JP3733110B2 - 相同組換えによる脊椎動物細胞等のトランスフェクション - Google Patents

相同組換えによる脊椎動物細胞等のトランスフェクション Download PDF

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、直鎖状ＤＮＡ構築物、該構築物を使用する、タンパク質を生産する方法、一次又は二次細胞に存在する遺伝子の発現を変える方法、トランスフェクトされた一次又は二次細胞、トランスフェクト二次細胞のクローン細胞株を生産する方法、並びにトランスフェクト二次細胞のクローン細胞株に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの遺伝子療法を開発する試みは、腎臓移植の初期の成功で健常者の細胞を遺伝疾患患者に移植することができるかもしれないと考えられるようになった１９５０年代にさかのぼる。ゴーシェ病およびニーマン−ピック病における酵素欠損の発見からまもなく、学者らは、まれな遺伝疾患を治療するために臓器移植、骨髄移植、および酵素投与を検討しはじめた（例えば、非特許文献１参照）。１９６０年代後期から１９７０年代初期までに、数名の研究者らは、患者自身の細胞に遺伝子を導入することもできるのではないかと考え、わずか数年後には最初のヒト遺伝子のクローニングが行なわれ当該分野の研究が強化された。
【０００３】
最近まで、ヒトの遺伝子療法に関する理論的および実験的研究はほとんどいずれもごくまれな遺伝疾患に注目していて、当該分野の多くの者にとって遺伝子療法とは遺伝疾患を治療するために患者の遺伝子を変更することを意味するようになっていた。ところが、遺伝子療法は単なる遺伝疾患治療よりはるかに応用範囲が広いのである。遺伝子療法は、治療目的のタンパク質の長期投与によって改善されるであろう病因を問わないあらゆる状態を治療または治癒させるために、由来元が治療対象者であるか別の適当なソースである細胞を遺伝的に変更する医学的介入であると表現するのがより適切であろう。したがって、遺伝子療法はインビボのタンパク質産生・送達システムと考えることができ、現在はタンパク質の投与によって治療されている疾患はほとんどすべてが遺伝子療法を用いる治療の対象候補となる。
【０００４】
遺伝子療法は、生殖細胞遺伝子療法と体細胞遺伝子療法という２つの分野に分けることができる。生殖細胞遺伝子療法とは、精細胞、卵細胞、接合子、または早期段階の胚に改変を加えることをいう。倫理基準と実用基準のいずれから見ても、生殖細胞遺伝子療法はヒトに使用するには不適当である。生殖細胞遺伝子療法とは対照的に、体細胞遺伝子療法は治療を受けている者だけにしか影響を及ぼさない（体細胞とは完全個体に発育することができない細胞であり、生殖細胞以外の身体細胞すべてを含む）。したがって、体細胞遺伝子療法はヒトにおけるある種の障害の治療と治癒への合理的なアプローチである。
【０００５】
体細胞遺伝子療法方式においては、体細胞（たとえば線維芽細胞、肝細胞、または内皮細胞）を患者から採取し、インビトロで培養し、治療上の興味がもたれる単数または複数の遺伝子をトランスフェクトし、キャラクタライゼーションを行ない、患者に戻す。これら５段階を実施する手段は、既知の遺伝子療法方式の顕著な特徴である。
【０００６】
現在利用可能な遺伝子療法へのアプローチは、発現させようとする遺伝物質を含むレトロウイルスベクターなどの感染性ベクターを利用する。この様なアプローチは、ベクター製造時に複製応答性ウイルスができてしまう可能性があること、治療用ウイルスと内因性(endogenous)レトロウイルスゲノムの間に組換えが起きて、新たな細胞特異性や宿主範囲をもったり病原性や細胞毒性が増大した感染性物質を生じる可能性があること、多数の細胞に独立的に組み込まれることで腫瘍原性挿入事象の危険が増大すること、レトロウイルス中のクローニング能力が制限され（治療応用性を制限する）対象産物のインビボ発現が短命であることなどの限界がある。遺伝子産物、とくに現在利用可能な方法に伴う危険を回避し長期的製造を可能にする遺伝子産物を提供する、より良いアプローチがあれば有用であろう。治療上の興味がもたれるタンパク質は、該治療作用タンパク質をコードする外因性(exogenous) ＤＮＡを適当な細胞に導入することによって製造されるのが普通である。
【０００７】
【非特許文献１】
ブラディー（Brady, R. ）, NEJM 275:312 (1966)
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、特にヒトの遺伝子療法に有益な、直鎖状ＤＮＡ構築物、該構築物を使用する、タンパク質を生産する方法、一次又は二次細胞に存在する遺伝子の発現を変える方法、トランスフェクトされた一次又は二次細胞、トランスフェクト二次細胞のクローン細胞株を生産する方法、並びにトランスフェクト二次細胞のクローン細胞株を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、治療目的の産物(therapeutic product) をコードする外因性ＤＮＡ、それ自体が治療目的の産物である外因性ＤＮＡおよび／またはトランスフェクト(transfected) 細胞に対してそれに対応する非トランスフェクト細胞中で生ずるより高いレベルで遺伝子を発現させる外因性ＤＮＡをトランスフェクトされた脊椎動物由来、とりわけ哺乳類由来のトランスフェクト(transfected) 一次および二次体細胞に関する。本発明はさらに、目的の（たとえば治療目的の）産物をコードするかそれ自体が目的の（たとえば治療目的の）産物である外因性遺伝物質（ＤＮＡ）をトランスフェクトされた脊椎動物由来、とりわけ哺乳類由来のトランスフェクトされた一次および二次体細胞、一次および二次細胞にトランスフェクトを受けさせて外因性遺伝物質を取り込ませる方法、クローン細胞株（clonal cell strains)または不均一細胞株(hetero-genous cell strains)を製造する方法、上記トランスフェクト一次または二次細胞を用いる遺伝子療法の方法、本発明の方法によって作成されたトランスフェクト一次または二次細胞を使用することによって治療目的タンパク質を製造する方法、および該トランスフェクト一次または二次細胞を用いて抗体を製造する方法に関する。
【００１０】
一つの態様においては、本発明は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはインスリノトロピンなど臨床的に有用な産物をコードする外因性遺伝物質（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をトランスフェクトされた脊椎動物由来、とりわけ哺乳類由来のトランスフェクト一次および二次体細胞、一次および二次細胞にトランスフェクトを受けさせてｈＧＨ、ＥＰＯまたはインスリノトロピンをコードする外因性遺伝物質を組み込ませる方法、ｈＧＨ、ＥＰＯまたはインスリノトロピンをコードする外因性遺伝物質を発現するクローン細胞株または不均一細胞株を製造する方法、本発明のトランスフェクト細胞を使用することによるかｈＧＨ、ＥＰＯまたはインスリノトロピンをコードするＤＮＡを個体に直接注射することによって、そのものを必要としている個体に対して生理的に有用な量のｈＧＨ、ＥＰＯまたはインスリノトロピンを提供する方法、および該トランスフェクト一次または二次細胞を用いて該コード化物に対する抗体を製造する方法に関する。
【００１１】
別の態様においては、本発明は、脊椎動物、とりわけ哺乳類由来の細胞中でのジーンターゲティング(gene targeting)またはＤＮＡターゲティング(targeting) の方法に関する。すなわち、本発明は、ＤＮＡの相同組換えまたはターゲティング(targeting) によって脊椎動物由来の一次または二次細胞にＤＮＡを導入する方法であって、あらかじめ選択された部位で該一次または二次細胞のゲノムＤＮＡに導入されることに関する。あらかじめ選択された部位は、使用するターゲティング配列を決定する。本発明はさらに、本発明の方法によって製造された相同的に組換えられた一次または二次細胞、相同的に組換えられた（ＨＲ）一次または二次細胞という、および該ＨＲ一次または二次細胞の用途に関する。
【００１２】
本発明はまた、脊椎動物由来の一次細胞、二次細胞または不死化(immortalized)細胞中に存在する通常は該細胞中では全く発現されないか細胞中で有意量では発現されない遺伝子を働かせる、すなわち活性化させる方法に関する。相同組換えまたはターゲティングを用いて、対応する非トランスフェクト(nontransfected)細胞中で見られるレベルより高いレベルで遺伝子を発現させる調節配列を有する遺伝子と関係するのが正常である調節領域を置換または不活性化する。したがって、本発明は、トランスフェクト一次、二次または不死化細胞中で目的の産物をコードする内因性遺伝子を働かせる、すなわち活性化させることによってタンパク質を製造する方法に関する。
【００１３】
本明細書で使用する場合、一次細胞という用語は、脊椎動物組織ソースから単離した（平板培養する前、すなわち皿やフラスコなどの組織培養容器に付着させる前に）細胞の懸濁液中に存在する細胞、組織から得た外植片中に存在する細胞両者とも一次平板培養された前タイプの細胞、およびこれら平板培養された細胞から得た細胞懸濁液を包含する。二次細胞または二次細胞株という用語は、培養中のその後のすべての段階の細胞をいう。すなわち、一次平板細胞を培養容器から取り出し、再び平板培養（継代）したとき、本明細書中ではこれをその後の継代におけるすべての細胞とともに二次細胞と呼ぶ。二次細胞は、１回以上継代された二次細胞より成る細胞株である。細胞株は、１）１回以上継代され、２）培養中に有限回数の平均集団倍化を示し、３）接触によって阻害される足場依存性増殖の性質を示し（足場依存性は懸濁培養で増殖される細胞には適用されない）、しかも４）不死化されないことを特徴とする二次細胞から成る。「クローン細胞株」とは、単一の創始細胞に由来する細胞株であると定義する。「不均一細胞株」とは、２個以上の創始細胞に由来する細胞株であると定義する。
【００１４】
本発明は、ゲノムに安定的に組み込まれているか細胞中でエピソーム的に発現されている外因性ＤＮＡでトランスフェクトされた線維芽細胞、ケラチン細胞、上皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液細胞成分(formed elements) 、筋肉細胞、その他の培養可能体細胞、及び体細胞前駆体等の一次および二次体細胞を包含する。生じた細胞は、それぞれトランスフェクト一次細胞(transfected primary cells) およびトランスフェクト二次細胞と呼ぶ。該外因性ＤＮＡは、１）治療目的の産物である翻訳産物（例えばタンパク質）や転写産物（例えばリボザイムやアンチセンス核酸配列）などの産物をコードし、２）それ自体が治療目的の産物（例えば細胞調節タンパク質に結合するか遺伝子発現を変化させるＤＮＡ）であるか、３）レシピエント細胞(recipient cells) のゲノムＤＮＡとの相同組換えを受けて内因性遺伝子の発現の変化（増大または低下）をもたらすＤＮＡである。
【００１５】
外因性ＤＮＡがレシピエント細胞によって発現される翻訳または転写産物をコードする態様においては、生じる産物は細胞内に保持され、細胞膜に取り込まれるか細胞から分泌される。本態様においては、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡは、トランスフェクト細胞中の外因性ＤＮＡの発現に充分な付加的(additional)ＤＮＡ配列とともに細胞に導入され、それらの配列に効果的(operatively) に結合される。
【００１６】
外因性ＤＮＡが発現されない態様においては、遺伝子産物は存在せず、ＤＮＡ自体が治療目的の産物となる。本態様においては、外因性ＤＮＡは、たとえば細胞調節タンパク質に結合するＤＮＡ配列、トランスフェクト一次または二次細胞中に存在するタンパク質、または核酸のキレート形成 (sequestration)に充分なＤＮＡ配列、染色体の二次または三次構造を変化させるＤＮＡ配列、または転写調節要素であるＤＮＡ配列である。外因性ＤＮＡを発現させるか利用可能ならしめるために改変された上記一次細胞は、本明細書ではトランスフェクト一次細胞と呼び、組織から取り出し、初めて培地上に置かれた細胞を含む。外因性ＤＮＡを発現させるか利用可能ならしめるために改変された二次細胞は、本明細書ではトランスフェクト二次細胞と呼ぶ。
【００１７】
外因性ＤＮＡがトランスフェクト（レシピエント）細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えを受ける態様においては、該外因性ＤＮＡを導入すると、内因性（ゲノム性）配列の全体または一部を置換するか内因性配列を破壊することによって、該内因性遺伝子の発現を支配する内因性配列が無力化される。
【００１８】
本発明の方法によってトランスフェクトを受けた一次および二次細胞は３つのタイプまたは範疇に分れる。すなわち、１）治療目的の産物を産生したり含有したりしない採取したままの(as obtained) 細胞、２）治療目的の産物を産生するか含有するが、正常より少ない量（生理的に正常な下限より少ない量）または不完全である細胞、および３）生理的に正常なレベルで治療目的の産物を産生するがその含有量または産生量を増大または強化すべき細胞である。
【００１９】
外因性ＤＮＡは様々な手法によって一次または二次細胞に導入される。たとえば、治療目的のタンパク質をコードする外因性ＤＮＡおよびレシピエント細胞中での発現に必要な付加的ＤＮＡ配列を含む構築物をエレクトロポレーション、顕微注入、またはその他の手段（たとえばリン酸カルシウム沈殿法、リン酸カルシウム沈殿法変法、ポリブレン沈殿法、リポソーム融合法、受容体介在ＤＮＡ送達法）によって一次または二次細胞に導入する。あるいは、外因性ＤＮＡを含むレトロウイルスベクターなどのベクターを用いることができ、該ベクターに感染させることで細胞を遺伝的に改変させることができる。
【００２０】
トランスフェクト一次および二次細胞は、外因性ＤＮＡ以外にも、発現されると抗生物質抵抗性、細胞毒性物質抵抗性、原栄養性、または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型をレシピエントに付与する選択(selectable)マーカーをコードするＤＮＡを任意に含有していてもよい。それが存在することで、外因性ＤＮＡを含有する細胞を同定し選択することが可能になる。ｎｅｏ、ｇｐｔ、ｄｈｆｒ、ａｄａ、ｐａｃ、ｈｙｇ、ｍｄｒ、およびｈｉｓＤなど様々な選択マーカー遺伝子を用いることができる。
【００２１】
本発明のトランスフェクト細胞は、トランスフェクト一次細胞の集団、トランスフェクトクローン細胞株、トランスフェクト不均一細胞株、および前記３つのトランスフェクト細胞範疇の一つに属する少なくとも１個の代表的細胞が存在する細胞混合物として、また、１）治療目的のタンパク質（たとえば個体中に存在しないか、個体の生理的要求より産生量が少ないか、欠損しているか、非効率的または不適当に利用されているタンパク質、酵素機能や輸送機能などの新規機能を有するタンパク質）、または２）治療目的の核酸（たとえば調節タンパク質と結合、すなわちキレート形成するＤＮＡ、遺伝子発現を阻害するか本質的酵素活性を有するＲＮＡ）のいずれかである治療目的の産物の送達に反応する異常または好ましくない状態を有する個体の治療のための送達システムとして有用である。治療目的のタンパク質または核酸を提供する本発明の方法においては、トランスフェクト一次細胞、クローン細胞株または不均一細胞株を、異常または好ましくない状態を治療または予防しようとする個体に対し、生理的に意義のあるレベルで外因性ＤＮＡを発現または利用可能にするのに充分な量と適当な経路で投与する。生理的に意義のあるレベルとは、その産物の体内産生レベルに近いか、異常または好ましくない状態の改善をもたらすレベルである。本方法において投与される細胞は、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、それ自体が治療目的の産物である外因性ＤＮＡ、または相同組換えによってゲノムＤＮＡ中のあらかじめ選ばれた部位に導入され、レシピエント細胞に正常状態ではその細胞中に発現されない産物を産生させるか、対応する非トランスフェクト細胞中で生じるよりも高いレベルで該産物を産生させるよう機能する、調節配列などの外因性ＤＮＡのトランスフェクトを受けた細胞である。調節配列（たとえばプロモーター）が導入される態様においては、該調節配列は、正常では遺伝子と関連している調節配列を置換または無力化させ、対応する非トランスフェクト細胞中で生じるレベルより高いレベルでの該遺伝子の発現をもたらす。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明は、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、それ自体が治療目的の産物である外因性ＤＮＡ、および／またはトランスフェクト細胞に対してそれに対応する非トランスフェクト細胞中に存在するレベルより高いレベルで遺伝子を発現させる外因性ＤＮＡをトランスフェクトされた脊椎動物由来、とりわけ哺乳類由来の一次および二次体細胞に関する。
【００２３】
本明細書で説明するように、脊椎動物、とりわけ哺乳類由来の一次または二次細胞に治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡをトランスフェクトすると、長期間にわたりインビトロとインビボのいずれにおいてもコードされた治療目的の産物を安定的かつ再現的に産生することが示されている。また、該トランスフェクト一次および二次細胞は、生理的に意義のあるレベルでインビボで該コード化産物を発現し、移植後の回収が可能で、再培養すると増殖し移植前の性質を示すことが示されている。この事実は、当該分野に習熟せる者が予想することと全く対照的である。なぜなら、たとえば、当該分野の専門家でさえも、正常な体細胞の寿命は有限であること、およびレトロウイルスを用いて細胞を遺伝的に改変させないかぎり、遺伝子療法への使用を妨げる適切な移植可能細胞を単離または培養することができないとみているからである。ミラー（Miller, A.D.), Blood, 76:271-278(1990)。ところが、レトロウイルスで処理した線維芽細胞を移植しても、せいぜい一時的に代謝が向上するだけであることが示されており、治療方式としては大きな限界があるとみられている。正常（不死化されていない）線維芽細胞は、「リン酸カルシウム沈殿法を用いてトランスフェクトするのが連続細胞株よりはるかに困難である」という特徴がある。ミラー（Miller, A.D.), Blood, 76:271-278(1990)。さらに、遺伝子療法のためにレトロウイルスを使わない方法を検討するにあたり、当該分野の専門家らは次のように考えるのが普通である。すなわち、「・・・遺伝子送達の効率は低く、・・・療法に必要な数百万の適切な変化を保証するためには、医師は不可能な数の細胞を患者から入手しなければならないであろう」［ベルマ（Verma, I.M.), Scient. Amer., November 1990,pages 68-84 ] 。
【００２４】
驚くべきことに、本出願人らは、目的の産物（すなわち治療目的のタンパク質またはそれに対する抗体が産生される抗原である翻訳産物）をコードする外因性ＤＮＡを含み、該外因性ＤＮＡを安定的に発現するトランスフェクト一次または二次細胞を製造することに成功している。本明細書で説明する方法を用いれば、その他の翻訳産物（天然には産生されない新規タンパク質）や転写産物（たとえばアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム）をコードする外因性ＤＮＡまたはそれ自体が治療目的の産物（たとえば、トランスフェクト細胞中に存在する調節タンパク質と結合する外因性ＤＮＡ）である外因性ＤＮＡを含むトランスフェクト一次または二次細胞を製造することもできる。
【００２５】
本発明の方法は、１）トランスフェクト一次細胞を投与される個体またはその他のソースから得られた一次細胞の集団を提供し、２）該一次細胞または一次細胞由来二次細胞に、上記のような外因性ＤＮＡおよび上記のような必要な付加的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を導入してトランスフェクト一次または二次細胞を製造し、３）トランスフェクト一次または二次細胞を増殖に適した条件下で維持し、４）トランスフェクト一次または二次細胞を同定し、５）増殖に適した培養条件下で十分な時間にわたり維持することによって（４）で同定したトランスフェクト一次または二次細胞からコロニーを作成することで、（４）で同定した（創始）細胞由来の細胞株を作成するというステップから成るものである。本方法の一つの態様においては、ＤＮＡ構築物に存在する配列とゲノムＤＮＡに存在するＤＮＡ配列の間の相同組換えによって外因性ＤＮＡをゲノムＤＮＡに導入する。
【００２６】
トランスフェクト二次細胞のクローン集団を製造する本発明の方法の一つの態様においては、一次または二次細胞を含有する細胞懸濁液を、治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡおよびｎｅｏ遺伝子などの選択マーカーをコードするＤＮＡと混合する。該２つのＤＮＡ配列は、同一のＤＮＡ構築物または２つの異なるＤＮＡ構築物上に存在する。得られた混合物は、２５０〜３００ボルト、９６０μファラッドのキャパシタンスで、細胞がＤＮＡ構築物を取り込むのに適した一定時間（たとえば１４ないし２０ミリ秒）というのが通常の条件であるエレクトロポーレーションに付す。別の態様においては、顕微注射を用いてＤＮＡ構築物を一次または二次細胞に導入する。いずれの態様においても、外因性ＤＮＡを導入すると、トランスフェクト一次または二次細胞ができる。
【００２７】
不均一細胞株を製造する本発明の方法においては、単一のトランスフェクト一次または二次細胞を単離して創始細胞として使わないこと以外はクローン細胞株の製造について説明したのと同じステップを実施する。異なる点は、複数のトランスフェクト一次または二次細胞を培養して不均一細胞株を製造することである。
【００２８】
本発明はまた、外因性ＤＮＡによってコードされるタンパク質に対して特異的な抗体を製造する方法にも関する。該方法においては、求める抗体に対する抗原を発現するトランスフェクト一次または二次細胞を動物レシピエント（たとえばウサギ、マウス、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、モルモット、ヒツジ、ヒト以外の霊長類）に導入する。動物レシピエントは発現される抗原に対する抗体を産生するが、該抗原は完全タンパク質抗原であってもよいし、完全抗原をコードする無傷の遺伝子の断片によってコードされるペプチドであってもよい。該動物からポリクローナル血清を得る。トランスフェクト一次または二次細胞を使用することによってモノクローナル抗体を製造することもできる。目的のモノクローナル抗体に対する抗原を発現するトランスフェクト一次または二次細胞の動物レシピエントから脾臓細胞を採取する。コプロウスキーら（Koprowski et al. ）（米国特許第４，１７２，１２４号）の方法やケーラーら（Kohler et al.)［Nature 256:495-497 (1975) ］の方法など公知の方法を用いて該脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させ、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を製造する。得られたポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、その他の方法によって製造された抗体と同じ目的（たとえば診断、予防、治療の目的）に用いることができる。
【００２９】
本発明は、異常または好ましくない状態の治療において応用範囲が広く、様々な産物を個体に提供するために用いることができる。たとえば、本発明は、分泌タンパク質（主に全身性の作用または主に局所性の作用があるもの）、膜タンパク質（たとえば新たな細胞応答性や強化された細胞応答性を付与したり、毒性産物の除去を促進したり、細胞を標識化またはターゲティングする目的で）、または細胞内タンパク質（たとえば遺伝子発現に影響を及ぼしたり自己消化作用を得る目的で）を提供するために用いることができる。また、本発明は、遺伝子発現を変化させるアンチセンス(anti-sence)アプローチにおいて有用な操作ＲＮＡを製造するかそれに対して個体中で免疫応答が起きる抗原を提供する（ワクチン投与のように疾患を予防するため、または既存の状態を抑制するために）目的で、細胞タンパク質と結合するかキレート形成するように設計されたＤＮＡを提供するために用いることができる。本発明は、異常または好ましくない状態の治療において、１）治癒性がある（一つの遺伝子療法治療は患者の寿命を延長させる可能性がある）、２）精密な投与が可能である（生理的要求に基づく必要なタンパク質の最適用量を患者の細胞が連続的に決定し送達させるうえに、安定トランスフェクト細胞株は移植に先立ち詳細にインビトロでキャラクタライゼーションされて長期インビボ機能を正確に予想することができる）、３）患者を治療する際に適用が簡単である、４）患者の承諾に関する問題を排除する（１回の遺伝子療法治療を行なった後で毎日タンパク質を注射する必要がなくなる）、５）治療費用が減る（治療目的のタンパク質は患者自身の細胞によって合成されるので、コストのかかるタンパク質製造と精製の投資が不要になる）、および６）安全である（本発明は、患者の細胞を遺伝的に操作するためにレトロウイルスなどの感染性物質を使用することはないので、他の遺伝子療法方式の妨げとなっている安全性と有効性の問題が解決される）という点でとくに有利である。
【００３０】
本明細書でさらに説明するように、脊椎動物、とりわけ哺乳類由来の一次または二次細胞にＥＰＯをコードする外因性ＤＮＡをトランスフェクトすると、長期間にわたりインビトロとインビボのいずれにおいてもコード化ＥＰＯを再現的に産生することが示されている。また、トランスフェクト一次および二次細胞は生理的に意義のあるレベルでインビボでＥＰＯを発現することが示されている。発現されたＥＰＯはヒト尿から精製されたＥＰＯまたは組換えヒトＥＰＯに特有のグリコシル化パターンを有することが示されている。
【００３１】
また、本明細書でさらに説明するように、脊椎動物、とりわけ哺乳類由来の一次または二次細胞にｈＧＨをコードする外因性ＤＮＡをトランスフェクトすると、コードされたｈＧＨを長期的にインビトロとインビボのいずれにおいても再現的に産生することが示されている。また、該トランスフェクト一次および二次細胞は生理的に意義のあるレベルでインビボでｈＧＨを発現することが示されている。
【００３２】
出願人らはまた、ＥＰＯをコードする外因性ＤＮＡを安定的に発現するトランスフェクト一次または二次細胞、上記トランスフェクト細胞のクローン細胞株および不均一細胞株を製造する方法、クローン及び不均一細胞株を製造する方法、およびＥＰＯを発現するトランスフェクト細胞を用いて該コード産物を生理的に意義のあるレベルで哺乳類個体に送達する方法を完成した。本明細書で説明する構築物および方法は、たとえばＥＰＯ産生および／または機能が増大または強化される必要のある［たとえば、低下すなわち正常以下であるか、正常であってもその個体が赤血球産生の強化によって少なくとも一時的に利益を受ける場合（たとえば透析前療法または透析療法実施中、ＡＺＴでエイズを治療中、手術後、または化学療法実施中）］個体（ヒト）を治療するのに有用である。
【００３３】
やはり本明細書で説明するように、脊椎動物、とりわけ哺乳類由来の一次または二次細胞に、インスリノトロピンをコードする外因性ＤＮＡをトランスフェクトすること、およびそれらを用いて、インスリンの産生、機能および／または感受性が低下している個体にインスリノトロピンを提供することができる。本明細書で使用する場合、インスリノトロピンという用語は、たとえばＧＬＰ（７−３７）、ＧＬＰ（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３４）などのグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）の誘導体、ならびにインビボのアミド化酵素によって生じるそれらのカルボキシ末端アミド化誘導体、トランケートされた(truncated）ＧＬＰ−１のそれと実質的に同じ生物活性または血中安定性か、強化された生物活性または安定性をもたらすアミノ酸変化またはその他の変化を有する誘導体を含む。
【００３４】
本明細書でさらに説明するように、本出願人らは、ＤＮＡ構築物またはプラスミド中で一次または二次脊椎動物細胞にＤＮＡを導入し、相同組換えによって該トランスフェクト一次または二次細胞のゲノムに組み込むことができるということも明らかにした。すなわち、本出願人らは、一次および二次哺乳類細胞におけるジーンターゲティングを証明したのである。本出願人らは、さらに、該外因性ＤＮＡは相同組換え体（ＨＲ）細胞中に目的の機能を有すること、および選択マーカー遺伝子によって付与される検出可能表現型に基づいて正しくターゲティングされた細胞を同定することができるということも証明した。
【００３５】
また、本発明は、トランスフェクト一次、二次、または不死化細胞を用いてタンパク質を製造する方法に関する。本方法は、一次細胞、二次細胞、または不死化細胞に治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡ、または治療目的の産物をコードする内因性遺伝子にターゲティングしかつそれを活性化させるのに十分なＤＮＡをトランスフェクトするものである。たとえば、実施例１８ｆと１９と２１は、選択された内因性遺伝子のターゲティングおよび活性化によるタンパク質製造について説明している。
【００３６】
本出願人らは、選択マーカー遺伝子を含有するプラスミド（プラスミドｐｃＤＮＥＯ）、治療目的の産物をコードする遺伝子を含有するプラスミド（プラスミドｐＸＧＨ５）、または両方の遺伝子を含有するプラスミド（ｐＸＧＨ３０１）の構築について説明する（実施例３）。また、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座（ＨＰＲＴ座）へのターゲティングと薬剤抵抗性表現型に基づく選択に有用なプラスミドの構築についても説明する（実施例１８ａ）。このプラスミドをｐＥ３Ｎｅｏと呼び、細胞ゲノムのＨＰＲＴ座へ組み込むと、ｈｐｒｔ- 、６−ＴＧ抵抗性表現型を有しやはりＧ４１８抵抗性を示す細胞ができる。上記のように、本出願人らは、樹立細胞に導入されたＤＮＡがＨＰＲＴ遺伝子のエキソン３の位置にあることを証明することによって、樹立ヒト線維芽細胞系におけるジーンターゲティングにおいてｐＥ３Ｎｅｏが正しく機能することを明らかにした（実施例１８ｂ）。
【００３７】
また、本出願人らは、ｐＥ３Ｎｅｏを用いる一次および二次ヒト皮膚線維芽細胞におけるジーンターゲティングを証明し（実施例１８ｃ）、治療目的の産物［ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）］をコードする遺伝子のヒトゲノムへのターゲティング挿入(targeted insertion)のためのプラスミドの構築について説明する（実施例１８ｄ）。本願はさらに、ＤＮＡ末端の改変がゲノムＤＮＡへのＤＮＡターゲティングを強化すること（実施例１８ｃと実施例１８ｅ）、および様々なターゲティングプラスミドの構築を強化することを明らかにする。たとえば、本出願人らは、ヒト細胞中で機能することが知られているネズミプロモーターの支配下にヒト遺伝子をおくための（実施例１８ｆと１８ｉ）、遺伝子をフランキングする配列へのターゲティングと様々なスクリーニングおよび選択アプローチを用いるターゲティングされる二次線維芽細胞の単離のための（実施例１８ｇ、１８ｈ、１８ｊ、１８ｋ）、コード産物を発現する相同組換え体一次または二次細胞を製造するために、ヒト以外またはヒトの由来のプロモーターの支配下において、一次または二次細胞中では正常に発現されないヒト遺伝子をおくための、ターゲティングプラスミド（実施例１８ｆ〜１８ｋ）について説明する。
【００３８】
さらに本発明の二つの態様について説明するが（実施例１９）、いずれも、遺伝子（たとえばヒトＥＰＯ遺伝子）の上流にある正常調節配列を変化させて、非トランスフェクト状態では検出可能な量の遺伝子産物を発現しないのが普通である一次または二次細胞株中での遺伝子産物の発現を可能にするものである。一つの態様においては、ターゲティング事象(targeting events)の産物はキメラ性転写ユニットであり、調節要素および効果的に結合されたエキソンが、活性化させようとする目的の内因性遺伝子の上流に位置している。転写、スプライシング、および翻訳の結果、該外因性ＤＮＡのエキソン１によってコードされるアミノ酸が、内因性遺伝子中のエキソン２と下流エキソンによってコードされるアミノ酸と融合されたキメラ性タンパク質ができる。第２の態様においては、ターゲティング事象の結果、内因性遺伝子の調節配列とエキソン１配列が、対応する外生配列で置換される。転写、スプライシング、および翻訳の結果、上記したものと同様のキメラ性タンパク質ができる。通常、上記タンパク質の分泌は、膜透過とシグナルペプチドの除去を伴い、その結果、このケースでは、キメラ性シグナルペプチドを欠く正常なタンパク質ができる。いずれの場合も、キメラ性タンパク質はこの時点で目的の調節要素の支配下にある。
【００３９】
実施例１８ｆ〜１８ｈおよび１９は、ヒトＥＰＯ遺伝子の上流の正常な調節配列を変化させて、非トランスフェクト状態では検出可能な量のＥＰＯを発現しない一次または二次線維芽細胞株におけるｈＥＰＯ発現を可能にする態様について説明する。一つの態様においては、ターゲティングの結果、正常ＥＰＯタンパク質は無傷のままであるが、マウスメタロチオネインプロモーターの支配下におかれる。実施例１８ｉおよび１８ｊは、類似のターゲティング構築物を用いて一次または二次ヒト線維芽細胞中で内因性成長ホルモン遺伝子を活性化させることを明らかにする。ヒト線維芽細胞中のＥＰＯ発現の活性化に関するその他の態様においては、ターゲティング事象の産物はキメラ性転写ユニットであり、ヒト成長ホルモン遺伝子の最初のエキソンはＥＰＯエキソン２−５の上流に位置する。転写（マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にある）、スプライシング、および翻訳の産物は、ｈＥＰＯシグナルペプチドのアミノ酸１−４がｈＧＨのアミノ酸残基１−３で置換されたタンパク質である。このタンパク質のキメラ部分、すなわちシグナルペプチドは分泌の前に細胞から除去される。
【００４０】
実施例は、ジーンターゲティングによって内因性遺伝子を活性化する方法であって、ｈＥＰＯコード領域とｈＧＨタンパク質コード領域の操作やその他の使用を必要としない方法を提供するものである。これらの方法により、通常は不活性の遺伝子を、インビボのタンパク質送達方法（たとえば遺伝子療法）およびインビトロのタンパク質製造（たとえば薬剤製造）にとって望ましい性質を有する細胞中で活性化させてもよい。
【００４１】
図７と８は、ｈＥＰＯ遺伝子を転写的に活性化するための２つの方法を説明するものである。細線はｈＥＰＯ配列を示し、太線はマウスメタロチオネインＩプロモーター、点線ボックスはｈＧＨの５’未翻訳領域、黒塗りボックスはｈＧＨのエキソン１、ストライプいりボックスはｈＥＰＯのイントロン１に由来する１０ｂｐのリンカー、網かけボックスはｈＥＰＯの５’未翻訳領域、白抜きボックスはｈＥＰＯ配列コード配列、ＨＩＩＩはＨｉｎｄＩＩＩ部位を示す。
【００４２】
本明細書で説明する当該分野における通常の技術を有する者にとって明白な方法、ＤＮＡ構築物、またはプラスミド、またはそれらに改変を加えたものを用いれば、治療目的の産物（たとえばタンパク質、リボザイム、核酸）をコードする外因性ＤＮＡを脊椎動物（たとえば哺乳類、ヒトおよびヒト以外の両者）の一次または二次細胞のゲノム中のあらかじめ選択された部位に挿入することができる。
【００４３】
本明細書で説明する方法およびＤＮＡ構築物は、様々な目的に用いることができる。該方法は、レシピエントの一次または二次細胞中にすでに存在するＤＮＡを修復、改変、欠失または置換する目的で、あるいは治療目的の産物またはその他の目的産物をコードするかそれ自体が治療目的の産物またはその他の産物である遺伝子またはＤＮＡ配列を一次または二次細胞中に（あらかじめ選択された部位に）導入する目的で、あるいは一次または二次細胞レシピエント中に存在する調節配列に対して付加または置換を行なう目的で、あるいは一次または二次細胞中に存在するある遺伝子の全体または一部をノックアウトまたは除去する目的で、あるいは普遍的なドナー細胞を製造する目的で、脊椎動物由来の一次または二次細胞を変化させるために用いることができる。
【００４４】
トランスフェクト一次または二次細胞は、選択可能表現型を付与する選択マーカーをコードするＤＮＡを含むことで、同定と単離をしやすくしてもよい。本出願人らは、外因性ＤＮＡを安定的に発現するトランスフェクト一次または二次細胞を製造する方法、上記トランスフェクト細胞のクローン細胞株および不均一細胞株、該クローン細胞株および不均一細胞株を製造する方法、および本発明のトランスフェクト一次または二次細胞の集団を使用することにより異常または好ましくない状態を治療または予防する方法も完成した。
【００４５】
トランスフェクト細胞
本発明の方法によってトランスフェクトを受けさせる一次および二次細胞は様々な組織から得ることができ、培養状態で維持することができるすべての細胞型を含む。たとえば、本発明の方法によってトランスフェクトを受けさせることができる一次および二次細胞としては、線維芽細胞、ケラチン細胞、上皮細胞（たとえば乳房上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液細胞成分（たとえば白血球、骨髄細胞）、筋肉細胞、およびこれらの型の体細胞の前駆体などが挙げられる。一次細胞は、トランスフェクト一次または二次細胞を投与される個体から得るのが好ましいが、一次細胞は、同種または別種（たとえばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）のドナー（レシピエント以外）から得てもよい。
【００４６】
トランスフェクト一次および二次細胞は、表現型の選択の有無にかかわらず、実施例５〜７で説明するようにして製造されたものであり、たとえばＥＰＯやインスリノトロピンをはじめとする治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡを発現することが示されている。
【００４７】
不死化細胞も本発明の方法によってトランスフェクトを受けさせることができ、遺伝子療法またはタンパク質製造に用いることができる。本発明の方法によるタンパク質製造に有用な不死化ヒト細胞系の例としては、ＨＴ１０８０、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７乳癌細胞、Ｋ−５６２白血病細胞、ＫＢ癌腫細胞、および２７８０ＡＤ卵巣癌細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
外因性ＤＮＡ
本発明の方法によって一次または二次細胞に組み入れられる外因性ＤＮＡは、１）既存の状態を治療するかその発生を予防するのに有用な翻訳または転写産物など一次または二次細胞における発現が望まれる翻訳または転写産物（たとえばＥＰＯまたはインスリノトロピン）をコードするＤＮＡ、および２）既存の状態を治療するかその発生を予防するのに有用なＤＮＡなど遺伝子産物はコードしないがそれ自体が有用であるＤＮＡまたは３）レシピエント細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを起こして内因性遺伝子の発現の変化（増大または低下）が起きるＤＮＡである。
【００４９】
一次または二次細胞にトランスフェクトされたＤＮＡは目的産物全体をコードすることができるが、該産物のたとえば単数または複数の活性部分または機能性部分をコードすることもできる。該産物は、たとえばホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または天然には存在しないタンパク質または核酸（すなわち新規タンパク質または新規核酸）であることができる。該ＤＮＡは、天然にそれを含むソースから得ることができ、また、遺伝子操作技術や合成法を用いて製造することもできる。一次または二次細胞にトランスフェクトされたＤＮＡは、１つ以上の治療目的の産物をコードすることができる。一次または二次細胞へのトランスフェクト後、該外因性ＤＮＡをレシピエント細胞のゲノムに安定的に組み込み（使用するＤＮＡ構築物中に存在する追加配列とともに）、そのゲノムから発現されたりその他の機能を示す。あるいは、該外因性ＤＮＡは、トランスフェクト一次または二次細胞内にエピソーム的に存在してもよい。
【００５０】
目的産物をコードするＤＮＡは、誘導可能プロモーターの支配下で細胞に導入し、できた細胞またはそれを個体に導入したものは該産物を発現しないがそうなるように誘導することができるという結果を得ることができる（すなわち、トランスフェクト細胞が産生された後の移植前または移植後に産生を誘導する）。無論、目的産物をコードするＤＮＡは、導入の時点で（すなわち誘導なしに）発現されるようなやり方で細胞に導入することができる。
【００５１】
選択マーカー
様々な選択マーカーを一次または二次細胞に組み込むことができる。たとえば、薬剤抵抗性、原栄養性、細胞毒性物質抵抗性、または表面タンパク質の発現などの選択可能表現型を付与する選択マーカーを用いることができる。用いることのできる選択マーカー遺伝子としては、ｎｅｏ、ｇｐｔ、ｄｈｆｒ、ａｄａ、ｐａｃ、ｈｙｇ、およびｈｉｓｄなどが挙げられる。付与された選択可能表現型は、レシピエントの一次または二次細胞の同定と単離を可能にする。
【００５２】
選択マーカーは、ポジティブ選択可能なものとネガティブ選択可能なものの２つの範疇に分けることができる。ポジティブ選択においては、ポジティブ選択マーカーを発現する細胞は選択物質による処理に耐えることができる（ｎｅｏ、ｇｐｔ、ｄｈｆｒ、ａｄａ、ｐａｃ、ｈｙｇ、ｍｄｒｌ、およびｈｉｓＤなど）。ネガティブ選択においては、ネガティブ選択マーカーを発現する細胞は選択物質の存在下で破壊される（たとえばｔｋ、ｇｐｔ）。
【００５３】
ＤＮＡ構築物
外因性ＤＮＡおよび必要に応じて選択マーカーをコードするＤＮＡをレシピエントの一次または二次細胞中での該外因性ＤＮＡの発現に必要な追加配列とともに含むＤＮＡ構築物を用いて、該コード産物を製造しようとする一次または二次細胞にトランスフェクトを受けさせる。該ＤＮＡ構築物は、宿主細胞ＤＮＡとの相同組換えのためのターゲティング配列を含むこともできる。遺伝子産物をコードしない（および治療目的の産物である）外因性ＤＮＡ配列を含み、さらに必要に応じて選択マーカーをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて、一次または二次細胞にトランスフェクトを受けさせることができる。あるいは、レトロウイルス、ヘルペス、アデノウイルス、アデノウイルス関連性、オタフクカゼウイルス、ポリオウイルスベクターなどの感染性ベクターをこの目的に用いることができる。
【００５４】
本発明の一つの態様においては、上記外因性ＤＮＡおよび該外因性ＤＮＡの発現に必要な配列などの追加配列を含むＤＮＡ構築物を用いることができる（たとえばプラスミドｐＸＧＨ５またはプラスミドｐＸＥＰＯ１）。ＤＮＡ構築物は、該外因性ＤＮＡの発現を支配する誘導可能プロモーターを含むことで誘導可能発現を可能にすることができる。任意には、該ＤＮＡ構築物は、細菌の複製開始点および細菌中における大規模プラスミド増殖を可能にする細菌の抗生物質抵抗性マーカーを含んでいてもよい。プロモーター、ポリアデニル化部位、およびスプライスジャンクションなどの追加配列とともに、選択マーカーをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて、トランスフェクト一次または二次細胞に選択可能表現型を付与することができる（たとえばプラスミドｐｃＤＮＥＯ）。該２つのＤＮＡ構築物は、本明細書で説明する方法を用いて一次または二次細胞に同時トランスフェクションされる。あるいは、外因性ＤＮＡと選択マーカーと追加配列（たとえば該外因性ＤＮＡの発現および選択マーカー遺伝子の発現に必要なもの）を含むＤＮＡ構築物を用いることもできる。このようなＤＮＡ構築物（たとえばｈＧＨ遺伝子とｎｅｏ遺伝子を含むプラスミドＰＸＧＨ３０１、またはＥＰＯ遺伝子とｎｅｏ遺伝子を含むプラスミドｐＥ３ｎｅｏＥＰＯ；これらのプラスミドについては、それぞれ図３と６で説明する）。インスリノトロピンをコードする外因性ＤＮＡと追加配列（たとえばインスリノトロピン発現に必要な配列）を含む類似の構築物を製造することができる（たとえばプラスミドｐＸＧＬＰ１、実施例１１参照）。これらの構築物は、プロモーター、ポリアデニル化部位、およびスプライスジャンクションなどその他の配列だけでなく、選択マーカーをコードするＤＮＡも含むこともできる。
【００５５】
ＤＮＡが筋肉への注射などによって個体に直接注射される場合、該ＤＮＡ構築物は、外因性ＤＮＡ、およびレシピエント細胞への該ＤＮＡ構築物の進入の際にコード産物（たとえばＥＰＯ）の発現に必要かつ十分な調節配列を含む。
【００５６】
本発明のもう一つの態様においては、目的産物をコードする外因性ＤＮＡ、相同組換えのためのターゲティング配列、および任意には１個以上の選択マーカーをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて、相同組換えを起こさせる一次または二次細胞にトランスフェクトを受けさせる。本態様においては、外因性ＤＮＡの発現に必要なＤＮＡ配列も存在するのが普通である。遺伝子産物をコードしない外因性ＤＮＡ配列を含み（および目的の産物である）、任意には選択マーカーをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を用いて、一次および二次細胞にトランスフェクトを受けさせることもできる。
【００５７】
外因性ＤＮＡ、ターゲティング配列および選択マーカーは単一のＤＮＡ構築物上または複数の構築物上にのせて細胞に導入することができる。ＤＮＡ構築物の全長は成分（外因性ＤＮＡ、ターゲティング配列、選択マーカー遺伝子）の数およびそれぞれの長さによって異なる。構築物の全長は少なくともヌクレオチド２０個以上であるのが普通である。外因性ＤＮＡがゲノムＤＮＡと相同組換えを起こすのに十分な相同性を有する構築物の場合、該構築物は単一の成分すなわち外因性ＤＮＡを含む。本態様においては、外因性ＤＮＡは相同性ゆえにゲノムＤＮＡ中への組み込みをターゲティングする(target integation) 役目も果たし、追加のターゲティング配列は不要である。このような構築物は、完全遺伝子、遺伝子部分、調節要素またはその一部、または除去されると調節配列と構造配列を機能的に類似させるＤＮＡ領域などの常在性ＤＮＡ配列のノックアウト、置換、または修復に有用である。外因性ＤＮＡが選択マーカーである場合にも有用である。
【００５８】
第３の態様においては、ＤＮＡ構築物は、外因性ＤＮＡおよび通常は該外因性ＤＮＡの両端に存在する１つ以上の分散したターゲティング配列を含む。ターゲティング配列は、採取したままの細胞ゲノム中の、一次または二次細胞ゲノム中に存在するのが普通であるＤＮＡ配列である（たとえば必須遺伝子、非必須遺伝子または非コード性遺伝子、または以前の改変によってゲノム中に存在するもの）。このような構築物は、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または天然には存在しないタンパク質または核酸などの治療目的の産物をコードする外因性ＤＮＡの組み込みに有用である。とくに、外因性ＤＮＡは以下のもののうちの１種をコードすることができる。すなわち、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、エリスロポエチン、アルファ−１型アンチトリプシン、カルシトニン、グルコセレブロシダーゼ、成長ホルモン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、アポリポタンパク質Ｅ、ＩＬ−２受容体およびその拮抗剤、インスリン、グロビン、免疫グロブリン、触媒抗体、インターロイキン、インスリン様成長因子、スーパーオキシドジスムターゼ、免疫応答物質修飾因子、副甲状腺ホルモン、インターフェロン、神経成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、およびコロニー刺激因子である。このような構築物は、トランスフェクト一次または二次細胞中のタンパク質または核酸のキレート形成に十分なＤＮＡ配列、細胞調節タンパク質に結合するＤＮＡ配列、染色体の二次構造または三次構造を変化させるＤＮＡ配列、および一次または二次細胞のゲノムＤＮＡ中の転写調節要素であるＤＮＡ配列などの治療目的の産物である外因性ＤＮＡの組み込みにも有用である。
【００５９】
第４の態様においては、ＤＮＡ構築物は、外因性ＤＮＡ、ターゲティングＤＮＡ配列、および少なくとも１個の選択マーカーをコードするＤＮＡを含む。この第４の態様においては、構築物成分の順序は、ターゲティング配列−外因性ＤＮＡ−単数または複数の選択マーカーをコードするＤＮＡ−ターゲティング配列であってよい。本態様においては、１個以上の選択マーカーが構築物に含まれ、これによって選択可能表現型に基づく選択が可能となる。構築物を安定的に組み込む細胞は選択物質による処理に耐える。安定トランスフェクト細胞のサブセットはＨＲ細胞となるであろうが、このものはＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、および表現型スクリーニングをはじめとする様々な手法によって同定することができる。
【００６０】
第５の態様においては、ＤＮＡ構築物中の成分の順序はターゲティング配列−選択マーカー１−ターゲティング配列−選択マーカー２であってよい。本態様においては、選択マーカー２はネガティブ選択性を示す。すなわち、選択マーカー２の遺伝子産物は、選択マーカー２を発現する細胞を殺す物質（通常は薬物または代謝類似体）を含有する適当な培地処方における成長に対する阻害を基準として選択することができる。選択マーカー１をフランキングするターゲティング配列と宿主細胞ゲノム中の相同配列の組換えは、選択マーカー１のターゲティング組み込み(targeted integration)をもたらすが、選択マーカー２は組み込まれない。このような組換え事象は、選択マーカー１を安定的にトランスフェクトされているが選択マーカー２は安定的にトランスフェクトされていない細胞を生じるが、このような細胞は、選択マーカー１の成長を許す選択物質と選択マーカー２の成長を阻害する選択物質を含有する培地における成長を基準として選択することができる。
【００６１】
ＤＮＡ構築物に関するすべての態様において、外因性ＤＮＡは１個以上の産物をコードすることができ、１個以上の治療目的の産物またはそれぞれの１個以上のものであることができるので、複数の産物を送達することが可能となる。
【００６２】
一次または二次細胞のトランスフェクションおよびクローン細胞株または不均一細胞株の製造
本発明の方法を図４に概略的に示す。図に示すように、まず、脊椎動物の組織を得るが、これはパンチ生検その他、対象の一次細胞型の組織ソースを得る外科的方法などの公知の手順を用いて行なう。たとえば、線維芽細胞またはケラチン細胞のソースとしてパンチ生検を用いて皮膚を採取する。酵素消化または外片移植などの公知の方法を用いて一次細胞の混合物を組織から得る。酵素消化を用いる場合は、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ジスパーゼ、プロナーゼ、トリプシン、エラスターゼ、キモトリプシンなどの酵素を用いることができる。
【００６３】
生じた一次細胞混合物は直接トランスフェクトに付してもよいし、まず培養し、プレートから移し、再懸濁してからトランスフェクトに付してもよい。一次細胞または二次細胞は、ゲノムに安定的に組み込ませる外因性ＤＮＡおよび任意には選択マーカーをコードするＤＮＡと結合させ、トランスフェクトを行なうために処理する。外因性ＤＮＡと選択マーカーコードＤＮＡはそれぞれ別の構築物（たとえばｐＸＧＨ５およびｐｃＤＮＥＯ、図１と２参照）上、または、単一の構築物（たとえばｐＸＧＨ３０１およびｐＥ３ｎｅｏＥＰＯ、図３と図６参照）上にある。適当な量のＤＮＡを用いて、外因性ＤＮＡを含有し正しく発現する少なくとも１個の安定トランスフェクト細胞を産生させる。一般に、０．１〜５００μｇのＤＮＡを使用する。
【００６４】
本発明の方法を用いて１個の選択マーカー遺伝子だけを導入すると、原料細胞１０万個あたり１７０個（エレクトロポーレーションによって処理された５８８個の原料細胞のうち１個、実施例６）ないし２千個（顕微注入によって処理された４９個の原料細胞のうちの１個、実施例５）の安定トランスフェクト細胞ができる。本発明の方法を用いて治療目的の遺伝子と選択マーカー遺伝子を導入すると、原料細胞１０万個あたり７個（エレクトロポーレーションによって処理された１４，７０５個の原料細胞のうち１個、実施例６）ないし９５０個（顕微注入によって処理された１０５個の原料細胞のうちの１個、実施例５）の安定トランスフェクト細胞ができる。これらの安定トランスフェクト体のうちの４３〜９０％が治療に遺伝子を発現する。正しく発現する細胞は１個あればよいので、原料細胞はかなり少なくてよいことが明らかである。逆に、本発明の方法よりかなり効率の悪いトランスフェクト方法を用いると、原料細胞ソースとして大量の個体組織を使用しないかぎり、上記細胞は１つも得ることはできないであろう。
【００６５】
トランスフェクト一次または二次細胞を製造する本発明の方法の一つの態様においては、実施例で説明するようにエレクトロポーレーションによってトランスフェクトが促進される。エレクトロポーレーションは、単数または複数のＤＮＡ構築物の一次または二次細胞への進入をもたらすのに適した電圧とキャパシタンス（および対応する一定時間）で行なわれる。エレクトロポーレーションは、広い電圧範囲（たとえば５０〜２０００ボルト）と対応するキャパシタンスで行なうことができる。本明細書で説明するように、エレクトロポーレーションは、２５０〜３００ボルトの範囲のエレクトロポーレーション電圧、および９６０μファラッドのキャパシタンスで行なう場合に非常に効率がよい。通常、合計約０．１〜５００μｇのＤＮＡを使用する。実施例で説明するように、合計６０μｇのＤＮＡ、２５０〜３００ボルトの電圧、９６０μファラッドのキャパシタンス、１４〜２０ｍｓｅｃの一定時間という条件を使用すると効率がよいことが示されている。
【００６６】
本発明の方法のもう一つの態様においては、顕微注入を用いて一次または二次細胞をトランスフェクトに付す。例えば実施例５参照。あるいは、リン酸カルシウム沈殿法、リン酸カルシウム沈殿法変法、ポリブレン沈殿法、リポソーム融合法、および受容体介在遺伝子送達法などの公知の方法を用いて細胞をトランスフェクトに付すことができる。安定トランスフェクト二次細胞を増殖させるとともにトランスフェクト二次細胞のクローン細胞株を生じる培養条件下で十分な時間にわたり、１個の安定トランスフェクト細胞を単離、培養、継代培養する。あるいは、複数のトランスフェクト細胞を培養、継代培養して、不均一細胞株を作成する。
【００６７】
トランスフェクト一次または二次細胞は、治療目的の産物（たとえばＥＰＯ）を効果的な量で個体に提供するのに十分なサイズのクローン細胞株または不均一細胞株を産生させるのに十分な回数の倍化を起こす。一般に、たとえば０．１ｃｍ2 の皮膚生検標本を採取すると、１０万個の細胞を含んでいると考えられる。１個の細胞を用いてクローン細胞株を作成し、約２７回の倍化を起こすと１億個のトランスフェクト二次細胞ができる。約１０万個の細胞から成るオリジナルのトランスフェクト集団から１個の不均一細胞株を作成する場合、１億個のトランスフェクト細胞を作成するには１０回の倍化で十分である。
【００６８】
トランスフェクトクローン細胞株または不均一細胞株中の必要な細胞の数は変化し、様々な要素によって変わるが、その要素としては、トランスフェクト細胞の使用、トランスフェクト細胞中の外因性ＤＮＡの機能レベル、トランスフェクト細胞の移植の部位（たとえば、使用可能な細胞の数は移植の解剖学的位置によって制限される）、および患者の年齢、体表面積、および臨床状態などが挙げられるがこれらに限定されない。これらの要素を考慮にいれると、明確な成長ホルモン欠損を有する点以外は健常な６０ｋｇの患者に治療作用レベルのヒト成長ホルモンを送達するためには、約１〜５億個のトランスフェクト線維芽細胞が必要である。これは、患者の親指の先端に存在する細胞の量にほぼ相当する。
【００６９】
外因性ＤＮＡのエピソーム発現
細胞内部に存在するがゲノムにまだ組み込まれていないＤＮＡ配列をエピソームという。組換え体エピソームは少なくとも３つの状況において有用となる場合がある。すなわち、１）特定の細胞型が外因性ＤＮＡを安定的に組み込む能力を欠く場合、２）特定の細胞型がＤＮＡの組み込みによって悪影響を受ける場合、および３）特定の細胞型が、組み込まれたＤＮＡではなくエピソームＤＮＡを持っていて向上した治療機能を示す能力がある場合である。
【００７０】
実施例で説明する遺伝子療法のトランスフェクトおよび培養アプローチを用いれば、エピソームのかたちの外因性ＤＮＡを脊椎動物の一次および二次細胞に導入することができる。エプスタイン−バールウイルスの複製開始点と核抗原のＤＮＡ配列を追加することによってプラスミドｐＸＧＨ３０１をそのようなエピソームに変換することができる［イェーツ（Yates, J.L. ）, Nature 319:780-7883 (1985)］。あるいは、脊椎動物の自己複製配列を該構築物に導入することができる［ウエイドル（Weidle, U.H.）, Gene 73(2):427-437(1988) ］。これらおよびその他のエピソーム的に得られた配列も、選択マーカーを有さないｐＸＧＨ５などのＤＮＡ構築物に含ませることができる。次いで、本願に説明するようにして該エピソーム外因性ＤＮＡを一次または二次脊椎動物細胞に導入する（選択マーカーがエピソームに含まれている場合、選択剤を用いてトランスフェクト細胞を処理する）。
【００７１】
トランスフェクト二次細胞のクローン細胞株または不均一細胞株の移植
上記および下記実施例において説明する方法によって製造されたトランスフェクト細胞は、治療目的の産物を送達しようとする個体に公知の方法を用いて導入される。次いで、クローン細胞株または不均一細胞株を、様々な投与経路を用いて様々な部位に（たとえば腎臓被膜下、皮下、中枢神経系（鞘内(intrathecal) を含む）、血管内、肝臓内、内臓内、腹腔内（大網内を含む）、または筋肉内移植）公知の方法を用いて個体に導入する。トランスフェクト細胞は個体に移植されると、外因性ＤＮＡによってコードされる治療目的の産物を産生するか、外因性ＤＮＡ自体によって影響を受ける。たとえば、血液中に正常に見られるタンパク質である因子ＩＸの欠損によって引き起こされる出血障害であるＢ型血友病であると診断された個体は、遺伝子療法治療の対象候補である。患者は微小皮膚生検を受けるが、これは外来で行なうことができる簡単な手順である。マッチの頭程の大きさの皮膚片をたとえば腕の下から採取するが、採取には約１分かかる。試料を処理すると、患者の細胞（この場合は線維芽細胞）が単離され、これに遺伝子操作を加えて、失われた因子ＩＸを産生させる。患者の年齢、体重、および臨床状態に応じて必要数の細胞を大規模培養する。プロセス全体で４〜６週を要するのが普通であり、終了時にやはり外来で、適当な数の遺伝子操作細胞を個体に導入する（たとえば患者の皮膚下に注射して戻すことによって）。この時点で、患者は自己の因子ＩＸを産生する能力を獲得しており、もはや血友病ではなくなっている。
【００７２】
類似のアプローチを用いてその他の状態や疾患を治療することもできる。たとえば、ヒト成長ホルモンを発現する一次または二次細胞を移植することでヒト成長ホルモンを個体に投与することによって小人症を治療することができ、ＥＰＯを発現する一次または二次細胞を移植することによって貧血を治療することができる。
【００７３】
上記実施例以外にも、上記のようにして製造されたインスリノトロピンコード性ＤＮＡを含有するトランスフェクト細胞を、インスリン産生、分泌、機能および／または感受性が低下している個体に送達する。これらのトランスフェクト細胞は、公知の方法によって様々な投与部位で（たとえば腎臓、被膜下、皮下、中枢神経系（鞘内(intrathecal) を含む）、血管内、肝臓内、内臓内、腹腔内（大網内を含む）、または筋肉内移植）個体に導入される。トランスフェクト細胞は個体に移植されると、外因性ＤＮＡによってコードされるインスリノトロピンを産生する。たとえば、インスリン産生、分泌、または感受性が損なわれている個体は、本明細書で説明するようにして製造されたインスリノトロピンコード性外因性ＤＮＡ発現トランスフェクト細胞の移植による療法または予防治療を受けることができる。遺伝子操作を行なう細胞は上記のようにして得、同様にして十分な数の細胞を産生するように処理され、個体に再導入される。
【００７４】
これらの実施例が示唆するように、使用する細胞は患者特有の遺伝子操作細胞であるのが普通であるが、同種の他の個体または異種から細胞を得ることもできる。そのような細胞の使用は、移植細胞の拒絶を防ぐために免疫抑制剤の投与、組織適合性抗原の変更、またはバリヤーデバイスの使用を必要とする。
【００７５】
一つの態様においては、バリヤーデバイス(barrier device)を用いて、レシピエント以外のソース（例えば別の者、又はウシ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類等ヒト以外の哺乳類）から得た移植細胞の拒絶を防止するのに使用される。本態様においては、外因性ＤＮＡによってコードされる産物がレシピエントの循環系または組織を通過することを許すが細胞とレシピエント免疫系の接触を防止して、細胞に対するレシピエントの免疫応答（及び起こりうる拒絶）を防ぐ物質（例えばアミコンＸＭ−５０などの膜）でできたバリヤーデバイスの中に、本発明のトランスフェクト細胞は置かれる。あるいは、ｈＧＨ、ＥＰＯ、又はインスリノトロピンをコードするＤＮＡを例えば筋肉あるいはその他の適当な部位への直接注射法によって導入することができる。本態様においては、ＤＮＡ構築物は、治療目的の産物（例えばＥＰＯ、インスリノトロピン）をコードする外因性ＤＮＡ及びレシピエント細胞における外因性ＤＮＡの発現に十分な調節配列を含んでいる。個体への注射後、ＤＮＡ構築物は一部のレシピエント細胞によって取り込まれる。ＤＮＡは単独で注射することもできるし、生理的に適合性のある担体（例えば生理学的緩衝液）及び任意にはＤＮＡ構築物の細胞への進入の効率を高めたり、ＤＮＡを安定化させたり、ＤＮＡを分解から守る物質等その他の成分を含む処方として注射することもできる。
【００７６】
多くの疾患の場合、これは１回きりの治療であるが、他の疾患では頻回の遺伝子療法治療が必要となろう。
【００７７】
トランスフェクト一次および二次細胞および細胞株の用途
本明細書で説明するトランスフェクト一次または二次細胞または細胞株は、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗原、抗体、凝固因子、アンチセンスＲＮＡ、調節タンパク質、転写タンパク質、受容体、構造タンパク質、リボザイム、新規（天然には存在しない）タンパク質および核酸産物、および遺伝子操作ＤＮＡ等の治療目的の産物の媒体または送達システムとしての応用範囲が広い。例えば、トランスフェクト一次または二次細胞を用いて治療作用タンパク質を提供することができ、そのようなタンパク質としては、ファクターＶIII 、ファクターＩＸ、エリスロポエチン、アルファ−１型アンチトリプシン、カルシトニン、グルコセレブロシダーゼ、成長ホルモン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、アポリポタンパク質Ｅ、受容体ＩＬ−２受容体およびその拮抗剤、インスリン、グロビン、免疫グロブリン類、触媒抗体、インターロイキン類、インスリン様成長因子類、スーパーオキシドジスムターゼ、免疫応答修飾物質、副甲状腺ホルモンおよびインターフェロン、神経成長因子類、組織プラスミノーゲンアクチベーター類、およびコロニー刺激因子類などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、トランスフェクト一次および二次細胞を用いて個体を免疫することができる（すなわちワクチンとして）。
【００７８】
本発明の細胞株の多彩な用途は、以下に示すようにまとめると最も便利であろう。該細胞株は下記の治療目的の産物を送達する目的に用いることができる。１．主に全身作用を示す分泌タンパク質。２．主に局所作用を示す分泌タンパク質。３．新規の、または強化された細胞応答性を付与する膜タンパク質。４．毒性産物の除去を促進する膜タンパク質。５．細胞を標識化またはターゲティングする膜タンパク質。６．細胞内タンパク質。７．遺伝子発現に直接的に影響する細胞内タンパク質。８．自己消化作用を示す細胞内タンパク質。９．調節タンパク質と結合またはキレート形成する遺伝子産物−遺伝子操作ＤＮＡ。１０．リボザイム。１１．遺伝子発現を阻害するためのアンチセンス−遺伝子操作ＲＮＡ。
【００７９】
本発明のトランスフェクト一次または二次細胞は、現在は患者の協力としばしば医学スタッフの参加を要して静脈内、筋肉内、または皮下投与されている治療目的のタンパク質（たとえばホルモン、酵素、凝固因子）を投与するために用いることができる。トランスフェクト一次または二次細胞を用いる場合、個体に投与する前に、一般的に単離ポリペプチドを用いるときに必要なポリペプチドを高度に精製する必要はない。また、本発明のトランスフェクト一次または二次細胞は正常に産生されるのと同じように治療目的の産物を産生する。
【００８０】
本発明のトランスフェクト一次または二次細胞を使用することの利点の一つは、個体に導入される細胞の数を調節することによって体内に送達される産物の量を調節することができることである。また、場合によっては、産物が不要になったときにトランスフェクト細胞を除去することができる。本発明のトランスフェクト一次または二次細胞を使用する治療のもう一つの利点は、亜鉛、ステロイド剤、またはタンパク質産物または核酸産物の翻訳または転写に影響を及ぼすか核酸産物の安定性に影響を及ぼす物質の投与などによって、治療目的の産物の産生を調節することができることである。
【００８１】
本発明において説明するインビボのタンパク質製造および送達システムを用いて治療目的で送達することができるその他の分子としては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびグルカゴン様ペプチド１誘導体（ＧＬＰ−１誘導体）がある。ＧＬＰ−１誘導体としては、トランケートされた誘導体ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３４）、およびその他のトランケートされたカルボキシ末端アミド化誘導体、ならびにトランケートされたＧＬＰ−１誘導体のものと実質的に同じ生物活性または血中安定性、または強化された（トランケートされたＧＬＰ−１誘導体のものより大きい）生物活性または血中安定性をもたらすアミノ酸置換、欠失、付加、またはその他の変化（たとえば非アミノ酸成分の付加）を有するＧＬＰ−１誘導体などが挙げられる。本明細書で使用する場合、ＧＬＰ−１誘導体という用語は上記分子すべてを含む。本明細書で使用する場合、ＧＬＰ−１関連ペプチドという用語はＧＬＰ−１とＧＬＰ−１誘導体を含む。ＧＬＰ−１誘導体はインスリノトロピンまたはインクレチンとも呼ばれ、胃腸管細胞によって正常に循環系に分泌される。インビボの研究で、これらのペプチドは内分泌膵臓からのインスリン分泌を刺激しグルカゴン分泌を阻害するとともに末梢組織中のインスリン感受性を増大させる機能を果たすことが明らかにされている［ゴーケら（Goke, R. et al.) (1991) Eur. J.Clin. Inv. 21:135-144；グートニアクら（Gutniak, M. etal.) (1992) New Engl. J. Med. 326:1316-1322］。インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者は、低下したインスリン感受性を補うために高レベルのインスリンで治療されることが多い。したがって、ＧＬＰ−１誘導体によるインスリン放出の刺激とインスリン感受性の増大はＮＩＤＤＭ患者にとって利益となるであろう。インスリン分泌のインスリノトロピン誘導刺激は血糖値に強く依存するという事実はとくに重要であり、これらのペプチドはインビボにおける血糖値上昇に反応してインスリン放出を刺激し、最終的には血糖値を下げる作用を示すことが示唆される。
【００８２】
相同組換えによる遺伝子の調節配列の置換
本明細書で説明するように、遺伝子ターゲティングを用いて、異なる遺伝子から単離した調節配列、または遺伝子工学的方法を用いて合成した新規調節配列で遺伝子の既存の調節領域を置換することができる。このような調節配列は、プロモーター、エンハンサー、骨格付着領域、ネガティブ調節要素、転写開始部位、調節タンパク質結合部位、またはこれら配列を組み合わせたものから成るものであってよい。（あるいは、産生されるＲＮＡまたはタンパク質の構造または安定性に影響を及ぼす配列は、ターゲティングによって置換、除去、付加、またはその他の改変を加えることができ、そのような配列としては、ポリアデニル化部位、ｍＲＮＡ安定性要素、スプライス部位、タンパク質の輸送または分泌特性を強化または変化させるためのリーダー配列、またはタンパク質またはＲＮＡ分子の機能または安定性を変化または向上させるその他の配列などが挙げられる。）
【００８３】
いくつかの態様が可能である。まず、ターゲティング事象は、調節配列の単純挿入によって遺伝子を新しい調節配列の支配下におくものであってよい（たとえば新規プロモーターまたはエンハンサーまたはその両者を遺伝子の上流に挿入する）。次に、ターゲティング事象は、組織特異性ネガティブ調節要素の欠失など調節要素の単純欠失であってよい。第３に、ターゲティング事象は、既存の要素を置換するものであってよく、たとえば組織特異性エンハンサーを天然に存在する要素より広いか異なる細胞型特異性を有するエンハンサーで置換することができる。本態様においては、天然に存在する配列が失われ、新規配列が付加される。いずれの場合も、ターゲティングＤＮＡと近接の１個以上の選択マーカー遺伝子を使用することで外因性ＤＮＡが宿主細胞ゲノムに組み込まれている細胞の選択を可能にすることによって、ターゲティング事象の判定が促進される。ターゲティングの判定は、ネガティブ選択マーカーが外因性ＤＮＡに連結されるがネガティブ選択マーカーがターゲティング配列をフランキングするような、そして宿主細胞ゲノム中の配列との正しい相同組換え事象がネガティブ選択マーカーの安定組み込みをもたらさないような、ネガティブ選択性を示す１個以上のマーカー遺伝子を使用することによっても促進される。この目的に有用なマーカーとしては、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子または細菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子などが挙げられる。
【００８４】
以下実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない。
【００８５】
【実施例】
実施例１．線維芽細胞の単離
ａ. 線維芽細胞の起源
ヒトの線維芽細胞は、肝臓、腎臓、肺、皮膚由来の生検試料を含めて、様々な組織から得ることができる。ここに示されている方法は皮膚の線維芽細胞を単離するために最適化されたもので、最小限度の不快感と危険で様々な年齢の個体から容易に得られる（胚および胎児の線維芽細胞はこの方法を用いて同様に単離できるかも知れない）。他の組織から線維芽細胞を単離したいときはこの方法を多少変更する必要があるかも知れない。
【００８６】
ヒトの皮膚は環状切除あるいはパンチ生検により得られる。その試料は三つの主要な成分から成っている。それは皮膚そのものの表皮および真皮の層、および真皮の層に付着した筋膜の層である。線維芽細胞は真皮および筋膜の両方から単離することが可能である。
【００８７】
ｂ. ヒトの筋膜線維芽細胞の単離
およそ３ｃｍ2 の組織をおよそ１０ｍｌの洗浄溶液（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧ、１００μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ、0.5 μｇ／ｍｌ Ｆｕｎｇｉｓｏｎｅを含むＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ溶液）の中へ入れ室温で10分間、計３回緩やかに攪拌した。組織を次に１０ｍｌの消化溶液（0.1 ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ａ、2.4 ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｇｒａｄｅ ＩＩ Ｄｉｓｐａｓｅを含んだ洗浄溶液）を入れた１００ｍｍ組織培養皿に移した。
【００８８】
解剖顕微鏡の元に、皮膚を表皮が裏側になるようにする。筋膜細胞は切り裂く事(blunt dissection)により真皮や表皮から分離される。筋膜組織は次に小さい断片（１ｍｍ未満）に切断され、回転台の上で37℃で30分間インキュベートされる。酵素／細胞懸濁液は取り除かれ、保存される。そして１０ｃｃの消化液を残った組織の断片にさらに加え、その組織は30分間37℃で再インキュベートされる。酵素／細胞懸濁液はプールされ、15ゲージの針に数回通し、150 メッシュスクリーンを装備したＣｅｌｌｅｃｔｏｒ Ｓｉｅｖｅ（Ｓｉｇｍａ）に通す。細胞懸濁液を１１００ｒｐｍ、15分間、室温で遠心分離する。上清は吸引され、ばらばらにされた細胞を１０ｍｌの栄養培地（以下を参照）に再懸濁した。線維芽細胞の培養は、細胞培養処理用フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の上でおよそ40,000ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 の濃度で開始された。
【００８９】
ｃ. ヒト真皮線維芽細胞の単離
筋膜は上述したように皮膚生検あるいは環状切除試料から遊離される。そして、皮膚は 0.5ｃｍ2 未満の小さな断片に切断される。組織を0.25％トリプシンで60分間、37℃でインキュベートする（あるいは、組織をトリプシンで18時間、４℃でインキュベートしてもよい）。解剖顕微鏡下で、真皮と表皮を分離する。真皮の線維芽細胞は、筋膜の線維芽細胞について以前に記述されたように単離される。
【００９０】
ｄ. ウサギの線維芽細胞の単離
方法は基本的に以前に記述されたとおりである。皮膚は、剃って、承認された方法で外科的に調整された殺菌溶液を用いて洗浄された領域から取られるべきである。
【００９１】
実施例２．線維芽細胞の培養
ａ. ヒトの線維芽細胞の培養
融合性(confluent) であるとき、最初のカルチャーは通常の方法でトリプシン処理され、およそ10,000ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 になるように蒔かれる。細胞を５％ＣＯ2 を含む湿らせた空気のもと37℃で培養する。ヒト線維芽細胞栄養培地（ＤＭＥＭ、ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅを含む高ｇｌｕｃｏｓｅ、10−15％子牛血清、20ｍＭ ＨＥＰＥＳ、20ｍＭ Ｌーｇｌｕｔａｍｉｎｅ、50ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ、10μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ ｓｕｌｆａｔｅを含んでいる）は１週間に２度交換する。
【００９２】
ｂ. ウサギ線維芽細胞の培養
細胞はトリプシン処理され、ヒト線維芽細胞について記述されているように培養する。ウサギ線維芽細胞栄養培地は20％子牛血清を含むＭＣＤＢ−１１０（Ｓｉｇｍａ）と調節された培地の１：１溶液で構成されている。調節された培地とは基本的に、２−３日集合培養で生育したウサギ線維芽細胞から取り除かれたヒト線維芽細胞栄養培地（15％子牛血清を含む）である。
【００９３】
実施例３．ヒト成長ホルモンおよびネオマイシン耐性遺伝子を持つプラスミド（ｐＸＧＨ 301 ）の構築
ｐＸＧＨ301 は二段階の方法で構築された。ｐＢＲ322 由来のＳａＩＩ−ＣｌａＩ断片（ｐＢＲ322 の23-651の位置）が単離され、そしてＳａＩＩ−ＣｌａＩ処理ｐｃＤ ＮＥＯの中へ挿入され、その結果ｐｃＤＮＥＯのＳＶ40初期プロモーター領域の上流にＢａｍＨＩ部位が導入された。このプラスミド、ｐＢＮＥＯをBamHI で消化し、ＳＶ40の初期プロモーターの支配下にあるｎｅｏ遺伝子を含む 2.1ｋｂの断片が単離され、ＢａｍＨＩで処理されたｐＸＧＨ5 に挿入された。ｎｅｏとｈＧＨ遺伝子はお互いに同じ方向に転写される、2.1 ｋｂ ＢａｍＨＩ断片の単一の挿入を持つプラスミドが単離された。このプラスミドはｐＸＧＨ301 と命名された（図３）。
【００９４】
実施例４．マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にあるヒトエリスロポエチン遺伝子を含むプラスミド（ｐＸＥＰＯ１）の構築
発現プラスミドｐＸＥＰＯ1 はマウスメタロチオネイン（ｍＭＴ）プロモーターにより転写を制御されているｈＥＰＯ遺伝子を持っている。ｐＸＥＰＯ1 は次のように構築される。プラスミドｐＵＣ19（ＡＴＣＣ＃37254）はＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩにより処理され、マウスメタロチオネインプロモーター〔Ｈａｍｅｒ, Ｄ. Ｈ. ａｎｄ Ｗａｌｌｉｎｇ, Ｍ., Ｊ . Ｍｏｌ . Ａｐｐｌ . Ｇｅｎ., 1:273-288（1982）。この断片はまた、ジーンバンクにより利用可能なｍＭＴの配列、即ち、ＭＵＳＭＴＩ、ＭＵＳＭＴＩＰ、ＭＵＳＭＴＩＰＲＭの解析からデザインされたＰＣＲプライマーを用いて、マウスゲノムＤＮＡより単離することが可能である。〕を含む 0.7ｋｂのＫｐｎＩーＢｇｌＩＩ断片にライゲーションされた。結果として得られたクローンはｐＸＱＭ2 と呼ぶ。
【００９５】
ｈＥＰＯ遺伝子は完全なｈＥＰＯ遺伝子を持ったバクテリオファージλのクローンから単離された。このバクテリオファージは、ヒトＳａｕ3 Ａ、つまり0.77ｋｂのヒト遺伝子を持つλベクターＬＡＭＢＤＡ ＤＡＳＨの中に構築された部分的なゲノムDNA ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングすることにより単離された。この0.77ｋｂの断片は以下に示されたプライマーを用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）によりヒトゲノムＤＮＡから増幅された。
【００９６】
ヒトＥＰＯ ＰＣＲプライマー：
オリゴ ｈＥＰＯ−１： ５’ＧＴＴＴＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ 1 ）（ジーンバンクのＨＵＭＥＲＰＡ配列の2214−2234の位置）
【００９７】
オリゴ ｈＥＰＯ−２： ５’ＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＣＣＴＧＴＧＡＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２）（ジーンバンクのＨＵＭＥＲＰＡ配列の2986−2967の位置）
【００９８】
増幅された断片、これはヒトＥＰＯ遺伝子のエキソン4 および5 を含んでいるが、放射標識され、そしてヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられた。完全なヒトＥＰＯ遺伝子を含む5.4 ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を持つファージは、公表されたＤＮＡ配列および制限酵素マッピングデータ〔Ｌｉｎ, ＦーＫ., ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ . Ｎａｔｌ . Ａｃａｄ . Ｓｃｉ . ＵＳＡ，82:7580-7584（1985）〕に基づいて完全な遺伝子を含んでいると仮定された。
【００９９】
4.8 ｋｂのＢｓｔＥＩＩーＢａｍＨＩ断片（ＢｓｔＥＩＩ部位はジーンバンクＨＵＭＥＲＰＡの配列の580 の位置であり、ＢａｍＨＩ部位はこの部位の4.8 ｋｂ3'側の位置にあり、シークエンスされた領域の外側にある）はバクテリオファージのクローンから単離された。精製された断片は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で処理して平滑末端化され、ＨｉｎｃＩＩで処理されたｐＸＱＭ2 へライゲーションされ、サブクローニングされたｍＭＴプロモーターの3'側に近接したｐＵＣ19に由来するポリリンカーに切り込む。取り除かれたＢｓｔＥＩＩ部位がｍＭＴプロモーターに隣接している、一つの配向性が制限酵素地図で同定され、ｐＸＥＰＯ１（図５）と命名された。
【０１００】
実施例５．顕微注入による一次ヒト線維芽細胞の安定なトランスフェクション
細胞の核へのＤＮＡの直接的な注入は、細胞を安定にトランスフェクトするための別の方法である。一次および二次ヒト包皮線維芽細胞がこの方法により安定にトランスフェクトされる可能性については既に報告されている。プラスミドＲＶ6.9 ｈ（Ｚｈｅｎｇ, Ｈ. ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ . Ｎａｔｌ . Ａｃａｄ . Ｓｃｉ . ＵＳＡ, 88 ： 18 8067-8071（1991））由来の8 ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ断片はゲル電気泳動および陰イオン交換カラム（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ. ）を通す事により精製された。（10μｇ／ｍｌ）のＤＮＡを外径0.1 μｍのガラス針を用いて一次あるいは二次ヒト包皮線維芽細胞に注入した。2,000 細胞への注入の後、41個のＧ４１８r のクローンが単離された（49の出発細胞中１個）。
【０１０１】
hGH 発現クローンもまた、顕微注入によって作成された。プラスミドｐＸＧＨ301 はＳｃａＩ処理（ｐＵＣ１２骨格の中のａｍｐr 遺伝子に１回切れ込みを入れる）により直線化され、陰イオン交換カラム（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ. ）を通すことにより精製され、外径０．１μｍのガラス針を用いて一次あるいは二次ヒト包皮線維芽細胞に注入された。2.5-20μｇ ｐＸＧＨ301 ／ｍｌの範囲で幾つかのＤＮＡ濃度が用いられた。2,100 細胞への顕微注入の後、20個のＧ418 耐性クローンが単離された（105 の出発細胞中１個）。Ｇ418 細胞の画分は、処理された全ての細胞のおよそ１％である。解析された10クローンの内の９個はｈＧＨを発現した。この実験で単離されたクローンのｈＧＨ発現の平均値は0.6 μｇ／10ｃｅｌｌｓ／24ｈｒであり、3 つのクローンはｈＧＨの長期的な発現を研究するために拡大された。3 つのクローンすべてｈＧＨを安定に発現しており、ｈＧＨは３つの株に対してそれぞれ33、44および73ｍｐｄで常に生産されている。
【０１０２】
上述された方法を用いて、例えばｐＥ3 ｎｅｏＥＰＯのような他のＤＮＡ構築物を持つ一次ヒト線維芽細胞の安定なトランスフェクションが得られるかも知れない。
【０１０３】
実施例６．外因性ＤＮＡおよび選択マーカー遺伝子による一次および二次線維芽細胞のエレクトロポーレーションを用いたトランスフェクション
対数増殖期あるいは初期定常期の線維芽細胞はトリプシナイズされ、栄養培地を用いてプラスチック表面から洗い流された。一定量の細胞懸濁液はカウントするために取り除かれる、そして、残りの細胞は遠心分離される。上清は吸引され、ペレットは5 ｍｌのエレクトロポーレーションバッファー（20ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ 7.3, 137 ｍＭ ＮａＣｌ, ５ｍＭ ＫＣｌ, 0.7 ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ，６ｍＭ ｄｅｘｔｒｏｓｅ）に再懸濁される。細胞は再び遠心分離され、上清は吸引され、細胞は１ｍｇ／ｍｌ アセチル化ウシ血清アルブミンを含むエレクトロポーレーションバッファーに再懸濁される。最終的な細胞懸濁液はおよそ３×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞を含んでいる。エレクトロポーレーションは再懸濁後すぐに行われるべきである。
【０１０４】
スーパーコイル状のプラスミドＤＮＡは0.4 ｃｍの電極のギャップを持った滅菌したキュベット（ＢｉｏーＲａｄ）に入れられる。最終ＤＮＡ濃度は一般に少なくとも120 μｇ／ｍｌである。0.5 ｍｌの細胞懸濁液（およそ 1.5×１０6 細胞を含んでいる）をその後キュベットに加え、細胞懸濁液とＤＮＡ溶液とを緩やかに混合する。エレクトロポーレーションはＧｅｎｅーＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏーＲａｄ）を用いて行われる。キャパシタンスおよび電圧はそれぞれ 960μＦ(Farads)および250-300 Ｖに設定される。電圧が上昇すると、細胞の生存数が減少するが、ゲノムの中に導入されたＤＮＡが安定に組み込まれている生存細胞のパーセンテージが劇的に上昇する。これらのパラメーターが与えられると、およそ14-20 ｍｓｅｃのパルス時間が観察されるだろう。
【０１０５】
エレクトロポーレーションされた細胞はおよそ５分間室温でインキュベートされ、そしてキュベットの内容物はその後滅菌されたトランスファーピペットで緩やかに取り除かれる。細胞は１０ｃｍの皿の中の１０ｍｌのあらかじめ暖められた栄養培地（上記のように15％の子牛血清を含んでいる）に直接加えれる。そして上述のように培養される。その翌日、培地は吸引され、そして10ｍｌの新鮮な培地と交換され、さらに16-24 時間培養される。その翌日、クローニング効率およびＧ418 耐性コロニーを選別するために細胞のサブカルチャーが行われる。細胞はトリプシン処理され、カウントされ、そして平板培養される。特に、線維芽細胞はクローニング効率の決定のためには103 ｃｅｌｌｓ／10ｃｍ ｄｉｓｈで培養し、G418選択のためには1-2 × 104 cells／10ｃｍ ｄｉｓｈで培養する。
【０１０６】
ヒト線維芽細胞は線維芽細胞栄養培地（15％子牛血清を含む）の中に300-400 μｇ／ｍｌのＧ418 （およそ50％の効力を示すＧｅｎｅｔｉｃｉｎ, ｄｉｓｕｌｆａｔｅ ｓａｌｔ; Ｇｉｂｃｏ）を含む培地でＧ418 耐性の選択をする。クローニング効率はＧ418 の非存在下で確かめられた。培養された細胞は12−14日間インキュベートされる。そしてその時細胞はホルマリンで固定され、ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔで染色され、カウントされ（クローニング効率プレート）あるいはクローニングシリンダーを用いて単離される（Ｇ418 プレート）。ウサギ線維芽細胞のエレクトロポーレーションおよび選択は選択条件を除いてヒト線維芽細胞について記述されたのと基本的に同じように行われる。ウサギ線維芽細胞は1 ｍｇ／ｍｌのＧ418 を含む培地で選択される。
【０１０７】
線維芽細胞は新鮮な切除されたヒト包皮から単離された。カルチャーはＤＭＥＭ＋10％子牛血清の中に50,000ｃｅｌｌｓ／ｃｍになるように蒔かれた。カルチャーが融合性(confluent) になったとき、線維芽細胞はトリプシン処理することにより集められ、エレクトロポーレーションによりトランスフェクトされた。トランスフェクト条件はプラスミドｐｃＤＮＥＤを用いたトランスフェクションにより評価された。ほぼ最適な条件（エレクトロポーレーション電圧が250 ボルトでキャパシタンスが 960μＦ(Farads)でプラスミドｐｃＤＮＥＯが60μｇ）での典型的なエレクトロポーレーション実験の結果、処理細胞588 個につきＧ418 コロニー１個（全ての処理細胞のうち0.17％）、あるいは71のクローン化可能な細胞につきＧ418 コロニー１個が得られた(1.4％）。
【０１０８】
９回の別々のエレクトロポーレーション実験が至適条件付近（エレクトロポーレーション電圧が300 ボルトでキャパシタンスが 960μＦの設定においてプラスミドｐｃＤｎｅｏが60μｇ）で行われ、平均して、1,899 個の処理細胞につき一つのＧ418 コロニーが観察され（0.05％）、これは、処理細胞の1/882 から1/7,500 の範囲であった。これは平均して、38個のクローン化可能細胞あたり一つのＧ418 コロニーに相当する(2.6％）。
【０１０９】
低いパッセージ(low passage) の一次ヒト線維芽細胞をプラスミドｐｃＤＮＥＯおよびｐＸＧＨ5 を用いたコトランスフェクションによりｈＧＨ発現細胞へ変換した。典型的には、二つのプラスミドの等モル数の混合液60μｇが至適条件（エレクトロポレーション電圧300 ボルト、キャパシタンス960 μＦａｒａｄｓ）付近でトランスフェクトされた。このような実験の結果、処理細胞14,705につきＧ418 コロニーは一つであった。
【０１１０】
これらおよび同一のトランスフェクション条件で単離された他の細胞についてのｈＧＨ発現データは以下に要約されている。最終的に全Ｇ４１８r コロニーの98％が集団培養するために広げることが可能であった。
【０１１１】
解析されたＧ４１８r コロニーの数 154
Ｇ４１８r ／ｈＧＨ発現コロニーの数 65
ｈＧＨ発現の平均レベル 2.3 μghGH／106Cells／24hr
hGH 発現の最大レベル 23.0μghGH／106Cells／24hr
【０１１２】
安定なトランスフェクタントはまた、ｎｅｏおよびｈＧＨ遺伝子が同一のプラスミド分子（実施例３）に存在しているＤＮＡ構築物である、ｐＸＧＨ301 を用いた一次又は二次ヒト線維芽細胞のエレクトロポーレーションにより作製されている。例えば、1.5 ×106 細胞が60μｇのｐＸＧＨ301 を用いて300 ボルト、960 μＦａｒａｄｓでエレクトロポーレーションされた。Ｇ418 耐性コロニーはトランスフェクトされた二次線維芽細胞から単離され、その頻度は 1.5×10個の処理細胞のうちＧ418 耐性コロニーが652 であった（2299処理細胞につき１個）。これらのコロニーのおよそ59％がｈＧＨを発現した。
【０１１３】
実施例７．選択が存在しない状態でのトランスフェクタントの単離
プラスミドｐＸＧＨ５を用いた一次線維芽細胞の安定なトランスフェクションは、レシピエント線維芽細胞が周囲の培地中にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を分泌できるようにする。したがってｈＧＨ（あるいは他の発現蛋白質）に対するラジオイムノアッセイは、選択マーカーと選択試薬の使用に代わる単純かつ迅速なトランスフェクタント検索法として用いる事ができる。加えて遺伝子の発現を全く必要としないＰＣＲのような検索法を用いることにより外来ＤＮＡの安定な組み込みの真の頻度を決定する事も可能であろう。
【０１１４】
以下に述べる実験結果より、コトランスフェクトさせた(cotransfected) プラスミドによる選択なしで安定にｈＧＨを発現するトランスフェクタントを、実際に分離できることが示された。これらの実験は一次ヒト包皮線維芽細胞および一次ウサギ皮膚線維芽細胞で成功している。安定な発現トランスフェクタントの頻度は約１０コロニーに一つであった。
【０１１５】
１． ヒト包皮組織
新たに組織から分離された約２．０×１０6 個の細胞は３００Ｖ、９６０μＦａｒａｄｓの条件で６０μｇのｐＸＧＨ５を用いてエレクトロポーレートした。細胞は温めておいた１０ｍｌの培地を含む１００ｍｍ組織培養皿にすばやく蒔き、加湿した５％ＣＯ2 大気中３７℃で培養した。トランスフェクション２日後に５×１０3 個の細胞を２４穴クローニングプレート（Bellco Glass Co.）で継代培養した。２４穴プレートのそれぞれの穴は１６の、より小さな穴を含んでいる（３８４穴／プレート）。８日後、大きい２４穴中１０穴についてラジオイムノアッセイによりｈＧＨの発現を検索した。１０穴全てが有意なｈＧＨ発現を示した。培地を吸引し新しい培地に交換し、２４時間後にｈＧＨを測定した。１０穴ともすべて、ｈＧＨを再び発現していた。この時点で１０穴それぞれのコロニー数をカウントした。大きな穴あたり平均１１．５コロニーであった。もし、１穴あたり最低１個の安定なトランスフェクタントがあるとすれば、トランスフェクション頻度の最下限はクローニング可能(clonable)細胞の約８〜９％と計算できる。
【０１１６】
大きい穴の中の小さな１６穴それぞれの個々のコロニーはトリプシン処理され、９６穴プレートの１６穴に移された。３日後にそれぞれの穴でｈＧＨ発現を測定した。１６穴のうちの１つは、ｈＧＨを発現している細胞を含んでいることが分かった。この穴の細胞を培地に広げた。これらの細胞、ＨＦ２６−１９Ｍは４２mpd まで培養後、２６０ng／１０6 cells ／２４hrのｈＧＨを生産した。
【０１１７】
上記の実験は他の一次ヒト包皮線維芽細胞培養物を用いてくりかえされた。この実験からｈＧＨを発現する二次クローンが単離された。２４mpd まで培養後、この細胞ＨＦ２４−ＧＨｌは、６０ngｈＧＨ／１０cells ／２４hrのｈＧＨを生産した。ｈＧＨ生産は細胞が４５mpd になるまで続け、その時点で細胞を凍結した。トランスフェクション頻度の下限は最初の実験とほぼ同じ（クローニング可能(clonable)細胞の６〜７％）であった。
【０１１８】
２．一次ウサギ線維芽細胞
一次ウサギ皮膚細胞はｐＸＧＨ５でトランスフェクトされた。エレクトロポーレーションの条件は上記のヒト組織エレクトロポーレーションに従った。１×１０3 個の細胞を３８４穴プレート中で継代培養した。七日後、大きい２４穴中１０穴についてｈＧＨの測定を行った。１０穴中９穴でｈＧＨが発現されていた。これらのうちの一つを選んでコロニーを単離した。この穴は小さい１６穴に分散した９コロニーを含んでいた。小さな１６穴それぞれに入っている細胞をトリプシン処理し、９６穴プレートの１６穴に移した。引き続いてのｈＧＨ測定では、１６穴中の１つでｈＧＨが発現していることが示された。このクローンを培地に広げた。ｈＧＨの生産は３５mpd まで培養後で５８ng／１０cells ／２４hrであった。この実験で算出されるトランスフェクト頻度は総計９コロニー中、ｈＧＨ発現が１コロニーであった（１１％）。
【０１１９】
実施例８．トランスフェクト一次ヒト皮膚線維芽細胞由来の細胞株による長期間 in vitro ｈＧＨ生産
線維芽細胞は、新たに切除されたヒト皮膚線維芽細胞から単離し、１０％の仔牛血清を含むＤＭＥＭ中で培養した。ｐｃＤＮＥＯ及びｐＸＧＨ５の等モル混合物６０μｇでエレクトロポーレーション〔２５０Ｖ，９６０μＦ(Farads)〕を行い、処理された細胞はＧ４１８を含む（３００μｇ／ｍｌ）培地中で選択した。コロニーは単離され、常法に従い広げ、得られた一次細胞株は、培養中の時間の関数としてのｈＧＨ発現の安定性をモニターするため、繰り返し継代培養した。そういった２つの種、ＨＦ９６−１１及びＨＦ９６−２３から得られたデータを図９に示した。細胞は１０％の仔牛血清を含むＤＭＥＭ中、低レベルのＧ４１８（７５μｇ／ｍｌ）で保持し、接種密度１００００ｃｅｌｌ／ｃｍ2 で継代培養した。培養液は細胞の植え継ぎ(passaging) のための採取に先立つこと２４ｈｒで交換した。植え継ぎ時には培養液の適当量をｈＧＨ測定のために除去し、それから細胞を回収し、計数し、再び接種した。培地中のｈＧＨ濃度は市販されるイムノアッセイを用いて測定した。ｈＧＨレベル（μｇ／１０6 ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒで示した）は９〜２８代の種々の培養継代数に対してプロットした。これらのアッセイの結果は、この長期にわたるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養期間（例えば、２つの異なる株から得られたデータは、ＨＦ９６−１１が第２８代で６９ｍｐｄに達し、一方でＨＦ９６−２３が第２７代で７６ｍｐｄに達していることを示している）を通して、ｈＧＨ発現が著しく一定に保持されることを示している。
【０１２０】
実施例９．トランスフェクトされた一次及び二次ウサギ皮膚線維芽細胞から得られた細胞株による長期間 in vitro ｈＧＨ生産
線維芽細胞は新たに切除されたウサギ皮膚から単離し、１０％の仔牛血清を含むＤＭＥＭで培養した。ｐｃＤＮＥＯ及びｐＸＧＨ５の等モル混合物６０μｇでエレクトロポーレーション（２５０Ｖ，９６０μＦ）を行い、処理された細胞はＧ４１８を含む（１ｍｇ／ｍｌ）培地中で選択した。コロニーはクローニングシリンダーを用いて単離され常法に従い広げ、得られた一次細胞株は、培養中の時間の関数としてのｈＧＨ発現の安定性をモニターするため、繰り返し継代培養した。そのようなうちの一種、ＲＦ４０／１−３から得られたデータを図１０に示した。ＲＦ４０／１−３細胞は選択不在下でウサギ線維芽細胞栄養培地中で保持され、接種密度１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 で継代培養した。培養液は細胞の継代培養のための回収に先立つこと２４ｈｒで交換した。継代時には培養液の一定量をｈＧＨ測定のために除去し、それから細胞を回収し、計数し、再び接種した。培地中のｈＧＨ濃度は市販されているイムノアッセイ（Ｎｉｃｈｏｌｓ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて測定した。ｈＧＨレベル（μｇ／１０6 ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒで示した）はそれぞれおよそ２８〜８４の培養平均倍加（ｍｐｄ）レベルにあたる４、８、１０、１３、１６、１９、２２代の培養継代数に対してプロットした。これらのアッセイの結果は、この長期にわたるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養期間を通して、ｈＧＨ発現が著しく一定に保持されており、実質的に約２０ｍｐｄで観測されるレベル（４７μｇ／１０6 ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒ）に等しい。
【０１２１】
実施例１０．マウスにおけるヒト成長ホルモンの長期発現
ヌードマウスは、遺伝子工学的な操作を受けた細胞の組織移植が治療上有益なタンパク質を動物の体循環に送達する能力を研究するうえで貴重な系をもたらしている。これらの動物は、他に比べて免疫不能(immune-incompetence) であるのである種の一次及び二次ウサギ線維芽細胞を長期にわたってｉｎ ｖｉｖｏで生存させ得ると考えられている。
【０１２２】
腎下部皮膜への細胞の移植のためにマウスはＡｖｅｒｔｉｎ（２％ｗ／ｖ ２．２．２−トリブロモエタノール、２％ｖ／ｖ２−メチル、２−ブタノールの溶液）を０．０１７ｍｌ／ｇ体重の割合で腹腔注射される。腎臓（一般には左腎臓）は肋骨の下約３ｍｍにつくられた８〜１０ｍｍの切開部を通して操作する。皮膚、腹筋、腹膜及び腎側筋膜を腎臓を露出させるために後退(retract) させた。小さな鉗子を用いて腎臓を腹腔から取り出す。２７ゲージの皮下注射針が腎皮膜に小さな開口部を作るのに用いられる。２０ゲージのＩ．Ｖ．カテーテルを用いて移植されるべき細胞（一般に５〜１０μｌの容積中に３００万個の細胞）は１ｍｌシリンジに吸い込まれ、腎皮膜の下にゆっくりと注入される。細胞がその腎被膜の開口部から遠くへ放出されるように注意する。切開部はステープル一つで筋肉及び皮膚を通して縫合される。軽麻酔がかかるまでメトキシフランをいれた大きなビーカーにネズミをいれた後、血を採取した。眼窩腔から血液を採取するためにパストゥールピペットの先端を眼と眼窩周辺部位の間に入れた。血清のｈＧＨレベルは市販されているキット（Ｎｉｃｈｏｌ’ｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて測定した。
【０１２３】
我々の最初の実験では、５００万個のトランスフェクトウサギ線維芽細胞（ＲＦ２０−１１）をヌードマウスに移植した。このマウスは一年間、その血清中に検出可能なｈＧＨを示していた。発現の経時変化を以下に示す。
【０１２４】
Figure 0003733110
【０１２５】
さらにマウスに９６μｇ／１０ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒを発現するウサギ線維芽細胞株（ＲＦ４０／１−３）を移植したより大規模な実験が行われた。この実験の結果は図１１に示す。バーは標準誤差を示し、Ｎはそれぞれの時点で採取されたマウスの数を示している。これらの結果から、平均血清ｈＧＨレベルが１４カ月以上も比較的一定を保っており、移植以来平均１〜３ｎｇ／ｍｌであることが示される。この期間中に渡って移植細胞に起因するどのようなタイプの副作用も観測されなかった。
【０１２６】
実施例１１．腎下部被膜移植組織由来のｈＧＨ生産細胞の再培養
移植細胞の生存能力のストリンジェント(stringent) テストは、動物から切除してｉｎ ｖｉｔｒｏで再培養した際に、生育し、移植前の性質を示す能力とした。２４．５μｇ／１０6 ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒを発現するＲＦ４０／１−３細胞（３×１０6 ｃｅｌｌｓ／マウス）をヌードマウスの腎下部被膜の下に移植した。これらの細胞は移植前に培地中で４９ｍｐｄを示していた。ｉｎ ｖｉｖｏで５又は１０週間経過後、動物を屠殺し腎臓を回収し、移植組織近傍の細胞（腎臓表面で明白に見える）を顕微切除した。得られた組織をスケールダウンした標準的な酵素的細胞分散法（実施例６）にかけ、単一細胞懸濁物(single cell suspension)をＧ４１８を含む培地にいれた。細胞培養のデータは移植後５週のマウス由来の再培養組織５つと移植後１０週のマウス由来の再培養組織４つから得られた。回収された細胞は培地中で１９ｍｐｄまで増殖させ、そしてｈＧＨレベルを、培地に移した後約１０日から約５０日間の範囲の様々の時点で分析した。これらの実験結果を図１２に示した。図１２のそれぞれの点は少なくとも独立した４つの回収(recovery)試験の平均（標準偏差を含む）を示している。５週および１０週の移植組織の両者の実験において、ｈＧＨを高レベルで発現するＧ４１８r 細胞が回収され、ｈＧＨ発現はｉｎ ｖｉｔｒｏでの１９回の回収後の倍加の間に渡って比較的安定であった。
【０１２７】
実施例１２．トランスフェクトされた自己由来細胞を移植したウサギでのヒト成 長ホルモンの発現と高力価の抗ｈＧＨ抗血清の生産
自己移植遺伝子治療実施のためのすべての技術的・論理的要求を探求する実験がウサギで行われている。最初に皮膚生検資料を８匹の生きているウサギから採取する。皮膚線維芽細胞を単離して一次培養した。ｉｎ ｖｉｔｒｏで一継代後、ｐＸＧＨ３０１またはｐＸＧＨ５とｐｃＤＮＥＯでトランスフェクトした。Ｇ４１８耐性クローンを単離しｈＧＨ発現について分析した。１０μｇ／１０6 ｃｅｌｌｓ／日より大を発現するクローンをローラーボトルに広げた。最終的に各クローンの細胞をローラーボトルから回収し、皮膚生検のドナーとして用いられた同一のウサギにＳＲＣ細胞移植またはＩＰ注入するために調製した。
【０１２８】
ウサギ皮膚線維芽細胞を単離するため、沈静に達するまでウサギに塩酸ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ体重）および塩酸キシラジン（５ｍｇ／ｋｇ体重）の筋肉内注射により麻酔をかける。動物は一部、例えば右骨盤関節上部などを刈り込み、常法を用いて外科手術の準備をする。卵形のパッチを作るように背部と腹部でつながる２つの弓形の切開部を約３ｃｍ離して作る。鋸歯状鉗子を用いて表皮を除去し、小鋏でその下の筋膜を除去する。表皮と筋膜を培地中に移し、切開部を３−０ナイロン縫合糸で縫合する。ウサギは回復のため温床上に移す。筋膜線維芽細胞は、実施例１、２及び４で述べるように、培養、トランスフェクトされ、選択される。
【０１２９】
腎被膜内へ細胞を移植するため、上記の通りにウサギに麻酔する。動物は右側面の横臥位に置き、左肋骨下側を露出させる。動物は剃られ、承認された方法に従って準備をした。１２番目の肋骨の下約２ｃｍの所の背腹部の６ｃｍの切開部を通して左腎臓に到達した。切開部を腹筋、腹膜、腎周囲の脂肪・筋膜まで貫通させる。バルフォア開創器を用いて腹部切開口を保持し、腎周囲の脂肪と筋膜の切除を行なう。１１ゲージの手術刀を用いて腎臓被膜表面に２〜３ｍｍの切開口を作る。２０ゲージのＩ．Ｖ．カテーテルを用いて移植細胞（一般に１６５〜６６０μｌ中に１〜２億個の細胞）を１ｍｌシリンジにいれ、ゆっくりと腎被膜下部に注入する。腎被膜の開口部から遠位に細胞が放出されるように注意する。腹膜口は３−０可吸着性クロミック縫合糸(adsorbable chromic gut)を用いて腹膜および腹筋を縫合して閉じる。皮膚は３−０ナイロン縫合糸と滅菌ガーゼ絆創膏で縫合し、抗生物質(Bactrin) を傷口につける。ウサギは回復のため暖めたパッド上に移す。全身性抗生物質(Tribrissin)を皮膚生検および移植の後に投与する。腹膜内（ＩＰ）経路で細胞を導入するため、細胞（３．５〜５．５ｍｌ中に７〜１１億個）を２２ゲージの注射針で注入する。２２ゲージの注射針を用いて検体動物(restrained animals)の中耳動脈から血液を採取する。
【０１３０】
ｈＧＨ発現レベルおよび動物に導入した細胞数についての関連情報を表１にまとめる。８匹すべての動物で血清ｈＧＨレベルが容易に検出可能であった。１４日目までにどの動物のｈＧＨも検出されなくなった。これらの動物血清中からの最終的なｈＧＨの消失は予期されていた、というのはヒト成長ホルモンはウサギにとって抗原となることが知られているからである。したがって血清サンプルは抗ｈＧＨ抗体についてアッセイした（抗ウサギＩｇＧのＥＬＩＳＡによって定量される）。それぞれの場合において、血清ｈＧＨレベルの減少は抗ｈＧＨ抗体の増加に一致している。
【０１３１】
【表１】
Figure 0003733110
【０１３２】
これらの結果から、トランスフェクトされた皮膚線維芽細胞を用いたウサギでの自己由来遺伝子治療を行うために技術的障壁がないであろうことが示された。遺伝子工学的に修飾された自己由来細胞によるｈＧＨ供給が８匹の実験動物すべてで成功した。予想されたように、血清ｈＧＨレベルは、抗ｈＧＨ抗体の増加に従って減少した。高力値（１：４００００）はＩＰまたはＳＲＣを移植した動物ではまれではなく、このことは１回の移植処置による持続的なタンパク質供給が、脊椎動物の予防接種やタンパク質抗原に対する高力価抗体の生産のための効率的な手法となり得るという提案と一致している。
【０１３３】
実施例１３．トランスフェクトヒトとウサギの二次皮膚線維芽細胞によるインビトロでの hEPO の生産
１． ヒト皮膚線維芽細胞
線維芽細胞は新しく切り出されたヒト皮膚線維芽細胞から分離され、そしてDMEM + 15%牛血清中で培養された。60μg のpcDNEOとpXEPO1の等モル混合物とのエレクトロポレーション（250 ボルト、960 μファラッド）は１継代細胞で行われ、そして処理された細胞はG418を含む培地（300 μg/ml G418 ）で選択された。コロニーは単離され、標準的な方法を使って広げられた。56の個々のクローンの分析から由来したデータは表2 に示されている。細胞はDMEM + 15%牛血清中のG418中（300 μg/ml G418 ）に保持され、そして10,000細胞／ｃｍ2 の接種密度で植えつがれた。培養培地は継代のために細胞が採取される24時間前に変えられた。継代の時には、培養培地の部分はhEPO分析のために除かれ、そして細胞はそれから採取され、数えられ、再び植え継がれた。培地中のhEPO濃度は商業的に利用できるＥＬＩＳＡ(R & D systems）を用いて決定された。hEPO濃度はmU／106cells／24hrとして表され、そして発現レベルは69から55,591mU／106cells／24hrに広がり、全G418耐性コロニーの19% が検出できる濃度のhEPOを発現した。
【０１３４】
【表２】
Figure 0003733110
【０１３５】
pcDneoとpXEPO1を同時にトランスフェクションすることにより分離されたヒト線維芽細胞由来のクローンの、分泌されたhEPOのグリコシル化の状態の分析がされた。培地がhEPO生産細胞からあつめられ、そしてヒトエリスロポエチンに特異的なマウスモノクローナル抗体(Genzyme Corporation）を用いて免疫沈降された。免疫沈降された物質は12.5％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され、そしてPVDF膜（Milipore）に写された。膜は免疫沈降に用いた同じ抗hEPOモノクローナル抗体を用いて調べられ、次にHRP 結合ヒツジ抗マウスIgG 抗血清（Cappel）を用いて処理され、その後hEPOを蛍光産物の生産を通して目に見えるようにするために発光検出（ECL Western blotting detection kit, Amershan）を行った。
【０１３６】
pEXPO1とpcDNEOを同時にトランスフェクションした正常ヒト線維芽細胞によって分泌されたhEPOのウエスタンブロット分析はヒトエリスロポエチンに特異的な抗体と反応する、およそ34kdの分子量を持つ分子であることを証明した。これは、本来存在する完全にグリコシル化されたヒトエリスロポエチンの予想されている大きさである。
【０１３７】
トランスフェクションされたヒト線維芽細胞クローンによって生産されたヒトエリスロポエチンについて、尿から単離される天然ヒトエリスロポエチン又はチャイニーズハムスター卵巣細胞によって生産された組換えhEPOのN-とO-結合グリコシル化の両方の性質を持つかどうか決定するために分析された。ウエスタンブロット分析はpXEPO1とpcDNEOを同時にトランスフェクションした正常ヒト線維芽細胞のクローン株からの上清上で行われた。上清のサンプルは、最初にエンドグリコシダーゼ−Ｆ(New England Nuclear）、ノイラミニダーゼ(Genzyme）あるいはＯ−グリカナーゼ（Genzyme ）を用いて処理された。エンドグリコシダーゼ−Ｆを用いた処理で分子量が34kdから約27kdへのシフトを生じた。ノイラミニダーゼを用いた処理ではかろうじてバンドの位置のわかるシフトを生じ、一方Ｏ−グリカナーゼを用いた処理は免疫反応バンドの大きさが約18.5kdに下がるという大きなシフトを生じた。これらの結果より、尿から分離された天然のヒトエリスロポエチンあるいはチャイニーズハムスター卵巣細胞によって生産された組換えhEPOと得られたそれらとは区別できない〔ブラウンら、（Browne, J. K. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:693-702(1986)〕。
【０１３８】
２． ウサギ線維芽細胞
線維芽細胞は新しく切り出されたウサギ皮膚から分離され、そしてDMEM 10%牛血清で培養された。60μg のpcDNEOとpXEPO1の等モル混合物を用いたエレクトロポレーション（250 ボルト、960 μファラッド）が行われ、そして処理された細胞はG418を含むウサギ線維芽細胞成長培地（１mg/ml G418；実施例２）中で選択された。コロニーは分離され、標準的方法を用いて広められ、そして生じた二次細胞株のhEPO発現を分析された。49の個々のウサギ線維芽細胞クローンから由来したデータは表３に示す。これらのクローンの発現レベルは43から 2,900,000mU／106 細胞／24時間範囲で、全G418耐性クローンの72% が検出できる濃度のhEPOを発現した。
【０１３９】
【表３】
Figure 0003733110
【０１４０】
実施例１４．ヒト EPO 遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子の両方を持つプラスミドの構築
HPRT配列〔(Genbank entry HUMHPRTB,エドワーズら(Edwards, A et al.), Genomics, 6:593-608(1990)〕内でHPRT遺伝子のエキソン２および３を含む11,960から18,869の位置に広がっている6.9 kbのHindIII 断片がpUC12 のHindIII 部位にサブクローニングされる。生じたクローンはHPRT遺伝子断片のエキソン３内の唯一のXhoIの部位で切断され、そしてpMC1NEO(Stratagene）からのneo 遺伝子を含む1.1 kbのSalI-XhoI 断片が挿入され、エキソン３のコーディング配列を壊す。１方向つまりneo 転写の方向を持ちHPRT転写とは反対方向を持つ物が選ばれ、pE3Neoと名付けられた。pE3neoはHPRT配列とneo 遺伝子の５’側の結合部位に唯一のXhoI部位を持つ。pE3neoはXhoIで切られ、大腸菌DNA ポリメラーゼのクレノウ断片を用いて処理されることにより平滑末端にされる。
【０１４１】
neo 選択プラスミドpE3Neo内にhEPO遺伝子を挿入するためにプラスミドpXEPO1（実施例３；図５）から5.1 kbのEcoRI-HindIII 断片が分離された。EcoRI 部位はmMT プロモーターの５’側の隣に位置しており、HindIII 部位は5.1 kb離れたhEPOコーディング領域の３’側にある。精製された断片は大腸菌DNA ポリメラーゼのクレノウ断片を用いて処理されることによって平滑末端にされ、上で述べたXhoI消化され、そして平滑末端のされたpE3neo断片につなげられる。大腸菌への形質転換の後、pE3neoに挿入された1 コピーのmMT-hEPO断片を持つプラスミドは隣接するneo 遺伝子と同じ方向にhEPO遺伝子が転写されることを制限酵素分析によって確認された。このプラスミドはpE3neoEPO と名付けられた。hEPOを発現するG418r クローンの直接選択ができることに加えて、この断片はヒトHPRT位へhEPO遺伝子を組み込みさせるためのジーンターゲティングの際にも用いられるだろう。
【０１４２】
実施例１５．hEPO 遺伝子と選択マーカー（ pE3neoEPO ）を発現するヒト線維芽細胞クローンの分離
線維芽細胞は新しく切り出されたヒト皮膚線維芽細胞から分離され、そしてDMEM + 15%牛血清中で培養された。60μg のスーパーコイル化された(supercoiled)pE3neoEPOを用いたエレクトロポレーション(250ボルト, 960 μファラッド）は一継代細胞で行われ、そして処理された細胞はG418を含む培地（300 μg/ml G418）で選択された。コロニーは分離され、標準的な方法で広げられた。26の個々のクローンの分析に由来するデータは表４に示されている。細胞はDMEM + 15 ％牛血清中のG418中（300 μg/ml G418）で保持され、接種密度10,000細胞／ｃｍ2 で植えつがれた。培養培地は継代のために細胞を採集する24時間前に変えられた。継代の時、培養培地の一部分はhEPO分析のために取り除かれ、それから細胞は採集され、数を測定され、そして再び植え継がれた。培地中のhEPO濃度は商業的に利用できるＥＬＩＳＡ(R and D systems）を用いて決定された。hEPO濃度は mU hEPO／106 細胞／24時間としてあらわされ、そして発現レベルは240 から961,620 mU／106 細胞／24時間の範囲であった。全G418耐性クローンの89％が検出できる濃度のhEPOを発現した。
【０１４３】
【表４】
Figure 0003733110
【０１４４】
hEPOを発現するヒト線維芽細胞クローンは60μg のHindIII 消化したpE3neoEPO を用いたエレクトロポレーションによっても分離される。hEPOを発現するウサギ線維芽細胞クローンはウサギ線維芽細胞クローンが１mg/ml G418を含むウサギ線維芽細胞成長培地（実施例２）で選別されるのを除いて、全く同じトランスフェクションの条件でプラスミドpE3neoEPO を用いて分離される。
【０１４５】
実施例１６．生物学的に活性なヒトエリスロポイエチンのマウス中での発現
マウスは、動物の一般循環系で治療学的に有用なタンパク質を供給する能力を持つ、遺伝子学的に修飾された細胞の移植の研究において貴重な系をもたらしている。ヌードマウスの相対的な免疫不全は外来の移植が生物学的機能を保持するのを許し、特定の一次及び二次ウサギ線維芽細胞を長期にわたってインビボで生存させ得るかもしれない。
【０１４６】
腎下部皮膜への細胞の移植のためにマウスはアベルチン(Avertin) を０．０１７５ｍｌ／ｇ体重の割合で腹腔注射する。腎臓（一般には左腎臓）は肋骨の下約３ｍｍにつくられた８〜１０ｍｍの切開部を通して操作する。皮膚、腹筋、腹膜及び腎側筋膜を腎臓を露出させるために萎縮させた。小さな鉗子を用いて腎臓を腹腔から取り出す。２７ゲージの皮下注射針が腎皮膜に小さな開口部を作るのに用いられる。２０ゲージのＩ．Ｖ．カテーテルを用いて移植されるべき細胞（一般に５〜１０μｌの容積中に３００万個の細胞）は１ｍｌシリンジに回収され、腎皮膜の下にゆっくりと注入される。細胞が腎皮膜の開口部から遠く放出される事に注意が払われる。切開部は一本の繊維(staple)で筋組織及び皮膚を通して縫合される。軽い麻酔がかかるまでメトキシフランをいれた大きなビーカーにネズミをいれた後、血を採取した。眼窩腔から血液を採取するためにパスツールピペットの先端を眼窩周辺部位の間に入れる。血清ｈＥＰＯレベルは商業的に利用可能なキット(R and D Systems) を用いて決定される。血液の部分もヘマトクリットレベルを決定するためにＥＤＴＡで覆った毛細管（Ｓｔａｔｓｐｉｎ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）に吸い込まれる。
【０１４７】
ウサギ皮膚線維芽細胞のクローン株は実施例１３で述べられた方法によって分離された。ＲＦ１１５−Ｄ４と名付けられたあるクローンではヒトＥＰＯ遺伝子が安定してトランスフェクションされていると決定され、そしておよそ７８６，０００ｍＵ ｈＥＰＯ／１０6 細胞／２４時間発現された。３００万の細胞が６匹のヌードマウスの腎下部皮膜に１５づつ移植された。およそ４００μｌの血液が移植後１日目と７日目に吸い取られ、そしてその後は２１日目まですべての日に吸い取られた。この期間の低張性ショックを防ぐために採血の後塩溶液が等量注射された。血液はその後６３日目間で週ごとに吸い取られた。同じ採血スケジュールが細胞移植していない１０匹のマウスに用いられた。図１３ａは一般に赤血球数の指標として用いられている血液ヘマトクリット（ＨＣＴ）に対するこれらの処置の作用が示されており、移植及びコントロール動物について測定されている。コントロール動物においてはＨＣＴは７日目までには急激に落ちて、その後１５日目までに大体普通のレベルに戻る。対してｈＥＰＯ発現細胞の移植を受けた動物は７日目までに高いＨＣＴレベルを示した。ＨＣＴは６３日目まで高いままで、移植後３５日目には１日目のレベルの４５％よりも１．４倍高い６４％のピークに達する。図１３ｂに示されているように、免疫反応性(immunoreactive)ｈＥＰＯは移植された動物の血液中で簡単に検出できた（キットの製造元によってｈＥＰＯ ＥＬＩＳＡの感度性は２ｍＵ／ｍｌであると決められており（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）、そしてＥＬＩＳＡキットで使われている抗体と内因性のマウスＥＰＯは交差反応を示さない）。移植された動物のｈＥＰＯレベルは移植後７日目から６３日目までに２９から９ｍＵ／ｍｌまで徐々に落ちた。
【０１４８】
本実施例は、ｈＥＰＯを発現し分泌するために遺伝的に処理された普通の皮膚線維芽細胞は、１）インビボで生存して２か月間まで動物の全身循環系にｈＥＰＯを供給することができ、そして２）生産されたｈＥＰＯは生物学的に機能し、しばしば採血されるコントロール動物に観察されるヘマトクリット値の低下を防止するために働き、コントロールの動物では貧血反応を生じる採血スケジュールを試されたときでさえ、最終的にＨＣＴの増加を生じるという事をはっきりと証明した。
【０１４９】
実施例１７．GLP-1(7-37 ）発現プラスミドをトランスフェクションした後の二次ヒト皮膚線維芽細胞株からの GLP-1(7-37 ）の発現
GLP-1 の７から37のアミノ酸残基の部分〔GLP-1(7-37);Genebank sequence HUMGLUCG２において7214から7306の塩基対によってコードされている〕はインビボでインスリノトロピン活性を持つことが証明された。プラスミドpXGLP1は、GLP-1(7-37) の部分が、そのＮ末端において、小胞体を通しての運搬を効果的にするためにヒト成長ホルモン由来の26アミノ酸のシグナルペプチドと融合するように構築される。この融合タンパク質は、分泌前に、分泌産物がＧＬＰ−１の７−３７残基のみから構成されるように、残基２６のすぐＣ末端側が切断される。シグナルペプチドの発現：GLP-1(1-37) 融合タンパク質はマウスメタロチオネインプロモーターによってコントロールされる。
【０１５０】
プラスミドpXGLP1は次のように構築される：プラスミドPXGH５〔Selden, R. F., Mol. Cell. Biol. 6:3173-3179(1986) 〕がSmaIで消化され、BgIII 部位を含む2 本鎖のオリゴヌクレオチド（BgIII linkers;New England Biolads ）につなげられる。つなげられた産物はBgIII とEcoRI で処理され、そしてヒト成長ホルモン遺伝子の３’側の翻訳されない領域に相当する0.32kbの断片が分離された（Genbank entry HUMGHCSAの6698位のSmaI部位にBgIII linkerを持つ）。hGH 断片も、Genbank entry HUMGHCSAの6698から7321の間を増幅するために設計されたPCR プライマーを用いてヒトゲノムDNA から既知の方法で分離された。マウスメタロチオネイン（mMT ）プロモーター〔Harmer, D. H. and Walling, M. J. Mol. Appl. Gen., 1:273-288(1982)〕を含む1.45のEcoRI-BgIII 断片が次に分離された。マウスメタロチオネインプロモーターは、マウスゲノムDNA から、Genbank から利用できるmMT 配列（すなわち Genbank entires MUSMTI, MUSMTIP, MUSMTIPRM)の分析から設計されたPCR プライマーを用いて、既知の方法で分離された。プラスミドpUC19 （ATCC＃37254）がEcoRI で切断され、細菌アルカリフォスファターゼを用いて処理された。処理されたプラスミドは上で述べられたhGH やmMT 断片に繋げられた。生ずるプラスミドは、マウスメタロチオネインプロモーターと、BgIII 部位で繋げられたhGH の3 ’側の翻訳されない領域をそれぞれ一コピー持つ。
【０１５１】
pX1 と名付けられこのプラスミドはBgIII で処理され、完全な長さの線状産物がゲル電気泳動によって精製された。11.1と11.2のオリゴヌクレオチドは、PCR によってヒトゲノムDNA からGLP-1 の7-37のアミノ酸をコードするDNA 配列の増幅のために用いられる。増幅された産物（104 bp）は精製されpXGH5 とオリゴヌクレオチド11.2、11.3、11.4、11.5に混合され、PCR に付す。オリゴヌクレオチド11.3と11.4は相補的でありhGH シグナルペプチドとGLP-1 アミノ酸残基７の間の所望の連結部(junciton)に相当する。500 塩基対の増幅産物は、hGH(Genbank entry HUMGHCSAの5168から5562のヌクレオチド）からの５’側の翻訳されない領域やエキソン１、イントロン１、エキソン２配列の一部を含んでおり、GLP-1 の7-37残基をコードする15の融合されたものがストップコドンの前にある。断片は設計によって、両末端にBamHI 部位がフランクしている。
【０１５２】
断片はBamHI で切断され、上で述べられたpXI のBgIII 処理物に連結される。連結産物は、GLP-１残基37がmMT プロモーターの遠位になるように、pX１においてmMT プロモーターと３’側の翻訳されないｈＧＨ配列を分離してBgIII 部位に挿入されているhGH-GLP-1(7-37) 融合産物の一コピーを用いて分析し同定される。
【０１５３】
【表５】
Figure 0003733110
【０１５４】
他の方法として、小さいサイズのシグナルペプチドと必要とされるGLP-１の一部分で、完全な融合遺伝子が合成的に調製できる。LDL レセプターのシグナルペプチド（アミノ酸残基１−21）、プレプログルカゴン（アミノ酸残基１−20）またはヒト成長ホルモン（アミノ酸残基１−26）をコードするDNA が知られている方法で合成できると考えられ、そして同じように合成したGLP-１の7-37または7-36（すぐにストップコドンがつづく）のアミノ酸をコードするDNA とin vitroで連結される。これらの分子を設計し、合成するのに必要な配列は、Genbank エントリーの HUMLDLRO1（ヒトLDL レセプター）、HUMGLUCG2 （ヒトGLP-1 とグルカゴン配列）とHUMGHCSA（ヒト成長ホルモン）において簡単に利用できる。連結産物はヒト線維芽細胞に使用されるための適当な哺乳類発現ベクターに挿入することができる。プラスミドpMSG(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ）は５’側と３’側の翻訳されない配列、スプライス部位、ポリA 付加部位、エンハンサーとヒト皮膚線維芽細胞で用いられるプロモーターを持つので、この目的に適当である。別の方法として、連結産物は適当な５’側の翻訳されない配列を用いて合成され、上で述べえられたプラスミドpX1 に挿入することも可能である。
【０１５５】
第二のインスリノトロピック(insulinotropic)なGLP-１、つまりGLP-１（7-36）は、上述のオリゴヌクレオチド11.2をオリゴヌクレオチド11.6で置換することによって発現できる。後のクローニング操作の全てはpXGLP1構築のために上述した方法に従い、GLP-１（7-37）特有のＣ末端のグリシン残基を最終産物が欠くようになる。他に、インスリノトロピンGLP-１（7-36）アミドをつくるために、ペプチジルグリシンアルファーアミド化酵素の活性によって、インビボでこの末端のグリシン残基を除いても良い。
【０１５６】
プラスミドpXGLP1は、実施例13でpXEPO1とpcDNEOについて述べたとおりにプラスミドpcDNEOと共に一次ヒト線維芽細胞にコトランスフェクト(co-transfect)される。クローンはG418を含む培地で選別され、96穴プレートに移され、そして細胞上清のGLP-１（7-37）活性または免疫反応性について測定する。GLP-１（7-37）活性は、細胞上清をラットインスリノーマRINm5F細胞と一緒に加温放置し、市販のインスリンラジオイムノアッセイ(Coat-a-Count Insulin, DPC, Los Angels, CA）を用い、これらの細胞からインスリン分泌を誘導するための上清の能力を測定することによって決定された。GLP-１（7-37）抗原は、市販の抗GLP-１抗血清（Peninsula Laboratories、Belmont 、CA）を用いて測定される。GLP-１（7-37）ポジティブクローンは実施例16で述べられているようにヌードマウスに移植するため広げられ、そして血液サンプルが血清ヒトGLP-１（7-37）レベルを測定するために採取された。
【０１５７】
インビボの活性は絶食動物において、腹膜内にグルコースを注射をした後（体重１g あたり１mgのグルコース）、インスリン生成の指数の測定によってモニターされる。一般には、32匹の移植を受けたマウスのグループと受けていないグループは一晩絶食され、28匹がグルコースを注射された。注射後、28匹のマウスは任意に4 匹づつ7 つのグループに分けられ、そして血液が（血清グルコースとインスリンのために）、それぞれのグループについて注射後５、10、20、30、45、60、90分に採取され、絶食コントロールとしてグルコース注射をしないグループとともに行われた。GLP-１（7-37）発現細胞を受けた動物における注射後のインスリン生成の指数（血液中におけるグルコースに対するインスリンの割合）の移植しない動物をうわまる増加は、発現されたペプチドのインビボにおけるインスリノトロピック活性を支持するものである。
【０１５８】
実施例１８．遺伝子ターゲティングによるトランスフェクト細胞株の作製
トランスフェクトするＤＮＡが、相同組み換え事象を通して、染色体ＤＮＡ配列に導入される時、または部分的に置換する時に、ジーンターゲティングが生じる。このような事象はどのようなトランスフェクト実験の途中でも生じる可能性があるが、それらは非相同又は不正の(illegitimate)組み換えによってプラスミドＤＮＡが組み込まれるという事象が大過剰に起こることによって、通常マスクされている。
【０１５９】
ａ． ヒト細胞中のジーンターゲティング事象の選択に有用な構築物の作製
ターゲティングの事象を選択する一つの方法は、トランスフェクトするＤＮＡの組み込みによる遺伝子機能の消失を選択する遺伝子的選択によるものである。ヒトＨＰＲＴ遺伝子座(locus) はヒポキサンチン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素をコードしている。ｈｐｒｔ- 細胞は、６−チオグアニン（６−ＴＧ）類似のヌクレオシドを含む培地で増殖することにより選択することができる。すなわち、野生型（ＨＰＲＴ+ ）対立遺伝子(allele)を持つ細胞は、６−ＴＧによって死滅するが、変異体（ｈｐｒｔ- ）対立遺伝子を持つ細胞は生きつづけることができる。従って、ＨＰＲＴ遺伝子機能を破壊する、ターゲティングされた事象を保持する細胞が６−ＴＧ培地で選択できる。
【０１６０】
ＨＰＲＴ遺伝子座に対するターゲティングのためのプラスミドを構築するために、ＨＰＲＴ配列〔遺伝子バンク(Genebank)名ＨＵＭＨＰＲＴＢ：エドワーズ(Edwards, A.) ら，Genomics 6:593-608(1990)]の１１，９６０〜１８，８６９位を含みかつＨＰＲＴ遺伝子のエキソン２と３を含む６．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片がｐＵＣ１２のＨｉｎｄＩＩＩの中にサブクローン化される。得られたクローンはＨＰＲＴ遺伝子断片のエキソン３の唯一のＸｈｏＩ部位で切断され、ｐＭＣｌＮｅｏ(Stratagene)からのｎｅｏ遺伝子を含む１．１ｋｂのＳａｌＩ−ＸｈｏＩ断片が挿入されて、エキソン３をコードする部分が除かれる。ＨＰＲＴ転写の方向と反対方向のｎｅｏ転写の方向を持った一つのオリエンテーション（orientation)が選びだされ、ｐＥ３Ｎｅｏと名付けられた。正常なＨＰＲＴエキソン３をｎｅｏを欠いた(neo-disrupted) 型のもので置換すると６−ＴＧ耐性表現型のｈｐｒｔ- が得られるであろう。このような細胞はＧ４１８耐性でもある。
【０１６１】
ｂ． 確立したヒト線維芽細胞系でのジーンターゲティング
不死化した細胞系におけるターゲティングを示すため、そして、ジーンターゲティングにおいてｐＥ３Ｎｅｏが適切に機能することを確立させるため、ヒト線維肉腫細胞系ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １２１）がｐＥ３Ｎｅｏによりエレクトロポーレーションを用いてトランスフェクトされた。
【０１６２】
ＨＴ１０８０細胞は、エレクトロポーレーションに先立って、１５％子牛血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）含有のＨＡＴ（ヒポキサンチン／アミノプテリン／キサンチン）補填のＤＭＥＭ培地で維持された。エレクトロポーレーションの２日前に、細胞をアミノプテリンのない同様の培地に移し変える。等比級数的に増殖した細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ／１５％子牛血清で希釈し、遠心分離して、ＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）に再懸濁させて、１ｍｌ当たり１３３０万細胞の最終細胞体積にする。ｐＥ３ＮｅｏはＨｉｎｄＩＩＩで処理され、ｐＵＣ１２骨格から８ｋｂのＨＰＲＴ−ｎｅｏ断片を分離し、フェノール抽出とエタノール沈殿により精製して、６００μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁させる。５０μｌ（３０μｇ）を、エレクトロポーレーション用チューブ(cuvette) （０．４ｃｍ電極間隔、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、７５０μｌの細胞懸濁液（細胞数１０００万）と共に加える。エレクトロポーレーションが４５０Ｖ，２５０μ Ｆａｒａｄｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ；Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で行われた。チューブの内容物を直ちに、１５％子牛血清含有のＤＭＥＭ培地に加えて、２５ｍｌの培地当たり、１００万個の細胞になるような細胞懸濁液を作る。この処理された細胞懸濁液２５ｍｌを１５０ｍｍ径の組織培養皿にまいて、３７℃、５％炭酸ガス中で培養する。２４時間後、Ｇ４１８溶液を直接その皿に加えて、Ｇ４１８として８００μｇ／ｍｌの最終濃度のものにする。５日後、培地をＤＭＥＭ／１５％子牛血清／８００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８の培地に換える。エレクトロポーレーションの９日後に培地をＤＭＥＭ／１５％子牛血清／８００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８及び１０μＭ６−チオグアニン含有のものに換える。Ｇ４１８と６−ＴＧに耐性のコロニーがこの２重選別の開始後１４〜１６日後に、クローニングシリンダーを用いて採取された。
【０１６３】
ＨＴ１０８０細胞における５個の代表的なターゲティング実験の結果を表６に示す。
【０１６４】
【表６】
Figure 0003733110
【０１６５】
トランスフェクション例５では、Ｇ４１８r コロニーの全収率決定用のコントロール皿によると、３３，７００個のＧ４１８r コロニーが最初１×１０7 個の処理細胞から発生することが示された。このように、ターゲットされた現象とターゲットされない現象の比は、６６／３３，７００すなわち１対５１０である。この５つの実験を合わせると、ターゲットされた現象は、３．６×１０6 の頻度すなわち処理細胞の０．０００３６％という頻度で発生する。
【０１６６】
制限酵素と、ｎｅｏとＨＰＲＴ遺伝子から得られたプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション実験から、ＨＰＲＴ遺伝子座のＨＰＲＴのエキソン３中の予想された位置にｎｅｏ遺伝子が位置していることが示された。
【０１６７】
ｃ． 一次及び二次のヒト皮膚線維芽細胞でのジーンターゲティング
ｐＥ３ＮｅｏをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＵＣ１２骨格から８ｋｂのＨＰＲＴ−ｎｅｏ断片を分離し、フェノール抽出とエタノール沈殿により精製する。ＤＮＡは、２ｍｇ／ｍｌとなるよう再懸濁する。０．５ｍｌの容量中、３００万個の二次ヒト包皮線維芽細胞が１００μｇのＨｉｎｄＩＩＩｐＥ３Ｎｅｏ（５０μｌ）と共に、２５０ボルトと９６０μファラッドでエレクトロポーレートされた。３回に分けてトランスフェクションを行い、全部で９００万個の処理細胞となった。１５０ｍｍ培養皿ごとに、５００，０００個の細胞がＧ４１８選択用にまかれた点を除き、実施例６記載のように細胞を処理し、Ｇ４１８耐性株を選択する。選択条件で１０日後に、培養液を４００μｇ／ｍｌのＧ４１８と１０μＭ６−ＴＧを含むヒト線維芽細胞栄養培地に換える。２種の薬剤の組み合わせで選択することを、さらに１０日継続する。培養皿を顕微鏡で見て、両薬剤に耐性なヒト線維芽細胞コロニーを検索する。Ｇ４１８r ｔ−ＴＧr コロニーの比率は、９００万個の処理細胞当たり４個である。これらのコロニーは、コロニーを作り得るすべての細胞の０．０００１％（又は、１００万分の１）となっている。Ｇ４１８r コロニーの全収量を決定するために用いられるコントロール用培養皿から、最初の９×１０6 個の処理細胞から２８５０個のＧ４１８r コロニーが発生し得ることが示された。このように、ターゲットされない現象に対するターゲットされたものの比率は４／２，８５０すなわち１対７１２である。制限酵素及び、ｎｅｏとＨＰＲＴ遺伝子に由来するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション実験により、ＨＰＲＴ遺伝子座のＨＰＲＴエキソン３の中の予想される部位にｎｅｏ遺伝子が位置し、そしてこれら４個のクローン化された細胞株中に、ターゲティングが生じていることが示される。両薬剤に耐性なコロニーはトランスフェクトされる一次細胞からも単離される（１／３．０×１０7 ）。
【０１６８】
いくつかのｐＥ３Ｎｅｏターゲティング実験の結果は表７にまとめられている。ＨｉｎｄＩＩＩで処理されたｐＥ３Ｎｅｏは、直接トランスフェクトされるか、又はトランスフェクションに先立って５’端に単鎖の突出部を発生させるため、エキソヌクレアーゼで処理された（実施例１８ｃ参照）。長さが１７５から９３０塩基対の範囲の単鎖領域を持ったＤＮＡが試験された。ＨｉｎｄＩＩＩのみで分解したｐＥ３ｎｅｏを用いて、１／７９９ Ｇ４１８−耐性コロニーが、制限酵素とサザンハイブリダイゼーション分析により、ＨＰＲＴ遺伝子座にターゲティングされた挿入であるｎｅｏ遺伝子があることが、同定された（全部で２４個の目的のクローンが単離された）。１７５塩基対の突出部を用いた時に、ターゲティングは最大に増強され（約１０倍の増強）、１／８０ Ｇ４１８r コロニーに、ＨＰＲＴのターゲティングの診断に役立つ制限断片の存在が示される（全部で９個の目的とするクローンが単離された）。このように、ここに記載された条件と組み換えＤＮＡ構築物を用いれば、ターゲティングは通常のヒト線維芽細胞で容易に観察でき、全体のターゲティングの頻度（ターゲットされたクローンの数を、Ｇ４１８耐性株へ安定にトランスフェクトされたクローンの数で割ったもの）は、実施例１８ｅに記載するような方法で、単鎖の突出尾部を含むターゲティング構築物でトランスフェクトすることで増強され得る。
【０１６９】
【表７】
Figure 0003733110
【０１７０】
ｄ． ヒトのゲノムへの治療に有益な遺伝子のターゲティング挿入のための構築物作製とジーンターゲティングでのその利用
治療に有益な遺伝子が、ｎｅｏ遺伝子に隣接するかその近くのＨＰＲＴのコーディング領域に挿入されているｐＥ３Ｎｅｏ変異型は、レシピエント一次又は二次細胞染色体の特定の位置に、治療に有益な遺伝子をターゲティングするために使用することができる。ＨＰＲＴ遺伝子座にｈＧＨ遺伝子をターゲティングするために、このようなｐＥ３Ｎｅｏ変異型を構築することができる。
【０１７１】
ｐＸＧＨ５はＥｃｏＲＩで処理され、ｈＧＨ遺伝子とそれに結合したマウスメタロチオネン（ｍＭＴ）プロモーターを含む４．１ｋｂ断片が分離される。ＥｃｏＲＩの突出部はＥ．coli ＤＮＡポリメラーゼからのクレノー(Klenow)断片で埋められている。別個にｐＥ３Ｎｅｏはｎｅｏ断片とＨＰＲＴエキソン３の結合（エキソン３に挿入された３’側の結合）を切断するＸｈｏＩで処理する。直鎖状になったプラスミドのＸｈｏＩ突出端は、Ｅ．coli ＤＮＡポリメラーゼからのクレノー断片で埋め合わされ、得られた断片が４．１ｋｂの平滑末端のｈＧＨ−ｍＭＴ断片につながれる。つながれた混合物由来のバクテリアのコロニーは、ｈＧＨ−ｍＭＴ断片が単一コピー挿入されているか及び方向は合っているかが、制限酵素分析によってスクリーニングされ、ｎｅｏ遺伝子と同じ方向で転写されたｈＧＨ遺伝子が選ばれてｐＥ３Ｎｅｏ／ｈＧＨと名付けられる。ｐＥ３Ｎｅｏ／ｈＧＨをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＨＰＲＴ，ｎｅｏとｍＭＴ−ｈＧＨ配列を含む１２．１ｋｂの断片を切り離す。切断したＤＮＡが処理されて、実施例１８ｃに記載する一次又は二次ヒト線維芽細胞にトランスフェクトされる。Ｇ４１８r ＴＧr コロニーが選択され、実施例１８ｃに記載するように、ＨＰＲＴ遺伝子中へのｍＭＴ−ｈＧＨとｎｅｏ配列のターゲティング挿入について分析される。個々のコロニーは市販される免疫測定法(Nichols Institute) を用いて、ｈＧＨの発現を測定する。
【０１７２】
二次ヒト線維芽細胞をｐＥ３Ｎｅｏ／ｈＧＨでトランスフェクトし、チオグアニン耐性コロニーが、安定なｈＧＨの発現についておよび制限酵素とサザンハイブリダイゼーション分析法によって、分析された。１３個のＴＧr コロニーが分析され、８個のコロニーが内在性のＨＰＲＴ遺伝子座にｈＧＨ遺伝子が挿入されていると同定されている。８個の株はすべて、ｈＧＨの有意な量を安定に発現しており、２４時間の平均発現レベルは２２．７μｇ／１０6 細胞であった。
【０１７３】
ｅ． ターゲティングを増強させるためのＤＮＡ末端の修飾
いくつかの一連の証拠から、Ｅ．coli、バクテリオファージ、Ｓ．cerevisiaeとアフリカツメガエルにおける或る相同性組み換えの過程に、３’端突出部が関与することが示唆されている。アフリカツメガエルの卵母細胞においては、数百個の塩基対の長さの３’端突出部を持った分子が、制限酵素で消化されて発生する非常に短い突出部（４ｂｐ）を持った分子よりも、顕微注入後に非常にすみやかに同様に処理された分子と組み換えを起こした。酵母においては、数百個の塩基対の長さを持った３’端突出部の発生が減数分裂的(meiotic) 組み換えにおける律速段階であるように見える。ヒト細胞の組み換えにおいて３’端突出部が関与するとの証拠は報告されておらず、ある種の修飾ＤＮＡ基質が、どのような種においても、ターゲティング（相同性組み換えの一種）を促進するということは示されていない。ヒトの細胞において、ターゲティングに関する３’端突出部の効果は、試験されていない。以下の実施例に記載の実験から、５’端突出部が一次及び二次のヒト線維芽細胞のターゲティングに最も有効であることが示された。
【０１７４】
トランスフェクトするＤＮＡ分子の末端を修飾することによって、ターゲティングを増強させることに関する報告はなされていない。この実施例では分子末端を２本鎖型から１本鎖型に変換することによる直鎖状ＤＮＡ分子の末端の修飾により、一次及び二次のヒト線維芽細胞の染色体へのターゲティングが増強できることを示す。
【０１７５】
１１００μｇのプラスミドｐＥ３Ｎｅｏ（実施例１８ａ）がＨｉｎｄＩＩＩで切断される。このＤＮＡは、フェノール抽出とエタノール沈殿の後に、直接用いることができる。あるいはＨＰＲＴとｎｅｏ遺伝子のみを含む８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片が、ゲル電気泳動法によってｐＵＣ１２ベクター配列と分離することができる。ＨｉｎｄＩＩＩ切断したＤＮＡのＥｘｏＩＩＩ処理により、両末端に、各フリーの３’末端で始まり、５’の突出端を残す広範なエンドヌクレオティックな切断が起こる。エンドヌクレオティック反応の程度とその結果としての５’端突出部の長さは、ＥｘｏＩＩＩ処理反応の時間を変化させることにより、コントロールできる。ＨｉｎｄＩＩＩ処理されたｐＥ３Ｎｅｏの１００μｇのＥｘｏＩＩＩ処理反応が、供給者の推薦する条件に従い、３０秒、１分、１．５分、２分、２．５分、３分、３．５分、４分、４．５分と５分の時間で実施された。消化反応の程度をモニターするため、それぞれの時間の点で、ＥｘｏＩＩＩで処理されたＤＮＡを１μｇ含むように採取された試料を、マングビーンヌクレアーゼ(Promega) を用いて供給者の推薦する条件で処理し、その試料をゲル電気泳動で分画する。未処理のＨｉｎｄＩＩＩ処理されたｐＥ３ＮｅｏとＥｘｏＩＩＩとマングビーンヌクレアーゼで処理された同じ分子のサイズの違いを測定する。２つに分かれたこのサイズの相違から、分子のそれぞれの末端にある５’端突出部の平均の長さが出る。上述の時間の点と３０°での処理では、作りだされる５’端突出部は１００〜１０００塩基の範囲である。
【０１７６】
それぞれの反応時点で採取されたＥｘｏＩＩＩ処理のＤＮＡ６０μｇ（ｐＥ３Ｎｅｏの全ＨｉｎｄＩＩＩ処理物）が精製され、実施例１８ｃに記載の条件下で一次及び二次のヒト線維芽細胞へエレクトロポーレーションにより導入された。それぞれのＥｘｏＩＩＩ処理調製物でターゲティングがどの程度増強されたかについては、Ｇ４１８r ６−ＴＧr コロニーの数を計測し、ＥｘｏＩＩＩで未処理のＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐＥ３Ｎｅｏによるターゲティングで得られた数と比較することによって定量される。
【０１７７】
３’端突出部の効果も又、同様の系を用いて定量することができる。この場合、ＨｉｎｄＩＩＩで処理されたｐＥ３Ｎｅｏを用いて、供給者の推薦する条件で時間間隔を変えてバクテリオファージＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ(United States Biochemicals)で処理する。処理の程度（末端毎に作りだされた３’端突出部の平均の長さ）とエレクトロポーレーションの条件の決定は、ＥｘｏＩＩＩで処理されたＤＮＡに関する記載に準じる。それぞれのＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ処理調製物で、ターゲティングが増強される程度については、Ｇ４１８r ６−ＴＧr コロニーの数を計測し、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ未処理のＨｉｎｄＩＩＩ処理ｐＥ３ＮＥＯによるターゲティングで得られた数と比較することによって定量される。
【０１７８】
５’及び３’端突出部を発生させる他の方法も可能である。例えば、相互に部分的にオーバーラップしている２つの直鎖状分子を変性させ、アニーリングすることで、出発時の直鎖状分子と区別できない再アニーリングされた断片とともに、それぞれの分子の両末端に３’端突出部を有する分子、あるいは両末端に５’端突出部を有する分子の混合物が得られる。突出部の長さは２つのＤＮＡ断片の間で共通でないＤＮＡの長さから決定される。
【０１７９】
ｆ． 一次及び二次ヒト線維芽細胞においてマウスメタロチオネンプロモーターの制御下にヒトエリスロポエチン遺伝子を置くためのターゲティングプラスミドの構築
以下に、本件発明の一つの態様を例示する。そこでは、得られたままの状態では有意な量でＥＰＯを発現しない一次及び二次ヒト線維芽細胞株において、ヒトエリスロポエチンが発現できるように、ヒトのエリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子の上流に位置する正常なポジティブとネガティブの調節配列を変化させる。
【０１８０】
ヒトＥＰＯをコードする領域の上流にのみ存在する領域をＰＣＲで増幅することができる。この目的のために用いられる３組のプライマーが、発表されているヒトＥＰＯの解析からデザインされた〔Genbank 名称 HUMEPRPA; Lin, F-K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7580-7584(1985)〕。これらプライマーの組は６０９，６０３又は５９０ｂｐの断片を増幅することができる。
【０１８１】
【表８】
Figure 0003733110
【０１８２】
３つの断片は実質的に重なりあっていて、本件の目的には交換可能なものである。翻訳開始部位を基準に−６２３〜−１４に広がった（ＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチドの２〜６１０位）６０９ｂｐ断片の両端にＣｌａＩリンカーが結合される。その結果得られたＣｌａＩ−結合断片をＣｌａＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ／＋(Stratagene)のＣｌａＩ部位に挿入する。その際の配向性はＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置６１０がプラスミドポリリンカーのＳａｌＩ部位に隣接するようにする。このプラスミドｐ５’ＥＰＯをＥＰＯ上流部分の断片中に唯一あるＦｓｐＩ又はＳｆｉＩ部位で、別々に切断し（ＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置として各々１５０と４０５）、マウスのメタロチオネンプロモーターに連結させる。典型的には、ｍＭＴ−Ｉ遺伝子から得られた１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ〔ｍＭＴをコードしない（ＤＮＡ）配列を含むものとして；Hamer, D.H. and Walling M., J. Mol. Appl. Gen.1: 273 288(1982); この断片はまた、Ｇｅｎｂａｎｋから入手できるｍＭＴ配列、例えばＭＵＳＭＴＩ、ＭＵＳＭＴＩＰ、ＭＵＳＭＴＩＰＲＭの解析からデザインされるＰＣＲプライマーを用いてマウスゲノムＤＮＡから公知方法により単離することもできる〕を公知方法で平滑末端化し、ＳｆｉＩで処理した（先端を同様に平滑末端にした）ｐ５’ＥＰＯあるいはＦｓｐＩで処理したｐ５’ＥＰＯと結合させる。得られたクローンの配向性が分析され、前のｍＭＴ ＢｇｌＩＩ部位がプラスミドポリリンカー中のＳａｌＩ部位の近くにあるものが、一次及び二次のヒト線維芽細胞をターゲティングするために用いられる。この配向性は、最終の構築物の中で、ＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置６１０の方向に向かってｍＭＴの転写を指向させる。得られたプラスミドは、ＦｓｐＩとＳｆｉＩ部位で、それぞれｍＭＴの挿入を行うことから、ｐ５’ＥＰＯ−ｍＭＴＦ及びｐ５’ＥＰＯ−ｍＭＴＳと名付けられている。
【０１８３】
さらに上流の配列は、負の調節要素あるいは最初のターゲット配列の上流に存在するエンハンサーの修飾、欠失及び／又は置換が望ましい場合に、有用である。ＥＰＯの場合には、肝臓外の組織と腎臓外組織の中で、ＥＰＯの発現を抑制する負の調節要素〔Semenza, G.L. et al., Mol. Cell Biol. 10: 930-938(1990) 〕は欠失することができる。６ｋｂ断片中に一連の欠失のあるものが調製される。削除された領域は幅広い宿主細胞活性を有するエンハンサーで置換されてもよい〔例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのエンハンサー〕。
【０１８４】
ＨＵＭＥＲＰＡ配列の５’末端の前にＢａｍＨＩ部位（遠位）とＨｉｎｄＩＩＩ部位（近位）が位置するので、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ／＋ベクター中の６０９ｂｐ５’ＥＰＯ断片の配向性が選択された。このように、６０９ｂｐ断片の上流部分に通常存在する６ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片〔Semenza, G.L. et al., Mol. Cell Biol. 10: 930-938(1990) 〕は、公知方法を用いて染色体ＤＮＡから単離できる。例えばバクテリオファージ、コスミドあるいは酵母の人為染色体ライブラリー(artificial chromosome library) を、６０９ｂｐのＰＣＲ増幅断片をプローブとしてスクリーニングすることができる。所望のクローンは６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を有するであろうし、その同定は公知方法で決定されたヒトＥＰＯ遺伝子の周辺の制限酵素地図とこの制限酵素地図を比較することによって確認することができる。また別の方法として、６０９ｂｐ断片をプローブとして用いて、ＥＰＯ遺伝子上流部分のヒトゲノムの制限酵素地図を作成することによって、ＨＵＭＥＲＰＡコーディネート２と６０９に間に起始し、上流ＢａｍＨＩ部位を越えて延びる断片を作る酵素を同定することができる。この断片は、ヒトゲノムＤＮＡの適当に処理したものからゲル電気泳動法で単離することができ、バクテリアあるいは酵母のクローニングベクターに結合させることができる。正しいクローンは６０９ｂｐの５’ＥＰＯプローブにハイブリダイズし、６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有する。単離された６ｋｂ断片は、正しい配向性でｐ５’ＥＰＯ、ｐ５’ＥＰＯ−ｍＭＴＦ又はｐ５’ＥＰＯ−ｍＭＴＳに挿入（ＨｉｎｄＩＩＩ部位がＨＵＭＥＲＰＡヌクレオチド位置２に隣接するように）される。さらに、上流の配列を公知方法で単離することができ、それには染色体ウォーキングテクニックを用いるか、あるいは６０９ｂｐの５’ＥＰＯプローブにハイブリダイズする酵母人為染色体の単離によって行うことができる。
【０１８５】
以上述べたクローニングのストラテジーは、その後の一次、二次ヒト線維芽細胞のターゲティングされたトランスフェクションを可能にするためのＥＰＯの上流配列のインビトロでの修飾を可能にする。このストラテジーでは、負の調節領域の欠失とともに簡単なｍＭＴプロモーターの挿入、また負の調節領域の欠失と広範囲の宿主細胞活性を有するエンハンサーによる置換について述べている。
【０１８６】
ｇ． ヒトＥＰＯ遺伝子の隣接配列に対するターゲティングと、標的一次、二次および不死化されたヒト線維芽細胞のスクリーニングによる単離
ターゲティングに際し、プラスミドを制限酵素で切断し、プラスミドの骨格（backbone) から挿入配列を切り離す。p5’EPO-mMTSの場合、HindIII と SaII で切断することにより 2.4 kb のターゲティングフラグメントが切り離されるが、このフラグメントは1.8 kbの mMTプロモーターと、該プロモーターの５’、３’側にそれぞれ隣接した405bp と204bp の配列よりなる。この隣接配列は、この構築物を EPO遺伝子の調節領域にターゲティングするためのDNA である。このDNA 、または2.4kb のターゲティングフラグメントのみがフェノール抽出およびエタノール沈澱により精製され、実施例18c に記載された条件下で一次あるいは二次のヒト線維芽細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、ヒト線維芽細胞栄養培養液中、150mm ディッシュに蒔かれる。48時間後、細胞は 10,000cells/cm2の密度〔１ウエル当たり約20,000細胞の割合。もし106 のクローニング可能な(clonable)細胞に対し 1回の割合でターゲティングを行うならば、（実施例18ｃ）、その際単一の発現コロニーを分離するためのアッセイに約50ウエルが必要であろう〕で24ウエルのディッシュに蒔かれる。トランスフェクトする(transfecting)DNA が EPOの上流の相同領域をターゲットする細胞は、mMT プロモーターの制御下でEPO を発現するだろう。10日後、すべてのウエルの上清は、市販の利用可能なイムノアッセイキット（アムジェン) を用いてEPO の発現についてアッセイされる。 EPOの合成が認められるウエルからのクローンが、既知の方法を用いて分離される。代表的には個々のウェルあるいはプレート中に分離された異なる細胞集団のフラクションをアッセイし、これらのポジティブなウェルのフラクションのアッセイを必要に応じて繰り返し、最終的に1 ウエル当たり1 細胞の割合で蒔かれた96穴のマイクロタイタープレートをスクリーニングすることによりターゲティングされたコロニーが分離される。プレートライセート(plate lysates) 全体からのDNA が、HUMERPA 核酸部位 1の上流に位置するプライマーとmMT に特異的なプライマーを用いたPCR によりフラグメントを増幅することにより、分析され得る。この一対のプライマーは、DNA 配列に基いてその長さが正確に予想されるようなDNA フラグメントを増幅するはずである。ポジティブなプレートがトリプシン処理され、次々と低い希釈で蒔きなおし、ターゲットされた細胞を分離するのに必要なまで、DNA の調製とPCR のステップが繰り返される。
【０１８７】
ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬物供給(pharmacologic delivery)のためにhGH を産生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばHT1080線維芽細胞、HeLa、MCF-7 乳癌細胞、K-562 白血病細胞、KB癌細胞、あるいは2780AD卵巣癌細胞) においてhGH の発現を活性化することにもおそらく使用されるだろう。
【０１８８】
ｈ． ヒト EPO 遺伝子の隣接配列に対するターゲティングと、ターゲティングされた一次、二次および不死化されたヒト線維芽細胞のポジティブあるいはポジティブ／ネガティブ組み合わせ選択システムによる単離
p5’EPO-mMTF、p5’EPO-mMTS、および上流に付加的な6kb の BamHI-Hind III フラグメントを有する誘導体を構築するためのストラテジーは、mMT プロモーターに隣接した neo遺伝子の挿入という付加的なステップを続けて行うことができる。加えて、ネガティブな選択マーカー、例えばgpt[pMSG (ファルマシア) あるいは他の適切な供給源から得られる] は pBluescriptIISK/ ＋ポリリンカー中の HUMERPA配列に隣接して挿入することができる。前者の場合、G418r コロニーが分離され、ターゲットされたコロニーを同定するためにコロニー集団から調製されたDNA のPCR 増幅、又は制限酵素とサザンハイブリダイゼーション分析により、スクリーニングされる。後者の場合、G418r コロニーは、 gpt遺伝子の組み込み(integration) に対する選択のために、6 -thioxanthine を含む培養液中に蒔かれる〔ベスナード(Besnard, C)ら、Mol.Cell.Biol. 7;4139-4141 (1987)〕。付言するに、 HSV-TK 遺伝子はgpt のような挿入配列とは反対側に配置でき、それにより400 μg/mlのG418、100 μM の6-thioxanthine、25μg/ml gancyclovirを含むヒト線維芽細胞栄養培養液中で細胞を増殖させることにより、neo に対するポジティブ選択あるいはgpt とTK両方に対するネガティブ選択が可能となる。二重のネガティブ選択法は、真のターゲティングに対する、ほぼ完全な選択法となるであろうし、サザンブロット分析は最終的な確証を与えるだろう。
【０１８９】
ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬物供給のためにhEPOを産生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばHT1080線維芽細胞、HeLa、MCF-7 乳癌細胞、K-562 白血病細胞、KB癌細胞、あるいは2780AD卵巣癌細胞) においてhEPOの発現を活性化することにもおそらく使用されるだろう。
【０１９０】
ｉ． 一次のヒト線維芽細胞において、マウスメタロチオネインプロモーターの制御下にヒト成長ホルモン遺伝子を配置することを目的とした、ターゲティングプラスミドの構築
以下の実施例は、一次、二次のヒト線維芽細胞株においてヒト成長ホルモン遺伝子を発現させるために、該ヒト成長ホルモン遺伝子の上流に位置する通常の調節配列を変化させる、という本発明の一態様を説明している。
【０１９１】
EPO 遺伝子の調節領域に対するターゲティングに関して実施例18f で述べられたのと同様のターゲティング分子が、ヒト成長ホルモン N遺伝子の 5’末に由来するクローン化された DNAフラグメントを利用して得られる。HUMGHCSA(Genbank Entry) ヌクレオチド部位3787-5432 (2つの EcoNI制限酵素部位ではさまれた部分であり、クローニング、あるいはこのフラグメントを含むサブクローンの診断的切断に対して都合の良いサイズのフラグメントを提供する) に相当する約1.8kb のフラグメントが、この領域における HUMGHCSA 配列の分析によってデザインされた PCRプライマーにより増幅される。この領域は、hGH 遺伝子 Nイントロン1 の途中から翻訳開始部位の 5’側より約 1.4kb上流にまで及ぶ。pUC12 が Eco RI とBamHI で切断され、クレノーで処理することにより平滑末端化され、希釈条件化で再環状化される。その結果、プラスミドは Eco RI とBam HI が欠失されたものとなる。このプラスミドはpUC12XEBと命名される。HindIII リンカーが、増幅した hGHフラグメントにライゲートされ、その結果物であるフラグメントは Hind III で切断され、 Hind III で切断された pUC12XEB にライゲートされる。その結果得られたプラスミド、 pUC12XEB- 5’hGH は、 hGH転写開始部位のすぐ上流に位置する 0.5kbフラグメントを除去するために Eco RI とBam HIで切断される。切断された DNAは、mMT-I 遺伝子由来の 1.8kb EcoRI-BglIIフラグメントにライゲートされる。〔mMT のコード配列は含んでいない。ハマーとウォリング(Hamer, D.H. and Walling, M.), J. Mol. Appl. Gen. 1.:273-288 (1982);フラグメントはGenbank から入手可能な mMT配列、たとえばMUSMTI、MUSMTIP 、MUSMTIPRM の分析によりデザインされるPCR プライマーを用いてマウスのゲノムDNA から既知の方法でも分離され得る。〕このプラスミド p 5’hGH-mMT は、上流のhGH 配列(upstream hGH sequences)が両側に隣接するmMT プロモーターを有している。
【０１９２】
以上述べたクローニングのストラテジーにより、hGH の上流の配列がインビトロで修飾され、引き続いて一次および二次のヒト線維芽細胞のターゲット化トランスフェクションがなされる。このストラテジーは、 mMTプロモーターの単純な挿入を示す。たとえば幅広い宿主細胞特異性を有するエンハンサーを挿入mMT 配列の上流に挿入させるといった、他のストラテジーも考え得る。
【０１９３】
ｊ． ヒト hGH 遺伝子に隣接する配列のターゲティング、およびターゲティングされた一次、二次および不死化されたヒト線維芽細胞のスクリーニングによる単離
ターゲティングに際し、プラスミドを制限酵素で切断し、プラスミドの骨格から挿入物を切り離す。 p 5’hGH-mMT の場合、HindIII で切断することにより 2.9kbのターゲティングフラグメントが切り離されるが、このフラグメントはこの構築物を hGH遺伝子の調節領域にターゲッッティングするためのDNA が、その 5’および 3’側に隣接した1.8 kbの mMTプロモーターからなる。このDNA 、または2.9kb のターゲティングフラグメントのみがフェノール抽出およびエタノール沈澱により精製され、実施例６に記載された条件下で一次あるいは二次のヒト線維芽細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、ヒト線維芽細胞栄養培養液存在下、150mm ディッシュに蒔かれる。48時間後、細胞は10,000cells/cm2 の密度〔１ウエル当たり約20,000細胞の割合。もし106 のクローニング可能な(clonable)細胞に対し 1回の割合でターゲティングを行うならば（実施例18ｃ）、その際単一の発現コロニーを分離するためのアッセイに約50ウエルが必要であろう〕で24ウエルのディッシュに蒔かれる。トランスフェクトする(transfecting) DNAがhGH の上流の相同領域をターゲットした細胞は、mMT プロモーターの制御下でhGH を発現するだろう。10日後、すべてのウエルの上清が市販の利用可能なイムノアッセイキット（ニコルズ) を用いてhGH の発現についてのアッセイに供される。 hGHの合成が認められるウエルからのクローンが、既知の方法を用いて分離される。代表的には個々のウェルあるいはプレート中に分離された異なる細胞集団のフラクションをアッセイし、これらのポジティブなウェルのフラクションのアッセイを必要に応じて繰り返し、最終的に1 ウエル当たり1 細胞の割合で蒔かれた96穴のマイクロタイタープレートをスクリーニングすることにより、ターゲティングされたコロニーが分離される。プレートライセート全体からのDNA が、HUMGHCSAヌクレオチド部位 5,432の下流に位置するプライマーとmMT に特異的なプライマーを用いたPCR によってフラグメントを増幅することにより、分析され得る。この一対のプライマーは、DNA 配列に基いてその長さが正確に予想されるようなDNA フラグメントを増幅するはずである。ポジティブなプレートがトリプシン処理され、次々と低い希釈で蒔きなおし、DNA の調製とPCR のステップが、ターゲットされた細胞を分離するのに必要なまで繰り返される。
【０１９４】
ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬剤供給のためにhGH を産生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばHT1080線維芽細胞、HeLa、MCF-7 乳癌細胞、K-562 白血病細胞、KB癌細胞、あるいは2780AD卵巣癌細胞) においてhGH の発現を活性化することにもおそらく使用されるだろう。
【０１９５】
ｋ． ヒト hGH 遺伝子の隣接配列に対するターゲティングと、ターゲティングされた一次、二次および不死化されたヒト線維芽細胞のポジティブあるいはポジティブ／ネガティブ組み合わせ選択システムによる単離
p5’hGH-mMT を構築するためのストラテジーは、mMT プロモーターに隣接した neo遺伝子の挿入という付加的なステップを続けて行うことができる。加えて、ネガティブな選択マーカー、例えばgpt[pMSG (ファルマシア) あるいは他の適切な供給源から得られる] は pUC12ポリリンカー中の HUMGHCSA 配列に隣接して挿入することができる。前者の場合、G418r コロニーが分離され、ターゲットされたコロニーを同定するためにコロニー集団から調製されたDNA のPCR 増幅、又は制限酵素とサザンハイブリダイゼーション分析によりスクリーニングされる。後者の場合、G418r コロニーは、 gpt遺伝子の組み込みのネガティブ選択のために、thioxanthineを含む培養液中に蒔かれる〔ベスナード(Besnard, C)ら、Mol. Cell. Biol. 7;4139-4141(1987) 〕。付言するに、 HSV-TK 遺伝子はgpt のような挿入配列とは反対側に配置でき、それにより、400 μg/mlのG418、100 μM の6-thioxanthine、25μg/ml gancyclovirを含むヒト線維芽細胞栄養培養液中で細胞を増殖させることにより、neo に対するポジティブ選択あるいはgpt とTK両方に対するネガティブ選択が可能となる。二重のネガティブ選択法は、真のターゲティングに対し、ほぼ完全な選択法となるであろう。サザンブロット分析は確認的なものである。
【０１９６】
ここで述べられたターゲティングの手法は、通常の薬剤供給のためにｈＧＨを産生させる目的で、不死化されたヒトの細胞（たとえばHT1080線維芽細胞、HeLa、MCF-7 乳癌細胞、K-562 白血病細胞、KB癌細胞、あるいは2780AD卵巣癌細胞) においてhGH の発現を活性化することにも、おそらく使用されるだろう。
【０１９７】
実施例１９．ヒトの成長ホルモンとエリスロポエチンの配列が融合されたキメラ型転写単位を生じさせるターゲティングプラスミドの構築
以下の実施例は、得られたままのトランスフェクトされていない状態では検出可能な量の EPOを発現しないような一次あるいは二次の線維芽細胞株において、ヒトEPO 遺伝子の上流に位置する本来の調節配列をhEPOの発現が可能なように変化させる、という本発明の2 つのさらなる態様を説明している。これらの態様において、ターゲティングの結果物は、ヒト成長ホルモン遺伝子第１エキソンが EPOのエキソン 2-5 の上流に位置するようなキメラ型転写単位である。転写、スプライシング、翻訳の産物は、hEPO のシグナルペプチドのアミノ酸 1-4がhGH のアミノ酸残基 1-3に置き変わったようなタンパク質である。２つの態様は、挿入される外来の調節配列の相対的な位置と、最終的にプロセッシングされた転写産物を生産するのに必要であるスプライシングの特異的なパターンに関して異なる。
【０１９８】
プラスミド pXEPO-10 は、ヒトの第 7染色体上に内在的に存在する hEPO 遺伝子に対するジーンターゲティングにより、hEPOのエキソン 1をhGH のエクンン 1で置き換えるためにデザインされる。プラスミド pXEPO-10 は以下のように構築される。まず、HindIII-Bam HIで切断されたpBluescriptII SK＋(Stratagene,LaJolla, CA)中に、hEPOのコード領域の上流に存在する 6kbの HindIII-Bam HI フラグメント( 実施例 18f参照) を挿入することにより、中間的なプラスミド pT163が構築される。このライゲーションの産物は、pT163 を構築するために、 XhoI およびHindIII で切断されpMClneoPolyA [Thomas, K. R. and Capecchi, M. R. Cell 51: 503-512 (1987) 。Stratagene,LaJolla, CAから入手可能] 由来の 1.1kb HindIII-XhoI フラグメントにライゲートされる。オリゴヌクレオチド 13.1-13.4は、融合フラグメント作製のためにポリメラーゼ・チェイン・リアクションに利用される。融合フラグメントとはマウスメタロチオネイン 1(mMT-I) プロモーター−hGH エキソン1 配列が、hEPOイントロン1 の配列に付加的に融合されたものである。まず、オリゴヌクレオチド13.1と13.2が、pXGH5 由来の約 0.73kb のmMT-I プロモーター−hGH エキソン1 フラグメントを増幅するために使用される（図１）。次に、オリゴヌクレオチド 13.3 と13.4が、主としてヒトゲノムDNA 由来の hEPO イントロン1 よりなる約0.57kbのフラグメントを増幅するために、使用される。最後に2 つの増幅されたフラグメントが混合され、最終的な融合フラグメント（融合フラグメント３）を作製するために、オリゴヌクレオチド13.1と13.4でさらに増幅される。融合フラグメント 3は、Sal I 部位によりmMT-I 部分の5 ’側に隣接しており、Xho I 部位により hEPO のイントロン1 配列の3 ’側に隣接している。融合フラグメント 3は Xho IとSal I で切断され、Xho I で切断された pT163にライゲートされる。ライゲーション混合物は E.coli 中にトランスフォームされ(transformed) 、 hEPO イントロン 1配列の3 ’側においてXhoI部位が復活している融合フラグメント3 挿入物を一つだけ有するクローンが同定され、pXEPO-10と命名される。
【０１９９】
Figure 0003733110
オリゴ13.1の太文字でない領域は、５’末端に本来の KpnＩ部位を有するmMT-I プロモーターに同一である。太文字の部分は、５’末端を SalＩ部位に変換するための SalＩ部位のテール(tail)を意味する。オリゴ13.2と13.3の太文字領域は hGH配列を意味し、一方太文字でない領域は hEPO 遺伝子由来のイントロン１配列である。オリゴ13.4の太文字でない領域はhEPOイントロン１の最後の25ベースに同一である。太文字の領域は、増幅されたフラグメントの３’末端を XhoＩ部位に変換するための XhoＩ部位のテールを含む。
【０２００】
プラスミド pXEPO-11 は、mMT-I プロモーターと hEPO 構造遺伝子上流に存在するhGH のエキソン１とプロモーター領域をヒト第７染色体上の内在的な hEPO の領域に配置するように、ジーンターゲティングによりデザインされる。プラスミド pXEPO-11 は以下のように構築される。オリゴヌクレオチド13.1と13.5-13.7 が、融合フラグメントを作製するためにポリメラーゼ・チェイン・リアクションにおいて利用される。融合フラグメントとは、マウスメタロチオネイン I (mMT-I)プロモーター−hGH エキソン1 配列が、 hEPO コード領域に対し-1から-630に相当する hEPO の配列に融合されたものである。最初に、pXGH5 由来の約0.73kbの mMT-Iプロモーター−hGH エキソン1 のフラグメントを増幅するために、オリゴヌクレオチド13.1と13.5が使用される（図１）。次にヒトのゲノムDNA から、主として hEPO のコード領域に対し-1から-620に相当する hEPO の配列よりなる約0.62kbのフラグメントを増幅するために、オリゴヌクレオチド 13.6 と13.7が使用される。オリゴ13.5と13.6の両方は、hGH イントロン1 ─hEPOプロモーター領域に位置する10bpのリンカー配列を含んでおり、その配列は、天然の hEPO イントロン1 のスプライス供与部位に相当する。最後に、 mMT-I部分の５’側の Sal I部位と hEPO プロモーター領域の 3’側の Xho I部位により隣接された最終的な融合フラグメント( 融合フラグメント 6) を作製するために、2 つの増幅されたフラグメントは混合され、さらにオリゴヌクレオチド 13.1 と13.7で増幅される。融合フラグメント6 は、XhoIとSal I で切断され、Xho I で切断されたpT163 に結合される。ライゲーションの混合液は E.coli にトランスフォームされ、hEPOプロモーター配列の３’側に XhoＩ部位が復活した融合フラグメント６が一つ挿入されたクローンが同定され、pXEPO-11と命名される。
【０２０１】
Figure 0003733110
オリゴ13.5と13.6の太文字の領域は hGHの配列を意味する。イタリックの領域は hEPO イントロン１の最初の10塩基対に相当する。残りのオリゴは hEPO コード領域に対し-620から-597のhEPOの塩基配列に相当する。オリゴ13.7の太文字でない領域は hEPO のコード領域に対し-1から-24 の塩基と同一である。太文字の領域は、増幅されたフラグメントの３’末端を XhoＩ部位に変換するための XhoＩ部位のテールを含んでいる。
【０２０２】
プラスミドpXEPO-10は、hEPOの配列を両側に連結したmMT-I/hGH 融合物を含む7.3kb のフラグメントを Bam HI とXhoIで切断して遊離することにより、ジーンターゲティングのために使用され得る。このフラグメント（ターゲティングフラグメント１）はhEPOのコード配列を含んでおらず、ヒトのEPO の遺伝子座(locus) にターゲティングを方向づけするhEPOのコード領域の上流-620から約-6620 の配列とhEPOイントロン１の配列のみを有している。ターゲティングフラグメント１は、実施例18c で述べられているのと同様の条件を用いて一次あるいは二次の皮膚線維芽細胞にトランスフェクトされる。G418に耐性のコロニーを選んで96ウエルプレートの各ウエルに入れ、ELISA アッセイ（R & D システム、ミネアポリスMN) によりEPO の発現がスクリーニングされる。トランスフェクト(transfecting) DNAがランダムにヒトゲノム中に組み込まれた(integrates)細胞は、EPO を産生することができない。トランスフェクト(transfecting)DNA が、内在的なhEPOイントロン１および hEPO 上流配列と相同組み換えをおこした細胞は、mMT-I のプロモーター、非転写配列、 hGHの５’非翻訳配列、hGH エキソン１が正常の hEPO のプロモーターと hEPO エキソン１に入れ替わったキメラ遺伝子を含んでいる（図７参照) 。ターゲティングフラグメント１中の非hEPO配列は、hEPOイントロン１の下流のhEPO配列に結合している。天然の hEPO 調節領域のmMT-I プロモーターによる置換は、本来ならEPO を発現しない線維芽細胞中のEPO 遺伝子を活性化する。hEPOエキソン１の hGHエキソン１による置換により、hEPOシグナルペプチドの最初の４アミノ酸が hGHのアミノ酸1-3 に置換されているタンパク質が得られ、翻訳後のプロセッシングにより成熟したタンパク質から除かれ、発現細胞により分泌される機能的なキメラのシグナルペプチドが生成される。
【０２０３】
プラスミドｐＸＥＰＯ−１１は、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで処理することにより、両端がｈＥＰＯ配列によりフランクされた(flanked) ｍＭＴ−Ｉ／ｈＧＨ融合体を含む７．４ｋｂのフラグメントを得て、ジーンターゲティングに用いることができる。このフラグメント（ターゲティングフラグメント２）は、ｈＥＰＯをエードする配列を含んでおらず、ヒトＥＰＯ領域へのターゲティングを指向するため、ｈＥＰＯコード領域の−１からおよそ−６６２０上流にある配列のみを有する。ターゲティングフラグメント２は実施例１８ｇに記載されたものと同様の条件を用いて、一次又は二次ヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクトされる。Ｇ４１８耐性コロニーは９６穴プレートの各々の穴に分別され、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄシステムズ，ミネアポリス，ミネソタ）により、ＥＰＯの発現でスクリーニングされる。トランスフェクトしたＤＮＡがヒトゲノムの中へランダムにとりこまれた細胞はＥＰＯを産生できない。フラグメントしたＤＮＡが内在性のｈＥＰＯプロモーター及び上流の配列と相同組み換えを起こした細胞は、ｍＭＴ−Ｉプロモーターと非転写配列、ｈＧＨ５’非翻訳配列及びｈＧＨエキソン１及び、ｈＥＰＯイントロン１の最初の１０塩基から成る１０塩基対リンカーがｈＥＰＯをコードする領域に対して−６２０位(position)に存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入されたキメラ遺伝子を含んでいる（図８参照）。通常サイレントであるｈＥＰＯプロモーターの上流にｍＭＴ−Ｉプロモーターが存在することにより、（５’から３’への）非翻訳メタロチオネイン及びｈＧＨ配列、ｈＧＨエキソン１、ｈＥＰＯイントロン１由来の最初の１０塩基と同一の１０塩基、そして通常のｈＥＰＯプロモーターとｈＥＰＯエキソン１（ＥＰＯをコードする配列に対して−６２０から＋１３位）のメッセージ(message) の合成が、一次あるいは二次皮膚線維芽細胞中で導かれるであろう。ｈＥＰＯイントロン１の１０塩基対リンカー配列は、ｈＧＨエキソン１を続く下流のｈＥＰＯエキソン２のすぐ上流であるスプライスアクセプタ部位に結合させるためのスプライスドナー部位として働く。よってその結果、生じる転写のプロセシングは、ｈＥＰＯプロモーター、エキソン１そしてイントロン１配列をスプライスアウトするであろう。ｈＧＨエキソン１によるｈＥＰＯエキソン１の置換により、ｈＥＰＯシグナルペプチドの最初の４アミノ酸が、ｈＧＨのアミノ酸１〜３で置きかわった蛋白が得られ、成熟蛋白から翻訳後プロセシングによって切り離され発現細胞から分泌される機能的なキメラシグナルペプチドを作りだすことになる。
【０２０４】
ｐＸＥＰＯ−１０とｐＸＥＰＯ−１１に関する一連の構築物は、公知方法を用いて構築されるであろう。これらの構築物においては、ｍＭＴ−ＩプロモーターとｈＧＨ配列の相対的位置は、ｍＭＴ−Ｉ／ｈＧＨ配列がｈＥＰＯ上流配列に挿入される位置と同様、ジーンターゲティングを促進する別のキメラ転写ユニットを作るため、融合転写体のより能率的な発現を生じさせるため、又は、他の望ましい性質を付与するため変えることができる。このような構築物は、通常のｈＥＰＯ領域を指向したジーンターゲティングにより、ｈＧＨ−ｈＥＰＯ融合遺伝子が外来性のプロモーターの支配下にあるという同様の結果を与えるであろう。例えば、ｈＥＰＯ遺伝子の上流にある６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（実施例１８ｆ参照）は、ｎｅｏ遺伝子とｍＭＴ−Ｉプロモーター／ｈＧＨ融合フラグメントの挿入部位に用いうる多くの制限酵素認識部位を有する。このような部位の１つ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位のおよそ１．３ｋｂ上流にあるＢｇｌＩＩ部位は、この領域で唯一のものであり、１個又はそれ以上の選択マーカー及び一次、二次あるいは不死化したヒト細胞でのＥＰＯ発現の活性化に寄与する他の遺伝子の調節領域の挿入に用いうる。
【０２０５】
第一に、中間体プラスミドｐＴ１６４は、ｈＥＰＯコード領域の上流にある６ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（実施例１８ｆ）を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで処理されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋〔ストラタジーン，ラジョラ，カリフォルニア(Stratagene, Lajolla, CA) 〕に挿入することにより、構築する。プラスミドｐＭＣ１ｎｅｏＰｏｌｙＡ〔トーマス Ｋ．Ｒ．及びカペッケ Ｍ．Ｒ．(Thomas, K.R. and Capecchi, M.R.) Cell 51 503-512(1987)：ストラタジーン，ラジョラ，カリフォルニア(Stratagene, Lajolla, CA) より市販）はＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩによって処理され、Ｅ．coli ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片処理により、平滑末端化し、それによって生じる１．１ｋｂのフラグメントが精製される。ｐＴ１６４はＢｇｌＩＩで処理され、Ｅ．coli ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片処理により、平滑末端化される。前記２個の平滑末端断片はつなぎ合わされ、コンピテント(competent) Ｅ．coli中にトランスフォームされる。１．１ｋｂのｎｅｏフラグメントが１個挿入されたクローンを単離し、平滑なＸｈｏＩ部位とＢｇｌＩＩ部位の融合にて再生されたＢｇｌＩＩ部位がプラスミドｐＴ１６４にある唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位から１．３ｋｂ離れたところに位置しているものを同定するため、制限酵素分析を行う。その結果得られるプラスミドｐＴ１６５は、ｎｅｏ転写ユニットの５’側にフランキングした唯一のＢｇｌＩＩ部位で開裂しうる。
【０２０６】
マウスメタロチオネインＩ（ｍＭＴ−Ｉ）プロモーター−ｈＧＨエキソン１配列が付加的にスプライスドナー部位を含む１０塩基対フラグメントに融合したフラグメントを作るため、オリゴヌクレオチド１３．８と１３．９がポリメラーゼチェインリアクションに用いることができる。より多くのスプライスドナー部位又はコンセンサススプライスドナー部位が使えるかも知れないが、この選ばれたスプライスドナー部位は天然のｈＥＰＯイントロン１スプライスドナー部位に対応する。オリゴヌクレオチド（１３．８及び１３．９）は、ｐＸＧＨ５由来のおよそ０．７３ｋｂのｍＭＴ−Ｉプロモーター−ｈＧＨエキソン１フラグメント（図１）を増幅するために用いられる。その増幅されたフラグメント（フラグメント７）はＢｇｌＩＩで処理され、ＢｇｌＩＩで処理されたｐＴ１６５につなぎ合わされる。つなぎ合わされた混合物は、Ｅ．coliに導入される。ｍＭＴ−ＩプロモーターのＫｐｎＩ部位がｎｅｏ遺伝子の５’末端の近傍にあり、かつそのｍＭＴ−Ｉプロモーターが唯一のＨｉｎｄＩＩＩ部位に向かって転写が起こるように配置されたフラグメント７が１個挿入されたものを含むクローンが同定され、ｐＸＥＰＯ−１２と命名される。
【０２０７】
Figure 0003733110
オリゴ１３．８の太字でない部分は、５’境界部位(boundary)に天然のＫｐｎＩ部位を有するｍＭＴ−Ｉプロモーターと同一である。太字タイプは５’境界部位をＢｇｌＩＩ部位に変えるためのＢｇｌＩＩ部位テール部分を表す。
【０２０８】
Figure 0003733110
オリゴ１３．９の太字部分は、ｈＧＨ配列を表す。イタリックの部分はｈＥＰＯイントロン１の最初の１０塩基対に対応する。下線部のＢｇｌＩＩ部位はプラスミド構築の目的のため加えられた。
【０２０９】
プラスミドｐＸＥＰＯ−１２は、ｎｅｏ遺伝子とｈＥＰＯ配列で両側をフランクされたｍＭＴ−Ｉ／ｈＧＨ融合物を含む７．９ｋｂフラグメントを遊離するようＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ処理をすることによりジーンターゲティングに用いることができる。このフラグメント（ターゲティングフラグメント３）は、ｈＥＰＯをコードする配列を含まず、ヒトＥＰＯ領域上流へのターゲティングを指向するためにＥＰＯコーディング領域上流のおよそ−６２０からおよそ−６６２０の間にある配列のみを有する。ターゲティングフラグメント３は、実施例１８ｂ及び１８ｃに記載されたものと同様の条件を用いて、一次、二次又は不死化ヒト皮膚線維芽細胞にトランスフェクトされる。Ｇ４１８−耐性コロニーは、９６穴プレートの各々の穴に分別され、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄシステムス，ミネアポリス，ミネソタ）により、ＥＰＯの発現に対してスクリーニングされる。トランスフェクトしたＤＮＡがヒトゲノムの中にランダムにとりこまれた細胞はＥＰＯを生産することができない。トランスフェクトしたＤＮＡが内在性のｈＥＰＯプロモーター及び上流の配列と相同組み換えされた細胞は、ｍＭＴ−Ｉプロモーターと非転写配列、ｈＧＨ５’非翻訳配列及びｈＧＨエキソン１、及びｈＥＰＯイントロン１の最初の１０塩基対から成る１０塩基対リンカーがｈＥＰＯをコードする領域に対しておよそ−１９２０の位置にあるＢｇｌＩＩ部位に挿入されているキメラ遺伝子を含んでいる。通常サイレントであるｈＥＰＯプロモーターの上流にｍＭＴ−Ｉプロモーターが存在することにより、（５’から３’への）非翻訳メタロチオネイン及びｈＧＨの配列、ｈＧＨエキソン１、ｈＥＰＯイントロン１の最初の１０塩基対と同一のＤＮＡ１０塩基、及びｈＥＰＯ上流領域とｈＥＰＯエキソン１（ＥＰＯをコードする配列に対し、およそ−１９２０から＋１３位）のメッセージの合成が一次、二次あるいは不死化線維芽細胞（又は他のイト細胞）中で導かれるであろう。ｈＥＰＯイントロン１由来の１０塩基対リンカー配列は、ｈＧＨエキソン１をｈＥＰＯエキソン２のすぐ上流にある下流のスプライスアクセプター部位に結合させるためのスプライスドナー部位として働く。その結果生じる転写のプロセシングは、ｈＥＰＯ上流配列、プロモーター領域、エキソン１及びイントロン１配列をスプライスアウトするであろう。ｐＸＥＰＯ−１０，−１１及び−１２を用いた場合、メッセージの転写後のプロセシングは、ｍＭＴ−ＩプロモーターとｈＥＰＯエキソン１の間のｈＥＰＯ上流配列にある所望のメッセージを作りだすのに必要な生産的スプライシングの発生レベルを下げるスプライスアクセプター部位を除去するインビトロ突然変異法を用いることにより、改良されるかもしれない。ｈＧＨエキソン１によるｈＥＰＯエキソン１の置換により、ｈＥＰＯシグナルペプチドの最初の４アミノ酸がｈＧＨのアミノ酸１−３で置きかわったタンパク質が得られ、成熟タンパク質から翻訳後プロセッシングにより切り離され、発現細胞から分泌されるキメラシグナルペプチドが生じる。
【０２１０】
実施例２０．ｈＧＨ及び／又はｎｅｏ遺伝子を有するプラスミドによる正常ヒト乳房上皮細胞の安定なトランスフェクション
乳組織から分離された管断片の消化によりヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）を得る。乳組織は脂肪を取り去り、２〜４ｍｍ3 の小片に細切する。細切された組織は、ハンクス基本塩溶液（ＨＢＳＳ）で洗い、次にトリプシン化フラスコ〔ベルコ，ヴィンランド，ニュージャージー（Bellco, Vineland, NJ）〕中で１０ｇ組織あたりおよそ５０ｍｌの酵素溶液の割合で、酵素溶液にひたす。酵素溶液はコラゲナーゼＡ（ベーリンガーマンハイム，インディアナポリス，インディアナ）１ｍｇ／ｍｌ及びヒアルロンダーゼ（シグマ，セントルイス，モンタナ）１００ユニット／ｍｌを、５％子ウシ血清、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ギブコ，グランドアイランド，ニューヨーク）及び１０μｇ／ｍｌウシインシュリン（シグマ）を含む乳房上皮細胞基本培地（ＭＥＢＭ，クロネケティクス，サンディエゴ，カリフォルニア）で溶解したものから成る。消化は、３７℃、５％ＣＯ2 の条件下、オービタル振盪機（１８０ｒｐｍ）で一晩行われる。消化された組織は、大口径のピペットで繰り返し吸引放出することによりさらに分解させる。管断片(ductal fragment) は、１５又は５０ｍｌの円錐遠心分離管で１０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、ＨＢＳＳ（１０〜４０ｍｌ）で３回洗う。ペレットは、凍結用培地（ＭＥＢＭ＋２０％子ウシ血清＋１０％ＤＭＳＯ）に再度懸濁させ、液体窒素で凍らせておくか、単一細胞を得るために更に消化を行う。単一細胞を得るために、トリプシン（０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ，ギブコ）を管ペレット（０．５ｍｌペレットあたり１０ｍｌトリプシン）に加え、オービタル振盪機上で３７℃３０分（２００ｒｐｍ）インキュベートする。トリプシン処理は、２ｍｌの子ウシ血清を加えて終了させ、細胞は１２００ｒｐｍ１０分間の遠心で沈殿させる。細胞ペレットは増殖用培地に再懸濁させ、数を数えて非コーティング培養器に１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 接種する。ＨＭＥＣは、ウシインシュリン（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）、上皮細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ，コラボラティブリサーチ，ワルサム，マサチューセッツ）、ウシトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ，シグマ）、ハイドロコーチゾン（０．１４μＭ，シグマ）及びウシ下垂体抽出物（３５μｇ／ｍｌ，シグマ）を含むＭＥＢＭからなる血清を含まない成長培地ＭＥＧＭで通常培養される。
【０２１１】
培養初期のサブコンフルエント(subconfluent)なＨＭＥＣがトリプシン処理され、ＨＢＳＳ＋１５％子ウシ血清に再懸濁され、計数される。細胞は次にペレットにし、１０ｍｌのエレクトロポーレーション緩衝液（ＥＰＢ）に再懸濁して、もう一度ペレットにする。細胞は３×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌの割合でＥＰＢ＋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，シグマ）に再懸濁させる。スーパーコイルプラスミドＤＮＡを０．４ｃｍ電極ギャップを有する滅菌キュベット（バイオラッド，メルヴィル，ニューヨーク）に加える。０．５ｍｌの細胞懸濁溶液をキュベットに加え、滅菌トランスファーピペット（コスター，ケンブリッジ，マサチューセッツ）を用いてＤＮＡと混合する。エレクトロポーレーションのため、ジーンパルサー機器（バイオラッド，メルヴィル，ニューヨーク）は、容量９６０μＦ及び１５０−４００Ｖにセットする。エレクトロポーレーションに続いて、細胞はトランスファーピペットで除かれ、ＭＥＧＭを入れた１５ｍｌポリプロピレン円錐遠心管に移される。細胞懸濁液は、選別のため、１．５×１０6 ｃｅｌｌ／１００ｍｍ ｄｉｓｈの密度で組織培養皿に加えられる。４８時間後、細胞は５０μｇ／ｍｌのＧ４１８（ジェネチシン，ギブコ）を含むＭＥＧＭで再び培養される。選別皿は、２ｍｍ2 又はそれ以上大きな独立したコロニーが認められるまで、１４〜２８日間インキュベートされる。選別期間中、培養物には１週間ＭＥＧＭ＋５０μｇ／ｍｌＧ４１８を再添加せず、その後、週２回再添加する。コロニーは、クローニングシリンダーで単離され、９６又は２４穴プレートに移される。
【０２１２】
ＨＭＥＣは、電圧域１５０−４００Ｖで、ｐＸＧＨ３０１（１２０μｇ）、ｐｃＤＮＥＯ（５−６０μｇ）でトランスフェクトされるか又はｐＸＧＨ５とｐｃＤＮＥＯ（各々１００μｇ）でコトランスフェクトされた。２３個のｈＧＨ発現クローンにおけるｈＧＨ発現の平均は２．２μｇｈＧＨ／１０6 ｃｅｌｌ／２４時間であった。表９はトランスフェクトされたクローンとトランスフェクトされなかったクローンのサンプルが示した細胞分裂の数を要約したものである。データが示すように安定にトランスフェクトされたヒト乳房上皮細胞クローンは２０回以上の細胞分裂を示し、インビボでの蛋白供給や遺伝子治療のための細胞移植物としても使えるかも知れない。
【０２１３】
【表９】
Figure 0003733110
【０２１４】
実施例２１．不死化ヒト線維芽細胞株におけるヒトＥＰＯ領域のターゲティングと活性化
ヒト線維芽細胞中で内在性ｈＥＰＯ遺伝子が活性化されうるという仮説を試すため、ターゲティング構築物ｐＸＥＰＯ−１３が作られた。まず、マウスのメタロチオネイン−１プロモーター（ｍＭＴ−Ｉ）に結合したｈＥＰＯ遺伝子の最初のコドンの上流にある６３ｂｐのゲノムｈＥＰＯ配列を含むプラスミドｐＴ２２．１が構築された。ｍＭＴ−ＩとｈＥＰＯ配列を結合させるため、オリゴヌクレオチド２２．１から２２．４がＰＣＲに用いられた。これらのプライマーの性状は次の通りである。２２．１は、ｍＭＴ−Ｉ ＫｐｎＩ部位の２８ｂｐ上流から始まるｍＭＴ−Ｉプロモーターの一部と相同な２１塩基オリゴヌクレオチドである。２２．２と２２．３は、ｈＥＰＯ遺伝子の最初のコドンの３５塩基上流に始まる２８ｂｐのｈＥＰＯ配列及びオリゴヌクレオチド２２．２の塩基２９から始まるｍＭＴ−Ｉ配列を含むようなｈＥＰＯ及びｍＭＴ−Ｉ配列の結合を定める５８ヌクレオチドの相補的プライマーであり、天然のｍＭＴ−ＩのＢｇｌＩＩ部位を有し、ｍＭＴ−Ｉ配列を３０塩基延長させる。２２．４は２１ヌクレオチドの長さでｈＥＰＯ遺伝子の最初のコドンの７２５ｂｐ下流に始まるｈＥＰＯ配列と相同である。これらのプライマーは、上述のようにｍＭＴ−ＩとｈＥＰＯ配列の融合物を含む１．４ｋｂのＤＮＡ断片を増幅するのに用いられた。その結果生じるフラグメントは、ＫｐｎＩで切断され（ＰＣＲフラグメントは２つのＫｐｎＩ部位を含む：ｍＭＴ−Ｉプロモーター領域唯一の天然ＫｐｎＩ部位と、ｈＥＰＯ配列中唯一の天然ＫｐｎＩ部位である）、精製される。プラスミドｐＸＥＰＯ１（図５）は、同様にＫｐｎＩで切断され、１．４ｋｂフラグメントと６．４ｋｂフラグメントを遊離させた。６．４ｋｂフラグメントは精製され、１．４ｋｂのＫｐｎＩ ＰＣＲ融合フラグメントにつながれた。得られた構築物をｐＴ２２．１と呼ぶことにした。２番目の中間体、ｐＴ２２．２はｈＥＰＯ構造遺伝子の上流にあるおよそ６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（実施例１８ｆ参照）をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢＳＩＩＳＫ＋（ストラタジーン，ラジョラ，カリフォルニア）につないで構築した。３番目の中間体ｐＴ２２．３の構築はまず、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＭＣＩＮＥＯpolyＡ（ストラタジーン，ラジョラ，カリフォルニア）から１．１ｋｂのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩを切り出した。フラグメントは次にＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（ニューイングランド バイオラブス）で平滑末端化された。このフラグメントは、次にｐＢＳＩＩＳＫ＋のＨｉｎｃＩＩ部位（同様にしてＤＮＡポリメラーゼＩで平滑末端化している）につながれて、ｐＴ２２．３が作られた。４番目の中間体、ｐＴ２２．４はｐＴ２２．２由来のｎｅｏ遺伝子を含む１．１ｋｂのＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを精製し、このフラグメントをＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＴ２２．２につないで作られた。従ってｐＴ２２．４はｈＥＰＯフラグメント上流のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩのＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接したｎｅｏ遺伝子を有する。最後にｐＸＥＰＯ−１３は、ｐＴ２２．１から２．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩフラグメントをまず切り出すことにより作られた。このフラグメントのＥｃｏＲＩ部位は、ｍＭＴ−Ｉプロモーターの５’境界を定め、一方、このフラグメントのＡｃｃＩ部位はｈＥＰＯエキソン５の中にある。このようにＡｃｃＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントは、ほとんど完全なｈＥＰＯ発現ユニットを含み、エキソン５の一部と天然のポリアデニル化部位のみを欠く。この２．８ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＡｃｃＩフラグメントは精製され、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片処理により平滑末端化され、そしてＸｈｏＩで処理され、平滑末端化したｐＴ２２．４につなぎ合わされた。
【０２１５】
ＨＴ１０８０細胞はＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩで切断されたｐＸＥＰＯ−１３でトランスフェクトされた。このように切断されたｐＸＥＰＯ−１３は次のような３つの断片を作る。ａｍｐ遺伝子の一部を含む１ｋｂのベクターフラグメント、残りのベクター配列の１．７ｋｂフラグメント及びｈＥＰＯ，ｎｅｏおよびｍＭＴ−Ｉ配列を含む約８．９ｋｂの断片である。８．９ｋｂのＢａｍＨＩ／ＰｖｕＩフラグメントは、次の配列をＢａｍＨＩ部位から順に含んでいた。６．０ｋｂの上流ｈＥＰＯゲノム配列、１．１ｋｂのｎｅｏ転写ユニット、０．７ｋｂのｍＭＴ−Ｉプロモーター及びエキソン５内にトランケートされた２．８ｋｂのｈＥＰＯコーディング配列である。上記方法で切断された４５μｇのｐＥＸＰＯ−１３は、１２００万個の細胞のエレクトロポーレーションに用いられた（エレクトロポーレーション条件は、実施例１８ｂに記載）。このエレクトロポーレーションは合計８回繰り返され、計９６００万細胞に行われた。細胞はｍｌあたり１００万個の細胞密度になるよう培地と混合され、１ｍｌ量が各々最少３５ｍｌのＤＭＥＭ／１５％子ウシ血清を含む計９６個の１５０ｍｍ組織培養プレート（ファルコン）に分注された。翌日、培地は吸引除去され、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ）を含む新しい培地に交換された。１０日間のインキュベートの後、各プレートの培地はｈＥＰＯのＥＬＩＳＡ分析（Ｒ＆Ｄシステムズ）のため、サンプリングされた。９６プレートのうち６個が少なくとも１０ｍＵ／ｍｌのｈＥＰＯを含んでいた。これらのプレートの１つ、第１８番がｈＥＰＯ発現コロニーの精製のために選ばれた。９６の１５０ｍｍプレートの各々がおよそ６００のＧ４１８耐性コロニー（全９６プレート上のＧ４１８耐性コロニーの集計見積もりは５７，６００）を含んでいた。１８番プレート上の約６００コロニーは、トリプシン処理され、３６４穴プレート（ステアリン）に５０ｃｅｌｌｓ／ｍｌで再接種された。１週間のインキュベート後３６４穴プレートの大きい穴あたり約１０個の割合で、単独のコロニーが見えるようになった（このプレートは２４の大きい穴の各々の中に１６の小さい穴がある）。個々の穴は、この時ｈＥＰＯ発現についてスクリーニングされた。２つの大きい穴が少なくとも２０ｍＵ／ｍｌのｈＥＰＯを含んでいた。Ａ２号の穴で１６の小さい穴の間に１５のコロニーがあることが認められた。これらの小さい穴の個々の中身はトリプシン処理され、９６穴プレートの１６の別々の穴に移された。７日間のインキュベートの後、これら各々の穴から培地がｈＥＰＯのＥＬＩＳＡ分析のためサンプリングされた。番号１０の穴１つだけがｈＥＰＯを含んでいた。この細胞株は、ＨＴ１６５−１８Ａ２−１０と命名され、定量的ＥＰＯ分析、ＲＮＡ単離、ＤＮＡ単離のため培養に供された。ｈＥＰＯ生産の定量分析の結果は、２，５００ミリユニット／１００万細胞／２４時間であった。
【０２１６】
ｈＥＰＯエキソン５のＡｃｃＩ部位から３’非翻訳領域のＢｇｌＩＩ部位にのびる０．２ｋｂのＤＮＡプローブが、ＨＴ１６５−１８Ａ２−１０細胞のゲノムＤＮＡのプローブに用いられた。エキソン５のＡｃｃＩ部位でトランケートされたターゲティング構築物，ｐＸＥＰＯ−１３は、これらＡｃｃＩ／ＢｇｌＩＩ配列を有していないので、ｈＥＰＯ領域のターゲティングのため好適(diagnostic)である。天然ｈＥＰＯ配列が相同的に組み込まれた細胞株だけがＡｃｃＩ／ＢｇｌＩＩ配列と相同配列を含むｈＥＰＯｍＲＮＡを作るであろう。ＨＴ１６５１８Ａ２−１０は、３２−ＰでラベルしたＡｃｃＩ／ＢｇｌＩＩｈＥＰＯプローブとハイブリダイズする予期された大きさのｍＲＮＡを発現しているのがノーザンブロットにおいて認められた。制限酵素とサザンブロット分析により、ｎｅｏ遺伝子とｍＭＴ−ＩプロモーターはＨＴ１６５−１８Ａ２−１０細胞の２つのｈＥＰＯアレルのうちの１つに対してターゲットされたことが確認された。
【０２１７】
これらの結果により、相同組み換えは、ヒト線維芽細胞中で通常サイレントである遺伝子の調節領域をターゲットし、その遺伝子の機能を活性化させるのに用いうることが示された。
【０２１８】
Figure 0003733110
【０２１９】
配列表フリーテキスト
配列番号：１の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：２の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：３の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：４の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：５の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：６の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：７の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：８の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：９の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：１０の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：１１の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：１２の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：１３の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：１４の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：１５の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：１６の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：１７の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：１８の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：１９の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：２０の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：２１の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：２２の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：２３の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：２４の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
配列番号：２５の塩基配列は、実施例で使用したプライマーの配列である。
【０２２０】
均等物
当業者であれば、単に常識的実験手法を用いて、ここに述べた発明の具体的態様に対する多くの均等物を知りまた確認し得るであろう。これらのおよび他の全ての均等物は下記のクレームの範疇に含まれるものである。
【０２２１】
【発明の効果】
本発明により、特にヒトの遺伝子療法に有益な、直鎖状ＤＮＡ構築物、タンパク質を生産する方法、一次または二次細胞に存在する遺伝子の発現を変える方法、トランスフェクトされた一次または二次細胞、トランスフェクト二次細胞のクローン細胞株を生産する方法、並びにトランスフェクト二次細胞のクローン細胞株が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウスメタロチオネインプロモーターの支配下にあるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子を含むプラスミドｐＸＧＨ５の概略図である。
【図２】図２は、プラスミドｐｃＤのＢａｍＨＩ部位に挿入したプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏに由来するｎｅｏコード領域（ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片）、ｐＢＲ３２２由来のＡｍｐ−Ｒ配列とｐＢＲ３２２Ｏｒｉ配列、およびＳＶ４０由来のポリＡと１６Ｓスプライスジャンクションと初期プロモーター領域を含むプラスミドｐｃＤＮＥＯの概略図である。
【図３】図３は、ヒト成長ホルモン遺伝子およびｎｅｏ遺伝子を含むプラスミドｐＸＧＨ３０１の概略図である。
【図４】図４は、本発明の方法の流れ図である。
【図５】図５は、プラスミドｐＸＥＰＯ１の概略図である。黒色実線アークはｐＵＣ１２バックボーンを示し、矢印はアンピシリン抵抗性遺伝子の転写の方向を示す。点線アークはマウスメタロチオネインプロモーター（ｐｍＭＴ１）を示す。黒ボックスによって遮られた白抜きアークはヒトエリスロポエチンＥＰＯ遺伝子を示す（黒ボックスはエキソンを示し、矢印はｈＥＰＯ転写方向を示す）。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の相対的位置を示す。
【図６】図６は、プラスミドｐＥ３ｎｅｏＥＰＯの概略図である。ヒトエリスロポエチン遺伝子およびｎｅｏならびにａｍｐ抵抗性遺伝子の位置を示す。矢印は様々な遺伝子の転写の方向を示す。ｐｍＭＴ１はマウスメタロチオネインプロモーター（ｈＥＰＯ発現を促す）を示し、ｐＴＫは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（ｎｅｏ発現を促す）を示す。マップの点線部分は、ヒトＨＧＰＲＴ配列の位置を示す。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の相対的位置を示す。
【図７】図７は、ｈＥＰＯ遺伝子を転写的に活性化させる方法の図式である。
【図８】図８は、ｈＥＰＯ遺伝子を転写的に活性化させる方法の図式である。
【図９】図９は、トランスフェクト一次ヒト皮膚線維芽細胞（２系統、ＨＦ９６−１１とＨＦ９６−２３）による長期インビトロｈＧＨ産生の判定結果を示す。
【図１０】図１０は、トランスフェクト一次ウサギ皮膚線維芽細胞によるインビトロでのヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現のグラフ図である。
【図１１】図１１は、トランスフェクトｈＧＨ発現ウサギ線維芽細胞を移植されたマウスにおけるｈＧＨの血清レベルの経時変化を調べるアッセイの結果を示す。
【図１２】図１２は、腎臓被膜下移植片から回収した細胞におけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）発現のグラフ図である。
【図１３】図１３ａは、対照マウスおよびトランスフェクトｈＥＰＯ発現ウサギ線維芽細胞を移植されたマウスにおけるヘマトクリット（ＨＣＴ）値を示す。図１３ｂは、トランスフェクトｈＥＰＯ発現ウサギ線維芽細胞を移植されたマウスの血清中のｈＥＰＯを検出するアッセイの結果を示す。

Claims (8)

  1. （ａ）標的部位に相同するターゲティング配列、および
    （ｂ）外因性調節配列
    を含有したＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡ内の標的部位で相同組換えした場合、それにより、該調節配列を挿入または発現対象遺伝子の調節領域の全部もしくは一部と置換し、細胞における標的遺伝子の発現を変える、直鎖状ＤＮＡ構築物、ここで、ＤＮＡ構築物の各末端はエキソヌクレアーゼにより生成された１本鎖突出であり、一本鎖突出のそれぞれが１００〜１０００ヌクレオチド長である、直鎖状ＤＮＡ構築物。
  2. １本鎖突出のそれぞれが３’突出または５’突出である、請求項１記載の構築物。
  3. （ａ）請求項１記載の DNA 構築物を HT1080 細胞に導入し、タンパク質をコードする標的遺伝子の発現を変化させるステップ；
    （ｂ）該タンパク質の生産に適する条件下に細胞を培養し、それにより該タンパク質を生産するステップ；ならびに
    （ｃ）タンパク質が生産されたことを確認するステップ
    を含む、タンパク質を生産する方法。
  4. タンパク質が、カルシトニン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様成長因子、副甲状腺ホルモン、神経成長因子、インターロイキン、免疫グロブリン、触媒抗体、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、血液凝固ＶＩＩＩ因子、血液凝固ＩＸ因子、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ａ−１、グロビン、低密度リポタンパク質受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−２受容体アンタゴニスト、アルファ−１型アンチトリプシン、免疫応答物質修飾因子、成長ホルモン、インターフェロン、グルコセレブロシダーゼ、コロニー刺激因子およびエリスロポエチンからなる群より選択される、請求項３記載の方法。
  5. （ｄ）細胞由来のタンパク質を単離するステップをさらに含み、かつ該タンパク質がエリスロポエチン、成長ホルモン、グルコセレブロシダーゼまたはコロニー刺激因子である、請求項３記載の方法。
  6. （ａ）調節配列を含有した請求項１に記載のＤＮＡ構築物を相同組換えに適する条件下に一次または二次細胞に導入し、それにより、該調節配列を挿入または発現対象遺伝子の調節領域の全部もしくは一部と置換し、該遺伝子の発現を変えるステップ、ならびに
    （ｂ）該一次または二次細胞を培養して、遺伝子の発現が変えられた相同組換え二次細胞のクローン細胞株を生産するステップ、
    を含む、一次または二次細胞に存在する遺伝子の発現を変える方法。
  7. 遺伝子が、ヒトエリスロポエチン遺伝子、成長ホルモン遺伝子およびインシュリン遺伝子からなる群より選択される、請求項６記載の方法。
  8. 細胞が、線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液細胞成分、筋細胞、肝細胞およびそれらの前駆体からなる群より選択された脊椎動物起源の一次または二次細胞である、請求項６記載の方法。
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