JP3831008B2 - Ｎａｄｈ、ｎａｄｐｈ及びそれらの類似体の電気化学的再生に適切なメディエーター - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
診断薬産業においては、酵素の有する選択性を、電流測定による検出の感度と結びつけた分析方法に関心が集まっている。ニコチンアミド補酵素（ＮＡＤ及びＮＡＤＰ）の還元は、これらが、デヒドロゲナーゼによって触媒される反応において生成することから、特に重要である。デヒドロゲナーゼにより触媒される、次式：
【０００２】
【化２】
【０００３】
の反応は、生物学的細胞中及び分析学的反応において重要な役割を果たしている。種々の基質から生成物への転換を選択的に触媒する、数百の異なるデヒドロゲナーゼが知られている。基質、例えばグルコースが酸化されると、酵素であるＮＡＤ+ 及び／又はＮＡＤＰ+ は、それぞれＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに還元される。これらの補酵素類は、それらがデヒドロゲナーゼ酵素と共に作用して、エネルギー移動酸化還元対を形成する能力のせいで、その反応における必要な因子である。ピリジンにリンクしたデヒドロゲナーゼは、２還元当量を基質からピリジンヌクレオチドの酸化型へと逆に転移させる。そのうち１つは還元されたピリジンヌクレオチド中に水素原子として見いだされ、もう１つは、電子である。基質から離れたもう１つの水素原子は、遊離のＨ+ として、媒体中に見いだされる。
【０００４】
補酵素ＮＡＤ+ 及びＮＡＤＰ+ は、もしこれらを安価な使い捨ての分析器具で、経済的に使用しようとするならば、これらを再生、再酸化してもとの状態に戻すことが必須になるような、高価な化学薬品である。
【０００５】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ＮＡＤＨは、１ボルトオーダーの高い過電圧によってのみ、種々の塩基電極材において直接的に酸化される。しかし、この過電圧は、ＮＡＤＨから電極への電子の移動を媒介する機能物を電極表面に吸着させることにより、減少させることができる。このような媒介物（メディエーター）は、典型的に、過剰の過電圧を要さずに電気化学的に再酸化されて、電気化学的再生の副次的システムとしてそれ自体が有用となる材料から選択される。この目的に適切な種々のメディエーターが公知である。米国特許第4,490,464 号には、発明の背景として、フェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）；フェナジンエトスルフェート（ＰＥＳ）；チオニン及び１，２−ベンゾキノンのようなメディエーターが記載されている。この特許は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの類似体の酸化を触媒するために、ヘテロ原子を有するか又は有しない、少なくとも３個、好ましくは４個以上の縮合芳香族環からなる縮合芳香族環系を、メディエーターとして電極表面に付与することにより改質された電極についてさらに記載している。さらに詳細には、この特許はアルキルフェナジニウムイオン、フェナジニウムイオン、フェナジノン、フェノキサジニウムイオン、フェノキサジノン、フェノチアジニウムイオン又はフェノチアジノンのいずれか１つを含む構造的要素による、補酵素又はそれらの類似体との電子の交換について記載している。
【０００６】
J. Electroanal. Chem. 287, 61-80 (1990) には、式（Ｉ）：
【０００７】
【化３】
【０００８】
で示される３−β−ナフトイルトルイジンブルーＯであって、4,490,464 号特許中で開示されているもののなかではおそらく一番効果的な公知のフェノチアジニウムメディエーターが記載されている。この特許において開示されている種々のメディエーターは、J. Electroanal. Chem. 292, 115-138 (1990) において比較されている。
【０００９】
フェノキサジニウム及びフェノチアジニウムイオンは、4,490,464 号特許に開示されており、これらは上記（Ｉ）式のようにプラスに荷電した種類であって、本願発明のメディエーターとは容易に区別される。この、4,490,464 号特許にクレームされているフェノキサジオン類及びフェノチアジノン類は、３Ｈ−フェノチアジン類（II）及び３Ｈ−フェノキサジン類（III)：
【００１０】
【化４】
【００１１】
（式中、３位がカルボニルの酸素によって誘導体化されている）である。これらの化合物は、それぞれ式（II）及び（III)中の酸素原子が、置換フェニル環を有する窒素原子により置き換えらている本願の化合物と、構造的な類似点を有する。しかし、実際には、これらの化合物は、極めて相違するものであって、（II）及び（III)の化合物のカルボニルの酸素を、フェニル置換した窒素原子で置き換えることにより効果的なメディエーターを生じ得るということが、先行技術から示唆されるということは全くない。
【００１２】
メディエーターとしての用途が本願中に教示されている化合物は、米国特許第4,710,570 号に開示されており、その中で、これらの染料の「ロイコ」型、すなわち還元型が、「感圧性の、サーモグラフによる、光サーモグラフによる、及び写真による造影システムにおける染料形成剤として適切である」との記載がある。
【００１３】
米国特許第5,264,092 号には、ＮＡＤＨの電気化学的再生に有用である、ポリマーに共有結合した4,490,464 号特許のメディエーターを開示している。この特許においては、メディエーターが結合する種々のポリマー主鎖を開示している。ポリマー／メディエーターによって改質された電極もまた開示されている。本発明のある種のメディエーターも、ポリマー上に固定された場合には良好な性能を発揮する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、補酵素であるジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）又はそれらの類似体の電気化学的再生に適切な電極に関し、該電極は、その表面に、置換又は非置換の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキシジン類からなる群から選択される１種以上のメディエーターを含む、メディエーター機能を付与されている。
【００１５】
本発明は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキシジン類化合物が、ＮＡＤＨの電気化学的再生（酸化）に有用なメディエーターであるという発見に基づいている。本発明のメディエーターは、一般式（IV）及び（Ｖ）により表される。
【００１６】
【化５】
【００１７】
上記の式（IV）及び（Ｖ）中のＲ1 及びＲ2 が、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の置換基を表し得ることは自明のことである。そのような置換基は、電子伝達の要件として必須な電気化学的性質を有する安定な化合物を調製する当業者の能力によってのみ限定されるものである。
【００１８】
例えば、上記式中の置換基Ｒ1 及びＲ2 は、同一であっても異なっていても良く、水素、低級アルキル、アリール、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族及び脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン（−Ｂ（ＯＨ)2）などから選択される。Ｒ1 及びＲ2 に含まれる脂肪族及び芳香族基は、それ自身種々の置換基を有することができる。
【００１９】
置換基Ｒ1 及びＲ2 は、メディエーターの酸化−還元（レドックス）電位を調節するか、溶解度を変化させるか、又はポリマー若しくは個体支持体にメディエーターが共有結合するための取っ手（handle）の機能を果たすことができる。
【００２０】
式（IV）及び（Ｖ）の化合物は、単一の式（Ａ）
【００２１】
【化６】
【００２２】
（式中、Ｘは、酸素又は硫黄を表し、Ｒ1 及びＲ2 は、式（IV）及び式（Ｖ）において定義したとおりである）で示される。
【００２３】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型はＮＡＤ+ 、還元型はＮＡＤＨ）は、化学的酸化還元の機能を多くのデヒドロゲナーゼ酵素に提供する、補助因子である。この補助因子は、基質分子が酸化される一連の酵素反応の間に還元される。これらの酵素を基質濃度測定の手段として使用することを目的とする、アンペロメトリー（電流滴定）によるバイオセンサーは、この補助因子が電気化学的に再酸化されるときに発生する電流と、該濃度とを連関させたものである。このＮＡＤＨは、グラファイト、熱分解炭素、ガラス状カーボン、白金、金又はこれらの物質から製造される複合体の電極上で、メディエーターなしで電気化学的に再酸化されうるが、この反応は、大きな過電圧及び電極の汚れなどをはじめとするいくつかの問題点を引き起こす。
【００２４】
本発明は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン類（IV）及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキシジン類（Ｖ）又はそれらの誘導体の、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ補酵素の電気化学的再生時における一次的使用を記載しており、したがって、広範囲のフェノチアジン及びフェノキサジン誘導体を包含する。本願のメディエーターは、またＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの、誘導体の電気化学的再生にも用い得る。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの誘導体とは、DolabdjianらがEnzyme Engineering Vol. 4, G.B. Brown and G. Manecke, eds., Plenum Press, New York, 1978, pp.399-400に記載したように、該補酵素がポリマーに結合した場合、又は、M.Persson らがBiotechnology 9, pp.280-284 (1991)中に記載したように該補酵素がデヒドロゲナーゼ酵素に共有結合した場合、又はそれらがデヒドロゲナーゼ酵素の補助因子として機能しうる範囲の他の置換基を有している合成類似体である場合、などのような、改質された補酵素を含有する。これらの引例は、参考のためにここに含めた。
【００２５】
好ましい実施態様においては、メディエーターは、ガントレッツ（GANTREZ)、すなわちメチルビニルエーテルとマレイン酸無水物の共重合体に共有結合する。ガントレッツは、次式：
【００２６】
【化７】
【００２７】
（式中、ｎは好ましくは約１２０から５００である）
で表すことができる。
【００２８】
本発明において有用なメディエーターは、一般式（IV）及び（Ｖ）で示されている。合成され、試験された該化合物類の構造は、アラビア数字で番号をつけて、表１の第１欄に示す。表１の第２〜７欄は実施例III 及びIVに記載したメディエーターの評価の結果を要約したものである。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
【００３２】
これらのフェノチアジン類及びフェノキサジン類の中で、製造され、ＮＡＤＨのメディエーターとして好適な性質を有しているとされたものとしては、
３−（４′−クロロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−ジエチルアミノ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−エチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−ニトロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−メトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
７−アセチル−３−（４′−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
７−トリフルオロメチル−３−（４′−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−ω−カルボキシ−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
【００３３】
３−（４′−（２″−（５″−（ｐ−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾリル））フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
６−（４′−エチルフェニル）アミノ−３−（４′−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
６−（４′〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニル）アミノ−３−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンホウ酸、
３−（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−カルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン、
３−（２′，５′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン酸及び３−（３′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸がある。
【００３４】
【実施例】
本発明を実施する方法は、さらに以下の実施例で説明する。
【００３５】
実施例Ｉ（メディエーターの合成）
一般に、メディエーターとして有用な本発明の化合物の合成は、アニリンと、フェノチアジン又はフェノキサジンとの酸化的カップリングを含む。Liebigs Ann. Chemn. 322, 39 (1902)には非置換の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンの合成が報告されており、一方、米国特許第4,710,570 号には、他の２つの類似体の合成が報告されている。これらの引例のどちらも、参考として含めた。これらの化合物の一般的合成スキームを、表Ｉ中の化合物１８を例としてとり上げ、スキームＩに示した。
【００３６】
【化８】
【００３７】
表Ｉ中の特定の化合物（化合物４、１２及び２０）の合成は、以下のようにして実施した。
【００３８】
３−（４′−トリフルオロメチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン（化合物４）
フェノチアジン（２．０ｇ、１０mmol）及び４−アミノベンゾトリフルオリド（１．７７ｇ、１１mmol）を、メタノール（ＭＥＯＨ）１００mlを４５℃まで暖めながらその中に溶解し、ＭＥＯＨ８０ml中に溶解したＩ2 （５．０ｇ、１９．４mmol）の溶液を一度に加え、４５℃で３時間攪拌した。反応混合物をろ過し、得られた固形物をＭＥＯＨ １００mlで洗浄した。固形物を、トリエチルアミン（ＮＥｔ3)６mlを含有するＣＨＣｌ3 ６０mlに溶解し、ついでこの溶液をヘキサン２００mlで希釈し、氷浴中で２時間冷却した。分離してきた紫色の固形物をろ取し、ＣＨＣｌ3 ／ＮＥｔ3 （１０：１、v/v)５０ml中に再溶解し、シリカゲル２５０g 上で、ＣＨＣｌ3 ／アセトン（９６：４、v/v)で展開するクロマトグラフィーに付した。紫色の生成物のバンドを集め、減圧下で蒸発乾固して、mp= ２０７−２０８℃の、化合物４（０．２６ｇ、７．３％）を得た。
分析値：Ｃ19Ｈ11Ｎ2 Ｆ3 Ｓとしての、
理論値： Ｃ、６３．８４；Ｈ、３．３８；Ｎ、７．８４
測定値： Ｃ、６３．６９；Ｈ、３．２６；Ｎ、７．８４
【００３９】
３−（３′，５′−ジカルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン（化合物１８）
フェノチアジン（１．０ｇ、５．０mmol）と５−アミノイソフタル酸（０．９ｇ、５．０mmol）を、ＭｅＯＨ２００ml中に溶解し、１０℃に冷却し、１M のＡｇＮＯ3 ３０ml（３０mmol）を加えた。１０℃で３０分攪拌した後、Ｈ2 Ｏ（４０ml）を加え、更に５分間攪拌を続けた。固形の生成物をろ取し、Ｈ2 Ｏ（５０ml）で洗浄した。固形物を、濃ＮＨ4 ＯＨ水溶液１０mlを含むＭｅＯＨ５００mlに溶解し、２０分間攪拌した後にろ過してＡｇを取り除いた。ろ液を、減圧下でもとの容量の約半分まで濃縮し、一晩５℃で冷蔵した。ついで、混合物をCelite（Celite Corp.）を通してろ過し、減圧下で固形物が分離しはじめるまで濃縮した。得られた溶液約１００mlを、再びCeliteを通してろ過し、酢酸エチル９００mlで希釈し、１５分間放置した。分離した赤色の固形物をろ過により回収し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥して化合物１８（１．５５ｇ、８２．５％）を得た。
【００４０】
３−（３′，５′−ジカルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン（化合物２０）
フェノキサジン（０．９２ｇ、５mmol）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１０mlに溶解し、濃ＮＨ4 ＯＨ水溶液１mlを含有する５−アミノイソフタル酸（０．８８ｇ、４．８６mmol）のＨ2 Ｏ（１０ml）溶液と共に、周囲温度で攪拌した。混合物に１．０M のＡｇＮＯ3 水溶液１３．５mlを急速に加え、２時間攪拌し、その間に固形分が分離した。この固形分を、ろ過により回収し、ＴＨＦ各回１００mlで３回抽出した。合わせた抽出液を減圧下で蒸発乾固し、暗色の固体０．８ｇを得、これをＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（１：１、v/v)１００mlを暖めながらその中に取り、シリカゲル３００ｇ上でＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（２：１、v/v)で展開するクロマトグラフィーに付した。暗橙色の生成物のバンドを集め、これを減圧下で蒸発乾固して化合物２０（０．３０ｇ、１６．７％）を得た。
【００４１】
当業者であれば、上記で説明した手順を用いて、これらの化合物の置換類似体を広い範囲にわたって合成することができる。
【００４２】
実施例II（ポリマーに結合したメディエーターの製造）
ここにＰ−３として示すポリマー結合メディエーターの合成方法は、本願発明の範囲内の、ポリマーに結合した他のメディエーターを製造するのに用いられる方法の代表例である。この製造方法は、スキーム２及びそれに続く記載に説明するとおりである。Ｐ−３は、「ガントレッツ上４０％が化合物１３である」と表現されてもよく、それは、ポリマー上の無水物基の４０％が化合物１３のアミノ部分と反応しているからである。
【００４３】
【化９】
【００４４】
ガントレッツ上の４０％が化合物１３であるもの（Ｐ−３）
ガントレッツＡＮ−１１９（ISP Technologies, Inc., Wayne, NJ)（０．１５６ｇ、１．０mmol、無水物）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０．０mlに加えた溶液を、不活性ガス雰囲気下、周囲温度に保ち、無水ＤＭＦ５．０ml中に化合物１３（０．１３２６ｇ、０．４mmol）と無水トリエチルアミン（０．５６ml、４．０mmol）とを加えた溶液を一度に加えた。さらにＤＭＦ３．０mlを用いて痕跡量の化合物１３溶液をすすぎ入れ、ついで反応混合物を１時間攪拌した。この混合物をＨ2 Ｏ（２５ml）で希釈し、１５分攪拌し、ついでさらにＨ2 Ｏ（１７５ml）と混合した。得られた溶液を濃ＨＣｌ（３．０ml）で酸性とすると、生成物が固体として分離してきた。この混合物を、２０分間、１０，４００×G で遠心分離し、上清を捨てた。得られたペレットを超音波処理により０．１M ＨＣｌ（２０ml）に再懸濁させ、２０分間、３３，４００×G で遠心分離した。上清を捨て、ペレットを超音波処理により１００％エタノール２０ml中に再懸濁し、ついで３０分間、３３，４００×G で遠心分離した。上清を捨て、ペレットを減圧下で乾燥して、Ｐ−３（０．２６ｇ）を、黒色粉末として得た。
【００４５】
ポリマー結合メディエーターＰ１（ガントレッツ上の２０％が化合物１１である）及びＰ−２（ガントレッツ上の２０％が化合物１３である）は、化合物１３の０．４mmolのかわりに化合物１１及び１３の０．２mmolを用いた他はＰ−３を調製するのと同様にして調製した。
【００４６】
実施例III （グラファイト電極上のメディエーターの評価）
グラファイト棒電極（ＧＲＥ：Johnson Matthey Electronics, Ward Hill, MA）（直径３mmのもの）の電極表面を、まずきめの細かい紙ヤスリで、ついで、１ミクロン以下のアルミナ粒子の懸濁液で研磨したものを準備した。メディエーターの１〜２mMメタノール溶液を調製し、電極をこの溶液に２分間浸漬した。ついで、電極を水ですすぎ、０．２５M リン酸緩衝液（pH＝７．０）に短時間浸した。電流対電圧の様子を、まず測定して、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対するプラスピークとマイナスピークの位置を決定した。ついでＮＡＤＨを２０〜２００μM の濃度で含有するpH＝７．０の溶液中で、上記のサイクリックボルタンメトリー実験で得られる酸化ピーク電圧（Ｅ°OX）より一般に１００mV高い電圧を用いて電流を測定し（使用した実際の電圧は表１の３欄に示した）、最小二乗法により得られた、ＮＡＤＨ濃度データに対する電流の直線の傾斜により、各メディエーターの相対感度を、ＮＡＤＨ１μM 当たりの電位（μA)として得た。種々のメディエーターに対するこれらの傾斜を、表１の４欄に示した。ここで、傾斜が大きくなるほど、メディエーターとしては良好である。比較として、これらの条件のもとでの３−β−ナフトイル−トルイジンブルー０（Ｉ）の傾斜は、０．００７５である。
【００４７】
実施例IV（プリント電極上のメディエーターの評価）
プリントされたセンサーカードと、グラファイト／炭素作用電極及び銀／塩化銀参照電極からなる、プリント電極の実験を実施した。グラファイト／炭素電極に用いたインキは、No.423SS（Acheson Colloids Co., Port Huron, MI）であり、銀／塩化銀参照電極には、１５〜２５％ＡｇＣｌと混合したNo.427SS銀インキ（販売元上記と同じ）を用いた。電極の表面部分は、０．０３cm2 であった。
【００４８】
サイクリックボルタンメトリー実験を、プリント電極上で、グラファイト電極上で実施したと同様に実施した。図１では、０．６mMの化合物１８の、pH＝７．０の０．６mMＰＩＰＥＳ緩衝液のみの中で測定した場合と、５mMＮＡＤＨの存在下での場合とのサイクリックボルタモグラムを示した。ＮＡＤＨの存在下、電圧２６mVにおける電流の増加は、ＮＡＤＨにより還元されたメディエーターの酸化によるものである。このメディエーターは、これがＮＡＤＨを酸化してＮＡＤ+ にするときに還元され、ついで、電極において電気化学的に再酸化される。実際、このメデイエーターは、ＮＡＤＨを直接に酸化するのに必要な電位よりもかなり低い電位においてその電気化学的酸化を促進した。図２では、直接に（メディエーターなしに）プリント電極上で酸化した場合の、ＮＡＤＨの典型的サイクリックボルタモグラムを示した。より高いピーク電位（４４３mV）が明らかであった。
【００４９】
グルコース濃度を測定するバイオセンサーは、酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼが、グルコースをグルコノラクトンに酸化する際にＮＡＤ+ を還元してＮＡＤＨにすることを利用している。メディエーターによるＮＡＤＨからＮＡＤ+ への電気化学的再酸化が、該グルコース濃度に比例する電流を生じさせる。
【００５０】
典型的グルコースバイオセンサーは、以下のようにして製造した。：
２５mMのＫＣｌを含有するpH＝７．０のリン酸緩衝液１００mM中メディエーター４mMの溶液を調製し、５％スルフィノール（Surfynol, Air Products and Chemicals, Inc., Allentown, PA)１．９６ｇ、ＮＡＤ（０．３２ｇ）、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ（Toyobo）０．７０ｇ、pH＝７．０の０．５M ＰＩＰＥＳ緩衝液１．４４ｇ及び脱イオン水５．５mlからなる同量の溶液で希釈した。混合物１．７５μl をセンサー領域に塗布し、室温で放置して乾燥し、約２０分乾燥した。この電極を小さなキャピラリー挿入部（gap)を有するフォーマット中に組み入れ、グルコース水溶液で処理して表１の６欄に記載した電位で電流を測定した。これを、グルコースを各０、５０、１００、２００及び５００mg/dl の濃度で含む試料に関して行い、グルコース濃度に対する電流の最小二乗法により得られた直線（lisine line)の傾斜が、各メディエーターの相対感度（μA/グルコースmg/dl)を表していた。傾斜が大きくなるにしたがって、メディエーターの性能は良好になる。これらの傾斜は、表１の最終欄に示した。
【００５１】
図３は、化合物１８に関して、１００mV及び３００mVの電位においてグルコース濃度に対する電流をプロットしたものを示す。
【００５２】
各々のポリマー結合メディエーターは、完成したグルコースバイオセンサー中に上述したように組み込まれ、その相対感度は、表２の最終欄に示した。
【００５３】
【表４】
【００５４】
図４は、３種のポリマー結合メディエーターに関して、３００mVの電位においてグルコース濃度に対する電流をプロットしたものを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】０．６mMＰＩＰＥＳ緩衝液中、pH７．０における、化合物１８（０．６mM）の、単独での、及び５mMＮＡＤＨの存在下でのサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２】プリント電極上で直接的に酸化されたＮＡＤＨの、典型的なサイクリックボルタモグラムを示す。
【図３】設定された電圧において、本発明のメディエーターの１種に関して、グルコース濃度に対する電流をプロットしたものである。
【図４】ポリマーに結合したメディエーターを用いた場合の、グルコース濃度に対する電流をプロットしたものである。
【発明の属する技術分野】
診断薬産業においては、酵素の有する選択性を、電流測定による検出の感度と結びつけた分析方法に関心が集まっている。ニコチンアミド補酵素（ＮＡＤ及びＮＡＤＰ）の還元は、これらが、デヒドロゲナーゼによって触媒される反応において生成することから、特に重要である。デヒドロゲナーゼにより触媒される、次式：
【０００２】
【化２】
の反応は、生物学的細胞中及び分析学的反応において重要な役割を果たしている。種々の基質から生成物への転換を選択的に触媒する、数百の異なるデヒドロゲナーゼが知られている。基質、例えばグルコースが酸化されると、酵素であるＮＡＤ+ 及び／又はＮＡＤＰ+ は、それぞれＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに還元される。これらの補酵素類は、それらがデヒドロゲナーゼ酵素と共に作用して、エネルギー移動酸化還元対を形成する能力のせいで、その反応における必要な因子である。ピリジンにリンクしたデヒドロゲナーゼは、２還元当量を基質からピリジンヌクレオチドの酸化型へと逆に転移させる。そのうち１つは還元されたピリジンヌクレオチド中に水素原子として見いだされ、もう１つは、電子である。基質から離れたもう１つの水素原子は、遊離のＨ+ として、媒体中に見いだされる。
【０００４】
補酵素ＮＡＤ+ 及びＮＡＤＰ+ は、もしこれらを安価な使い捨ての分析器具で、経済的に使用しようとするならば、これらを再生、再酸化してもとの状態に戻すことが必須になるような、高価な化学薬品である。
【０００５】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ＮＡＤＨは、１ボルトオーダーの高い過電圧によってのみ、種々の塩基電極材において直接的に酸化される。しかし、この過電圧は、ＮＡＤＨから電極への電子の移動を媒介する機能物を電極表面に吸着させることにより、減少させることができる。このような媒介物（メディエーター）は、典型的に、過剰の過電圧を要さずに電気化学的に再酸化されて、電気化学的再生の副次的システムとしてそれ自体が有用となる材料から選択される。この目的に適切な種々のメディエーターが公知である。米国特許第4,490,464 号には、発明の背景として、フェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）；フェナジンエトスルフェート（ＰＥＳ）；チオニン及び１，２−ベンゾキノンのようなメディエーターが記載されている。この特許は、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの類似体の酸化を触媒するために、ヘテロ原子を有するか又は有しない、少なくとも３個、好ましくは４個以上の縮合芳香族環からなる縮合芳香族環系を、メディエーターとして電極表面に付与することにより改質された電極についてさらに記載している。さらに詳細には、この特許はアルキルフェナジニウムイオン、フェナジニウムイオン、フェナジノン、フェノキサジニウムイオン、フェノキサジノン、フェノチアジニウムイオン又はフェノチアジノンのいずれか１つを含む構造的要素による、補酵素又はそれらの類似体との電子の交換について記載している。
【０００６】
J. Electroanal. Chem. 287, 61-80 (1990) には、式（Ｉ）：
【０００７】
【化３】
で示される３−β−ナフトイルトルイジンブルーＯであって、4,490,464 号特許中で開示されているもののなかではおそらく一番効果的な公知のフェノチアジニウムメディエーターが記載されている。この特許において開示されている種々のメディエーターは、J. Electroanal. Chem. 292, 115-138 (1990) において比較されている。
【０００９】
フェノキサジニウム及びフェノチアジニウムイオンは、4,490,464 号特許に開示されており、これらは上記（Ｉ）式のようにプラスに荷電した種類であって、本願発明のメディエーターとは容易に区別される。この、4,490,464 号特許にクレームされているフェノキサジオン類及びフェノチアジノン類は、３Ｈ−フェノチアジン類（II）及び３Ｈ−フェノキサジン類（III)：
【００１０】
【化４】
（式中、３位がカルボニルの酸素によって誘導体化されている）である。これらの化合物は、それぞれ式（II）及び（III)中の酸素原子が、置換フェニル環を有する窒素原子により置き換えらている本願の化合物と、構造的な類似点を有する。しかし、実際には、これらの化合物は、極めて相違するものであって、（II）及び（III)の化合物のカルボニルの酸素を、フェニル置換した窒素原子で置き換えることにより効果的なメディエーターを生じ得るということが、先行技術から示唆されるということは全くない。
【００１２】
メディエーターとしての用途が本願中に教示されている化合物は、米国特許第4,710,570 号に開示されており、その中で、これらの染料の「ロイコ」型、すなわち還元型が、「感圧性の、サーモグラフによる、光サーモグラフによる、及び写真による造影システムにおける染料形成剤として適切である」との記載がある。
【００１３】
米国特許第5,264,092 号には、ＮＡＤＨの電気化学的再生に有用である、ポリマーに共有結合した4,490,464 号特許のメディエーターを開示している。この特許においては、メディエーターが結合する種々のポリマー主鎖を開示している。ポリマー／メディエーターによって改質された電極もまた開示されている。本発明のある種のメディエーターも、ポリマー上に固定された場合には良好な性能を発揮する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、補酵素であるジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）又はそれらの類似体の電気化学的再生に適切な電極に関し、該電極は、その表面に、置換又は非置換の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキシジン類からなる群から選択される１種以上のメディエーターを含む、メディエーター機能を付与されている。
【００１５】
本発明は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキシジン類化合物が、ＮＡＤＨの電気化学的再生（酸化）に有用なメディエーターであるという発見に基づいている。本発明のメディエーターは、一般式（IV）及び（Ｖ）により表される。
【００１６】
【化５】
上記の式（IV）及び（Ｖ）中のＲ1 及びＲ2 が、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の置換基を表し得ることは自明のことである。そのような置換基は、電子伝達の要件として必須な電気化学的性質を有する安定な化合物を調製する当業者の能力によってのみ限定されるものである。
【００１８】
例えば、上記式中の置換基Ｒ1 及びＲ2 は、同一であっても異なっていても良く、水素、低級アルキル、アリール、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族及び脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン（−Ｂ（ＯＨ)2）などから選択される。Ｒ1 及びＲ2 に含まれる脂肪族及び芳香族基は、それ自身種々の置換基を有することができる。
【００１９】
置換基Ｒ1 及びＲ2 は、メディエーターの酸化−還元（レドックス）電位を調節するか、溶解度を変化させるか、又はポリマー若しくは個体支持体にメディエーターが共有結合するための取っ手（handle）の機能を果たすことができる。
【００２０】
式（IV）及び（Ｖ）の化合物は、単一の式（Ａ）
【００２１】
【化６】
（式中、Ｘは、酸素又は硫黄を表し、Ｒ1 及びＲ2 は、式（IV）及び式（Ｖ）において定義したとおりである）で示される。
【００２３】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型はＮＡＤ+ 、還元型はＮＡＤＨ）は、化学的酸化還元の機能を多くのデヒドロゲナーゼ酵素に提供する、補助因子である。この補助因子は、基質分子が酸化される一連の酵素反応の間に還元される。これらの酵素を基質濃度測定の手段として使用することを目的とする、アンペロメトリー（電流滴定）によるバイオセンサーは、この補助因子が電気化学的に再酸化されるときに発生する電流と、該濃度とを連関させたものである。このＮＡＤＨは、グラファイト、熱分解炭素、ガラス状カーボン、白金、金又はこれらの物質から製造される複合体の電極上で、メディエーターなしで電気化学的に再酸化されうるが、この反応は、大きな過電圧及び電極の汚れなどをはじめとするいくつかの問題点を引き起こす。
【００２４】
本発明は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン類（IV）及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキシジン類（Ｖ）又はそれらの誘導体の、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ補酵素の電気化学的再生時における一次的使用を記載しており、したがって、広範囲のフェノチアジン及びフェノキサジン誘導体を包含する。本願のメディエーターは、またＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの、誘導体の電気化学的再生にも用い得る。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの誘導体とは、DolabdjianらがEnzyme Engineering Vol. 4, G.B. Brown and G. Manecke, eds., Plenum Press, New York, 1978, pp.399-400に記載したように、該補酵素がポリマーに結合した場合、又は、M.Persson らがBiotechnology 9, pp.280-284 (1991)中に記載したように該補酵素がデヒドロゲナーゼ酵素に共有結合した場合、又はそれらがデヒドロゲナーゼ酵素の補助因子として機能しうる範囲の他の置換基を有している合成類似体である場合、などのような、改質された補酵素を含有する。これらの引例は、参考のためにここに含めた。
【００２５】
好ましい実施態様においては、メディエーターは、ガントレッツ（GANTREZ)、すなわちメチルビニルエーテルとマレイン酸無水物の共重合体に共有結合する。ガントレッツは、次式：
【００２６】
【化７】
（式中、ｎは好ましくは約１２０から５００である）
で表すことができる。
【００２８】
本発明において有用なメディエーターは、一般式（IV）及び（Ｖ）で示されている。合成され、試験された該化合物類の構造は、アラビア数字で番号をつけて、表１の第１欄に示す。表１の第２〜７欄は実施例III 及びIVに記載したメディエーターの評価の結果を要約したものである。
【００２９】
【表１】
【表２】
【表３】
これらのフェノチアジン類及びフェノキサジン類の中で、製造され、ＮＡＤＨのメディエーターとして好適な性質を有しているとされたものとしては、
３−（４′−クロロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−ジエチルアミノ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−エチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−ニトロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−メトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
７−アセチル−３−（４′−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
７−トリフルオロメチル−３−（４′−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−ω−カルボキシ−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
【００３３】
３−（４′−（２″−（５″−（ｐ−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾリル））フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
６−（４′−エチルフェニル）アミノ−３−（４′−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
６−（４′〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニル）アミノ−３−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンホウ酸、
３−（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（４′−カルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
３−（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン、
３−（２′，５′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン酸及び３−（３′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸がある。
【００３４】
【実施例】
本発明を実施する方法は、さらに以下の実施例で説明する。
【００３５】
実施例Ｉ（メディエーターの合成）
一般に、メディエーターとして有用な本発明の化合物の合成は、アニリンと、フェノチアジン又はフェノキサジンとの酸化的カップリングを含む。Liebigs Ann. Chemn. 322, 39 (1902)には非置換の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジンの合成が報告されており、一方、米国特許第4,710,570 号には、他の２つの類似体の合成が報告されている。これらの引例のどちらも、参考として含めた。これらの化合物の一般的合成スキームを、表Ｉ中の化合物１８を例としてとり上げ、スキームＩに示した。
【００３６】
【化８】
表Ｉ中の特定の化合物（化合物４、１２及び２０）の合成は、以下のようにして実施した。
【００３８】
３−（４′−トリフルオロメチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン（化合物４）
フェノチアジン（２．０ｇ、１０mmol）及び４−アミノベンゾトリフルオリド（１．７７ｇ、１１mmol）を、メタノール（ＭＥＯＨ）１００mlを４５℃まで暖めながらその中に溶解し、ＭＥＯＨ８０ml中に溶解したＩ2 （５．０ｇ、１９．４mmol）の溶液を一度に加え、４５℃で３時間攪拌した。反応混合物をろ過し、得られた固形物をＭＥＯＨ １００mlで洗浄した。固形物を、トリエチルアミン（ＮＥｔ3)６mlを含有するＣＨＣｌ3 ６０mlに溶解し、ついでこの溶液をヘキサン２００mlで希釈し、氷浴中で２時間冷却した。分離してきた紫色の固形物をろ取し、ＣＨＣｌ3 ／ＮＥｔ3 （１０：１、v/v)５０ml中に再溶解し、シリカゲル２５０g 上で、ＣＨＣｌ3 ／アセトン（９６：４、v/v)で展開するクロマトグラフィーに付した。紫色の生成物のバンドを集め、減圧下で蒸発乾固して、mp= ２０７−２０８℃の、化合物４（０．２６ｇ、７．３％）を得た。
分析値：Ｃ19Ｈ11Ｎ2 Ｆ3 Ｓとしての、
理論値： Ｃ、６３．８４；Ｈ、３．３８；Ｎ、７．８４
測定値： Ｃ、６３．６９；Ｈ、３．２６；Ｎ、７．８４
【００３９】
３−（３′，５′−ジカルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン（化合物１８）
フェノチアジン（１．０ｇ、５．０mmol）と５−アミノイソフタル酸（０．９ｇ、５．０mmol）を、ＭｅＯＨ２００ml中に溶解し、１０℃に冷却し、１M のＡｇＮＯ3 ３０ml（３０mmol）を加えた。１０℃で３０分攪拌した後、Ｈ2 Ｏ（４０ml）を加え、更に５分間攪拌を続けた。固形の生成物をろ取し、Ｈ2 Ｏ（５０ml）で洗浄した。固形物を、濃ＮＨ4 ＯＨ水溶液１０mlを含むＭｅＯＨ５００mlに溶解し、２０分間攪拌した後にろ過してＡｇを取り除いた。ろ液を、減圧下でもとの容量の約半分まで濃縮し、一晩５℃で冷蔵した。ついで、混合物をCelite（Celite Corp.）を通してろ過し、減圧下で固形物が分離しはじめるまで濃縮した。得られた溶液約１００mlを、再びCeliteを通してろ過し、酢酸エチル９００mlで希釈し、１５分間放置した。分離した赤色の固形物をろ過により回収し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥して化合物１８（１．５５ｇ、８２．５％）を得た。
【００４０】
３−（３′，５′−ジカルボキシフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン（化合物２０）
フェノキサジン（０．９２ｇ、５mmol）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１０mlに溶解し、濃ＮＨ4 ＯＨ水溶液１mlを含有する５−アミノイソフタル酸（０．８８ｇ、４．８６mmol）のＨ2 Ｏ（１０ml）溶液と共に、周囲温度で攪拌した。混合物に１．０M のＡｇＮＯ3 水溶液１３．５mlを急速に加え、２時間攪拌し、その間に固形分が分離した。この固形分を、ろ過により回収し、ＴＨＦ各回１００mlで３回抽出した。合わせた抽出液を減圧下で蒸発乾固し、暗色の固体０．８ｇを得、これをＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（１：１、v/v)１００mlを暖めながらその中に取り、シリカゲル３００ｇ上でＣＨＣｌ3 ／ＭｅＯＨ（２：１、v/v)で展開するクロマトグラフィーに付した。暗橙色の生成物のバンドを集め、これを減圧下で蒸発乾固して化合物２０（０．３０ｇ、１６．７％）を得た。
【００４１】
当業者であれば、上記で説明した手順を用いて、これらの化合物の置換類似体を広い範囲にわたって合成することができる。
【００４２】
実施例II（ポリマーに結合したメディエーターの製造）
ここにＰ−３として示すポリマー結合メディエーターの合成方法は、本願発明の範囲内の、ポリマーに結合した他のメディエーターを製造するのに用いられる方法の代表例である。この製造方法は、スキーム２及びそれに続く記載に説明するとおりである。Ｐ−３は、「ガントレッツ上４０％が化合物１３である」と表現されてもよく、それは、ポリマー上の無水物基の４０％が化合物１３のアミノ部分と反応しているからである。
【００４３】
【化９】
ガントレッツ上の４０％が化合物１３であるもの（Ｐ−３）
ガントレッツＡＮ−１１９（ISP Technologies, Inc., Wayne, NJ)（０．１５６ｇ、１．０mmol、無水物）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０．０mlに加えた溶液を、不活性ガス雰囲気下、周囲温度に保ち、無水ＤＭＦ５．０ml中に化合物１３（０．１３２６ｇ、０．４mmol）と無水トリエチルアミン（０．５６ml、４．０mmol）とを加えた溶液を一度に加えた。さらにＤＭＦ３．０mlを用いて痕跡量の化合物１３溶液をすすぎ入れ、ついで反応混合物を１時間攪拌した。この混合物をＨ2 Ｏ（２５ml）で希釈し、１５分攪拌し、ついでさらにＨ2 Ｏ（１７５ml）と混合した。得られた溶液を濃ＨＣｌ（３．０ml）で酸性とすると、生成物が固体として分離してきた。この混合物を、２０分間、１０，４００×G で遠心分離し、上清を捨てた。得られたペレットを超音波処理により０．１M ＨＣｌ（２０ml）に再懸濁させ、２０分間、３３，４００×G で遠心分離した。上清を捨て、ペレットを超音波処理により１００％エタノール２０ml中に再懸濁し、ついで３０分間、３３，４００×G で遠心分離した。上清を捨て、ペレットを減圧下で乾燥して、Ｐ−３（０．２６ｇ）を、黒色粉末として得た。
【００４５】
ポリマー結合メディエーターＰ１（ガントレッツ上の２０％が化合物１１である）及びＰ−２（ガントレッツ上の２０％が化合物１３である）は、化合物１３の０．４mmolのかわりに化合物１１及び１３の０．２mmolを用いた他はＰ−３を調製するのと同様にして調製した。
【００４６】
実施例III （グラファイト電極上のメディエーターの評価）
グラファイト棒電極（ＧＲＥ：Johnson Matthey Electronics, Ward Hill, MA）（直径３mmのもの）の電極表面を、まずきめの細かい紙ヤスリで、ついで、１ミクロン以下のアルミナ粒子の懸濁液で研磨したものを準備した。メディエーターの１〜２mMメタノール溶液を調製し、電極をこの溶液に２分間浸漬した。ついで、電極を水ですすぎ、０．２５M リン酸緩衝液（pH＝７．０）に短時間浸した。電流対電圧の様子を、まず測定して、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対するプラスピークとマイナスピークの位置を決定した。ついでＮＡＤＨを２０〜２００μM の濃度で含有するpH＝７．０の溶液中で、上記のサイクリックボルタンメトリー実験で得られる酸化ピーク電圧（Ｅ°OX）より一般に１００mV高い電圧を用いて電流を測定し（使用した実際の電圧は表１の３欄に示した）、最小二乗法により得られた、ＮＡＤＨ濃度データに対する電流の直線の傾斜により、各メディエーターの相対感度を、ＮＡＤＨ１μM 当たりの電位（μA)として得た。種々のメディエーターに対するこれらの傾斜を、表１の４欄に示した。ここで、傾斜が大きくなるほど、メディエーターとしては良好である。比較として、これらの条件のもとでの３−β−ナフトイル−トルイジンブルー０（Ｉ）の傾斜は、０．００７５である。
【００４７】
実施例IV（プリント電極上のメディエーターの評価）
プリントされたセンサーカードと、グラファイト／炭素作用電極及び銀／塩化銀参照電極からなる、プリント電極の実験を実施した。グラファイト／炭素電極に用いたインキは、No.423SS（Acheson Colloids Co., Port Huron, MI）であり、銀／塩化銀参照電極には、１５〜２５％ＡｇＣｌと混合したNo.427SS銀インキ（販売元上記と同じ）を用いた。電極の表面部分は、０．０３cm2 であった。
【００４８】
サイクリックボルタンメトリー実験を、プリント電極上で、グラファイト電極上で実施したと同様に実施した。図１では、０．６mMの化合物１８の、pH＝７．０の０．６mMＰＩＰＥＳ緩衝液のみの中で測定した場合と、５mMＮＡＤＨの存在下での場合とのサイクリックボルタモグラムを示した。ＮＡＤＨの存在下、電圧２６mVにおける電流の増加は、ＮＡＤＨにより還元されたメディエーターの酸化によるものである。このメディエーターは、これがＮＡＤＨを酸化してＮＡＤ+ にするときに還元され、ついで、電極において電気化学的に再酸化される。実際、このメデイエーターは、ＮＡＤＨを直接に酸化するのに必要な電位よりもかなり低い電位においてその電気化学的酸化を促進した。図２では、直接に（メディエーターなしに）プリント電極上で酸化した場合の、ＮＡＤＨの典型的サイクリックボルタモグラムを示した。より高いピーク電位（４４３mV）が明らかであった。
【００４９】
グルコース濃度を測定するバイオセンサーは、酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼが、グルコースをグルコノラクトンに酸化する際にＮＡＤ+ を還元してＮＡＤＨにすることを利用している。メディエーターによるＮＡＤＨからＮＡＤ+ への電気化学的再酸化が、該グルコース濃度に比例する電流を生じさせる。
【００５０】
典型的グルコースバイオセンサーは、以下のようにして製造した。：
２５mMのＫＣｌを含有するpH＝７．０のリン酸緩衝液１００mM中メディエーター４mMの溶液を調製し、５％スルフィノール（Surfynol, Air Products and Chemicals, Inc., Allentown, PA)１．９６ｇ、ＮＡＤ（０．３２ｇ）、グルコースデヒドロゲナーゼＧＤＨ（Toyobo）０．７０ｇ、pH＝７．０の０．５M ＰＩＰＥＳ緩衝液１．４４ｇ及び脱イオン水５．５mlからなる同量の溶液で希釈した。混合物１．７５μl をセンサー領域に塗布し、室温で放置して乾燥し、約２０分乾燥した。この電極を小さなキャピラリー挿入部（gap)を有するフォーマット中に組み入れ、グルコース水溶液で処理して表１の６欄に記載した電位で電流を測定した。これを、グルコースを各０、５０、１００、２００及び５００mg/dl の濃度で含む試料に関して行い、グルコース濃度に対する電流の最小二乗法により得られた直線（lisine line)の傾斜が、各メディエーターの相対感度（μA/グルコースmg/dl)を表していた。傾斜が大きくなるにしたがって、メディエーターの性能は良好になる。これらの傾斜は、表１の最終欄に示した。
【００５１】
図３は、化合物１８に関して、１００mV及び３００mVの電位においてグルコース濃度に対する電流をプロットしたものを示す。
【００５２】
各々のポリマー結合メディエーターは、完成したグルコースバイオセンサー中に上述したように組み込まれ、その相対感度は、表２の最終欄に示した。
【００５３】
【表４】
図４は、３種のポリマー結合メディエーターに関して、３００mVの電位においてグルコース濃度に対する電流をプロットしたものを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】０．６mMＰＩＰＥＳ緩衝液中、pH７．０における、化合物１８（０．６mM）の、単独での、及び５mMＮＡＤＨの存在下でのサイクリックボルタモグラムを示す。
【図２】プリント電極上で直接的に酸化されたＮＡＤＨの、典型的なサイクリックボルタモグラムを示す。
【図３】設定された電圧において、本発明のメディエーターの１種に関して、グルコース濃度に対する電流をプロットしたものである。
【図４】ポリマーに結合したメディエーターを用いた場合の、グルコース濃度に対する電流をプロットしたものである。
Claims (18)
- 補酵素類であるジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）又はそれらの類似体の電気化学的再生に適切な電極であって、該電極表面に、置換又は非置換の、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキサジン類の群から選択されるメディエーター化合物の１種又はそれ以上を含有するメディエーター機能が付与されていることを特徴とする電極。
- メディエーターが、式（IV）又は式（Ｖ）：
- Ｒ1及びＲ2が、同一でも異なっていてもよく、水素、低級アルキル、アリール、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族及び脂肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ及びジヒドロキシボロンよりなる群から選択され、ここで脂肪族及び芳香族基は置換されているか又は非置換である、請求項２記載の電極。
- 電極材料が、グラファイト、熱分解炭素、ガラス状炭素、白金、金又はこれらの材料から製造された複合材である、請求項１記載の電極。
- メディエーターが、ポリマーに結合している、請求項１記載の電極。
- ポリマーが、メチルビニルエーテルとマレイン酸無水物のコポリマーである、請求項５記載の電極。
- メディエーターが、３−（４′−クロロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ジエチルアミノ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−エチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ニトロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−メトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、７−アセチル−３−（４′−メトキシカルボニルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、７−トリフルオロメチル−３−（４′−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ω−カルボニル−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−（２″−（５″−（ｐ−アミノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾリル））フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、６−（４′−エチルフェニル）アミノ−３−（４′−エチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、６−（４′−〔２−（２−エタノ−ルオキシ）エトキシ〕エトキシフェニル）アミノ−３−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンホウ酸、３−（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−カルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジン、３−（２′，５′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン酸及び３−（３′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸からなる群から選択される、請求項１記載の電極。
- メディエーターが、３−（４′−トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンである、請求項７記載の電極。
- メディエーターが、３−（４′−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンである、請求項７記載の電極。
- メディエーターが、３−（４′−ω−カルボキシ−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンである、請求項７記載の電極。
- メディエーターが、３−（４′−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンである、請求項７記載の電極。
- メディエーターが、３−（４′−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンである、請求項７記載の電極。
- メディエーターが、３−（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンである、請求項７記載の電極。
- メディエーターが、３−（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジンである、請求項７記載の電極。
- メディエーターが、３−（２′，５′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン酸である、請求項７記載の電極。
- メディエーターが、３−（３′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸である、請求項７記載の電極。
- メディエーターが、３−（４′−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、又は３−（４′−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンである、請求項５記載の電極。
- メディエーターが、３−（４′−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、又は３−（４′−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンである、請求項６記載の電極。
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