JP3699659B2 - デアザアデニン類を含む核酸及びこれを製造するためのフォスフォロアミダイト - Google Patents
デアザアデニン類を含む核酸及びこれを製造するためのフォスフォロアミダイト Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、ＤＮＡ変異解析、ＤＮＡ−タンパク相互作用の解析、ＤＮＡの複製、ＲＮＡへの転写等への利用が期待される、デアザアデニン類を含んでなる核酸と、核酸に該デアザアデニン類を導入するために用いられる新規なフォスフォロアミダイトに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子中で生じる点変異は、重い遺伝病の原因として、しばしば重大な意味を持つ。Ｇ（グアニン）：Ｃ（シトシン）−Ａ（アデニン）：Ｔ（チミン）変異は、天然でしばしば認められるＤＮＡの点変異の一つである。このタイプの変異が遺伝子上で生じると、例えばあるアミノ酸に対応するコドンがストップコドンへ変化するナンセンスミューテーションに代表される重大なエラーをしばしば引き起こし、その結果、タンパク合成の不完全な終結によって様々な重篤な遺伝子病を生ずる。遺伝子病の起源を理解するためには、遺伝子の特定の領域で遺伝子を変異させる遺伝子技術を開発することが極めて重要である。Ｇ：Ｃ−Ａ：Ｔ変異を効率よく生じさせる方法として、亜硫酸塩によるシトシンの処理や、５位がメチル化されたシトシンもしくはシトシンを含むシクロブタンピリミジン二量体の加水分解による脱アミノ化がよく知られている。そのほかには、２個かそれ以上の塩基を認識することができる縮重塩基を利用する方法がある。これまでにＣ，Ｔと塩基対を形成することができるプリン誘導体としてＯ６−メチルグアニンや２−アミノプリンや６−メトキシアデニンが知られている。これらの塩基は、プロトネーションや互変異性化やゆらぎ塩基対によって複数の異なる塩基を区別して認識する。しかしながら、これらによる塩基対形成においては、どれも二重鎖ＤＮＡを形成することができるものの、それらの大きな不安定化が観察され、変異研究に必要な短鎖オリゴヌクレオチドへの複数の縮重塩基の導入は現実的ではなかった。
７−デアザプリンは、非ワトソン−クリック塩基対の形成において重要な役割を果たす７位の窒素原子が炭素原子に交換された非天然の塩基であり、核酸構造研究において有用な道具として用いられる。様々な置換基で置換された７−デアザプリンがいくつかの研究グループから報告されており、これらを含むオリゴマーの二重鎖安定性についていくつかのグループから報告されている。しかしながらそれらの塩基認識の選択性にはこれまで全く触れられていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、複数の塩基と安定な塩基対を形成することができ、且つ、ＤＮＡの相補鎖側のチミン、シトシン両方を認識できる縮重塩基として働くことが出来るデアザアデニン類を、ＤＮＡの分子中に容易に導入しうる新規なフォスフォロアミダイトと、該デアザアデニン類を組み込んだ核酸を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、チミン塩基と三本の水素結合を使って安定な塩基対を形成することが知られている２−アミノアデニンのデアザ類縁体である２−アミノ−７−デアザアデニン（ＡＺＡ）をＤＮＡに導入し、天然の塩基との塩基対形成能を検討すると共に、ＡＺＡを含むオリゴマーについて、複数の塩基と安定な塩基対を形成することができる縮重塩基としての能力について検討し、併せて、ポリメラーゼによる伸長反応を用いて変異原としての能力についても検討した結果、上記目的を達成しうる本発明に到達した。
【０００５】
即ち、本発明は、分子中に２−アミノ−７−デアザアデニンを含んでなる核酸若しくはオリゴヌクレオチドに関する。
【０００６】
また、本発明は、一般式［２］
【化４】
で示されるフォスフォロアミダイトを使用し、フォスフォロアミダイト法によるＤＮＡ合成法によりＤＮＡ若しくはオリゴヌクレオチドに２−アミノ−７−デアザ−２'−デオキシアデノシンを導入することを特徴とする上記核酸若しくはオリゴヌクレオチドの製造法に関する。
【０００７】
更に、本発明は、一般式［２］
【化５】
で示されるフォスフォロアミダイトに関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
分子中に２−アミノ−７−デアザアデニンを含んでなる本発明の核酸としては、例えば下記一般式［１］で示されるものが挙げられる。
【化６】
【０００９】
本発明において、分子中に２−アミノ−７−デアザアデニン（ＡＺＡ）を含んでなる核酸若しくはオリゴヌクレオチドを製造するために用いられる２−アミノ−７−デアザ−２'−デオキシアデノシンのフォスフォロアミダイトの合成法は大略次の通りである。
先ず、原料となる２−アミノ−７−デアザ−２’−デオキシアデノシンを、例えばＬｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１９８７，１５−１９等に記載されている方法に従って合成する。次いで、このデアザアデノシン分子が有する２箇所のエキソサイクリックアミノ基を例えば、ジメチルホルムアミドジメチルアセタール、ジメチルホルムアミドジエチルアセタール、ジメチルホルムアミドジ−ｎ−プロピルアセタール、ジメチルホルムアミドジ−ｎ−ブチルアセタール、ジメチルホルムアミドジ−ｔ−ブチルアセタール、ジメチルホルムアミドジネオペンチルアセタール等のジメチルホルムアミドジアルキルアセタールを使用して保護する。そして更に、５'位の１級水酸基を塩化４，４’−ジメトキシトリチル、臭化４，４’−ジメトキシトリチル等のハロゲン化４，４’−ジメトキシトリチルを使用して保護する。その後、該生成物をＤＮＡ合成にむけて、常法に従ってシアノエチルフォスホロアミダイトへと変換する。
【００１０】
上で得られたフォスフォロアミダイトを用いた２−アミノ−７−デアザ−２'−デオキシアデノシンのＤＮＡ若しくはオリゴヌクレオチドへの導入は、フォスフォロアミダイト法を用いて、市販のＤＮＡ自動合成機により固相合成を行えばよい。固相担体からの切り出しおよび脱保護反応は、例えば２８％アンモニア水溶液中、３０〜６０℃、１０〜２０時間の加熱処理等により行われる。粗生成物は、逆相液体クロマトグラフィー等により精製することが出来る。
【００１１】
上記の如くして得られた本発明のＡＺＡ導入オリゴヌクレオチドについて、ＤＮＡ二本鎖融解温度（Ｔｍ）の測定を行った結果を以下に示す。
Ｔ ｍ の測定
ＡＺＡ−Ｔ（チミン）塩基対を含む二重鎖５’−ｄ（ＴＴＴＧＧＴＴＡＺＡＴＴＴ）−３’／５’−（ＡＡＡＴＡＡＣＣＡＡＡ）−３’の融解温度（Ｔｍ）を、２６０ｎｍの紫外光によって測定した。この二重鎖のＴｍは、１３．８℃であり、野生型塩基対Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）のＴｍより、１℃上昇した。２−アミノアデニン（ＡＡ）−ＴのＴｍが１４．０℃、７−デアザアデニン（ＺＡ）−ＴのＴｍが１２．２℃であり、これらとＡＺＡ−ＴのＴｍを比べると、ＡＺＡ−ＴのＴｍはＡＡ−ＴのＴｍに近い。この結果は、ＡＺＡ−Ｔを含む二重鎖が、ＡＡ−Ｔ間の相互作用と同様、ＡＺＡとＴの間に三本の水素結合を形成することによって安定化されていることを示唆している。
ＡＺＡの相補鎖の塩基をＴではない他の塩基に置き換えたとき、ＡＺＡ−ＡやＺＡ−Ｇの場合には、大きく二重鎖を不安定化させたが、逆にＣの場合、Ｔｍは１９．０℃となり、ＡＺＡ−Ｔを含む二重鎖のＴｍよりも５．２℃も二重鎖を強く安定化させた。このＴｍの値は、Ａ−Ｔ塩基対やＡＡ−Ｔ塩基対で観察された値よりもむしろＧ−Ｃ塩基対で観察されるＴｍ（１９．８℃）に近い。
ＺＡもまたＣと塩基対を形成することによってわずかに二重鎖を安定化したが、一方ＡＡは、Ｃとの対形成によって二重鎖を大きく不安定化し、塩基対が効果的に形成されていないことを示している。これらのことからもＡＺＡが、Ｔとだけでなく、Ｔよりもさらに強くＣと塩基対を形成することができることは、特筆に値する。各種塩基を導入したＤＮＡ二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を表１に示す。
【００１２】
【表１】
【００１３】
次に、本発明のＡＺＡ導入オリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼによる一塩基伸長反応を行った結果について記す。
ポリメラーゼによる一塩基伸長反応
ＡＺＡの塩基対形成の効率に関して検討するために、ＡＺＡを含むＤＮＡ配列を鋳型としたポリメラーゼによる伸長反応を行った。ポリメラーゼ（大腸菌由来ポリメラーゼ クレノウフラグメント）存在下５ｍＭのプライマー鋳型の二重鎖と天然の４つのヌクレオシド三リン酸（ＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ）のうちの１つをｐＨ７．３のバッファー中、３７℃で反応させた。一定の時間ごとに反応を停止し、ゲル電気泳動によって結果を解析した。与えられたゲルバンドの強度から、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを行い、反応のＶｍａｘとＫｍを求めた。ゲル電気泳動の結果を図１に示す。また、Ｖｍａｘ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ／Ｋｍによって得られる挿入効率、及びＴＴＰの挿入効率を基準とした相対頻度を表２に示す。
【００１４】
【表２】
【００１５】
表２から明らかなように、鋳型上のＡＺＡに対してＴＴＰは効率よく取り込まれたが、一方でＡＺＡと塩基対形成可能なｄＣＴＰは、ＴＴＰの１．８％の効率でしか取り込まれなかった。プリン塩基の取り込み効率は、Ｔの取り込み効率の１％に満たなかった。
また、この条件で、４つすべてのヌクレオシド三リン酸存在下反応を行ったところ、鎖は末端まで伸長し、ＡＺＡ部位の後でポリメラーゼ伸長反応の停止は観察されなかった。
プライマーの３'側１１ｍｅｒの３'側に（ＡＺＡの反対側に）ＴもしくはＣを付加した１２ｍｅｒ５'−ｄ（ＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＸ）−３'と上記実験で用いられた鋳型で形成される二重鎖のＴｍを測定した。その結果、Ｘ＝ＣのＴｍ（２８．０℃）は、Ｘ＝ＴのＴｍ（２６．２℃）より高く、上記のＴｍ測定と同じくＡＺＡ−Ｔ塩基対よりもむしろＡＺＡ−Ｃ塩基対の方が安定だった。ＡＺＡ−Ｃ塩基対が安定であるにもかかわらず、上で述べたようにポリメラーゼによるｄＣＴＰの取り込みは極めて遅かった。以上の結果は、ＡＺＡは、ＣとＧ−Ｃ塩基対と同程度の安定な塩基対を形成することができるが、Ｃとの塩基対形成過程が容易でないためにｄＣＴＰの取り込みが大きく遅くなることを示唆している。
【００１６】
以上の結果から、判ったことをまとめると以下の如くなる。
ＡＺＡは、ＴよりむしろＣと安定な塩基対を形成する。ＡＺＡは、これまでに報告されている縮重塩基とは異なり、二重鎖の安定性を低下させることなく複数の塩基と塩基対を形成することができる。一方で、ポリメラーゼによる塩基の取り込みでは、ＡＺＡの反対側には、Ｔが優先的に挿入され、Ｃは挿入されない。ＡＺＡは、その特異な塩基対形成の性質から、サザンハイブリダイゼーションのような二重鎖形成で用いることができる縮重塩基として用いることができるだけでなく、複製段階においてＧ：Ｃ−Ａ：Ｔ変異を誘導することができる強力な変異原としても有用と考えられる。
【００１７】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００１８】
参考例１．２,４−ジアミノ−７−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピロール［２,３−ｄ］ピリミジン（ＡＺＡＤ）の合成
メタノール−アンモニア溶液（−７６℃で飽和させたもの）４０ｍｌに２−アミノ−４−クロロ７−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン ２．０ｇ（３．８４ｍｍｏｌ）を懸濁させ、密閉容器中、１００℃で８時間撹拌を行った。反応後、混濁液を濾過し、濾液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：１０％メタノール／クロロホルム）により生成してＡＺＡＤ ７６０ｍｇを得た。収率７５％。
１H NMR(400MHz,DMSO-d６) δ(ppm)=6.90(d, 1H,J=3.6Hz),
6.37(d, 1H,J=3.6Hz), 6.63(br, 2H,), 6.32(dd, 1H, J=9.6Hz),
5.58(br, 2H), 5.21(m, 1H), 4.29(m, 1H), 3.76(m, 1H),
3.49(m,3Hz), 2.39-2.06(m, 2H)。
【００１９】
実施例１．２,４−ビス（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノメチリデン−７−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル−３−Ｏ−シアノエチル−Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト）−７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン（化合物Ａ）の合成
（１）２,４−ビス（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノメチリデン）−７−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン（化合物１）の合成
Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド−ジメチルアセタール ２ｍＬ（１１．３ｍｍｏｌ）を含むＡＺＡＤ ２００ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）溶液を５５℃で８時間撹拌した。次に、反応溶液を褐色油状になるまで溶媒留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）によって精製を行い、化合物１ ２２８ｍｇを得た。収率８１％。
１H NMR(400MHz,CDCl３) δ(ppm)=8.80(br, 1H), 8.71(br, 1H),
6.88(d, 1H, J=3.7Hz), 6.50(d, 1H, J=3.7Hz),
6.30(dd, 1H, J=5.7, 9.0Hz), 4.72(d, 1H, J=5.6Hz),
4.11(d, 1H, J=1.8Hz), 3.72-3.92(m, 2H), 3.14(d, 6H, J=10.5Hz),
3.09(d, 6H, J=9.3Hz), 2.23-3.05(m, 2H)。
１３C NMR(125MHz,CDCl３) δ(ppm)=161.4, 157.5, 157.0, 152.7, 123.7,
109.4, 100.5, 88.0, 87.8, 77.2, 73.3, 63.4, 41.2, 41.0, 40.9,
40.1, 35.1, 34.9。
MS(FAB, NBA/CH２Cl２) m/z(%) 376[M+H]＋。
HRMS(FAB) 計算値：376.2095 （C１７H２６O３N７[M+H]＋として）
実測値：376.2113。
【００２０】
（２）２,４−ビス（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノメチリデン）−７−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン（化合物２）の合成
化合物１ ４５０ｍｇ（１．１３ｍｍｏｌ）、４,４'−ジメトキシトリチルクロリド ４９４ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン ４１ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１５ｍＬ）を室温で３時間撹拌した。次に、反応溶液を褐色油状になるまで溶媒留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：メタノール＝１０：１０：１、トリエチルアミン１％含有）によって精製を行い、化合物２ ６５６ｍｇを得た。収率８６％。
１H NMR(400MHz,CDCl３) δ(ppm)=8.91(br, 1H), 8.67(br, 1H),
6.96(d, 1H, J=3.7), 6.78-7.42(m, 14H), 6.51(d, 1H, J=3.8),
4.55(m, 1H), 3.76(s, 6H), 3.26(m, 2H), 3.14(d, 6H, J=10.5Hz),
3.09(d, 6H, J=9.3Hz), 3.05(m, 1H), 2.41(m, 2H)。
１３C NMR(125MHz,CDCl３) δ(ppm)=158.54, 158.49, 157.5, 157.1,
153.8, 144.5, 135.83, 135.81, 135.71, 135.69, 130.0, 128.2,
127.9, 126.8, 120.6, 113.1, 107.8, 101.5, 86.4, 84.8, 77.2,
72.8, 64.2, 64.1, 55.23, 55.22, 45.8, 41.0, 40.9, 40.6,
35.2, 34.8。
MS(FAB, NBA/CH２Cl２) m/z(%) 678[M+H]＋。
HRMS(FAB) 計算値：678.3401 （C３８H４３O５N７[M+H]＋として）
実測値：678.3390。
【００２１】
（３）２,４−ビス（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノメチリデン−７−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル−３−Ｏ−シアノエチル−Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト）−７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン（化合物Ａ）の合成
化合物２ １００ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピル−２−シアノエチルジフォスフォロアミダイト ５２μＬ（０．１６ｍｍｏｌ）、テトラゾール １２ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．５ｍＬ）溶液を室温で４時間撹拌した。反応後、反応溶液を濾過し、化合物Ａを含んだ濾液をそのまま次の合成へ供した。反応収率は、ほぼ定量的であった。
反応溶液の一部を採取し、単離精製した化合物Ａの１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）チャートを図２に、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）チャートを図３に、ＦＡＢ マススペクトルデータを図４にそれぞれ示す。
また、化合物Ａの合成スキームを以下に示す。
【００２２】
【化７】
【００２３】
実施例２．オリゴヌクレオチドの合成及び評価
実施例１で得られた化合物Ａを用い、アプライド バイオシステム社の３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を使用して、周知のフォスフォロアミダイト法により、ＡＺＡＤを導入したオリゴヌクレオチドシークェンスを固相合成した（ＴＨＦ／ピリジン／水溶媒中、２０ｍＭ Ｉ２で酸化。カップリング時間：Ｇ及びＴは１２０秒、ＡＺＡは１時間。）。
固相担体からの切り出し及び脱保護反応は、２８％アンモニア水溶液中、５５℃、１８時間の加熱処理によって行った。粗生成物は、５-ＯＤＳ-Ｈカラム［１０×１５０ｍｍ、溶出液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）／アセトニトリル混合液、ｐＨ７．０、リニアグラジエント（５％〜２０％アセトニトリル、３０分）、流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ］を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。なお、この一連の合成過程で、分解生成物は生じなかった。
得られた精製オリゴヌクレオチド５'−ｄ(ＴＴＴＧＧＴＴＡＺＡＴＴＴ）−３'のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ マススペクトルデータ［(Ｍ−Ｈ)−］を図５に示す。また、同精製オリゴヌクレオチドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［コスモシル５Ｃ−１８ＡＲカラム４．６×１５０ｍｍ、溶出液：０．１Ｍ ＴＥＡＡ／アセトニトリル、ｐＨ７．０、リニアグラジエント（５％〜３０％アセトニトリル、２０分）、流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ］による分析結果を図６に示す。
【００２４】
次に、同精製オリゴヌクレオチドを５０Ｕ／ｍＬ仔牛腸由来アルカリホスファターゼ、０．１５Ｕ／ｍＬ蛇毒由来ホスホジエステラーゼ及び５０Ｕ／ｍＬ Ｐ１ヌクレアーゼで、３７℃、３時間消化した。消化後の試料のＨＰＬＣ［コスモシル５Ｃ−１８ＡＲカラム４．６×１５０ｍｍ、溶出液：０．１Ｍ ＴＥＡＡ／アセトニトリル、ｐＨ７．０、リニアグラジエント（０％〜１０％アセトニトリル、２０分）、流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ］による分析結果を図７に示す。
【００２５】
融解温度（Ｔ ｍ ）の測定
上で得られた各種オリゴヌクレオチド二重鎖（最終塩基濃度：２．５μＭ）のＴｍ値を１０ｍＭカコジル酸ナトリウムを含むｐＨ７．０の緩衝液中で測定した。 ＪＡＳＣＯ ＴＰＵ−４３６温度制御器を備えたＪＡＳＣＯ ＴＰＵ−５５０ＵＶ／ＶＩＳスペクトロメーターを使用して温度変化に対する２６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。加熱速度１℃／ｍｉｎで２℃〜８０℃まで加熱して吸光度の変化を測定し、得られたグラフからそれぞれのＴｍ値を算出した。
結果は前記表１に示した通りである。
【００２６】
一塩基伸長反応
ＡＺＡの塩基対形成の効率に関して検討するために、ＡＺＡを含むＤＮＡ配列を鋳型としたポリメラーゼによる伸長反応を行った。
プライマー−鋳型の二重鎖を緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸、ｐＨ７．３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ含有）中で混合し、９０℃に加熱してアニーリングした後、ゆっくりと室温まで冷却した。プライマー−鋳型の二重鎖（５ｍＭ）をポリメラーゼ（大腸菌由来ポリメラーゼクレノウフラグメント（エクソ−））の存在下、３７℃で各種デオキシヌクレオチドリン酸と反応させた。反応を一定時間毎に８０％ホルムアミド停止液（８０％v/vホルムアミド溶液、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％キシレンシアノール及び０．１％ブロモフェノールブルー含有）で停止させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２０％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素）で分析した。結果を図１に示す。
また、ＶｍａｘとＫｍは３回繰り返し実験後、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔから算出した。
結果は前記表２に示した通りである。
【００２７】
【発明の効果】
本発明に係るデアザアデニン類は、ＤＮＡの相補鎖側のチミン、シトシン両方を認識できる縮重塩基として働く。また、当該デアザアデニン類を含むＤＮＡ二重鎖は、高い熱的安定性を有する。従って、これをＤＮＡ中に取り込むことにより、ＤＮＡ変異解析、ＤＮＡ−タンパク相互作用の解析等への利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に係る２−アミノ−７−デアザアデニン（ＡＺＡ）を含むＤＮＡ配列を鋳型としたポリメラーゼによる伸長反応を追跡したゲル電気泳動の結果を示す。
【図２】図２は、本発明のフォスフォロアミダイトの１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）チャートである。
【図３】図３は、本発明のフォスフォロアミダイトの１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）チャートである。
【図４】図４は、本発明のフォスフォロアミダイトのＦＡＢ マススペクトルデータである。
【図５】図５は、本発明の精製オリゴヌクレオチド５'−ｄ(ＴＴＴＧＧＴＴＡＺＡＴＴＴ）−３'のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ マススペクトルデータ［(Ｍ−Ｈ)−］である。
【図６】図６は、本発明の精製オリゴヌクレオチドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析結果である。
【図７】図７は、本発明の精製オリゴヌクレオチドを各種酵素で消化した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した結果である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば、ＤＮＡ変異解析、ＤＮＡ−タンパク相互作用の解析、ＤＮＡの複製、ＲＮＡへの転写等への利用が期待される、デアザアデニン類を含んでなる核酸と、核酸に該デアザアデニン類を導入するために用いられる新規なフォスフォロアミダイトに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子中で生じる点変異は、重い遺伝病の原因として、しばしば重大な意味を持つ。Ｇ（グアニン）：Ｃ（シトシン）−Ａ（アデニン）：Ｔ（チミン）変異は、天然でしばしば認められるＤＮＡの点変異の一つである。このタイプの変異が遺伝子上で生じると、例えばあるアミノ酸に対応するコドンがストップコドンへ変化するナンセンスミューテーションに代表される重大なエラーをしばしば引き起こし、その結果、タンパク合成の不完全な終結によって様々な重篤な遺伝子病を生ずる。遺伝子病の起源を理解するためには、遺伝子の特定の領域で遺伝子を変異させる遺伝子技術を開発することが極めて重要である。Ｇ：Ｃ−Ａ：Ｔ変異を効率よく生じさせる方法として、亜硫酸塩によるシトシンの処理や、５位がメチル化されたシトシンもしくはシトシンを含むシクロブタンピリミジン二量体の加水分解による脱アミノ化がよく知られている。そのほかには、２個かそれ以上の塩基を認識することができる縮重塩基を利用する方法がある。これまでにＣ，Ｔと塩基対を形成することができるプリン誘導体としてＯ６−メチルグアニンや２−アミノプリンや６−メトキシアデニンが知られている。これらの塩基は、プロトネーションや互変異性化やゆらぎ塩基対によって複数の異なる塩基を区別して認識する。しかしながら、これらによる塩基対形成においては、どれも二重鎖ＤＮＡを形成することができるものの、それらの大きな不安定化が観察され、変異研究に必要な短鎖オリゴヌクレオチドへの複数の縮重塩基の導入は現実的ではなかった。
７−デアザプリンは、非ワトソン−クリック塩基対の形成において重要な役割を果たす７位の窒素原子が炭素原子に交換された非天然の塩基であり、核酸構造研究において有用な道具として用いられる。様々な置換基で置換された７−デアザプリンがいくつかの研究グループから報告されており、これらを含むオリゴマーの二重鎖安定性についていくつかのグループから報告されている。しかしながらそれらの塩基認識の選択性にはこれまで全く触れられていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、複数の塩基と安定な塩基対を形成することができ、且つ、ＤＮＡの相補鎖側のチミン、シトシン両方を認識できる縮重塩基として働くことが出来るデアザアデニン類を、ＤＮＡの分子中に容易に導入しうる新規なフォスフォロアミダイトと、該デアザアデニン類を組み込んだ核酸を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、チミン塩基と三本の水素結合を使って安定な塩基対を形成することが知られている２−アミノアデニンのデアザ類縁体である２−アミノ−７−デアザアデニン（ＡＺＡ）をＤＮＡに導入し、天然の塩基との塩基対形成能を検討すると共に、ＡＺＡを含むオリゴマーについて、複数の塩基と安定な塩基対を形成することができる縮重塩基としての能力について検討し、併せて、ポリメラーゼによる伸長反応を用いて変異原としての能力についても検討した結果、上記目的を達成しうる本発明に到達した。
【０００５】
即ち、本発明は、分子中に２−アミノ−７−デアザアデニンを含んでなる核酸若しくはオリゴヌクレオチドに関する。
【０００６】
また、本発明は、一般式［２］
【化４】
【０００７】
更に、本発明は、一般式［２］
【化５】
【０００８】
【発明の実施の形態】
分子中に２−アミノ−７−デアザアデニンを含んでなる本発明の核酸としては、例えば下記一般式［１］で示されるものが挙げられる。
【化６】
本発明において、分子中に２−アミノ−７−デアザアデニン（ＡＺＡ）を含んでなる核酸若しくはオリゴヌクレオチドを製造するために用いられる２−アミノ−７−デアザ−２'−デオキシアデノシンのフォスフォロアミダイトの合成法は大略次の通りである。
先ず、原料となる２−アミノ−７−デアザ−２’−デオキシアデノシンを、例えばＬｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１９８７，１５−１９等に記載されている方法に従って合成する。次いで、このデアザアデノシン分子が有する２箇所のエキソサイクリックアミノ基を例えば、ジメチルホルムアミドジメチルアセタール、ジメチルホルムアミドジエチルアセタール、ジメチルホルムアミドジ−ｎ−プロピルアセタール、ジメチルホルムアミドジ−ｎ−ブチルアセタール、ジメチルホルムアミドジ−ｔ−ブチルアセタール、ジメチルホルムアミドジネオペンチルアセタール等のジメチルホルムアミドジアルキルアセタールを使用して保護する。そして更に、５'位の１級水酸基を塩化４，４’−ジメトキシトリチル、臭化４，４’−ジメトキシトリチル等のハロゲン化４，４’−ジメトキシトリチルを使用して保護する。その後、該生成物をＤＮＡ合成にむけて、常法に従ってシアノエチルフォスホロアミダイトへと変換する。
【００１０】
上で得られたフォスフォロアミダイトを用いた２−アミノ−７−デアザ−２'−デオキシアデノシンのＤＮＡ若しくはオリゴヌクレオチドへの導入は、フォスフォロアミダイト法を用いて、市販のＤＮＡ自動合成機により固相合成を行えばよい。固相担体からの切り出しおよび脱保護反応は、例えば２８％アンモニア水溶液中、３０〜６０℃、１０〜２０時間の加熱処理等により行われる。粗生成物は、逆相液体クロマトグラフィー等により精製することが出来る。
【００１１】
上記の如くして得られた本発明のＡＺＡ導入オリゴヌクレオチドについて、ＤＮＡ二本鎖融解温度（Ｔｍ）の測定を行った結果を以下に示す。
Ｔ ｍ の測定
ＡＺＡ−Ｔ（チミン）塩基対を含む二重鎖５’−ｄ（ＴＴＴＧＧＴＴＡＺＡＴＴＴ）−３’／５’−（ＡＡＡＴＡＡＣＣＡＡＡ）−３’の融解温度（Ｔｍ）を、２６０ｎｍの紫外光によって測定した。この二重鎖のＴｍは、１３．８℃であり、野生型塩基対Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）のＴｍより、１℃上昇した。２−アミノアデニン（ＡＡ）−ＴのＴｍが１４．０℃、７−デアザアデニン（ＺＡ）−ＴのＴｍが１２．２℃であり、これらとＡＺＡ−ＴのＴｍを比べると、ＡＺＡ−ＴのＴｍはＡＡ−ＴのＴｍに近い。この結果は、ＡＺＡ−Ｔを含む二重鎖が、ＡＡ−Ｔ間の相互作用と同様、ＡＺＡとＴの間に三本の水素結合を形成することによって安定化されていることを示唆している。
ＡＺＡの相補鎖の塩基をＴではない他の塩基に置き換えたとき、ＡＺＡ−ＡやＺＡ−Ｇの場合には、大きく二重鎖を不安定化させたが、逆にＣの場合、Ｔｍは１９．０℃となり、ＡＺＡ−Ｔを含む二重鎖のＴｍよりも５．２℃も二重鎖を強く安定化させた。このＴｍの値は、Ａ−Ｔ塩基対やＡＡ−Ｔ塩基対で観察された値よりもむしろＧ−Ｃ塩基対で観察されるＴｍ（１９．８℃）に近い。
ＺＡもまたＣと塩基対を形成することによってわずかに二重鎖を安定化したが、一方ＡＡは、Ｃとの対形成によって二重鎖を大きく不安定化し、塩基対が効果的に形成されていないことを示している。これらのことからもＡＺＡが、Ｔとだけでなく、Ｔよりもさらに強くＣと塩基対を形成することができることは、特筆に値する。各種塩基を導入したＤＮＡ二重鎖の融解温度（Ｔｍ）を表１に示す。
【００１２】
【表１】
次に、本発明のＡＺＡ導入オリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼによる一塩基伸長反応を行った結果について記す。
ポリメラーゼによる一塩基伸長反応
ＡＺＡの塩基対形成の効率に関して検討するために、ＡＺＡを含むＤＮＡ配列を鋳型としたポリメラーゼによる伸長反応を行った。ポリメラーゼ（大腸菌由来ポリメラーゼ クレノウフラグメント）存在下５ｍＭのプライマー鋳型の二重鎖と天然の４つのヌクレオシド三リン酸（ＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ）のうちの１つをｐＨ７．３のバッファー中、３７℃で反応させた。一定の時間ごとに反応を停止し、ゲル電気泳動によって結果を解析した。与えられたゲルバンドの強度から、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを行い、反応のＶｍａｘとＫｍを求めた。ゲル電気泳動の結果を図１に示す。また、Ｖｍａｘ、Ｋｍ、Ｖｍａｘ／Ｋｍによって得られる挿入効率、及びＴＴＰの挿入効率を基準とした相対頻度を表２に示す。
【００１４】
【表２】
表２から明らかなように、鋳型上のＡＺＡに対してＴＴＰは効率よく取り込まれたが、一方でＡＺＡと塩基対形成可能なｄＣＴＰは、ＴＴＰの１．８％の効率でしか取り込まれなかった。プリン塩基の取り込み効率は、Ｔの取り込み効率の１％に満たなかった。
また、この条件で、４つすべてのヌクレオシド三リン酸存在下反応を行ったところ、鎖は末端まで伸長し、ＡＺＡ部位の後でポリメラーゼ伸長反応の停止は観察されなかった。
プライマーの３'側１１ｍｅｒの３'側に（ＡＺＡの反対側に）ＴもしくはＣを付加した１２ｍｅｒ５'−ｄ（ＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＸ）−３'と上記実験で用いられた鋳型で形成される二重鎖のＴｍを測定した。その結果、Ｘ＝ＣのＴｍ（２８．０℃）は、Ｘ＝ＴのＴｍ（２６．２℃）より高く、上記のＴｍ測定と同じくＡＺＡ−Ｔ塩基対よりもむしろＡＺＡ−Ｃ塩基対の方が安定だった。ＡＺＡ−Ｃ塩基対が安定であるにもかかわらず、上で述べたようにポリメラーゼによるｄＣＴＰの取り込みは極めて遅かった。以上の結果は、ＡＺＡは、ＣとＧ−Ｃ塩基対と同程度の安定な塩基対を形成することができるが、Ｃとの塩基対形成過程が容易でないためにｄＣＴＰの取り込みが大きく遅くなることを示唆している。
【００１６】
以上の結果から、判ったことをまとめると以下の如くなる。
ＡＺＡは、ＴよりむしろＣと安定な塩基対を形成する。ＡＺＡは、これまでに報告されている縮重塩基とは異なり、二重鎖の安定性を低下させることなく複数の塩基と塩基対を形成することができる。一方で、ポリメラーゼによる塩基の取り込みでは、ＡＺＡの反対側には、Ｔが優先的に挿入され、Ｃは挿入されない。ＡＺＡは、その特異な塩基対形成の性質から、サザンハイブリダイゼーションのような二重鎖形成で用いることができる縮重塩基として用いることができるだけでなく、複製段階においてＧ：Ｃ−Ａ：Ｔ変異を誘導することができる強力な変異原としても有用と考えられる。
【００１７】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００１８】
参考例１．２,４−ジアミノ−７−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピロール［２,３−ｄ］ピリミジン（ＡＺＡＤ）の合成
メタノール−アンモニア溶液（−７６℃で飽和させたもの）４０ｍｌに２−アミノ−４−クロロ７−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン ２．０ｇ（３．８４ｍｍｏｌ）を懸濁させ、密閉容器中、１００℃で８時間撹拌を行った。反応後、混濁液を濾過し、濾液を濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：１０％メタノール／クロロホルム）により生成してＡＺＡＤ ７６０ｍｇを得た。収率７５％。
１H NMR(400MHz,DMSO-d６) δ(ppm)=6.90(d, 1H,J=3.6Hz),
6.37(d, 1H,J=3.6Hz), 6.63(br, 2H,), 6.32(dd, 1H, J=9.6Hz),
5.58(br, 2H), 5.21(m, 1H), 4.29(m, 1H), 3.76(m, 1H),
3.49(m,3Hz), 2.39-2.06(m, 2H)。
【００１９】
実施例１．２,４−ビス（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノメチリデン−７−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル−３−Ｏ−シアノエチル−Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト）−７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン（化合物Ａ）の合成
（１）２,４−ビス（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノメチリデン）−７−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン（化合物１）の合成
Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド−ジメチルアセタール ２ｍＬ（１１．３ｍｍｏｌ）を含むＡＺＡＤ ２００ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）溶液を５５℃で８時間撹拌した。次に、反応溶液を褐色油状になるまで溶媒留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１０：１）によって精製を行い、化合物１ ２２８ｍｇを得た。収率８１％。
１H NMR(400MHz,CDCl３) δ(ppm)=8.80(br, 1H), 8.71(br, 1H),
6.88(d, 1H, J=3.7Hz), 6.50(d, 1H, J=3.7Hz),
6.30(dd, 1H, J=5.7, 9.0Hz), 4.72(d, 1H, J=5.6Hz),
4.11(d, 1H, J=1.8Hz), 3.72-3.92(m, 2H), 3.14(d, 6H, J=10.5Hz),
3.09(d, 6H, J=9.3Hz), 2.23-3.05(m, 2H)。
１３C NMR(125MHz,CDCl３) δ(ppm)=161.4, 157.5, 157.0, 152.7, 123.7,
109.4, 100.5, 88.0, 87.8, 77.2, 73.3, 63.4, 41.2, 41.0, 40.9,
40.1, 35.1, 34.9。
MS(FAB, NBA/CH２Cl２) m/z(%) 376[M+H]＋。
HRMS(FAB) 計算値：376.2095 （C１７H２６O３N７[M+H]＋として）
実測値：376.2113。
【００２０】
（２）２,４−ビス（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノメチリデン）−７−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン（化合物２）の合成
化合物１ ４５０ｍｇ（１．１３ｍｍｏｌ）、４,４'−ジメトキシトリチルクロリド ４９４ｍｇ（１．５ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン ４１ｍｇ（０．３３ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（１５ｍＬ）を室温で３時間撹拌した。次に、反応溶液を褐色油状になるまで溶媒留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：メタノール＝１０：１０：１、トリエチルアミン１％含有）によって精製を行い、化合物２ ６５６ｍｇを得た。収率８６％。
１H NMR(400MHz,CDCl３) δ(ppm)=8.91(br, 1H), 8.67(br, 1H),
6.96(d, 1H, J=3.7), 6.78-7.42(m, 14H), 6.51(d, 1H, J=3.8),
4.55(m, 1H), 3.76(s, 6H), 3.26(m, 2H), 3.14(d, 6H, J=10.5Hz),
3.09(d, 6H, J=9.3Hz), 3.05(m, 1H), 2.41(m, 2H)。
１３C NMR(125MHz,CDCl３) δ(ppm)=158.54, 158.49, 157.5, 157.1,
153.8, 144.5, 135.83, 135.81, 135.71, 135.69, 130.0, 128.2,
127.9, 126.8, 120.6, 113.1, 107.8, 101.5, 86.4, 84.8, 77.2,
72.8, 64.2, 64.1, 55.23, 55.22, 45.8, 41.0, 40.9, 40.6,
35.2, 34.8。
MS(FAB, NBA/CH２Cl２) m/z(%) 678[M+H]＋。
HRMS(FAB) 計算値：678.3401 （C３８H４３O５N７[M+H]＋として）
実測値：678.3390。
【００２１】
（３）２,４−ビス（Ｎ,Ｎ'−ジメチルアミノメチリデン−７−（２−デオキシ−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル−３−Ｏ−シアノエチル−Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルフォスフォロアミダイト）−７Ｈ−ピロロ［２,３−ｄ］ピリミジン（化合物Ａ）の合成
化合物２ １００ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトライソプロピル−２−シアノエチルジフォスフォロアミダイト ５２μＬ（０．１６ｍｍｏｌ）、テトラゾール １２ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．５ｍＬ）溶液を室温で４時間撹拌した。反応後、反応溶液を濾過し、化合物Ａを含んだ濾液をそのまま次の合成へ供した。反応収率は、ほぼ定量的であった。
反応溶液の一部を採取し、単離精製した化合物Ａの１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）チャートを図２に、１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）チャートを図３に、ＦＡＢ マススペクトルデータを図４にそれぞれ示す。
また、化合物Ａの合成スキームを以下に示す。
【００２２】
【化７】
実施例２．オリゴヌクレオチドの合成及び評価
実施例１で得られた化合物Ａを用い、アプライド バイオシステム社の３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を使用して、周知のフォスフォロアミダイト法により、ＡＺＡＤを導入したオリゴヌクレオチドシークェンスを固相合成した（ＴＨＦ／ピリジン／水溶媒中、２０ｍＭ Ｉ２で酸化。カップリング時間：Ｇ及びＴは１２０秒、ＡＺＡは１時間。）。
固相担体からの切り出し及び脱保護反応は、２８％アンモニア水溶液中、５５℃、１８時間の加熱処理によって行った。粗生成物は、５-ＯＤＳ-Ｈカラム［１０×１５０ｍｍ、溶出液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン（ＴＥＡＡ）／アセトニトリル混合液、ｐＨ７．０、リニアグラジエント（５％〜２０％アセトニトリル、３０分）、流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ］を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。なお、この一連の合成過程で、分解生成物は生じなかった。
得られた精製オリゴヌクレオチド５'−ｄ(ＴＴＴＧＧＴＴＡＺＡＴＴＴ）−３'のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ マススペクトルデータ［(Ｍ−Ｈ)−］を図５に示す。また、同精製オリゴヌクレオチドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）［コスモシル５Ｃ−１８ＡＲカラム４．６×１５０ｍｍ、溶出液：０．１Ｍ ＴＥＡＡ／アセトニトリル、ｐＨ７．０、リニアグラジエント（５％〜３０％アセトニトリル、２０分）、流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ］による分析結果を図６に示す。
【００２４】
次に、同精製オリゴヌクレオチドを５０Ｕ／ｍＬ仔牛腸由来アルカリホスファターゼ、０．１５Ｕ／ｍＬ蛇毒由来ホスホジエステラーゼ及び５０Ｕ／ｍＬ Ｐ１ヌクレアーゼで、３７℃、３時間消化した。消化後の試料のＨＰＬＣ［コスモシル５Ｃ−１８ＡＲカラム４．６×１５０ｍｍ、溶出液：０．１Ｍ ＴＥＡＡ／アセトニトリル、ｐＨ７．０、リニアグラジエント（０％〜１０％アセトニトリル、２０分）、流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ］による分析結果を図７に示す。
【００２５】
融解温度（Ｔ ｍ ）の測定
上で得られた各種オリゴヌクレオチド二重鎖（最終塩基濃度：２．５μＭ）のＴｍ値を１０ｍＭカコジル酸ナトリウムを含むｐＨ７．０の緩衝液中で測定した。 ＪＡＳＣＯ ＴＰＵ−４３６温度制御器を備えたＪＡＳＣＯ ＴＰＵ−５５０ＵＶ／ＶＩＳスペクトロメーターを使用して温度変化に対する２６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定した。加熱速度１℃／ｍｉｎで２℃〜８０℃まで加熱して吸光度の変化を測定し、得られたグラフからそれぞれのＴｍ値を算出した。
結果は前記表１に示した通りである。
【００２６】
一塩基伸長反応
ＡＺＡの塩基対形成の効率に関して検討するために、ＡＺＡを含むＤＮＡ配列を鋳型としたポリメラーゼによる伸長反応を行った。
プライマー−鋳型の二重鎖を緩衝液（１０ｍＭ トリス−塩酸、ｐＨ７．３、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ含有）中で混合し、９０℃に加熱してアニーリングした後、ゆっくりと室温まで冷却した。プライマー−鋳型の二重鎖（５ｍＭ）をポリメラーゼ（大腸菌由来ポリメラーゼクレノウフラグメント（エクソ−））の存在下、３７℃で各種デオキシヌクレオチドリン酸と反応させた。反応を一定時間毎に８０％ホルムアミド停止液（８０％v/vホルムアミド溶液、１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％キシレンシアノール及び０．１％ブロモフェノールブルー含有）で停止させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２０％ポリアクリルアミド、７Ｍ尿素）で分析した。結果を図１に示す。
また、ＶｍａｘとＫｍは３回繰り返し実験後、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔから算出した。
結果は前記表２に示した通りである。
【００２７】
【発明の効果】
本発明に係るデアザアデニン類は、ＤＮＡの相補鎖側のチミン、シトシン両方を認識できる縮重塩基として働く。また、当該デアザアデニン類を含むＤＮＡ二重鎖は、高い熱的安定性を有する。従って、これをＤＮＡ中に取り込むことにより、ＤＮＡ変異解析、ＤＮＡ−タンパク相互作用の解析等への利用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に係る２−アミノ−７−デアザアデニン（ＡＺＡ）を含むＤＮＡ配列を鋳型としたポリメラーゼによる伸長反応を追跡したゲル電気泳動の結果を示す。
【図２】図２は、本発明のフォスフォロアミダイトの１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）チャートである。
【図３】図３は、本発明のフォスフォロアミダイトの１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）チャートである。
【図４】図４は、本発明のフォスフォロアミダイトのＦＡＢ マススペクトルデータである。
【図５】図５は、本発明の精製オリゴヌクレオチド５'−ｄ(ＴＴＴＧＧＴＴＡＺＡＴＴＴ）−３'のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ マススペクトルデータ［(Ｍ−Ｈ)−］である。
【図６】図６は、本発明の精製オリゴヌクレオチドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析結果である。
【図７】図７は、本発明の精製オリゴヌクレオチドを各種酵素で消化した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した結果である。
Claims (3)
- 下記一般式［１］
- 一般式［２］
- 一般式［２］
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