JPH08511158A - フォンヒッペルーリンダウ（ＶＨＬ）病遺伝子および対応するｃＤＮＡおよびＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はフォンヒッペルーリンダウ（ＶＨＬ）病遺伝子およびその対応するｃＤＮＡに関する。本ｃＤＮＡから誘導されるプローブを使用するＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 フォンヒッペルーリンダウ（ＶＨＬ）病遺伝子 および対応するｃＤＮＡおよびＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法 【技術分野】 本発明は腫瘍サプレッサー遺伝子の分野である。特に、本発明はフォンヒッペ ルーリンダウ（ＶＨＬ）病遺伝子およびその対応するｃＤＮＡおよびそのｃＤＮ Ａから誘導されるプローブを用いたＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法に関する。 【発明の背景】 フォンヒッペルーリンダウ（ＶＨＬ）病は家族性癌症候群である。この病気は 常染色体性優性遺伝病であり、ＶＨＬ病遺伝子での突然変異に対してヘテロ接合 性である患者は種々の癌（最も頻繁であるのは中枢神経系の血管芽腫および網膜 、腎細胞癌（ＲＣＣ）および褐色細胞腫）の素因を持っている。この病気の多機 構特性から（各々の標的器官で多様な腫瘍が形成されるであろうことを合わせて ）患者の平均余命を４９歳に減少させることにより示されるようにかなりの発病 率および死亡率が報告されている（ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｖ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ ｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（１９８３）Ｊｏｈｎｓ Ｈｏ ｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ５３４−５３５）。ＶＨＬ病の罹患率は３６，０００人に１ 人であるが、その晩発性のためほとんどの人は遺伝性ＶＨＬ病を持っていること を認識する前に子供をもうけている。多年に渡ってこの病気の症状発現前または 出生前診断の唯一の方法は、ＶＨＬ家族のすべての無症候性構成員の目、脳およ び腹部の定期的な検査であった。都合の悪いことに、単一の器官に限定される病 気であっても、病気の検出を確かなものにするにはすべての標的器官の試験が必 要となる。これらの試験の不便さおよびその費用に加え、それらからは決定的な 診断情報が得られられないであろうというさらなる欠点を持っている。従って、 危険性を持っている個体のＶＨＬ病の確実な診断を可能にする方法を開発するた め研究者はＶＨＬ病遺伝子を同定および単離することに努力を集中させてきた。 これらの研究の結果からＶＨＬ病遺伝子は腫瘍サプレッサー遺伝子のファミリ ーの一員であること（Ｔｏｒｙ，Ｋ Ｊ．ら、Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ． （１９８９）８１：１０９７−１１０１；Ｍａｈｅｒ，Ｅ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９０）２７：３１１−３１４）およびそれがヒト癌発生の ヌッソン理論に従って振る舞うこと（Ｋｎｕｄｓｏｎ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７１）６８：８１６−８２３）が示されて いる。さらに、ＶＨＬ病遺伝子に固く連結されたＤＮＡマーカーの同定によりヒ ト染色体３ｐ２５−ｐ２６にＶＨＬ病遺伝子が位置していることが示された（Ｈ ｏｓｏｅ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９０）８：６３４−６４０；Ｍａｈ ｅｒ，Ｅ．Ｒ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９０）８：９５７−９６０；Ｇｌｅ ｎｎ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９０）８：２０７−２１０，Ｌ ａｔｉｆ，Ｆ．ら、Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９２）５１（ｓｕｐ ｐｌ）Ａ６３；Ｔｏｒｙ，Ｋ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９２）１３：２７５ −２８６；Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９ ３）３０：１０４−１０７；Ｓｅｉｚｉｎｇｅｒ，Ｂ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（ １９８８）３３２：２６８−２６９；Ｓｅｉｚｉｎｇｅｒ，Ｂ．Ｒ．ら、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２８６４−２８６ ８およびＶａｎｃｅ Ｊ．Ｍ．ら、Ａｍ Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９３ ）５１：２０３−２０９）。最近、Ｇｌｅｎｎら（Ｇｌｅｎｎ，Ｇ．Ｍ．ＪＡＭ Ａ（１９９２）１２２６−１２３１）はＶＨＬ病の危険性を持つ家族の構成員で ある人から単離されたＤＮＡの制限酵素断片多型分析によりＶＨＬ病遺伝子への 連結を検出するため、ＶＨＬ病遺伝子に隣接するＤＮＡマーカーをプローブとし て使用した。このＤＮＡ多型法はＶＨＬ病遺伝子の保有者の同定の正確さを増加 させるが、ＤＮＡ多型分析がＶＨＬ病遺伝子それ自身を検出しない場合は本来的 に無効である。さらに最近、ＶＨＬ領域に位置する遺伝子がクローン化された（ Ｌａｔｉｆ，Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）６３：８６１ー８６ ７）。しかしながら、この遺伝子はＶＨＬ患者の突然変異を検出することができ ないことが見いだされ、それ故ＶＨＬ病遺伝子保有者を１００％の精度で同定で きる方法に利用することは現在のところできない。しかし、最近同定および単離 されたＶＨＬ病遺伝子（Ｌａｔｉｆ，Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、印刷中、”フォ ンヒッ ペルーリンダウ病腫瘍サプレッサー遺伝子の同定”）およびその対応するｃＤＮ ＡはＶＨＬ病遺伝子の保有者の確実な検出を提供する診断法の開発を可能にする にちがいない。 【発明の開示】発明の要約 本発明はフォンヒッペルーリンダウ（ＶＨＬ）病遺伝子およびその対応するｃ ＤＮＡに関する。 本発明はまたＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法にも関する。第一の方法はＶＨＬ 病に付随するＶＨＬ病遺伝子の突然変異について被験者のＤＮＡを分析すること を含んでいる。 第二の方法はＶＨＬ病に付随するＶＨＬ特異的ｍＲＮＡの突然変異または変化 について被験者のＲＮＡを分析することを含んでいる。 第三の方法はＶＨＬ病に付随するＶＨＬ蛋白質発現の変化について被験者の蛋 白質を分析する方法を含んでいる。 本発明はまた、ＶＨＬｃＤＮＡから誘導される組換え体ＶＨＬ蛋白質、および 該ＶＨＬ蛋白質またはそれらから誘導されるペプチドに対する抗体も含んでいる 。 本発明はまた、野生型ＶＨＬ遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターを保有 者に投与することからなるＶＨＬ病遺伝子の保有者の処置法にも関する。 本発明はまた、ＶＨＬ病遺伝子の保有者を検出する診断キットを提供する。本 キットはＶＨＬ病に付随するＶＨＬ病遺伝子の突然変異についてＤＮＡまたはＲ ＮＡを分析する際にＰＣＲプライマーとして有用な精製され単離された核酸配列 を含んでいる。図の説明 図１（パネルＡ）はＶＨＬ遺伝子を含んでいる染色体３ｐ領域の遺伝的および 物理的地図を示している。選択されたマーカー間の遺伝的および物理的距離は各 々センチモルガンおよびキロ塩基で示されている。選択された交差の位置は十字 により示されている。図１（パネルＢ）はＶＨＬ領域をおおう１６０ｋｂコスミ ドおよびファージのクローン整列群を示している。ｃｏｓ３、ｃｏｓ１１、およ びファージｐ１９１の拡大された制限地図は、ｃｏｓ１１の動原体末端からの保 存７ｋｂ断片でλｇｔ１１奇形癌ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングにより 単離されたｇ７ｃＤＮＡの位置を詳述している。最も小さい構造欠失の始まりは アステリスクおよび線で示されている。制限酵素部位：Ｂ、Ｂａｍ Ｈ１；Ｅ、 Ｅｃｏ ＲＩ；Ｎ、Ｎｏｔ Ｉ；Ｎｒ、Ｎｒｕ Ｉ；Ｍ、Ｍｌｕ Ｉ。 図２Ａおよび２Ｂは種々のヒト組織中のｇ７ｃＤＮＡにより表示された遺伝子 発現のノーザンブロット分析を示している。図２（Ａ）は２μｇのポリＡ⁺ｍＲ ＮＡを含む低分解能ブロットを示しており、組織はレーンの上に示されている。 図２（Ｂ）は１μｇのポリＡ⁺ｍＲＮＡ形を含む高分解能ブロットを示している ：レーン１、胎児脳；レーン２、成人脳；レーン３、胎児腎臓；レーン４、成人 腎臓；レーン５、小脳；レーン６、成人副腎；レーン７、前立腺。転写体の大き さは２８Ｓおよび１８Ｓ ｒＲＮＡバンドの位置から決定された。 図３Ａ−３Ｅはプローブとしてｇ７ ｃＤＮＡを用いたＶＨＬ患者の構造ＤＮ Ａ転移突然変異のサザンブロッティング分析による検出を示している。（図３Ａ ）７人の非相関ＶＨＬ患者のリンパ芽球様細胞株からのＤＮＡがＥｃｏＲＩで消 化され、標準ブロッティング法により分析された。正常不変バンドは約２０から ２２ｋｂであり、多分遺伝子内欠失により生じる異常型バンドの大きさは４から ２５ｋｂである。患者コード番号はレーンの上に示されている。（図３Ｂ）新し い突然変異家族（”Ｓ”と略号をつけた）の家系のメンバーのリンパ芽球様細胞 株からのＤＮＡがＤｒａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化された。疾患 を持つ（点を付けた丸）および予想される（平行線を付けた丸）人の位置を示し た家系図が表示されている（図３Ｃ）。男性は四角、および女性は丸で表されて いる。普通のＶＨＬ家族（”Ｐ”と略号をつけた）における突然変異体対立遺伝 子（異常バンド）の遺伝的伝達。ＤＮＡはＥｃｏＲＩで消化され、サザンブロッ ティングにより分析された（図３Ｄ）；家系図が示されている（図３Ｅ）。 図４はＶＨＬ患者のゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を示している（各々の 患者の頭文字のみが与えられている）。ＤＮＡはＥｃｏＲＩで消化されｇ７の異 なった領域のプローブが用いられた。パネルＡ：全ｇ７ｃＤＮＡプローブ；パネ ルＢ：５’末端プローブ、ヌクレオチド３−１４６；パネルＣ：３’末端プロー ブ、ヌクレオチド１２７７−１６００。 図５Ａおよび５Ｂは８ｂｐ挿入突然変異を持つＶＨＬ患者（表１）のゲノムＤ ＮＡのポリメラーゼ連鎖反応ー一本鎖コンホメーション分析（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ ）の結果を示している。ＤＮＡ配列決定ゲルの一部が示されており、正常（図５ Ａ）および７１４挿入TTGTCCGT突然変異配列（図５Ｂ）が示されている。ＤＮＡ 配列はアンチセンス鎖のものであり；従って挿入された塩基は5'ACGGACAA3'であ る。シークエンシングラダーの横に挿入の位置、および配列から予想される挿入 物の種類が示されている。 図６は推定ＶＨＬ遺伝子の進化的保存を示す”動物園”ブロットの結果を示し ている。ｇ７ｃＤＮＡは哺乳類、鳥類、ハエおよびウニからのＤＮＡに交差種相 同性を示した。レーン：１、ヒト（ホモ サピエンス）；２、チンパンジー（パ ン トログロダイテス）；３、マカク（マカカ ファシキュラリス）；４、ウシ （ボビス ドメスチカス）；５、ラット（ラッタス ノルビジカス）；６、マウ ス（ムス ムスキュラス）；７、ニワトリ（ガルラス ドメスチカス）；８、カ エル（ゼノパス ラエビス）；９、ハエ（ドロソフィラ メラノガスター）；１ ０、ウニ（ストロンジロセトロタス プルプラタス）；および１１、酵母（サッ カロマイセス セリビゼエ）。発明の詳細な説明 本発明はＶＨＬ病遺伝子およびその対応するｃＤＮＡに関する。最近、酵母人 工染色体（ＹＡＣＳ）を用いる遺伝子歩行によりＶＨＬ病遺伝子を含むヒト染色 体３の領域がクローン化され、クローン化ＤＮＡは染色体３特異的ライブラリー からコスミドで回収された（Ｌａｔｉｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、印刷中）。ＶＨＬ 病遺伝子を含むファージ１９１は１９９３年５月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔ ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１２３０１ Ｐ ａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２）に寄託 されている（登録番号６９３１１）。このＶＨＬ病遺伝子は野生型ＶＨＬ遺伝子 を表しており、ここで野生型とはＶＨＬ病を起こさない遺伝子を意味している。 本発明はまたＶＨＬ病遺伝子に関連するｃＤＮＡにも関している。このｃＤＮ Ａ配列は（ｇ７と名付けられた）配列ＩＤ番号：１として下に示されており、１ ９９３年５月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌ ｅｃｔｉｏｎに寄託された（登録番号６９３１２）。このｃＤＮＡはまたＧｅｎ Ｂａｎｋ登録番号Ｌ１５４０９をも持っている。 ヌクレオチドに使用された略号は本分野で標準的に使用されるものである。 ｇ７ｃＤＮＡから演繹されるアミノ酸配列が下記の配列ＩＤ番号：２として示 されており、配列ＩＤ番号：１のヌクレオチド１から出発して８５１ヌクレオチ ドまで伸びている。 配列ＩＤ番号：１に示したｃＤＮＡ配列内で変異が企図され、それは配列ＩＤ 番号：２に示した蛋白質の類似体の産生を指示することができるＤＮＡ配列を生 じさせるであろう。前に示したＤＮＡ配列は本発明の好適な実施態様を表してい ることに注意するべきである。遺伝コードは縮重しているため、このＶＨＬ蛋白 質またはその類似体の産生を指示することができるＤＮＡ配列に至る多数のヌク レオチドの選択がなされるであろうことを理解しなければならない。そのように 、前に示した配列と機能的に等価である、または前に示したアミノ酸配列に従っ て産生されるＶＨＬ蛋白質の類似体の産生を指示するであろう配列と機能的に等 価であるＤＮＡ配列は本発明の範囲に含まれるべきことが意図されている。 術語、類似体にはここに特に示した配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を 持つ任意の蛋白質またはポリペプチドが含まれ、その中では一つまたはそれ以上 のアミノ酸残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されており、ここに記載し たようなＶＨＬ蛋白質の機能的特徴を示している。保存的置換の例には、例えば 一つのイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような非極性（即ち 疎水性）残基の別のものへの置換；アルギニンおよびリジン間、グルタミンおよ びアスパラギン間またはグリシンおよびセリン間のような一つの極性（即ち親水 性）残基の別のものへの置換；リジン、アルギニンまたはヒスチジンのような一 つの塩基性残基の別のものへの置換；またはアスパラギン酸またはグルタミン酸 のような一つの酸性残基の別のものへの置換が含まれている。 句、保存的置換はまた、もし得られた蛋白質またはペプチドが必要な機能活性 を示すならば非誘導体化残基の代わりに化学的に誘導体化した残基の使用を含ん でいてもよい。 化学誘導体とは機能的側基の反応により化学的に誘導体化された一つまたはそ れ以上の残基を持つＶＨＬ蛋白質またはポリペプチドを表している。そのような 誘導体化分子の例には、遊離アミノ基が誘導体化されて例えば、アミン塩酸塩、 ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチロキシカルボニル基 、クロロアセチル基またはホルミル基が形成されているような分子が含まれるが 、それらに制限されるわけではない。遊離カルボキシル基は塩、メチルおよびエ チルエステルまたは他の型のエステルまたはヒドラジドを形成するように誘導化 さ れていてもよい。遊離ヒドロキシル基はＯ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を 形成するように誘導体化されていてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素はＮ −ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成するように誘導体化されていてもよい。２０ の標準アミノ酸の一つまたはそれ以上の天然に存在するアミノ酸を含む蛋白質ま たはポリペプチドのような化学誘導体も含まれる。例えば、プロリンが４−ヒド ロキシプロリンに置換されてもよいし；リジンが５−ヒドロキシリジンに置換さ れてもよいし；ヒスチジンが３−メチルヒスチジンに置換されてもよいし；リジ ンがオルニチンに置換されてもよい。本発明のＶＨＬ蛋白質またはポリペプチド にはまた、必要とされる活性が保持されている限り、その配列がここに示されて いるような蛋白質またはポリペプチドの配列に関して一つまたはそれ以上の残基 の付加および／または欠失を持つ蛋白質またはポリペプチドも含まれている。 本発明はまた、ＶＨＬ病遺伝子の保有者を検出する方法にも関している。 本発明で開示される検出法は胎児をスクリーンするために出生前に、または彼 ／彼女の家族歴を通して危険性をもつ被験者をスクリーンするために発症前に使 用できることが当業者には理解されるであろう。さらに、これらの方法は腎臓、 肺および膀胱癌のような他のヒトの悪性腫瘍にＶＨＬ病遺伝子が含まれているか どうかの決定に使用することができる。 本発明の一つの実施態様において、ＶＨＬ病遺伝子の保有者を検出する方法は ＶＨＬ病に付随するＶＨＬ病遺伝子の突然変異について被験者のＤＮＡを分析す ること含んでいる。 本発明の目的のための被験者とは哺乳類を意味しており、突然変異とはＶＨＬ 病遺伝子の逆位、転座、挿入、欠失または点突然変異を意味している。 ＤＮＡの分析のためには、生物学的試料が被験者から得られる。本発明で使用 するために得られるであろう生物学的試料の例には組織生検試料、全血、尿、便 または病気の診断に通常試験されるその他の試料が含まれるが、それらに制限さ れるわけではない。好適な生物学的試料は全血または尿である。 いつも必要とされるわけではないが、分析前に生物学的試料からＤＮＡを少な くとも部分的に精製するのが好ましい。例えば、試料中の細胞を破壊した後、試 料のフェノール抽出により夾雑する細胞破片および他の蛋白質物質から核酸を抽 出できる。フェノール抽出において、水性試料は約等容量の再蒸留フェノールと 混合され、遠心分離により二層に分離される。核酸を含む水相をとり、エタノー ルで沈澱させるとフェノールを含まない核酸が得られる。もしくは、ＤＮＡはＳ ｉｄｒａｎｓｋｙ，Ｄ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：１０２−１０ ５）またはＧｌｅｎｎらの方法（Ｇｌｅｎｎ，Ｇ．Ｍ．らＪＡＭＡ（１９９２） ２６７：１２２６−１２３１）に従って生物学的試料から精製できる。分析され るべきＤＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよい。 ＶＨＬ病遺伝子の突然変異についてＤＮＡを分析する方法には、適当な制限酵 素で消化した後のサザンブロッティング（制限酵素断片長多型、ＲＦＬＰ）（Ｂ ｏｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８０）６９：２ ０１−２０５）、変性勾配電気泳動技術（Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ （１９８５）３１３：４９５−４９８）、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼー ション（Ｃｏｎｎｅｒ，Ｒ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８４）３：１３３２１− １３２６）、プローブＲＮＡおよび標的ＤＮＡ間のテ゛ュープレックスのＲＮア ーゼ消化（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ．Ｓ．Ａ．（１９８５）８２：７５７５−７５７９）、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４８ ７−４９１；米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号） 、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（欧州特許出願第０，３２０，３０８号および０ ，４３９，１８２号）ＰＣＲ−一本鎖コンホメーション分析（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ ）（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９８９）５：８７４−８７９； Ｄｅａｎ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ（１９９０）６１：８６３−８７１）が含まれる。 一つの好適な実施態様において、ＤＮＡはサザン分析により分析される。 サザン分析により分析されるべきＤＮＡは一つまたはそれ以上の制限酵素によ り消化される。本発明で使用されるべき制限酵素はその認識部位の存在または不 在がＶＨＬ病に結びつくような酵素である。好適な制限酵素にはＥｃｏＲＩ、Ｈ ｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＤｒａＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、およびＰｖｕＩＩ が含まれる。制限酵素消化に続いて、生じるＤＮＡ断片はゲル電気泳動により分 離され、断片は標識核酸プローブによるハイブリダイゼーションにより検出され る（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（１９７５）９８：５ ０３−５１７）。 サザン分析にプローブとして使用される核酸配列は一本鎖または二本鎖の形で 標識できる。核酸配列の標識は当業者には既知の技術により実施できる。そのよ うな標識技術で放射性標識および酵素を含ませることができる（Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ，Ｊ．ら（１９８９）、”モレキュラークローニング、実験室手引き”Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。さらに、ピリミジンおよびプリン環へ化学基を結合させる方法（Ｄ ａｌｅ，Ｒ．Ｎ．Ｋ．ら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ，７０：２２３８−２２４２；Ｈｅｃｋ，Ｒ．Ｆ．（１９６８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ ｅｍ．Ｓｏｃ． ，９０：５５１８−５５２３）、化学発光により検出を可能にす る方法（Ｂａｒｔｏｎ，Ｓ．Ｋ．ら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ，１１４：８７３６−８７４０）およびビオチニル化核酸プローブを利用する方 法（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｋ．ら（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１ ３３：１２６−１３１；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｆ．ら（１９８２）Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ，５１：２４１−２４９：Ｍａｔｔｈａ ｅｉ，Ｆ．Ｓ．ら（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５７：１２３− １２８）および市販品として利用可能な製品を用いて蛍光により検出を可能にす る方法を含む信号増幅のための非放射性技術が知られている。プローブの大きさ は約２００ヌクレオチドから約数千塩基の範囲が可能である。好適なプローブの 大きさは約５００から約２０００ヌクレオチドである。サザン分析でプローブと して使用される各々の核酸は配列ＩＤ番号：１に示したｃＤＮＡ配列の対応する 部分と実質的に相同である。”実質的に相同”とはプローブとして使用される核 酸と配列ＩＤ番号：１に示された対応する配列間の相同性のレベルを意味してい る。相同性のレベルが７０％を超えることが好ましく、最も好ましくは８０％を 超え、核酸配列が配列ＩＤ番号：１に示した配列と９０％を超える相同性を持っ ているのが特に好適である。分離されたＤＮＡ断片が標識核酸プローブへハイブ リダイズされたら、制限酵素消化パターンはオートラジオグラフィーにより可視 化でき、ＶＨＬ病に付随する制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の存在または不在 を検討す る。 第二の好適な実施態様において、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｏｒｉｔａら（１９８９ ）、Ｄｅａｎら（１９９０））によりＶＨＬ病遺伝子内の突然変異についてＤＮ Ａが分析される。この方法においてＰＣＲで使用するために選択されたプライマ ー対の各々はＶＨＬ病遺伝子内の配列にハイブリダイズするように設計されてお り、増幅生成物中の突然変異の増幅および続いての検出を可能にするために遺伝 子内で適当な距離だけ離れている（少なくとも約５０ヌクレオチド）。そのよう なＶＨＬ遺伝子配列に特異的にハイブリダイズできるプライマー対はＶＨＬ遺伝 子配列から誘導できる。好適な実施態様において、プライマーは配列ＩＤ番号： １に示したｃＤＮＡ配列から誘導される。対のプライマーの各々は二本鎖標的配 列の一つの鎖の３’末端の配列と相同であり、約１５から約５０塩基長の一本鎖 オリゴヌクレオチドである。各々の対は二つのそのようなプライマーを含んでお り、その一つは相補的３’末端であり、他方は標的配列の他の３’末端と相補的 である。標的配列は一般的に約１００から約３００塩基対長であるが、５００− ６００塩基対の大きさにまでなることがある。ＶＨＬ病遺伝子への十分な特異的 ハイブリダイゼーションを得る増幅反応の最適化は本分野ではよく知られており 、好適にはアニーリング温度を調節することにより達成される。 本発明はまた、ＶＨＬ遺伝子内の突然変異についてのＤＮＡの分析に使用する ための精製され単離されたプライマーの対も提供する。これらのプライマーの核 酸配列は下記配列ＩＤ番号３−８に示されている。 ここで配列ＩＤ番号：３および配列ＩＤ番号：４はプライマーの一つの対を表 しており；配列ＩＤ番号：５および配列ＩＤ番号：６はプライマーの第二の対を 表しており；および配列ＩＤ番号：７および配列ＩＤ番号：８はプライマーの第 三の対を表している。 本発明のプライマーはオリゴヌクレオチド合成の既知の方法を使用して合成で き（例えば、Ａｇａｒｗａｌら（１９７２、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅ ｄ．Ｅｎｇｌ．１１：４５１）のホスホジエステル法、Ｈｓｉｕｎｇら（１９７ ９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：１３７１）のホスホトリエステ ル法またはＢｅｕａｃａｇｅら（１９８１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ｅｒｓ ２２：１８５９−１８６２）の自動化ジエチルホスホロアミダイト法） 、または天然に存在するかまたはクローン化ＤＮＡの単離断片であってもよい。 さらに、当業者はオリゴヌクレオチドは種々の製造元から販売されている自動化 装置により合成できるか、または会社に注文して製造できることを知っているで あろう。一つの実施例において、プライマー伸長生成物の検出および／または同 定に適した検出可能な標識（例えば、ビオチン、アビジンまたは放射性標識ｄＮ ＴＰ）を含むように、または増幅生成物の単離の助けとなる物質（例えば、ビオ チンまたはアビジン）で誘導体化できる。一つの好適な実施態様において、配列 ＩＤ番号：３から配列ＩＤ番号：８は合成オリゴヌクレオチドである。 別の実施態様において、プライマー対はＶＨＬ病遺伝子の突然変異体形にハイ ブリダイズするように選択できる。野生型ＶＨＬ遺伝子配列への非特異的ハイブ リダイゼーションが突然変異遺伝子配列の増幅生成物の同定を妨げないように、 選択されたプライマー対は突然変異した遺伝子配列へ十分特異的にハイブリダイ ズするであろう。ＶＨＬ遺伝子配列内の突然変異にハイブリダイズするプライマ ー対は生物学的試料のＤＮＡ内に存在する特異的突然変異体遺伝子配列の増幅に 使用できるであろう。 ＰＣＲの増幅生成物は直接的または間接的に検出できる。ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法 においては、増幅生成物の直接検出がプライマー対の標識により行われる。本発 明のプライマーを標識するのに適した標識は当業者には既知であり、放射活性標 識、ビオチン、アビジン、酵素および蛍光性分子が含まれる。誘導された標識は 増幅反応を実施する前にプライマー内に取り込ませることができる。好適な標識 法では、放射標識ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを利用する（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）”モレキュラークローニング、実験室手引き ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， ＮＹ）。もしくは、所望の標識は増幅反応の間に一つまたはそれ以上の標識され たｄＮＴＰの形でプライマー伸長生成物内へ取り込ませることができる。本発明 において、標識された増幅ＰＣＲ生成物は、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳 動によりＰＣＲ生成物を分離して、またはＰＣＲ生成物の直接配列決定によりＶ ＨＬ病遺伝子に付随するＶＨＬ遺伝子の突然変異を分析できる。 さらに別の実施態様においては、サザンブロットまたはドットブロットにおい て、放射性標識した、またはビオチン標識した核酸プローブとのハイブリダイゼ ーションによりＶＨＬ病遺伝子の突然変異について非標識増幅生成物が分析でき る。この実施態様で有用な核酸プローブは前にサザン分析で記載したようなもの である。 第二の実施態様において、ＶＨＬ病遺伝子の保有者を検出する方法はＶＨＬ病 に付随するＶＨＬー特異的ｍＲＮＡの突然変異または変化について被験者のＲＮ Ａを分析することを含んでいる。 この方法によるＲＮＡの分析のためには、血液または腫瘍生験試料に由来する ＲＮＡが該被験者から得られる（該腫瘍には目、脳、肝臓、腎臓、膵臓および褐 色細胞腫が含まれているが、それらに制限されるわけではない）。 分析されるべきＲＮＡは血液または腫瘍生験試料から全細胞ＲＮＡまたはポリ （Ａ）⁺ＲＮＡとして単離できる。全細胞ＲＮＡは当業者には既知の方法により 単離できる。そのような方法には分別沈澱によるＲＮＡの抽出（Ｂｉｒｎｂｉｏ ｍ，Ｈ．Ｃ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：１４ ８７−１４９７），有機溶媒によるＲＮＡの抽出（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ ． ら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９）および 強い変性剤によるＲＮＡの抽出（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら（１９７９）Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｒｙ，１８：５２９４−５２９９）が含まれる。ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡはオリゴｄ（Ｔ）カラムによるアフィニティクロマトグラフィーにより全 細胞ＲＮＡから選択される（Ａｖｉｖ，Ｈ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６９：１４０８−１４１２）。ＲＮＡを単離する好適な方 法は全細胞ＲＮＡからの酸ーフェノールによる抽出である（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓ ｋｉ，Ｐ．１９８７）。 ＶＨＬ病に連動するＶＨＬ特異的ｍＲＮＡ発現のパターンまたはレベルについ てＲＮＡを分析する方法には、ノーザンブロッティング（Ａｌｗｉｎｅ，Ｊ．Ｃ ．ら（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５３５０− ５３５４）、ドットおよびスロットハイブリダイゼーション（Ｋａｆａｔｏｓ， Ｆ．Ｃ．ら（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７：１５４１ −１５２２）、フィルターハイブリダイゼーション（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ｍ． Ｃ．ら（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：１７４−１７９）ＲＮア ーゼ保護（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）”モレキュラークローニング 、実験室手引き”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａ ｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗ ａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９２）”組換え体ＤＮＡ”第二版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒ ｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）が含まれる。一つの 好適な方法はノーザンブロッティングである。 ＶＨＬ特異的ｍＲＮＡ発現を検出するためのプローブとして使用される核酸配 列は配列ＩＤ番号：１と実質的に相同である。”実質的に相同”とは核酸と配列 ＩＤ番号：１のｃＤＮＡ配列間の相同性のレベルを意味している。相同性のレベ ルが７０％を超えることが好ましく、より好ましくは８０％を超え、特に好適な 核酸配列は配列ＩＤ番号：１に示したｃＤＮＡ配列と９０％を超える相同性を持 っている。 最も好適な方法は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）であり、ここ でＲＮＡの逆転写により産生されるｃＤＮＡの増幅に使用されるプライマーは配 列ＩＤ番号：１に示したｃＤＮＡ配列から誘導される。これらのプライマーは前 に記載したように標識でき、ＲＴ−ＰＣＲ生成物の変性ポリアクリルアミドゲル 電気泳動により、またはＲＴ−ＰＣＲの生成物の直接的配列決定によりＶＨＬ病 に付随するＶＨＬ遺伝子の突然変異についてＲＴ−ＰＣＲ生成物が分析できる。 本発明はまた、配列ＩＤ番号：１に示したｃＤＮＡから誘導される組換え体蛋 白質および前記蛋白質（ＶＨＬ蛋白質と称される）の抗体も含んでいる。組換え 体ＶＨＬ蛋白質は当業者には既知である組換えＤＮＡ方法論により産生できる。 例えば、配列ＩＤ番号：２に示されているアミノ酸配列の全部または一部を含む 蛋白質をコードできる核酸配列はベクター内にクローン化でき宿主内へ移され、 その中で複製される。本発明の目的に適した核酸配列は配列ＩＤ番号：１に示さ れている配列である。適した発現ベクターにはワクシニアウイルスベクター、バ キュロウイルスおよび大腸菌ｐＴＲＣＨＩＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．Ｓ ａｎ Ｄｉｅｇｏ）が含まれるがそれらに制限されるわけではない。適した発現 ベクター中でＶＨＬ蛋白質の合成を指示できる核酸配列の挿入により産生された 組換え体発現ベクターは当業者には既知である方法により大腸菌または適した真 核細胞系内へ移すことができる。 発現された組換え体ＶＨＬ蛋白質を含む細胞、組換え体発現ベクターでトラン スフェクトされた細胞からの細胞溶解物または発現された組換え体ＶＨＬ蛋白質 を含む培養上清液は哺乳類においての抗ーＶＨＬ抗体の産生を惹起する免疫源と して使用できる。もしくは、配列ＩＤ番号：２に示されているアミノ酸配列から 免疫源として使用するための合成ペプチドを発生させることができる。免疫源と して使用するために好適なペプチド配列が以下に示されている： 免疫源を哺乳類に純粋なまたは実質的に純粋な形で投与することは可能である が、医薬組成物、処方または調製品として存在させるのが好適である。免疫化に 適した哺乳類はマウス、ウサギなどである。本発明の抗ーＶＨＬ抗体は典型的に は哺乳類を免疫学的に有効量の本発明の合成ペプチドで免疫することにより産生 される。そのようなペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体 の調製は本分野ではよく知られている（Ｓｔａｎｄｔら（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ ．Ｍｅｄ．１５７：６８７−７０４）。組換え体ＶＨＬ蛋白質で哺乳類を免疫す ることにより誘導された抗ーＶＨＬペプチド抗体分子を哺乳類から集め、例えば イムノクロマトグラフィーのようなよく知られた技術によりそれらのＶＨＬ蛋白 質に対する免疫特異性を所望の程度まで上げる。 第三の実施態様においては、ＶＨＬ病遺伝子の保有者を検出する方法はＶＨＬ 病によるＶＨＬ蛋白質発現の変化について被験者の蛋白質を分析することを含ん でいる。 この方法による蛋白質の分析のためには、蛋白質は腫瘍生験試料および尿など の生物学的試料から得られる。蛋白質は粗溶解物として得ることもできるが、当 業者には既知の方法により（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９）”モレキュ ラークローニング、実験室手引き”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐ ｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）さらに精製することもできる。 粗蛋白質溶解物は抗ーＶＨＬ抗体を用いてイムノアッセイによりＶＨＬ蛋白質 について分析できる。 本発明のイムノアッセイはラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセ イ、免疫蛍光アッセイ、酵素イムノアッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学 的アッセイなどであろう。ＥＬＩＳＡとして本分野で知られている標準的な技術 は、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ，第二版，Ｒｏｓｅ およびＢｉｇａｚｚｉ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９８０ およびＣａｍｐｂｅｌｌらによるＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，１９６４に記載されており、両方とも ここに参照文献として含まれている。そのようなアッセイは本分野において記載 されているような直接、間接、競合的または非競合的イムノアッセイであろう。 （Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ，Ｍ．１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． ２２：８９５−９０４）。 形成されたＶＨＬ蛋白質抗ーＶＨＬ抗体複合体の検出は、複合体と標識抗ーウ サギ抗体のような第二の抗体との反応により達成できる。標識は複合体を適当な 蛍光性または発色性試薬の存在下でインキュベートすることにより検出されるよ うな酵素であろう。放射性標識、コロイド金などのような他の検出可能な標識も 使用することができる。標識されたＶＨＬ蛋白質ー抗ーＶＨＬ抗体複合体は次に オートラジオグラフィーにより可視化される。 本発明はまた、ＶＨＬ病遺伝子の保有者の処置のための方法にも関しており、 野生型ＶＨＬ遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターが保有者に投与される。 野生型ＶＨＬ遺伝子を表す核酸配列は配列ＩＤ番号：１に示されている。そのよ うな核酸配列は当業者には既知である方法により適当な発現ベクター内へ挿入さ れる（実施例５）。インビボで高い効率の遺伝子輸送を行うために適している発 現ベクターにはレトロウイルス、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスベク ターが含まれる。 野生型ＶＨＬ遺伝子を表す核酸配列を含む発現ベクターは静脈内、筋肉内、皮 下、腹腔内または経口で投与できる。好適な投与経路は静脈内である。 本発明はまたＶＨＬ病遺伝子の保有者を検出するための診断キットを提供する 。この診断キットは精製および単離された配列ＩＤ番号：３から配列ＩＤ番号： ８による核酸配列、ＶＨＬ病に結びついたＶＨＬ病遺伝子の突然変異についてＤ ＮＡを分析する際にＰＣＲプライマーとして有用な前記配列を含んでいる。 ここに参照した文献および特許はここにすべて参照文献として含まれている。 以下の実施例は本発明の種々の態様を例示するものであり、本発明の範囲を制限 することを意図しているものではない。材料 以下の実施例で分析された被験者は米国、欧州およびカナダの眼科医、泌尿器 科医、医学遺伝学者および神経外科医により同質と同定された。家族の構成員は ルイジアナ、テネシー、ミシシッピー、バージニア、ペンシルバニア、ニューヨ ーク、ミシガン、ケベック、ノバスコチア、英国およびオランダに居住している 。病気に冒されていることが知られている各々の家族構成員の医学的記録は再検 討された。無症候性の家族構成員および診断に不確かさがある家族構成員はＮａ ｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの臨床センターで病気 の潜在性についてインフォームドコンセントを実施した後試験された。試験は病 歴および健康診断からなっている。ＶＨＬ家族の無症候性の構成員は一つまたは それ以上の下記の病気の徴候が検出されたら病気に冒されていると考えられた： 網膜血管腫、脊椎または小脳の血管芽腫、褐色細胞腫、多発性膵嚢胞および腎細 胞癌腫に伴う多発性両側性腎嚢胞。病気の診断は制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ ）状態の知識なしで行われた。 制限酵素はＢｅｔｈｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢＲ Ｌ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎ ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得られ、使用説明書に従って使用された。δ −³²ＰｄＣＴＰ（約３０００ｉｕ／ミリモル）はＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎ ｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）からのものである。ノーザンブロッティング に使用された種々のヒト組織ポリアデニル化ＲＮＡは、成人腎臓二本鎖相補的Ｄ ＮＡ試料としてＣｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入され た。ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ用品はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ（ Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）から；デオキシヌクレオチド三リン酸および蛍光標識ジ デオキシヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ（Ｆｏ ｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から得られた。ナイロン膜はＭＳＩ，Ｉｎｃ．（Ｗ ｅｓｔｌｏｒ，ＭＡ）から購入された。方法 サザンおよびノーザンブロッティング、フィルターハイブリダイゼーションお よびプローブ標識はランダムプライミングにより、標準プロトコールにより実施 された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９））。ＤＮＡ挿入物はＧｅｎｅＣ ｌｅａｎ（Ｂｉｏ１０１）（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）プロトコ ールに従って精製され、サブクローニングまたは標識に使用された。ＰＣＲおよ びＲＴ−ＰＣＲでプライマーとしてまたはシークエンシングのために使用された オリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃモデル３ ９２ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機にて使用説明書に従って合成された。パルスフィール ドゴール電気泳動はＣＨＥＦ−ＤＲＩＩまたはＣＨＥＦマッパーＸＡシステムを 用い、所望の分解能を得るために最適の条件下、説明書（ＢｉｏＲａｄ）に記載 されているように実施された。 ＰＣＲは１μＭの各々のプライマー、２５０μＭの各々のデオキシヌクレオチ ド三リン酸、５μｌの１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液（５００ＭＭ ＫＣｌ；１２０ＭＭ トリスーＨＣｌ、ｐＨ８．０；１．５ＭＭ ＭｇＣｌ₂；および０．１％ゼラチ ン）および１．２５単位のＡｍｐＴａｑ（Ｃｅｔｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼを含 む混合物を５０μｌの反応液量で、第一世代自動熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）中で実施された。ＰＣＲ条件は、９４℃で１分間変性 、特定の温度（５５ー６５℃）で１分間アニーリングおよび７２℃で４分間の伸 長を４０サイクル行い続いて７２℃の最終伸長７分間からなっていた。 ＲＮＡ調製およびノーザンブロッティング−全細胞ＲＮＡは標準プロトコール に従って（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９））病気に冒されたＶＨＬ患者 のリンパ芽球様細胞株またはグアニジンチオシアネート中の腎臓組織から抽出さ れ、次に５．７Ｍ ＣｓＣｅクッションを通しての遠心分離により単離された。 ＲＮＡ試料は２．２Ｍホルムアミドを含む１％アガロースゲルでの電気泳動によ り分離され、ナイロン膜へ移されてｇ７ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズされ た（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９））。 ＲＴ−ＰＣＲ−約５μｇの全細胞ＲＮＡがＶＨＬ患者のリンパ芽球様細胞株ま たは腎臓組織から単離され、２．５ｎｇの正常成人腎臓二本鎖相補的ＤＮＡ試料 の発現がＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＣｅｔｕｓからのＲＴ−ＰＣＴキット用い て分析された。プライマーは配列ＩＤ番号：１に示されたｇ７ｃＤＮＡから誘導 されたものであり、反応は種々のアニーリング温度を用いて行われた。反応生成 物はゲル電気泳動およびサザンブロッティングにより分析された（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ，Ｊ．ら（１９８９））。 実施例 実施例 １ ＶＨＬ病遺伝子の単離 ＶＨＬ病遺伝子の単離は、以前に疾病遺伝子の単離に使用されたポジショナル クローニング戦略（Ｌａｔｉｆら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）６３： ８６１−８６７：Ｔｒｏｆａｔｔｅｒら，Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：７９１− ８００およびハンチントン病共同研究グループ；Ｃｅｌｌ（１９９３）７２：９ ７１−９８３）により行われ、Ｌａｔｉｆら（Ｓｃｉｅｎｃｅ，印刷中、”フォ ンヒッペルーリンダウ病腫瘍サプレッサー遺伝子の単離”）により記載されてい る。ＶＨＬ遺伝子を含む染色体３ｐ領域の遺伝的および物理的地図は図１に示さ れている。多点連結分析および減数分裂地図作製（Ｔｏｒｙら、１９８９）によ り地図上のＶＨＬ座位が位置決定され（図１、パネルＡ）；選択された交差の位 置は十字により示されている。ＹＡＣライブラリースクリーニングおよびＹＡＣの分析 ＷＵおよびＣＥＰＨ ＹＡＣのコピーは各々Ｃｒａｉｇ Ｃｈｉｎａｕｌｔ博士（Ｂａｙｌｏｒ Ｉｎ ｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）およ びＤａｎｉｅｌ Ｃｏｈｅｎ博士（Ｃｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏ ｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ，Ｐａｒｉｓ）から入手した。ＷＵおよ びＣＥＰＨライブラリーはＰＹＡＣ４ベクター内に構築された全ヒトゲノムライ ブラリーである（Ｂｕｒｋｅ，Ｄ．Ｔ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３６ ：８０６−８１２；Ａｎａｎｄ，Ｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ．（１９９０）１８：１９５１−１９５６）。これらのライブラリーは、ＶＨＬ 領域中のＤ３Ｓ６０１、Ｄ３Ｓ５８７およびＤ３Ｓ１８座位のためのプライマー を使用し、ＰＣＲに基づく技術を用いるｓｉｂ選択（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｅ．Ｄ．ら 、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９０）８７：１２１３−１２ １７）によりスクリーニングされた（図１）。ＹＡＣ、Ｙ５２Ａ１０、ＹＡ１０ １ Ｄ４、Ｙ１３２Ｆ２、およびＹ７０Ｄ２の同定に有効に使用されたプライマーの 配列は配列ＩＤ番号：１１から配列ＩＤ番号：１６に示されている： 染色体３コスミドライブラリーのスクリーニングおよびコスミドベクター整列 群の組立 染色体３コスミドライブラリーはＬｅｒｍａｎら（Ｌｅｒｍａｎ，Ｍ ．Ｉ．ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９１）８６：５６７−５７７）により記 載されているように構築された。このライブラリーをＢａｘｅｎｄａｌｅら（Ｂ ａｘｅｎｄａｌｅ，Ｓ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９１）１９ ：６６５１）により記載されているようなＹＡＣ ＤＮＡ挿入物をプローブとし て用いたコロニーハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８ ９））によりスクリーニングを行った。³²Ｐ−ｄＣＴＰで標識後、プローブは１ ０００倍過剰のせん断ヒトＤＮＡと前もって会合させた。コスミドベクター配列 群は、全コスミドをプローブとして用い、ＥｃｏＲＩ消化コスミドのサザンブロ ットの重なりあったバンドを見つけだすことにより構築された。コスミドベクタ ー配列群の隙間は挿入末端断片プローブ（制限酵素地図作製および制限ゲノムＤ ＮＡへのハイブリダイゼーションにより同定された）を用いる染色体歩行により 閉じられた。これらの挿入末端断片プローブは各々の歩行工程に使用された。図 １はＶＨＬ領域をおおう１６０ｋｂコスミドおよびファージのクローン整列群を 示している。ファージＴ４２は前記のように全ゲノムファージライブラリーのＹ ＡＣ ＤＮＡ挿入物でのスクリーニングにより単離された。ＶＨＬ病遺伝子を含 むファージｐ１９１はスリーーヒットＰ１ファージゲノムライブラリー（Ｇｅｎ ｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を配列ＩＤ番号：１に示した ｇ７ｃＤＮＡのエクソン内から選ばれたプライマーでスクリーニングすることに より単離された。ファージｐ１９１は１９９３年５月１３日にＡＴＣＣに寄託さ れた。 実施例２ ＶＨＬ病遺伝子に対応するｃＤＮＡの単離 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング λｇｔ１１奇形癌ライブラリー（Ｍａ ｘｉｎｅ Ｓｉｎｇｅｒ博士、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔ ｕｔｅ、から寄贈された）は４ｘ１０⁴ｐｆｕ／１５０ｍｍフィルターの密度の １０°フィルター固定化ｃＤＮＡファージクローンへのプラークハイブリダイゼ ーションにより（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９））スクリーニングされ た。図１（パネルＢ）λｇｔ１１奇形癌ｃＤＮＡライブラリーをｃｏｓ１１の動 原体末端保存的７ｋｂ断片をスクリーニングのプローブとして用いたスクリーニ ングにより単離されたｇ７ｃＤＮＡの位置を示している。ｇ７ｃＤＮＡの配向は 配列決定およびベクターの整列群への制限酵素地図作製により確立された。最も 小さい構造欠失の始まりはアステリスクおよび線で示されている。制限酵素部位 ：Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｎｒ、ＮｒｕＩ；Ｍ、Ｍｌ ｕＩ。 ｃＤＮＡ配列および配列分析 ｇ７ｃＤＮＡクローンはブルースクリプトＫＳ （＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内へサブ クローニングされた。Ｔａｇ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙターミネーターサイクルシー クエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）で実施 された配列決定反応には二本鎖プラスミドＤＮＡが使用された。全ての配列が反 応をＡＢＩ３７３Ａ自動シークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）で行うことにより得られた。最初のシークエンシングは Ｔ３およびＴ７プライマーで実施され、次にシークエンシングを続けるために” 歩行”プライマーが構築された。ｃＤＮＡクローンは一つの向きまたは両方の向 きで複数回配列決定された。データベース検索、配列編集、配列組立および配列 分析はウイスコンシン大学Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ配 列分析ソフトウェアーパッケージ、バージョン７．０（Ｄｅｖｅｒｅａｘ、Ｊ． ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８４）１２：３８７−３９５）で実 施された。ｇ７ｃＤＮＡの配列は配列ＩＤ番号：１に示されている。このｃＤＮ Ａは１９９３年５月１３日にＡＴＣＣに寄託された。ｃＤＮＡは２８４アミノ酸 の読み枠（ＯＲＦ）を明らかにし、残りはｍＲＮＡの３’非翻訳領域の一部を表 すことを示している。このＯＲＦは高い確率で（＞９０％）蛋白質コード配列で あることを示している（Ｆｉｃｋｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ．（１９８２）１０：５３０３）。ヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸 配列のどちらもデータベースの遺伝子または蛋白質と有意の相同性を示さなかっ た。 実施例３ 標的組織でのｇ７特異的ｍＲＮＡ発現の検出 ＲＮＡ調製およびノーザンブロッティング分析 ＶＨＬ遺伝子を同定するため にｇ７遺伝子座が評価され、それは標的組織での発現を分析することにより行わ れた。 ｇ７遺伝子の発現パターンはノーザン（ＲＮＡ）ブロッティングにより試験さ れた。図２Ａは低分解能ブロットを示しており、各々のレーンは：レーン１、胎 児脳；レーン２、成人脳；レーン３、胎児腎臓；レーン４、成人腎臓；レーン５ 、小脳；レーン６、成人副腎；レーン７、前立腺からのポリＡ⁺ｍＲＮＡ（２μ ｇ）を含んでおり、一方図２Ｂは図２Ａに示したような組織からの１μｇのポリ Ａ⁺ｍＲＮＡの高分解能ブロットを示している。転写体の大きさは同一のゲルで 行われた全ＲＮＡの２８Ｓおよび１８Ｓ ｒＲＮＡバンドの位置から決定された 。転写体は二つの異なった大きさであり（６および６．５ｋｂ）、組織特異的に および発育により選択的様式で発現された；即ち胎児脳および胎児腎臓では６ｋ ｂまたは６．５ｋｂ種のみが発現されたが、一方成人組織では両方が発現されて いた。二つの転写体はｇ７ｍＲＮＡの別のスプライス形を表しているのであろう 。 実施例４ ＶＨＬ病に付随するＶＨＬ病遺伝子の突然変異の検出 遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ研究 家系図中の病気に冒された患者および新しい突然変異患者の構成ＤＮＡの突然 変異を検出するため、突然変異（即ち、小さな遺伝子内および非重複欠失または 挿入）に対する精力的な研究が実行され、２２１人の非相関ＶＨＬ患者からの構 成ＤＮＡ中の機能の消失型が検討された。７人の患者の血液から単離され、Ｅｃ ｏＲＩで消化されたゲノムＤＮＡのサザンブロット分析（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ．ら（１９８９））が図３Ａに示されている。このブロットはｇ７ｃＤＮＡをプ ローブとして用い、このプローブはＣｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏ ｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ（ＣＥＰＨ）により提供された１００以 上の非相関ＤＮＡ試料での前もっての試験で決定されているように、正常ＤＮＡ の単一不変２０−２２ｋｂＥｃｏＲＩ断片を検出することが示されている。異常 型バンドの高い発生率（≧１２％）が観察され、そのバンドは４から２５ｋｂの 大きさ（図３Ａ）であり、これらのＶＨＬ患者は新しい突然変異と分類された。 ２０−２２ｋｂ不変断片に由来する単一異常型バンドがこの断片内の欠失また は挿入であることを決定するため、ＥｃｏＲＩ以外のいくつかの他の制限酵素分 解（ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、Ｂｇ１ＩＩ、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩ Ｉ、ＰｓｔＩおよびＰｖｕＩＩ）でサザンブロット分析が実施された。いくつか のこれらの酵素でのサザン分析の結果は図３Ｂに示されている。これらの結果は 突然変異が疾患とともに伝搬されていることを示している（図３Ｃ）。図３Ｄは 普通のＶＨＬ家族（”Ｐ”と略号を付けた）から単離されＥｃｏＲＩで消化され たＤＮＡのサザンブロッティング分析の結果を示している。この結果はこのＶＨ Ｌ家族における突然変異体対立遺伝子（異常型バンド）の伝搬を明らかに示して いる（図３Ｄおよび３Ｅ）。 実施例５ ＶＨＬ病遺伝子の欠失の検出および地図作製 欠失の存在を証明するためおよびそれらの正確な地図作製のため、ＰＣＲによ り発生されたｇ７ｃＤＮＡの領域を表す副断片が、ＶＨＬ患者の血液から単離さ れＥｃｏＲＩで消化されたゲノムＤＮＡのサザンブロッティング分析のプローブ として使用された。（図４、各々のパネルで使用されたプローブは：図４Ａ、全 ｇ７ｃＤＮＡ；図４Ｂ、ｇ７ｃＤＮＡのヌクレオチド３−１４６；および図４Ｃ 、 ｇ７ｃＤＮＡのヌクレオチド１２７７−１６００である）。この結果は、ｃＤＮ Ａの一部は各々の患者の新規バンドが検出できなかったが、１８の再配列は欠失 であったことを確実に示している（図４）。 これらの欠失は表１に示したように３つの群に分類できた。 同一のｃＤＮＡ内で３つの重複欠失が見られたことはｇ７ｃＤＮＡをＶＨＬ遺 伝子と同定する強い証拠を提供する。 実施例６ ＰＣＲ−ＳＳＣＰおよびＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子内欠失または挿入の検出 遺伝子内欠失または挿入を発見するため、ＶＨＬ患者リンパ芽球様細胞株（リ ンパ芽球様細胞は標準プロトコール（Ｎｉｌｉｓｏｎ，Ｋ．ら、Ａｄｖ．Ｃａｎ ｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８２）３７：３１９−３８０）に従ってエプスタインー バールウイルスで形質転換され固定されている）から単離されたゲノムＤＮＡが 、配列ＩＤ番号：３から配列ＩＤ番号：８に示したプライマーを用いるＰＣＲ− 一本鎖コンホメーション多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）により変化が分析され、およ び特発性腎細胞癌腫（ＲＣＣ）細胞株（Ａｎｇｌａｒｄ，Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９２）％２：３４８−３５６）から単離されたＲＮＡは逆転写 ーポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により分析された。ＲＣＣ細胞株のＲ Ｔ−ＰＣＲに使用されるプライマーは配列ＩＤ番号：１７から配列ＩＤ番号：２ ０として示されている： ここで配列ＩＤ番号：１７および配列ＩＤ番号：１８はプライマーの一つの対で あり、配列ＩＤ番号：１および配列ＩＤ番号：１９はプライマーの第二の対であ る。これらの分析の結果は表２に示されている。 ヌッソンの説によると（Ｋｎｕｄｓｏｎ（１９７１））特発性癌は同一の悪性 腫瘍の遺伝性形に冒された同一の遺伝子座の突然変異に付随するべきであるので ＲＣＣが選ばれた。異常パターンが５つのＲＣＣ細胞株で同定され、その４つは フレームシフト突然変異を作る小さな（１から１０ｂｐ）欠失および蛋白質の切 り捨てが証明された（表２）。細胞株ＵＭＲＣ５およびＲＣＣ”ＵＯＫ１１８” は終止コドンが続く２８の新規アミノ酸を作る同一の１ｂｐ欠失をヌクレオチド ７３７、アミノ酸２４６に持っている。付随的に、この欠失は新規ＥｃｏＲＩ部 位を作り、サザンブロットで２つの異常バンドを与えることになる（示されては いない）。株ＵＭＲＣ６は１０ｂｐ欠失を持っており（ヌクレオチド７１５から ７２４）、フレームシフトを作りそのため新規終止コドンの前に３２の新規アミ ノ酸が存在する。最後に、株Ａ４９８は５ｂｐ欠失を持っており（ヌクレオチド ６３８から６４２）新規６２のアミノ酸後に前成熟終止となる。５番目のＲＣＣ 細胞株（ＵＯＫ１５１）において変化はノンセンス突然変異であり、ヌクレオチ ド７６１でＣからＡのトランスバージョンが起こり（ＴＣＧ→ＴＡＧ）、アミノ 酸が切り捨てられる。これらのデータはＶＨＬ病遺伝子は特発性腎臓癌に重要な 役割を果たしていることを示唆している。そのため、本出願に記載されているよ うなＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰは原発性腎臓腫瘍と他の組織または器 官から広がった腫瘍を区別するおよび腎臓腫瘍の異なった組織学的型を区別する 診断法として使用できる。 ＶＨＬ患者に由来するＶＨＬリンパ芽球様細胞株のＤＮＡにおいて、疾病によ るＳＳＣＰ異常バンドの分離が配列ＩＤ番号：３から配列ＩＤ番号：８に示した プライマーを用いて検出された。１つ（患者”ＶＡ”）はヌクレオチド７１４の 後に８ｂｐ（ＴＴＧＴＣＣＧＴ）が挿入されたのが観察された。この挿入は読み 枠のシフトを生じ、蛋白質が切り捨てられた。第二の患者（”ＣＳ”）は読み枠 内に３ｂｐの欠失を持っており、アミノ酸１４６（イソロイシン）が除去された 。最後に、患者”Ｅ”は読み枠内に９ｂｐの欠失（ヌクレオチド４５６から４６ ４）を持っており、１５３−１５５位の３つのアミノ酸が除去された。これらの 結果を合わせると、ｇ７遺伝子はＶＨＬおよび特発性ＲＣＣ腫瘍サプレッサー遺 伝子を表すという結論が強く支持される。 実施例７ 種間でのｇ７ｃＤＮＡの保存 ｇ７ｃＤＮＡが哺乳類からドロソフィラおよびウニの範囲の種の間で高度に保 存されているかを決定するためにヒト（ホモ サピエンス）、チンパンジー（パ ン トログロダイテス）、マカク（マカカ ファシキュラリス）、ウシ（ボビス ドメスチカス）、ラット（ラッタス ノルビジカス）、マウス（ムス ムスキュ ラス）、ニワトリ（ガルラス ドメスチカス）、カエル（ゼノパス ラエビス） 、ハエ（ドロソフィラ メラノガスター）、ウニ（ストロンジロセトロタス プ ルプラタス）および酵母（サッカロマイセス セリビゼエ）（すべてＢＩＯＳＬ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ，ＵＳＡ）から購入された ）から単離されたＤＮＡに対しｇ７ｃＤＮＡをプローブとして動物園ブロッティ ングが実施された。（プリ）ハイブリダイゼーションはチャーチ緩衝液（Ｇ．Ｍ ．ＣｈｕｒｃｈおよびＷ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，１９９１（１９８４））中、６５℃で１８時間行っ た。ブロットは０．１ｘチャーチ緩衝液中、６０℃で６０分間洗浄した。動物園 ブロットの結果は図６に示されている。結果は広範囲の進化的保存を示しており 、そのことはｇ７が基本的生命機能に役だっていること、およびｇ７が腫瘍抑制 の役割も持っていることを暗示している。 全ての引例（即ち、雑誌、論文、および特許など）の内容はここに参照文献と して含まれている。 ここに記載した実施例および実施態様は例示の目的のためであり、当業者には 明白な種々の修正および変更は本出願の精神および範囲および付随する請求の範 囲内に含まれることが理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラティフ，ファリダ アメリカ合衆国メリーランド州21702，フ レデリック，ガブリエル・コート 803, ナンバー311 (72)発明者 ズバー，バートン アメリカ合衆国メリーランド州20896，ガ ーレット・パーク，オックスフォード・ス トリート 4400 (72)発明者 ラインハン，マーストン アメリカ合衆国メリーランド州20892，ロ ックヴィル，ティルデン・レーン 7009

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＡＴＣＣ寄託番号 の同定特性を持つＶＨＬ病遺伝子を含むファ ージ。 ２．配列ＩＤ番号：１に従った配列を持つＶＨＬ病遺伝子配列またはその類 似体。 ３．配列ＩＤ番号：２を含み、蛋白質をコードしているＶＨＬ病遺伝子また はその類似体。 ４．ＶＨＬ病に付随するＶＨＬ病遺伝子の突然変異について被験者のＤＮＡ を分析することを含むＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法。 ５．該分析の工程がサザンブロット分析を含む請求項第４項に記載の方法。 ６．該サザンブロット分析で使用されるプローブが野生型ＶＨＬ病遺伝子配 列から誘導される請求項第５項に記載の方法。 ７．該配列がｃＤＮＡである請求項第６項に記載の方法。 ８．該ｃＤＮＡまたはその類似体が配列ＩＤ番号：１に従った配列を持つ請 求項第７項に記載の方法。 ９．該分析の工程がＰＣＲ−ＳＳＣＰにより実施される請求項第４項に記載 の方法。 １０．ＰＣＲ−ＳＳＣＰに使用されるプライマーがｃＤＮＡまたはその類似体 から誘導され、配列ＩＤ番号：１に従ったｃＤＮＡ配列を持つ請求項第９項に記 載の方法。 １１．該プライマーが配列ＩＤ番号：３から配列ＩＤ番号：８に従った核酸配 列を持つ請求項第１０項に記載の方法。 １２．ＶＨＬ病に付随するＶＨＬー特異的ｍＲＮＡの突然変異または変化につ いて被験者のＲＮＡを分析することを含むＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法。 １３．該分析の工程がＲＴ−ＰＣＲを含む請求項第１２項に記載の方法。 １４．該ＲＴ−ＰＣＲに使用されるプライマーがｃＤＮＡまたはその類似体か ら誘導され、配列ＩＤ番号：１に従ったｃＤＮＡ配列を持つ請求項第１３項に記 載の方法。 １５．該プライマーが配列ＩＤ番号：１７から配列ＩＤ番号：２０に従った配 列を持つ請求項第１４項に記載の方法。 １６．ＶＨＬ病遺伝子配列から誘導されるプライマー。 １７．該配列がｃＤＮＡである請求項第１５項に記載のプライマー。 １８．該ｃＤＮＡまたはその類似体が配列ＩＤ番号：１に従った配列を持つ請 求項第１６項に記載のプライマー。 １９．該プライマーが配列ＩＤ番号：３から配列ＩＤ番号：８、および配列Ｉ Ｄ番号：１７から配列ＩＤ番号：２０よりなる群から選択される核酸配列を持つ 請求項第１７項に記載のプライマー。 ２０．配列ＩＤ番号：３から配列ＩＤ番号：８、および配列ＩＤ番号：１７か ら配列ＩＤ番号：２０よりなる群から選択される核酸配列を持つプライマーを含 む、ＶＨＬ病遺伝子の保有者の検出に使用するための診断キット。 ２１．ＶＨＬ病に付随するＶＨＬ蛋白質発現の変化について被験者の蛋白質を 分析することを含むＶＨＬ病遺伝子保有者の検出法。 ２２．該分析の工程がウエスタンブロッティングを含む請求項第２０項に記載 の方法。 ２３．該ウエスタンブロッティングに使用される抗体がＶＨＬ蛋白質に対する ものである請求項第２１項に記載の方法。 ２４．請求項第２項に記載の遺伝子配列から誘導される組換え体ＶＨＬ蛋白質 。 ２５．ＶＨＬ蛋白質に対する抗体。 ２６．該抗体がポリクローナルおよびモノクローナル抗体より成る群から選択 される請求項第２５項に記載の抗体。