JP3684205B2 - ラクトコッカス・ラクチスｃｂｔ−１９及びこれを利用した抗菌培養液の分離濃縮物の製造方法並びにこれを包含する化粧料組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はニキビの原因菌に対する抗菌機能を有する乳酸菌株であるラクトコッカス・ラクチスCBT-１９及びこれを利用した抗菌培養液の分離濃縮物の製造方法並びにこの分離濃縮物を包含する化粧料組成物に関するもので、より詳細には、ニキビの原因菌になるプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)の生育を特異的に阻害できて、ニキビの原因菌に対する抗菌機能を有するラクトコッカス・ラクチスCBT-１９及びこれを利用した抗菌培養液の分離濃縮物の製造方法並びにこれを包含する化粧料組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、乳酸菌培養液等は化粧品に適用されてきたが、その適用方法は、菌体及び不溶性成分を除去した乳酸菌培養液を主に利用するものであった。このような乳酸菌培養液には主要成分として乳酸、乳糖、アミノ酸、リン酸塩等が含まれている。これらの成分は皮膚の角質成分に親和的に作用し、皮膚の抗酸化作用、保湿作用、pH調節作用及び皮膚細菌叢の調節作用等ができるので、化粧品に有用に利用されている。従って、色々な乳酸菌培養液がその成分によって、多様な種類の化粧品用素材として開発されてきた。特に、色々な乳酸菌の中でもストレップトコッカス・サーモフィルス菌(Streptococcus thermophilus)、ラクトバシラス(Lactobacillus)及びビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属に属する微生物の中で、保湿効果、活性酸素除去効果及び免疫復活機能を有する乳酸菌培養液が化粧品に主に適用されてきた。但し、継続的な研究の結果、適用される微生物の範囲は次第に広くなっている。
【０００３】
前記従来の技術による化粧品用乳酸菌の培養方法及びこれを利用した化粧料組成物の製造方法に関してもう少し詳しく説明すると、次の通りである。
【０００４】
従来の技術による乳酸菌培養液を利用した化粧料組成物の製造工程は、化粧品用乳酸菌の培養に続き、菌体の分離を行い、更に培養余液またはその乾燥物の製造の後、化粧料組成物の製造を行う工程からなる。
【０００５】
これら製造工程に示されるように、乳酸菌培養液を利用した化粧料組成物を製造するためには、まず、適切な乳酸菌を選択してこれを培養する必要がある。ここで、従来技術においては、このような乳酸菌の培養は一般的にペプトン類、肉エキス、酵母抽出物、ブドウ糖及び無機イオンが組み合わされた醗酵培地を利用して嫌気性醗酵器（装置）内で行われた後に、その培養液から菌体を分離していた。なお、前記分離工程は遠心分離機または限外濾過器を利用して行われることが好ましく、このような方法により菌体が分離された乳酸菌培養液の乾燥粉末化状態、あるいは、液体状態で化粧品成分、増粘剤、乳化剤等と混合して化粧料組成物を製造していた。
【０００６】
一方、炎症性のニキビ疾患に関連する臨床的治療法において、テトラサイクリン(tetracycline)、シンダマイシン(cindamycine)、 エリスロマイシン (erythromycin)等の抗生物質が主に利用されてきた。しかしながら、このような抗生物質を長期間投与する場合、ニキビの原因菌が抗生物質に対して耐性を持つようになり、治療効果が低減するという問題点があった。ニキビ誘発菌のプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)は、その人工的な培養が困難であるので、これらの薬剤に対する感受性実験が根拠の弱いものになり、よって適切な薬剤を選定するのが困難であった。しかも、前記薬剤は全てが抗生物質であるので、化粧品としての利用が不可能であるという問題があった。
【０００７】
このように、従来の技術において、乳酸菌培養液の化粧品への利用は、その培養液に含まれている色々な成分によって保湿効果、免疫復活機能、活性酸素除去機能、有機酸等による静菌作用(Bacteriostatic action)等の付随的な効果を上げるためのものに限られ、特定菌株の生育を阻害することでニキビ等の皮膚疾患を治癒するための適用はなかった。このために、ニキビ等の皮膚疾患は、その治療のために主に抗生物質を利用してきたが、抗生物質は過剰投与による耐性の発生、化粧品には適用できないという限界等の問題点が多かった。このような従来技術の問題点によって、抗菌微生物の培養液を適用するとニキビ等の皮膚疾患を誘発する原因菌の生育を阻害する可能性があり、副作用なくニキビ等の皮膚疾患を根本的に治癒できる機能性化粧品の開発が切実に要求されてきた。
【０００８】
特に、このような抗菌微生物の培養液は耐性等の副作用がなく、抗生物質に比べて日常生活で使われる化粧品に比較的容易に適用できるので、ニキビ等の治療において、その効用が大きい。また、このような効能を持つことができる乳酸菌株、その培養液分離濃縮液の製造方法及びこれを利用した化粧料組成物の必要性は更に大きいといえる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前述の問題点を解決するためになされたもので、ニキビの原因菌であるプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)を選択的に死滅させることができ、ニキビ原因菌の生育を特異的に抑制できる乳酸菌株および、本発明に係る菌株の培養液分離濃縮物の製造方法並びに、このような分離濃縮物を含有することでニキビ予防及び治療効果を備えた化粧料組成物を提供することにその目的がある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は前述の目的を達成するために、ニキビの原因菌であるプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)の生育を特異的に抑制でき、寄託番号KCTC10180BPとして寄託されているラクトコッカス・ラクチスCBT-１９からなる乳酸菌株を提供する。
【００１１】
また、本発明は ３〜５重量%のブドウ糖、０.５〜１重量%の酵母抽出物、１〜１.５重量%の肉エキス、０.５〜１重量%の蛋白加水分解物及び０.０１〜０.１重量%のイオン成分を水に溶解させて、嫌気的醗酵器で殺菌して製造した培養液に、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)の生育を特異的に抑制でき、寄託番号KCTC10180BPとして寄託されているラクトコッカス・ラクチスCBT-１９からなる乳酸菌株を接種して乳酸菌を培養し抗菌物質を発生させる工程と、高速遠心分離または限外濾過により前記乳酸菌培養液から菌体を除去する工程と、
前記菌体が除去された培養余液を分画分子量１０，０００の限外濾過膜に通過させ、前記透過液を再び分画分子量１，０００のナノメートル膜に通過させて、前記培養余液を濃縮させる工程と、
前記濃縮液に無菌水を連続的に加え、その結果物をさらに分画分子量１，０００のナノメートル膜に通過させながら乳酸を除去することにより、分子量１，０００〜１０，０００の範囲のｐＨが中性を示す抗菌物質の分離濃縮物を製造する工程とを含むことを特徴とする乳酸菌培養液の分離濃縮物の製造方法を提供する。
【００１２】
前記本発明に係る分離濃縮液の製造方法において、前記イオン成分は、クエン酸アンモニウム（アンモニウム・シトレート）、酢酸ナトリウム（ソジウム・アセテート）、リン酸二カリウム（ジポタシウム・ホスフェート）、硫酸マグネシウム（マグネシウム・サルフェート）、硫酸マンガン（マンガン・サルフェート）、塩化ナトリウム（ソジウム・クロライド）よりなるグループから選択された少なくとも一つ以上の物質であることが好ましい。
【００１３】
また、前記本発明に係る分離濃縮物の製造方法は、前記抗菌物質の分離濃縮物を製造する工程を実施した後、製造された分離濃縮物に凍結乾燥工程又は噴射式流動層乾燥工程をさらに実施することもできる。これによって、製造された分離濃縮物の貯蔵安全性を向上させることができる。
【００１４】
また、本発明は前記の方法で製造された乳酸菌培養液の分離濃縮物を、０.０１重量%以上の濃度または１０Au/ｇ以上の抗菌活性を有するように含むことを特徴とする化粧料組成物を提供する。このような化粧料組成物はニキビの原因菌の生育を抑制でき、このような組成物を利用して化粧品を製造することによって、ニキビに対する治療効果を上げるようになるものである。
【００１５】
前記本発明に係る組成物において、前記組成物は、適用される化粧品の種類に適合するように油中水型乳化剤、水中油型乳化剤、透明スキン、懸濁スキン、ジェル剤等で製造されることができ、有害細菌に対する静菌作用、美白、保湿、抗酸化効果を表す補助成分としては、ヒアルロン酸ナトリウム（ソジウムヒアルロン酸(Sodium hyaluronic acid)）、ラクトフェリン (Lactoferrin)、血清蛋白質(Serum protein)、パンテチン(Pantethine)、サリチル酸(Salicylic acid)、トリクロサン(Triclosan)等をさらに含むことができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、添付した図面を参照して本発明に係る乳酸菌株、培養液分離濃縮物の製造方法及びこの濃縮物を含む化粧料組成物に関してより詳細に説明する。
【００１７】
前述のように、本発明はニキビの原因菌に特異的な阻害活性を持つ新規の乳酸菌株の開発、前記菌株に対する最適の培養培地及び培養工程の構成、前記培養（発酵）を通じて形成された培養液から、抗菌活性を有した培養液分離濃縮物を製造する方法、前記分離濃縮物を含んでおり、化粧料の組成に容易な液剤または水溶性粉末状態の組成物と、これを利用して製造される多様な剤形の化粧料に関するものである。
【００１８】
本発明に使われる乳酸菌株は、ラクトコッカス・ラクチスと同定されるラクトコッカス・ラクチスCBT-１９乳酸球菌であり、ニキビの原因菌で知られたプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)に対して特異的な阻害活性を発揮する物質を生産する。前記菌株に対する最適な培養培地及び培養条件は、ニキビの原因菌に対する生育抑制物質が大量に生産されるように構成されている。また、抗菌物質の分離濃縮過程は遠心分離または限外濾過による菌体及び不溶性成分の除去、分子量分画法を利用した抗菌活性分画の捕集及び濃縮並びに有機酸除去の工程からなる。乾燥粉体化工程は濃縮液を殺菌後、水溶性賦形剤を利用した噴射式流動層乾燥または凍結乾燥によって行われる。
【００１９】
このような工程で得られた乳酸菌の培養分画乾燥物は、乳化剤及びその他の化粧品原料等と混合して柔軟化粧水、栄養化粧水、エッセンス、クリーム、ローション、メークアップ、色調化粧品等のあらゆる化粧品剤形の化粧料として製造されることができる。
【００２０】
前述のような、本発明に係る菌株、分離濃縮液の製造方法及びこの濃縮液を含む化粧料組成物に関して詳細に説明すると次の通りである。
【００２１】
１)菌株の選抜（図１の工程１０１）
ラクトコッカス・ラクチスを嫌気的に培養し、培養液から菌体を分離した乳酸菌培養余液に対して、指示菌としてプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)を半流動性培地で培養しながら生育阻止領域試験を実施した。試験の結果、８００Au/ml以上の抗菌活性を発揮する乳酸菌種を選別して、選別された菌株をラクトコッカス・ラクチスCBT-１９と命名し、これをブダペスト条約による国際寄託機関に寄託して、寄託番号（KCTC10180BP）が付与された。
【００２２】
２)菌株の特性調査
前述のような方法で製造された乳酸菌株ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９に関連する生理学的、生化学的特性等を調べ下記の表１、２に示し、前記菌株の電子顕微鏡写真を図２に表示した。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
３)抗菌活性物質の製造（図１の工程１０２）
前述のように、本発明に使われた乳酸菌株はラクトコッカス・ラクチスCBT-１９であり、これはラクトコッカス・ラクチスを嫌気的に培養した後、得られた乳酸菌培養余液に対して指示菌としてプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)を使用して、半流動性培地で生育阻止領域試験を実施することによって、８００Au/ml以上の抗菌活性を発揮する乳酸菌を選別して製造されたものである。前記菌株による抗菌物質生産は３〜５重量%のブドウ糖、０.５〜１重量%の酵母抽出物、１〜１.５重量%の肉エキス、０.５〜１重量%の蛋白加水分解物及び０.０１〜０.１重量%のクエン酸アンモニウム（アンモニウム・シトレート）、酢酸ナトリウム（ソジウム・アセテート）、リン酸二カリウム（ジポタシウム・ホスフェート）、硫酸マグネシウム（マグネシウム・サルフェート）、硫酸マンガン（マンガン・サルフェート）または塩化ナトリウム（ソジウム・クロライド）等のイオン成分を水に溶解させて製造された培養用培地に前記本発明に係る菌株を接種し、酸素が除去された嫌気性条件で１６時間培養（発酵）することにより行われる。該培養工程の経時変化を図３に示したが、１６時間経過時、ニキビの原因菌のプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)に対して最大１６００Au/mlの阻害活性を示す抗菌活性物質が生産された。
【００２６】
４)培養液の分離濃縮及び乳酸の除去（図１の工程１０３−１０６）
前述のような方法で培養工程を経た後、前記培養液は１５，０００ｒｐｍ以上の高速遠心分離機または菌体分離用限外濾過器により菌体と培養余液に分離される。菌体が分離された培養余液は分画分子量１０，０００の限外濾過膜(Ultrafiltration membrane)で１次濾過し、１次濾過した透過液に対して分画分子量１，０００のナノメートル膜(Nanometer membrane)にて分離、濃縮し分子量１，０００〜１０，０００間の活性分画のみを捕集して濃縮し、前記濃縮液に対しては５倍量の無菌水を連続的に加えて、pHが６.０以上になるまで ダイアフィルトレーション（Diafiltration）することにより、乳酸成分を完全除去した後、有機酸が除去された最終濃縮液の体積を培養原液に対比して１/１０の体積に調節する。培養液から抗菌物質を分離捕集し、乳酸を除去する工程での抗菌活性物質の経時変化は表３に、最終濃縮物の抗菌活性観察写真は図４に示した。
【００２７】
【表３】
【００２８】
５)乾燥粉体化（図１の工程１０７）
前述した濃縮液に対して１〜１０重量%の乳糖、マルトデキストリン、マンニトール、脱脂粉乳を混合して溶解させ、８０℃の温度条件で撹拌しながら３０分間の熱処理を２回行い、その他の雑菌及び乳酸菌等を殺菌して凍結乾燥器に投入して乾燥させる。あるいは、噴射式流動層乾燥器で乾燥し粉砕して粉末を製造する。場合によって、抗菌活性物質の濃縮液を化粧料原料として直接使用するが、この場合には乾燥粉体化工程を省略できる。
【００２９】
８)化粧料の製造（図１の工程１０８）
前記抗菌物質濃縮液を原料に含んだ化粧料の剤形に関して、特別に限定されることはない。本発明に係る化粧料の剤形には具体的に 柔軟化粧水、栄養化粧水、エッセンス、クリーム、ローション、メーキャップ、色調化粧品等の全ての化粧品剤形が可能であり、各剤形の化粧料製造において増粘剤、防腐剤、香料、着色料等の一般的な原料成分は化粧料の製造方法、剤形、使用目的等によって適切に選択して配合できる。化粧料の製造時、本発明の本質成分である抗菌物質濃縮物は、全体組成物に対して０.０１%以上の濃度または１０Au/g以上の抗菌活性を維持するように配合して、追加的にその他の有害細菌に対する静菌作用、美白、保湿、抗酸化効果を表す補助成分として、ヒアルロン酸ナトリウム（ソジウムヒアルロン酸(Sodium hyaluronic acid)）、ラクトフェリン (Lactoferrin)、血清蛋白質(Serum protein)、パンテチン(Pantethine)、サリチル酸(Salicylic acid)、トリクロサン(Triclosan)等を単独または混合して化粧料を製造する。
【００３０】
［実施例１］
ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９菌によるニキビの原因菌を阻害する濃縮培養液及び濃縮乾燥物の製造
ブドウ糖２５kg、肉エキス５kg、酵母抽出物２.５kg、カゼイン・ペプトン２.５kg、ソイ・ペプトン２.５kg、クエン酸アンモニウム（アンモニウム・シトレート）０.２５kg、酢酸ナトリウム（ソジウム・アセテート）０.２５kg、硫酸マグネシウム（マグネシウム・サルフェート）０.０５kg、硫酸マンガン（マンガン・サルフェート）０.０５kgを水５００Lに添加して溶解させ、８００L容量の嫌気性醗酵器に移送して１２１℃で１５分間殺菌し、予め培養した種菌１０Lを接種して２０時間培養した。培養液を６０L/Hrの流速で連続式遠心分離機に移送させながら菌体を除去し、培養余液を分画分子量１０，０００の限外濾過器フィルターに通過させて透過液を回収し、再び分画分子量１，０００のナノメートルフィルターに通過させて分子量１，０００〜１０，０００間の抗菌物質濃縮液を５０L獲得した。濃縮液に対して更に５倍量の無菌水を連続的に加えて、分画分子量１，０００のナノメートルフィルターに通過させて透過液と濃縮液を再分離した。この工程で残存有機酸、色素、不溶性成分等が完全に除去され、ニキビの原因菌に対して抗菌活性をもった分子量１，０００〜１０，０００間の抗菌物質分画が選択的に分離濃縮された。分離濃縮された抗菌物質捕集液は最終体積を培養原液の１/１０程度に濃縮し、ニキビの原因菌に対する抗菌活性もまた１０倍に濃縮された。抗菌物質の分離濃縮液に対して５〜５０重量%範囲のマンニトール、乳糖等の水溶性賦形剤を用いて凍結乾燥または噴射式流動層乾燥により水溶性粉末化した。この時、抗菌活性は最終粉末の場合、１，６００〜１６，０００Au/gになるように稀釈比を調整した。
【００３１】
［実施例２］乃至［実施例５］
乳酸菌培養液の濃縮乾燥物を含有する一般化粧水の製造
【００３２】
【表４】
【００３３】
原料１)〜５）を混合して均質に溶解させた。別の容器で原料６)〜１１)を４０℃以下の温度で加熱しながら混合して溶解させた後、先に製造された１)〜５)原料溶液に徐々に投入し、アジミキサー（Agi-mixer）で均質化させて化粧水を製造した。この時、ニキビの原因菌であるプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)を含む皮膚有害細菌に対する抗菌作用に関連した活性を示す分離濃縮物としての５)ラクトパッド(Lactopad)を主成分とし、同じく活性を示す補助成分としての７)サリチル酸（Salicylicacid）及び８) トリクロサン(Triclosan)を単独、または同時に一定の濃度で混合して化粧水を製造した。
【００３４】
［実施例６］乃至［実施例９］
抗菌物質の濃縮乾燥物を含有する栄養化粧水の製造
【００３５】
【表５】
【００３６】
原料１)〜９)を混合し加熱して６５〜７０℃まで温度を上昇させて溶解した。別の容器で原料１０)〜１１)を混合して溶解させ加熱して６５〜７０℃まで温度を上昇させ、先に製造した溶液に徐々に投入しながらホモミキサー（homo-mixer）で均質化させてエマルジョンを形成した。この形成されたエマルジョン溶液に対して原料１２)〜１６）を順次に混合して粘性のあるエマルジョンを製造した。この時、一般化粧水の製造と同様に ニキビの原因菌のプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)を含む皮膚有害細菌に対する抗菌作用に関連した活性成分の主成分である５) ラクトパッド（Lactopad）に対し、補助成分として７)サリチル酸（Salicylic acid）及び８) トリクロサン(Triclosan)を単独、または同時に一定の濃度で混合して栄養化粧水を製造した。
【００３７】
以上の［実施例２］乃至［実施例９］によって作られた化粧料組成物は各々室温、５℃、３７℃、そして４５℃で一ケ月以上保存し、製品中の層分離現象を比較測定したが、皆安定で層分離等の現象もなく、抗菌活性もそのまま維持された。ラクトパッド(LACTOPAD)を使用した化粧料組成物の剤形の安定性及び臨床資料を表６及び表７に示す。
【００３８】
【表６】
【００３９】
【表７】
【００４０】
このように、本発明のニキビの原因菌に対する抗菌機能を有する乳酸菌培養液の分離濃縮物の製造方法及びその濃縮物の組成物は、ニキビの予防及び治療効果を持つ機能性製品の使用上の効率性を極大化する。
【００４１】
【発明の効果】
本発明のニキビの原因菌に対する抗菌機能を有する新規の乳酸菌株及び前記菌株の培養液分離濃縮物の製造方法並びにこの濃縮物を含む化粧料組成物は、ニキビの原因菌であるプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)に対して特異的な阻害活性機能を持っており、皮膚に棲息するニキビの原因菌及び有害細菌に対して抗菌作用を発揮してニキビ疾患を治療・予防する。また、本水溶性抗菌成分の分離濃縮物は化粧料の組成に適合した物性であるから柔軟化粧水、栄養化粧水、エッセンス、クリーム、ローション、メークアップ、色調化粧品等の全ての化粧品類として製造でき、使用者の使用上効率性を極大化する非常に優れた発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る菌株のラクトコッカス・ラクチスCBT-１９の培養液分離濃縮物を製造し、前記濃縮物を含む化粧料組成物を製造する工程を示した工程図である。
【図２】ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９の電子顕微鏡観察写真である。
【図３】ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９と抗菌物質との培養経時変化を表すグラフである。
【図４】ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９培養液分離濃縮液のニキビの原因菌であるプロピオニバクテリウム・アクネス (Propionibacteriumacnes)に対する生育阻止領域の観察写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明はニキビの原因菌に対する抗菌機能を有する乳酸菌株であるラクトコッカス・ラクチスCBT-１９及びこれを利用した抗菌培養液の分離濃縮物の製造方法並びにこの分離濃縮物を包含する化粧料組成物に関するもので、より詳細には、ニキビの原因菌になるプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)の生育を特異的に阻害できて、ニキビの原因菌に対する抗菌機能を有するラクトコッカス・ラクチスCBT-１９及びこれを利用した抗菌培養液の分離濃縮物の製造方法並びにこれを包含する化粧料組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来から、乳酸菌培養液等は化粧品に適用されてきたが、その適用方法は、菌体及び不溶性成分を除去した乳酸菌培養液を主に利用するものであった。このような乳酸菌培養液には主要成分として乳酸、乳糖、アミノ酸、リン酸塩等が含まれている。これらの成分は皮膚の角質成分に親和的に作用し、皮膚の抗酸化作用、保湿作用、pH調節作用及び皮膚細菌叢の調節作用等ができるので、化粧品に有用に利用されている。従って、色々な乳酸菌培養液がその成分によって、多様な種類の化粧品用素材として開発されてきた。特に、色々な乳酸菌の中でもストレップトコッカス・サーモフィルス菌(Streptococcus thermophilus)、ラクトバシラス(Lactobacillus)及びビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属に属する微生物の中で、保湿効果、活性酸素除去効果及び免疫復活機能を有する乳酸菌培養液が化粧品に主に適用されてきた。但し、継続的な研究の結果、適用される微生物の範囲は次第に広くなっている。
【０００３】
前記従来の技術による化粧品用乳酸菌の培養方法及びこれを利用した化粧料組成物の製造方法に関してもう少し詳しく説明すると、次の通りである。
【０００４】
従来の技術による乳酸菌培養液を利用した化粧料組成物の製造工程は、化粧品用乳酸菌の培養に続き、菌体の分離を行い、更に培養余液またはその乾燥物の製造の後、化粧料組成物の製造を行う工程からなる。
【０００５】
これら製造工程に示されるように、乳酸菌培養液を利用した化粧料組成物を製造するためには、まず、適切な乳酸菌を選択してこれを培養する必要がある。ここで、従来技術においては、このような乳酸菌の培養は一般的にペプトン類、肉エキス、酵母抽出物、ブドウ糖及び無機イオンが組み合わされた醗酵培地を利用して嫌気性醗酵器（装置）内で行われた後に、その培養液から菌体を分離していた。なお、前記分離工程は遠心分離機または限外濾過器を利用して行われることが好ましく、このような方法により菌体が分離された乳酸菌培養液の乾燥粉末化状態、あるいは、液体状態で化粧品成分、増粘剤、乳化剤等と混合して化粧料組成物を製造していた。
【０００６】
一方、炎症性のニキビ疾患に関連する臨床的治療法において、テトラサイクリン(tetracycline)、シンダマイシン(cindamycine)、 エリスロマイシン (erythromycin)等の抗生物質が主に利用されてきた。しかしながら、このような抗生物質を長期間投与する場合、ニキビの原因菌が抗生物質に対して耐性を持つようになり、治療効果が低減するという問題点があった。ニキビ誘発菌のプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)は、その人工的な培養が困難であるので、これらの薬剤に対する感受性実験が根拠の弱いものになり、よって適切な薬剤を選定するのが困難であった。しかも、前記薬剤は全てが抗生物質であるので、化粧品としての利用が不可能であるという問題があった。
【０００７】
このように、従来の技術において、乳酸菌培養液の化粧品への利用は、その培養液に含まれている色々な成分によって保湿効果、免疫復活機能、活性酸素除去機能、有機酸等による静菌作用(Bacteriostatic action)等の付随的な効果を上げるためのものに限られ、特定菌株の生育を阻害することでニキビ等の皮膚疾患を治癒するための適用はなかった。このために、ニキビ等の皮膚疾患は、その治療のために主に抗生物質を利用してきたが、抗生物質は過剰投与による耐性の発生、化粧品には適用できないという限界等の問題点が多かった。このような従来技術の問題点によって、抗菌微生物の培養液を適用するとニキビ等の皮膚疾患を誘発する原因菌の生育を阻害する可能性があり、副作用なくニキビ等の皮膚疾患を根本的に治癒できる機能性化粧品の開発が切実に要求されてきた。
【０００８】
特に、このような抗菌微生物の培養液は耐性等の副作用がなく、抗生物質に比べて日常生活で使われる化粧品に比較的容易に適用できるので、ニキビ等の治療において、その効用が大きい。また、このような効能を持つことができる乳酸菌株、その培養液分離濃縮液の製造方法及びこれを利用した化粧料組成物の必要性は更に大きいといえる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前述の問題点を解決するためになされたもので、ニキビの原因菌であるプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)を選択的に死滅させることができ、ニキビ原因菌の生育を特異的に抑制できる乳酸菌株および、本発明に係る菌株の培養液分離濃縮物の製造方法並びに、このような分離濃縮物を含有することでニキビ予防及び治療効果を備えた化粧料組成物を提供することにその目的がある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は前述の目的を達成するために、ニキビの原因菌であるプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)の生育を特異的に抑制でき、寄託番号KCTC10180BPとして寄託されているラクトコッカス・ラクチスCBT-１９からなる乳酸菌株を提供する。
【００１１】
また、本発明は ３〜５重量%のブドウ糖、０.５〜１重量%の酵母抽出物、１〜１.５重量%の肉エキス、０.５〜１重量%の蛋白加水分解物及び０.０１〜０.１重量%のイオン成分を水に溶解させて、嫌気的醗酵器で殺菌して製造した培養液に、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)の生育を特異的に抑制でき、寄託番号KCTC10180BPとして寄託されているラクトコッカス・ラクチスCBT-１９からなる乳酸菌株を接種して乳酸菌を培養し抗菌物質を発生させる工程と、高速遠心分離または限外濾過により前記乳酸菌培養液から菌体を除去する工程と、
前記菌体が除去された培養余液を分画分子量１０，０００の限外濾過膜に通過させ、前記透過液を再び分画分子量１，０００のナノメートル膜に通過させて、前記培養余液を濃縮させる工程と、
前記濃縮液に無菌水を連続的に加え、その結果物をさらに分画分子量１，０００のナノメートル膜に通過させながら乳酸を除去することにより、分子量１，０００〜１０，０００の範囲のｐＨが中性を示す抗菌物質の分離濃縮物を製造する工程とを含むことを特徴とする乳酸菌培養液の分離濃縮物の製造方法を提供する。
【００１２】
前記本発明に係る分離濃縮液の製造方法において、前記イオン成分は、クエン酸アンモニウム（アンモニウム・シトレート）、酢酸ナトリウム（ソジウム・アセテート）、リン酸二カリウム（ジポタシウム・ホスフェート）、硫酸マグネシウム（マグネシウム・サルフェート）、硫酸マンガン（マンガン・サルフェート）、塩化ナトリウム（ソジウム・クロライド）よりなるグループから選択された少なくとも一つ以上の物質であることが好ましい。
【００１３】
また、前記本発明に係る分離濃縮物の製造方法は、前記抗菌物質の分離濃縮物を製造する工程を実施した後、製造された分離濃縮物に凍結乾燥工程又は噴射式流動層乾燥工程をさらに実施することもできる。これによって、製造された分離濃縮物の貯蔵安全性を向上させることができる。
【００１４】
また、本発明は前記の方法で製造された乳酸菌培養液の分離濃縮物を、０.０１重量%以上の濃度または１０Au/ｇ以上の抗菌活性を有するように含むことを特徴とする化粧料組成物を提供する。このような化粧料組成物はニキビの原因菌の生育を抑制でき、このような組成物を利用して化粧品を製造することによって、ニキビに対する治療効果を上げるようになるものである。
【００１５】
前記本発明に係る組成物において、前記組成物は、適用される化粧品の種類に適合するように油中水型乳化剤、水中油型乳化剤、透明スキン、懸濁スキン、ジェル剤等で製造されることができ、有害細菌に対する静菌作用、美白、保湿、抗酸化効果を表す補助成分としては、ヒアルロン酸ナトリウム（ソジウムヒアルロン酸(Sodium hyaluronic acid)）、ラクトフェリン (Lactoferrin)、血清蛋白質(Serum protein)、パンテチン(Pantethine)、サリチル酸(Salicylic acid)、トリクロサン(Triclosan)等をさらに含むことができる。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、添付した図面を参照して本発明に係る乳酸菌株、培養液分離濃縮物の製造方法及びこの濃縮物を含む化粧料組成物に関してより詳細に説明する。
【００１７】
前述のように、本発明はニキビの原因菌に特異的な阻害活性を持つ新規の乳酸菌株の開発、前記菌株に対する最適の培養培地及び培養工程の構成、前記培養（発酵）を通じて形成された培養液から、抗菌活性を有した培養液分離濃縮物を製造する方法、前記分離濃縮物を含んでおり、化粧料の組成に容易な液剤または水溶性粉末状態の組成物と、これを利用して製造される多様な剤形の化粧料に関するものである。
【００１８】
本発明に使われる乳酸菌株は、ラクトコッカス・ラクチスと同定されるラクトコッカス・ラクチスCBT-１９乳酸球菌であり、ニキビの原因菌で知られたプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)に対して特異的な阻害活性を発揮する物質を生産する。前記菌株に対する最適な培養培地及び培養条件は、ニキビの原因菌に対する生育抑制物質が大量に生産されるように構成されている。また、抗菌物質の分離濃縮過程は遠心分離または限外濾過による菌体及び不溶性成分の除去、分子量分画法を利用した抗菌活性分画の捕集及び濃縮並びに有機酸除去の工程からなる。乾燥粉体化工程は濃縮液を殺菌後、水溶性賦形剤を利用した噴射式流動層乾燥または凍結乾燥によって行われる。
【００１９】
このような工程で得られた乳酸菌の培養分画乾燥物は、乳化剤及びその他の化粧品原料等と混合して柔軟化粧水、栄養化粧水、エッセンス、クリーム、ローション、メークアップ、色調化粧品等のあらゆる化粧品剤形の化粧料として製造されることができる。
【００２０】
前述のような、本発明に係る菌株、分離濃縮液の製造方法及びこの濃縮液を含む化粧料組成物に関して詳細に説明すると次の通りである。
【００２１】
１)菌株の選抜（図１の工程１０１）
ラクトコッカス・ラクチスを嫌気的に培養し、培養液から菌体を分離した乳酸菌培養余液に対して、指示菌としてプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)を半流動性培地で培養しながら生育阻止領域試験を実施した。試験の結果、８００Au/ml以上の抗菌活性を発揮する乳酸菌種を選別して、選別された菌株をラクトコッカス・ラクチスCBT-１９と命名し、これをブダペスト条約による国際寄託機関に寄託して、寄託番号（KCTC10180BP）が付与された。
【００２２】
２)菌株の特性調査
前述のような方法で製造された乳酸菌株ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９に関連する生理学的、生化学的特性等を調べ下記の表１、２に示し、前記菌株の電子顕微鏡写真を図２に表示した。
【００２３】
【表１】
【表２】
３)抗菌活性物質の製造（図１の工程１０２）
前述のように、本発明に使われた乳酸菌株はラクトコッカス・ラクチスCBT-１９であり、これはラクトコッカス・ラクチスを嫌気的に培養した後、得られた乳酸菌培養余液に対して指示菌としてプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)を使用して、半流動性培地で生育阻止領域試験を実施することによって、８００Au/ml以上の抗菌活性を発揮する乳酸菌を選別して製造されたものである。前記菌株による抗菌物質生産は３〜５重量%のブドウ糖、０.５〜１重量%の酵母抽出物、１〜１.５重量%の肉エキス、０.５〜１重量%の蛋白加水分解物及び０.０１〜０.１重量%のクエン酸アンモニウム（アンモニウム・シトレート）、酢酸ナトリウム（ソジウム・アセテート）、リン酸二カリウム（ジポタシウム・ホスフェート）、硫酸マグネシウム（マグネシウム・サルフェート）、硫酸マンガン（マンガン・サルフェート）または塩化ナトリウム（ソジウム・クロライド）等のイオン成分を水に溶解させて製造された培養用培地に前記本発明に係る菌株を接種し、酸素が除去された嫌気性条件で１６時間培養（発酵）することにより行われる。該培養工程の経時変化を図３に示したが、１６時間経過時、ニキビの原因菌のプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)に対して最大１６００Au/mlの阻害活性を示す抗菌活性物質が生産された。
【００２６】
４)培養液の分離濃縮及び乳酸の除去（図１の工程１０３−１０６）
前述のような方法で培養工程を経た後、前記培養液は１５，０００ｒｐｍ以上の高速遠心分離機または菌体分離用限外濾過器により菌体と培養余液に分離される。菌体が分離された培養余液は分画分子量１０，０００の限外濾過膜(Ultrafiltration membrane)で１次濾過し、１次濾過した透過液に対して分画分子量１，０００のナノメートル膜(Nanometer membrane)にて分離、濃縮し分子量１，０００〜１０，０００間の活性分画のみを捕集して濃縮し、前記濃縮液に対しては５倍量の無菌水を連続的に加えて、pHが６.０以上になるまで ダイアフィルトレーション（Diafiltration）することにより、乳酸成分を完全除去した後、有機酸が除去された最終濃縮液の体積を培養原液に対比して１/１０の体積に調節する。培養液から抗菌物質を分離捕集し、乳酸を除去する工程での抗菌活性物質の経時変化は表３に、最終濃縮物の抗菌活性観察写真は図４に示した。
【００２７】
【表３】
５)乾燥粉体化（図１の工程１０７）
前述した濃縮液に対して１〜１０重量%の乳糖、マルトデキストリン、マンニトール、脱脂粉乳を混合して溶解させ、８０℃の温度条件で撹拌しながら３０分間の熱処理を２回行い、その他の雑菌及び乳酸菌等を殺菌して凍結乾燥器に投入して乾燥させる。あるいは、噴射式流動層乾燥器で乾燥し粉砕して粉末を製造する。場合によって、抗菌活性物質の濃縮液を化粧料原料として直接使用するが、この場合には乾燥粉体化工程を省略できる。
【００２９】
８)化粧料の製造（図１の工程１０８）
前記抗菌物質濃縮液を原料に含んだ化粧料の剤形に関して、特別に限定されることはない。本発明に係る化粧料の剤形には具体的に 柔軟化粧水、栄養化粧水、エッセンス、クリーム、ローション、メーキャップ、色調化粧品等の全ての化粧品剤形が可能であり、各剤形の化粧料製造において増粘剤、防腐剤、香料、着色料等の一般的な原料成分は化粧料の製造方法、剤形、使用目的等によって適切に選択して配合できる。化粧料の製造時、本発明の本質成分である抗菌物質濃縮物は、全体組成物に対して０.０１%以上の濃度または１０Au/g以上の抗菌活性を維持するように配合して、追加的にその他の有害細菌に対する静菌作用、美白、保湿、抗酸化効果を表す補助成分として、ヒアルロン酸ナトリウム（ソジウムヒアルロン酸(Sodium hyaluronic acid)）、ラクトフェリン (Lactoferrin)、血清蛋白質(Serum protein)、パンテチン(Pantethine)、サリチル酸(Salicylic acid)、トリクロサン(Triclosan)等を単独または混合して化粧料を製造する。
【００３０】
［実施例１］
ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９菌によるニキビの原因菌を阻害する濃縮培養液及び濃縮乾燥物の製造
ブドウ糖２５kg、肉エキス５kg、酵母抽出物２.５kg、カゼイン・ペプトン２.５kg、ソイ・ペプトン２.５kg、クエン酸アンモニウム（アンモニウム・シトレート）０.２５kg、酢酸ナトリウム（ソジウム・アセテート）０.２５kg、硫酸マグネシウム（マグネシウム・サルフェート）０.０５kg、硫酸マンガン（マンガン・サルフェート）０.０５kgを水５００Lに添加して溶解させ、８００L容量の嫌気性醗酵器に移送して１２１℃で１５分間殺菌し、予め培養した種菌１０Lを接種して２０時間培養した。培養液を６０L/Hrの流速で連続式遠心分離機に移送させながら菌体を除去し、培養余液を分画分子量１０，０００の限外濾過器フィルターに通過させて透過液を回収し、再び分画分子量１，０００のナノメートルフィルターに通過させて分子量１，０００〜１０，０００間の抗菌物質濃縮液を５０L獲得した。濃縮液に対して更に５倍量の無菌水を連続的に加えて、分画分子量１，０００のナノメートルフィルターに通過させて透過液と濃縮液を再分離した。この工程で残存有機酸、色素、不溶性成分等が完全に除去され、ニキビの原因菌に対して抗菌活性をもった分子量１，０００〜１０，０００間の抗菌物質分画が選択的に分離濃縮された。分離濃縮された抗菌物質捕集液は最終体積を培養原液の１/１０程度に濃縮し、ニキビの原因菌に対する抗菌活性もまた１０倍に濃縮された。抗菌物質の分離濃縮液に対して５〜５０重量%範囲のマンニトール、乳糖等の水溶性賦形剤を用いて凍結乾燥または噴射式流動層乾燥により水溶性粉末化した。この時、抗菌活性は最終粉末の場合、１，６００〜１６，０００Au/gになるように稀釈比を調整した。
【００３１】
［実施例２］乃至［実施例５］
乳酸菌培養液の濃縮乾燥物を含有する一般化粧水の製造
【００３２】
【表４】
原料１)〜５）を混合して均質に溶解させた。別の容器で原料６)〜１１)を４０℃以下の温度で加熱しながら混合して溶解させた後、先に製造された１)〜５)原料溶液に徐々に投入し、アジミキサー（Agi-mixer）で均質化させて化粧水を製造した。この時、ニキビの原因菌であるプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)を含む皮膚有害細菌に対する抗菌作用に関連した活性を示す分離濃縮物としての５)ラクトパッド(Lactopad)を主成分とし、同じく活性を示す補助成分としての７)サリチル酸（Salicylicacid）及び８) トリクロサン(Triclosan)を単独、または同時に一定の濃度で混合して化粧水を製造した。
【００３４】
［実施例６］乃至［実施例９］
抗菌物質の濃縮乾燥物を含有する栄養化粧水の製造
【００３５】
【表５】
原料１)〜９)を混合し加熱して６５〜７０℃まで温度を上昇させて溶解した。別の容器で原料１０)〜１１)を混合して溶解させ加熱して６５〜７０℃まで温度を上昇させ、先に製造した溶液に徐々に投入しながらホモミキサー（homo-mixer）で均質化させてエマルジョンを形成した。この形成されたエマルジョン溶液に対して原料１２)〜１６）を順次に混合して粘性のあるエマルジョンを製造した。この時、一般化粧水の製造と同様に ニキビの原因菌のプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)を含む皮膚有害細菌に対する抗菌作用に関連した活性成分の主成分である５) ラクトパッド（Lactopad）に対し、補助成分として７)サリチル酸（Salicylic acid）及び８) トリクロサン(Triclosan)を単独、または同時に一定の濃度で混合して栄養化粧水を製造した。
【００３７】
以上の［実施例２］乃至［実施例９］によって作られた化粧料組成物は各々室温、５℃、３７℃、そして４５℃で一ケ月以上保存し、製品中の層分離現象を比較測定したが、皆安定で層分離等の現象もなく、抗菌活性もそのまま維持された。ラクトパッド(LACTOPAD)を使用した化粧料組成物の剤形の安定性及び臨床資料を表６及び表７に示す。
【００３８】
【表６】
【表７】
このように、本発明のニキビの原因菌に対する抗菌機能を有する乳酸菌培養液の分離濃縮物の製造方法及びその濃縮物の組成物は、ニキビの予防及び治療効果を持つ機能性製品の使用上の効率性を極大化する。
【００４１】
【発明の効果】
本発明のニキビの原因菌に対する抗菌機能を有する新規の乳酸菌株及び前記菌株の培養液分離濃縮物の製造方法並びにこの濃縮物を含む化粧料組成物は、ニキビの原因菌であるプロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)に対して特異的な阻害活性機能を持っており、皮膚に棲息するニキビの原因菌及び有害細菌に対して抗菌作用を発揮してニキビ疾患を治療・予防する。また、本水溶性抗菌成分の分離濃縮物は化粧料の組成に適合した物性であるから柔軟化粧水、栄養化粧水、エッセンス、クリーム、ローション、メークアップ、色調化粧品等の全ての化粧品類として製造でき、使用者の使用上効率性を極大化する非常に優れた発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る菌株のラクトコッカス・ラクチスCBT-１９の培養液分離濃縮物を製造し、前記濃縮物を含む化粧料組成物を製造する工程を示した工程図である。
【図２】ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９の電子顕微鏡観察写真である。
【図３】ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９と抗菌物質との培養経時変化を表すグラフである。
【図４】ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９培養液分離濃縮液のニキビの原因菌であるプロピオニバクテリウム・アクネス (Propionibacteriumacnes)に対する生育阻止領域の観察写真である。
Claims (7)
- プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)の生育を特異的に抑制できる乳酸菌株ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）CBT-１９（KCTC10180BP）。
- ３〜５重量%のブドウ糖、０.５〜１重量%の酵母抽出物、１〜１.５重量%の肉エキス、０.５〜１重量%の蛋白加水分解物及び０.０１〜０.１重量%のイオン成分を水に溶解させて、嫌気的醗酵器で殺菌して製造した培養液に、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)の生育を特異的に抑制できる乳酸菌株ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９（KCTC10180BP）を接種して乳酸菌を培養する工程と、
高速遠心分離または限外濾過を介して前記乳酸菌培養液から菌体を除去する工程と、
前記菌体が除去された培養余液を分画分子量１０，０００の限外濾過膜に通過させ、前記透過液を再び分画分子量１，０００のナノメートル膜に通過させて、前記培養余液を濃縮させる工程と、
前記濃縮液に無菌水を連続的に加え、その結果物をさらに分画分子量１，０００のナノメートル膜に通過させながら乳酸を除去することにより、分子量１，０００〜１０，０００の範囲のｐＨが中性を示す抗菌物質の分離濃縮物を製造する工程と、
を含むことを特徴とする乳酸菌培養液の分離濃縮物の製造方法。 - 前記イオン成分は、クエン酸アンモニウム（アンモニウム・シトレート）、酢酸ナトリウム（ソジウム・アセテート）、リン酸二カリウム（ジポタシウム・ホスフェート）、硫酸マグネシウム（マグネシウム・サルフェート）、硫酸マンガン（マンガン・サルフェート）、塩化ナトリウム（ソジウム・クロライド）よりなるグループから選択された少なくとも一つ以上の物質であることを特徴とする請求項２に記載の乳酸菌培養液の分離濃縮物の製造方法。
- 前記抗菌物質の分離濃縮物を製造する工程を実施した後、製造された分離濃縮物に凍結乾燥工程又は噴射式流動層乾燥工程をさらに実施することを特徴とする請求項２又は３に記載の乳酸菌培養液の分離濃縮物の製造方法。
- プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)の生育を特異的に抑制できる乳酸菌株ラクトコッカス・ラクチスCBT-１９（KCTC10180BP）から製造された乳酸菌培養液の分離濃縮物を、０.０１重量%以上の濃度または１０Au/ｇ以上の抗菌活性を有するように含むことを特徴とする化粧料組成物。
- 前記化粧料組成物が、油中水型乳化剤、水中油型乳化剤、透明スキン、懸濁スキン、ジェル剤のいずれかの形態であることを特徴とする請求項５に記載の化粧料組成物。
- 前記化粧料組成物が、ヒアルロン酸ナトリウム（ソジウムヒアルロン酸(Sodium hyaluronic acid)）、ラクトフェリン (Lactoferrin)、血清蛋白質(Serum protein)、パンテチン(Pantethine)、サリチル酸(Salicylic acid)、トリクロサン(Triclosan)よりなるグループから選択された少なくとも一つ以上の物質をさらに含むことを特徴とする請求項５又は６に記載の化粧料組成物。
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