JPH0725788B2 - オリゴまたはポリヌクレオチド - Google Patents
オリゴまたはポリヌクレオチドInfo
- Publication number
- JPH0725788B2 JPH0725788B2 JP61-504618A JP50461886A JPH0725788B2 JP H0725788 B2 JPH0725788 B2 JP H0725788B2 JP 50461886 A JP50461886 A JP 50461886A JP H0725788 B2 JPH0725788 B2 JP H0725788B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pyrimidine
- mixture
- added
- fluorescent
- dioxopyrido
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、螢光を発するピリドピリミジンヌクレオチド
誘導体を分子中又は分子末端に含むオリゴ又はポリヌク
レオチドに関する。
誘導体を分子中又は分子末端に含むオリゴ又はポリヌク
レオチドに関する。
背景技術
生体高分子、特に蛋白質や核酸における構造と機能の相
関を明らかにするために、螢光プローブを利用した研究
が広く行なわれている。そして核酸の研究においては、
核酸中に存在する螢光性の微量塩基をプローブとして用
いる方法や、核酸へ螢光分子を化学的に導入してこれを
プローブとして用いる方法がある。螢光性塩基を有する
ヌクレオシドの例としては、アデノシン類やシチジン類
をクロルアセトアルデヒドで化学修飾して得られる、下
記式で示されるような螢光性のエテノ誘導体がある。
関を明らかにするために、螢光プローブを利用した研究
が広く行なわれている。そして核酸の研究においては、
核酸中に存在する螢光性の微量塩基をプローブとして用
いる方法や、核酸へ螢光分子を化学的に導入してこれを
プローブとして用いる方法がある。螢光性塩基を有する
ヌクレオシドの例としては、アデノシン類やシチジン類
をクロルアセトアルデヒドで化学修飾して得られる、下
記式で示されるような螢光性のエテノ誘導体がある。
特に、エテノアデノシン類は、中性で強く螢光を発する
ことから、これをプローブとして用いて種々の研究が行
なわれてきた。しかし、これらは塩基対形成能を有しな
い。
ことから、これをプローブとして用いて種々の研究が行
なわれてきた。しかし、これらは塩基対形成能を有しな
い。
発明の開示
本発明者らは、螢光性を有しグアニンあるいはアデニン
との塩基対形成が可能な、ピリミジンヌクレオチド誘導
体を得るべく鋭意研究を行ない、本発明に到達した。
との塩基対形成が可能な、ピリミジンヌクレオチド誘導
体を得るべく鋭意研究を行ない、本発明に到達した。
即ち、本発明は、一般式（Ｉ）
で表わされるピリドピリミジンヌクレオチド誘導体を構
成単位として有する、すなわち分子中又は分子末端に又
は分子末端に、一般式（II） で表わされる螢光性ヌクレオチドを、少なくとも１個含
有するオリゴ又はポリヌクレオチドである。
成単位として有する、すなわち分子中又は分子末端に又
は分子末端に、一般式（II） で表わされる螢光性ヌクレオチドを、少なくとも１個含
有するオリゴ又はポリヌクレオチドである。
図面の簡単な説明
第１図は、固相リン酸トリエステル法によるオリゴヌク
レオチドの合成システムを示す。第２図は、本発明のオ
リゴ又はポリヌクレオチドの構成単位であるピリドピリ
ミジン塩基のRNaseAによる水解反応を示す。第３図と第
４図は、本発明のピリドピリミジンヌクレオチドを含む
オリゴヌクレオチドの、吸光度と温度の関係を示す。第
５図は、本発明のオリゴヌクレオチドのホモクロマトグ
ラフィーによるフィンガープリンドを示す。
レオチドの合成システムを示す。第２図は、本発明のオ
リゴ又はポリヌクレオチドの構成単位であるピリドピリ
ミジン塩基のRNaseAによる水解反応を示す。第３図と第
４図は、本発明のピリドピリミジンヌクレオチドを含む
オリゴヌクレオチドの、吸光度と温度の関係を示す。第
５図は、本発明のオリゴヌクレオチドのホモクロマトグ
ラフィーによるフィンガープリンドを示す。
第６図は、ホスファイト・トリエステル法によるオリゴ
ヌクレオチドの合成システムを示す。
ヌクレオチドの合成システムを示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の一般式（Ｉ）において特に好ましいのは、X1及
び／又はY1が （ｎは1,2又は３の整数を示す）で,Z1が水素又は水酸基
で,W1が水素である化合物である。
び／又はY1が （ｎは1,2又は３の整数を示す）で,Z1が水素又は水酸基
で,W1が水素である化合物である。
水酸基が公知の適当な保護基で保護されているものも、
本発明の範囲に含まれる。
本発明の範囲に含まれる。
一般式（Ｉ）において、X1とY1が共に水酸基（本発明の
範囲には含まれない）でW1とZ1が水素又は水酸基の化合
物は、水銀化合物を用いるBergstromらの方法（J.Org.C
hem.,47,2174（1982））によって合成できる。別な方法
としては、例えば、５−ヨードデオキシウリジンにPd
（OAc）２とPh3Pの存在下にアクリル酸メチルを作用さ
せ、得られた化合物の糖水酸基をアセチル基で保護した
後、４位のトリアゾリド化を行ない、アンモニアで処理
することによりデオキシシチジン誘導体を得、次いで得
られた化合物を水中で高圧水銀灯で照射し、ピリド［2,
3−ｄ］ピリミジンヌクレオシドを得る方法である。
範囲には含まれない）でW1とZ1が水素又は水酸基の化合
物は、水銀化合物を用いるBergstromらの方法（J.Org.C
hem.,47,2174（1982））によって合成できる。別な方法
としては、例えば、５−ヨードデオキシウリジンにPd
（OAc）２とPh3Pの存在下にアクリル酸メチルを作用さ
せ、得られた化合物の糖水酸基をアセチル基で保護した
後、４位のトリアゾリド化を行ない、アンモニアで処理
することによりデオキシシチジン誘導体を得、次いで得
られた化合物を水中で高圧水銀灯で照射し、ピリド［2,
3−ｄ］ピリミジンヌクレオシドを得る方法である。
次に、一般式（Ｉ）の化合物においてR1がハロゲンのも
のは、前記ピリミジンヌクレオシドの塩基部の変換反応
によって得ることができる。例えば、ピリド［2,3−
ｄ］ピリミジンヌクレオシドの糖水酸基をアセチル基で
保護した後、クロロホルム中でPOCl3とジメチルホルム
アミドを70℃で１時間作用させることにより、７位がCl
体のものが得られる。
のは、前記ピリミジンヌクレオシドの塩基部の変換反応
によって得ることができる。例えば、ピリド［2,3−
ｄ］ピリミジンヌクレオシドの糖水酸基をアセチル基で
保護した後、クロロホルム中でPOCl3とジメチルホルム
アミドを70℃で１時間作用させることにより、７位がCl
体のものが得られる。
またR1がアミノ基のものは、例えば、５−ヨードデオキ
シウリジンにPd（OAc）２とPh3Pの存在下、アクリロニ
トリルを作用させることにより、５位にシアノビニル基
が入った化合物を得、次いで４位のトリアゾリド化を行
ない、その後アンモニアで処理することによりデオキシ
シチジン誘導体を得、次いでこの化合物の水溶液に高圧
水銀灯で60分間光照射を行なうことによって得られる。
シウリジンにPd（OAc）２とPh3Pの存在下、アクリロニ
トリルを作用させることにより、５位にシアノビニル基
が入った化合物を得、次いで４位のトリアゾリド化を行
ない、その後アンモニアで処理することによりデオキシ
シチジン誘導体を得、次いでこの化合物の水溶液に高圧
水銀灯で60分間光照射を行なうことによって得られる。
これらの化合物は、後述の如くすべて螢光性を示しかつ
ピリミジン塩基としての特性を示した。
ピリミジン塩基としての特性を示した。
上記の如くして得られた螢光性ヌクレオシドは、その
３′位又は５′位に後述の如き方法でリン酸基を導入し
ヌクレオチドとすることができる。
３′位又は５′位に後述の如き方法でリン酸基を導入し
ヌクレオチドとすることができる。
かくして得られた一般式（Ｉ）の化合物は、螢光性であ
りかつ核酸塩基のグアニンあるいはアデニンと塩基対を
形成する能力があるので、これを分子中又は分子末端に
有するオリゴ又はョポリヌクレオチドは、螢光プローブ
として利用できる。あるいは、これらの化合物は、DNA
二重らせん中に組み入れた際に、塩基部分は空間的に適
合しており、塩基間の水素結合形成能力又はスタッキン
グ作用を増強する可能性も考えられる。
りかつ核酸塩基のグアニンあるいはアデニンと塩基対を
形成する能力があるので、これを分子中又は分子末端に
有するオリゴ又はョポリヌクレオチドは、螢光プローブ
として利用できる。あるいは、これらの化合物は、DNA
二重らせん中に組み入れた際に、塩基部分は空間的に適
合しており、塩基間の水素結合形成能力又はスタッキン
グ作用を増強する可能性も考えられる。
また、本発明の一般式（II）において特に好ましいの
は、X2が であり、Y2が−Ｏ−でW2が水素である、オリゴ又はポリ
ヌクレオチドである。
は、X2が であり、Y2が−Ｏ−でW2が水素である、オリゴ又はポリ
ヌクレオチドである。
螢光性ヌクレオシド又はヌクレオチドをDNAオリゴマー
あるいはポリマーへ導入するには、有機化学的に合成す
る方法と、酵素化学的に導入する２通りの方法がとられ
る。
あるいはポリマーへ導入するには、有機化学的に合成す
る方法と、酵素化学的に導入する２通りの方法がとられ
る。
有機化学的に合成する方法は、螢光性ヌクレオシド
（Ｆ）を含むオリゴヌクレオチドを直接合成する方法で
ある。その方法として、例えばItakuraらが開発した固
相リン酸トリエステル法，ホスファイト・トリエステル
法等がある。
（Ｆ）を含むオリゴヌクレオチドを直接合成する方法で
ある。その方法として、例えばItakuraらが開発した固
相リン酸トリエステル法，ホスファイト・トリエステル
法等がある。
（ｉ） 固相リン酸トリエステル法は、第１図に示すサ
イクルに従って合成を行なった。すなわちステップ１と
して、ベンゼンスルホン酸（BSA）で、５′−水酸基の
ジメトキシトリチル基（DMTr基）を除去し、ステップ２
で、ダイマーブロックをメシチレンスルホン酸ニトロト
リアゾール（MSNT）で縮合し、固相に担持されたＦ含
有オリゴマーの鎖を伸長した。また、目的と異なる配列
のオリゴマー生成を防ぐために、縮合反応において未反
応の５′−水酸基は、４−ジメチルアミノピリジン（DM
AP）存在下無水酢酸（Ac2O）でキャッピングを行なっ
た。
イクルに従って合成を行なった。すなわちステップ１と
して、ベンゼンスルホン酸（BSA）で、５′−水酸基の
ジメトキシトリチル基（DMTr基）を除去し、ステップ２
で、ダイマーブロックをメシチレンスルホン酸ニトロト
リアゾール（MSNT）で縮合し、固相に担持されたＦ含
有オリゴマーの鎖を伸長した。また、目的と異なる配列
のオリゴマー生成を防ぐために、縮合反応において未反
応の５′−水酸基は、４−ジメチルアミノピリジン（DM
AP）存在下無水酢酸（Ac2O）でキャッピングを行なっ
た。
このサイクルをくり返すことによって、目的とするオリ
ゴマーを合成した。オリゴヌクレオチドのポリマー支持
体からの切り出しとリン酸の保護基の除去は、室温でア
ンモニア水で処理することにより行なった。
ゴマーを合成した。オリゴヌクレオチドのポリマー支持
体からの切り出しとリン酸の保護基の除去は、室温でア
ンモニア水で処理することにより行なった。
更にアンモニア水で加熱処理することにより、塩基部の
アシル基を除去した。次いで逆層のシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーで精製し、必要なフラクションを分取
し、５′−末端のDMTr基を除去し、更に高速液体クロマ
トグラフィーで精製した。
アシル基を除去した。次いで逆層のシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーで精製し、必要なフラクションを分取
し、５′−末端のDMTr基を除去し、更に高速液体クロマ
トグラフィーで精製した。
（ii） ホスファイト・トリエステル法は、第６図に示
すサイクルに従って合成を行なった。
すサイクルに従って合成を行なった。
すなわちステップ１として、トリクロロ酢酸（TCA）
で、５′−水酸基のジメトキシトリチル基（DMTr）を除
去し、ステップ２で、ヌクレオシド−３′−ホスホアミ
ダイトをテトラゾールにより活性化した。ステップ３
で、活性化したヌクレオシド−３′−ホスホアミダイト
を５′−水酸基とカップリングさせた。また、未反応の
５′−水酸基は、４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）
存在下、無水酢酸でキャッピングした。ステップ５でヨ
ウ素で３価のリンを５価に酸化した。このサイクルをく
り返すことにより、目的とするオリゴマーを合成した。
次いでリン酸の保護基の除去をチオフェノールによって
行なった後、オリゴヌクレオチドのポリマー支持体から
の切り出しは、アンモニア水により行なった。以後、常
法に従って精製した。
で、５′−水酸基のジメトキシトリチル基（DMTr）を除
去し、ステップ２で、ヌクレオシド−３′−ホスホアミ
ダイトをテトラゾールにより活性化した。ステップ３
で、活性化したヌクレオシド−３′−ホスホアミダイト
を５′−水酸基とカップリングさせた。また、未反応の
５′−水酸基は、４−ジメチルアミノピリジン（DMAP）
存在下、無水酢酸でキャッピングした。ステップ５でヨ
ウ素で３価のリンを５価に酸化した。このサイクルをく
り返すことにより、目的とするオリゴマーを合成した。
次いでリン酸の保護基の除去をチオフェノールによって
行なった後、オリゴヌクレオチドのポリマー支持体から
の切り出しは、アンモニア水により行なった。以後、常
法に従って精製した。
螢光性ヌクレオシド又はヌクレオチドをDNAオリゴマー
あるいはポリマーに酵素化学的に導入する方法として
は、 （ｉ） DNAポリメラーゼを用いるニック・トランスレ
ーション （Rigby,P.W.ら,J.Mol.Biol.,113,237（1977）参照） （ii） 末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ
を用いる３′−末端付加反応 （F.J.Bollum,The Enzymes,（P.D.Boyer,ed.）,3rd Ed.
Vol.10,pp.145−171,Academic Press,New York,N.Y.（1
974）参照） の２つが、通常用いられる。
あるいはポリマーに酵素化学的に導入する方法として
は、 （ｉ） DNAポリメラーゼを用いるニック・トランスレ
ーション （Rigby,P.W.ら,J.Mol.Biol.,113,237（1977）参照） （ii） 末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ
を用いる３′−末端付加反応 （F.J.Bollum,The Enzymes,（P.D.Boyer,ed.）,3rd Ed.
Vol.10,pp.145−171,Academic Press,New York,N.Y.（1
974）参照） の２つが、通常用いられる。
いずれの酵素を用いる場合にも、基質としては、好まし
くは、ヌクレオシド５′−トリリン酸が用いられる。螢
光性ヌクレオシドの５′−モノリン酸の合成は、Yoshik
awaら（Tetrahedron Lett.,5065（1967））の方法に従
って合成できる。また、５′−モノリン酸をイミダゾリ
ドとした後ジリン酸と反応させる、５′−トリリン酸の
合成は、Ottoらの方法（J.Am.Chem.Soc.,87,1785−1788
（1965））に従って行なうことができる。
くは、ヌクレオシド５′−トリリン酸が用いられる。螢
光性ヌクレオシドの５′−モノリン酸の合成は、Yoshik
awaら（Tetrahedron Lett.,5065（1967））の方法に従
って合成できる。また、５′−モノリン酸をイミダゾリ
ドとした後ジリン酸と反応させる、５′−トリリン酸の
合成は、Ottoらの方法（J.Am.Chem.Soc.,87,1785−1788
（1965））に従って行なうことができる。
次に合成した５′−トリリン酸を基質として用い、DNA
ポリメラーゼを用いて、ニック・トランスレーションを
行なうと、シチジンの代りに、螢光性ヌクレオチドが導
入され螢光標識されたオリゴマーあるいはポリマーを調
製することができる。また、末端デオキシヌクレオチド
トランスフェラーゼを用いると、３′−末端に螢光性ヌ
クレオチドポリマーを付加することができる。
ポリメラーゼを用いて、ニック・トランスレーションを
行なうと、シチジンの代りに、螢光性ヌクレオチドが導
入され螢光標識されたオリゴマーあるいはポリマーを調
製することができる。また、末端デオキシヌクレオチド
トランスフェラーゼを用いると、３′−末端に螢光性ヌ
クレオチドポリマーを付加することができる。
以下、参考例，実施例により本発明を詳述する。
参考例１
（１） シチジン（ａ）14.7gを蒸留水200mlに溶解し、
酢酸第二水銀21.5gを加えて、70℃で６時間反応させ
た。冷却した後、6.5M塩化ナトリウム水溶液20mlを加え
て、室温で１時間反応させた。生成した白色沈澱を濾取
して、0.1M塩化ナトリウム25mlで１回、蒸留水100mlで
２回、エタノール100mlで２回、ジエチルエーテル100ml
で２回ずつ洗浄し、減圧下乾燥すると、５−クロロマー
キュリーシチジン（ｂ）が27g得られた。
酢酸第二水銀21.5gを加えて、70℃で６時間反応させ
た。冷却した後、6.5M塩化ナトリウム水溶液20mlを加え
て、室温で１時間反応させた。生成した白色沈澱を濾取
して、0.1M塩化ナトリウム25mlで１回、蒸留水100mlで
２回、エタノール100mlで２回、ジエチルエーテル100ml
で２回ずつ洗浄し、減圧下乾燥すると、５−クロロマー
キュリーシチジン（ｂ）が27g得られた。
（２） ５−クロロマーキュリーシチジン（ｂ）19.1g
をメタノール150mlに懸濁させ、これに0.1M塩化リチウ
ムパラジウム（Li2PdCl4）メタノール溶液210ml,アクリ
ル酸メチル40ml,塩化第二銅4.12gをそれぞれ加えて、室
温で14時間攪拌した。パラジウムの沈澱を濾去し、濾液
に硫化水素を吹き込み生じた沈澱をセライト濾過で除去
した。濾液を飽和重曹水で中和し、減圧下濃縮乾固し、
残渣を水より再結晶すると、（Ｅ）−５−（２−メトキ
シカルボニルエテニル）シチジン（ｃ）4.62gを得た。
をメタノール150mlに懸濁させ、これに0.1M塩化リチウ
ムパラジウム（Li2PdCl4）メタノール溶液210ml,アクリ
ル酸メチル40ml,塩化第二銅4.12gをそれぞれ加えて、室
温で14時間攪拌した。パラジウムの沈澱を濾去し、濾液
に硫化水素を吹き込み生じた沈澱をセライト濾過で除去
した。濾液を飽和重曹水で中和し、減圧下濃縮乾固し、
残渣を水より再結晶すると、（Ｅ）−５−（２−メトキ
シカルボニルエテニル）シチジン（ｃ）4.62gを得た。
（３） （Ｅ）−５−（２−メトキシカルボニルエテニ
ル）シチジン（ｃ）590mgを蒸留水500mlに溶解し、高圧
水銀灯（Ushio UM 102）で30分間照射した。
ル）シチジン（ｃ）590mgを蒸留水500mlに溶解し、高圧
水銀灯（Ushio UM 102）で30分間照射した。
反応液を減圧下乾固し、残渣を水より再結晶して、３−
β−Ｄ−リボフラノシル−2,7−ジオキソピリド［2,3−
ｄ］ピリミジン（ｄ）508mgを得た。物性値は以下の通
りであった。
β−Ｄ−リボフラノシル−2,7−ジオキソピリド［2,3−
ｄ］ピリミジン（ｄ）508mgを得た。物性値は以下の通
りであった。
m.p. 240℃
Mass m/e 295（M+）
NMR（DMSO−d6−D2O）
δ＋9.05（s,1H）,7.58（d.1H,J＝9Hz）6.19（d,1H,J＝
9Hz）， 5.81（s,1H）,4.02（m,3H）,3.70（m,2H） 元素分析値 C12H13O6N3として、 Ｃ Ｈ Ｎ 計算値（％） 48.82 4.43 14.23 実測値（％） 48.61 4.37 14.01 参考例２ シチジンの代りに２′−デオキシシチジンより出発し
て、参考例１と同様の方法に従って、３−β−Ｄ−２′
−デオキシリボフラノシル−2,7−ジオキソピリド［2,3
−ｄ］ピリミジンを得た。
9Hz）， 5.81（s,1H）,4.02（m,3H）,3.70（m,2H） 元素分析値 C12H13O6N3として、 Ｃ Ｈ Ｎ 計算値（％） 48.82 4.43 14.23 実測値（％） 48.61 4.37 14.01 参考例２ シチジンの代りに２′−デオキシシチジンより出発し
て、参考例１と同様の方法に従って、３−β−Ｄ−２′
−デオキシリボフラノシル−2,7−ジオキソピリド［2,3
−ｄ］ピリミジンを得た。
参考例３
シチジンの代りに、アラビノシルトシンより出発して、
参考例１と同様の方法に従って、３−β−Ｄ−アラビノ
フラノシル−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリミジ
ンを得た。
参考例１と同様の方法に従って、３−β−Ｄ−アラビノ
フラノシル−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリミジ
ンを得た。
参考例４
３−β−Ｄ−リボフラノシル−2,7−ジオキソピリド
［2,3−ｄ］ピリミジン（ａ）295mgを無水ジメチルホル
ムアミド10mlに溶かし、これにヨウ化メチル0.1mlと炭
酸カリウム0.21gを加え、室温で12時間反応させた。炭
酸カリウムを瀘別し、濾液を酢酸で中和し、減圧下で濃
縮乾固させ、残渣を水より再結晶して、３−β−Ｄ−リ
ボフラノシル−2,7−ジオキソ−８−メチルピリド［2,3
−ｄ］ピリミジン（ｂ）279mgを得た。物性値は以下の
通りであった。
［2,3−ｄ］ピリミジン（ａ）295mgを無水ジメチルホル
ムアミド10mlに溶かし、これにヨウ化メチル0.1mlと炭
酸カリウム0.21gを加え、室温で12時間反応させた。炭
酸カリウムを瀘別し、濾液を酢酸で中和し、減圧下で濃
縮乾固させ、残渣を水より再結晶して、３−β−Ｄ−リ
ボフラノシル−2,7−ジオキソ−８−メチルピリド［2,3
−ｄ］ピリミジン（ｂ）279mgを得た。物性値は以下の
通りであった。
m.p. 263〜265℃
Mass m/e 309（M+）
NMR（DMSO−d6−D2O）
δ＋9.06（s,1H）,7.57（d.1H,J＝9.5Hz）,6.31（d,1H,
J＝9.5Hz）,5.79（s,1H）， 元素分析値 C13H15O6N3として、 Ｃ Ｈ Ｎ 計算値（％） 50.49 4.89 13.59 実測値（％） 50.49 4.83 13.55 参考例５ （１） ３−β−Ｄ−リボフラノシル−2,7−ジオキソ
ピリド［2,3−ｄ］ピリミジン（ａ）2.01gを無水ピリジ
ン50mlに溶かし、これに無水酢酸8mlを加えて、室温で1
2時間反応させた。氷冷下でメタノール10mlを加え、減
圧下で溶媒を留去し、残渣をエタノール水系で再結晶し
て、２′,3′,5′−トリ−Ｏ−アセチル−３−β−Ｄ−
リボフラノシル−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリ
ミジン（ｂ）2.40gを得た。
J＝9.5Hz）,5.79（s,1H）， 元素分析値 C13H15O6N3として、 Ｃ Ｈ Ｎ 計算値（％） 50.49 4.89 13.59 実測値（％） 50.49 4.83 13.55 参考例５ （１） ３−β−Ｄ−リボフラノシル−2,7−ジオキソ
ピリド［2,3−ｄ］ピリミジン（ａ）2.01gを無水ピリジ
ン50mlに溶かし、これに無水酢酸8mlを加えて、室温で1
2時間反応させた。氷冷下でメタノール10mlを加え、減
圧下で溶媒を留去し、残渣をエタノール水系で再結晶し
て、２′,3′,5′−トリ−Ｏ−アセチル−３−β−Ｄ−
リボフラノシル−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリ
ミジン（ｂ）2.40gを得た。
（２） オキシ塩化リン0.3mlに無水クロロホルム20ml
を加え、更にジメチルホルムアミド0.2mlを加えて室温
で10分間反応させた。次に、２′,3′,5′−トリ−Ｏ−
アセチル−３−β−Ｄ−リボフラノシル−2,7−オキソ
ピド［2,3−ｄ］ピリミジン（ｂ）630mgを加え、70℃で
２時間反応させた。次に、反応液を減圧下濃縮し、クロ
ロホルム−水の系で抽出し、クロロホルム層を無水硫酸
ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下留去し、
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、
２′,3′,5′−トリ−Ｏ−アセチル−３−β−Ｄ−リボ
フラノシル−２−オキソ−７−クロロピリド［2,3−
ｄ］ピリミジン（ｃ）408mgを得た。
を加え、更にジメチルホルムアミド0.2mlを加えて室温
で10分間反応させた。次に、２′,3′,5′−トリ−Ｏ−
アセチル−３−β−Ｄ−リボフラノシル−2,7−オキソ
ピド［2,3−ｄ］ピリミジン（ｂ）630mgを加え、70℃で
２時間反応させた。次に、反応液を減圧下濃縮し、クロ
ロホルム−水の系で抽出し、クロロホルム層を無水硫酸
ナトリウムで乾燥した。クロロホルムを減圧下留去し、
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、
２′,3′,5′−トリ−Ｏ−アセチル−３−β−Ｄ−リボ
フラノシル−２−オキソ−７−クロロピリド［2,3−
ｄ］ピリミジン（ｃ）408mgを得た。
（３） ２′,3′,5′−トリ−Ｏ−アセチル−３−β−
Ｄ−リボフラノシル−２−オキソ−７−クロロピリド
［2,3−ｄ］ピリミジン（ｃ）44mgを塩化メチレン1mlに
溶解させ、これにアンモニア飽和メタノール10mlを加え
て、室温で12時間反応させた。その後、反応液減圧下濃
縮して、残渣をエタノール−水系で再結晶して、３−β
−Ｄ−リボフラノシル−２−オキソ−７−クロロピリド
［2,3−ｄ］ピリミジン（ｄ）26mgを得た。物性値は以
下の通りであった。
Ｄ−リボフラノシル−２−オキソ−７−クロロピリド
［2,3−ｄ］ピリミジン（ｃ）44mgを塩化メチレン1mlに
溶解させ、これにアンモニア飽和メタノール10mlを加え
て、室温で12時間反応させた。その後、反応液減圧下濃
縮して、残渣をエタノール−水系で再結晶して、３−β
−Ｄ−リボフラノシル−２−オキソ−７−クロロピリド
［2,3−ｄ］ピリミジン（ｄ）26mgを得た。物性値は以
下の通りであった。
m.p. 189−190℃
UV ▲λH2O max▼ 293nm（ε＝8,400），
Mass m/e 314（M+）
NMR（DMSO−d6）
δ＋10.58（br s,1H）,7.81（d.1H,J＝8.1Hz）,7.08
（d,1H,J＝8.1Hz）,6.07（s,1H）,5.50（s,1H） 元素分析値 C12H12O5N3Cl・H2Oとして Ｃ Ｈ Ｎ Cl 計算値（％） 43.33 4.25 12.67 10.70 実測値（％） 43.66 4.13 12.72 10.74 参考例６ （１） ５−ヨードデオキシウリジン（ａ）460mgを、
無水ジオキサン20mlに溶かし、これに酢酸パラジウム22
mg,トリフェニルホスフィン34mg,トリエチルアミン0.3m
l,アクリロニトリル0.13mlを加え、100℃で12時間反応
させた。沈澱を瀘別したのち、硫化水素ガスを吹き込
み、生じた沈澱をセライト濾過で除去した。濾液を減圧
下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
で精製し、（Ｅ）−５−（２−シアノエテニル）デオキ
シウリジン（ｂ）159mgを得た。
（d,1H,J＝8.1Hz）,6.07（s,1H）,5.50（s,1H） 元素分析値 C12H12O5N3Cl・H2Oとして Ｃ Ｈ Ｎ Cl 計算値（％） 43.33 4.25 12.67 10.70 実測値（％） 43.66 4.13 12.72 10.74 参考例６ （１） ５−ヨードデオキシウリジン（ａ）460mgを、
無水ジオキサン20mlに溶かし、これに酢酸パラジウム22
mg,トリフェニルホスフィン34mg,トリエチルアミン0.3m
l,アクリロニトリル0.13mlを加え、100℃で12時間反応
させた。沈澱を瀘別したのち、硫化水素ガスを吹き込
み、生じた沈澱をセライト濾過で除去した。濾液を減圧
下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
で精製し、（Ｅ）−５−（２−シアノエテニル）デオキ
シウリジン（ｂ）159mgを得た。
（２） （Ｅ）−５−（２−シアノエテニル）デオキシ
ウリジン（ｂ）140mgを無水ピリジン5mlに溶かし、これ
に無水酢酸1mlを加えて、室温で12時間反応させる。氷
冷下で、メタノール10mlを加えて、10分間反応させたの
ち、減圧下で溶媒を留去し、残渣をエタノール−水系で
再結晶して、３′,5′−ジ−Ｏ−アセチル−（Ｅ）−５
−（２−シアノエテニル）デオキシウリジン（ｃ）168m
gを得た。
ウリジン（ｂ）140mgを無水ピリジン5mlに溶かし、これ
に無水酢酸1mlを加えて、室温で12時間反応させる。氷
冷下で、メタノール10mlを加えて、10分間反応させたの
ち、減圧下で溶媒を留去し、残渣をエタノール−水系で
再結晶して、３′,5′−ジ−Ｏ−アセチル−（Ｅ）−５
−（２−シアノエテニル）デオキシウリジン（ｃ）168m
gを得た。
（３） ３′,5′−ジ−Ｏ−アセチル−（Ｅ）−５−
（２−シアノエテニル）デオキシウリジン（ｃ）2.00g
を無水アセトニトリル20mlに溶かし、これに氷冷下で、
トリエチルアミン9.2ml,オキシ塩化リン1.12mlを加え、
次に1.3Mトリアゾールアセトニトリル溶液50mlを加え
て、室温で90分間反応させた。その後、水を加えて10分
間放置して、反応液を減圧下乾固させて、残渣を水−ク
ロロホルム系で抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナ
トリウムで乾燥した後、減圧下でクロロホルムを留去し
た。残渣をジオキサン20mlに溶かし、アンモニア水を加
えて、室温で12時間放置した。減圧下で濃縮乾固し、残
渣をＣ−18逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー
（20％アセトン／水で溶出）にて精製し、（Ｅ）−５−
（２−シアノエテニル）デオキシシチジン（ｅ）1.28g
を得た。
（２−シアノエテニル）デオキシウリジン（ｃ）2.00g
を無水アセトニトリル20mlに溶かし、これに氷冷下で、
トリエチルアミン9.2ml,オキシ塩化リン1.12mlを加え、
次に1.3Mトリアゾールアセトニトリル溶液50mlを加え
て、室温で90分間反応させた。その後、水を加えて10分
間放置して、反応液を減圧下乾固させて、残渣を水−ク
ロロホルム系で抽出した。クロロホルム層を無水硫酸ナ
トリウムで乾燥した後、減圧下でクロロホルムを留去し
た。残渣をジオキサン20mlに溶かし、アンモニア水を加
えて、室温で12時間放置した。減圧下で濃縮乾固し、残
渣をＣ−18逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー
（20％アセトン／水で溶出）にて精製し、（Ｅ）−５−
（２−シアノエテニル）デオキシシチジン（ｅ）1.28g
を得た。
（４） （Ｅ）−５−（２−シアノエテニル）デオキシ
ウリジン（ｅ）250mgを蒸留水500mlに溶かし、高圧水銀
灯で60分間光照射した。反応液を減圧下濃縮して、残渣
をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、水
から再結晶して、３−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル
−２−オキソ−７−アミノピリド［2,3−ｄ］ピリミジ
ン（ｆ）159mgを得た。
ウリジン（ｅ）250mgを蒸留水500mlに溶かし、高圧水銀
灯で60分間光照射した。反応液を減圧下濃縮して、残渣
をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、水
から再結晶して、３−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル
−２−オキソ−７−アミノピリド［2,3−ｄ］ピリミジ
ン（ｆ）159mgを得た。
物性値は以下の通りであった。
m.p.220℃（着色）
UV（中性） 252,308nm
（酸性,pH4.0）257,350,363nm
NMR（DMSO−d6）
（中性）δ＋7.28（d,J＝8.3Hz）,6.18（s,−NH2）6.07
（d,J＝8.3Hz）,5.88（d,1H,H−１′）,5.85（s,1H,H−
４） （DMSO−d6−CF3COOH−D2O）δ＋8.87（s,1H,H−
４′）， 7.91（d,1H,J＝9.3Hz）,6.69（d,1H,J＝9.3Hz）6.10
（t,1H,H−１′） 元素分析値 C12H14O4N4として、 Ｃ Ｈ Ｎ 計算値（％） 51.79 5.07 20.13 実測値（％） 51.64 5.10 20.05 参考例７ アクリロニトリルの代りに、アクリル酸メチルを用いそ
れ以外は参考例１と同様にして、３−β−Ｄ−リボフラ
ノシル−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリミジンを
得た。この生成物は、参考例１で合成したものと、物性
値はまったく一致した。
（d,J＝8.3Hz）,5.88（d,1H,H−１′）,5.85（s,1H,H−
４） （DMSO−d6−CF3COOH−D2O）δ＋8.87（s,1H,H−
４′）， 7.91（d,1H,J＝9.3Hz）,6.69（d,1H,J＝9.3Hz）6.10
（t,1H,H−１′） 元素分析値 C12H14O4N4として、 Ｃ Ｈ Ｎ 計算値（％） 51.79 5.07 20.13 実測値（％） 51.64 5.10 20.05 参考例７ アクリロニトリルの代りに、アクリル酸メチルを用いそ
れ以外は参考例１と同様にして、３−β−Ｄ−リボフラ
ノシル−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリミジンを
得た。この生成物は、参考例１で合成したものと、物性
値はまったく一致した。
参考例の方法に従って合成した種々のピリドピリミジン
ヌクレオシド誘導体の、螢光特性を第１表に示した。比
較として1,N6−エテノアデノシンの特性も示した（相対
強度はエテノアデノシンを1.0とした）。Ｆは３−β−
Ｄ−リボフラノシル−2.7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］
ピリミジンを意味し、dFはその２′デオキシ体を意味
し、８−Me,7−Cl,7−NH2は８位や７位がそれぞれメチ
ル基，クロル基，アミノ基で置換されていることを示
す。
ヌクレオシド誘導体の、螢光特性を第１表に示した。比
較として1,N6−エテノアデノシンの特性も示した（相対
強度はエテノアデノシンを1.0とした）。Ｆは３−β−
Ｄ−リボフラノシル−2.7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］
ピリミジンを意味し、dFはその２′デオキシ体を意味
し、８−Me,7−Cl,7−NH2は８位や７位がそれぞれメチ
ル基，クロル基，アミノ基で置換されていることを示
す。
第１表より、いずれもエテノアデノシンよりも強い螢光
性を有すること、８位や７位を置換すると螢光強度の減
少をもたらすこと、７位をアミノ化したものは酸性条件
下では強い螢光性を有することがわかる。
性を有すること、８位や７位を置換すると螢光強度の減
少をもたらすこと、７位をアミノ化したものは酸性条件
下では強い螢光性を有することがわかる。
次に、３−β−Ｄ−リボフラノシル−2,7−ジオキソビ
リド［2,3−ｄ］ピリミジン（Ｆ）が、ピリミジン塩基
として認識されるかどうかについて検討した。上田らの
方法（Chem.Pharm.Bull.,18,2303−2308（1970））によ
り、化合物Ｆをジメチルホルムアミド中、ポリリン酸，
トリブチルアミンで加熱処理することにより、２′,3′
−Ｏ−環状リン酸体を合成した。この環状リン酸体とピ
リミジン塩基に特異的であるRNaseAとを37℃でインキュ
ベートし，その水解率を調べた。比較として、ウリジン
ヌクレオシド（Ｕ）も同様に処理した。結果を第２図に
示した。第２図から、化合物ＦはＵと同程度によく水解
されることがわかる。
リド［2,3−ｄ］ピリミジン（Ｆ）が、ピリミジン塩基
として認識されるかどうかについて検討した。上田らの
方法（Chem.Pharm.Bull.,18,2303−2308（1970））によ
り、化合物Ｆをジメチルホルムアミド中、ポリリン酸，
トリブチルアミンで加熱処理することにより、２′,3′
−Ｏ−環状リン酸体を合成した。この環状リン酸体とピ
リミジン塩基に特異的であるRNaseAとを37℃でインキュ
ベートし，その水解率を調べた。比較として、ウリジン
ヌクレオシド（Ｕ）も同様に処理した。結果を第２図に
示した。第２図から、化合物ＦはＵと同程度によく水解
されることがわかる。
参考例８
３−β−Ｄデオキシリボフラノシル−2,7−ジオキソピ
リド［2,3−ｄ］ピリミジン（ａ）560mgを無水トリエチ
ルホスフェート5mlに溶かし、これを０℃に冷却して、
オキシ塩化リン613mgを加え、６時間反応させた後、氷1
gを加えて加水分解した。減圧下濃縮した後、残渣を蒸
留水1mlに溶かして、DEAE−セファデックスＡ−25（HCO
3−型）を用い、トリエチルアンモニウムビカーボネー
トの直線濃度勾配にて、精製し、３−（５′−Ｏ−ホス
ホリル−β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシル）−2,
7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリミジン（ｂ）575mg
を得た。
リド［2,3−ｄ］ピリミジン（ａ）560mgを無水トリエチ
ルホスフェート5mlに溶かし、これを０℃に冷却して、
オキシ塩化リン613mgを加え、６時間反応させた後、氷1
gを加えて加水分解した。減圧下濃縮した後、残渣を蒸
留水1mlに溶かして、DEAE−セファデックスＡ−25（HCO
3−型）を用い、トリエチルアンモニウムビカーボネー
トの直線濃度勾配にて、精製し、３−（５′−Ｏ−ホス
ホリル−β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシル）−2,
7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリミジン（ｂ）575mg
を得た。
参考例９
３−（５′−０−ホスホリル−β−Ｄ−デオキシリボフ
ラノシル）−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリミジ
ン（ｂ）88mgを無水ジメチルホルムアミド5mlに溶か
し、これにカルボニルジイミダゾール400mgを加えて、
室温で１時間反応させた。その後、反応液を、20mlの１
％ヨウ化ナトリウム／アセトンに注ぎ、精製した沈澱は
瀘別して、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥した。沈澱
を無水ジチルホルムアミド5mlに溶かし、モノ−トリ−
ｎ−ブチルアンモニウムホスフェート2gを加えて、室温
で24時間反応させた。減圧下、濃縮した後、残渣を蒸留
水3mlに溶かして、DEAE−セファデックスＡ−25（HCO3
−型）を用い、トリエチルアンモニウムビカーボネート
の直線濃度勾配にて精製し３−（５′−０−ジホスホリ
ル−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−2,7−ジオキ
ソピリド［2,3−ｄ］ピリミジン（ｃ）53mgを得た。
ラノシル）−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリミジ
ン（ｂ）88mgを無水ジメチルホルムアミド5mlに溶か
し、これにカルボニルジイミダゾール400mgを加えて、
室温で１時間反応させた。その後、反応液を、20mlの１
％ヨウ化ナトリウム／アセトンに注ぎ、精製した沈澱は
瀘別して、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥した。沈澱
を無水ジチルホルムアミド5mlに溶かし、モノ−トリ−
ｎ−ブチルアンモニウムホスフェート2gを加えて、室温
で24時間反応させた。減圧下、濃縮した後、残渣を蒸留
水3mlに溶かして、DEAE−セファデックスＡ−25（HCO3
−型）を用い、トリエチルアンモニウムビカーボネート
の直線濃度勾配にて精製し３−（５′−０−ジホスホリ
ル−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−2,7−ジオキ
ソピリド［2,3−ｄ］ピリミジン（ｃ）53mgを得た。
参考例10
参考例９において、モノ−トリ−ｎ−ブチルアンモニウ
ムホスフェートの代りに、ジ−トリ−ｎ−ブチルアンモ
ニウムジホスフェートを用いて、同じ操作を行ない、３
−（５′−０−トリホスホリル−β−Ｄ−デオキシリボ
フラノシル）−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリミ
ジン（ｄ）を得た。
ムホスフェートの代りに、ジ−トリ−ｎ−ブチルアンモ
ニウムジホスフェートを用いて、同じ操作を行ない、３
−（５′−０−トリホスホリル−β−Ｄ−デオキシリボ
フラノシル）−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］ピリミ
ジン（ｄ）を得た。
実施例１
本発明の螢光性ピリミジンヌクレオチドを含むドデカマ
ーの合成を以下の如き固相リン酸トリエステル合成法
（第１図参照）で行なった。固相支持体は、１％架橋ポ
リスチレン樹脂を用い３′−末端となるシチジンの３′
−水酸基と樹脂とをコハク酸エステルで結合し、担持し
た。合成は、第１図に示すサイクルに従って、ダイマー
ブロック縮合を行なった。
ーの合成を以下の如き固相リン酸トリエステル合成法
（第１図参照）で行なった。固相支持体は、１％架橋ポ
リスチレン樹脂を用い３′−末端となるシチジンの３′
−水酸基と樹脂とをコハク酸エステルで結合し、担持し
た。合成は、第１図に示すサイクルに従って、ダイマー
ブロック縮合を行なった。
ステップ１（脱トリチル化反応）
５μmolヌクレオシド相当の樹脂を用いて、２％ベンゼ
ンスルホン酸（BSA）クロロホルム溶液2mlで１分間処理
した（２回くり返した）。
ンスルホン酸（BSA）クロロホルム溶液2mlで１分間処理
した（２回くり返した）。
ステップ２（縮合反応）
ダイマー20μmolを200〜300μのピリジンに溶かし、
縮合剤として、メシチレンスルホン酸ニトロトリアゾー
ル（MSNT）70μmolを加えて、40℃で20分間反応させ
た。
縮合剤として、メシチレンスルホン酸ニトロトリアゾー
ル（MSNT）70μmolを加えて、40℃で20分間反応させ
た。
ステップ３（キャッピング反応）（未反応物の非反応化
反応） 無水酢酸（Ac2O）0.2mlを0.1M4−ジメチルアミノピリジ
ン（DMAP）のピリジン溶液1.8mlと混合し（用時調
製）、反応させた。
反応） 無水酢酸（Ac2O）0.2mlを0.1M4−ジメチルアミノピリジ
ン（DMAP）のピリジン溶液1.8mlと混合し（用時調
製）、反応させた。
この操作（ステップ１〜３）を、５回くり返し、ドデカ
マーを合成した。
マーを合成した。
合成したドデカマー（dGGGAAFTTTCCC……Ｆは螢光性ヌ
クレオシド）は、次の順序の操作に従って、脱保護し精
製した。
クレオシド）は、次の順序の操作に従って、脱保護し精
製した。
（ｉ） 濃アンモニア水16mlとピリジン4mlを加え、室
温で24時間反応させた。
温で24時間反応させた。
（ii） さらに、50℃に加熱して４時間反応させた。
（iii） 逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（C
18カラム：ウオータース社製,35〜100μｍ）で、精製し
た（アセトニトリルグラジエント:10％−35％）。
18カラム：ウオータース社製,35〜100μｍ）で、精製し
た（アセトニトリルグラジエント:10％−35％）。
（iv） 80％酢酸に溶かし、室温で20分間処理して、
５′−末端のジメトキシトリチル基を除去した。
５′−末端のジメトキシトリチル基を除去した。
（ｖ） 逆相高速液体クロマトグラフィーにて精製した
（東洋ソーダー:TSK−410AK）。
（東洋ソーダー:TSK−410AK）。
（vi） イオン交換高速液体クロマトグラフィーにて精
製して、単一ピークを得た（東洋ソーダ:TSKgel IEX540
K）。
製して、単一ピークを得た（東洋ソーダ:TSKgel IEX540
K）。
以上の様な方法で下に示す５種類の自己相補的なドデカ
マー（12量体）を合成した。
マー（12量体）を合成した。
ドデカマーのUVスペクトルにおいて、343nmの吸収よ
り、螢光性ヌクレオチドの存在が確認された。
り、螢光性ヌクレオチドの存在が確認された。
（２） 各ドデカマーの吸光度（260nm）の温度変化を
測定し、Tmを算出した。結果を第２表と第３図と第４図
に示した。（測定条件：濃度0.75A260,溶媒0.1MNaCl,0.
01Mカコジル酸ナトリウム）。ドデカマーNo.2,3は変曲
点を有さず（第４図参照）、測定温度では自己相補的な
二重鎖は形成していないことがわかる。
測定し、Tmを算出した。結果を第２表と第３図と第４図
に示した。（測定条件：濃度0.75A260,溶媒0.1MNaCl,0.
01Mカコジル酸ナトリウム）。ドデカマーNo.2,3は変曲
点を有さず（第４図参照）、測定温度では自己相補的な
二重鎖は形成していないことがわかる。
また、ドデカマーNo.1,4,5はいずれもTmが算出でき（第
３図参照）２つの興味ある点が観察できた。即ち、N
o.1,5のTmの変化より、Ｃ→Ｆの変換は、Tmの上昇（50.
5℃→58.4℃）をもたらし、２重鎖結合安定化の効果が
あることがわかる。すなわち、Ｃ→Ｆの変換は、Ｇとの
水素結合能を保持するばかりでなく、結合を強化するも
のである。これは、DNAプローブにＦを導入した場合
に、より強いハイブリダイゼーション能力が期待され、
感度の向上にもつながるものと思われる。No.4,5のTm
の変化より、ＦはＧのみならず、弱いながらもＡと水素
結合を形成することがわかった。
３図参照）２つの興味ある点が観察できた。即ち、N
o.1,5のTmの変化より、Ｃ→Ｆの変換は、Tmの上昇（50.
5℃→58.4℃）をもたらし、２重鎖結合安定化の効果が
あることがわかる。すなわち、Ｃ→Ｆの変換は、Ｇとの
水素結合能を保持するばかりでなく、結合を強化するも
のである。これは、DNAプローブにＦを導入した場合
に、より強いハイブリダイゼーション能力が期待され、
感度の向上にもつながるものと思われる。No.4,5のTm
の変化より、ＦはＧのみならず、弱いながらもＡと水素
結合を形成することがわかった。
（３） No.2のドデカマー５′−末端を放射性標識（32
P）し、蛇毒ホスホジエステラーゼで限定加水分解を行
ない、２次元ホモクロマトグラフィーでこれのフインガ
ープリントを行なったところ第５図に示した如き結果が
得られた。第５図の結果は、本発明の螢光性ピリミジン
ヌクレオチドは、通常のヌクレオチドと同程度に基質と
なることを示し、塩基配列の正しいことが確認された。
P）し、蛇毒ホスホジエステラーゼで限定加水分解を行
ない、２次元ホモクロマトグラフィーでこれのフインガ
ープリントを行なったところ第５図に示した如き結果が
得られた。第５図の結果は、本発明の螢光性ピリミジン
ヌクレオチドは、通常のヌクレオチドと同程度に基質と
なることを示し、塩基配列の正しいことが確認された。
実施例２
本発明の螢光剤ピリミジンヌクレオチドを含むペンタデ
カマー（15量体）の合成を以下の方法で行なった。
カマー（15量体）の合成を以下の方法で行なった。
（１）
３−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル−2,7−ジオキソ
ピリド［2,3−α］ピリミジン（ａ）279mgをピリジン15
mlに懸濁させ、これにトリエチルアミン0.194ml,4−ジ
メチルアミノピリジン（DMAP）6mg,4,4′−ジメトキシ
トリチルクロライド（DMTr−Cl）407mgを加え室温で５
時間反応させた後、水15mlを加え、ジエチルエーテルで
抽出した。減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラ
ムにより精製し、３−（５′−Ｏ−ジメトキシトリチル
−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−2,7−ジオキソ
ピリド［2,3−ｄ］ピリミジン（ｂ）490mgを得た。
ピリド［2,3−α］ピリミジン（ａ）279mgをピリジン15
mlに懸濁させ、これにトリエチルアミン0.194ml,4−ジ
メチルアミノピリジン（DMAP）6mg,4,4′−ジメトキシ
トリチルクロライド（DMTr−Cl）407mgを加え室温で５
時間反応させた後、水15mlを加え、ジエチルエーテルで
抽出した。減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラ
ムにより精製し、３−（５′−Ｏ−ジメトキシトリチル
−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−2,7−ジオキソ
ピリド［2,3−ｄ］ピリミジン（ｂ）490mgを得た。
（２）
３−（５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−デオキ
シリボフラノシル）−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］
ピリミジン（ｂ）490mgをCH2Cl25mlに溶解し、ジイソプ
ロピルエチルアミン0.585ml加え、次いでクロロ−N,N−
ジイソプロピルアミノ−メトキシホスフィン0.244mlを
ゆっくりと滴下し、15分間反応させた後、メタノール0.
2mlを加え、酢酸エチル30ml,トリエチルアミン1.5mlで
抽出した。減圧下、溶媒を留去した後シリカゲルカラム
により精製し、３−（５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−
３′−Ｏ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニル
−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−2,7−ジオキソ
ピリド［2,3−ｄ］ピリミジン（ｃ）330mgを得た。
シリボフラノシル）−2,7−ジオキソピリド［2,3−ｄ］
ピリミジン（ｂ）490mgをCH2Cl25mlに溶解し、ジイソプ
ロピルエチルアミン0.585ml加え、次いでクロロ−N,N−
ジイソプロピルアミノ−メトキシホスフィン0.244mlを
ゆっくりと滴下し、15分間反応させた後、メタノール0.
2mlを加え、酢酸エチル30ml,トリエチルアミン1.5mlで
抽出した。減圧下、溶媒を留去した後シリカゲルカラム
により精製し、３−（５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−
３′−Ｏ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニル
−β−Ｄ−デオキシリボフラノシル）−2,7−ジオキソ
ピリド［2,3−ｄ］ピリミジン（ｃ）330mgを得た。
（３） ３−（５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−
Ｏ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニル−β−
Ｄ−デオキシリボフラノシル）−2,7−ジオキソピリド
［2,3−ｄ］ピリミジン（ｃ）をDNAシンセサイザー（ア
プライド バイオシステム社製）の基質として用いホス
ファイト・トリエステル法（第６図参照）により、本発
明の螢光性ピリミジンヌクレオチドを含むペンタデカマ
ーを合成した。
Ｏ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィニル−β−
Ｄ−デオキシリボフラノシル）−2,7−ジオキソピリド
［2,3−ｄ］ピリミジン（ｃ）をDNAシンセサイザー（ア
プライド バイオシステム社製）の基質として用いホス
ファイト・トリエステル法（第６図参照）により、本発
明の螢光性ピリミジンヌクレオチドを含むペンタデカマ
ーを合成した。
合成したペンタデカマーは次の順序に従って脱保護し、
精製した。濃アンモニア水に溶解したペンタデカマーを
55℃で一夜放置し、アンモニアを減圧下留去した後、セ
ファデックスＧ−50で濾過し、濃縮後エタノール沈澱を
行った。その沈澱をホルムアミドに溶解後、7M尿素、20
％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、ペンタデ
カマーを含む目的バンドを切り出し、0.5M酢酸アンモニ
ウム,1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）,1mMEDTAによ
り抽出し、濃縮後エタノール沈澱により以下に示す３種
類のペンタデカマーを得た。
精製した。濃アンモニア水に溶解したペンタデカマーを
55℃で一夜放置し、アンモニアを減圧下留去した後、セ
ファデックスＧ−50で濾過し、濃縮後エタノール沈澱を
行った。その沈澱をホルムアミドに溶解後、7M尿素、20
％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、ペンタデ
カマーを含む目的バンドを切り出し、0.5M酢酸アンモニ
ウム,1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）,1mMEDTAによ
り抽出し、濃縮後エタノール沈澱により以下に示す３種
類のペンタデカマーを得た。
（ｉ） ５′ dAGAGCGTCGACCGAT ３′
（ii） ５′ dAGAGCGTFGACCGAT ３′
（iii） ５′ dAGAGCGTFGAFCGAT ３′
ペンタデカマー（ｉ）はpBR322中SalI認識部位を含むシ
ークエンス（pBR322の塩基の番号（645〜659）であり、
同様のシークエンス中で、（ii）は１個、（iii）は２
個のシチジン（Ｃ）を本発明における螢光性ピリミジン
ヌクレオチド（Ｆ）に変換している。ペンタデカマー
（ii）（iii）のUVスペクトルにおいて、330nmの吸収に
より螢光性ヌクレオチドの存在が確認された。
ークエンス（pBR322の塩基の番号（645〜659）であり、
同様のシークエンス中で、（ii）は１個、（iii）は２
個のシチジン（Ｃ）を本発明における螢光性ピリミジン
ヌクレオチド（Ｆ）に変換している。ペンタデカマー
（ii）（iii）のUVスペクトルにおいて、330nmの吸収に
より螢光性ヌクレオチドの存在が確認された。
実施例３ ペンタデカマーの５′末端標識
10μのペンタデカマー水溶液（20pmol）,3μのキナ
ーゼ緩衝液（0.5M Tris−HCl pH7.6,0.1MMg Cl2,50mMジ
チオスレイトール,1mMスペルミジン,1mM EDTA）、５μ
の［γ−32P］−ATP（50μCl）と水を加えて全量を29
μとし、よく攪拌した後、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼ１μ（2.5u）を加えて37℃で30分間反応させた。0.
25M MDTA1.2μを加え酵素反応を止め水50μ，変性
サケ精子DNA3μ（10mg/ml）を加えた後、フェノール
抽出を行い、水層をセファデックスＧ−50Fカラムにか
けペンタデカマー画分を分取した。次いでエタノール沈
澱を行い、沈澱を水に溶解して、pBR322とのハイブリダ
イゼーションにおけるDNAプローブとして使用するまで
−20℃で保存した。
ーゼ緩衝液（0.5M Tris−HCl pH7.6,0.1MMg Cl2,50mMジ
チオスレイトール,1mMスペルミジン,1mM EDTA）、５μ
の［γ−32P］−ATP（50μCl）と水を加えて全量を29
μとし、よく攪拌した後、T4ポリヌクレオチドキナー
ゼ１μ（2.5u）を加えて37℃で30分間反応させた。0.
25M MDTA1.2μを加え酵素反応を止め水50μ，変性
サケ精子DNA3μ（10mg/ml）を加えた後、フェノール
抽出を行い、水層をセファデックスＧ−50Fカラムにか
けペンタデカマー画分を分取した。次いでエタノール沈
澱を行い、沈澱を水に溶解して、pBR322とのハイブリダ
イゼーションにおけるDNAプローブとして使用するまで
−20℃で保存した。
実施例４ ５′末端標識したペンタデカマーとpBR322と
のハイブリダイゼーション pBR322 25μg/100μ（10mM Tris−HCl pH8.0,1mM ED
TA）を100℃で10分間加熱した後、０℃で１分間急冷
し、次いで20mM Tris−HCl pH7.4,1mM EDTAにより希釈
系列を調製し、この溶液をニトロセルロースメンブラン
に対し、１スポットあたりpBR322が0.5μg,0.25μg,0.1
25μg,0.062μg,0.031μg,0.016μｇとなる様にブロッ
ティングした。このニトロセルロースメンブランを1.5M
NaCl、0.5M NaCl−HClで３分間，次いで1.5M NaCl,0.5
M Tris−HCl pH7.2,1mM EDTAで３分間処理し、乾燥後、
真空オーブン中80℃で２時間加熱した。
のハイブリダイゼーション pBR322 25μg/100μ（10mM Tris−HCl pH8.0,1mM ED
TA）を100℃で10分間加熱した後、０℃で１分間急冷
し、次いで20mM Tris−HCl pH7.4,1mM EDTAにより希釈
系列を調製し、この溶液をニトロセルロースメンブラン
に対し、１スポットあたりpBR322が0.5μg,0.25μg,0.1
25μg,0.062μg,0.031μg,0.016μｇとなる様にブロッ
ティングした。このニトロセルロースメンブランを1.5M
NaCl、0.5M NaCl−HClで３分間，次いで1.5M NaCl,0.5
M Tris−HCl pH7.2,1mM EDTAで３分間処理し、乾燥後、
真空オーブン中80℃で２時間加熱した。
このニトロセルロースフイルターを６×SSC（0.9M NaC
l,0.09Mクエン酸ナトリウム）,0.5％SDS,変性サケ精子D
NA20μg/ml,デンハルト溶液（0.1％牛血清アルブミン,
0.1％フイコール,0.1％ポリビニルピロリドン）中55℃
で３時間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで
６×SSC,0.5％SDS,変性サケ精子DNA20μg/ml,デンハル
ト溶液に実施例３で調製したDNAプローブ（ｉ），（i
i），（iii）を１×106cpm/mlとなる様に加え、55℃で1
8時間ハイブリダイゼーションを行った後、55℃におい
て２×SSC,（0.3M NaCl,0.03Mクエン酸ナトリウム）で
２回,2×SSC,0.1％SDS1回で洗浄し、乾燥後オートラジ
オグラフィーにかけた。次いで同ニトロセルロースフイ
ルターを、65℃において２×SSCで２回、２×SSC,0.1％
SDSで１回洗浄し、乾燥後オートラジオグラフィーにか
けた。次いで同ニトロセルロースフィルターを、72℃に
おいて２×SSCで２回,2×SSC,0.1％SDSで１回洗浄し、
乾燥後オートラジオグラフィーにかけた。
l,0.09Mクエン酸ナトリウム）,0.5％SDS,変性サケ精子D
NA20μg/ml,デンハルト溶液（0.1％牛血清アルブミン,
0.1％フイコール,0.1％ポリビニルピロリドン）中55℃
で３時間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで
６×SSC,0.5％SDS,変性サケ精子DNA20μg/ml,デンハル
ト溶液に実施例３で調製したDNAプローブ（ｉ），（i
i），（iii）を１×106cpm/mlとなる様に加え、55℃で1
8時間ハイブリダイゼーションを行った後、55℃におい
て２×SSC,（0.3M NaCl,0.03Mクエン酸ナトリウム）で
２回,2×SSC,0.1％SDS1回で洗浄し、乾燥後オートラジ
オグラフィーにかけた。次いで同ニトロセルロースフイ
ルターを、65℃において２×SSCで２回、２×SSC,0.1％
SDSで１回洗浄し、乾燥後オートラジオグラフィーにか
けた。次いで同ニトロセルロースフィルターを、72℃に
おいて２×SSCで２回,2×SSC,0.1％SDSで１回洗浄し、
乾燥後オートラジオグラフィーにかけた。
その結果、55℃洗浄では（ｉ）（ii）（iii）ともに0.0
31μｇのpBR322まで検出可能であったが、65℃洗浄にお
いては（ｉ）がpBR322と二重鎖結合できずにほとんど洗
い流されていまうのに対し、（ii）および（iii）では5
55℃洗浄の場合とほぼ同程度にpBR322が検出可能であっ
た。72℃洗浄では（ｉ）（ii）（iii）ともに二重鎖結
合できず、pBR322の検出はできなかった。したがってＣ
からＦへの変換はＧとの水素結合を強化し、その結果Tm
が上昇し二重鎖結合が安定化することが、ハイブリダイ
ゼーションの系で証明された。すなわちDNAプローブ中
のＣをＦに変換することにより、より高い温度でのハイ
ブリダイゼーションが可能であるため、非選択的吸着が
ない、新規な高感度DNAプローブとなりうる。
31μｇのpBR322まで検出可能であったが、65℃洗浄にお
いては（ｉ）がpBR322と二重鎖結合できずにほとんど洗
い流されていまうのに対し、（ii）および（iii）では5
55℃洗浄の場合とほぼ同程度にpBR322が検出可能であっ
た。72℃洗浄では（ｉ）（ii）（iii）ともに二重鎖結
合できず、pBR322の検出はできなかった。したがってＣ
からＦへの変換はＧとの水素結合を強化し、その結果Tm
が上昇し二重鎖結合が安定化することが、ハイブリダイ
ゼーションの系で証明された。すなわちDNAプローブ中
のＣをＦに変換することにより、より高い温度でのハイ
ブリダイゼーションが可能であるため、非選択的吸着が
ない、新規な高感度DNAプローブとなりうる。
実施例５
ニックトランスレーション法による方法
（ａ） 用いた試薬
大腸菌DNAポリメラーゼＩ（Boehringer−Mannheimな
ど、5unit/mlの50％グリセロール溶液を原液のまま使
用），脾臓DNase I［1mg/mlとなるように0.01M塩酸に溶
かし、−20℃で保存。使用時に希釈液（10mM Tris−HC
l,pH7.5,5mM Mg Cl2,1mg/mlウシ血清アルブミン）にて1
0倍に希釈し０℃で２時間放置して活性化したあとさら
に終濃度0.14mg/mlにして用いる］，ニックトランスレ
ーション緩衝液（10倍量,500mM Tris−HCl,pH7.5,50mMM
gCl2,10mM2−メルカプトエタノール）,dNTP溶液（各0.1
mMのdTTP,dGTP,dATPおよび、ピリドピリミジンヌクレオ
シド−５′−トリホスフェート（dFTP）溶液），試料DN
A（10mM Tris HCl,pH7.5,10mM KCl,0.2mM EDTAに１μg/
μとなるようにλファージHind IIIフラグメントDNA
を溶かす）。
ど、5unit/mlの50％グリセロール溶液を原液のまま使
用），脾臓DNase I［1mg/mlとなるように0.01M塩酸に溶
かし、−20℃で保存。使用時に希釈液（10mM Tris−HC
l,pH7.5,5mM Mg Cl2,1mg/mlウシ血清アルブミン）にて1
0倍に希釈し０℃で２時間放置して活性化したあとさら
に終濃度0.14mg/mlにして用いる］，ニックトランスレ
ーション緩衝液（10倍量,500mM Tris−HCl,pH7.5,50mMM
gCl2,10mM2−メルカプトエタノール）,dNTP溶液（各0.1
mMのdTTP,dGTP,dATPおよび、ピリドピリミジンヌクレオ
シド−５′−トリホスフェート（dFTP）溶液），試料DN
A（10mM Tris HCl,pH7.5,10mM KCl,0.2mM EDTAに１μg/
μとなるようにλファージHind IIIフラグメントDNA
を溶かす）。
（ｂ） 方法
（１） 6.5μのニックトランスレーション緩衝液、1
0μのdDTP溶液,2μの試料DNA（１μg/μ）と水を
加えて全量を65μとし、よく攪拌した。
0μのdDTP溶液,2μの試料DNA（１μg/μ）と水を
加えて全量を65μとし、よく攪拌した。
（２） 活性化したDNase I溶液５μを加えて室温に
２分間放置してニックを入れた。ついで、大腸菌DNAポ
リメラーゼＩを２μ加えて14℃で１時間反応させた。
２分間放置してニックを入れた。ついで、大腸菌DNAポ
リメラーゼＩを２μ加えて14℃で１時間反応させた。
（３） 0.25M EDTAを35μ加えて68℃で10分間加温
し、酵素反応を止めた。フェノール抽出を２回，エタノ
ール沈澱を２回繰り返した。最後の沈澱を0.5mlの10mM
Tris−HCl,pH7.5,10mM KCl,0.2mM EDTAに溶かして使用
時まで−20℃に保存した。
し、酵素反応を止めた。フェノール抽出を２回，エタノ
ール沈澱を２回繰り返した。最後の沈澱を0.5mlの10mM
Tris−HCl,pH7.5,10mM KCl,0.2mM EDTAに溶かして使用
時まで−20℃に保存した。
産業上の利用可能性
本発明に係る分子中又は分子末端にピリドピリミジンヌ
クレオチド誘導体単位を少なくとも１個含有するオリゴ
又はポリヌクレオチドは、塩基対形成能を有する螢光DN
Aプローブとして、生体高分子、特に蛋白質や核酸にお
ける構造と機能の相関を明らかにする種々の研究、ま
た、迅速な病原微生物の同定、遺伝疾患や、遺伝病の診
断、さらに正常細胞と癌細胞の鑑別等に使用することが
できる。
クレオチド誘導体単位を少なくとも１個含有するオリゴ
又はポリヌクレオチドは、塩基対形成能を有する螢光DN
Aプローブとして、生体高分子、特に蛋白質や核酸にお
ける構造と機能の相関を明らかにする種々の研究、ま
た、迅速な病原微生物の同定、遺伝疾患や、遺伝病の診
断、さらに正常細胞と癌細胞の鑑別等に使用することが
できる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 上村 孝
東京都日野市豊田２丁目30番１号
(56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｖｏｌ．47（Ｎ
ｏ．11）Ｐ．2174−2178，（1982)
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ；Ｖｏｌ．13（Ｎｏ．19）Ｐ.
7119−7128，（1985)
Claims (2)
- 【請求項１】分子中又は分子末端に、一般式（II）で表
わされるピリドピリミジンヌクレオチド誘導体単位を、
少なくとも１個含有するオリゴ又はポリヌクレオチド。 - 【請求項２】一般式（II）において、X2が でありY2が−Ｏ−でW2が水素である、請求の範囲第１項
記載のオリゴ又はポリヌクレオチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-504618A JPH0725788B2 (ja) | 1985-09-09 | 1986-08-28 | オリゴまたはポリヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19768985 | 1985-09-09 | ||
| JP60-197689 | 1985-09-09 | ||
| JP61-504618A JPH0725788B2 (ja) | 1985-09-09 | 1986-08-28 | オリゴまたはポリヌクレオチド |
| PCT/JP1986/000441 WO1987001373A1 (fr) | 1985-09-09 | 1986-08-28 | Derives de nucleotides de pyridopyrimidine |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO1987001373A1 JPWO1987001373A1 (ja) | 1987-06-04 |
| JPH0725788B2 true JPH0725788B2 (ja) | 1995-03-22 |
| JPH0725788B1 JPH0725788B1 (ja) | 1995-03-22 |
Family
ID=16378713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61-504618A Expired - Lifetime JPH0725788B2 (ja) | 1985-09-09 | 1986-08-28 | オリゴまたはポリヌクレオチド |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4965350A (ja) |
| EP (1) | EP0235301B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0725788B2 (ja) |
| DE (1) | DE3686150T2 (ja) |
| WO (1) | WO1987001373A1 (ja) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5071974A (en) * | 1986-10-31 | 1991-12-10 | Amoco Corporation | Compositions and methods for the synthesis of oligonucleotides having 5'-phosphorylated termini |
| US5459255A (en) * | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
| US6399754B1 (en) | 1991-12-24 | 2002-06-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar modified oligonucleotides |
| US5872232A (en) * | 1990-01-11 | 1999-02-16 | Isis Pharmaceuticals Inc. | 2'-O-modified oligonucleotides |
| US6395492B1 (en) * | 1990-01-11 | 2002-05-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties |
| US6339066B1 (en) | 1990-01-11 | 2002-01-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C |
| AU651569B2 (en) * | 1990-01-11 | 1994-07-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for detecting and modulating RNA activity and gene expression |
| US5852182A (en) * | 1990-01-11 | 1998-12-22 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Thiol-derivatized oligonucleosides |
| US6114513A (en) * | 1990-01-11 | 2000-09-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized oligonucleotides |
| US6005087A (en) * | 1995-06-06 | 1999-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
| US5859221A (en) * | 1990-01-11 | 1999-01-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
| JPH0874B2 (ja) * | 1990-07-27 | 1996-01-10 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | 遺伝子発現を検出および変調するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド |
| US6262241B1 (en) * | 1990-08-13 | 2001-07-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compound for detecting and modulating RNA activity and gene expression |
| US5965722A (en) | 1991-05-21 | 1999-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides |
| ATE244259T1 (de) * | 1992-02-12 | 2003-07-15 | Chromagen Inc | Verwendungen von fluoreszierenden n-nukleosiden und dessen analogen |
| US5652099A (en) * | 1992-02-12 | 1997-07-29 | Conrad; Michael J. | Probes comprising fluorescent nucleosides and uses thereof |
| US6537973B1 (en) | 1992-03-16 | 2003-03-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide inhibition of protein kinase C |
| CA2145750A1 (en) * | 1993-08-18 | 1995-02-23 | Michael J. Conrad | Applications of fluorescent n-nucleosides and fluorescent structural analogs of n-nucleosides |
| US5591578A (en) * | 1993-12-10 | 1997-01-07 | California Institute Of Technology | Nucleic acid mediated electron transfer |
| US5525711A (en) * | 1994-05-18 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes |
| US6232465B1 (en) | 1994-09-02 | 2001-05-15 | Andrew C. Hiatt | Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides |
| GB9602025D0 (en) * | 1996-02-01 | 1996-04-03 | Amersham Int Plc | Nucleoside analogues |
| GB2309968B (en) * | 1996-02-01 | 2000-08-09 | Amersham Int Plc | Nucleoside analogues |
| JP3511788B2 (ja) | 1996-03-29 | 2004-03-29 | 宇部興産株式会社 | ７−アミノ−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ピリド ［２，３−ｄ］ ピリミジン及びその製造法 |
| US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
| US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
| US9096636B2 (en) | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
| GB9716231D0 (en) | 1997-07-31 | 1997-10-08 | Amersham Int Ltd | Base analogues |
| US6232463B1 (en) | 1997-10-09 | 2001-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted purines and oligonucleotide cross-linking |
| US6335432B1 (en) * | 1998-08-07 | 2002-01-01 | Bio-Red Laboratories, Inc. | Structural analogs of amine bases and nucleosides |
| UA72612C2 (en) * | 2000-07-06 | 2005-03-15 | Pyrido[2.3-d]pyrimidine and pyrimido[4.5-d]pyrimidine nucleoside analogues, prodrugs and method for inhibiting growth of neoplastic cells | |
| US7105962B2 (en) * | 2000-08-03 | 2006-09-12 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Brushless motor for partable electronic equipment with wire treatment technique of coils |
| WO2004027030A2 (en) * | 2002-09-18 | 2004-04-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Efficient reduction of target rna’s by single- and double-stranded oligomeric compounds |
| AU2003291755A1 (en) | 2002-11-05 | 2004-06-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use |
| US7781163B2 (en) | 2003-01-08 | 2010-08-24 | Lesley Davenport | G-quadruplex binding assays and compounds therefor |
| US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
| US7842512B2 (en) * | 2004-03-26 | 2010-11-30 | Purdue Research Foundation | Dyed microspheres for characterization of photochemical reactor behavior |
| US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
| US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
| CA2600886A1 (en) | 2005-03-08 | 2006-09-14 | Biota Scientific Management Pty Ltd. | Bicyclic nucleosides and nucleotides as therapeutic agents |
| CN106957350B (zh) | 2017-02-28 | 2019-09-27 | 北京大学 | 5-醛基胞嘧啶的标记方法及其在单碱基分辨率测序中的应用 |
| CN109678802B (zh) * | 2019-01-28 | 2020-12-29 | 四川大学 | 衍生醛基嘧啶的方法、检测5-醛基胞嘧啶的方法以及醛基嘧啶衍生物的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1219824A (en) * | 1981-04-17 | 1987-03-31 | David C. Ward | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
| US4711955A (en) * | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
-
1986
- 1986-08-28 WO PCT/JP1986/000441 patent/WO1987001373A1/ja not_active Ceased
- 1986-08-28 EP EP86905396A patent/EP0235301B1/en not_active Expired
- 1986-08-28 DE DE8686905396T patent/DE3686150T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1986-08-28 JP JP61-504618A patent/JPH0725788B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-11 US US07/351,317 patent/US4965350A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｖｏｌ．４７（Ｎｏ．１１）Ｐ．２１７４−２１７８，（１９８２） |
| ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｖｏｌ．１３（Ｎｏ．１９）Ｐ．７１１９−７１２８，（１９８５） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3686150T2 (de) | 1993-03-04 |
| EP0235301A1 (en) | 1987-09-09 |
| WO1987001373A1 (fr) | 1987-03-12 |
| DE3686150D1 (de) | 1992-08-27 |
| EP0235301A4 (en) | 1989-10-12 |
| US4965350A (en) | 1990-10-23 |
| JPH0725788B1 (ja) | 1995-03-22 |
| EP0235301B1 (en) | 1992-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0725788B2 (ja) | オリゴまたはポリヌクレオチド | |
| JPWO1987001373A1 (ja) | オリゴまたはポリヌクレオチド | |
| US7060809B2 (en) | LNA compositions and uses thereof | |
| EP0135587B2 (en) | Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis | |
| EP0203959B1 (en) | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection | |
| CN103588839B (zh) | 核苷酸和核苷以及将其用于dna测序的方法 | |
| US5652099A (en) | Probes comprising fluorescent nucleosides and uses thereof | |
| US8895712B2 (en) | Artificial base pair capable of forming specific base pair | |
| JP5231032B2 (ja) | オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションにユニバーサル・ヌクレオシドとして使用されるｎ８−及びｃ８−連結プリン塩基、並びに構造的に関連したヘテロ環 | |
| US6320035B1 (en) | C-nucleoside derivatives and their use in the detection of nucleic acids | |
| KR20200026215A (ko) | 표면-결합 올리고뉴클레오타이드의 화학적 절단 및 탈보호를 위한 조성물 및 방법 | |
| US20100279895A1 (en) | Oligonucleotide analogues | |
| JP2006258818A (ja) | 核酸標識化合物 | |
| CA2215176C (en) | C-nucleoside derivatives and their use in the detection of nucleic acids | |
| JPH06509945A (ja) | 酵素媒介三本鎖形成のための架橋性オリゴヌクレオチド | |
| JP2001501581A (ja) | ヌクレオシド類似体 | |
| JP2835630B2 (ja) | 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成 | |
| JP3119871B2 (ja) | オリゴデオキシリボヌクレオチド類 | |
| JP4211948B2 (ja) | 標的核酸配列の増幅方法 | |
| JPH0371437B2 (ja) | ||
| JPH06135991A (ja) | 螢光性ポリヌクレオチド | |
| JPH0551599B2 (ja) | ||
| JP2005023050A (ja) | 新規核酸誘導体、及びそのフォスフォロアミダイト体、トリリン酸体の製造及び使用 | |
| HK1195076A (en) | Nucleotides and nucleosides and methods for their use in dna sequencing | |
| HK1234412A1 (en) | Modified thymine polynucleotide oligomers and methods |