18:1951−1956）。これらのライブラリーは、VHL領域中のD3S601、D3S587およびD3S18座位のためのプライマーを使用し、PCRに基づく技術を用いるsib選択（Greene,E.D.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（1990）87:1213−1217）によりスクリーニングされた（図１）。YAC、Y52A10、YA101D4、Y132F2、およびY70D2の同定に有効に使用されたプライマーの配列は配列ID番号:11から配列ID番号:16に示されている：
実施例２
VHL病遺伝子に対応するcDNAの単離
cDNAライブラリーのスクリーニング λgt11奇形癌ライブラリー（Maxine Singer博士、National Cancer Institute、から寄贈された）は４×104pfu/150mmフィルターの密度の10゜フィルター固定化cDNAファージクローンへのプラークハイブリダイゼーションにより（Sambrook,J.ら（1989））スクリーニングされた。図１（パネルＢ）λgt11奇形癌cDNAライブラリーをcos11の動原体末端保存的7kb断片をスクリーニングのプローブとして用いたスクリーニングにより単離されたg7cDNAの位置を示している。g7cDNAの配向は配列決定およびベクターの整列群への制限酵素地図作製により確立された。最も小さい構造欠失の始まりはアステリスクおよび線で示されている。制限酵素部位:B、BamH I;E、EcoR I;N、Not I;Nr、Nru I;M、Mlu I。
cDNA配列および配列分析 g7cDNAクローンはブルースクリプトKS（＋）プラスミド（Stratagene,La Jolla,CA）内へサブクローニングされた。Tag Dye Deoxyターミネーターサイクルシークエンシングキット（Applied Biosystems,Inc）で実施された配列決定反応には二本鎖プラスミドDNAが使用された。全ての配列が反応をABI373A自動シークエンシングシステム（Applied Biosystems,Inc）で行うことにより得られた。最初のシークエンシングはT3およびT7プライマーで実施され、次にシークエンシングを続けるために”歩行”プライマーが構築された。cDNAクローンは一つの向きまたは両方の向きで複数回配列決定された。データベース検索、配列編集、配列組立および配列分析はウィスコンシン大学Genetics Computer Group配列分析ソフトウェアーパッケージ、バージョン7.0（Devereax、J.ら、Nucl.Acids Res.（1984）12:387−395）で実施された。g7cDNAの配列は配列ID番号:1に示されている。このcDNAは1993年５月13日にATCCに寄託された。cDNAは284アミノ酸の読み枠（ORF）を明らかにし、残りはmRNAの3'非翻訳領域の一部を表すことを示している。このORFは高い確率で（＞90％）蛋白質コード配列であることを示している（Fickett,J.W.,Nucl.Acids Res.（1982）10:5303）。ヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列のどちらもデータベースの遺伝子または蛋白質と有意の相同性を示さなかった。
実施例３
標的組織でのg7特異的mRNA発現の検出
RNA調製およびノーザンブロッティング分析 VHL遺伝子を同定するためにg7遺伝子座が評価され、それは標的組織での発現を分析することにより行われた。
g7遺伝子の発現パターンはノーザン（RNA）ブロッティングにより試験された。図2Aは低分解能ブロットを示しており、各々のレーンは：レーン１、胎児脳；レーン２、成人脳；レーン３、胎児腎臓；レーン４、成人腎臓；レーン５、小脳；レーン６、成人副腎；レーン７、前立腺からのポリA+mRNA（２μｇ）を含んでおり、一方図2Bは図2Aに示したような組織からの１μｇのポリA+mRNAの高分解能ブロットを示している。転写体の大きさは同一のゲルで行われた全RNAの28Sおよび18S rRNAバンドの位置から決定された。転写体は二つの異なった大きさであり（６および6.5kb）、組織特異的におよび発育により選択的様式で発現された；即ち胎児脳および胎児腎臓では6kbまたは6.5kb種のみが発現されたが、一方成人組織では両方が発現されていた。二つの転写体はg7mRNAの別のスプライス形を表しているのであろう。
実施例４
VHL病に付随するVHL病遺伝子の突然変異の検出
遺伝子発現のRT−PCR研究
家系図中の病気に冒された患者および新しい突然変異患者の構成DNAの突然変異を検出するため、突然変異（即ち、小さな遺伝子内および非重複欠失または挿入）に対する精力的な研究が実行され、221人の非相関VHL患者からの構成DNA中の機能の消失型が検討された。７人の患者の血液から単離され、EcoR Iで消化されたゲノムDNAのサザンブロット分析（Sambrook,J.ら（1989））が図3Aに示されている。このブロットはg7cDNAをプローブとして用い、このプローブはCentre d'Etude du Polymorphisme Humain（CEPH）により提供された100以上の非相関DNA試料での前もっての試験で決定されているように、正常DNAの単一不変20−22kbEcoR I断片を検出することが示されている。異常型バンドの高い発生率（≧12％）が観察され、そのバンドは４から25kbの大きさ（図3A）であり、これらのVHL患者は新しい突然変異と分類された。
20−22kb不変断片に由来する単一異常型バンドがこの断片内の欠失または挿入であることを決定するため、EcoR I以外のいくつかの他の制限酵素分解（BamH I、Bgl I、Bal II、Dra I、EcoR V、Hind III、Pst IおよびPvu II）でサザンブロット分析が実施された。いくつかのこれらの酵素でのサザン分析の結果は図3Bに示されている。これらの結果は突然変異が疾患とともに伝搬されていることを示している（図3C）。図3Dは普通のVHL家族（"P"と略号を付けた）から単離されEcoR Iで消化されたDNAのサザンブロッティング分析の結果を示している。この結果はこのVHL家族における突然変異体対立遺伝子（異常型バンド）の伝搬を明らかに示している（図3Dおよび3E）。
実施例５
VHL病遺伝子の欠失の検出および地図作製
欠失の存在を証明するためおよびそれらの正確な地図作製のため、PCRにより発生されたg7cDNAの領域を表す副断片が、VHL患者の血液から単離されEcoR Iで消化されたゲノムDNAのサザンブロッティング分析のプローブとして使用された。（図４、各々のパネルで使用されたプローブは：図4A、全g7cDNA;図4B、g7cDNAのヌクレオチド３−146;および図4C、g7cDNAのヌクレオチド1277−1600である）。この結果は、cDNAの一部は各々の患者の新規バンドが検出できなかったが、18の再配列は欠失であったことを確実に示している（図４）。
これらの欠失は表１に示したように３つの群に分類できた。
D ＝欠失されている
同一のcDNA内で３つの重複欠失が見られたことはg7cDNAをVHL遺伝子と同定する強い証拠を提供する。
実施例６
PCR−SSCPおよびRT−PCRによる遺伝子内欠失または挿入 の検出
遺伝子内欠失または挿入を発見するため、VHL患者リンパ芽球細胞株（リンパ芽球様細胞は標準プロトコール（Nilison,K.ら、Adv.Cancer Res.（1982）37:319−380）に従ってエプスタインーバールウイルスで形質転換され固定されている）から単離されたゲノムDNAが、配列ID番号:3から配列ID番号:8に示したプライマーを用いるPCR−一本鎖コンホメーション多型（PCR−SSCP）により変化が分析され、および特発性腎細胞癌腫（RCC）細胞株（Anglard,P.ら、Cancer Res.（1992）％2:348−356）から単離されたRNAは逆転写ーポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）により分析された。RCC細胞株のRT−PCRに使用されるプライマーは配列ID番号:17から配列ID番号:20として示されている：
配列ID番号:17
VHL患者に由来するVHLリンパ芽球様細胞株のDNAにおいて、疾病によるSSCP異常バンドの分離が配列ID番号:3から配列ID番号:8に示したプライマーを用いて検出された。１つ（患者"VA"）はヌクレオチド714の後に8bp（TTGTCCGT）が挿入されたのが観察された。この挿入は読み枠のシフトを生じ、蛋白質が切り捨てられた。第二の患者（"CS"）は読み枠内に3bpの欠失を持っており、アミノ酸146（イソロイシン）が除去された。最後に、患者"E"は読み枠内に9bpの欠失（ヌクレオチド456から464）を持っており、153−155位の３つのアミノ酸が除去された。これらの結果を合わせると、g7遺伝子はVHLおよび特発性RCC腫瘍サプレッサー遺伝子を表すという結論が強く支持される。
実施例７
種間でのg7cDNAの保存
g7cDNAが哺乳類からドロソフィラおよびウニの範囲の種の間で高度に保存されているかを決定するためにヒト（ホモ サピエンス）、チンパンジー（パン トログロダイテス）、マカク（マカカ ファシキュラリス）、ウシ（ボビスドメスチカス）、ラット（ラッタス ノルビジカス）、マウス（ムス ムスキュラス）、ニワトリ（ガルラス ドメスチカス）、カエル（ゼノパス ラエビス）、ハエ（ドロソフィラ メラノガスター）、ウニ（ストロンジロセトロタス プルプラタス）および酵母（サッカロマイセス セリビゼエ）（すべてBIOSLaboratories（New Haven,CT,USA）から購入された）から単離されたDNAに対しg7cDNAをプローブとして動物園ブロッティングが実施された。（プリ）ハイブリダイゼーションはチャーチ緩衝液（G.M.ChurchおよびW.Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,1991（1984））中、65℃で18時間行った。ブロットは0.1xチャーチ緩衝液中、60℃で60分間洗浄した。動物園ブロットの結果は図６に示されている。結果は広範囲の進化的保存を示しており、そのことはg7が基本的生命機能に役だっていること、およびg7が腫瘍抑制の役割も持っていることを暗示している。
全ての引例（即ち、雑誌、論文、および特許など）の内容はここに参照文献として含まれている。
ここに記載した実施例および実施態様は例示の目的のためであり、当業者には明白な種々の修正および変更は本出願の精神および範囲および付随する請求の範囲内に含まれることが理解されよう。
配列表
（２）配列ID番号:1
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:1816塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:284アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:37塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:14アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:13アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：未知
（Ｄ）トポロジー：未知
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:21塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:21塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:23塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:21塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ:24塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
配列
Claims (15)
- ATCC受託番号69311として寄託された、VHL遺伝子を含有するファージ。
- （ａ）SEQ ID NO:1に記載の配列を有する核酸分子；
（ｂ）SEQ ID NO:1に記載のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を有する核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そして腫瘍抑制性活性を有する核酸分子；または
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）で定義される核酸分子に対して相補的である核酸分子；
を含む、核酸分子。 - １または複数の以下のペア：
（ａ）SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4の核酸分子；
（ｂ）SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:6の核酸分子；および
（ｃ）SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8の核酸分子；
を含む核酸分子。 - １または複数の以下のペア：
（ａ）SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:18の核酸分子；および
（ｂ）SEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:20の核酸分子；
を含む核酸分子。 - 請求項２に記載の核酸分子を含有する発現ベクター。
- 請求項５に記載のベクターを含有する宿主細胞。
- SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:10に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
- 請求項７に記載のポリペプチドに対する抗体。
- ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項８に記載の抗体。
- 請求項２に記載の核酸分子の突然変異に基づいて生物学的サンプル中のVHL疾患を検出する方法であって、VHL病遺伝子内の配列にハイブリダイズするように設計された、PCRで使用するために選択されたプライマー対でVHL遺伝子をハイブリダイズする工程を含む、前記方法。
- 生物学的サンプル中のVHL疾患遺伝子のアリルを同定する方法であって以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルをVHL疾患遺伝子のアリルについて解析する工程；そして
（ｂ）アリルを請求項２に記載の配列と比較し、それによりアリルを同定する工程；
を含む、前記方法。 - 前記解析する工程がサザンブロット解析、PCR−SSCP、PCR、RT−PCR、またはノザンブロット解析のいずれか、もしくはこれらの組み合わせを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記解析する工程がSEQ ID NO:1に記載のVHL疾患遺伝子配列に由来するプライマーまたはプローブを使用する、請求項11または12に記載の方法。
- サザンブロット解析、およびノザンブロット解析において使用されるプローブを、SEQ ID NO:1のうち以下の断片、３〜146、169〜391、291〜501、585〜940、921〜1231および1277〜1600、から選択される、請求項12または13に記載の方法。
- PCR−SSCP、PCR、およびRT−PCRにおいて使用されるプライマーが、SEQ ID NO:3〜SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17〜SEQ ID NO:20に記載の核酸配列を有する、請求項12または13に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/061,889 | 1993-05-14 | ||
| US08/061,889 US5654138A (en) | 1993-05-14 | 1993-05-14 | Von hippel-lindau (VHL) disease gene and corresponding cDNA and methods for detecting carriers of the VHL disease gene |
| PCT/US1994/005378 WO1994026894A1 (en) | 1993-05-14 | 1994-05-12 | VON HIPPEL-LINDAU (VHL) DISEASE GENE AND CORRESPONDING cDNA AND METHODS FOR DETECTING CARRIERS OF THE VHL DISEASE GENE |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08511158A JPH08511158A (ja) | 1996-11-26 |
| JP3650397B2 true JP3650397B2 (ja) | 2005-05-18 |
Family
ID=22038796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52573994A Expired - Fee Related JP3650397B2 (ja) | 1993-05-14 | 1994-05-12 | フォンヒッペルーリンダウ（ＶＨＬ）病遺伝子および対応するｃＤＮＡおよびＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5654138A (ja) |
| EP (1) | EP0698093B1 (ja) |
| JP (1) | JP3650397B2 (ja) |
| AT (1) | ATE182622T1 (ja) |
| AU (1) | AU696234B2 (ja) |
| CA (1) | CA2162928A1 (ja) |
| DE (1) | DE69419748T2 (ja) |
| DK (1) | DK0698093T3 (ja) |
| ES (1) | ES2135581T3 (ja) |
| GR (1) | GR3030876T3 (ja) |
| WO (1) | WO1994026894A1 (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6312890B1 (en) * | 1993-05-14 | 2001-11-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Partial intron sequence of von hippel-lindau (VHL) disease gene and its use in diagnosis of disease |
| US6013436A (en) * | 1994-07-08 | 2000-01-11 | Visible Genetics, Inc. | Compositions and methods for diagnosis of mutation in the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene |
| US5958684A (en) * | 1995-10-02 | 1999-09-28 | Van Leeuwen; Frederik Willem | Diagnosis of neurodegenerative disease |
| US5789168A (en) * | 1996-05-01 | 1998-08-04 | Visible Genetics Inc. | Method for amplification and sequencing of nucleic acid polymers |
| US5830657A (en) * | 1996-05-01 | 1998-11-03 | Visible Genetics Inc. | Method for single-tube sequencing of nucleic acid polymers |
| US5888736A (en) * | 1995-12-22 | 1999-03-30 | Visible Genetics, Inc. | Method, compositions and kit for detection and identification of microorganisms |
| US6214555B1 (en) | 1996-05-01 | 2001-04-10 | Visible Genetics Inc. | Method compositions and kit for detection |
| US6083699A (en) * | 1996-05-01 | 2000-07-04 | Visible Genetics Inc. | Method for bi-directional sequencing of nucleic acid polymers |
| DE69709087T2 (de) * | 1996-05-01 | 2002-04-25 | Visible Genetics, Inc. | Verfahren zum nachweis und zur identifizierung von mikroorganismen |
| US6413718B1 (en) | 1996-05-01 | 2002-07-02 | Visible Genetics Inc. | Method for sequencing of nucleic acid polymers |
| AU7125401A (en) * | 2000-05-19 | 2001-12-03 | David J Marshall | Materials and methods for detection of nucleic acids |
| AU1317502A (en) | 2000-10-14 | 2002-04-29 | Eragen Biosciences Inc | Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases |
| US7222059B2 (en) | 2001-11-15 | 2007-05-22 | Siemens Medical Solutions Diagnostics | Electrophoretic trace simulator |
| US20050208023A1 (en) * | 2002-07-19 | 2005-09-22 | Krissansen Geoffrey W | Tumor treating composition and methods |
| NZ520322A (en) * | 2002-07-19 | 2005-04-29 | Auckland Uniservices Ltd | Tumor treating composition and methods |
| WO2004061077A2 (en) * | 2002-12-24 | 2004-07-22 | North Carolina State University | Increasing gamete production with a gene switch |
| US7494467B2 (en) * | 2004-04-16 | 2009-02-24 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Medical system having multiple ultrasound transducers or an ultrasound transducer and an RF electrode |
| US9261498B2 (en) * | 2005-03-17 | 2016-02-16 | The Regents Of The University Of California | Biomarker for sensitivity to mTOR inhibitor therapy in kidney cancer |
| WO2012166824A2 (en) * | 2011-05-31 | 2012-12-06 | Oregon Health And Science University | Methods and kits that identify tumors responsive to src inhibitors |
| WO2013028871A1 (en) * | 2011-08-23 | 2013-02-28 | University Of South Florida | Inducible mouse models of lung injury and lung diseases |
| CN110066874A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-07-30 | 复旦大学附属华山医院 | 血管母细胞瘤分型诊断试剂盒 |
-
1993
- 1993-05-14 US US08/061,889 patent/US5654138A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-05-12 JP JP52573994A patent/JP3650397B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-12 AU AU68337/94A patent/AU696234B2/en not_active Ceased
- 1994-05-12 DE DE69419748T patent/DE69419748T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-12 ES ES94916774T patent/ES2135581T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-12 WO PCT/US1994/005378 patent/WO1994026894A1/en not_active Ceased
- 1994-05-12 EP EP94916774A patent/EP0698093B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-12 CA CA002162928A patent/CA2162928A1/en not_active Abandoned
- 1994-05-12 DK DK94916774T patent/DK0698093T3/da active
- 1994-05-12 AT AT94916774T patent/ATE182622T1/de not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-06-05 US US08/462,611 patent/US5759790A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-07-29 GR GR990401912T patent/GR3030876T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2162928A1 (en) | 1994-11-24 |
| JPH08511158A (ja) | 1996-11-26 |
| DE69419748T2 (de) | 1999-12-09 |
| GR3030876T3 (en) | 1999-11-30 |
| ES2135581T3 (es) | 1999-11-01 |
| DE69419748D1 (de) | 1999-09-02 |
| ATE182622T1 (de) | 1999-08-15 |
| EP0698093A1 (en) | 1996-02-28 |
| EP0698093B1 (en) | 1999-07-28 |
| WO1994026894A1 (en) | 1994-11-24 |
| DK0698093T3 (da) | 1999-11-29 |
| AU696234B2 (en) | 1998-09-03 |
| US5654138A (en) | 1997-08-05 |
| US5759790A (en) | 1998-06-02 |
| AU6833794A (en) | 1994-12-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3650397B2 (ja) | フォンヒッペルーリンダウ（ＶＨＬ）病遺伝子および対応するｃＤＮＡおよびＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法 | |
| US5352775A (en) | APC gene and nucleic acid probes derived therefrom | |
| EP0569527B1 (en) | Inherited and somatic mutations of apc gene in colorectal cancer of humans | |
| Latif et al. | Von Hippel-Lindau syndrome: Cloning and identification of the plasma membrane Ca++-transporting ATPase isoform 2 gene that resides in the von Hippel-Lindau gene region | |
| US5487970A (en) | Compositions and methods for detecting gene rearrangements and translocations | |
| JP3944654B2 (ja) | 神経細胞アポトーシスの抑制タンパクとその遺伝子配列、並びに脊髄性筋萎縮症の原因となる当該遺伝子の突然変異 | |
| EP0822993B1 (en) | Diagnostic methods and gene therapy using reagents derived from the human metastasis suppressor gene kai1 | |
| EP0889959B1 (en) | Partial intron sequence of von hippel-lindau (vhl) disease gene and its use in diagnosis of disease | |
| WO1998020143A1 (en) | Reagents and methods useful for detecting diseases of the lung | |
| JPH07143884A (ja) | 腫瘍サプレッサー遺伝子メルリンおよびその用途 | |
| US20020115094A1 (en) | Liver tumor marker sequences | |
| EP1558737A1 (en) | Gene families associated with cancers | |
| JP2004516813A (ja) | 関連腫瘍マーカー | |
| AU760490B2 (en) | Diagnostic methods and gene therapy using reagents derived from the human metastasis suppressor gene KAI1 | |
| WO2002022875A2 (en) | Polymorphisms associated with cardiac arrythmia | |
| AU3708501A (en) | Partial intron sequence of von hippel-lindau (VHL) disease gene and its use in diagnosis of disease | |
| WO2001098456A2 (en) | IDENTIFICATION OF cDNAs ASSOCIATED WITH BENIGN PROSTATIC HYPERPLASIA | |
| WO2004016637A1 (en) | Gene families associated with liver cancer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040514 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040628 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040817 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041005 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041203 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050125 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050218 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100225 Year of fee payment: 5 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |