JP3911023B2 - ポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲート - Google Patents

ポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲート Download PDF

Info

Publication number
JP3911023B2
JP3911023B2 JP51336397A JP51336397A JP3911023B2 JP 3911023 B2 JP3911023 B2 JP 3911023B2 JP 51336397 A JP51336397 A JP 51336397A JP 51336397 A JP51336397 A JP 51336397A JP 3911023 B2 JP3911023 B2 JP 3911023B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
factor
factor viii
polypeptide
mpeg
motomeko
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP51336397A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH11513378A (ja
JPH11513378A5 (ja
Inventor
ダルボルイ，ヨハンナ
サンドベルイ，ヘレナ
スメツズ，アンナ−リーサ
オーケルブロム，エバ
Original Assignee
バイオビトラム・アクテイエボラーグ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20399642&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP3911023(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by バイオビトラム・アクテイエボラーグ filed Critical バイオビトラム・アクテイエボラーグ
Publication of JPH11513378A publication Critical patent/JPH11513378A/ja
Publication of JPH11513378A5 publication Critical patent/JPH11513378A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3911023B2 publication Critical patent/JP3911023B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/813—Carrier is a saccharide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

発明の分野
本発明は、有機化学合成により生産されたリガンドを有するグループ特異的吸着剤へポリペプチドを固定化し、生体適合性ポリマーを活性化し、この活性化生体適合性ポリマーを固定化ポリペプチドとコンジュゲーションし、その後吸着剤からコンジュゲートを溶出させることにより、当該ポリペプチドの露出した標的を保護してそのポリペプチドのインビボでの機能を改善する方法に関する。本発明はさらに本方法により得られるポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲートおよび当該コンジュゲートの薬剤としての使用に関する。とりわけ、ポリペプチドは第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子または第IX因子である。この発明は特に、ポリペプチドが高比活性を有する第VIII因子で、生体適合性ポリマーとしてモノメトキシポリアルキレンオキシド（mPEG）を用いたコンジュゲートが望ましい。
発明の背景
ポリペプチドのインビトロでの安定性とインビボでの半減期が生体適合性ポリマー（biocompatible polymer）への共有結合により増加することは良く知られている（以下、コンジュゲーションまたは修飾と呼ぶ）。ポリペプチド表面の修飾はまた、ポリペプチドが示す免疫原性を減らすという利点もある。
ペジル化（pegylation）、すなわち、いろいろなポリエチレングリコール（PEG）をポリペプチドに結合させることは、例えばタンパク質のインビトロでの安定性とインビボでの半減期を増加するために広く用いられている技術である。ペジル化については何年にもわたって多くの技術が提案された。このことはZalipsky,S.et al in Poly（Ethylene Glycol）Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, New York（1992）,and Katre N.V.,Adv.Drug Deliv.Rev.,10,91-114（1993）に論及されている。
ある種のタンパク質ではこのコンジュゲーションの結果、活性や機能の低下が認められ、その効果は修飾程度により増加する（Inada,Y.et al,Trends in Biotechnology,13,86-91（1995））。この問題を回避すべく結合をより選択的にする方法が開発された。例えば、部位特異的突然変異がリコンビナントインターロイキンー２（rIL-2）に適用された。特異的な標的はシステインの挿入により創られる（Goodson,R.J.and Katre,N.V.,Bio/Technology 8,344-346（1990）;Katre 1993,上を参照）。そのような手段は一般的には治療用タンパク質には適用できない。なぜならばアミノ酸置換は分子の元々の性格を変えその結果、問題が生じるからである。その代わりに、ポリマーはタンパク質の糖鎖形成部位に直接結合させることができる。例えば、WO/94/29370（Enzon）で開示された第IX因子（factor IX）がある。しかし、この場合、糖タンパク質を過ヨウ素酸ナトリウムと反応させたりガラクトースオキシダーゼにより酵素的に処理をしたときに起こりうる炭化水素部分の酸化を伴う。このような状態は分子にとって有害であることが多い。この開示された例では、コンジュゲーションしょうとする糖鎖形成部位は第IX因子のインビボで加水分解活性化の間に除去されてしまうペプチド配列に存在していた。それゆえ、生体適合性ポリマーは活性ポリペプチドの機能に影響しない。
WO94/13322（Farmitalia Carlo Erba）には、特定のタンパク質（第１物質）の機能に不可欠な部位の機能を損なわずに行われるペジル化が示されている。これは第１物質の機能部位に特異的に結合しうる第２物質と接触させ、その部位を防護することにより達成される。さらに詳細には、特定のタンパク質を当該タンパク質に対して特異的な親和性を有するリガンドを用いてレジンに固定化して、ペジル化を行う。第２物質は例えば相補的な生物学的分子である。WO94/13322には、抗体（第１物質）−対応する抗原（第２物質）、特異的阻害剤（第１物質）−酵素（第２物質）、成長因子（第１物質）−対応するレセプター（第２物質）の対、またはこれらの対を逆にした対が例として開示されている。
しかし、医薬製造を意図したプロセスでは、生物学的に複雑な物質の使用を最小限に抑えることが好ましい。これは主として、当該物質の生物化学的な均一性および使用時の安定性の考証が厳密に要求されるからである。従って、有機化学合成により製造されるアフィニティーリガンドを使用するのが望ましい。
DE3717210はバイオポリマー、好ましくは電荷を有するバイオポリマーの修飾に関する。バイオポリマーを、例えばイオン交換吸着剤に固定化し、酵素や他の生物化学的試薬などの試薬と反応させ反応生成物を得て、次いで反応生成物を吸着剤から脱着させるというプロセスである。反応生成物は好ましくは制限酵素により切断された核酸である。DE3717210では、吸着した状態のバイオポリマーを利用してバイオポリマーと試薬の接触（露出）をより良好にし、それにより修飾効率を上げている。しかし、インビボでのバイオポリマーを機能上有利にする、露出した標的を保護することについてもバイオポリマーの活性を維持することについても開示されていない。DE3717210の発明は核酸などの生物分子の特性のマッピング、実際上のプロセシングによる元来の性質の変更、または放射性同位元素の結合などによる高分子の機能的実体（functional entities）の数の増大を目的にしたにすぎない。
治療用を意図した多くのタンパク質が、様々なペジル化技術を用いてコンジュゲーションされている（Francis,G.E.et al,in Stability of Protein Pharmaceuticals/Series:Pharmaceutical Biotechnology 3,235-263（1992）;Inada,Y.et al,Trends in Biotechnology,13,86-91（1995））。多くの例は静脈内投与に関する。しかし、m-PEGとアレルゲンとのコンジュゲートの皮下投与後の血漿、肺、肝臓、脾臓への取り込みが開示され、m-PEGとアレルゲンとのコンジュゲートの皮下投与による免疫療法が有効であることが立証されている（Dreborg,S.andÅkerblom,E.B., Crit. Rew.Therap.Drug Carr.Sys.6（4）,315-365（1990））。また、筋肉内投与はアデノシンデアミナーゼの臨床試験で用いられた（Hershfield,M.S.et al,New Eng.J.Med.316,589-596（1987）。また、少数ではあるが、ペジル化は経口投与でも有益であると主張されている。経口投与のためのIgGのペジル化はMount Sinai School of MedicineのEP-A-0614373に開示された。経口投与のための第VIII因子と第IX因子のペジル化はSakuragawa et al,Acta Med.Biol.,34（3）,77-84（1987）とNippon Chemifar Companyの日本特許出願番号No.44509/83に開示された。
第VIII因子は本質的に備わっている血液凝固に関与するタンパク質であり、リン脂質とカルシウムイオンの存在下で、酵素第IXa因子が酵素前駆体第X因子を最終的にフィブリン塊を導く活性体、第Xa因子に変える反応の補因子である。ヒトの第VIII因子は約３００キロダルトンの単鎖分子として合成され構造的ドメインA1-A2-B-A3-C1-C2からなる（Gitschier et al.,1984,Nature 312,p.326;Wood et al.,1984,Nature 312,p.330;Vehar et al.,1984,Nature 312,p.337;Toole et al.,1984,Nature,312,p.342）。前駆体産生物はゴルジ体で２００キロダルトンと８０キロダルトンの２つのポリペプチド鎖にプロセスされ、２つの鎖は金属イオンの働きで結合を保ち、血液中に出現する（Kaufman et al.,1988,J.Biol.Chem.,263,p.6352;Andersson et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.,83,p.2979）。第VIII因子のBドメインは第VIII因子の補因子機能に関して不可欠であるとみられているのに対して、A,Cドメインは止血において役割を果たす別の高分子と相互作用する部位を持つ（Sandberg et al.,1993,Thrombos.Haemostas.,69,p.1204 and Lind et al.,1995,Eur.J.Biochem.,232,p.19）。
フォン・ウィルブランド因子（vWf）は約２４０キロダルトンのジスルフィド結合したサブユニットからなる多機能ポリマー血漿タンパク質である。これらのサブユニットは、約１メガダルトンから２０メガダルトンの分子量を有する多量体の不均一な集団を形成する。１次止血におけるvWfの機能は高い剪断速度の状況下で血小板の血管壁への接着を促進することにある。vWfはまた第VIII因子と共有結合ではないが、強く結合する。正常ヒト血漿中で第VII因子とvWfは互いに複合体を作って循環する。vWf第VIII因子をプロテアーゼによる分解から保護するという点で、第VIII因子分子の重要な安定化効果を有する（Koedam et al.,1987,Doctoral Thesis,ICG Printing,Dordrecht,1986,p83;Hamer et al.,1986,Haemostasis,1987,58,p.223）。ヒトの第VIII因子のインビボでの半減期は通常１０〜１５時間である。vWf欠乏の患者において、低下したvWfレベルは第VIII因子の放出の低下と第VIII因子の分解速度の上昇に起因する第VIII因子レベルの低下を伴う。Tuddenham et al.,1982,Br.J.Haemato.,52,p.259およびBrinkhous et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.,82,p.8752はvWfの存在が第VIII因子のインビボでの残存に対して重要な効果があることを示した。第VIII因子を血友病の犬に注入したときの半減期は７〜１０時間であったが、vWf欠乏犬に注入した後は約１時間であった（Brinkhous et al.,上を参照）。
第IX因子は上述の第IXa因子の酵素前駆体である。第IX因子はセリンプロテアーゼで、ビタミンＫ依存凝固タンパク質の１つであり、分子量は約５５キロダルトンである（DiScipio et al.,1977,Biochemistry,16,p.698）。第IXa因子は他の成分と特異的に相互作用して第X因子を活性化する（In:Haemostasis and Thrombosis,1994,vol.1,third edition,ed.Bloom A.et al.）。
上のパラグラフから明らかなように、第VIII因子はそれぞれ特異的な機能を引き受けるいくつかの相互作用部位を有するタンパク質である。それゆえ、第VIII因子を生物学的機能を充分保持したまま修飾するのは困難である。
ペジル化技術は以前に第VIII因子を含むタンパク質混合物に適用された。WO94/15625（Enzon）に、修飾程度は測定不可能であるが、第VIII因子に対して１００倍モル過剰のmPEGを混ぜ、カルバミン酸（ウレタン）結合を利用して第VIII因子をペジル化すると、マウスのインビボでの半減期を１３時間から５５時間に増加させ得ることが開示されている。マウスにおける半減期は通常約１時間であると考えられている。それゆえ、１３時間というのは異常に長い半減期である。その上、最初の第VIII因子試料の極めて低い精製度（20-50IU/mgタンパク質）を考えると、カップリング反応の間第VIII因子よりも他のタンパク質が優勢であったことを考慮しなければならない。低い精製度の第VIII因子試料の中に通常存在する重要なタンパク質はフォン・ウィルブランド因子であり、それは第VIII因子の機能を安定化させると共にコンジュゲーションプロセスの間、対応する機能部位の保護に非常に良く貢献し得る。コンジュゲーション後、mPEGは、通常第VIII因子を少しだけ含むタンパク質混合物中のどのタンパク質上にも存在し得る。第VIII因子を含むペジル化タンパク質混合物は静脈内投与に用いられた。しかし、薬品製造に要求される管理条件として、最初に含まれる物質を充分に明らかにすることが不可欠である。
他のポリマーも第VIII因子のコンジュゲーションに用いられている。U.S.Patent 4,970,300にはデキストランコンジュゲートが第VIII因子の半減期を長くできることが開示されている。
ほとんどのカップリング技術でポリマー試薬はポリペプチドのリシン残基のε-アミノ基と反応する。この基はポリペプチドの表面全体に存在し、機能部位に近接してのコンジュゲーションが生じる。この結果、ランダムカップリングによって、活性や機能が破壊されることが多い。我々の経験では、凝集活性を有するB-ドメイン欠失リコンビナント第VIII因子のような非常に精製度の高い試料にこのような技術を適用するとき、第VIII因子１分子当たり約5mPEGの修飾程度で活性は著しく低下する。
発明の概要
本発明の発明者は、ポリペプチドをカップリング反応前にグループ特異的吸着剤（group-specific adsorbent）に単に固定化し、その後、通常の技術により脱着させることにより、コンジュゲートされたポリペプチドの比活性が高度に維持され得ることを見いだした。これは全く驚くべきことである。なぜならば、これまでは生物学的機能に重要なドメインの保護を達成するためには、問題となっているポリペプチドに関して特異的に結合する性質を有する吸着剤を使用することが必要と考えられていたからである。
修飾に用いる生体適合性ポリマーの利点は修飾の程度に依存することが多い。ゆえに、高度の修飾、即ちポリペプチド１分子当たりの多数の生体適合性ポリマーが加水分解活性に対する効率的な防御のために要求されるのが普通である。本発明では生体適合性ポリマーがより選択的に導入されるので、特異的活性は良く維持される。こうして、本発明の発明者は第VIII因子に対する分解活性が認められるインビトロの環境下で、第VIII因子を分解から効率的に保護し得ることを見い出した。この効果は第VIII因子当たりわずか4-5mPEGの修飾程度で達成され得る。
本発明によればグループ特異的吸着剤の使用は先行技術に開示された吸着剤に比べ経済的である。グループ特異的吸着剤の使用はまた治療薬としてコンジュゲートを登録するときに有利である。
本発明の方法によると、特に生物学的利用能（bioavailability）を含む薬物動態学的機能を改善することにより、またポリペプチドが示す免疫原性を減らせることにより、ポリペプチドのインビボでの機能を改善することができる。
それゆえ、本発明はポリペプチドの露出された標的を防護することにより当該ポリペプチドのインビボでの機能を改善する方法に関する。本方法においては、
a）有機化学合成により製造されたリガンドを有するグループ特異的吸着剤との相互作用によりポリペプチドを固定化し、
b）生体適合性ポリマーを活性化し、
c）固定化ポリペプチドと活性化した生体適合性ポリマーとをコンジュゲーションし、その後
d）吸着剤からコンジュゲートを溶出する。
発明の詳細な説明
本発明では、相互作用部位という語は特定のポリペプチドの生物学的機能に必要ないろいろな部位に関連する。
本発明では、露出された標的という語は、インビボで望ましくない反応を受けやすい問題となるポリペプチド上の外側の部位に関連する。例えば、抗原性を有するエピトープや加水分解の開裂部位がある。ある種の加水分解開裂部位は相互作用部位とも呼ばれる。
本発明は、例えば加水分解開裂や凝集などのインビボでの望ましくない反応の影響を低下させることを可能にする一方で、ポリペプチドの生物学的機能に必要な相互作用部位には影響しない。従来、これは不可能であった。このことは（リコンビナント）第VIII因子のmPEGコンジュゲーションの適用により明らかになった。より詳細には、有機化学合成により製造されたリガンドを有するグループ特異的吸着剤との相互作用によるポリペプチドの固定化により、ポリペプチド上の相互作用部位は生体適合性ポリマーへのコンジュゲーションから保護される。その上、活性化された生体適合性ポリマーをポリペプチドの望みの外側の部位へコンジュゲーションすることにより、露出した標的はタンパク質分解酵素などの働きから守られる。
本発明において、ポリペプチドは鎖中に少なくとも２０アミノ酸を有するタンパク質やオリゴペプチドを意味する。本発明により産生されるポリペプチドのアミノ酸の数は30〜4,500の間で、好ましくは40〜3,000である。ポリペプチドはほ乳類、特にヒト由来か,またはリコンビナントDNA技術により生産されたものであってもよい。本発明によりコンジュゲートされ得るポリペプチドには凝集活性を表すポリペプチド、または凝集に対して補助機能を有するポリペプチドが含まれる。ポリペプチドは完全長のものであってもよい。すなわち、アミノ酸の配列は一般的にほ乳類に見出せる配列および特にヒトに見出せる配列に一致するアミノ酸配列であっても良い。ポリペプチドはまた１つ以上のアミノ酸が失われた完全長ポリペプチドの欠失誘導体であっても良い。ポリペプチドは第VIII凝集因子、フォン・ウィルブランド因子（vWf）並びにそれらの組合せ、または第IX凝集因子が適しており、第VIII凝集因子が好ましい。ヒト血しょうに存在する完全長第VIII因子は約３００キロダルトンの分子量を有する。ヒト血しょう由来の第VIII因子濃縮物はAndersson et alに記載されたいくつかの断片化された完全に活性な第VIII因子型を含む（上を参照）。最も小さい活性型は約１７０キロダルトンの分子量を有し金属イオンにより結合している約９０キロダルトンと約８０キロダルトンの２つの鎖からなる。このことはPharmacia & Upjohn ABによるEP-A-0 197 901で論及されている。それゆえ、本発明に従って生産される生物学的に活性な第VIII因子は約１７０キロダルトンから約３００キロダルトンまでの範囲の分子量を有するものが適切である。
Pharmacia Ab of Stockholm,Swedenは治療用第VIII因子濃縮物中の１７０キロダルトン血しょう第VIII因子型に対応したリコンビナント第VIII因子を開発した。截形（truncated）リコンビナント第VIII因子分子はr-VIIISQと呼ばれ無血清培地での細胞培養系でチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞により生産される。r-VIIISQの比活性は総タンパク質１mg当たり約15,000IU VIII:Cであった。r-VIIISQの構造と生化学はPharmacia ABに譲渡されたWO-A-91/09122に記載されている。
本発明では、第VIII因子は血しょう第VIII因子またはリコンビナント第VIII因子のどちらでもよい。第VIII因子がリコンビナントのとき、それは完全長の第VIII因子であるか、または好ましくは凝集活性を有する完全長の第VIII因子からの欠失誘導体である。さらに好ましくは、欠失誘導体はリコンビナント第VIIISQ因子（r-VIIISQ）である。ここで、欠失誘導体はBドメインの全部または一部が失われているが凝集活性は残っている凝集第VIII因子と定義される。残りのドメインはアミノ酸リンカーと結合する。いろいろなリンカーの構造の例はP.Lind et al,Eur.J.Biochem.,vol.232（1995）pp.19-27に示されている。
本発明は多種の第VIII因子製造物中に生体適合性ポリマーを選択的に導入するのに使用することができて有益である。それゆえ、本発明はフォン・ウィルブランド因子（vWf）であるキャリアタンパク質との共働によりすでに安定化しているインビボでの血しょう第VIII因子をさらに安定化させるために用いることができる。
最終生産物が明確になっているのは有利である。それゆえ、本発明のカップリング後の第VIII因子比活性は少なくとも約1,000IU/mg総タンパク質であり、少なくとも2,000IV/mg総タンパク質が適している。第VIII因子比活性は好ましくは5,000〜20,000IU/mg総タンパク質の間であり、さらに好ましくは10,000〜17,000IU/mg総タンパク質の間である。
カップリング後の第VIII因子活性は少なくとも約1,000IU/mlであり、少なくとも2,000IV/mlが適している。第VIII因子活性は好ましくは5,000から50,000IU/mlの間であり、さらに好ましくは20,000〜40,000IU/mlの間である。
本発明の生体適合性ポリマーは、モノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキサイドのホモポリマー、共重合体またはブロック共重合体からなるグループから選択される。生体適合性ポリマーは直鎖でも分枝があってもよい。モノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキシドはポリエチレングリコールホモポリマーとポリプロピレングリコールホモポリマーからなるグループより選択されるのが適している。生体適合性ポリマーは好ましくはポリエチレングリコール（PEG）ホモポリマーである。PEGの分子量は約300〜20,000までで、このなかでも1,500〜10,000までが適しており、好ましくは3,000〜5,000までである。
生体適合性ポリマーは交差誘導体化（cross derivatization）を防止すべく一端がキャッピングされている。この目的のために適した基の例は直鎖または分枝鎖の低級アルコキシ基であり、好ましくはモノメトキシ基である。当該発明の中で特に好ましい生体適合性ポリマーはモノメトキシポリエチレングリコール（mPEG）である。
他の生体適合性ポリマーもまた考えられる。例えばデキストラン、ポリビニルピロリドンとDLアミノ酸がある。
生体適合性ポリマーは共有結合が形成されるようにカップリング反応の前に活性化されなければならない。この目的のため、ポリペプチドに接する生体適合性ポリマーの終端には活性化されやすい水酸基が結合していなければならない。生体適合性ポリマーを活性化する方法は、共有結合形成のために選択されたアミノ酸に依存して多数ある。アミノ基へのカップリングに適したmPEG誘導体はmPEGスクシニイミジルスクシネート、mPEGスクシニイミジルスクシンアミド、mPEGスクシニイミジルプロピオネート、mPEGスクシニイミジルカーボネート、カルボキシメチル化されたmPEGスクシニイミジルエステル、mPEGオキシカルボニルイミダゾール、mPEGニトロフェニルカーボネート、mPEGトリクロロフェニルカーボネート、mPEGトレシレート（最後のものはNilsson K.,Mosbach K.,Methods in Enzymology,Vol104,pp56-69（1984））,（ここに挙げた総ての試薬はShearwater Polymer,Inc.,Huntsville,AL,USAで市販されている）,mPEG無水マレイン酸並びにmPEG無水メチルマレイン酸（Garman A.,Kajindjian S.B.,FEB Vol223:2,pp361-365）及びmPEGコハク酸の混合酸無水物、mPEG酢酸またはmPEGプロピオン酸である（Dreborg S.and Akerblom E.,上を参照）。
システイン残基はmPEGマレイミド、mPEGビニルスルフォン及びmPEGオルトピリジルジスルフィドとコンジュゲートしうる（Sheawater Polymers,Inc.,Huntsville,AL,USAが市販）。アルギニンのグアニジノ基のコンジュゲーションに適した試薬はフェニルグリオキサールのmPEG誘導体である（Zalipski上を参照）。
炭化水素は最初に酸化されるに違いないのでアルデヒド基が存在しmPEGヒドラジドとコンジュゲートしうる（Zalipski上を参照）。
カップリング手順はアミノ酸がコンジュゲーションされるのに適したpHで行われる。この際、生体適合性ポリマーの反応性がpHに依存することと同様に、ポリペプチド全体として適したpHがあることも考慮されなければならない。それ故、通常カップリングのためのpHは約７から約８の間にある。約７はカップリング過程の延長を避けるための下限値であり、また約８はポリペプチドに対して穏和な条件を与える上限値である。このpH範囲はリシンの関与するコンジュゲーションに適している。それゆえ、本出願の実施例では、そのような穏和な条件下で第VIII因子活性を有する物質をコンジュゲートした。この範囲外のpH値もときには適している。例えば、システインが関与するコンジュゲーションは約７より下のpHが適しているが、アルギニンは約５．５から約９．３のpH範囲が適している。
カップリング手順は０℃より上の温度で行われ、約５℃から約４０℃が適しており、好ましくは１０℃から３０℃である。ここでも、生体適合性ポリマーのへ反応温度が影響するのと同じく、ポリペプチド全体に適した温度も考慮しなければならない。本出願の実施例では、すべてのカップリング過程は室温で行われた。
本発明で用いられた吸着剤は固定化すべきポリペプチドに関してはグループ特異的（group-specific）である。グループ特異的吸着剤はいろいろなポリペプチドに対して親和性を有する。とりわけ、その結合は比較的弱い場合が多く、その溶出は、単一かまたは非常に少数のポリペプチドに結合する単一特異的（mono-specific）吸着剤の場合より穏和な条件で行われる。適切なグループ特異的な吸着剤はJansson.J.-C.et al,Protein Purification,Principles.に例示されている。High Resolution Methods,and Applications,VCH Publishers,pp.274-285（1989）が参考文献として載っている。本発明の吸着剤はさらに有機化学合成により製造されたリガンドを有することを特徴とする。この基準に適合した吸着剤の例として、一般的にタンパク質の吸着に使用できるクロマトグラフィー用樹脂がある。クロマトグラフィー用樹脂には例えば、陰イオンおよび陽イオン交換基、スルフヒドリル基、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（IMAC）基、直鎖若しくは分枝鎖で飽和若しくは不飽和の炭化水素鎖および芳香族基のようなリガンドを結合させた生体適合性基質がある。混合機能リガンド、例えば、アミノアルキルまたはジメチルアミノプロピルカルバミルペンチルのようなイオン性及び疎水性部分を有するリガンドも有用である。これらの２つのリガンドは血しょう由来第VIII因子の精製に有益であると報告されている。これらはMorgenthaler et al,Thromb.Haemostas.47（2）,124ff.（1982）and Te Booy,M.P.W.M.,et al,J.Chrom.503,103-114（1990）,にそれぞれ開示されている。アミノアルキルの好ましい例はアミノヘキシルである。有機化学合成により合成されたペプチド、リン脂質のようなより複雑なリガンドも使用しうる。当業者ならば、有機化学合成により合成されたグループアフィニティーリガンドにはいろいろな物質が含まれることがわかる。反応性のトリアジンベースの繊維染料は、キナーゼやヒドロゲナーゼのようないろいろな酵素の吸着剤として有用である。また、有機化学合成により合成された糖誘導体、ヌクレオチドやペプチド、それらの類似体も有益である（Dechow,F.J.,Separation and purification techniques in biotechnology,Noyes Publications,Park Ridge,NJ,USA,p.440-443（1989））。
本発明での使用に適したリガンドにはさらに陰イオン交換基があり、第４アミノエチル（QAE），トリメチルアミノエチル（TMAE），第４アミノメチル（Q）のように強いものが好ましく，第４アミノメチル（Q）はさらに好ましい。リガンドはさらに基質に強く結合しうる、またアルキルアミン、ヘキシルアミン、ジアミノジプロピルアミン、エチルアミノスクシンアミド（Persson & Lagerstrom,in Packings and stationary phases in chromatographic techniques,Unger,K.K.,ed.,Marcel Dekker Inc.1990,p.754）のようなスペーサーを介して，さらにまたリガンドが結合する分枝した触手（tentacle）（Merck of Gemany製造のFractogel TMEMD Merck of Germanyが好例である）を介して強く結合しうる。
当該カップリング手順の後、ポリペプチドのコンジュゲートは通常の技術で溶出される。この際、ポリペプチドのコンジュゲートの分解を避けるために、物理化学的条件を考慮することが必須である。カップリング経路がある範囲内のpHで不安定なコンジュゲーション結合に関わるならば、これを避けなければならない。
カップリング手順の中で、ポリペプチドが吸着剤上に固定化されているとき、ポリペプチドを可溶性ブロッキング試薬と接触させることにより、ポリペプチドの別の部位がコンジュゲートされるのを防止できる。そのようなブロッキング試薬は有機化学合成により合成すべきで、さらに、ポリマーに結合した上記定義のリガンドのいずれとも結合するべきである。このボリマーは例えば、モノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンオキシドの共重合体またはブロック共重合体、ポリエチレングリコールホモポリマーまたはポリプロピレングリコールホモポリマーから選ばれる。ブロッキング試薬はそれ自体がポリペプチドに対する特異的親和性を有することがある。
溶出後、可溶性ブロック試薬は適切な化学的条件下で脱着される。例えば、ブロッキング試薬が疎水結合で吸着しているならば、イオン強度を下げるか又は単純に温度を下げることにより脱着できる。可溶性ブロッキング試薬はその後、通常の条件でゲル浸透クロマトグラフィーによりコンジュゲートから分離される。
本発明に用いる吸着剤の基質（matrix）として、生物学的分子と適合することが知られている市販のレジンが使用できる。基質としていろいろな強親水性基質を選択しうる。強親水性基質には例えばPharmacia Biotech of Uppsala,Swedenにより市販されている多様なSepharoseTMのようなアガロース基質、Tosoh Corp.of Tokyo,Japanにより市販されているTSK-GELのような有機ポリマー基質、PerSeptive Biosystems of Boston,USAにより市販されている高度に多孔性の有機ポリマー基質がある。また、膜基質も適している。例えば、Sartorius of Germanyにより市販されているSartobindTM、Millipore of USAにより市販されているMemSepTMがある。アガロース基質が基質として好ましい。本発明に適したアガロース基質は、SepharoseTMに加え、Kem-EnTec A/S of Copenhagen,Denmarkにより売られているMinileakTM、Bio-Rad,of Brussels,Belgiumにより売られているBio-Gel Aがある。基質は早い速度（FF）とそれがもたらす高い生産力を持つ架橋されたものが好ましい。本発明のクロマトグラフィーはQ SepharoseTM FF gelにより行われることがさらに好ましい。さらに、オリゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレート、FractogelTM（Merck of Germanyが市販）のようなペンタエリトロールジメタクリレート、セルロースおよび多孔性ガラスも有益である。
本発明方法で得られるポリペプチドと生体適合性ポリマーのコンジュゲートは新規である。本方法により、コンジュゲーション後のポリペプチド活性は当該コンジュゲーション前の少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも70％を維持できる。
本発明方法で得られるポリペプチドと生体適合性ポリマーのコンジュゲートは医薬として用いることができる。特に、本方法により生産された第VIII因子、フォン・ウィルブランド因子、これらの組合せまたは第IX因子のいずれか１つと生体適合性ポリマーのコンジュゲートは医薬として使用できる。第VIII因子と生体適合性ポリマーのコンジュゲートの医薬としての使用は、コンジュゲーションの程度がモノアルキルでキャッピングされたPEG／第VIII因子の分子比が１〜１５のときに有益で、好ましくは２〜１０で、さらに好ましくは３〜７である。この場合、リコンビナントDNA技術により産生された第VIII因子のコンジュゲートが適しており、凝集活性を有する完全長の第VIII因子のリコンビナント欠失誘導体が好ましく、リコンビナント第VIIISQ（r-VIIISQ）の欠失誘導体はさらに好ましい。
本発明のポリペプチドコンジュゲートは皮下、筋肉内、皮内または静脈内に投与するのが適している。特に第VIII因子のコンジュゲートは血友病Aの治療、特に皮内、筋肉内、皮下または静脈内投与による治療用医薬の製造に用いられる。さらに、vWfコンジュゲートはフォン・ウィルブランド病の治療用、特に皮内、筋肉内、皮下または静脈内投与による治療用医薬に用いられる。本発明に従ってそれぞれコンジュゲートさせた第VIII因子とフォンウィルブランド因子は組み合わせて使うこともできる。また、第IX因子コンジュゲートも血友病Bの治療、特に皮内、筋肉内、皮下または静脈内投与による治療用医薬の製造に用いられる。
本発明は、さらに本方法に従って生産される第VIII因子と生体適合性ポリマーのコンジュゲートの皮内、筋肉内、皮下または静脈内投与による血友病Aの治療法に関する。
実施例
以下の実施例は例示を目的に挙げたに過ぎず、請求の範囲で明示された本発明の範囲をいかなる意味でも限定的に解釈するためのものではない。
実施例１
リコンビナント第VIII因子の調製
リコンビナント第VIIISQ（r-VIIISQ）因子の生産は本質的には特許WO-A-9109122、実施例１〜３に記載されたように行った。DHFR欠損CHO細胞株（DG44N.Y）にr-VIIISQ遺伝子を含む発現ベクターとジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含む発現ベクターをエレクトロポレイションにより導入した。選択培地による選択後生き残ったコロニーを、メトトレキサート量を段階的に増加させた増殖により増幅した。生じたコロニーの上清はコロニー毎に第VIII因子活性を測定してスクリーニングした。産生クローンを選択し、ついで明示の無血清培地で浮遊増殖させ、最後に大量培養により増やした。ある時間経ったところで上清を集め以下に述べるように精製した。
コンディションドメディウムをフィルトレーションにより浄化し、pHを調整し、次いで、ろ液をS SepharoseTM FFカラム（カラム容積は3L）にのせた。洗浄後、第VIII因子を5mMCaCl2と0.02% TritonTM X-100を含む塩バッファーで溶出した。この陽イオン交換クロマトグラフィー過程は2〜8℃で行った。S SepharoseTM FF過程で得られた溶出液（S-溶出液）はさらに精製するまで凍結した。
700mLのS-溶出液を融解させ室温に戻した。リン酸トリ-n-ブチル（TNBP）とTritonTM X-100をそれぞれ最終濃度0.3%（V/V）、1%（V/V）で30分間インキュベーションすることによりウィルスを不活性化した。260mLのモノクローナル抗体（mAb）イムノアフィニティーカラムを、ウィルス不活性化薬品を前述の濃度で含むS-溶出液を用いて平衡化した。次いで、第VIII因子溶液をmAbカラムにのせ、その後洗浄した。溶出は50%のエチレングリコールを含むバッファーで行った。
Q SepharoseTMカラムは高濃度の塩化ナトリウムでプレ平衡化し、次いでイムノアフィニティーカラムの溶出に用いたのと同じ組成のバッファーで平衡化した。mAb溶出液をのせ平衡化バッファーで洗浄し、次いで生理的イオン強度のバッファーで洗浄した。NaCl濃度を0.6Mに上げることによりカラムから溶出した。Q-カラムの洗浄、溶出には界面活性剤は使用しなかった。ブチルSepharoseTM 4FFカラムを50mMヒスチジン、1.4M NH4Ac、50mM CaCl2と0.02% TweenTM 80を含むバッファーpH6.8で平衡化した。NH4Acを最終濃度1.0Mになるように、TweenTM 80を最終濃度0.02%になるようにQ-溶出液に添加した。この溶液を60cm/hの直線流速でブチルゲルカラムにのせた。次いで、カラム容積の５倍量の平衡化バッファーでカラムを洗浄し、次いで、50mMヒスチジン、0.5M NH4Ac、50mM CaCl2と0.02% TweenTM 80を含むpH6.8のバッファーを用いて35cm/hの直線流速で溶出した。この調製品の精製度は非常に高く12,000〜17,000IU/mgタンパク質の比活性を有する。
分析
実施例１〜８で第VIII因子活性は他の方法が述べられていない限り色素アッセイ（Chromogenix AB of Molndal,Sweden）で行った。第VIII因子の量はA280で分光光度学的に，およびアミノ酸分析により決定した。ポリペプチドに結合したmPEGの量はプロトンNMR法（Dreborg,S.andÅkerblom,E.B.,Crit.Rew.Therap.Drug Carr.Sys.6（4）,315-365（1990））により測定した。
実施例２（比較のための実施例）
mPEGコハク酸の混合無水物とコンジュゲーションされる第VIII因子
実施例１に従って調製されたHIC溶出液のバッファー組成は、あらかじめ0.25M hepes,4mM CaCl2,pH7.8の組成のバッファーで平衡化されたSuperose １２カラム（Pharmacia Biotech of Uppsala,Swedenが市販）を用いたゲル浸透クロマトグラフィーにより置換した。r-VIIISQ溶液の一部に35、60または100倍モル過剰（r-VIIIに対して）のmPEGコハク酸の混合無水物（MW 3,000）を添加した。混合液を室温において回転装置上で1.5時間反応させた。過剰のmPEGコハク酸を除去し、不均一なrVIIIコンジュゲートをサイズに従って分離するために、今度はSuperose６カラム（Pharmacia Biotech of Uppsala,Swedenが市販）を用いて、ゲル浸透クロマトグラフィーを行った。各々のカップリング反応でタンパク質ピークの最初の半分と２番目の半分を別々に分析した（表１にプール１とプール２として示した）。表１はr-VIIISQとmPEGコハク酸混合無水物とのコンジュゲーションの結果を示す。
Figure 0003911023
表１から明らかなように、rVIIIの比活性はこのコンジュゲーション程度の低い条件でも劇的に低下した。
実施例３
mPEGコハク酸混合無水物との結合の間のQセファロースFFゲルに吸着した第VIII因子
第VIII因子分子上の負電荷に囲まれた反応性のリシンは、陰イオン交換ゲル上に第VIII因子が吸着しているのでmPEGとのコンジュゲーションから保護された。50mM L-ヒスチジン，0.15M NaCl,4mMCaCl2,pH6.5の組成のバッファーで平衡化されたQ SepharoseTM FF（Pharmacia Biotech of Uppsala,Swedenが市販）を詰めたカラムを第VIII因子の吸着に用いた。実施例１に従って調製されたHIC溶出液をカラムにのせた。mPEGカップリングのための適当な条件を得るために、mPEGを添加する前にカラムを0.25M hepes,4mM CaCl2,pH7.8のバッファーで洗浄した。ゲルを反応容器に移し、mPEGコハク酸混合無水物（MW 3,000）を、表２に示した第VIII因子に対するモル過剰に対応する量をスラリーに添加した。反応は回転させながら１．５時間行った。カラムを再度ゲル詰めし、rVIIIコンジュゲートを50mM L-ヒスチジン，0.6M NaCl,4mM CaCl2,pH6.8バッファーで溶出した。ゲルの量当たりのr-VIIISQ添加量を一定にして、４回の調製を行った。総ての過程を室温で行った。表２はQ SepharoseTM FFゲルに吸着したr-VIIISQコンジュゲートの結果を示す。
Figure 0003911023
表２から明らかなように、r-VIIISQコンジュゲートの比活性は実施例２のr-VIIISQコンジュゲートに比較して有意に高く維持されている。
実施例４
mPEGトレシレート（tresylate）とのカップリングの間にQセファロースFFゲルに吸着されたFVIII
この実施例でのr-VIIISQのQセファロースFFゲルとの吸着、カップリング、溶出の総ての過程は実施例３と同様に行った。mPEGトレシレート（MW 5,000）を第VIII因子のコンジュゲートに用いた。表３は発明に従ってQ SepharoseTM FFゲル上に吸着されたr-VIIISQとmPEGトレシレートのコンジュゲートでの結果を示す。
Figure 0003911023
この場合の比活性は、おそらくmPEGの分子量が高いためか、実施例３より若干低い。
実施例５
mPEGコハク酸混合無水物とのカップリングの間に触手（tentacle）陰イオン交換ゲルに吸着された第VIII因子
FractogelTM EMD TMAE650（Merckが販売）を詰めたカラムをr-VIIISQの吸着に用いた。総ての過程は実施例３のように行った。表４は発明に従って触手陰イオン交換ゲル上に吸着されたr-VIIISQとmPEGコハク酸混合無水物のコンジュゲートでの結果を示す。
Figure 0003911023
実施例６
mPEGとコンジュゲートした第VIII因子のトロンビンによる活性化
r-VIIISQコンジュゲートのトロンビンによる活性化は当業者に良く知られたインビトロのアッセイにより行った。実施例３に従って調製した試料で修飾程度がr-VIIISQ当たり4mPEGである試料をアッセイに用いた。r-VIIISQコンジュゲートはヒトトロンビンにより量依存的に活性化された。続いて、不活性化が起こった。図１はr-VIIISQコンジュゲート１ユニット当たり１NIHユニットのトロンビンを添加したときの活性変化のカーブである。Mikaelsson et al.,1983.Blood 62,p1006に従い行う１段階凝固法を反応混液から採取した試料の迅速なアッセイに用いた。１分以内で30倍の活性が得られ、次いで不活性化した。トロンビンで得られた活性化−不活性化パターンは第VIII因子とトロンビンとの相互作用の研究の報告と適合する（Fulcher et al.,1983,Blood,61,p.807,Andersson et al.,1986,Proc,Natl.Acad.Sci.,83,p.2979,Eaton et al.,1986,Biochemistry,25,p.505,Rotblat et al.,1985,Biochemistry,24,p.4294）。
実施例７
ブタ組織抽出液中でのmペジル化（mPEGlation）第VIII因子の安定性試験
皮下環境を表した溶液中で第VIII因子の安定性に対するmPEGコンジュゲーションの影響を評価するために、ブタ組織抽出液を用いたインビトロ試験を行った。mPEGと第VIII因子のコンジュゲートを実施例３に記載したように２つ調製し、抽出液中でインキュベートし、一部分について０、２、４、６及び２４時間で色素アッセイを用いて凝集活性を調べた。最初の６時間はコンジュゲーション程度は残存活性と相関した。
Figure 0003911023
表５と図２はmPEGコンジュゲーションが有意に第VIII因子の安定性を高めることを示している。
実施例８
カニクイサル（cynomolgus monkey）中でのmPEG化第VIII因子の生物学的利用能試験
インビボでの第VIII因子の安定性に対するmPEGコンジュゲーションの影響を評価するために、薬物動態学試験を行った。第VIII因子とmPEGのコンジュケート調製試料を２つ、実施例３のように生産し、それらの比活性を表６に示すように決定した。カップリング手順で均一性の高い修飾物質を得るために、調製品の分画をゲル浸透クロマトグラフィーを用いて２回行った。19mM L-ヒスチジン、0.31MNaCl,3.4mMNaCl2,0.02% Tween80,pH7.0で平衡化したSuperdex200PGXK16/60カラム（Phamacia Biotech of Uppsala,Swedenが市販）を用いた。２回目のゲル浸透クロマトグラフィーの前に第VIII因子溶液は加圧滅菌したCentriplus30コンセントレイター；遠心限外濾過器（カットオフ30キロダルトン、Amicon Inc.MA,USAが市販）で濃縮した。濃縮は2,500gで45分間３回行った。２回目のゲル浸透クロマトグラフィー後に得られたプール分画は次いで最終製剤と同じバッファー、すなわち、19mM L-ヒスチジン、0.31MNaCl,3.4mMCa Cl2,0.02%Tween80,17.5mMスクロース，pH7.0で希釈した。タンパク質溶液は最後には0.22μm Millex GVフィルター（Millipore,MA,USAが市販）で濾過し、加圧滅菌した瓶に詰めた。溶液は使用時まで-70℃で保存した。
６匹の雌カニクイサルに対して別々の時期に１キログラム当たり250IUの調製試料１を静脈内投与し、また１キログラム当たり1,500IUの調製試料１および調製試料２を皮下投与した。溶液は総て投与前に注射のために水で倍に希釈した。皮下投与の注射部位は動物の左または右背部、静脈内投与の注射部位は左または右橈側皮静脈（cephalic vein）であった。血液サンプルは総ての動物から大腿静脈（femoral vein）の穿刺を通して抗凝固剤としてクエン酸ナトリウム（総容積の10％）の入ったチューブに集めた。サンプルは注射後以下に挙げる時間に集めた。
静脈内投与：０（投与前）,0.25,1,2,4,8,24,30,48時間
皮下投与：０（投与前）,3,6,9,12,15,24,30,48時間
コンジュゲーションしていない第VIII因子の薬物動態学試験も同じ種を用いて別々に行った。投与量、投与方法と結果（平均（±標準偏差（SD））を表６に示す。
Figure 0003911023
ここでAUCは血しょう中濃度−時間曲線の下の面積を示す。
表６から明らかなように、どちらの第VIII因子とmPEGのコンジュゲートの調製品も皮下投与した場合、コンジュゲーションしていないr-VIIISQの皮下投与に比べ顕著に高い生物学的利用能を示した。Student's ｔ検定による統計学的分析によりその差は有意であることがわかった。

Claims (9)

  1. リコンビナント第ＶＩＩＩＳＱ因子ポリペプチドの露出された標的を保護する方法であって
    ａ）陰イオン交換リガンドを有するグループ特異的吸着剤との相互作用によりリコンビナント第ＶＩＩＩＳＱ因子を固定化し、
    ｂ）生体適合性ポリマーを活性化させ、
    ｃ）活性化した生体適合性ポリマーを固定化リコンビナント第ＶＩＩＩＳＱ因子の外側の部位とコンジュゲーションさせ、その後
    ｄ）吸着剤からコンジュゲートを溶出させる
    ことを特徴とする前記方法。
  2. 第ＶＩＩＩＳＱ因子の比活性が、固定化前は少なくとも総タンパク質１ｍｇ当たり２，０００ＩＵである請求項１に記載の方法。
  3. 第ＶＩＩＩＳＱ因子の比活性が固定化前は総タンパク質１ｍｇ当たり５，０００から２０，０００ＩＵの範囲にある請求項２に記載の方法。
  4. 第ＶＩＩＩＳＱ因子の活性が固定化前は少なくとも２，０００ＩＵ／ｍｌである請求項１から３のいずれか１に記載の方法。
  5. 第ＶＩＩＩＳＱ因子の活性が固定化前は５，０００から５０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲にある請求項４に記載の方法。
  6. 生体適合性ポリマーがモノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキシドのホモポリマー、共重合体又はブロック共重合体からなる群より選ばれたものである請求項１から５のいずれか１に記載の方法。
  7. モノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコール・ホモポリマーとポリプロピレングリコール・ホモポリマーからなる群より選ばれたものである請求項６に記載の方法。
  8. モノアルキルでキャッピングされたポリアルキレンオキシドがモノメトキシ・ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である請求項７に記載の方法。
  9. 陰イオン交換リガンドが第４アミノメチル、第４アミノエチル及びトリメチルアミノエチルまたはそれらの混合物からなる群より選ばれたものである請求項１から８のいずれか１に記載の方法。
JP51336397A 1995-09-29 1996-09-27 ポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲート Expired - Lifetime JP3911023B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9503380-9 1995-09-29
SE9503380A SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Protein derivatives
PCT/SE1996/001215 WO1997011957A1 (en) 1995-09-29 1996-09-27 Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JPH11513378A JPH11513378A (ja) 1999-11-16
JPH11513378A5 JPH11513378A5 (ja) 2004-09-02
JP3911023B2 true JP3911023B2 (ja) 2007-05-09

Family

ID=20399642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51336397A Expired - Lifetime JP3911023B2 (ja) 1995-09-29 1996-09-27 ポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲート

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6048720A (ja)
EP (3) EP1260582B1 (ja)
JP (1) JP3911023B2 (ja)
AT (3) ATE283351T1 (ja)
AU (1) AU706246B2 (ja)
BR (1) BR9610695A (ja)
CA (1) CA2231801C (ja)
DE (3) DE69633952T2 (ja)
DK (3) DK1260582T3 (ja)
ES (3) ES2238522T3 (ja)
HU (1) HU221208B1 (ja)
NO (2) NO321096B1 (ja)
NZ (1) NZ319322A (ja)
PL (1) PL185821B1 (ja)
PT (3) PT871649E (ja)
SE (1) SE9503380D0 (ja)
WO (1) WO1997011957A1 (ja)
ZA (1) ZA968139B (ja)

Families Citing this family (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT405740B (de) * 1996-12-13 1999-11-25 Immuno Ag Von willebrand-faktor-derivat sowie ein verfahren zur isolierung von proteinen
TR200101751T2 (tr) * 1998-04-28 2002-05-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Poliol-IFN-beta konjugatları
US7425541B2 (en) * 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
CA2634663C (en) 1999-02-22 2009-08-25 University Of Connecticut Novel albumin-free factor viii formulations
US6635676B2 (en) * 1999-04-28 2003-10-21 Regents Of The University Of Michigan Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use
US7655252B2 (en) 1999-04-28 2010-02-02 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial nanoemulsion compositions and methods
IT1318484B1 (it) * 2000-04-21 2003-08-25 Univ Roma Derivati di colina per il trattamento della malattia di alzheimer.
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
US6423826B1 (en) * 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US7160540B2 (en) 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
AU2001279301A1 (en) * 2000-07-07 2002-01-21 Leonid Z. Iakoubov Biologically active protein conjugates formed by first protecting active site
AU2002225681A1 (en) * 2000-11-15 2002-05-27 Globe Immune, Inc. Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof
JP2010209109A (ja) * 2001-06-25 2010-09-24 Regents Of The Univ Of Michigan 抗微生物ナノエマルジョンの組成物および方法
ATE468862T1 (de) * 2001-07-11 2010-06-15 Maxygen Inc G-csf konjugate
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US8008252B2 (en) * 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
EP2042196B1 (en) * 2001-10-10 2016-07-13 ratiopharm GmbH Remodelling and glycoconjugation of Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
SE0104186D0 (sv) * 2001-12-12 2001-12-12 Darcy Birse Method and device
DK3025726T3 (da) * 2002-01-18 2019-12-09 Biogen Ma Inc Polyalkylenpolymerforbindelser og anvendelser deraf
US20030149246A1 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Russell John C. Macromolecular conjugates and processes for preparing the same
JP2005526505A (ja) * 2002-03-02 2005-09-08 エフ．ホフマン−ラ　ロシュ　アーゲー ヒトゲラチナーゼａのｃドメイン及びポリエチレングリコールの接合体、その精製方法及び使用
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
ES2544527T3 (es) 2002-07-31 2015-09-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de fármacos y su uso para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
WO2004075923A2 (en) * 2003-02-26 2004-09-10 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor viii moiety conjugates
US7217794B2 (en) * 2003-04-02 2007-05-15 Daiamed, Inc. Compounds and methods for treatment of thrombosis
NZ542586A (en) 2003-04-09 2009-11-27 Biogenerix Ag Method of forming a covalent conjugate between a G-CSF peptide and PEG
WO2006127896A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP1626983B8 (en) * 2003-05-12 2010-12-22 Affymax, Inc. Novel poly (ethylene glycol) modified erythropoietin agonists and uses thereof
US7947261B2 (en) 2003-05-23 2011-05-24 Nektar Therapeutics Conjugates formed from polymer derivatives having particular atom arrangements
ES2725808T3 (es) * 2003-05-23 2019-09-27 Nektar Therapeutics Derivados de PEG que contienen dos cadenas de PEG
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
EP3434275A1 (en) 2003-11-06 2019-01-30 Seattle Genetics, Inc. Assay for cancer cells based on the use of auristatin conjugates with antibodies
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
AU2004296860B2 (en) * 2003-12-03 2010-04-22 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US20050171002A1 (en) * 2004-02-03 2005-08-04 Mohanty Dillip K. Polyoxyalkylene compound and method for making
US7425539B2 (en) 2004-03-19 2008-09-16 Baxter International Inc. Factor IXa for the treatment of bleeding disorders
ZA200609930B (en) * 2004-06-08 2009-01-28 Alza Corp Macromolecular peg conjucates by four-component condensation
CA2571292C (en) 2004-06-30 2013-05-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor ix moiety conjugates
AU2014280936B2 (en) * 2004-06-30 2016-12-15 Nektar Therapeutics Polymer-factor ix moiety conjugates
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
WO2006039326A2 (en) * 2004-09-29 2006-04-13 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Inhibitors of hepatitits c virus
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
AU2012203813B2 (en) * 2004-11-12 2013-10-24 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
AU2016203693B2 (en) * 2004-11-12 2018-08-23 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
KR101468345B1 (ko) 2004-11-12 2014-12-03 바이엘 헬스케어 엘엘씨 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
AU2013203348B2 (en) * 2004-11-12 2016-03-03 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
JP2008519863A (ja) * 2004-11-12 2008-06-12 シアトル ジェネティクス インコーポレイティッド Ｎ末端にアミノ安息香酸単位を有するオーリスタチン
BRPI0519562A2 (pt) * 2004-12-27 2009-01-27 Baxter Int construÇço proteinÁcea, complexo, mÉtodo para prolongar a meia-vida in vivo de fator viii (fviii) ou um derivado biologicamente ativo do mesmo composiÇço farmacÊutica, e, mÉtodo para formar uma construÇço proteinÁcea
US9029331B2 (en) 2005-01-10 2015-05-12 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006076471A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
WO2007008848A2 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
JP5171621B2 (ja) 2005-07-07 2013-03-27 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド フェニルアラニン側鎖修飾をｃ末端に有するモノメチルバリン化合物
US7395967B2 (en) * 2005-07-21 2008-07-08 University Of Washington Methods and systems for counterbalancing a scanning beam device
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
KR20080108147A (ko) 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US20080242607A1 (en) 2006-07-21 2008-10-02 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
BRPI0717505B8 (pt) * 2006-10-04 2021-05-25 Novo Nordisk As conjugado de peptídeo e formulação farmacêutica
AU2007333049B2 (en) 2006-12-15 2014-02-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Factor VIIa-(poly)sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
CA2673459C (en) 2006-12-22 2016-09-13 Stefan Schulte Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
MX2009007145A (es) 2006-12-27 2009-08-27 Nektar Therapeutics Al Corp Conjugados de polimero con factor viii y factor de von willebrand que tienen una ligadura liberable.
NZ577397A (en) * 2006-12-27 2012-01-12 Nektar Therapeutics Factor ix moiety-polymer conjugates having a releasable linkage
CN101796063B (zh) 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
JP5401446B2 (ja) * 2007-04-26 2014-01-29 バイエル ヘルスケア エルエルシー 凍結貯蔵を目的とした、組み換えタンパク質溶液の安定化
US8747872B2 (en) 2007-05-02 2014-06-10 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
US9493499B2 (en) 2007-06-12 2016-11-15 Novo Nordisk A/S Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography
AU2008261261B2 (en) * 2007-06-13 2013-06-27 Csl Behring Gmbh Use of VWF stabilized FVIII preparations and of VWF preparations without FVIII for extravascular administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders
ES2528922T3 (es) 2007-07-16 2015-02-13 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-CD79b humanizados e inmunoconjugados y métodos de uso
ATE543835T1 (de) 2007-07-16 2012-02-15 Genentech Inc Anti-cd79b-antikörper und immunkonjugate und anwendungsverfahren
US20090035848A1 (en) * 2007-08-03 2009-02-05 Robert Hickey Moving bed biofilm reactor (mbbr) system for conversion of syngas components to liquid products
AU2008323768A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Baxter Healthcare S.A. Modified recombinant Factor VIII and von Willebrand Factor and methods of use
PT2247620T (pt) 2008-01-31 2016-08-23 Genentech Inc Anticorpos e imunoconjugados anti-cd79b e métodos de utilização
DK2257311T3 (da) 2008-02-27 2014-06-30 Novo Nordisk As Konjugerede Faktor VIII-Molekyler
AU2009256093A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Bayer Healthcare Llc FVIII muteins for treatment of von Willebrand disease
DK2865760T3 (en) 2008-06-24 2018-01-15 Csl Behring Gmbh Factor VIII, Von Willebrand Factor or complexes thereof with extended in vivo half-life
AU2009303368B2 (en) * 2008-10-15 2012-04-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Pegylation of recombinant blood coagulation factors in the presence of bound antibodies
KR20110093775A (ko) * 2008-11-03 2011-08-18 바이엘 헬스케어 엘엘씨 혈우병 치료 방법
EP2385825B1 (en) 2008-11-07 2018-10-10 University of Connecticut Factor viii formulations
EP2376089B1 (en) 2008-11-17 2018-03-14 The Regents of the University of Michigan Cancer vaccine compositions and methods of using the same
CN108530543B (zh) 2009-02-03 2023-06-23 阿穆尼克斯制药公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
WO2011012850A2 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8637640B2 (en) * 2009-07-27 2014-01-28 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
RU2744370C2 (ru) 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
CN102741275B (zh) 2009-08-24 2016-08-03 阿穆尼克斯运营公司 凝血因子ix组合物及其制备和使用方法
WO2011069164A2 (en) 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
EP4450523A3 (en) 2010-04-02 2025-03-12 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
HRP20191305T1 (hr) 2010-07-09 2019-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Preradive jednolančane molekule i polipeptidi izrađeni koristeći iste
EP3508573A1 (en) 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
EP2651433A1 (en) * 2010-12-16 2013-10-23 Novo Nordisk A/S Aqueous factor viii solution
PL2654794T3 (pl) 2010-12-22 2020-07-27 Baxalta GmbH Materiały i sposoby sprzęgania rozpuszczalnej w wodzie pochodnej kwasu tłuszczowego z białkiem
CA2838833A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
AU2012282875B2 (en) 2011-07-08 2016-04-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
WO2013016454A1 (en) 2011-07-25 2013-01-31 Biogen Idec Hemophilia Inc. Assays to monitor bleeding disorders
EP2804623B1 (en) 2012-01-12 2019-08-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof
SMT201800586T1 (it) 2012-01-12 2019-01-11 Bioverativ Therapeutics Inc Riduzione dell'immunogenicita' contro il fattore viii negli individui che si sottopongono alla terapia con fattore viii
EP2822577B1 (en) 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
LT3564260T (lt) 2012-02-15 2023-01-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Viii faktoriaus kompozicijos ir jų gamybos bei panaudojimo būdai
WO2013120939A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Csl Behring Gmbh Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
CA2865578C (en) 2012-02-27 2023-01-17 Amunix Operating Inc. Xten conjugate compositions and methods of making same
GB201910190D0 (en) * 2012-04-16 2019-08-28 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Optimised subsutaneous therapeutic agents
WO2013083858A1 (en) 2012-04-24 2013-06-13 Novo Nordisk A/S Compounds suitable for treatment of haemophilia
AU2013270682A1 (en) 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Procoagulant compounds
EP2863940A4 (en) 2012-06-08 2016-08-10 Biogen Ma Inc Chimeric clotting factors
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
CN110054699A (zh) 2012-07-11 2019-07-26 比奥贝拉蒂治疗公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
US10001495B2 (en) 2012-07-25 2018-06-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
US10391152B2 (en) 2012-10-18 2019-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP3446700A1 (en) 2012-10-30 2019-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
AU2012395148B2 (en) 2012-11-24 2016-10-27 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
FI3889173T3 (fi) 2013-02-15 2023-10-02 Bioverativ Therapeutics Inc Optimoitu tekijä viii:n geeni
TWI828269B (zh) 2013-03-15 2024-01-01 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ix多肽調配物
ES2926798T3 (es) 2013-03-15 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc Formulaciones de polipéptido de factor VIII
ES2657291T3 (es) 2013-04-22 2018-03-02 Csl Ltd. Un complejo covalente de factor de von Willebrand y factor VIII asociado por un puente disulfuro
MX2015016567A (es) 2013-06-28 2016-03-31 Biogen Ma Inc Enlazador escindible por trombina con xten y usos del mismo.
WO2015021423A2 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Purification of chimeric fviii molecules
TWI667255B (zh) 2013-08-14 2019-08-01 美商生物化學醫療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
WO2015070014A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant fusion compound
EP3082848B1 (en) 2013-12-06 2023-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
SG11201605242YA (en) 2014-01-10 2016-07-28 Biogen Ma Inc Factor viii chimeric proteins and uses thereof
EP3102589A1 (en) 2014-02-04 2016-12-14 Biogen MA Inc. Use of cation-exchange chromatography in the flow-through mode to enrich post-translational modifications
FI3122757T3 (fi) 2014-02-28 2023-10-10 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Varautuneita linkkereitä ja niiden konjugointikäyttötapoja
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
BR112016030950A2 (pt) 2014-07-02 2018-03-27 Csl Ltd polipeptídeo modificado que se liga ao fator viii, complexo, composição farmacêutica, métodos para tratar uma coagulopatia, para produzir um polipeptídeo que compreende um vwf modificado e para aumentar a afinidade de ligação ao fator viii do vwf e a meia-vida do fator viii, uso de um polipeptídeo modificado ou de um complexo, polinucleotídeo, plasmídeo ou vetor, e, célula hospedeira.
DK3262071T3 (da) 2014-09-23 2020-06-15 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til anvendelse af anti-CD79b-immunkonjugater
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
CA2978374A1 (en) 2015-03-06 2016-09-15 Csl Behring Recombinant Facility Ag Modified von willebrand factor having improved half-life
SG10201910896UA (en) 2015-05-22 2020-01-30 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
US10772936B2 (en) 2015-05-22 2020-09-15 CSL Behring Lengnau AG Methods for preparing modified von Willebrand factor
CA2989269C (en) 2015-06-15 2020-09-22 Robert Yongxin Zhao Hydrophilic linkers for conjugation of a cytotoxic agent or chromophore molecule to a cell-binding molecule
EP3319936B1 (en) 2015-07-12 2025-12-17 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Bridge linkers for conjugation of cell-binding molecules
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
IL257231B (en) 2015-08-03 2022-09-01 Bioverativ Therapeutics Inc Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
TWI823830B (zh) 2015-11-13 2023-12-01 日商武田藥品工業股份有限公司 用於ａ型血友病基因治療之編碼表現增加之重組ｆｖｉｉｉ變異體之病毒載體
CN116479001A (zh) 2015-11-13 2023-07-25 武田药品工业株式会社 用于血友病a的基因治疗的具有增加的表达的编码重组fviii变体的病毒载体
AU2017205776B2 (en) 2016-01-07 2020-09-10 CSL Behring Lengnau AG Mutated von Willebrand factor
MX2018008337A (es) 2016-01-07 2018-09-17 CSL Behring Lengnau AG Factor de von willebrand truncado mutado.
KR20180118659A (ko) 2016-02-01 2018-10-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 최적화된 viii 인자 유전자
JP6877469B2 (ja) 2016-06-24 2021-05-26 モガム・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチＭｏｇａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｖｉｉｉおよびｖｗｆ因子を含むキメラタンパク質、ならびにそれらの使用
TW201828974A (zh) 2016-11-11 2018-08-16 瑞士商Ｃｓｌ貝林重組技能公司 用於血管外施予以治療或預防凝血疾病之截短型類血友病因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）多肽類
KR20190085021A (ko) 2016-11-11 2019-07-17 체에스엘 베링 렝나우 아게 혈우병을 치료하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드
AU2016429272A1 (en) 2016-11-14 2019-05-02 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Conjugation linkers, cell binding molecule-drug conjugates containing the likers, methods of making and uses such conjugates with the linkers
JP2019536794A (ja) 2016-12-02 2019-12-19 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
BR112020002394A2 (pt) 2017-08-09 2020-07-28 Bioverativ Therapeutics Inc. moléculas de ácidos nucleicos e usos das mesmas
AU2019215063B2 (en) 2018-02-01 2025-10-16 Bioverativ Therapeutics, Inc. Use of lentiviral vectors expressing Factor VIII
WO2019195055A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Sigilon Therapeutics, Inc. Implantable particles and related methods
SI3793588T1 (sl) 2018-05-18 2025-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Postopki zdravljenja hemofilije A
KR20210034013A (ko) 2018-07-16 2021-03-29 박스알타 인코퍼레이티드 발현이 증가된 재조합 fviii 변이체들을 인코딩하는 바이러스 벡터를 이용한 혈우병의 유전적 치료법
KR102925832B1 (ko) 2018-08-09 2026-02-11 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 핵산 분자 및 비바이러스 유전자 치료를 위한 이의 용도
UY38389A (es) 2018-09-27 2020-04-30 Sigilon Therapeutics Inc Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados
TWI851647B (zh) 2019-01-16 2024-08-11 日商武田藥品工業股份有限公司 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體
BR112021025426A2 (pt) 2019-06-19 2022-06-21 Bioverativ Therapeutics Inc Fator recombinante viii-fc para tratamento de hemofilia e baixa densidade mineral óssea
US12403164B2 (en) 2019-09-30 2025-09-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
CN114981299A (zh) 2019-12-12 2022-08-30 武田药品工业株式会社 使用编码具有增加的表达的重组fviii变体的病毒载体的a型血友病的基因疗法
KR20230074703A (ko) 2020-06-24 2023-05-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 유리 인자 viii을 상기 단백질이 발현되도록 변형된 렌티바이러스 벡터의 제제로부터 제거하는 방법
US20240269241A1 (en) 2021-06-14 2024-08-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
IL310997A (en) 2021-08-23 2024-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc Factor VIII gene optimization
EP4408874A1 (en) 2021-09-30 2024-08-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acids encoding factor viii polypeptides with reduced immunogenicity
CN117980327A (zh) 2021-11-03 2024-05-03 杭州多禧生物科技有限公司 抗体的特异性偶联
CN120035657A (zh) 2022-10-11 2025-05-23 西吉隆医疗股份有限公司 用于治疗疾病的经工程化的细胞和可植入元件
TW202517669A (zh) 2023-07-05 2025-05-01 日商武田藥品工業股份有限公司 用於Ａ型血友病之基因療法的編碼表現增加之重組ＦＶｌｌｌ變異體的病毒載體

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59172425A (ja) * 1983-03-18 1984-09-29 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤
US4970300A (en) * 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
SE8501050D0 (sv) * 1985-03-05 1985-03-05 Kabivitrum Ab Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof
DE3717210C2 (de) * 1987-05-22 1993-11-25 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
SE465222C5 (sv) * 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
WO1992016555A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5169627A (en) * 1991-10-28 1992-12-08 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Oral pharmaceutical composition containing a polyethylene glycol-immunoglobulin G conjugate for reconstitution of secretory immunity and method of reconstituting secretory immunity
GB9225448D0 (en) * 1992-12-04 1993-01-27 Erba Carlo Spa Improved synthesis of polymer bioactive conjugates
WO1994015625A1 (en) * 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
PT871649E (pt) 2003-04-30
BR9610695A (pt) 1999-07-06
ATE228531T1 (de) 2002-12-15
ES2236396T3 (es) 2005-07-16
DE69634373D1 (de) 2005-03-24
DE69625085D1 (de) 2003-01-09
DE69633952T2 (de) 2006-03-02
EP1258497A2 (en) 2002-11-20
ES2238522T3 (es) 2005-09-01
EP1260582B1 (en) 2004-11-24
JPH11513378A (ja) 1999-11-16
EP1258497A3 (en) 2002-11-27
CA2231801A1 (en) 1997-04-03
NO981408L (no) 1998-03-27
NO981408D0 (no) 1998-03-27
HUP9901203A2 (hu) 1999-07-28
NO20051950L (no) 1998-03-27
ZA968139B (en) 1997-05-29
AU706246B2 (en) 1999-06-10
PT1258497E (pt) 2005-06-30
WO1997011957A1 (en) 1997-04-03
ES2187676T3 (es) 2003-06-16
PL185821B1 (pl) 2003-08-29
PL325958A1 (en) 1998-08-17
NO321096B1 (no) 2006-03-13
HUP9901203A3 (en) 2000-02-28
EP0871649B1 (en) 2002-11-27
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29
HU221208B1 (en) 2002-08-28
DE69633952D1 (de) 2004-12-30
DE69634373T2 (de) 2005-12-29
DK0871649T3 (da) 2003-03-24
CA2231801C (en) 2010-07-27
ATE289321T1 (de) 2005-03-15
EP1258497B1 (en) 2005-02-16
AU7151796A (en) 1997-04-17
DE69625085T2 (de) 2003-07-17
ATE283351T1 (de) 2004-12-15
PT1260582E (pt) 2005-03-31
DK1260582T3 (da) 2005-03-29
DK1258497T3 (da) 2005-06-06
EP1260582A1 (en) 2002-11-27
US6048720A (en) 2000-04-11
EP0871649A1 (en) 1998-10-21
NZ319322A (en) 1998-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6048720A (en) Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer
CN103102406B (zh) Fviii的位点定向修饰
JP3495365B2 (ja) ブタ第ｖｉｉｉ因子ａ２ドメインをコードするｄｎａ
US20120121613A1 (en) Protein conjugate having an endopeptidase- cleavable bioprotective moiety
JPH06172201A (ja) 生物学的活性タンパク質性組成物
CN103497247A (zh) 缀合的因子viii分子
CA1308377C (en) Complex of polyethyleneglycol and tissue plasminogen activator
MXPA98002416A (es) Conjugados de un polipeptido y un polimero biocompatible
AU2016203693B2 (en) Site-directed modification of FVIII
HK1226754A1 (en) Site-directed modification of fviii
HK1184170A (en) Site-directed modification of fviii
HK1184170B (en) Site-directed modification of fviii
HK1117875B (en) Site-directed modification of fviii

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20060822

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20061121

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20070116

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20070126

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100202

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110202

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120202

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130202

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130202

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140202

Year of fee payment: 7

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term