JPH08334490A - Ｎａｄｈ、ｎａｄｐｈ及びそれらの類似体の電気化学的再生に適切なメディエーター - Google Patents
Ｎａｄｈ、ｎａｄｐｈ及びそれらの類似体の電気化学的再生に適切なメディエーターInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 補酵素ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの類
似体の電気化学的再生に適切な電極、及び生化学的燃料
電池の性能を改良する方法を提供する。 【解決手段】 置換又は非置換の、３−フェニルイミノ
−３Ｈ−フェノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３
Ｈ−フェノキサジン類の群から選択される１種又はそれ
以上のメディエーター化合物を含むメディエーター機能
が電極表面に付与されている電極、及びそれを燃料電池
に組み込む、該電池の性能の改良法。
似体の電気化学的再生に適切な電極、及び生化学的燃料
電池の性能を改良する方法を提供する。 【解決手段】 置換又は非置換の、３−フェニルイミノ
−３Ｈ−フェノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３
Ｈ−フェノキサジン類の群から選択される１種又はそれ
以上のメディエーター化合物を含むメディエーター機能
が電極表面に付与されている電極、及びそれを燃料電池
に組み込む、該電池の性能の改良法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】診断薬産業においては、酵素
の有する選択性を、電流測定による検出の感度と結びつ
けた分析方法に関心が集まっている。ニコチンアミド補
酵素（ＮＡＤ及びＮＡＤＰ）の還元は、これらが、デヒ
ドロゲナーゼによって触媒される反応において生成する
ことから、特に重要である。デヒドロゲナーゼにより触
媒される、次式：
の有する選択性を、電流測定による検出の感度と結びつ
けた分析方法に関心が集まっている。ニコチンアミド補
酵素（ＮＡＤ及びＮＡＤＰ）の還元は、これらが、デヒ
ドロゲナーゼによって触媒される反応において生成する
ことから、特に重要である。デヒドロゲナーゼにより触
媒される、次式：
【０００２】
【化２】
【０００３】の反応は、生物学的細胞中及び分析学的反
応において重要な役割を果たしている。種々の基質から
生成物への転換を選択的に触媒する、数百の異なるデヒ
ドロゲナーゼが知られている。基質、例えばグルコース
が酸化されると、酵素であるＮＡＤ+ 及び／又はＮＡＤ
Ｐ+ は、それぞれＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに還元され
る。これらの補酵素類は、それらがデヒドロゲナーゼ酵
素と共に作用して、エネルギー移動酸化還元対を形成す
る能力のせいで、その反応における必要な因子である。
ピリジンにリンクしたデヒドロゲナーゼは、２還元当量
を基質からピリジンヌクレオチドの酸化型へと逆に転移
させる。そのうち１つは還元されたピリジンヌクレオチ
ド中に水素原子として見いだされ、もう１つは、電子で
ある。基質から離れたもう１つの水素原子は、遊離のＨ
+ として、媒体中に見いだされる。
応において重要な役割を果たしている。種々の基質から
生成物への転換を選択的に触媒する、数百の異なるデヒ
ドロゲナーゼが知られている。基質、例えばグルコース
が酸化されると、酵素であるＮＡＤ+ 及び／又はＮＡＤ
Ｐ+ は、それぞれＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに還元され
る。これらの補酵素類は、それらがデヒドロゲナーゼ酵
素と共に作用して、エネルギー移動酸化還元対を形成す
る能力のせいで、その反応における必要な因子である。
ピリジンにリンクしたデヒドロゲナーゼは、２還元当量
を基質からピリジンヌクレオチドの酸化型へと逆に転移
させる。そのうち１つは還元されたピリジンヌクレオチ
ド中に水素原子として見いだされ、もう１つは、電子で
ある。基質から離れたもう１つの水素原子は、遊離のＨ
+ として、媒体中に見いだされる。
【０００４】補酵素ＮＡＤ+ 及びＮＡＤＰ+ は、もしこ
れらを安価な使い捨ての分析器具で、経済的に使用しよ
うとするならば、これらを再生、再酸化してもとの状態
に戻すことが必須になるような、高価な化学薬品であ
る。
れらを安価な使い捨ての分析器具で、経済的に使用しよ
うとするならば、これらを再生、再酸化してもとの状態
に戻すことが必須になるような、高価な化学薬品であ
る。
【０００５】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ＮＡＤ
Ｈは、１ボルトオーダーの高い過電圧によってのみ、種
々の塩基電極材において直接的に酸化される。しかし、
この過電圧は、ＮＡＤＨから電極への電子の移動を媒介
する機能物を電極表面に吸着させることにより、減少さ
せることができる。このような媒介物（メディエータ
ー）は、典型的に、過剰の過電圧を要さずに電気化学的
に再酸化されて、電気化学的再生の副次的システムとし
てそれ自体が有用となる材料から選択される。この目的
に適切な種々のメディエーターが公知である。米国特許
第4,490,464 号には、発明の背景として、フェナジンメ
トスルフェート（ＰＭＳ）；フェナジンエトスルフェー
ト（ＰＥＳ）；チオニン及び１，２−ベンゾキノンのよ
うなメディエーターが記載されている。この特許は、Ｎ
ＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの類似体の酸化を触媒す
るために、ヘテロ原子を有するか又は有しない、少なく
とも３個、好ましくは４個以上の縮合芳香族環からなる
縮合芳香族環系を、メディエーターとして電極表面に付
与することにより改質された電極についてさらに記載し
ている。さらに詳細には、この特許はアルキルフェナジ
ニウムイオン、フェナジニウムイオン、フェナジノン、
フェノキサジニウムイオン、フェノキサジノン、フェノ
チアジニウムイオン又はフェノチアジノンのいずれか１
つを含む構造的要素による、補酵素又はそれらの類似体
との電子の交換について記載している。
Ｈは、１ボルトオーダーの高い過電圧によってのみ、種
々の塩基電極材において直接的に酸化される。しかし、
この過電圧は、ＮＡＤＨから電極への電子の移動を媒介
する機能物を電極表面に吸着させることにより、減少さ
せることができる。このような媒介物（メディエータ
ー）は、典型的に、過剰の過電圧を要さずに電気化学的
に再酸化されて、電気化学的再生の副次的システムとし
てそれ自体が有用となる材料から選択される。この目的
に適切な種々のメディエーターが公知である。米国特許
第4,490,464 号には、発明の背景として、フェナジンメ
トスルフェート（ＰＭＳ）；フェナジンエトスルフェー
ト（ＰＥＳ）；チオニン及び１，２−ベンゾキノンのよ
うなメディエーターが記載されている。この特許は、Ｎ
ＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ又はそれらの類似体の酸化を触媒す
るために、ヘテロ原子を有するか又は有しない、少なく
とも３個、好ましくは４個以上の縮合芳香族環からなる
縮合芳香族環系を、メディエーターとして電極表面に付
与することにより改質された電極についてさらに記載し
ている。さらに詳細には、この特許はアルキルフェナジ
ニウムイオン、フェナジニウムイオン、フェナジノン、
フェノキサジニウムイオン、フェノキサジノン、フェノ
チアジニウムイオン又はフェノチアジノンのいずれか１
つを含む構造的要素による、補酵素又はそれらの類似体
との電子の交換について記載している。
【０００６】J. Electroanal. Chem. 287, 61-80 (199
0) には、式（Ｉ）：
0) には、式（Ｉ）：
【０００７】
【化３】
【０００８】で示される３−β−ナフトイルトルイジン
ブルーＯであって、4,490,464 号特許中で開示されてい
るもののなかではおそらく一番効果的な公知のフェノチ
アジニウムメディエーターが記載されている。この特許
において開示されている種々のメディエーターは、J. E
lectroanal. Chem. 292, 115-138 (1990) において比較
されている。
ブルーＯであって、4,490,464 号特許中で開示されてい
るもののなかではおそらく一番効果的な公知のフェノチ
アジニウムメディエーターが記載されている。この特許
において開示されている種々のメディエーターは、J. E
lectroanal. Chem. 292, 115-138 (1990) において比較
されている。
【０００９】フェノキサジニウム及びフェノチアジニウ
ムイオンは、4,490,464 号特許に開示されており、これ
らは上記（Ｉ）式のようにプラスに荷電した種類であっ
て、本願発明のメディエーターとは容易に区別される。
この、4,490,464 号特許にクレームされているフェノキ
サジオン類及びフェノチアジノン類は、３Ｈ−フェノチ
アジン類（II）及び３Ｈ−フェノキサジン類（III)：
ムイオンは、4,490,464 号特許に開示されており、これ
らは上記（Ｉ）式のようにプラスに荷電した種類であっ
て、本願発明のメディエーターとは容易に区別される。
この、4,490,464 号特許にクレームされているフェノキ
サジオン類及びフェノチアジノン類は、３Ｈ−フェノチ
アジン類（II）及び３Ｈ−フェノキサジン類（III)：
【００１０】
【化４】
【００１１】（式中、３位がカルボニルの酸素によって
誘導体化されている）である。これらの化合物は、それ
ぞれ式（II）及び（III)中の酸素原子が、置換フェニル
環を有する窒素原子により置き換えらている本願の化合
物と、構造的な類似点を有する。しかし、実際には、こ
れらの化合物は、極めて相違するものであって、（II）
及び（III)の化合物のカルボニルの酸素を、フェニル置
換した窒素原子で置き換えることにより効果的なメディ
エーターを生じ得るということが、先行技術から示唆さ
れるということは全くない。
誘導体化されている）である。これらの化合物は、それ
ぞれ式（II）及び（III)中の酸素原子が、置換フェニル
環を有する窒素原子により置き換えらている本願の化合
物と、構造的な類似点を有する。しかし、実際には、こ
れらの化合物は、極めて相違するものであって、（II）
及び（III)の化合物のカルボニルの酸素を、フェニル置
換した窒素原子で置き換えることにより効果的なメディ
エーターを生じ得るということが、先行技術から示唆さ
れるということは全くない。
【００１２】メディエーターとしての用途が本願中に教
示されている化合物は、米国特許第4,710,570 号に開示
されており、その中で、これらの染料の「ロイコ」型、
すなわち還元型が、「感圧性の、サーモグラフによる、
光サーモグラフによる、及び写真による造影システムに
おける染料形成剤として適切である」との記載がある。
示されている化合物は、米国特許第4,710,570 号に開示
されており、その中で、これらの染料の「ロイコ」型、
すなわち還元型が、「感圧性の、サーモグラフによる、
光サーモグラフによる、及び写真による造影システムに
おける染料形成剤として適切である」との記載がある。
【００１３】米国特許第5,264,092 号には、ＮＡＤＨの
電気化学的再生に有用である、ポリマーに共有結合した
4,490,464 号特許のメディエーターを開示している。こ
の特許においては、メディエーターが結合する種々のポ
リマー主鎖を開示している。ポリマー／メディエーター
によって改質された電極もまた開示されている。本発明
のある種のメディエーターも、ポリマー上に固定された
場合には良好な性能を発揮する。
電気化学的再生に有用である、ポリマーに共有結合した
4,490,464 号特許のメディエーターを開示している。こ
の特許においては、メディエーターが結合する種々のポ
リマー主鎖を開示している。ポリマー／メディエーター
によって改質された電極もまた開示されている。本発明
のある種のメディエーターも、ポリマー上に固定された
場合には良好な性能を発揮する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、補酵素である
ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
ＤＨ）、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）又はそれらの類似体の電
気化学的再生に適切な電極に関し、該電極は、その表面
に、置換又は非置換の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェ
ノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキ
シジン類からなる群から選択される１種以上のメディエ
ーターを含む、メディエーター機能を付与されている。
ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
ＤＨ）、ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）又はそれらの類似体の電
気化学的再生に適切な電極に関し、該電極は、その表面
に、置換又は非置換の３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェ
ノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノキ
シジン類からなる群から選択される１種以上のメディエ
ーターを含む、メディエーター機能を付与されている。
【００１５】本発明は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フ
ェノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノ
キシジン類化合物が、ＮＡＤＨの電気化学的再生（酸
化）に有用なメディエーターであるという発見に基づい
ている。本発明のメディエーターは、一般式（IV）及び
（Ｖ）により表される。
ェノチアジン類及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−フェノ
キシジン類化合物が、ＮＡＤＨの電気化学的再生（酸
化）に有用なメディエーターであるという発見に基づい
ている。本発明のメディエーターは、一般式（IV）及び
（Ｖ）により表される。
【００１６】
【化５】
【００１７】上記の式（IV）及び（Ｖ）中のＲ1 及びＲ
2 が、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の置換
基を表し得ることは自明のことである。そのような置換
基は、電子伝達の要件として必須な電気化学的性質を有
する安定な化合物を調製する当業者の能力によってのみ
限定されるものである。
2 が、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の置換
基を表し得ることは自明のことである。そのような置換
基は、電子伝達の要件として必須な電気化学的性質を有
する安定な化合物を調製する当業者の能力によってのみ
限定されるものである。
【００１８】例えば、上記式中の置換基Ｒ1 及びＲ2
は、同一であっても異なっていても良く、水素、低級ア
ルキル、アリール、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、
カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリール
オキシカルボニル、芳香族及び脂肪族ケト、アルコキ
シ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミ
ノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン（−Ｂ（Ｏ
Ｈ)2）などから選択される。Ｒ1 及びＲ2 に含まれる脂
肪族及び芳香族基は、それ自身種々の置換基を有するこ
とができる。
は、同一であっても異なっていても良く、水素、低級ア
ルキル、アリール、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、
カルボキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリール
オキシカルボニル、芳香族及び脂肪族ケト、アルコキ
シ、アリールオキシ、ニトロ、ジアルキルアミノ、アミ
ノアルキル、スルホ、ジヒドロキシボロン（−Ｂ（Ｏ
Ｈ)2）などから選択される。Ｒ1 及びＲ2 に含まれる脂
肪族及び芳香族基は、それ自身種々の置換基を有するこ
とができる。
【００１９】置換基Ｒ1 及びＲ2 は、メディエーターの
酸化−還元（レドックス）電位を調節するか、溶解度を
変化させるか、又はポリマー若しくは個体支持体にメデ
ィエーターが共有結合するための取っ手（handle）の機
能を果たすことができる。
酸化−還元（レドックス）電位を調節するか、溶解度を
変化させるか、又はポリマー若しくは個体支持体にメデ
ィエーターが共有結合するための取っ手（handle）の機
能を果たすことができる。
【００２０】式（IV）及び（Ｖ）の化合物は、単一の式
（Ａ）
（Ａ）
【００２１】
【化６】
【００２２】（式中、Ｘは、酸素又は硫黄を表し、Ｒ1
及びＲ2 は、式（IV）及び式（Ｖ）において定義したと
おりである）で示される。
及びＲ2 は、式（IV）及び式（Ｖ）において定義したと
おりである）で示される。
【００２３】ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（酸化型はＮＡＤ+ 、還元型はＮＡＤＨ）は、化学的酸
化還元の機能を多くのデヒドロゲナーゼ酵素に提供す
る、補助因子である。この補助因子は、基質分子が酸化
される一連の酵素反応の間に還元される。これらの酵素
を基質濃度測定の手段として使用することを目的とす
る、アンペロメトリー（電流滴定）によるバイオセンサ
ーは、この補助因子が電気化学的に再酸化されるときに
発生する電流と、該濃度とを連関させたものである。こ
のＮＡＤＨは、グラファイト、熱分解炭素、ガラス状カ
ーボン、白金、金又はこれらの物質から製造される複合
体の電極上で、メディエーターなしで電気化学的に再酸
化されうるが、この反応は、大きな過電圧及び電極の汚
れなどをはじめとするいくつかの問題点を引き起こす。
（酸化型はＮＡＤ+ 、還元型はＮＡＤＨ）は、化学的酸
化還元の機能を多くのデヒドロゲナーゼ酵素に提供す
る、補助因子である。この補助因子は、基質分子が酸化
される一連の酵素反応の間に還元される。これらの酵素
を基質濃度測定の手段として使用することを目的とす
る、アンペロメトリー（電流滴定）によるバイオセンサ
ーは、この補助因子が電気化学的に再酸化されるときに
発生する電流と、該濃度とを連関させたものである。こ
のＮＡＤＨは、グラファイト、熱分解炭素、ガラス状カ
ーボン、白金、金又はこれらの物質から製造される複合
体の電極上で、メディエーターなしで電気化学的に再酸
化されうるが、この反応は、大きな過電圧及び電極の汚
れなどをはじめとするいくつかの問題点を引き起こす。
【００２４】本発明は、３−フェニルイミノ−３Ｈ−フ
ェノチアジン類（IV）及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−
フェノキシジン類（Ｖ）又はそれらの誘導体の、ＮＡＤ
Ｈ及びＮＡＤＰＨ補酵素の電気化学的再生時における一
次的使用を記載しており、したがって、広範囲のフェノ
チアジン及びフェノキサジン誘導体を包含する。本願の
メディエーターは、またＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの、誘
導体の電気化学的再生にも用い得る。ＮＡＤＨ及びＮＡ
ＤＰＨの誘導体とは、DolabdjianらがEnzyme Engineeri
ng Vol. 4, G.B. Brown and G. Manecke, eds., Plenum
Press, New York, 1978, pp.399-400に記載したよう
に、該補酵素がポリマーに結合した場合、又は、M.Pers
son らがBiotechnology 9, pp.280-284 (1991)中に記載
したように該補酵素がデヒドロゲナーゼ酵素に共有結合
した場合、又はそれらがデヒドロゲナーゼ酵素の補助因
子として機能しうる範囲の他の置換基を有している合成
類似体である場合、などのような、改質された補酵素を
含有する。これらの引例は、参考のためにここに含め
た。
ェノチアジン類（IV）及び３−フェニルイミノ−３Ｈ−
フェノキシジン類（Ｖ）又はそれらの誘導体の、ＮＡＤ
Ｈ及びＮＡＤＰＨ補酵素の電気化学的再生時における一
次的使用を記載しており、したがって、広範囲のフェノ
チアジン及びフェノキサジン誘導体を包含する。本願の
メディエーターは、またＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの、誘
導体の電気化学的再生にも用い得る。ＮＡＤＨ及びＮＡ
ＤＰＨの誘導体とは、DolabdjianらがEnzyme Engineeri
ng Vol. 4, G.B. Brown and G. Manecke, eds., Plenum
Press, New York, 1978, pp.399-400に記載したよう
に、該補酵素がポリマーに結合した場合、又は、M.Pers
son らがBiotechnology 9, pp.280-284 (1991)中に記載
したように該補酵素がデヒドロゲナーゼ酵素に共有結合
した場合、又はそれらがデヒドロゲナーゼ酵素の補助因
子として機能しうる範囲の他の置換基を有している合成
類似体である場合、などのような、改質された補酵素を
含有する。これらの引例は、参考のためにここに含め
た。
【００２５】好ましい実施態様においては、メディエー
ターは、ガントレッツ（GANTREZ)、すなわちメチルビニ
ルエーテルとマレイン酸無水物の共重合体に共有結合す
る。ガントレッツは、次式：
ターは、ガントレッツ（GANTREZ)、すなわちメチルビニ
ルエーテルとマレイン酸無水物の共重合体に共有結合す
る。ガントレッツは、次式：
【００２６】
【化７】
【００２７】（式中、ｎは好ましくは約１２０から５０
０である）で表すことができる。
０である）で表すことができる。
【００２８】本発明において有用なメディエーターは、
一般式（IV）及び（Ｖ）で示されている。合成され、試
験された該化合物類の構造は、アラビア数字で番号をつ
けて、表１の第１欄に示す。表１の第２〜７欄は実施例
III 及びIVに記載したメディエーターの評価の結果を要
約したものである。
一般式（IV）及び（Ｖ）で示されている。合成され、試
験された該化合物類の構造は、アラビア数字で番号をつ
けて、表１の第１欄に示す。表１の第２〜７欄は実施例
III 及びIVに記載したメディエーターの評価の結果を要
約したものである。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】
【表３】
【００３２】これらのフェノチアジン類及びフェノキサ
ジン類の中で、製造され、ＮＡＤＨのメディエーターと
して好適な性質を有しているとされたものとしては、３
−（４′−クロロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチ
アジン、３−（４′−ジエチルアミノ−フェニルイミ
ノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−エチル−フ
ェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−
トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノ
チアジン、３−（４′−メトキシカルボニル−フェニル
イミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ニトロ
−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−
（４′−メトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチ
アジン、７−アセチル−３−（４′−メトキシカルボニ
ルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、７−トリ
フルオロメチル−３−（４′−メトキシカルボニル−フ
ェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−
ω−カルボキシ−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ
−フェノチアジン、３−（４′−アミノメチル−フェニ
ルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
ジン類の中で、製造され、ＮＡＤＨのメディエーターと
して好適な性質を有しているとされたものとしては、３
−（４′−クロロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチ
アジン、３−（４′−ジエチルアミノ−フェニルイミ
ノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−エチル−フ
ェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−
トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノ
チアジン、３−（４′−メトキシカルボニル−フェニル
イミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−ニトロ
−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−
（４′−メトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチ
アジン、７−アセチル−３−（４′−メトキシカルボニ
ルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、７−トリ
フルオロメチル−３−（４′−メトキシカルボニル−フ
ェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−
ω−カルボキシ−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ
−フェノチアジン、３−（４′−アミノメチル−フェニ
ルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
【００３３】３−（４′−（２″−（５″−（ｐ−アミ
ノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾリル））フェ
ニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−β
−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチア
ジン、６−（４′−エチルフェニル）アミノ−３−
（４′−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジ
ン、６−（４′〔２−（２−エタノールオキシ）エトキ
シ〕エトキシフェニル）アミノ−３−（４′−〔２−
（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニル
イミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′〔２−
（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニ
ルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−フェ
ニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンホウ酸、３−
（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ
−フェノチアジン、３−（４′−カルボキシ−フェニル
イミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（３′，５′−
ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジ
ン、３−（２′，５′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェ
ノチアジンジスルホン酸及び３−（３′−フェニルイミ
ノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸がある。
ノフェニル）−１，３，４−オキサジアゾリル））フェ
ニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−β
−アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチア
ジン、６−（４′−エチルフェニル）アミノ−３−
（４′−エチルフェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジ
ン、６−（４′〔２−（２−エタノールオキシ）エトキ
シ〕エトキシフェニル）アミノ−３−（４′−〔２−
（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシフェニル
イミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′〔２−
（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニ
ルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（４′−フェ
ニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンホウ酸、３−
（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ
−フェノチアジン、３−（４′−カルボキシ−フェニル
イミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、３−（３′，５′−
ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサジ
ン、３−（２′，５′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェ
ノチアジンジスルホン酸及び３−（３′−フェニルイミ
ノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸がある。
【００３４】
【実施例】本発明を実施する方法は、さらに以下の実施
例で説明する。
例で説明する。
【００３５】実施例Ｉ（メディエーターの合成） 一般に、メディエーターとして有用な本発明の化合物の
合成は、アニリンと、フェノチアジン又はフェノキサジ
ンとの酸化的カップリングを含む。LiebigsAnn. Chemn.
322, 39 (1902)には非置換の３−フェニルイミノ−３
Ｈ−フェノチアジンの合成が報告されており、一方、米
国特許第4,710,570 号には、他の２つの類似体の合成が
報告されている。これらの引例のどちらも、参考として
含めた。これらの化合物の一般的合成スキームを、表Ｉ
中の化合物１８を例としてとり上げ、スキームＩに示し
た。
合成は、アニリンと、フェノチアジン又はフェノキサジ
ンとの酸化的カップリングを含む。LiebigsAnn. Chemn.
322, 39 (1902)には非置換の３−フェニルイミノ−３
Ｈ−フェノチアジンの合成が報告されており、一方、米
国特許第4,710,570 号には、他の２つの類似体の合成が
報告されている。これらの引例のどちらも、参考として
含めた。これらの化合物の一般的合成スキームを、表Ｉ
中の化合物１８を例としてとり上げ、スキームＩに示し
た。
【００３６】
【化８】
【００３７】表Ｉ中の特定の化合物（化合物４、１２及
び２０）の合成は、以下のようにして実施した。
び２０）の合成は、以下のようにして実施した。
【００３８】３−（４′−トリフルオロメチルフェニル
イミノ）−３Ｈ−フェノチアジン（化合物４） フェノチアジン（２．０ｇ、１０mmol）及び４−アミノ
ベンゾトリフルオリド（１．７７ｇ、１１mmol）を、メ
タノール（ＭＥＯＨ）１００mlを４５℃まで暖めながら
その中に溶解し、ＭＥＯＨ８０ml中に溶解したＩ2
（５．０ｇ、１９．４mmol）の溶液を一度に加え、４５
℃で３時間攪拌した。反応混合物をろ過し、得られた固
形物をＭＥＯＨ １００mlで洗浄した。固形物を、トリ
エチルアミン（ＮＥｔ3)６mlを含有するＣＨＣｌ3 ６０
mlに溶解し、ついでこの溶液をヘキサン２００mlで希釈
し、氷浴中で２時間冷却した。分離してきた紫色の固形
物をろ取し、ＣＨＣｌ3 ／ＮＥｔ3 （１０：１、v/v)５
０ml中に再溶解し、シリカゲル２５０g 上で、ＣＨＣｌ
3 ／アセトン（９６：４、v/v)で展開するクロマトグラ
フィーに付した。紫色の生成物のバンドを集め、減圧下
で蒸発乾固して、mp= ２０７−２０８℃の、化合物４
（０．２６ｇ、７．３％）を得た。分析値：Ｃ19Ｈ11Ｎ
2 Ｆ3 Ｓとしての、 理論値： Ｃ、６３．８４；Ｈ、３．３８；Ｎ、７．８４ 測定値： Ｃ、６３．６９；Ｈ、３．２６；Ｎ、７．８４
イミノ）−３Ｈ−フェノチアジン（化合物４） フェノチアジン（２．０ｇ、１０mmol）及び４−アミノ
ベンゾトリフルオリド（１．７７ｇ、１１mmol）を、メ
タノール（ＭＥＯＨ）１００mlを４５℃まで暖めながら
その中に溶解し、ＭＥＯＨ８０ml中に溶解したＩ2
（５．０ｇ、１９．４mmol）の溶液を一度に加え、４５
℃で３時間攪拌した。反応混合物をろ過し、得られた固
形物をＭＥＯＨ １００mlで洗浄した。固形物を、トリ
エチルアミン（ＮＥｔ3)６mlを含有するＣＨＣｌ3 ６０
mlに溶解し、ついでこの溶液をヘキサン２００mlで希釈
し、氷浴中で２時間冷却した。分離してきた紫色の固形
物をろ取し、ＣＨＣｌ3 ／ＮＥｔ3 （１０：１、v/v)５
０ml中に再溶解し、シリカゲル２５０g 上で、ＣＨＣｌ
3 ／アセトン（９６：４、v/v)で展開するクロマトグラ
フィーに付した。紫色の生成物のバンドを集め、減圧下
で蒸発乾固して、mp= ２０７−２０８℃の、化合物４
（０．２６ｇ、７．３％）を得た。分析値：Ｃ19Ｈ11Ｎ
2 Ｆ3 Ｓとしての、 理論値： Ｃ、６３．８４；Ｈ、３．３８；Ｎ、７．８４ 測定値： Ｃ、６３．６９；Ｈ、３．２６；Ｎ、７．８４
【００３９】３−（３′，５′−ジカルボキシフェニル
イミノ）−３Ｈ−フェノチアジン（化合物１８） フェノチアジン（１．０ｇ、５．０mmol）と５−アミノ
イソフタル酸（０．９ｇ、５．０mmol）を、ＭｅＯＨ２
００ml中に溶解し、１０℃に冷却し、１M のＡｇＮＯ3
３０ml（３０mmol）を加えた。１０℃で３０分攪拌した
後、Ｈ2 Ｏ（４０ml）を加え、更に５分間攪拌を続け
た。固形の生成物をろ取し、Ｈ2 Ｏ（５０ml）で洗浄し
た。固形物を、濃ＮＨ4 ＯＨ水溶液１０mlを含むＭｅＯ
Ｈ５００mlに溶解し、２０分間攪拌した後にろ過してＡ
ｇを取り除いた。ろ液を、減圧下でもとの容量の約半分
まで濃縮し、一晩５℃で冷蔵した。ついで、混合物をCe
lite（Celite Corp.）を通してろ過し、減圧下で固形物
が分離しはじめるまで濃縮した。得られた溶液約１００
mlを、再びCeliteを通してろ過し、酢酸エチル９００ml
で希釈し、１５分間放置した。分離した赤色の固形物を
ろ過により回収し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥して化合
物１８（１．５５ｇ、８２．５％）を得た。
イミノ）−３Ｈ−フェノチアジン（化合物１８） フェノチアジン（１．０ｇ、５．０mmol）と５−アミノ
イソフタル酸（０．９ｇ、５．０mmol）を、ＭｅＯＨ２
００ml中に溶解し、１０℃に冷却し、１M のＡｇＮＯ3
３０ml（３０mmol）を加えた。１０℃で３０分攪拌した
後、Ｈ2 Ｏ（４０ml）を加え、更に５分間攪拌を続け
た。固形の生成物をろ取し、Ｈ2 Ｏ（５０ml）で洗浄し
た。固形物を、濃ＮＨ4 ＯＨ水溶液１０mlを含むＭｅＯ
Ｈ５００mlに溶解し、２０分間攪拌した後にろ過してＡ
ｇを取り除いた。ろ液を、減圧下でもとの容量の約半分
まで濃縮し、一晩５℃で冷蔵した。ついで、混合物をCe
lite（Celite Corp.）を通してろ過し、減圧下で固形物
が分離しはじめるまで濃縮した。得られた溶液約１００
mlを、再びCeliteを通してろ過し、酢酸エチル９００ml
で希釈し、１５分間放置した。分離した赤色の固形物を
ろ過により回収し、酢酸エチルで洗浄し、乾燥して化合
物１８（１．５５ｇ、８２．５％）を得た。
【００４０】３−（３′，５′−ジカルボキシフェニル
イミノ）−３Ｈ−フェノキサジン（化合物２０） フェノキサジン（０．９２ｇ、５mmol）をテトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）１０mlに溶解し、濃ＮＨ4 ＯＨ水溶液
１mlを含有する５−アミノイソフタル酸（０．８８ｇ、
４．８６mmol）のＨ2 Ｏ（１０ml）溶液と共に、周囲温
度で攪拌した。混合物に１．０M のＡｇＮＯ3 水溶液１
３．５mlを急速に加え、２時間攪拌し、その間に固形分
が分離した。この固形分を、ろ過により回収し、ＴＨＦ
各回１００mlで３回抽出した。合わせた抽出液を減圧下
で蒸発乾固し、暗色の固体０．８ｇを得、これをＣＨＣ
ｌ3 ／ＭｅＯＨ（１：１、v/v)１００mlを暖めながらそ
の中に取り、シリカゲル３００ｇ上でＣＨＣｌ3 ／Ｍｅ
ＯＨ（２：１、v/v)で展開するクロマトグラフィーに付
した。暗橙色の生成物のバンドを集め、これを減圧下で
蒸発乾固して化合物２０（０．３０ｇ、１６．７％）を
得た。
イミノ）−３Ｈ−フェノキサジン（化合物２０） フェノキサジン（０．９２ｇ、５mmol）をテトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）１０mlに溶解し、濃ＮＨ4 ＯＨ水溶液
１mlを含有する５−アミノイソフタル酸（０．８８ｇ、
４．８６mmol）のＨ2 Ｏ（１０ml）溶液と共に、周囲温
度で攪拌した。混合物に１．０M のＡｇＮＯ3 水溶液１
３．５mlを急速に加え、２時間攪拌し、その間に固形分
が分離した。この固形分を、ろ過により回収し、ＴＨＦ
各回１００mlで３回抽出した。合わせた抽出液を減圧下
で蒸発乾固し、暗色の固体０．８ｇを得、これをＣＨＣ
ｌ3 ／ＭｅＯＨ（１：１、v/v)１００mlを暖めながらそ
の中に取り、シリカゲル３００ｇ上でＣＨＣｌ3 ／Ｍｅ
ＯＨ（２：１、v/v)で展開するクロマトグラフィーに付
した。暗橙色の生成物のバンドを集め、これを減圧下で
蒸発乾固して化合物２０（０．３０ｇ、１６．７％）を
得た。
【００４１】当業者であれば、上記で説明した手順を用
いて、これらの化合物の置換類似体を広い範囲にわたっ
て合成することができる。
いて、これらの化合物の置換類似体を広い範囲にわたっ
て合成することができる。
【００４２】実施例II（ポリマーに結合したメディエー
ターの製造） ここにＰ−３として示すポリマー結合メディエーターの
合成方法は、本願発明の範囲内の、ポリマーに結合した
他のメディエーターを製造するのに用いられる方法の代
表例である。この製造方法は、スキーム２及びそれに続
く記載に説明するとおりである。Ｐ−３は、「ガントレ
ッツ上４０％が化合物１３である」と表現されてもよ
く、それは、ポリマー上の無水物基の４０％が化合物１
３のアミノ部分と反応しているからである。
ターの製造） ここにＰ−３として示すポリマー結合メディエーターの
合成方法は、本願発明の範囲内の、ポリマーに結合した
他のメディエーターを製造するのに用いられる方法の代
表例である。この製造方法は、スキーム２及びそれに続
く記載に説明するとおりである。Ｐ−３は、「ガントレ
ッツ上４０％が化合物１３である」と表現されてもよ
く、それは、ポリマー上の無水物基の４０％が化合物１
３のアミノ部分と反応しているからである。
【００４３】
【化９】
【００４４】ガントレッツ上の４０％が化合物１３であ
るもの（Ｐ−３） ガントレッツＡＮ−１１９（ISP Technologies, Inc.,
Wayne, NJ)（０．１５６ｇ、１．０mmol、無水物）を無
水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０．０ml
に加えた溶液を、不活性ガス雰囲気下、周囲温度に保
ち、無水ＤＭＦ５．０ml中に化合物１３（０．１３２６
ｇ、０．４mmol）と無水トリエチルアミン（０．５６m
l、４．０mmol）とを加えた溶液を一度に加えた。さら
にＤＭＦ３．０mlを用いて痕跡量の化合物１３溶液をす
すぎ入れ、ついで反応混合物を１時間攪拌した。この混
合物をＨ2 Ｏ（２５ml）で希釈し、１５分攪拌し、つい
でさらにＨ2 Ｏ（１７５ml）と混合した。得られた溶液
を濃ＨＣｌ（３．０ml）で酸性とすると、生成物が固体
として分離してきた。この混合物を、２０分間、１０，
４００×G で遠心分離し、上清を捨てた。得られたペレ
ットを超音波処理により０．１M ＨＣｌ（２０ml）に再
懸濁させ、２０分間、３３，４００×G で遠心分離し
た。上清を捨て、ペレットを超音波処理により１００％
エタノール２０ml中に再懸濁し、ついで３０分間、３
３，４００×G で遠心分離した。上清を捨て、ペレット
を減圧下で乾燥して、Ｐ−３（０．２６ｇ）を、黒色粉
末として得た。
るもの（Ｐ−３） ガントレッツＡＮ−１１９（ISP Technologies, Inc.,
Wayne, NJ)（０．１５６ｇ、１．０mmol、無水物）を無
水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０．０ml
に加えた溶液を、不活性ガス雰囲気下、周囲温度に保
ち、無水ＤＭＦ５．０ml中に化合物１３（０．１３２６
ｇ、０．４mmol）と無水トリエチルアミン（０．５６m
l、４．０mmol）とを加えた溶液を一度に加えた。さら
にＤＭＦ３．０mlを用いて痕跡量の化合物１３溶液をす
すぎ入れ、ついで反応混合物を１時間攪拌した。この混
合物をＨ2 Ｏ（２５ml）で希釈し、１５分攪拌し、つい
でさらにＨ2 Ｏ（１７５ml）と混合した。得られた溶液
を濃ＨＣｌ（３．０ml）で酸性とすると、生成物が固体
として分離してきた。この混合物を、２０分間、１０，
４００×G で遠心分離し、上清を捨てた。得られたペレ
ットを超音波処理により０．１M ＨＣｌ（２０ml）に再
懸濁させ、２０分間、３３，４００×G で遠心分離し
た。上清を捨て、ペレットを超音波処理により１００％
エタノール２０ml中に再懸濁し、ついで３０分間、３
３，４００×G で遠心分離した。上清を捨て、ペレット
を減圧下で乾燥して、Ｐ−３（０．２６ｇ）を、黒色粉
末として得た。
【００４５】ポリマー結合メディエーターＰ１（ガント
レッツ上の２０％が化合物１１である）及びＰ−２（ガ
ントレッツ上の２０％が化合物１３である）は、化合物
１３の０．４mmolのかわりに化合物１１及び１３の０．
２mmolを用いた他はＰ−３を調製するのと同様にして調
製した。
レッツ上の２０％が化合物１１である）及びＰ−２（ガ
ントレッツ上の２０％が化合物１３である）は、化合物
１３の０．４mmolのかわりに化合物１１及び１３の０．
２mmolを用いた他はＰ−３を調製するのと同様にして調
製した。
【００４６】実施例III （グラファイト電極上のメディ
エーターの評価） グラファイト棒電極（ＧＲＥ：Johnson Matthey Electr
onics, Ward Hill, MA）（直径３mmのもの）の電極表面
を、まずきめの細かい紙ヤスリで、ついで、１ミクロン
以下のアルミナ粒子の懸濁液で研磨したものを準備し
た。メディエーターの１〜２mMメタノール溶液を調製
し、電極をこの溶液に２分間浸漬した。ついで、電極を
水ですすぎ、０．２５M リン酸緩衝液（pH＝７．０）に
短時間浸した。電流対電圧の様子を、まず測定して、Ａ
ｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対するプラスピークとマイナス
ピークの位置を決定した。ついでＮＡＤＨを２０〜２０
０μMの濃度で含有するpH＝７．０の溶液中で、上記の
サイクリックボルタンメトリー実験で得られる酸化ピー
ク電圧（Ｅ°OX）より一般に１００mV高い電圧を用いて
電流を測定し（使用した実際の電圧は表１の３欄に示し
た）、最小二乗法により得られた、ＮＡＤＨ濃度データ
に対する電流の直線の傾斜により、各メディエーターの
相対感度を、ＮＡＤＨ１μM 当たりの電位（μA)として
得た。種々のメディエーターに対するこれらの傾斜を、
表１の４欄に示した。ここで、傾斜が大きくなるほど、
メディエーターとしては良好である。比較として、これ
らの条件のもとでの３−β−ナフトイル−トルイジンブ
ルー０（Ｉ）の傾斜は、０．００７５である。
エーターの評価） グラファイト棒電極（ＧＲＥ：Johnson Matthey Electr
onics, Ward Hill, MA）（直径３mmのもの）の電極表面
を、まずきめの細かい紙ヤスリで、ついで、１ミクロン
以下のアルミナ粒子の懸濁液で研磨したものを準備し
た。メディエーターの１〜２mMメタノール溶液を調製
し、電極をこの溶液に２分間浸漬した。ついで、電極を
水ですすぎ、０．２５M リン酸緩衝液（pH＝７．０）に
短時間浸した。電流対電圧の様子を、まず測定して、Ａ
ｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対するプラスピークとマイナス
ピークの位置を決定した。ついでＮＡＤＨを２０〜２０
０μMの濃度で含有するpH＝７．０の溶液中で、上記の
サイクリックボルタンメトリー実験で得られる酸化ピー
ク電圧（Ｅ°OX）より一般に１００mV高い電圧を用いて
電流を測定し（使用した実際の電圧は表１の３欄に示し
た）、最小二乗法により得られた、ＮＡＤＨ濃度データ
に対する電流の直線の傾斜により、各メディエーターの
相対感度を、ＮＡＤＨ１μM 当たりの電位（μA)として
得た。種々のメディエーターに対するこれらの傾斜を、
表１の４欄に示した。ここで、傾斜が大きくなるほど、
メディエーターとしては良好である。比較として、これ
らの条件のもとでの３−β−ナフトイル−トルイジンブ
ルー０（Ｉ）の傾斜は、０．００７５である。
【００４７】実施例IV（プリント電極上のメディエータ
ーの評価） プリントされたセンサーカードと、グラファイト／炭素
作用電極及び銀／塩化銀参照電極からなる、プリント電
極の実験を実施した。グラファイト／炭素電極に用いた
インキは、No.423SS（Acheson Colloids Co., Port Hur
on, MI）であり、銀／塩化銀参照電極には、１５〜２５
％ＡｇＣｌと混合したNo.427SS銀インキ（販売元上記と
同じ）を用いた。電極の表面部分は、０．０３cm2 であ
った。
ーの評価） プリントされたセンサーカードと、グラファイト／炭素
作用電極及び銀／塩化銀参照電極からなる、プリント電
極の実験を実施した。グラファイト／炭素電極に用いた
インキは、No.423SS（Acheson Colloids Co., Port Hur
on, MI）であり、銀／塩化銀参照電極には、１５〜２５
％ＡｇＣｌと混合したNo.427SS銀インキ（販売元上記と
同じ）を用いた。電極の表面部分は、０．０３cm2 であ
った。
【００４８】サイクリックボルタンメトリー実験を、プ
リント電極上で、グラファイト電極上で実施したと同様
に実施した。図１では、０．６mMの化合物１８の、pH＝
７．０の０．６mMＰＩＰＥＳ緩衝液のみの中で測定した
場合と、５mMＮＡＤＨの存在下での場合とのサイクリッ
クボルタモグラムを示した。ＮＡＤＨの存在下、電圧２
６mVにおける電流の増加は、ＮＡＤＨにより還元された
メディエーターの酸化によるものである。このメディエ
ーターは、これがＮＡＤＨを酸化してＮＡＤ+にすると
きに還元され、ついで、電極において電気化学的に再酸
化される。実際、このメデイエーターは、ＮＡＤＨを直
接に酸化するのに必要な電位よりもかなり低い電位にお
いてその電気化学的酸化を促進した。図２では、直接に
（メディエーターなしに）プリント電極上で酸化した場
合の、ＮＡＤＨの典型的サイクリックボルタモグラムを
示した。より高いピーク電位（４４３mV）が明らかであ
った。
リント電極上で、グラファイト電極上で実施したと同様
に実施した。図１では、０．６mMの化合物１８の、pH＝
７．０の０．６mMＰＩＰＥＳ緩衝液のみの中で測定した
場合と、５mMＮＡＤＨの存在下での場合とのサイクリッ
クボルタモグラムを示した。ＮＡＤＨの存在下、電圧２
６mVにおける電流の増加は、ＮＡＤＨにより還元された
メディエーターの酸化によるものである。このメディエ
ーターは、これがＮＡＤＨを酸化してＮＡＤ+にすると
きに還元され、ついで、電極において電気化学的に再酸
化される。実際、このメデイエーターは、ＮＡＤＨを直
接に酸化するのに必要な電位よりもかなり低い電位にお
いてその電気化学的酸化を促進した。図２では、直接に
（メディエーターなしに）プリント電極上で酸化した場
合の、ＮＡＤＨの典型的サイクリックボルタモグラムを
示した。より高いピーク電位（４４３mV）が明らかであ
った。
【００４９】グルコース濃度を測定するバイオセンサー
は、酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼが、グルコ
ースをグルコノラクトンに酸化する際にＮＡＤ+ を還元
してＮＡＤＨにすることを利用している。メディエータ
ーによるＮＡＤＨからＮＡＤ+ への電気化学的再酸化
が、該グルコース濃度に比例する電流を生じさせる。
は、酵素であるグルコースデヒドロゲナーゼが、グルコ
ースをグルコノラクトンに酸化する際にＮＡＤ+ を還元
してＮＡＤＨにすることを利用している。メディエータ
ーによるＮＡＤＨからＮＡＤ+ への電気化学的再酸化
が、該グルコース濃度に比例する電流を生じさせる。
【００５０】典型的グルコースバイオセンサーは、以下
のようにして製造した。：２５mMのＫＣｌを含有するpH
＝７．０のリン酸緩衝液１００mM中メディエーター４mM
の溶液を調製し、５％スルフィノール（Surfynol, Air
Products and Chemicals, Inc., Allentown, PA)１．９
６ｇ、ＮＡＤ（０．３２ｇ）、グルコースデヒドロゲナ
ーゼＧＤＨ（Toyobo）０．７０ｇ、pH＝７．０の０．５
M ＰＩＰＥＳ緩衝液１．４４ｇ及び脱イオン水５．５ml
からなる同量の溶液で希釈した。混合物１．７５μl を
センサー領域に塗布し、室温で放置して乾燥し、約２０
分乾燥した。この電極を小さなキャピラリー挿入部（ga
p)を有するフォーマット中に組み入れ、グルコース水溶
液で処理して表１の６欄に記載した電位で電流を測定し
た。これを、グルコースを各０、５０、１００、２００
及び５００mg/dl の濃度で含む試料に関して行い、グル
コース濃度に対する電流の最小二乗法により得られた直
線（lisine line)の傾斜が、各メディエーターの相対感
度（μA/グルコースmg/dl)を表していた。傾斜が大きく
なるにしたがって、メディエーターの性能は良好にな
る。これらの傾斜は、表１の最終欄に示した。
のようにして製造した。：２５mMのＫＣｌを含有するpH
＝７．０のリン酸緩衝液１００mM中メディエーター４mM
の溶液を調製し、５％スルフィノール（Surfynol, Air
Products and Chemicals, Inc., Allentown, PA)１．９
６ｇ、ＮＡＤ（０．３２ｇ）、グルコースデヒドロゲナ
ーゼＧＤＨ（Toyobo）０．７０ｇ、pH＝７．０の０．５
M ＰＩＰＥＳ緩衝液１．４４ｇ及び脱イオン水５．５ml
からなる同量の溶液で希釈した。混合物１．７５μl を
センサー領域に塗布し、室温で放置して乾燥し、約２０
分乾燥した。この電極を小さなキャピラリー挿入部（ga
p)を有するフォーマット中に組み入れ、グルコース水溶
液で処理して表１の６欄に記載した電位で電流を測定し
た。これを、グルコースを各０、５０、１００、２００
及び５００mg/dl の濃度で含む試料に関して行い、グル
コース濃度に対する電流の最小二乗法により得られた直
線（lisine line)の傾斜が、各メディエーターの相対感
度（μA/グルコースmg/dl)を表していた。傾斜が大きく
なるにしたがって、メディエーターの性能は良好にな
る。これらの傾斜は、表１の最終欄に示した。
【００５１】図３は、化合物１８に関して、１００mV及
び３００mVの電位においてグルコース濃度に対する電流
をプロットしたものを示す。
び３００mVの電位においてグルコース濃度に対する電流
をプロットしたものを示す。
【００５２】各々のポリマー結合メディエーターは、完
成したグルコースバイオセンサー中に上述したように組
み込まれ、その相対感度は、表２の最終欄に示した。
成したグルコースバイオセンサー中に上述したように組
み込まれ、その相対感度は、表２の最終欄に示した。
【００５３】
【表４】
【００５４】図４は、３種のポリマー結合メディエータ
ーに関して、３００mVの電位においてグルコース濃度に
対する電流をプロットしたものを示す。
ーに関して、３００mVの電位においてグルコース濃度に
対する電流をプロットしたものを示す。
【図１】０．６mMＰＩＰＥＳ緩衝液中、pH７．０におけ
る、化合物１８（０．６mM）の、単独での、及び５mMＮ
ＡＤＨの存在下でのサイクリックボルタモグラムを示
す。
る、化合物１８（０．６mM）の、単独での、及び５mMＮ
ＡＤＨの存在下でのサイクリックボルタモグラムを示
す。
【図２】プリント電極上で直接的に酸化されたＮＡＤＨ
の、典型的なサイクリックボルタモグラムを示す。
の、典型的なサイクリックボルタモグラムを示す。
【図３】設定された電圧において、本発明のメディエー
ターの１種に関して、グルコース濃度に対する電流をプ
ロットしたものである。
ターの１種に関して、グルコース濃度に対する電流をプ
ロットしたものである。
【図４】ポリマーに結合したメディエーターを用いた場
合の、グルコース濃度に対する電流をプロットしたもの
である。
合の、グルコース濃度に対する電流をプロットしたもの
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ２５Ｂ 11/04 Ｇ０１Ｎ 27/30 ３３１Ｙ 27/46 ３３８ (72)発明者 ポール・エフ・コーリー アメリカ合衆国、インデイアナ州、46514、 エルクハート、スプリングブルック・ドラ イブ 1535 (72)発明者 インピン・デン アメリカ合衆国、インデイアナ州、46530、 グレンジャー、ジェンシャン・レーン 51930 (72)発明者 アリスン・ジェイ・マレー アメリカ合衆国、インデイアナ州、46514、 エルクハート、ツイン・パインズ・ポイン ト 3006 (72)発明者 マシュー・ケー・ムショー アメリカ合衆国、インデイアナ州、46530、 グレンジャー、ノース・フェザント・コー ブ・ドライブ 10648 (72)発明者 ハンス−ウルリッヒ・シグマン アメリカ合衆国、インデイアナ州、46516、 エルクハート、レスリー・レーン 23119
Claims (19)
- 【請求項１】 補酵素類であるジヒドロニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ジヒドロニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤ
ＰＨ）又はそれらの類似体の電気化学的再生に適切な電
極であって、該電極表面に、置換又は非置換の、３−フ
ェニルイミノ−３Ｈ−フェノチアジン類及び３−フェニ
ルイミノ−３Ｈ−フェノキサジン類の群から選択される
メディエーター化合物の１種又はそれ以上を含有するメ
ディエーター機能が付与されていることを特徴とする電
極。 - 【請求項２】 メディエーターが、式（IV）又は式
（Ｖ）： 【化１】 （式中、Ｒ1 及びＲ2 は、メディエーターの酸化−還元
（レドックス）電位を調節するか、メディエーターの溶
解性を変化させるか、又はポリマー若しくは固体支持体
にメディエーターを共有結合させる部位として機能す
る、置換基である）で示される、請求項１記載の電極。 - 【請求項３】 Ｒ1 及びＲ2 が、同一でも異なっていて
もよく、水素、低級アルキル、アリール、ハロ、ハロア
ルキル、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルコキシ
カルボニル、アリールオキシカルボニル、芳香族及び脂
肪族ケト、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、ジア
ルキルアミノ、アミノアルキル、スルホ及びジヒドロキ
シボロンよりなる群から選択され、ここで脂肪族及び芳
香族基は置換されているか又は非置換である、請求項２
記載の電極。 - 【請求項４】 電極材料が、グラファイト、熱分解炭
素、ガラス状炭素、白金、金又はこれらの材料から製造
された複合材である、請求項１記載の電極。 - 【請求項５】 メディエーターが、ポリマーに結合して
いる、請求項１記載の電極。 - 【請求項６】 ポリマーが、メチルビニルエーテルとマ
レイン酸無水物のコポリマーである、請求項５記載の電
極。 - 【請求項７】 メディエーターが、 ３−（４′−クロロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノ
チアジン、 ３−（４′−ジエチルアミノ−フェニルイミノ）−３Ｈ
−フェノチアジン、 ３−（４′−エチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノ
チアジン、 ３−（４′−トリフルオロメチル−フェニルイミノ）−
３Ｈ−フェノチアジン、 ３−（４′−メトキシカルボニル−フェニルイミノ）−
３Ｈ−フェノチアジン、 ３−（４′−ニトロ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノ
チアジン、 ３−（４′−メトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェ
ノチアジン、 ７−アセチル−３−（４′−メトキシカルボニルフェニ
ルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、 ７−トリフルオロメチル−３−（４′−メトキシカルボ
ニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、 ３−（４′−ω−カルボニル−ｎ−ブチル−フェニルイ
ミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、 ３−（４′−アミノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−
フェノチアジン、 ３−（４′−（２″−（５″−（ｐ−アミノフェニル）
−１，３，４−オキサジアゾリル））フェニルイミノ）
−３Ｈ−フェノチアジン、 ３−（４′−β−アミノエチル−フェニルイミノ）−３
Ｈ−フェノチアジン、 ６−（４′−エチルフェニル）アミノ−３−（４′−エ
チル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、 ６−（４′−〔２−（２−エタノ−ルオキシ）エトキ
シ〕エトキシフェニル）アミノ−３−（４′−〔２−
（２−エタノールオキシ）エトキシ〕エトキシ−フェニ
ルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、 ３−（４′−〔２−（２−エタノールオキシ）エトキ
シ〕エトキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジ
ン、 ３−（４′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン
ホウ酸、 ３−（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−
３Ｈ−フェノチアジン、 ３−（４′−カルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フ
ェノチアジン、 ３−（３′，５′−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−
３Ｈ−フェノキサジン、 ３−（２′，５′−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチ
アジンジスルホン酸及び３−（３′−フェニルイミノ）
−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸からなる群から選択
される、請求項１記載の電極。 - 【請求項８】 メディエーターが、３−（４′−トリフ
ルオロメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジ
ンである、請求項７記載の電極。 - 【請求項９】 メディエーターが、３−（４′−メトキ
シカルボニル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジ
ンである、請求項７記載の電極。 - 【請求項１０】 メディエーターが、３−（４′−ω−
カルボキシ−ｎ−ブチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フ
ェノチアジンである、請求項７記載の電極。 - 【請求項１１】 メディエーターが、３−（４′−アミ
ノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンで
ある、請求項７記載の電極。 - 【請求項１２】 メディエーターが、３−（４′−β−
アミノエチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジ
ンである、請求項７記載の電極。 - 【請求項１３】 メディエーターが、３−（３′，５′
−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチア
ジンである、請求項７記載の電極。 - 【請求項１４】 メディエーターが、３−（３′，５′
−ジカルボキシ−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノキサ
ジンである、請求項７記載の電極。 - 【請求項１５】 メディエーターが、３−（２′，５′
−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンジスルホン
酸である、請求項７記載の電極。 - 【請求項１６】 メディエーターが、３−（３′−フェ
ニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジンスルホン酸であ
る、請求項７記載の電極。 - 【請求項１７】 メディエーターが、３−（４′−アミ
ノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
又は３−（４′−β−アミノエチル−フェニルイミノ）
−３Ｈ−フェノチアジンである、請求項５記載の電極。 - 【請求項１８】 メディエーターが、３−（４′−アミ
ノメチル−フェニルイミノ）−３Ｈ−フェノチアジン、
又は３−（４′−β−アミノエチル−フェニルイミノ）
−３Ｈ−フェノチアジンである、請求項６記載の電極。 - 【請求項１９】 触媒としてのデヒドロゲナーゼ、及び
エネルギー移動酸化還元対としての補酵素により作動す
る、生化学的燃料電池の性能を改良する方法であって、
請求項１記載の電極を、該燃料電池の陰極として組み込
むことを特徴とする方法。
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