JP3722842B2 - Ｐｔｈ−アミノ酸の分離方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、水系で固定相表面の親水性／疎水性のバランスを外的信号（例えば、温度）によって変化させてＰＴＨ−アミノ酸（アミノ酸の３−フェニル−２−チオヒダントイン誘導体）をクロマトグラフィーにより分離するＰＴＨ−アミノ酸の新規な分離方法に関する。
背景技術
蛋白質やペプチドなどのアミノ酸配列の決定はＥｄｍａｎ分解法により、アミノ酸末端から逐次アミノ酸残基をアニリノチアゾリノンとして遊離させ、酸性下で、安定なフェニルチオヒダントイン誘導体（ＰＴＨ−アミノ酸）に変換して同定される。同定には逆相カラムを用いた液体クロマトグラフィーが一般的に用いられている。蛋白質を構成する２０種のアミノ酸はこの逆相カラムにより、一回の分析によりすべて分離され、比較的高感度に、１時間以内に分析が可能である。
種々の逆相系のカラムが市販されているが、固定相に多孔性のシリカゲルが用いられており、これにオクタデシルシラン基やフェニル基が化学結合により固定化され、シリカ担体表面が疎水性になっている。この逆相表面での各ＰＴＨ−アミノ酸の疎水性度の違いにより分離される。クロマトグラフィー溶離液には緩衝液と水と自由に混合可能な有機溶媒の混合液が用いられている。
ＰＴＨ−アミノ酸の溶出には移動相中の有機溶媒の濃度を連続的に増加させて溶出する方法と一定濃度で分離する方法がある。いずれにしても、溶出溶媒の疎水性や親水性を変化させて溶出させる。緩衝液としては、酢酸ナトリウム系や酢酸アンモニウム系が主に用いられている。有機溶媒としては、アセトニトリルやメタノールが主に用いられている。様々な分離条件、例えば、溶出液の流速、イオン強度、ｐＨやカラム温度などにより分離能が大きく変化する。市販のカラムの種類により異なるが、一般的に高温での分離によって良好な結果が得られる。分離したＰＴＨ−アミノ酸はＵＶ検出器により、２５４ｎｍや２６８ｎｍなどの波長で検出し、標準のＰＴＨ−アミノ酸の溶出時間と比較し同定される。
しかし、従来の移動相に用いられている有機溶媒や緩衝液は溶出液に夾雑物として含まれ、それらのＵＶ吸収が非常に強くなるために、ベースラインの安定化や感度が著しく低下する欠点があった。また、連続して分析を行う前にカラムを洗浄し、初期の溶出液で平衡化する必要があるため、分析時間が長くなるという欠点もあった。しかも、このような有機溶媒や緩衝液は環境汚染を引き起こす虞れがある。したがって、これらの物質を用いない分離方法の確立が必要となってきている。
かかる問題点を解決するために、水系で生体要素（蛋白質、ＤＮＡ、糖、脂質等）および細胞を固体表面との相互作用を外的信号（例えば、温度）によって制御し、分離あるいは精製することができるクロマトグラフィー用充填剤を使用したクロマトグラフィー方法が提案されている（特開平７−３１８５５１号公報参照）。この方法によれば、移動相に有機溶媒や緩衝液を使用することなく、移動相を水系に固定したままで温度変化による固定相の表面特性の制御によって生体要素や細胞の分離精製が可能となる。このため、単一の水系の移動相によって蛋白質や細胞などの生体要素の機能を維持したままで分離・回収が可能となり夾雑物の混入を防止できる。
しかしながら、特開平７−３１８５５１号公報に記載された方法で分離・精製が可能な溶質は生理活性を有する蛋白質や細胞などで、具体的には牛血清アルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、トランスフェリン、血液凝固因子等が開示されている（例えば、同公報第５頁第７欄第５行〜第１０行）のみであり、その他の物質については全く教示されていない。
発明の開示
本発明者らは、ＰＴＨ−アミノ酸の短時間かつ高感度分析を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、特開平７−３１８５５１号公報に記載された方法では遊離アミノ酸を分析することは不可能であるにも拘わらず、ＰＴＨ−アミノ酸を分析することが可能であるという当業者にとっても予期しえない事実を発見し、この知見に基づいて本発明を完成した。
本発明は、移動相を水系に固定したままで、固定相表面の親水性／疎水性のバランスを外的信号によって変化させることが可能である充填剤を用いてＰＴＨ−アミノ酸のクロマトグラフィーによる分離を行うことを特徴とするＰＴＨ−アミノ酸の分離方法を提供する。
また本発明は、アミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤よりなる固定相にＰＴＨ−アミノ酸を保持させた後、外部温度を段階的に変化させる温度グラディエント法により固定相表面の親水性／疎水性のバランスを変化させ、同一の移動相を通過させることによってＰＴＨ−アミノ酸を分離することを特徴とするＰＴＨ−アミノ酸の分離方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１に記載された分離方法により得られた１７種類のＰＴＨ−アミノ酸の分析結果を示すチャートである。
図２は、実施例３に記載された分離方法により得られた１４種類のＰＴＨ−アミノ酸の分析結果を示すチャートである。
図３は、実施例４において使用した２０種類のＰＴＨ−アミノ酸のうち１０種類のＰＴＨ−アミノ酸の温度と保持時間の関係を示すグラフである。
図４は、図３に記載されていない残りの１０種類のＰＴＨ−アミノ酸の温度と保持時間の関係を示すグラフである。
図５は、実施例５に記載された分離方法により得られた６種類のＰＴＨ−アミノ酸の分析結果を示すチャートである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法によって分離するＰＴＨ−アミノ酸の種類は何ら限定されることなく、ＰＴＨ−アミノ酸であればいかなるＰＴＨ−アミノ酸であってもよい。
本発明の方法において水系とは、水のみ、あるいは無機塩類を含む水溶液であって、有機溶媒を含まないものを意味する。また、この場合、水とは蒸留水もしくは脱イオン水、あるいは両者を表わす。
本発明の方法において用いる外的信号とは、例えば、温度変化である。温度変化によって固定相表面の親水性／疎水性のバランスを変化させることは、例えば、クロマトグラフィー用充填剤の担体表面に温度応答性高分子を導入することによって達成される。このような充填剤として、例えば、担体表面を末端にアミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤を挙げられる。この化学修飾した充填剤の例としては、表面にアミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等の官能基を有するシリカ担体に前記のポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体を化学修飾したものを挙げることができる。アミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等の官能基を有するシリカ担体の具体例としては、アミノプロピルシリカゲル、アミノセファデックス、イオン交換樹脂等がある。
本発明の方法において使用するポリアルキルアクリルアミドとしては、下記の式に示すポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリジエチルアクリルアミドおよびポリアクリロイルピロリジンのいずれか一種、或いはこれらのポリマーの構成単位とアルキルアクリレート若しくはアルキルメタクリレートとの共重合体が好ましい。
ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）は３２℃に下限臨界温度を有するので、該分子で化学修飾した担体はこの臨界温度で親水／疎水に表面物性が変化するため、これをクロマトグラフィーの充填剤の表面にグラフもしくはコーティングして使用した場合、試料に対する保持力が温度によって変化するため溶出液の組成を変化させずに保持挙動を温度によってコントロールすることが可能である。下限臨界温度を３２℃以上にするためには、イソプロピルアクリルアミドよりも親水性のモノマーであるアクリルアミド、メタアクリル酸、アクリル酸、ジメチルアクリルアミド、ビニルピロリドンなどをＮ−イソプロピルアクリルアミドと共重合させることによって調整することが可能である。また、下限臨界温度を３２℃以下にしたいときは、疎水性モノマーであるスチレン、アルキルメタクリレート、アルキルアクリレートなどとの共重合によって調整することができる。
また、ポリジエチルアクリルアミドの下限臨界温度は、約３０℃〜３２℃であり、この温度を境として親水／疎水に表面物性が変化し、前述のポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の場合と同様に、試料に対する保持力を温度によって調整することができる。本発明で利用される新規なクロマトグラフィー用担体は、化学修飾或いは高分子のコーティングによって作製される。化学修飾手段としては表面グラフト法とラジカル重合の２つの方法を用いることができる。またコーティング方法としては、適用温度範囲内で不溶とした後、不溶なものをコーティングする。
上記したように、温度応答性高分子を担体へ導入するための化学修飾法は表面グラフト法とラジカル重合法を用いることができる。表面グラフト法は一定の大きさの温度応答性高分子を始めに合成して、担体に接合する方法であるのに対して、ラジカル重合法では担体表面上でモノマーから重合させ高分子を構築する方法である。表面グラフト法に比較し、担体表面に密に温度応答性高分子を導入することが可能である。担体表面の疎水性度を増大させ、保持時間をコントロールしやすくなる。また、担体表面でのシリカゲルとの相互作用による非特異的吸着を抑えることができる。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
［実施例１］
ポリマーの合成
カルボキシル末端基を持つＩＰＡＡｍコポリマーを分子量４０００を目安として合成した。ここでコポリマーの分子量は、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）の量によって設定することができる。文献値より分子量４０００のコポリマーを合成するには、モル比で、ＭＰＡ／（ＩＰＡＡｍ＋ＲＭＡ）＝０．０２８となるようにＭＰＡの量を調製した。
精製モノマー（ＩＰＡＡｍ：２５．０ｇ）
疎水性モノマー（ＩＰＡＡｍに対しモル比で１％ＢＭＡ；０．３１３ｇ、３％ＢＭＡ；０．９７２ｇ、５％ＢＭＡ；１．６５３ｇ、１％ＨＭＡ；０．３８ｇ）
ラジカル開始剤（ＡＩＢＮ；０．１４５ｇ）
連鎖移動剤（ＭＰＡ，１％ＢＭＡ；０．６６２ｇ、３％ＢＭＡ；０．６７７ｇ、５％ＢＭＡ；０．６９１ｇ、１％ＨＭＡ；０．６６３ｇ）
ＤＭＦ（５０ｍｌ）
（注）用語の説明
ＩＰＡＡｍ：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
ＢＭＡ：ｎ−ブチルメタクリレート
ＡＩＢＮ：２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）
ＨＭＡ：ｎ−ヘキシルメタクリレート
ＭＰＡ：３−メルカプトプロピオン酸
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
上記の各材料を重合管に入れ、三方活栓を取り付け輪ゴムで固定した。そして、コックを閉じた状態で重合管を液体窒素中に入れ完全に凍結させ、次にコックを開いて真空ポンプを用いて脱気した。次に再びコックを閉じてメタノール中に入れ管内のサンプルを完全に溶解させた。この操作を３回繰り返した（凍結融解脱気法）。このように、充分脱気したサンプル（減圧状態になっている重合管）を７０℃の振とう恒温層に入れ、２時間ラジカル重合反応させ片末端にカルボキシル基を持つコポリマーを合成した。反応後、室温になるまで放置し、溶媒（ＤＭＦ）を４０℃で減圧蒸留し濃縮し、残留物を氷冷したジエチルエーテルに滴下しポリマーを得た。得たポリマーを濾取し、常温で一晩減圧乾燥し、その乾燥物をアセトンに溶かし再びジエチルエーテルで精製し、これによって得たポリマーを再び濾取しこれを常温で一晩減圧乾燥した。この後、得たポリマーを５％の溶液になるように溶かした。これを透析膜を用いて３日間透析を行った（こまめに水を取り替えた）。透析後、透析を終えた溶液を適当な容器に移し凍結乾燥器を用いて２日間凍結乾燥を行った。これによって、さらに純度の高いコポリマーを得た。
ＩＰＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒの担体への導入
＜活性エステル（スクシニル）化法＞
上記の合成コポリマー １モル当量
ＤＣＣ ２．５モル当量
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ２．５モル当量
酢酸エチル １００ｍｌ
１．ナス型コルベンに合成コポリマーを入れ、半量の酢酸エチルで溶かした。
２．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を加え、さらにサンプル瓶にＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）を量り取り、残りの酢酸エチルで溶かして加えた。
３．４℃の氷水に浸し２時間スターラーで撹拌し、後に２５℃に設定した恒温槽に入れて一晩撹拌した。
４．溶液を濾過し、副生成物であるジシクロヘキシル尿素を取り除き、減圧下で濃縮した。
５．最後にジエチルエーテルで精製し、生成物を濾取・減圧乾燥して得られたスクシニル化コポリマーを冷凍庫に保存した。
担体（シリカゲル）への結合
スクシニル化したコポリマーを、溶媒に１，４−ジオキサンを用いて、３回に分けてアミノプロピルシリカゲルと反応させた。反応温度は室温（２５℃）で行った。
１．スクシニル化ポリマー（１．５ｇ）を１，４−ジオキサン（５０ｍｌ）に溶かし、振とう恒温槽中でアミノプロピルシリカゲル（３ｇ）と一晩反応させた。
２．反応液を濾取したものと、新たなコポリマー（１．５ｇ）を再び１，４−ジオキサン（５０ｍｌ）に溶かし一晩反応させた。この操作を２回繰り返した。
３．最後に濾取したものを、メタノール（５００ｍｌ）、蒸留水（１ｌ）、超純水（５００ｍｌ）で十分洗浄し、これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。
試料の調製
［試料Ａ］ １７種類のＰＴＨ−アミノ酸を蒸留水に溶解し、次の濃度を有するＰＴＨ−アミノ酸混合液１０ｍｌを調製した。
１．ＰＴＨ−Ｌ−アルギニン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
２．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン ０．４０４ ｍｇ／ｍｌ
３．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン酸 １．０８４ ｍｇ／ｍｌ
４．ＰＴＨ−Ｌ−システイン酸カリウム １．０００ ｍｇ／ｍｌ
５．ＰＴＨ−Ｌ−シトルリン ０．００１ ｍｇ／ｍｌ
６．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン ０．１２４ ｍｇ／ｍｌ
７．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン酸 ０．４７１ ｍｇ／ｍｌ
８．ＰＴＨ−グリシン ０．１０３ ｍｇ／ｍｌ
９．ＰＴＨ−Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
１０．ＰＴＨ−Ｌ−ロイシン ０．０１４ ｍｇ／ｍｌ
１１．ＰＴＨ−Ｌ−リシン ０．００５ ｍｇ／ｍｌ
１２．ＰＴＨ−ＤＬ−メチオニン ０．０６３ ｍｇ／ｍｌ
１３．ＰＴＨ−Ｌ−フェニルアラニン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
１４．ＰＴＨ−Ｌ−プロリン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
１５．ＰＴＨ−Δ−トレオニン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
１６．ＰＴＨ−ＤＬ−トリプトファン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
１７．ＰＴＨ−Ｌ−チロシン ０．０７７ ｍｇ／ｍｌ
［試料Ｂ］ ２０種類のＰＴＨ−アミノ酸を蒸留水に溶解し、次の濃度を有するＰＴＨ−アミノ酸混合液１０ｍｌを調製した。
１．ＰＴＨ−ＤＬ−α−アラニン ０．４２３ ｍｇ／ｍｌ
２．ＰＴＨ−Ｌ−アルギニン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
３．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン ０．４０４ ｍｇ／ｍｌ
４．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン酸 １．０８４ ｍｇ／ｍｌ
５．ＰＴＨ−Ｌ−システイン酸カリウム １．０００ ｍｇ／ｍｌ
６．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン ０．１２４ ｍｇ／ｍｌ
７．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン酸 ０．４７１ ｍｇ／ｍｌ
８．ＰＴＨ−グリシン ０．１０３ ｍｇ／ｍｌ
９．ＰＴＨ−Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
１０．ＰＴＨ−ＤＬ−イソロイシン ０．００６ ｍｇ／ｍｌ
１１．ＰＴＨ−Ｌ−ロイシン ０．０１４ ｍｇ／ｍｌ
１２．ＰＴＨ−Ｌ−リシン ０．００５ ｍｇ／ｍｌ
１３．ＰＴＨ−ＤＬ−メチオニン ０．０６３ ｍｇ／ｍｌ
１４．ＰＴＨ−Ｌ−フェニルアラニン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
１５．ＰＴＨ−Ｌ−プロリン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
１６．ＰＴＨ−ＤＬ−セリン ０．５５３ ｍｇ／ｍｌ
１７．ＰＴＨ−Δ−トレオニン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
１８．ＰＴＨ−ＤＬ−トリプトファン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
１９．ＰＴＨ−Ｌ−チロシン ０．０７７ ｍｇ／ｍｌ
２０．ＰＴＨ−ＤＬ−バリン ０．０２４ ｍｇ／ｍｌ
［試料Ｃ］ １４種類のＰＴＨ−アミノ酸を蒸留水に溶解し、次の濃度を有するＰＴＨ−アミノ酸混合液１０ｍｌを調製した。
１．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン酸 １．０８４ ｍｇ／ｍｌ
２．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン酸 ０．４７１ ｍｇ／ｍｌ
３．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン ０．４０４ ｍｇ／ｍｌ
４．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン ０．１２４ ｍｇ／ｍｌ
５．ＰＴＨ−Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
６．ＰＴＨ−ＤＬ−α−アラニン ０．４２３ ｍｇ／ｍｌ
７．ＰＴＨ−Ｌ−アルギニン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
８．ＰＴＨ−Ｌ−プロリン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
９．ＰＴＨ−ＤＬ−メチオニン ０．０６３ ｍｇ／ｍｌ
１０．ＰＴＨ−Δ−トレオニン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
１１．ＰＴＨ−Ｌ−ロイシン ０．０１４ ｍｇ／ｍｌ
１２．ＰＴＨ−Ｌ−フェニルアラニン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
１３．ＰＴＨ−Ｌ−チロシン ０．０７７ ｍｇ／ｍｌ
１４．ＰＴＨ−ＤＬ−トリプトファン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
試料Ａに含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離
上記充填剤（ＰＩＰＡＡｍ−ＢＭＡ５％で化学修飾したシリカ）を充填したカラムに試料Ａ１００μｌを注入した。カラムは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に接続し、溶出液に蒸留水を用いて、流速１．０ｍｌ／分の速度で分離を行い、紫外可視吸光度検出器により２５４ｎｍの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を変化させて分離能を比較した。ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３２℃で疎水性／親水性の担体表面物性が変化するが、この変化する温度を前記したように下限臨界温度という。この温度以下の５℃では、最も遅い保持時間を示すＰＴＨ−Ｌ−リシン（図１のピーク１１）の保持時間は２２分であったが、３０℃では６１分となった（図１）。このようにカラムの温度を変化させることによって、担体表面の疎水性／親水性を変化させ、各ＰＴＨ−アミノ酸の溶出時間を変化させることが可能であることを確認した。
［実施例２］
試料Ｂに含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離
実施例１における試料Ａに含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離の項に記載された分離条件と同様にして、試料Ｂに含まれる２０種類のＰＴＨ−アミノ酸の分離を行った。
［実施例３］
試料Ｃに含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離
特開平７−３１８５５１号公報の実施例１に記載されている（ａ）〜（ｄ）の方法に従ってポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ゲルでグラフト化したシリカ（ポリ（ＩＰＡＡｍ）ゲルグラフトシリカ）を作製した。これを充填剤として充填したカラムに試料Ｃ５０μｌを注入した。カラムは高速液体クロマトグラフに接続し、溶出液に０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いて、流速１．０ｍｌ／分の速度で分離を行い、紫外線可視吸光度検出器により２５４ｎｍの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を５℃および４０℃に設定して分離能を比較した。結果を図２に示す。
図２から明らかなように、カラム温度が５℃では１４種類のＰＴＨ−アミノ酸の分離が困難であったが、下限臨界温度以上の４０℃では表面は疎水性となり、疎水面での相互作用が強くなり、それぞれの保持時間が遅くなり、分離が可能となっている。この様にカラム温度を制御することで担体表面の物性の制御が可能であり、最適な分離条件の決定が可能となる。また、下限臨界温度はＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーに対するＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドモノマーの量を変化させ、重合させることで、任意の温度で相転移を示す温度応答性ポリマーを合成可能である。
なお、図２に示されているように、４０℃では分析時間が６５分になっているが、温度グラディエントをかけて分離することによって、より短時間に分離を行うことが可能となる。
［実施例４］
ＰＴＨ−アミノ酸の温度と保持時間の関係の検討
実施例１の試料Ａに含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離の項に記載された分離条件と同様にして、試料Ｂに含まれるアミノ酸の分離を行い、各ＰＴＨ−アミノ酸の温度と保持時間の関係を調べた。カラム温度は５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃および５０℃の１０段階に変化させ、各々のカラム温度における各ＰＴＨ−アミノ酸の保持時間を測定した。結果を図３および図４に示す。
図３および図４から、温度変化に伴って、ＰＴＨ−リシンを除いて溶出時間が大きく変化する疎水性アミノ酸と変化が小さい極性アミノ酸に分類することができることが確認された。したがって、カラム温度を適切に設定することにより最適な分離条件の決定が容易になし得る。
［実施例５］
アミノプロピルシリカ表面へのラジカル重合法によるゲル層の形成
１）アミノプロピルシリカへの重合開始剤の導入
充填剤の担体であるアミノプロピルシリカ５ｇにＤＭＦ中で両端にカルボキシル基を有するアゾ系重合開始剤である４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）（４，４’−ａｚｏｂｉｓ（４−ｃｙａｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）：Ｖ−５０１）３．５ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）を、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（Ｎ−Ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−２−ｅｔｈｏｘｙ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ：ＥＥＤＱ）６．１８ｇ（２５．０ｍｍｏｌ）を縮合剤として用い、窒素雰囲気下、室温で６時間反応させた。これによりアミノプロピルシリカに重合開始剤Ｖ−５０１をアミド結合を介して導入固定化した。
２）表面ゲル層の形成
１）で作製したＶ−５０１固定化シリカ４ｇに、ＩＰＡＡｍ（イソプロピルアクリルアミド）１０ｇおよびＮ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）（Ｎ，Ｎ’−Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ））０．２７ｇ共存下でエタノール中にて窒素雰囲気下、７０℃で５時間重合反応を行った。これにより担体表面にゲル層を形成した。得られた担体（ゲル（ＩＰＡＡｍ−２％ＢＩＳ）シリカ）を以下で充填剤として使用した。
試料の調製
次の６種類のＰＴＨ−アミノ酸を含有するＰＴＨ−アミノ酸混合液１０ｍｌを調製した。
１．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン ０．１２４ ｍｇ／ｍｌ
２．ＰＴＨ−Ｌ−グリシン ０．１０３ ｍｇ／ｍｌ
３．ＰＴＨ−ＤＬ−α−アラニン ０．４２３ ｍｇ／ｍｌ
４．ＰＴＨ−ＤＬ−メチオニン ０．０６３ ｍｇ／ｍｌ
５．ＰＴＨ−Ｌ−ロイシン ０．０１４ ｍｇ／ｍｌ
６．ＰＴＨ−Ｌ−チロシン ０．０７７ ｍｇ／ｍｌ
試料に含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離
上記充填剤（ゲル（ＩＰＡＡｍ−２％ＢＩＳ）シリカ）を充填したカラムに上記試料５０μｌを注入した。カラムは高速液体クロマトグラフに接続し、溶出液に蒸留水を用いて、流速１．０ｍｌ／分の速度で分離を行い、紫外可視吸光度検出器により２５４ｎｍの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を５℃および５０℃に設定して分離能を比較した。結果を図５に示す。
図５から明らかなように、ラジカル重合法により化学修飾した担体を充填剤として用いることにより、ＰＴＨ−アミノ酸の分離を簡単に行うことが可能で、温度により、保持時間をコントロールすることができる。表面グラフト法により合成した担体を用いた場合よりも、温度応答性高分子がより多く導入され、保持時間が延びており、溶出が早いアミノ酸の分離性能を向上させることができる。これは、次のような理由によるものと考えられる。
表面グラフト法は一定の大きさの温度応答性高分子を始めに合成して、担体に接合する方法であるのに対して、ラジカル重合法では担体表面上でモノマーから重合させ高分子を構築する方法である。表面グラフト法に比較し、担体表面に密に温度応答性高分子を導入することが可能である。したがって、担体表面の疎水性度を増大させ、保持時間をコントロールしやすくなる。また、担体表面でのシリカゲルとの相互作用による非特異的吸着を抑えることができる。
産業上の利用の可能性
以上詳述したように、本発明のＰＴＨ−アミノ酸の分離方法は、下記の利点を有する。
（１）移動相としてアセトニトリル、メタノール等の有機溶媒を用いる必要がなく、水系のみで分離可能である。
（２）移動相の調製が容易である。
（３）有機溶媒や酢酸緩衝液などを用いないため、不純物の混入が少なく、安定したベースラインの検出が可能であり、高感度検出が可能である。
（４）有機溶媒を用いないために、脱気操作による有機溶媒の混合組成の変化かない。
（５）再現性の高い分離が得られる。
例えば、下記の表に示すような再現性が得られた。
（注）▲１▼ 再現性に関する実験方法について
上記充填剤（ゲル（ＩＰＰＡｍ）シリカ）を充填したカラムを接続した高速液体クロマトグラフにＰＴＨ−メチオニン（５μｌ）、ＰＴＨ−ロイシン（１０μｌ）、ＰＴＨ−トリプトファン（２０μｌ）、ＰＴＨ−リシン（１００μｌ）をそれぞれ５回注入し、カラム温度５０℃の条件下で、それぞれの保持時間を測定し、相対標準偏差（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＶ）を計算し再現性を検討した。クロマトグラフィーの条件として、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶出液を水を用いて、２５４ｎｍの紫外部吸収により各種ＰＴＨ−アミノ酸を検出した。
▲２▼ Ｃ．Ｖ．値の算出法
各サンプルを一定の条件下（温度、注入量）で５回測定し、その値を用いて算術平均値及び標準偏差値を求めそこからＣ．Ｖ．値を算出した。
（６）温度制御することで保持時間を自由にコントロールすることが可能であり、分離精度を制御できる
（７）担体を再生する必要がなく、温度制御により何度でも繰り返し使用可能である。
本発明は、水系で固定相表面の親水性／疎水性のバランスを外的信号（例えば、温度）によって変化させてＰＴＨ−アミノ酸（アミノ酸の３−フェニル−２−チオヒダントイン誘導体）をクロマトグラフィーにより分離するＰＴＨ−アミノ酸の新規な分離方法に関する。
背景技術
蛋白質やペプチドなどのアミノ酸配列の決定はＥｄｍａｎ分解法により、アミノ酸末端から逐次アミノ酸残基をアニリノチアゾリノンとして遊離させ、酸性下で、安定なフェニルチオヒダントイン誘導体（ＰＴＨ−アミノ酸）に変換して同定される。同定には逆相カラムを用いた液体クロマトグラフィーが一般的に用いられている。蛋白質を構成する２０種のアミノ酸はこの逆相カラムにより、一回の分析によりすべて分離され、比較的高感度に、１時間以内に分析が可能である。
種々の逆相系のカラムが市販されているが、固定相に多孔性のシリカゲルが用いられており、これにオクタデシルシラン基やフェニル基が化学結合により固定化され、シリカ担体表面が疎水性になっている。この逆相表面での各ＰＴＨ−アミノ酸の疎水性度の違いにより分離される。クロマトグラフィー溶離液には緩衝液と水と自由に混合可能な有機溶媒の混合液が用いられている。
ＰＴＨ−アミノ酸の溶出には移動相中の有機溶媒の濃度を連続的に増加させて溶出する方法と一定濃度で分離する方法がある。いずれにしても、溶出溶媒の疎水性や親水性を変化させて溶出させる。緩衝液としては、酢酸ナトリウム系や酢酸アンモニウム系が主に用いられている。有機溶媒としては、アセトニトリルやメタノールが主に用いられている。様々な分離条件、例えば、溶出液の流速、イオン強度、ｐＨやカラム温度などにより分離能が大きく変化する。市販のカラムの種類により異なるが、一般的に高温での分離によって良好な結果が得られる。分離したＰＴＨ−アミノ酸はＵＶ検出器により、２５４ｎｍや２６８ｎｍなどの波長で検出し、標準のＰＴＨ−アミノ酸の溶出時間と比較し同定される。
しかし、従来の移動相に用いられている有機溶媒や緩衝液は溶出液に夾雑物として含まれ、それらのＵＶ吸収が非常に強くなるために、ベースラインの安定化や感度が著しく低下する欠点があった。また、連続して分析を行う前にカラムを洗浄し、初期の溶出液で平衡化する必要があるため、分析時間が長くなるという欠点もあった。しかも、このような有機溶媒や緩衝液は環境汚染を引き起こす虞れがある。したがって、これらの物質を用いない分離方法の確立が必要となってきている。
かかる問題点を解決するために、水系で生体要素（蛋白質、ＤＮＡ、糖、脂質等）および細胞を固体表面との相互作用を外的信号（例えば、温度）によって制御し、分離あるいは精製することができるクロマトグラフィー用充填剤を使用したクロマトグラフィー方法が提案されている（特開平７−３１８５５１号公報参照）。この方法によれば、移動相に有機溶媒や緩衝液を使用することなく、移動相を水系に固定したままで温度変化による固定相の表面特性の制御によって生体要素や細胞の分離精製が可能となる。このため、単一の水系の移動相によって蛋白質や細胞などの生体要素の機能を維持したままで分離・回収が可能となり夾雑物の混入を防止できる。
しかしながら、特開平７−３１８５５１号公報に記載された方法で分離・精製が可能な溶質は生理活性を有する蛋白質や細胞などで、具体的には牛血清アルブミン、ＩｇＧ、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、トランスフェリン、血液凝固因子等が開示されている（例えば、同公報第５頁第７欄第５行〜第１０行）のみであり、その他の物質については全く教示されていない。
発明の開示
本発明者らは、ＰＴＨ−アミノ酸の短時間かつ高感度分析を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、特開平７−３１８５５１号公報に記載された方法では遊離アミノ酸を分析することは不可能であるにも拘わらず、ＰＴＨ−アミノ酸を分析することが可能であるという当業者にとっても予期しえない事実を発見し、この知見に基づいて本発明を完成した。
本発明は、移動相を水系に固定したままで、固定相表面の親水性／疎水性のバランスを外的信号によって変化させることが可能である充填剤を用いてＰＴＨ−アミノ酸のクロマトグラフィーによる分離を行うことを特徴とするＰＴＨ−アミノ酸の分離方法を提供する。
また本発明は、アミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤よりなる固定相にＰＴＨ−アミノ酸を保持させた後、外部温度を段階的に変化させる温度グラディエント法により固定相表面の親水性／疎水性のバランスを変化させ、同一の移動相を通過させることによってＰＴＨ−アミノ酸を分離することを特徴とするＰＴＨ−アミノ酸の分離方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１に記載された分離方法により得られた１７種類のＰＴＨ−アミノ酸の分析結果を示すチャートである。
図２は、実施例３に記載された分離方法により得られた１４種類のＰＴＨ−アミノ酸の分析結果を示すチャートである。
図３は、実施例４において使用した２０種類のＰＴＨ−アミノ酸のうち１０種類のＰＴＨ−アミノ酸の温度と保持時間の関係を示すグラフである。
図４は、図３に記載されていない残りの１０種類のＰＴＨ−アミノ酸の温度と保持時間の関係を示すグラフである。
図５は、実施例５に記載された分離方法により得られた６種類のＰＴＨ−アミノ酸の分析結果を示すチャートである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法によって分離するＰＴＨ−アミノ酸の種類は何ら限定されることなく、ＰＴＨ−アミノ酸であればいかなるＰＴＨ−アミノ酸であってもよい。
本発明の方法において水系とは、水のみ、あるいは無機塩類を含む水溶液であって、有機溶媒を含まないものを意味する。また、この場合、水とは蒸留水もしくは脱イオン水、あるいは両者を表わす。
本発明の方法において用いる外的信号とは、例えば、温度変化である。温度変化によって固定相表面の親水性／疎水性のバランスを変化させることは、例えば、クロマトグラフィー用充填剤の担体表面に温度応答性高分子を導入することによって達成される。このような充填剤として、例えば、担体表面を末端にアミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤を挙げられる。この化学修飾した充填剤の例としては、表面にアミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等の官能基を有するシリカ担体に前記のポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体を化学修飾したものを挙げることができる。アミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等の官能基を有するシリカ担体の具体例としては、アミノプロピルシリカゲル、アミノセファデックス、イオン交換樹脂等がある。
本発明の方法において使用するポリアルキルアクリルアミドとしては、下記の式に示すポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリジエチルアクリルアミドおよびポリアクリロイルピロリジンのいずれか一種、或いはこれらのポリマーの構成単位とアルキルアクリレート若しくはアルキルメタクリレートとの共重合体が好ましい。
また、ポリジエチルアクリルアミドの下限臨界温度は、約３０℃〜３２℃であり、この温度を境として親水／疎水に表面物性が変化し、前述のポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の場合と同様に、試料に対する保持力を温度によって調整することができる。本発明で利用される新規なクロマトグラフィー用担体は、化学修飾或いは高分子のコーティングによって作製される。化学修飾手段としては表面グラフト法とラジカル重合の２つの方法を用いることができる。またコーティング方法としては、適用温度範囲内で不溶とした後、不溶なものをコーティングする。
上記したように、温度応答性高分子を担体へ導入するための化学修飾法は表面グラフト法とラジカル重合法を用いることができる。表面グラフト法は一定の大きさの温度応答性高分子を始めに合成して、担体に接合する方法であるのに対して、ラジカル重合法では担体表面上でモノマーから重合させ高分子を構築する方法である。表面グラフト法に比較し、担体表面に密に温度応答性高分子を導入することが可能である。担体表面の疎水性度を増大させ、保持時間をコントロールしやすくなる。また、担体表面でのシリカゲルとの相互作用による非特異的吸着を抑えることができる。
実施例
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。
［実施例１］
ポリマーの合成
カルボキシル末端基を持つＩＰＡＡｍコポリマーを分子量４０００を目安として合成した。ここでコポリマーの分子量は、連鎖移動剤である３−メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）の量によって設定することができる。文献値より分子量４０００のコポリマーを合成するには、モル比で、ＭＰＡ／（ＩＰＡＡｍ＋ＲＭＡ）＝０．０２８となるようにＭＰＡの量を調製した。
精製モノマー（ＩＰＡＡｍ：２５．０ｇ）
疎水性モノマー（ＩＰＡＡｍに対しモル比で１％ＢＭＡ；０．３１３ｇ、３％ＢＭＡ；０．９７２ｇ、５％ＢＭＡ；１．６５３ｇ、１％ＨＭＡ；０．３８ｇ）
ラジカル開始剤（ＡＩＢＮ；０．１４５ｇ）
連鎖移動剤（ＭＰＡ，１％ＢＭＡ；０．６６２ｇ、３％ＢＭＡ；０．６７７ｇ、５％ＢＭＡ；０．６９１ｇ、１％ＨＭＡ；０．６６３ｇ）
ＤＭＦ（５０ｍｌ）
（注）用語の説明
ＩＰＡＡｍ：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
ＢＭＡ：ｎ−ブチルメタクリレート
ＡＩＢＮ：２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）
ＨＭＡ：ｎ−ヘキシルメタクリレート
ＭＰＡ：３−メルカプトプロピオン酸
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
上記の各材料を重合管に入れ、三方活栓を取り付け輪ゴムで固定した。そして、コックを閉じた状態で重合管を液体窒素中に入れ完全に凍結させ、次にコックを開いて真空ポンプを用いて脱気した。次に再びコックを閉じてメタノール中に入れ管内のサンプルを完全に溶解させた。この操作を３回繰り返した（凍結融解脱気法）。このように、充分脱気したサンプル（減圧状態になっている重合管）を７０℃の振とう恒温層に入れ、２時間ラジカル重合反応させ片末端にカルボキシル基を持つコポリマーを合成した。反応後、室温になるまで放置し、溶媒（ＤＭＦ）を４０℃で減圧蒸留し濃縮し、残留物を氷冷したジエチルエーテルに滴下しポリマーを得た。得たポリマーを濾取し、常温で一晩減圧乾燥し、その乾燥物をアセトンに溶かし再びジエチルエーテルで精製し、これによって得たポリマーを再び濾取しこれを常温で一晩減圧乾燥した。この後、得たポリマーを５％の溶液になるように溶かした。これを透析膜を用いて３日間透析を行った（こまめに水を取り替えた）。透析後、透析を終えた溶液を適当な容器に移し凍結乾燥器を用いて２日間凍結乾燥を行った。これによって、さらに純度の高いコポリマーを得た。
ＩＰＡＡｍ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒの担体への導入
＜活性エステル（スクシニル）化法＞
上記の合成コポリマー １モル当量
ＤＣＣ ２．５モル当量
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド ２．５モル当量
酢酸エチル １００ｍｌ
１．ナス型コルベンに合成コポリマーを入れ、半量の酢酸エチルで溶かした。
２．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）を加え、さらにサンプル瓶にＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）を量り取り、残りの酢酸エチルで溶かして加えた。
３．４℃の氷水に浸し２時間スターラーで撹拌し、後に２５℃に設定した恒温槽に入れて一晩撹拌した。
４．溶液を濾過し、副生成物であるジシクロヘキシル尿素を取り除き、減圧下で濃縮した。
５．最後にジエチルエーテルで精製し、生成物を濾取・減圧乾燥して得られたスクシニル化コポリマーを冷凍庫に保存した。
担体（シリカゲル）への結合
スクシニル化したコポリマーを、溶媒に１，４−ジオキサンを用いて、３回に分けてアミノプロピルシリカゲルと反応させた。反応温度は室温（２５℃）で行った。
１．スクシニル化ポリマー（１．５ｇ）を１，４−ジオキサン（５０ｍｌ）に溶かし、振とう恒温槽中でアミノプロピルシリカゲル（３ｇ）と一晩反応させた。
２．反応液を濾取したものと、新たなコポリマー（１．５ｇ）を再び１，４−ジオキサン（５０ｍｌ）に溶かし一晩反応させた。この操作を２回繰り返した。
３．最後に濾取したものを、メタノール（５００ｍｌ）、蒸留水（１ｌ）、超純水（５００ｍｌ）で十分洗浄し、これを充填剤として減圧乾燥してデシケーターに保存した。
試料の調製
［試料Ａ］ １７種類のＰＴＨ−アミノ酸を蒸留水に溶解し、次の濃度を有するＰＴＨ−アミノ酸混合液１０ｍｌを調製した。
１．ＰＴＨ−Ｌ−アルギニン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
２．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン ０．４０４ ｍｇ／ｍｌ
３．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン酸 １．０８４ ｍｇ／ｍｌ
４．ＰＴＨ−Ｌ−システイン酸カリウム １．０００ ｍｇ／ｍｌ
５．ＰＴＨ−Ｌ−シトルリン ０．００１ ｍｇ／ｍｌ
６．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン ０．１２４ ｍｇ／ｍｌ
７．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン酸 ０．４７１ ｍｇ／ｍｌ
８．ＰＴＨ−グリシン ０．１０３ ｍｇ／ｍｌ
９．ＰＴＨ−Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
１０．ＰＴＨ−Ｌ−ロイシン ０．０１４ ｍｇ／ｍｌ
１１．ＰＴＨ−Ｌ−リシン ０．００５ ｍｇ／ｍｌ
１２．ＰＴＨ−ＤＬ−メチオニン ０．０６３ ｍｇ／ｍｌ
１３．ＰＴＨ−Ｌ−フェニルアラニン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
１４．ＰＴＨ−Ｌ−プロリン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
１５．ＰＴＨ−Δ−トレオニン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
１６．ＰＴＨ−ＤＬ−トリプトファン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
１７．ＰＴＨ−Ｌ−チロシン ０．０７７ ｍｇ／ｍｌ
［試料Ｂ］ ２０種類のＰＴＨ−アミノ酸を蒸留水に溶解し、次の濃度を有するＰＴＨ−アミノ酸混合液１０ｍｌを調製した。
１．ＰＴＨ−ＤＬ−α−アラニン ０．４２３ ｍｇ／ｍｌ
２．ＰＴＨ−Ｌ−アルギニン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
３．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン ０．４０４ ｍｇ／ｍｌ
４．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン酸 １．０８４ ｍｇ／ｍｌ
５．ＰＴＨ−Ｌ−システイン酸カリウム １．０００ ｍｇ／ｍｌ
６．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン ０．１２４ ｍｇ／ｍｌ
７．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン酸 ０．４７１ ｍｇ／ｍｌ
８．ＰＴＨ−グリシン ０．１０３ ｍｇ／ｍｌ
９．ＰＴＨ−Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
１０．ＰＴＨ−ＤＬ−イソロイシン ０．００６ ｍｇ／ｍｌ
１１．ＰＴＨ−Ｌ−ロイシン ０．０１４ ｍｇ／ｍｌ
１２．ＰＴＨ−Ｌ−リシン ０．００５ ｍｇ／ｍｌ
１３．ＰＴＨ−ＤＬ−メチオニン ０．０６３ ｍｇ／ｍｌ
１４．ＰＴＨ−Ｌ−フェニルアラニン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
１５．ＰＴＨ−Ｌ−プロリン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
１６．ＰＴＨ−ＤＬ−セリン ０．５５３ ｍｇ／ｍｌ
１７．ＰＴＨ−Δ−トレオニン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
１８．ＰＴＨ−ＤＬ−トリプトファン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
１９．ＰＴＨ−Ｌ−チロシン ０．０７７ ｍｇ／ｍｌ
２０．ＰＴＨ−ＤＬ−バリン ０．０２４ ｍｇ／ｍｌ
［試料Ｃ］ １４種類のＰＴＨ−アミノ酸を蒸留水に溶解し、次の濃度を有するＰＴＨ−アミノ酸混合液１０ｍｌを調製した。
１．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン酸 １．０８４ ｍｇ／ｍｌ
２．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン酸 ０．４７１ ｍｇ／ｍｌ
３．ＰＴＨ−Ｌ−アスパラギン ０．４０４ ｍｇ／ｍｌ
４．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン ０．１２４ ｍｇ／ｍｌ
５．ＰＴＨ−Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
６．ＰＴＨ−ＤＬ−α−アラニン ０．４２３ ｍｇ／ｍｌ
７．ＰＴＨ−Ｌ−アルギニン塩酸塩 １．０００ ｍｇ／ｍｌ
８．ＰＴＨ−Ｌ−プロリン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
９．ＰＴＨ−ＤＬ−メチオニン ０．０６３ ｍｇ／ｍｌ
１０．ＰＴＨ−Δ−トレオニン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
１１．ＰＴＨ−Ｌ−ロイシン ０．０１４ ｍｇ／ｍｌ
１２．ＰＴＨ−Ｌ−フェニルアラニン ０．０３８ ｍｇ／ｍｌ
１３．ＰＴＨ−Ｌ−チロシン ０．０７７ ｍｇ／ｍｌ
１４．ＰＴＨ−ＤＬ−トリプトファン ０．０１９ ｍｇ／ｍｌ
試料Ａに含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離
上記充填剤（ＰＩＰＡＡｍ−ＢＭＡ５％で化学修飾したシリカ）を充填したカラムに試料Ａ１００μｌを注入した。カラムは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に接続し、溶出液に蒸留水を用いて、流速１．０ｍｌ／分の速度で分離を行い、紫外可視吸光度検出器により２５４ｎｍの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を変化させて分離能を比較した。ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３２℃で疎水性／親水性の担体表面物性が変化するが、この変化する温度を前記したように下限臨界温度という。この温度以下の５℃では、最も遅い保持時間を示すＰＴＨ−Ｌ−リシン（図１のピーク１１）の保持時間は２２分であったが、３０℃では６１分となった（図１）。このようにカラムの温度を変化させることによって、担体表面の疎水性／親水性を変化させ、各ＰＴＨ−アミノ酸の溶出時間を変化させることが可能であることを確認した。
［実施例２］
試料Ｂに含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離
実施例１における試料Ａに含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離の項に記載された分離条件と同様にして、試料Ｂに含まれる２０種類のＰＴＨ−アミノ酸の分離を行った。
［実施例３］
試料Ｃに含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離
特開平７−３１８５５１号公報の実施例１に記載されている（ａ）〜（ｄ）の方法に従ってポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ゲルでグラフト化したシリカ（ポリ（ＩＰＡＡｍ）ゲルグラフトシリカ）を作製した。これを充填剤として充填したカラムに試料Ｃ５０μｌを注入した。カラムは高速液体クロマトグラフに接続し、溶出液に０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いて、流速１．０ｍｌ／分の速度で分離を行い、紫外線可視吸光度検出器により２５４ｎｍの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を５℃および４０℃に設定して分離能を比較した。結果を図２に示す。
図２から明らかなように、カラム温度が５℃では１４種類のＰＴＨ−アミノ酸の分離が困難であったが、下限臨界温度以上の４０℃では表面は疎水性となり、疎水面での相互作用が強くなり、それぞれの保持時間が遅くなり、分離が可能となっている。この様にカラム温度を制御することで担体表面の物性の制御が可能であり、最適な分離条件の決定が可能となる。また、下限臨界温度はＮ−イソプロピルアクリルアミドモノマーに対するＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドモノマーの量を変化させ、重合させることで、任意の温度で相転移を示す温度応答性ポリマーを合成可能である。
なお、図２に示されているように、４０℃では分析時間が６５分になっているが、温度グラディエントをかけて分離することによって、より短時間に分離を行うことが可能となる。
［実施例４］
ＰＴＨ−アミノ酸の温度と保持時間の関係の検討
実施例１の試料Ａに含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離の項に記載された分離条件と同様にして、試料Ｂに含まれるアミノ酸の分離を行い、各ＰＴＨ−アミノ酸の温度と保持時間の関係を調べた。カラム温度は５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃および５０℃の１０段階に変化させ、各々のカラム温度における各ＰＴＨ−アミノ酸の保持時間を測定した。結果を図３および図４に示す。
図３および図４から、温度変化に伴って、ＰＴＨ−リシンを除いて溶出時間が大きく変化する疎水性アミノ酸と変化が小さい極性アミノ酸に分類することができることが確認された。したがって、カラム温度を適切に設定することにより最適な分離条件の決定が容易になし得る。
［実施例５］
アミノプロピルシリカ表面へのラジカル重合法によるゲル層の形成
１）アミノプロピルシリカへの重合開始剤の導入
充填剤の担体であるアミノプロピルシリカ５ｇにＤＭＦ中で両端にカルボキシル基を有するアゾ系重合開始剤である４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）（４，４’−ａｚｏｂｉｓ（４−ｃｙａｎｏｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）：Ｖ−５０１）３．５ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）を、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（Ｎ−Ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−２−ｅｔｈｏｘｙ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ：ＥＥＤＱ）６．１８ｇ（２５．０ｍｍｏｌ）を縮合剤として用い、窒素雰囲気下、室温で６時間反応させた。これによりアミノプロピルシリカに重合開始剤Ｖ−５０１をアミド結合を介して導入固定化した。
２）表面ゲル層の形成
１）で作製したＶ−５０１固定化シリカ４ｇに、ＩＰＡＡｍ（イソプロピルアクリルアミド）１０ｇおよびＮ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）（Ｎ，Ｎ’−Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ（ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ））０．２７ｇ共存下でエタノール中にて窒素雰囲気下、７０℃で５時間重合反応を行った。これにより担体表面にゲル層を形成した。得られた担体（ゲル（ＩＰＡＡｍ−２％ＢＩＳ）シリカ）を以下で充填剤として使用した。
試料の調製
次の６種類のＰＴＨ−アミノ酸を含有するＰＴＨ−アミノ酸混合液１０ｍｌを調製した。
１．ＰＴＨ−Ｌ−グルタミン ０．１２４ ｍｇ／ｍｌ
２．ＰＴＨ−Ｌ−グリシン ０．１０３ ｍｇ／ｍｌ
３．ＰＴＨ−ＤＬ−α−アラニン ０．４２３ ｍｇ／ｍｌ
４．ＰＴＨ−ＤＬ−メチオニン ０．０６３ ｍｇ／ｍｌ
５．ＰＴＨ−Ｌ−ロイシン ０．０１４ ｍｇ／ｍｌ
６．ＰＴＨ−Ｌ−チロシン ０．０７７ ｍｇ／ｍｌ
試料に含まれるＰＴＨ−アミノ酸の分離
上記充填剤（ゲル（ＩＰＡＡｍ−２％ＢＩＳ）シリカ）を充填したカラムに上記試料５０μｌを注入した。カラムは高速液体クロマトグラフに接続し、溶出液に蒸留水を用いて、流速１．０ｍｌ／分の速度で分離を行い、紫外可視吸光度検出器により２５４ｎｍの波長で検出を行った。カラムを恒温槽に設置し、カラム温度を５℃および５０℃に設定して分離能を比較した。結果を図５に示す。
図５から明らかなように、ラジカル重合法により化学修飾した担体を充填剤として用いることにより、ＰＴＨ−アミノ酸の分離を簡単に行うことが可能で、温度により、保持時間をコントロールすることができる。表面グラフト法により合成した担体を用いた場合よりも、温度応答性高分子がより多く導入され、保持時間が延びており、溶出が早いアミノ酸の分離性能を向上させることができる。これは、次のような理由によるものと考えられる。
表面グラフト法は一定の大きさの温度応答性高分子を始めに合成して、担体に接合する方法であるのに対して、ラジカル重合法では担体表面上でモノマーから重合させ高分子を構築する方法である。表面グラフト法に比較し、担体表面に密に温度応答性高分子を導入することが可能である。したがって、担体表面の疎水性度を増大させ、保持時間をコントロールしやすくなる。また、担体表面でのシリカゲルとの相互作用による非特異的吸着を抑えることができる。
産業上の利用の可能性
以上詳述したように、本発明のＰＴＨ−アミノ酸の分離方法は、下記の利点を有する。
（１）移動相としてアセトニトリル、メタノール等の有機溶媒を用いる必要がなく、水系のみで分離可能である。
（２）移動相の調製が容易である。
（３）有機溶媒や酢酸緩衝液などを用いないため、不純物の混入が少なく、安定したベースラインの検出が可能であり、高感度検出が可能である。
（４）有機溶媒を用いないために、脱気操作による有機溶媒の混合組成の変化かない。
（５）再現性の高い分離が得られる。
例えば、下記の表に示すような再現性が得られた。
上記充填剤（ゲル（ＩＰＰＡｍ）シリカ）を充填したカラムを接続した高速液体クロマトグラフにＰＴＨ−メチオニン（５μｌ）、ＰＴＨ−ロイシン（１０μｌ）、ＰＴＨ−トリプトファン（２０μｌ）、ＰＴＨ−リシン（１００μｌ）をそれぞれ５回注入し、カラム温度５０℃の条件下で、それぞれの保持時間を測定し、相対標準偏差（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＶ）を計算し再現性を検討した。クロマトグラフィーの条件として、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶出液を水を用いて、２５４ｎｍの紫外部吸収により各種ＰＴＨ−アミノ酸を検出した。
▲２▼ Ｃ．Ｖ．値の算出法
各サンプルを一定の条件下（温度、注入量）で５回測定し、その値を用いて算術平均値及び標準偏差値を求めそこからＣ．Ｖ．値を算出した。
（７）担体を再生する必要がなく、温度制御により何度でも繰り返し使用可能である。
Claims (8)
- 移動相を水系に固体したままで、固定相表面の親水性／疎水性のバランスを外的信号によって変化させることが可能である充填剤を用いてＰＴＨ−アミノ酸のクロマトグラフィーによる分離を行うことを特徴とするＰＴＨ−アミノ酸の分離方法。
- 外的信号が温度変化である請求項１記載のＰＴＨ−アミノ酸の分離方法。
- 充填剤が、担体表面に温度応答性高分子で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤である請求項１記載のＰＴＨ−アミノ酸の分離方法。
- 充填剤が、ラジカル重合法を用いて温度応答性高分子を担体表面に化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤である請求項３記載のＰＴＨ−アミノ酸の分離方法。
- 温度応答性高分子が、末端にアミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体である請求項３または４記載のＰＴＨ−アミノ酸の分離方法。
- ポリアルキルアクリルアミドが、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリジエチルアクリルアミドまたはポリアクリロイルピロリジンのいずれか一種である請求項５記載のＰＴＨ−アミノ酸の分離方法。
- アミノ基、カルボキシル基、或いは水酸基等を有するポリアルキルアクリルアミド或いはその共重合体で化学修飾したクロマトグラフィー用充填剤よりなる固定相にＰＴＨ−アミノ酸を保持させた後、外部温度を段階的に変化させる温度グラディエント法により固定相表面の親水性／疎水性のバランスを変化させ、同一の移動相を通過させることによってＰＴＨ−アミノ酸を分離することを特徴とするＰＴＨ−アミノ酸の分離方法。
- 移動相が水系溶媒である請求項７記載のＰＴＨ−アミノ酸の分離方法。
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