PL185821B1 - Sposób udoskonalania funkcji in-vivo zrekombinowanSposób udoskonalania funkcji in-vivo zrekombinowanego czynnika VIII SQego czynnika VIII SQ - Google Patents

Sposób udoskonalania funkcji in-vivo zrekombinowanSposób udoskonalania funkcji in-vivo zrekombinowanego czynnika VIII SQego czynnika VIII SQ

Info

Publication number
PL185821B1
PL185821B1 PL96325958A PL32595896A PL185821B1 PL 185821 B1 PL185821 B1 PL 185821B1 PL 96325958 A PL96325958 A PL 96325958A PL 32595896 A PL32595896 A PL 32595896A PL 185821 B1 PL185821 B1 PL 185821B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
factor viii
mpeg
viii
activity
biocompatible polymer
Prior art date
Application number
PL96325958A
Other languages
English (en)
Other versions
PL325958A1 (en
Inventor
JohannaDalborg Johanna Dalborg
HelenaSandberg Helena Sandberg
Anna-LisaSmeds Anna-Lisa Smeds
EvaAkerblom Eva Akerblom
Original Assignee
Biovitrum Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20399642&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL185821(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biovitrum Ab filed Critical Biovitrum Ab
Publication of PL325958A1 publication Critical patent/PL325958A1/xx
Publication of PL185821B1 publication Critical patent/PL185821B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/647—Blood coagulation factors not provided for in a preceding group or according to more than one of the proceeding groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/813—Carrier is a saccharide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
  • Polyamides (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Sposób udoskonalania funkcji in vivo zrekombinowanego czynnika VIII SQ po- przez oslanianie wyeksponowanych miejsc wyzej wymienionego polipeptydu, znamienny tym, ze a) unieruchamia sie zrekombinowany czynnik VIII SQ przez interakcje ze swoistym wobec grupy niosacej anionowo-wymienne Ugandy adsorbentem; b) aktywuje sie biokompatybilny polimer; c) koniuguje sie aktywowany biokompatybilny polimer z zewnetrznymi miejscami unieruchomionego zrekombinowanego czynnika VIII SQ, a nastepnie d) eluuje koniugat z adsorbenta. PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób udoskonalania funkcji in vivo zrekombinowanego czynnika VIII SQ poprzez osłanianie wyeksponowanych miejsc tego polipeptydu, poprzez jego unieruchamianie przez interakcję z adsorbentem swoistym wobec grupy niosącej anionowo-wymienne ligandy, aktywację biokompatybilnego polimeru, skoniugowanie w ten sposób aktywowanego biokompatybilnego polimeru z zewnętrznymi miejscami unieruchomionego zrekombinowanego czynnika VIII SQ, a następnie elucję koniugatu z adsorbentu. Sposobem tym można otrzymać koniugaty polipeptydu i biokompatybilnego polimeru, które można zastosować jako leki.
Dobrze znany jest fakt, że stabilność in vitro oraz okres półtrwania in vivo polipeptydu mogą być zwiększone poprzez kowalencyjne przyłączenie biokompatybilnego polimeru (w dalszej części opisu określane jako koniugacja lub modyfikacja). Zaletą modyfikacji powierzchni polipeptydu jest również zmniejszenie immunogenności wykazywanej przez polipeptyd.
Polietylenoglikolowanie (pegylation), tj. sprzęganie różnych glikoli polietylenowych (PEG) z polipeptydami, jest sposobem szeroko stosowanym w zwiększaniu stabilności in vitro i okresu półtrwania in vivo np. białek. Na przestrzeni lat zaproponowano wiele sposobów polietylenoglikolowania. Odnosimy się tutaj do publikacji Zalipsky, S. et al w Poly-(Ethylene
185 821
Glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, New York (1992) oraz Katre N. V., Adv. Drug Deliv. Rev., 10, 91-114 (1993).
Dla niektórych polipeptydów zaobserwowano zjawisko utraty aktywności lub fUnkcji w wyniku takiej koniugacji, które nasila się wraz ze wzrostem stopnia modyfikacji (Inada, Y. et al, Trends in Biotechnology, 13, 86-91 (1995)). Opracowano więc sposoby bardziej selektywnego sprzęgania, aby rozwiązać ten problem. Przykładowo zastosowano ukierunkowaną mutagenezę dla zrekombinowanej interleukiny-2 (rIL-2). Specyficzne miejsce może być utworzone poprzez insercję cysteiny (Goodson, R. J. i Katre, N. V., Bio/Technology 8, 344-346 (1990); Katre 1993, patrz wyżej). Taka droga nie może być powszechnie stosowana w przypadku białek terapeutycznych, ponieważ podstawienie aminokwasu może zmienić pierwotne właściwości cząsteczki i dlatego jest kontrowersyjna. Alternatywnie, polimer może być skierowany do glikozylowanych miejsc białka, np. czynnika IX jak ujawniono w WO 94/29370 (Enzon). Jednak wiąże się to z utlenianiem grup funkcyjnych węglowodanów, które można przeprowadzić w reakcji glikoproteiny z nadjodanem sodu lub enzymatycznie przy użyciu oksydazy galaktozowej. Warunki te są często szkodliwe dla cząsteczki. W tym szczególnym przypadku glikozylowane miejsca przeznaczone do koniugacji są umiejscowione na sekwencji peptydowej czynnika IX, która jest usunięta podczas proteolitycznej aktywacji in vivo. Dlatego też biokompatybilny polimer nie wpływa na funkcje aktywnego polipeptydu.
W WO 94/13322 (Faimitalia Carlo Elba) ujawniono, że polietylenoglikolowanie może być przeprowadzone bez osłabienia funkcji pewnych miejsc istotnych w działaniu określonego białka, („substancja pierwsza”). Jest to osiągnięte przez ochronę miejsc poprzez zetknięcie pierwszej substancji z drugą substancją, która wiąże się specyficznie z wyżej wymienionymi miejscami. Bardziej szczegółowo, polietylenoglikolowanie jest przeprowadzone poprzez unieruchomienie określonego białka na żywicy zawierającej ligandy o specyficznym powinowactwie do wyżej wymienionego białka. Drugie substancje są przykładowo komplementarnymi biologicznymi cząsteczkami. Przykładami sprzęgających się par ujawnionymi w WO 94/13322 są przeciwciało (pierwsza substancja) - odpowiadający antygen (druga substancja); specyficzny inhibitor (pierwsza substancja) - enzym (draga substancja); czynnik wzrostu (pierwsza substancja) - odpowiadający receptor (druga substancja) lub odwrotności każdego z tych sprzężeń.
Jednak korzystne jest gdy w sposobie przeznaczonym do wykorzystania podczas farmaceutycznej produkcji, zastosowanie substancji o złożoności biologicznej jest ograniczone do minimum. Jest to głównie spowodowane surowymi wymaganiami dotyczącymi udokumentowania jednorodności i bezpieczeństwa użycia wyżej wymienionych substancji. Dlatego też zastosowanie ligandów wykazujących powinowactwo otrzymanych w chemicznej syntezie organicznej byłoby korzystne.
DE 3717210 dotyczy sposobu modyfikacji biopolimerów, korzystnie biopolimerów niosących ładunek, poprzez unieruchomienie biopolimeru na, na przykład, adsorbencie jonowymiennym, przereagowanie biopolimeru z reagentami, np. enzymami lub innymi reagentami biochemicznymi, aby uzyskać produkt reakcji, a następnie desorbowanie produktu reakcji z adsorbentu. Korzystnie produktem reakcji jest kwas nukleinowy rozcięty przy użyciu enzymu restrykcyjnego. W DE 3717210 wykorzystano biopolimer w postaci zaadsorbowanej w celu lepszego wystawienia biopolimeru na działanie reagentów, zwiększając w ten sposób wydajność modyfikacji. Jednakże nie ma tu wzmianki o osłanianiu wyeksponowanych miejsc lub zamiarze zachowania aktywności biopolimeru, które byłyby korzystne dla funkcji in vivo biopolimeru. Wynalazek w DE 3717210 zaledwie ma na celu naszkicowanie właściwości biocząsteczek takich, jak kwasy nukleinowe, zmianę pierwotnych właściwości poprzez przetwarzanie lub zwiększanie liczby jednostek funkcyjnych makrocząsteczki, przykładowo poprzez wprowadzenie radioaktywnych izotopów.
Wiele białek przeznaczonych do użytku terapeutycznego skoniugowano, powszechnie poprzez zastosowanie rozmaitych sposobów polietylenoglikolowania (Francis, G. E. et al, w Stability of Portein Pharmaceuticals/Series: Pharmaceutical Biotechnology 3, 235-263 (1992); Inada, Y. et al, Trends in Biotechnology, 13, 86-91 (1995)). Większość przykładów dotyczy podawania dożylnego. Jednakże, ujawniono wchłanianie niektórych alergenów skoniugowanych z mPEG po podaniu podskórnym do osocza, płuca, wątroby i śledziony, oraz
185 821 udowodniono skuteczność immunoterapii alergenami skoniugowanymi z mPEG (Dreborg, S. and Lkerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. Drug Carr. Sys. 6(4), 315-365 (1990)). Ponadto zastosowano podawanie domięśniowe w próbach klinicznych deaminazy adenozyny (Hershfield, M. S. et al, New Eng. J. Med. 316, 589-596 (1987)). Stwierdzono także, że polietylenoglikolowanie w kilku przypadkach okazało się korzystne w podawaniu doustnym. Dlatego też polietylenoglikolowanie IgG przeznaczonego do podawania doustnego ujawniono w EP-A-0 614 373 zgłoszonego przez Mount Sinai School of Medicine. Polietylenoglikolowanie czynnika VIII i czynnika IX przeznaczonych do podawania doustnego ujawniono w Sakuragawa et al, Acta Med. Biol., 34(3), 77-84 (1987) i w japońskim zgłoszeniu patentowym nr 44509/83 przez Nippon Chemifar Company.
Czynnik VIÓ jest białkiem, które bierze udział w wewnętrznym krzepnięciu krwi. Jest on kofaktorem w reakcji, w której enzymatyczny czynnik IXa w obecności fosfo lipidu i jonów wapnia przekształca proenzymatyczny czynnik X w formę aktywowaną, czynnik Xa, co ostatecznie prowadzi do skrzepu fibrynowego. Ludzki czynnik VIII jest syntetyzowany jako cząsteczka o pojedynczym łańcuchu o masie około 300 kDa i zawierająca strukturalne domeny A1-A2-B-A3-C1-C2 (Gitschier et al., 1984, Nature 312, str. 326; Wood et al., 1984, Nature 312, str. 330; Vehar et al., 1994, Nature 312, str. 337; Toole et al., 1984, Nature, 312, str. 342). Produkt prekursorowy jest przetworzony w dwa łańcuchy polipeptydowe o masach 200 i 80 kDa w aparacie Golgiego, a łańcuchy te trzymane razem przez jon(y) metalu są wydzielane do krwi (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem, 263, str. 6352; Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, str. 2979). Domena B czynnika Vm wydaje się być zbędna w odniesieniu do funkcji czynnika VIII jako kofaktora podczas gdy domeny A i C posiadają kilka miejsc interakcji z innymi makrocząsteczkami odgrywającymi rolę w hemostazie (Sandberg et al., 1993, Thrombos. Haemostas., 69, str. 1204 i Lind. et al., 1995, Eur. J. Biochem., 232, str. 19).
Czynnik von Willebranda (vWf) jest wielofunkcyjnym polimerycznym białkiem osocza, składającym się z dwóch podjednostek połączonych mostkiem dwusiarczkowym o masie ok. 240 kDa. Podjednostki te tworzą heterogenną populację multimerów, których masy cząsteczkowe zawierają się w zakresie od ok. 1 MDa do 20 MDa. Funkcja vWf w pierwotnej hemostazie polega na umożliwieniu adhezji płytek do ściany naczyniowej w warunkach wysokich sił „strzygących” prądu krwi. Co więcej vWf mocno, chociaż niekowalencyjnie wiąże czynnik VIII. W prawidłowym ludzkim osoczu czynnik VIII i vWf krążą skompleksowane ze sobą. vWf ma ważny stabilizujący wpływ na cząsteczkę czynnika VIII, zabezpieczając cząsteczkę przed jej degradacją przez proteazy (Koedam et al., 1987, Doctoral Thesis, ICG Printing, Dor-drecht, 1986, str. 83; Hamer et al., 1986, Haemostasis, 1987 58, str. 223). U człowieka okres półtrwania in vivo czynnika VIII wynosi zazwyczaj 10-15 godzin. U pacjentów z niedoborem vWf, zmniejszonej zawartości vWf towarzyszy zmniejszenie zawartości czynnika VIH spowodowane pogorszonym wydzielaniem i zwiększoną szybkością degradacji czynnika VIH. Publikacje Tuddenham et al., 1982, Br. J. Haematol., 52, str. 259 oraz Brinkhous et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, str. 8752 pokazały, że obecność vWf ma ważny wpływ na przetrwanie in vivo czynnika VIII. Kiedy dokonano wlewu czynnika VIII psom z hemofilią otrzymano okres półtrwania wynoszący 7-10 godzin, podczas gdy okres półtrwania wynoszący 1 godzinę otrzymano po wlewie psom z niedoborem vWf (Brinkhous et al., patrz wyżej).
Czynnik IX jest proenzymem czynnika IXa opisanego wyżej. Jest on proteazą serynową i jednym z czynników krzepnięcia zależnym od witaminy K. Jego masa cząsteczkowa wynosi około 55 kDa (DiScipio et al., 1977, Biochemistry, 16, str. 698). Czynnik IXa oddziałuje specyficznie z innymi składnikami biorącymi udział w aktywacji czynnika X (w: Haemostasis and Thrombosis, 1994, vol. 1, wyd. 3, ed. Bloom A. et al.)
Jak wynika z powyższych akapitów, czynnik VIII jest białkiem z kilkoma miejscami interakcji, z których każde jest odpowiedzialne za specyficzne funkcje. Zatem trudno jest modyfikować czynnik VIII zachowując wszystkie jego biologiczne funkcje.
Sposób polietylenoglikolowania zastosowano uprzednio do mieszanin białek zawierających czynnik VIII. W WO 94/15625 (Enzon) ujawniono, że polietylenoglikolowanie czynnika VIII z zastosowaniem wiązania karbaminianowego (uretanowego) przy nieokreślonym stopniu modyfikacji wynikającym ze 100-krotnego molamego nadmiaru mPEG w stosunku do
185 821 czynnika VIII, może zwiększyć jego okres półtrwania in vivo u myszy od 13 do 55 godzin. Zazwyczaj przyjmuje się, że okres półtrwania u myszy wynosi około 1 godziny. Zatem 13godzinny okres półtrwania u myszy jest niezwykle długi. Ponadto trzeba wziąć pod uwagę fakt, że przy skrajnie niskiej czystości wyjściowego preparatu czynnika VIII (20-50 IU/mg białka), inne białka niż czynnik VIII dominowały podczas reakcji sprzęgania. Ważnym białkiem obecnym zazwyczaj w preparatach czynnika VIII o niskiej czystości jest czynnik von Willebranda, który pełni funkcję stabilizującą czynnik VIII i mógłby również przyczynić się do ochrony odpowiednich miejsc funkcyjnych podczas procesu koniugacji. Po skoniugowaniu mPEG może być zlokalizowany na każdym z białek obecnych w mieszaninie białek, w której czynnik VIII zazwyczaj stanowi tylko małą część. Polietylenoglikolowaną mieszaninę białek, zawierającą czynnik VIII stosowano do podawania dożylnego. Jednakże dobrze określony wyjściowy materiał jest jednym z istotnych czynników zapewniających kontrolowane warunki niezbędne podczas produkcji farmaceutycznej.
Stosuje się również inne polimery do koniugowania czynnika VIII. W opisie patentowym USA nr 4,970,300 ujawniono, że koniugacja z dekstranem może powodować wydłużenie okresu półtrwania czynnika VTII.
W większości sposobów sprzęgania polimeryczny reagent reaguje z grupami s-aminowymi reszt lizynowych polipeptydu. Są one często rozmieszczone na całej powierzchni polipeptydu i przez to może dochodzić do koniugacji w sąsiedztwie miejsc funkcyjnych. W konsekwencji przypadkowej koniugacji aktywność lub funkcja jest często zaburzona. Z naszego doświadczenia wynika, że gdy stosuje się takie sposoby do bardzo czystych preparatów takich, jak zrekombinowany czynnik VIII z usuniętym obszarem B z aktywnością koagulantu, aktywność ta jest poważnie zmniejszona już przy stopniu modyfikacji około 5 m-PEG/cząsteczkę czynnika VIII.
Autorzy wynalazku stwierdzili, że aktywność właściwa skoniugowanych polipeptydów może być w wysokim stopniu zachowana po prostu przez unieruchomienie polipeptydu na adsorbencie specyficznym dla określonych grup przed reakcją sprzęgania, która pociąga za sobą desorpcję koniugatu przez zastosowanie zwykłych sposobów. Jest to zaskakujące ponieważ uprzednio uważano za istotne używanie adsorbentów specyficznie wiążących omawiany polipeptyd w celu uzyskania ochrony pewnych domen, ważnych dla funkcji biologicznych.
Korzyść z modyfikujących biokompatybilnych polimerów często zależy od stopnia modyfikacji. Zatem wysoki stopień modyfikacji, np. duża liczba biokompatybilnych polimerów na cząsteczkę polipeptydu, jest zwykle potrzebna dla skutecznej ochrony przed aktywnością proteolityczną. Dzięki wynalazkowi, w którym biokompatybilne polimery wprowadzono bardziej selektywnie, aktywność właściwa jest lepiej zachowana. Tak więc autorzy wynalazku stwierdzili, że czynnik VIII może być skutecznie chroniony przed rozpadem w otoczeniu in vitro, wykazującym działanie degradujące tę cząsteczkę. Efekt ten może być osiągnięty przy stopniu modyfikacji wynoszącym jedynie 4-5 mPEG/czynnik VIII.
Zastosowanie adsorbenta określonego w wynalazku specyficznego dla określonych grup jest bardziej korzystne ekonomicznie w porównaniu z adsorbentami uprzednio ujawnionymi w tej dziedzinie. Zastosowanie adsorbentów specyficznych dla określonych grup także ułatwi rejestrację koniugatów jako czynników terapeutycznych.
Przedstawiony sposób umożliwia udoskonalenie funkcji in vivo polipeptydu, szczególnie poprzez udoskonalenie funkcji farmakokinetycznej, nie wyłączając przyswajalności, oraz poprzez zmniejszenie immunogenności wykazywanej przez polipeptydy.
Wynalazek dotyczy sposobu udoskonalania funkcji in vivo zrekombinowanego czynnika Vni SQ poprzez osłanianie wyeksponowanych miejsc wyżej wymienionego polipeptydu polegającego na tym, że
a) unieruchamia się zrekombinowany czynnik VIII SQ przez interakcję ze swoistym wobec grupy niosącej anionowo-wymienne ligandy adsorbentem;
b) aktywuje się biokompatybilny polimer;
c) koniuguje się aktywowany biokompatybilny polimer z zewnętrznymi miejscami unieruchomionego zrekombinowanego czynnika VIII sQ, a następnie
d) eluuje koniugat z adsorbenta.
185 821 przy czym aktywność właściwa czynnika VIII SQ przed unieruchomieniem wynosi co najmniej 2000 IU/mg całkowitej ilości białka, a korzystnie zawiera się w przedziale od 5000 do 20000 IU/mg całkowitej ilości białka.
Aktywność czynnika VIII SQ przed unieruchomieniem wynosi co najmniej 2000 IU/ml, a korzystnie zawiera się w przedziale od 5000 do 50000 IU/ml.
W sposobie według wynalazku stosuje się biokompatybilny polimer wybrany z grupy obejmującej homopolimery, kopolimery, lub kopolimery blokowe zawierające politlenki alkilenowe zakończone monoalkilem.
Jako politlenek alkilenowy zakończony monoalkilem stosuje się korzystnie związek wybrany z grupy zawierającej homopolimery glikolu polietylenowego i homopolimery glikolu polipropylenowego, a jako politlenek alkilenowy zakończony monoalkilem jest glikol, monometoksypolietylenowy (mPEG).
W sposobie według wynalazku stosuje się ligand anionowymienny wybrany z grupy obejmującej czwartorzędową grupę metyloaminową, czwartorzędową grupę etyloaminową i trimetyloaminoetylową, lub ich mieszaniny.
W opisie wynalazku termin „miejsce interakcji” oznacza różne miejsca istotne dla funkcji biologicznej określonego polipeptydu.
Termin „wyeksponowane miejsca” oznacza zewnętrzne miejsca na polipeptydzie określonym wyżej istotne dla niepożądanych reakcji in vivo. Do przykładów wyeksponowanych miejsc należą epitopy (determinanty antygenowe) oraz miejsca proteolizy. Niektóre miejsca proteolizy sąjednocześnie uważane za miejsca interakcji.
Wynalazek umożliwia, w stopniu dotychczas nieosiągalnym, zmniejszenie wypływu niepożądanych reakcji in vivo, np. proteolizy oraz możliwości agregacji, przy jednoczesnym zachowaniu bez zmian miejsc interakcji istotnych dla funkcji biologicznych polipeptydów. Ujawniono to w zgłoszeniu dotyczącym koniugacji (zrekombinowanego) czynnika VIH z mPEG. Bardziej szczegółowo, przez unieruchomienie polipeptydu poprzez interakcję z adsorbentem specyficznym dla określonych grup, zawierającym ligandy wytworzone w chemicznej syntezie organicznej, miejsca interakcji na polipeptydzie są wyłączone z koniugacji z biokompatybilnym polimerem. Ponadto, poprzez skoniugowanie aktywowanego biokompatybilnegó polimeru z polipeptydem w pożądanym zewnętrznym miejscu wyeksponowane miejsca sąosłaniane przed działaniem np. proteaz.
Termin „polipeptydy” oznacza białka i oligopeptydy zawierające co najmniej 20 aminokwasów w łańcuchu. Odpowiednia liczba aminokwasów w polipeptydzie według wynalazku zawiera się w przedziale od 30 do 4500 aminokwasów, korzystnie od 40 do 3000 aminokwasów. Polipeptydami mogą być polipeptydy ssaków, ściślej ludzkie, pochodzenia naturalnego bądź wytworzone rekombinacyjnymi technikami DNA. Do polipeptydów, które można skoniugować według wynalazku należą polipeptydy wykazujące aktywność koagulantu bądź polipeptydy o funkcji wspomagającej koagulację. Polipeptydy mogą być polipeptydami o pełnej długości tj. sekwencja aminokwasów jest identyczna z ogólnie odpowiadającą sekwencją u ssaków, a szczególnie u ludzi. Polipeptydy mogą też być delecyjnymi pochodnymi polipeptydów o pełnej długości, w których brakuje jednego lub więcej aminokwasów. Takim stosowanym w sposobie według wynalazku polipeptydem jest koagulacyjny czynnik VIII.
Czynnik VIII o pełnej długości obecny w ludzkim osoczu ma masę cząsteczkową wynoszącą około 300 kDa. Koncentraty czynnika VID otrzymane z ludzkiego osocza zawierają kilka całkowicie aktywnych fragmentarycznych form czynnika VIII jak opisał Andersson i współ, (patrz wyżej). Najmniejsza aktywna forma ma masę cząsteczkową wynoszącą około 170 kDa i składa się z dwóch łańcuchów o masie cząsteczkowej około 90 kDa i około 80 kDa trzymanych razem przez jon(y) metalu. Odniesiono się tutaj do EP-A-0 197 901 Pharmacia & Upjohn AB. Dlatego też biologicznie aktywny czynnik VIII wytworzony zgodnie z wynalazkiem ma korzystnie masę cząsteczkową zawierającą się w zakresie od około 170 kDa do około 300 kDa.
Pharmacia AB w Sztokholmie, Szwecja, opracowała produkt zrekombinowanego czynnika VIII, który odpowiada 170 kDa formie czynnika VIII z osocza w terapeutycznych koncentratach czynnika VIII. Skrócona cząsteczka zrekombinowanego czynnika VIII jest nazywana r-VIII SQ i jest wytwarzana przez komórki jajnika chomika chińskiego (Chinese Hamster Ovary - CHO) w procesie kultury komórkowej na podłożu nie zawierającym surowicy.
185 821
Aktywność właściwa r-VTII SQ wynosi około 15000 IU VIII:C na mg całkowitego białka.
Strukturę i biochemię r-VIII SQ opisano w WO-A-91/09122 przypisanemu Pharmacia AB.
W niniejszym wynalazku czynnik VIII może być albo czynnikiem VIII z osocza albo zrekombinowanym czynnikiem VIII. Kiedy czynnik VIII jest rekombinantowy, to może on być czynnikiem VIII o pełnej długości, lub korzystnie delecyjną pochodną czynnika VIII o pełnej długości wykazującą aktywność koagulantu. Korzystniej, delecyjną pochodna jest zrekombinowanym czynnikiem VIII SQ (r-VIII SQ). W związku z tym delecyjną pochodna jest zdefiniowana jako koagulacyjny czynnik VIII, w którym brakuje całej lub części domeny B, podczas gdy aktywność koagulantu jest zachowana. Pozostałe domeny są odpowiednio połączone łącznikiem aminokwasowym. Przykłady różnych konstrukcji łącznika podano w P. Lind et al., Eur. J. Biochem., vol. 232 (1995) str. 19-27.
Korzystnie niniejszy wynalazek może być wykorzystany w selektywnym wprowadzaniu biokompatybilnych polimerów do szerokiej gamy produktów czynnika Vni. Dlatego też obecny wynalazek może być wykorzystany do dalszej stabilizacji in vivo czynnika VIII w osoczu, który jest już stabilizowany poprzez asocjacje z białkiem nośnikowym, czynnikiem von Willebranda (vWf).
Korzystnym jest, aby produkt końcowy był dobrze określony. Dlatego też aktywność właściwa czynnika VIII w sposobie sprzęgania według wynalazku powinna wynosić co najmniej około 1000 IU/mg całkowitej ilości białka, a właściwie co najmniej 2θ0θ IU/mg całkowitej ilości białka. Aktywność właściwa czynnika VIII korzystnie zawiera się w przedziale od 5000 do 20000 IU/mg całkowitą ilość białka, a korzystniej w przedziale od 10000 do 17000 IU/mg całkowitej ilości białka.
Aktywność czynnika VIII w sposobie sprzęgania może wynosić co najmniej około 1000 IU/ml, a odpowiednio co najmniej 2000 IU/ml. Aktywność czynnika VIII korzystnie zawiera się w przedziale od 5000 do 50000 IU/ml, a korzystniej od 20000 do 40000 IU/ml.
Biokompatybilny polimer według wynalazku może być wybrany z grupy składającej się z homopolimerów, kopolimerów lub kopolimerów blokowych politlenków alkilenu zakończonych monoalkilem. Biokompatybilne polimery mogą być proste lub rozgałęzione. Korzystnie politlenek alkilenu zakończony monoalkilem jest wybrany z grupy składającej się z homopolimerów glikolu polietylenowego i homopolimerów glikolu polipropylenowego. Korzystnie biokompatybilny polimer jest homopolimerem glikolu polietylenowego (PEG). Masa cząsteczkowa PEG zawiera się w przedziale od około 300 do 20000, odpowiednio w przedziale od 1500 do 10000, a korzystnie w przedziale od 3000 do 5000.
Biokompatybilny polimer powinien mieć jeden z końców zablokowany by uniknąć krzyżowej derywatyzacji. Przykładami odpowiednich do tego celu grup są proste lub rozgałęzione niższe grupy alkoksylowe, korzystnie grupy monometoksylowe. Szczególnie korzystnym biokompatybilnym polimerem niniejszego wynalazku jest glikol monometoksypolietylenowy (mPEG).
Innymi rozważanymi biokompatybilnymi polimerami są również np. dekstran, poliwinylopirolidyna i DL aminokwasy.
Biokompatybilny polimer musi być aktywowany przed reakcją sprzęgania, by umożliwić tworzenie wiązań kowalencyjnych. W tym celu koniec biokompatybilnegd polimeru skierowany do polipeptydu powinien mieć przyłączoną grupę hydroksylową która może ulec aktywowaniu. Istnieje kilka sposobów aktywowania biokompatybilnego polimeru, zależnych od aminokwasu wybranego dla wiązania kowalencyjnego. Odpowiednimi pochodnymi mPEG dla sprzęgania z grupami aminowymi są bursztynian sukcynoimidylowy mPEG, sukcynoamid sukcynoimidylowy mPEG, propionian sukcynoimidylowy mPEG, węglan sukcynoimidylowy mPEG, ester sukcynoimidylowy karboksymetylowanego mPEG, oksykarbonyloimidazol mPEG, węglany nitrofenylowe mPEG, węglan trichlorofenylowy mPEG, tresylan mPEG (ostatni przedstawiony przez Nilsson K., Mosbach K., Methods in Enzymology, Vol 104, str. 56-69 (1984)), (wszystkie wymienione reagenty są sprzedawane przez Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, aL, USA), bezwodnik maleinowy mPEG i bezwodnik metylomaleinowy mPEG (Garman A., Kalindjian S. B., FEB Vol 223:2, str. 361-365) oraz mieszane bezwodniki bursztynian mPEG, mPEG-kwas octowy lub mPEG-kwas propionowy (Dreborg S. i Akerblom E., patrz wyżej) odpowiednio.
185 821
Reszta cysteinowa może być skoniugowana z maleimidem m-PEG, sulfonem winylowym mPEG oraz dwusiarczkiem mPEG-ortopirydylowym (sprzedawanymi przez Shearwater
Polymers, Inc., Huntsville, AL, USA). Odpowiednimi reagentami w przypadku koniugacji grupy guanidynowej argininy sąmPEG pochodne fenylo-glioksalu (Zalipski, patrz wyżej).
Węglowodany muszą być najpierw utlenione w taki sposób aby obecne w nich były grupy aldehydowe zanim można je skoniugować z hydrazydami mPEG (Zalipski, patrz wyżej).
Proces sprzęgania odbywa się przy pH odpowiednim dla koniugowanych aminokwasów. Należy również zwrócić uwagę na pH odpowiednie dla całego polipeptydu, jak również na zależność reaktywności biokompatybilnego polimeru od pH. Dlatego też zazwyczaj pH sprzęgania zawiera się w zakresie od około 7 do około 8, dolna granica ustalona w ten sposób aby uniknąć przedłużonego procesu sprzęgania, a górna granica aby dostarczyć łagodnych warunków dla polipeptydu. Wyższy zakres pH jest odpowiedni dla koniugacji z udziałem lizyny. Dlatego też w przykładach niniejszego wynalazku skoniugowaliśmy substancję o aktywności FVIII w takich łagodnych warunkach. Wartości pH poza tym zakresem także mogą być odpowiednie w niektórych przypadkach. Tak więc koniugacje z udziałem cysteiny są odpowiednio przeprowadzone przy pH mniejszym od 7, podczas gdy arginina jest koniugowana odpowiednio przy pH w zakresie od około 5,5 do około 9,3.
Proces sprzęgania powinien być prowadzony w temperaturze wyższej niż 0°C, odpowiednio w zakresie od około 5 do około 40°C, a korzystnie w zakresie od 10 do 30°C. Ponownie należy wziąć pod uwagę temperaturę odpowiednią dla całego polipeptydu, jak również wpływ temperatury na reaktywność biokompatybilnych polimerów. W przykładach niniejszego zgłoszenia wszystkie etapy sprzęgania sąprowadzone w temperaturze pokojowej.
Adsorbent wykorzystany w niniejszym wynalazku jest specyficzny dla określonych grup w odniesieniu do unieruchomionego polipeptydu. Adsorbenty specyficzne dla określonych grup wykazują powinowactwo do kilku polipeptydów. Ponadto często łączą się słabiej i wymywanie może być prowadzone w łagodniejszych warunkach niż w przypadku mono specyficznych adsorbentów, które łączą się z jednym lub niewielką liczbą polipeptydów. Przykłady odpowiednich adsorbentów specyficznych dla określonych grup podano w publikacji Jansson, J.-C. et al., Protein Purification, Principles. High Resolution Methods, and Applications, VCH Publishers, str. 274-285 (1989), do której odnosimy się w niniejszym tekście. Adsorbent według wynalazku charakteryzuje się ponadto tym, że zawiera ligandy wytworzone w chemicznej syntezie organicznej. Przykładowymi adsorbentami odpowiadającymi tym kryteriom są żywice chromatograficzne zazwyczaj użyteczne w adsorpcji białek np. biokompatybilne matryce, z którymi sprzężono ligandy takie, jak aniono- i kationowymienne grupy, grupy sulfhydrylowe, grupy unieruchomionego metalu (IMAC) do chromatografii powinowactwa, proste lub rozgałęzione, nasycone lub nienasycone łańcuchy węglowodorowe lub grupy aromatyczne. Użyteczne są również ligandy o funkcjach mieszanych na przykład o częściach jonowych i hydrofobowych takie, jak grupy aminoalkilo lub dimetyloaminopropylocarbamylopentylowe. Istnieją doniesienia o użyteczności tych dwóch ligandów w oczyszczaniu czynnika VDI otrzymanego z osocza, ujawnione odpowiednio przez Morgenthaler et al., Thromb. Haemostas. 47(2), 124 ff (1982) oraz Te Booy, M. P. W. M., et al. J. Chrom. 503, 103-114 (1990). Korzystnym przykładem grupy aminoalkilowej jest grupa aminoheksylowa. Ligandy o większej złożoności takie, jak peptydy lub fosfolipidy wytworzone w chemicznej syntezie organicznej, także mogą być użyte. Dla specjalistów w tej dziedzinie, do grupy ligandów wykazujących powinowactwo wytwarzanych w chemicznej syntezie organicznej należy wiele substancji. Należą do nich reaktywne barwniki włókiennicze na bazie triazyny, które okazały się użyteczne jako adsorbenty kilku enzymów takich, jak kinazy i hydrogenazy. Ponadto użyteczne są pochodne cukru, nukleotydy i peptydy oraz ich analogi wytworzone w chemicznej syntezie organicznej (Dechow, F. J., Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications, Park Ridge, NJ, USA, str. 440-443 (1989)).
Ligandami odpowiednimi do wykorzystania w niniejszym wynalazku są ponadto anionowymienne grupy, korzystnie silne, takie, jak czwartorzędowa grupa aminoetylowa (QAE), grupa trimetyloaminoetylowa (TMAE) lub czwartorzędowa grupa aminometylowa (Q), korzystniej czwartorzędowa grupa aminometylowa (Q). Ponadto ligandy mogą być ściśle sprzę185 821 żone z matrycą lub z odstępnikiem takim, jak alkiloamina, heksyloamina, diaminodipropyloamina, etyloaminosukcynoamid (Persson & Lagerstróm, w Packings and stationary phases in chromatographic techniques, Unger, K. K., ed., Marcel Dekker Inc. 1990, str. 754), lub z rozgałęzionym ramieniem do którego dołączone są ligandy (odpowiednim przykładem jest
Fractogel™ EMD, wytwarzany przez Merck, Niemcy).
Po przeprowadzeniu wyżej opisanego sprzęgania, skoniugowany polipeptyd jest wymywany powszechnie stosowanymi sposobami. W związku z tym istotnym jest aby warunki fizykochemiczne zostały rozważone aby uniknąć degradacji skoniugowanego polipeptydu. Tak więc jeżeli częścią drogi sprzęgania jest etap, w którym w pewnym zakresie pH występuje koniugat o labilnym wiązaniu, to powinien być on unikany.
W procesie sprzęgania, kiedy polipeptyd jest unieruchomiony na adsorbencie, polipeptyd może być poddany działaniu rozpuszczalnego czynnika blokującego, aby ochronić dodatkowe miejsca przed koniugacją Taki czynnik blokujący powinien być wytworzony w chemicznej syntezie organicznej, a ponadto powinien być skoniugowany z którymś z wyżej zidentyfikowanych ligandów związanych z polimerem wybranym np. z politlenków alkilenu zakończonych monoalkilem, kopolimerów lub bloków kopolimerów politlenku alkilenu, homopolimerów glikolu polietylenowego lub homopolimerów glikolu polipropylenowego. Czynnik blokujący może także zawierać jednostki o specyficznym powinowactwie do polipeptydu.
Po elucji, działający rozpuszczalny czynnik blokujący jest desorbowany przez zastosowanie odpowiednich warunków chemicznych. Dla przykładu, jeżeli czynnik blokujący był adsorbowany na skutek wzajemnych oddziaływań hydrofobowych, może zostać zdesorbowany poprzez obniżenie siły jonowej roztworu, bądź po prostu poprzez obniżenie temperatury. Rozpuszczalny czynnik blokujący jest wówczas oddzielany od koniugatu przy wykorzystaniu sączenia molekularnego prowadzonego w powszechnie stosowanych warunkach.
Matrycą dla adsorbenta w niniejszym wynalazku może być jakakolwiek handlowo dostępna żywica kompatybilna z cząsteczkami biologicznymi. Dlatego więc, matryca może być wybrana spośród rozmaitych silnie hydrofitowych matryc, np. matryc agarozowych takich, jak ogromny wybór matryc Sepharose™ sprzedawanych przez Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja, polimerowych matryc organicznych takich jak TSK-GEL'e sprzedawanych przez Tosoh Corp., Tokio, Japonia, bądź też szerokoporowych polimerowych matryc organicznych sprzedawanych przez Per Septive Biosystems, Boston, USA. Odpowiednie są także matryce membranowe, np. Sartobind™ sprzedawany przez Sartorius, Niemcy, oraz MemSep™ sprzedawany przez Millipore, USA. Korzystną, matrycą jest matryca agarozowa. Odpowiednimi w niniejszym wynalazku matrycami agarozowymi są, oprócz Sepharose™, Minileak™ sprzedawany przez Kem-En-Tec A/S, Kopenhaga, Dania oraz Bio-Gel A sprzedawany przez BioRad, Bruksela, Belgia. Korzystną matrycą jest matryca usieciowana umożliwiająca szybki przepływ (FF) i w związku z tym wysoką sprawność produkcyjną. Korzystniej, chromatografia według wynalazku jest prowadzona na żelu Q Sepharose™ FF. Ponadto, z pożytkiem można zastosować także żywice utworzone z kopolimerów glikolu oligoetylenowego, metakrylanu glicydylu i dimetakrylanu pentaerytrolu jak Fractogel™ (rozprowadzany przez Merck, Niemcy), celulozę oraz porowate szkło.
Koniugaty polipeptydu i biokompatybilnego polimeru uzyskiwane niniejszym sposobem są nowe. Korzystając z niniejszego sposobu aktywność polipeptydów po skoniugowaniu może zostać zachowana w co najmniej 30% względem aktywności przed wspomnianą, koniugacją, odpowiednio co najmniej w 50% i korzystnie co najmniej w 70% aktywności przed koniugia^^
Koniugaty polipeptydu i biokompatybilnego polimeru uzyskiwane zgodnie z wynalazkiem mogą być wykorzystane jako leki. Szczególnie korzystnym jest użycie koniugatu czynnika VIII i biokompatybilnego polimeru, w którym stopień koniugacji zawiera się w przedziale od 1 do 15 PeG zakończonego monoalkilem/cząsteczkę czynnika VIII, odpowiednio w przedziale od 2 do 10 PEG zakończonego monoalkilem/cząsteczkę czynnika VIII, korzystnie w przedziale od 3 do 7 PEG zakończonego monoalkilem/cząsteczkę czynnika VIII.
W związku z tym skoniugowany czynnik VIII jest odpowiednio uzyskiwany poprzez zastosowanie techniki rekombinacyjnego DNA, korzystnie zrekombinowanej delecyjnej po10
185 821 chodnej czynnika VIII o pełnej długości posiadającej aktywność koagulantu, oraz korzystniej delecyjnej pochodnej zrekombinowanego czynnika VIII SQ (r-VIII SQ).
Skoniugowany polipeptyd według wynalazku jest odpowiednio wykorzystywany w podawaniu podskórnym, domięśniowym, śródskómym, lub dożylnym. Przede wszystkim, skoniugowany czynnik VIII może być zastosowany w przygotowywaniu leku przeznaczonego do leczenia hemofilii A, a w szczególności w podskórnym, domięśniowym, śródskómym lub dożylnym podawaniu takiego leku. Ponadto, skoniugowany vWf może być zastosowany w przygotowywaniu leku przeznaczonego do leczenia choroby von Willebranda, a w szczególności w podskórnym, domięśniowym, śródskómym lub dożylnym podawaniu takiego leku. Czynnik VIII oraz czynnik von Willebranda, mogą zostać także zastosowane w kombinacji. Także skoniugowany czynnik IX może zostać zastosowany w przygotowywaniu leku przeznaczonego do leczenia hemofilii B, a w szczególności w podskórnym, domięśniowym, śródskómym lub dożylnym podawaniu takiego leku.
Wykorzystując rozwiązanie według wynalazku umożliwiono leczenie hemofilii A poprzez podskórne, domięśniowe, śródskóme lub dożylne podawanie koniugatu czynnika VIII i biokompatybilnego polimeru przygotowanego zgodnie z wynalazkiem.
Przykłady
Poniższe przykłady zostały przedstawione jedynie w celu zilustrowania i nie należy ich interpretować jako ograniczające w jakikolwiek sposób zakres tego wynalazku, który jest zdefiniowany w załączonych zastrzeżeniach.
Przykład 1
Wytwarzanie zrekombinowanego czynnika VIII
Wytwarzanie zrekombinowanego czynnika VIII SQ (r-VIII SQ) zostało zasadniczo przeprowadzone według opisu zamieszczonego w opisie patentowym WO-A-9109122, przykład 1-3. DHRF został wprowadzony do wadliwej linii komórkowej CHO (DG44N.Y.) metodą elektroporacji wraz z wektorem ekspresyjnym zawierającym gen r-VIII SQ oraz z wektorem ekspresyjnym zawierającym gen reduktazy dihydrofolianowej. Następnie po przeprowadzeniu selekcji na podłożu selekcyjnym wzrost wyrosłych kolonii był zwielokrotniany poprzez stopniowo wzrastające ilości metotreksatu. Supematanty znad otrzymanych kolonii badano pojedynczo na aktywność czynnika VIII. Powstały klon wydzielono, a następnie przeniesiono do wolnej od surowicy zawiesiny, wzrastał w tak zdefiniowanym środowisku i ostatecznie został rozwinięty na dużą skalę proces kultywacji komórek. Supematanty były zbierane w pewnych odstępach czasowych a następnie oczyszczane jak opisano poniżej.
Zebrane podłoże oczyszczono poprzez sączenie, i po ustaleniu pH, przesącz umieszczono na kolumnie S Sepharose101 FF (objętość kolumny 31.). Po jej przepłukaniu, czynnik VIII wymyto buforem soli zawierającym 5mM CaCl2 i 0.02% Tritori™ Χ-100. Tą kationowymienną chromatografię prowadzono w temperaturze 2-8°C. Eluat zebrany z kolumny S Sepharose™ FF (eluat-S) został zamrożony do czasu późniejszego oczyszczania.
700 ml eluatu-S rozmrożono a temperaturę doprowadzono do temperatury pokojowej. Inaktywacja wirusa nastąpiła poprzez jego 30 min inkubację z fosforanem tri-n-butylowym (TNBP) i Tritonem™ Χ-100 o końcowych stężeniach odpowiednio wynoszących 0.3% (v/v) i 1.0% (v/v). Kolumnę przeinaczoną do chromatografii immunopowinowactwa przeciwciał monoklonalnych (mAb) o objętości 260 ml zrównoważono buforem eluatu-S zawierającym odpowiednie ilości związków chemicznych inaktywujących wirus. Wówczas, roztwór czynnika VIII wprowadzono na kolumnę mAb, i następnie przemyto. Elucję buforu zawierającego 50 przeprowadzono przy użyciu % glikol etylenowy.
Kolumnę Q Sepharose™ wstępnie zrównoważono roztworem chlorku sodu o wysokim stężeniu, a następnie zrównoważono buforem o takim samym składzie jaki miał eluent na kolumnie przeznaczonej do chromatografii immunopowinowactwa. Eluat-mAb wprowadzono, i wówczas kolumnę przemyto buforem którym była równoważona, po czym przemyto buforem o fizjologicznej mocy jonowej. Kolumnę wymyto roztworem chlorku sodu o stężeniu wzrastającym do stężenia 0.6 M. Do oczyszczania oraz do wymywania kolumny Q nie użyto żadnego detergentu. Kolumnę Butyl Sepharose™ 4 FF zrównoważono buforem zawierającym 50 mM histydyny, 1.4 M NH4Ac, 50 mM CaCl, i 0.02% Tween™ 80, pH 6.8. NH4Ac
185 821 dodawano do eluatu-Q do uzyskania końcowego stężenia 1.0 M, a Tween™ 80 do stężenia 0.02%. Roztwór ten wprowadzano na butylo-żelową kolumnę o liniowej prędkości przepływu wynoszącej 60 cm/godz. Wówczas kolumnę przemyto pięciokrotnością objętości kolumny buforem użytym do jej równoważenia a następnie wymyto z liniową prędkością przepływu wynoszącą 35 cm/godz. buforem zawierającym 50 mM histydyny, 0.5 M NH„Ac, 50 mM CaCl2 i 0.02% Tween™ 80, pH 6.8. Czystość tego sposobu była niezwykle wysoka, dając aktywność właściwą 12000-17000 IU/mg białka.
Analiza
W przykładach 1-8, aktywność czynnika VIII była analizowana poprzez oznaczanie chromogeniczne (Chromogenix AB, Mólndal, Szwecja) chyba, że ustalono inaczej. Ilość czynnika VIII określono spektrofotometrycznie przy A280 bądź poprzez analizę aminokwasów. Ilość mPEG sprzężonego z polipeptydem zmierzono przy zastosowaniu protonowego rezonansu paramagnetycznego NMR (Dreborg, S. oraz Lkerblom, E.B., Crit. Rew. Therap. DrugCarr. Sys. 6(4), 315-365 (1990)).
Przykład 2 (przykład porównawczy)
Czynnik VIII skoniugowany z mieszanym bezwodnikiem bursztynianu mPEG
Roztwór buforowy eluatu HIC, przygotowany według przykładu 1, wymieniono podczas sączenia molekularnego przeprowadzonego na kolumnie Superose 12 (sprzedawanej przez Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja), wcześniej zrównoważonej roztworem buforowym o następującym składzie: 0.25 M hepes, 4mM CaCl2, pH 7.8. Do roztworu zawierającego r-VIII SQ dodawano 35, 60 i 100 krotny nadmiar molowy (w stosunku do rVIII) mieszanego bezwodnika bursztynianu mPEG (M. Cz. 3000). Aby przereagowały, mieszaniny pozostawiono na 1.5 godziny w pokojowej temperaturze ciągle mieszając. Usunięcia nadmiaru mPEG - kwas bursztynowy oraz rozdzielenia populacji skoniugowanych z rVIII w zależności od wielkości, dokonano przy wykorzystaniu sączenia molekularnego, używając tym razem kolumny Superose 6 (sprzedawanej przez Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja). Z każdej z reakcji sprzęgania frakcje odpowiadające pierwszej lub drugiej połowie piku proteinowego były analizowane niezależnie (oznaczone polem 1 oraz polem 2 w tabeli I). Tabela I przedstawia rezultaty skoniugowanego r-VIII SQ z mieszanym bezwodnikiem bursztynianu mPEG.
Tabela I
r-VIII SQ (mg) Ilość dodawanego mPEG (nadmiar molowy) Stopień modyfikacji (mPEG/ rVIII) Aktywność właściwa (IU/mg) Aktywność właściwa (% aktywności wyjściowego SQ)
Wyjściowy r-VIII SQ - 0 0 15000 100
35*mPEG pole ł 1,2 35 2.5 4200 28
35*mPEG pole 2 1.2 35 1.2 6800 45
60*mPEG pole 1 1.6 60 2.4 2000 13
60*mPEG pole 2 1.6 60 na 4800 32
100*mPEG pole 1 1.1 100 4.8 1300 9
100*mPEG pole 2 1.1 100 3.8 2700 18
Jak wynika z tabeli I, aktywność właściwa rVIII obniża się drastycznie nawet przy niewielkim stopniu skoniugowania.
185 821
Przykład 3
Czynnik VIII zaadsorbowany na żelu Q Sepharose ™ FF podczas sprzęgania z mieszanym bezwodnikiem bursztynianu mPEG Reaktywne lizyny otoczone ładunkami ujemnymi na czynniku VIII zabezpieczono przed skoniugowaniem z mPEG poprzez adsorpcję czynnika VIII na anionowymiennym żelu. Kolumnę upakowaną Q Sepharose™ FF (sprzedawanym przez Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja), zrównoważoną roztworem buforowym o następującym składzie: 50 mM L-histydyny, 0.15 M NaCl, 4 mM CaCl2, pH 6.5, wykorzystano do zaadsorbowania czynnika VIII. Eluat HIC przygotowany według przykładu 1 naniesiono na kolumnę. W celu uzyskania odpowiednich warunków dla sprzęgania z mPEG, przed dodaniem mPEG kolumnę przemyto buforem zawierającym 0.25 M hepes, 4 mM CaCl2, pH 7.8. Żel wprowadzono do naczynia reakcyjnego, mieszany bezwodnik bursztynianu mPEG (M.Cz. 3000) dodano do zawiesiny w ilości odpowiadającej molowemu nadmiarowi w stosunku do czynnika VIII jak pokazano w tabeli II. Reakcję prowadzono przez 1.5 godziny ciągle mieszając. Wówczas kolumnę rozpakowano i skoniugowany rVIII wymyto roztworem buforowym 50 mM L-histydyny, 0.6 M NaCl, 4 mM CaCf, pH 6.8. Zebrano cztery próbki przy stałej ilości r-VIII SQ dodawanej na ilość żelu. Wszystkie etapy reakcji prowadzono w temperaturze pokojowej. Tabela II przedstawia wyniki skoniugowanego r-VIII zaadsorbowanego na żelu Q Sepharose™ FF.
Tabela II
r-VIII SQ (mg) Ilość dodawanego mPEG (nadmiar molowy) Stopień modyfikacji (mPEG/rVIII) Aktywność właściwa (IU/mg) Aktywność właściwa (% aktywności wyjściowego SQ)
Wyjściowy r-VIII SQ - 0 0 15000 100
Próbka 1 1.9 300 3.9 568400 56
Próbka 2 1.9 370 4.4 527800 52
Próbka 3 1.9 430 5.6 456800 45
Próbka 4 1.9 530 9.5 128009 19
Jak wynika z tabeli II, aktywność właściwa skoniugowanego r-VTI SQ utrzymuje się na dużo wyższym poziomie w porównaniu do skoniugowanego r-VIII SQ z przykładu 2.
Przykład 4
FVIII zaadsorbowany na żelu Q Sepharose ™ FF podczas sprzęgania z tresylanem mPEG
W tym przykładzie wszystkie etapy adsorpcji, sprzęgania i wymywania r-VIII SQ na żelu Q
Sepharose™ FF przeprowadzono jak w przykładzie 3. Tresylan mPEG (M.Cz. 5000) użyto w celu skoniugowania czynnika VIII. Tabela El przedstawia wyniki zaadsorbowanego na żelu Q Sepharose™ FF skoniugowanego r-VIII SQ z tresylanem mPEG według wynalazku.
T abela II
r-VIII SQ (mg) Ilość dodawanego mPEG (nadmiar molowy) Stopień mdyfikacji (mPEG/r-VIII) Aktywność właściwa (IU/mg) Aktywność właściwa (% aktywności wyjściowego SQ)
1 2 3 4 5 6
Wyjściowy r-VIII SQ - 0 0 15000 100
Próbka 1 1.8 300 2.2 9600 64
Próbka 2 1.8 400 na 8300 55
Próbka 3 1.8 500 5.8 3400 23
185 821
Aktywność właściwa w tym przypadku jest nieznacznie niższa niż w przykładzie 3, co prawdopodobnie jest zależne od większej masy cząsteczkowej mPEG.
Przykład 5
Czynnik VIII zaadsorbowany na ramieniowym anionowymiennym żelu podczas wiązania z mieszanym bezwodnikiem bursztynianu mPEG.
Użyto kolumny napełnionej Fractogel™’em EMD TMAE 650 (sprzedawanym przez Merck), aby zaadsorbować r-VIII SQ.
Wszystkie etapy przeprowadzono jak w przykładzie 3. Tabela IV przedstawia wyniki skoniugowanego r-Vin SQ zaabsorbowanego na ramieniowym anionowymiennym żelu z mieszanym bezwodnikiem bursztynianu mPEG według wynalazku.
Tabela IV
r-VIII SQ (mg) Ilość dodawanego mPEG (nadmiar molowy) Stopień modyfikacji (mPEG/rVIII) Aktywność właściwa (IU/mg) Aktywność właściwa (% aktywności wyjściowego SQ)
Wyjściowy r-VIII SQ - 0 0 15000 100
Próbka 1 2.0 300 na na
Próbka 2 2.0 500 na 2100 14
Przykład 6
Aktywacja skoniugowanego z mPEG czynnika VIII przez trombinę
Aktywacja skoniugowanego r-VIII SQ poprzez trombinę była testowana in vitro w próbach dobrze znanych specjalistom w tej dziedzinie. Próbkę przygotowano zgodnie z przykładem 3 i oznaczono stopień derywatyzacji wynoszący 4 mPEG/r-VIII SQ. Skoniugowany r-VIII SQ może być aktywowany przez ludzką trombinę w sposób zależny od dawki. Następnie następowała dezaktywacja. Na figurze 1, została pokazana krzywa zmian aktywności uzyskanych dla układu w którym na 1 jednostkę skoniugowanego r-VHI SQ dodano 1 jednostkę NIH trombiny. Jednoetapowy sposób krzepnięcia przeprowadzony zasadniczo zgodnie z Mikaelsson et al., 1983, Blood 62, str. 1006, wykorzystano do natychmiastowego oznaczania próbek pochodzących z mieszaniny reakcyjnej. W ciągu jednej minuty następującej po inaktywacji zaobserwowano 30-krotną aktywację. Modele aktywacja-dezaktywacja uzyskane dla trombiny były zgodne z przedstawianymi wcześniej badaniami nad oddziaływaniami trombiny z czynnikiem VIII (Fulcher et al., 1983, Blood, 61, str. 807, Andersson et al., 1986, - Proc. Natl. Acad. Sci., 83, str. 2979, Eaton et al., 1986, Biochemistry, 25, str. 505, Rotblat et al., 1985, Biochemistry, 24, str. 4294).
Przykład 7
Próba trwałości monometoksypolietyleno glikolowanego czynnika VIII w wyciągu z tkanki świń.
W celu oszacowania wpływu koniugacji mPEG na trwałość czynnika VIII w roztworze reprezentatywnym dla środowiska podskórnego, w teście in vitro wykorzystano wyciąg z tkanki świń. Dwa preparaty skoniugowanego z mPEG czynnika VIII przygotowano zgodnie z przykładem 3 oraz inkubowano w wyciągu i zanalizowano przy użyciu oznaczeń chromogenicznych ze względu na aktywność koagulantu po upływie 0, 2, 4, 6 i 24 godzin. Podczas pierwszych 6 godzin stopień koniugacji odpowiadał pozostałej aktywności.
185 821
Tabela V
Pozostała aktywność (%) Po upływie 0 godz. Pozostała aktywność (%) Po upływie 2 godz. Pozostała aktywność (%) Po upływie 4 godz. Pozostała aktywność (%) Po upływie 6 godz. Pozostała aktywność (%) Po upływie 24 godz.
Wyjściowy r-VIII SQ (kontrolny) 100 45 13 6 0
4.4 mPEG/rVIII 100 96 93 78 32
9.5 mPEG/rVIII 100 100 107 102 47
Rezultaty zamieszczone w tabeli V oraz na fig. 2 ukazują, że skoniugowanie z mPEG znacznie podnosi trwałość czynnika VIII.
Przykład 8
Badania nad przyswajalnościąpoliglikoloetylenowanego czynnika VIII u małp Cynomolgus.
Wykonano badanie farmakokinetyczne aby ocenić wpływ skoniugowania mPEG na trwałość in vivo czynnika VIII. Dwa preparaty skoniugowanego z mPEG czynnika VIII przygotowano zgodnie z przykładem 3 oraz ustalono ich aktywność właściwą, jak pokazano w tabeli VI. W celu zapewnienia wysokiej homogeniczności zderywatyzowanego materiału otrzymanego w wyniku procedury sprzęgania, frakcjonowanie każdego preparatu przeprowadzono poprzez dwukrotne sączenie molekularne. Wykorzystano kolumnę Superdex 200 PG XK 16/60 (sprzedawaną przez Pharmacia Biotech, Uppsala, Szwecja), zrównoważoną roztworem 19 mM L-histydyny, 0.31 M NaCl, 3.4 mM CaCl2, 0.02% Tween 80, pH 7.0. Zmniejszenie objętości roztworów czynnika VIII przed drugim sączeniem molekularnym przeprowadzono w zatężaczach Centriplus 30 z autoklawem lub w wirówce ultrafiltracyjnej (odcięcie przy 30 kDa, produkowanej przez Amicon Inc. MA, USA). Roztwory były zagęszczane trzykrotnie po 2500 g przez 45 min. Zebrane frakcje, otrzymane po drugim sączeniu molekularnym rozcieńczono następnie buforem przystosowanym do ostatecznej formy użytkowej; 19 mM L-histydyna, 0.31 M NaCl, 3.4 mM CaCl2, 0.02% Tween 80, 17.5 mM sacharoza, pH 7.0.
Ostatecznie roztwory białkowe przesączono wykorzystując 0.22 m filtry Millex GV (sprzedawane przez Millipore, MA, USA) a następnie napełniono nimi wysterylizowane w autoklawie butelki. Roztwory przechowywano do użycia w temperaturze -70°C.
Sześciu małpom Cynomolgus rodzaju żeńskiego przy różnych okazjach podawano dożylnie pojedyncze dawki Preparatu 1 o 250 IU/kg oraz podskórnie pojedyncze dawki Preparatu 1 oraz Preparatu 2 o 1500 IU/kg. Wszystkie roztwory przed podaniem były rozcieńczane 1:1 wodą do iniekcji. Miejscem iniekcji w podawaniu podskórnym była lewa bądź prawa część grzbietu zwierzęcia, natomiast w podawaniu dożylnym odpowiednio lewe bądź prawe żyły odpromieniowe. Nakłuwając żyłę udową pobrano próbki krwi od wszystkich zwierząt do probówek zawierających jako koagulant cytrynian sodu (10% całkowitej objętości) w następujących czasach po iniekcji:
Podawanie dożylne: 0 (przed podaniem), 0.25, 1, 2, 4, 8, 24, 30, 48 godz.
Podawanie podskórne: 0 (przed podaniem), 3, 6, 9, 12, 15, 24, 30, 48 godz.
Badania farmakokinetyczne nieskoniugowanego czynnika VIII przeprowadzono niezależnie z wykorzystaniem takiego samego gatunku. Dawki, droga podawania oraz wyniki (wartość średnia (odchylenie standardowe (SD))) zostały przedstawione w tabeli VI.
185 821
T a b e 1 a VI
Aktywność właściwa (IU/mg) Droga podawania Dawki (IU/kg) Okres połowicznego zaniku (godz.) Przyswajalność (F) (wartość średnia ± SD)
Nieskoniugowany r-VIII SQ 15000 I.V. 250 6.7 -
mPEG-rVnI Preparat 1 10000 I.V. 250 8.3 -
Nieskoniugowany r-VIL[SQ 15000 S. C. 2500 - 0.053 (0.021)
mPEG-rVIII Preparat 1 10000 S.C. 1500 - 0.22 (0.13)
mPEG-rVIII Preparat 2 6700 S.C. 1500 - 0.19 (0.15)
I.V.= podawanie dożylne
S.C.= podawanie podskórne
AUC (S.C.) * DAWKA (I.V.) } ~ AUC (I.V.) * DAWKA (S.C.) w którym AUC jest polem pod krzywą stężenia w osoczu od czasu.
Jak wynika z rezultatów zamieszczonych w tabeli VI podawanie podskórne preparatów skoniugowanego czynnika VIII z mPEG wykazuje znacznie większą przyswajalność w porównaniu do podawania nieskoniugowanego r-VIII SQ. Analizy statystyczne wykorzystujące test-t studenta wykazały, iż różnica jest znacząca.
185 821
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4.00 zł.

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób udoskonalania funkcji in vivo zrekombinowanego czynnika VIII SQ poprzez osłanianie wyeksponowanych miejsc wyżej wymienionego polipeptydu, znamienny tym, że
    a) unieruchamia się zrekombinowany czynnik VIII SQ przez interakcję ze swoistym wobec grupy niosącej anionowo-wymienne ligandy adsorbentem;
    b) aktywuje się biokompatybilny polimer;
    c) koniuguje się aktywowany biokompatybilny polimer z zewnętrznymi miejscami unieruchomionego zrekombinowanego czynnika VIII sQ, a następnie
    d) eluuje koniugat z adsorbenta.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność właściwa czynnika VIII SQ przed unieruchomieniem wynosi co najmniej 2000 IU/mg całkowitej ilości białka.
  3. 3. Sposób według zatrz. 2, znamienny tym, że aktywność właściwa czynnika VIIISQ przed unieruchomieniem zawiera się w przedziale od 5000 do 20000 IU/mg całkowitej ilości białka.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że aktywność czynnika VIII SQ przed unieruchomieniem wynosi co najmniej 2000 IU/ml.
  5. 5. Sposób według zatrz. 4, znamienny tym, że aktywność czynnika VIII SQ przed unieruchomieniem zawiera się w przedziale od 5000 do 50000 IU/ml.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 5, znamienny tym, że biokompatybilny polimer wybrany jest z grupy obejmującej homopolimery, kopolimery, lub kopolimery blokowe zawierające politlenki alkilenowe zakończone monoalkilem.
  7. 7. Sposób według zatrz. 6, znamienny tym, że stosuje się politlenek alkilenowy zakończony monoalkilem wybrany z grupy zawierającej homopolimery glikolu polietylenowego i homopolimery glikolu polipropylenowego.
  8. 8. Sposób według zatrz. 7, znamienny tym, że politlenkiem alkilenowym zakończonym monoalkilem jest glikol monometoksy- polietylenowy (mPEG).
  9. 9. Sposób według zatrz. 1 albo 2, albo 3, albo 5, albo 7, albo 8, znamienny tym, że ligand anionowymienny wybrany jest z grupy obejmującej czwartorzędową grupę metyloaminową, czwartorzędową grupę etyloaminową i trimetyloaminoetylową, lub ich mieszaniny.
PL96325958A 1995-09-29 1996-09-27 Sposób udoskonalania funkcji in-vivo zrekombinowanSposób udoskonalania funkcji in-vivo zrekombinowanego czynnika VIII SQego czynnika VIII SQ PL185821B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9503380A SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Protein derivatives
PCT/SE1996/001215 WO1997011957A1 (en) 1995-09-29 1996-09-27 Conjugates of a polypeptide and a biocompatible polymer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL325958A1 PL325958A1 (en) 1998-08-17
PL185821B1 true PL185821B1 (pl) 2003-08-29

Family

ID=20399642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL96325958A PL185821B1 (pl) 1995-09-29 1996-09-27 Sposób udoskonalania funkcji in-vivo zrekombinowanSposób udoskonalania funkcji in-vivo zrekombinowanego czynnika VIII SQego czynnika VIII SQ

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6048720A (pl)
EP (3) EP1260582B1 (pl)
JP (1) JP3911023B2 (pl)
AT (3) ATE283351T1 (pl)
AU (1) AU706246B2 (pl)
BR (1) BR9610695A (pl)
CA (1) CA2231801C (pl)
DE (3) DE69633952T2 (pl)
DK (3) DK1260582T3 (pl)
ES (3) ES2238522T3 (pl)
HU (1) HU221208B1 (pl)
NO (2) NO321096B1 (pl)
NZ (1) NZ319322A (pl)
PL (1) PL185821B1 (pl)
PT (3) PT871649E (pl)
SE (1) SE9503380D0 (pl)
WO (1) WO1997011957A1 (pl)
ZA (1) ZA968139B (pl)

Families Citing this family (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT405740B (de) * 1996-12-13 1999-11-25 Immuno Ag Von willebrand-faktor-derivat sowie ein verfahren zur isolierung von proteinen
TR200101751T2 (tr) * 1998-04-28 2002-05-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Poliol-IFN-beta konjugatları
US7425541B2 (en) * 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
CA2634663C (en) 1999-02-22 2009-08-25 University Of Connecticut Novel albumin-free factor viii formulations
US6635676B2 (en) * 1999-04-28 2003-10-21 Regents Of The University Of Michigan Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use
US7655252B2 (en) 1999-04-28 2010-02-02 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial nanoemulsion compositions and methods
IT1318484B1 (it) * 2000-04-21 2003-08-25 Univ Roma Derivati di colina per il trattamento della malattia di alzheimer.
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
US6423826B1 (en) * 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
US7160540B2 (en) 2000-06-30 2007-01-09 Regents Of The University Of Minnesota Methods for detecting activity of clottings factors
AU2001279301A1 (en) * 2000-07-07 2002-01-21 Leonid Z. Iakoubov Biologically active protein conjugates formed by first protecting active site
AU2002225681A1 (en) * 2000-11-15 2002-05-27 Globe Immune, Inc. Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof
JP2010209109A (ja) * 2001-06-25 2010-09-24 Regents Of The Univ Of Michigan 抗微生物ナノエマルジョンの組成物および方法
ATE468862T1 (de) * 2001-07-11 2010-06-15 Maxygen Inc G-csf konjugate
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US8008252B2 (en) * 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
EP2042196B1 (en) * 2001-10-10 2016-07-13 ratiopharm GmbH Remodelling and glycoconjugation of Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
SE0104186D0 (sv) * 2001-12-12 2001-12-12 Darcy Birse Method and device
DK3025726T3 (da) * 2002-01-18 2019-12-09 Biogen Ma Inc Polyalkylenpolymerforbindelser og anvendelser deraf
US20030149246A1 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Russell John C. Macromolecular conjugates and processes for preparing the same
JP2005526505A (ja) * 2002-03-02 2005-09-08 エフ．ホフマン−ラ　ロシュ　アーゲー ヒトゲラチナーゼａのｃドメイン及びポリエチレングリコールの接合体、その精製方法及び使用
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
ES2544527T3 (es) 2002-07-31 2015-09-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de fármacos y su uso para tratar el cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa
WO2004075923A2 (en) * 2003-02-26 2004-09-10 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor viii moiety conjugates
US7217794B2 (en) * 2003-04-02 2007-05-15 Daiamed, Inc. Compounds and methods for treatment of thrombosis
NZ542586A (en) 2003-04-09 2009-11-27 Biogenerix Ag Method of forming a covalent conjugate between a G-CSF peptide and PEG
WO2006127896A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP1626983B8 (en) * 2003-05-12 2010-12-22 Affymax, Inc. Novel poly (ethylene glycol) modified erythropoietin agonists and uses thereof
US7947261B2 (en) 2003-05-23 2011-05-24 Nektar Therapeutics Conjugates formed from polymer derivatives having particular atom arrangements
ES2725808T3 (es) * 2003-05-23 2019-09-27 Nektar Therapeutics Derivados de PEG que contienen dos cadenas de PEG
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
EP3434275A1 (en) 2003-11-06 2019-01-30 Seattle Genetics, Inc. Assay for cancer cells based on the use of auristatin conjugates with antibodies
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
AU2004296860B2 (en) * 2003-12-03 2010-04-22 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US20050171002A1 (en) * 2004-02-03 2005-08-04 Mohanty Dillip K. Polyoxyalkylene compound and method for making
US7425539B2 (en) 2004-03-19 2008-09-16 Baxter International Inc. Factor IXa for the treatment of bleeding disorders
ZA200609930B (en) * 2004-06-08 2009-01-28 Alza Corp Macromolecular peg conjucates by four-component condensation
CA2571292C (en) 2004-06-30 2013-05-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor ix moiety conjugates
AU2014280936B2 (en) * 2004-06-30 2016-12-15 Nektar Therapeutics Polymer-factor ix moiety conjugates
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
WO2006039326A2 (en) * 2004-09-29 2006-04-13 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Inhibitors of hepatitits c virus
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
AU2012203813B2 (en) * 2004-11-12 2013-10-24 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
AU2016203693B2 (en) * 2004-11-12 2018-08-23 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
KR101468345B1 (ko) 2004-11-12 2014-12-03 바이엘 헬스케어 엘엘씨 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
AU2013203348B2 (en) * 2004-11-12 2016-03-03 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of FVIII
JP2008519863A (ja) * 2004-11-12 2008-06-12 シアトル ジェネティクス インコーポレイティッド Ｎ末端にアミノ安息香酸単位を有するオーリスタチン
BRPI0519562A2 (pt) * 2004-12-27 2009-01-27 Baxter Int construÇço proteinÁcea, complexo, mÉtodo para prolongar a meia-vida in vivo de fator viii (fviii) ou um derivado biologicamente ativo do mesmo composiÇço farmacÊutica, e, mÉtodo para formar uma construÇço proteinÁcea
US9029331B2 (en) 2005-01-10 2015-05-12 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006076471A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
WO2007008848A2 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
JP5171621B2 (ja) 2005-07-07 2013-03-27 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド フェニルアラニン側鎖修飾をｃ末端に有するモノメチルバリン化合物
US7395967B2 (en) * 2005-07-21 2008-07-08 University Of Washington Methods and systems for counterbalancing a scanning beam device
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
US7750116B1 (en) 2006-02-18 2010-07-06 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugate metabolites
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
KR20080108147A (ko) 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US20080242607A1 (en) 2006-07-21 2008-10-02 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
BRPI0717505B8 (pt) * 2006-10-04 2021-05-25 Novo Nordisk As conjugado de peptídeo e formulação farmacêutica
AU2007333049B2 (en) 2006-12-15 2014-02-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Factor VIIa-(poly)sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
CA2673459C (en) 2006-12-22 2016-09-13 Stefan Schulte Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
MX2009007145A (es) 2006-12-27 2009-08-27 Nektar Therapeutics Al Corp Conjugados de polimero con factor viii y factor de von willebrand que tienen una ligadura liberable.
NZ577397A (en) * 2006-12-27 2012-01-12 Nektar Therapeutics Factor ix moiety-polymer conjugates having a releasable linkage
CN101796063B (zh) 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
JP5401446B2 (ja) * 2007-04-26 2014-01-29 バイエル ヘルスケア エルエルシー 凍結貯蔵を目的とした、組み換えタンパク質溶液の安定化
US8747872B2 (en) 2007-05-02 2014-06-10 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
US9493499B2 (en) 2007-06-12 2016-11-15 Novo Nordisk A/S Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography
AU2008261261B2 (en) * 2007-06-13 2013-06-27 Csl Behring Gmbh Use of VWF stabilized FVIII preparations and of VWF preparations without FVIII for extravascular administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders
ES2528922T3 (es) 2007-07-16 2015-02-13 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-CD79b humanizados e inmunoconjugados y métodos de uso
ATE543835T1 (de) 2007-07-16 2012-02-15 Genentech Inc Anti-cd79b-antikörper und immunkonjugate und anwendungsverfahren
US20090035848A1 (en) * 2007-08-03 2009-02-05 Robert Hickey Moving bed biofilm reactor (mbbr) system for conversion of syngas components to liquid products
AU2008323768A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Baxter Healthcare S.A. Modified recombinant Factor VIII and von Willebrand Factor and methods of use
PT2247620T (pt) 2008-01-31 2016-08-23 Genentech Inc Anticorpos e imunoconjugados anti-cd79b e métodos de utilização
DK2257311T3 (da) 2008-02-27 2014-06-30 Novo Nordisk As Konjugerede Faktor VIII-Molekyler
AU2009256093A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Bayer Healthcare Llc FVIII muteins for treatment of von Willebrand disease
DK2865760T3 (en) 2008-06-24 2018-01-15 Csl Behring Gmbh Factor VIII, Von Willebrand Factor or complexes thereof with extended in vivo half-life
AU2009303368B2 (en) * 2008-10-15 2012-04-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Pegylation of recombinant blood coagulation factors in the presence of bound antibodies
KR20110093775A (ko) * 2008-11-03 2011-08-18 바이엘 헬스케어 엘엘씨 혈우병 치료 방법
EP2385825B1 (en) 2008-11-07 2018-10-10 University of Connecticut Factor viii formulations
EP2376089B1 (en) 2008-11-17 2018-03-14 The Regents of the University of Michigan Cancer vaccine compositions and methods of using the same
CN108530543B (zh) 2009-02-03 2023-06-23 阿穆尼克斯制药公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
WO2011012850A2 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8637640B2 (en) * 2009-07-27 2014-01-28 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
RU2744370C2 (ru) 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
CN102741275B (zh) 2009-08-24 2016-08-03 阿穆尼克斯运营公司 凝血因子ix组合物及其制备和使用方法
WO2011069164A2 (en) 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
EP4450523A3 (en) 2010-04-02 2025-03-12 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
HRP20191305T1 (hr) 2010-07-09 2019-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Preradive jednolančane molekule i polipeptidi izrađeni koristeći iste
EP3508573A1 (en) 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
EP2651433A1 (en) * 2010-12-16 2013-10-23 Novo Nordisk A/S Aqueous factor viii solution
PL2654794T3 (pl) 2010-12-22 2020-07-27 Baxalta GmbH Materiały i sposoby sprzęgania rozpuszczalnej w wodzie pochodnej kwasu tłuszczowego z białkiem
CA2838833A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
AU2012282875B2 (en) 2011-07-08 2016-04-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
WO2013016454A1 (en) 2011-07-25 2013-01-31 Biogen Idec Hemophilia Inc. Assays to monitor bleeding disorders
EP2804623B1 (en) 2012-01-12 2019-08-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof
SMT201800586T1 (it) 2012-01-12 2019-01-11 Bioverativ Therapeutics Inc Riduzione dell'immunogenicita' contro il fattore viii negli individui che si sottopongono alla terapia con fattore viii
EP2822577B1 (en) 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
LT3564260T (lt) 2012-02-15 2023-01-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Viii faktoriaus kompozicijos ir jų gamybos bei panaudojimo būdai
WO2013120939A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Csl Behring Gmbh Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
CA2865578C (en) 2012-02-27 2023-01-17 Amunix Operating Inc. Xten conjugate compositions and methods of making same
GB201910190D0 (en) * 2012-04-16 2019-08-28 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Optimised subsutaneous therapeutic agents
WO2013083858A1 (en) 2012-04-24 2013-06-13 Novo Nordisk A/S Compounds suitable for treatment of haemophilia
AU2013270682A1 (en) 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Procoagulant compounds
EP2863940A4 (en) 2012-06-08 2016-08-10 Biogen Ma Inc Chimeric clotting factors
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
CN110054699A (zh) 2012-07-11 2019-07-26 比奥贝拉蒂治疗公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
US10001495B2 (en) 2012-07-25 2018-06-19 Bioverativ Therapeutics Inc. Blood factor monitoring assay and uses thereof
US10391152B2 (en) 2012-10-18 2019-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP3446700A1 (en) 2012-10-30 2019-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
AU2012395148B2 (en) 2012-11-24 2016-10-27 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
FI3889173T3 (fi) 2013-02-15 2023-10-02 Bioverativ Therapeutics Inc Optimoitu tekijä viii:n geeni
TWI828269B (zh) 2013-03-15 2024-01-01 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ix多肽調配物
ES2926798T3 (es) 2013-03-15 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc Formulaciones de polipéptido de factor VIII
ES2657291T3 (es) 2013-04-22 2018-03-02 Csl Ltd. Un complejo covalente de factor de von Willebrand y factor VIII asociado por un puente disulfuro
MX2015016567A (es) 2013-06-28 2016-03-31 Biogen Ma Inc Enlazador escindible por trombina con xten y usos del mismo.
WO2015021423A2 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Purification of chimeric fviii molecules
TWI667255B (zh) 2013-08-14 2019-08-01 美商生物化學醫療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
WO2015070014A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant fusion compound
EP3082848B1 (en) 2013-12-06 2023-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
SG11201605242YA (en) 2014-01-10 2016-07-28 Biogen Ma Inc Factor viii chimeric proteins and uses thereof
EP3102589A1 (en) 2014-02-04 2016-12-14 Biogen MA Inc. Use of cation-exchange chromatography in the flow-through mode to enrich post-translational modifications
FI3122757T3 (fi) 2014-02-28 2023-10-10 Hangzhou Dac Biotech Co Ltd Varautuneita linkkereitä ja niiden konjugointikäyttötapoja
WO2016004113A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Biogen Ma Inc. Optimized factor ix gene
BR112016030950A2 (pt) 2014-07-02 2018-03-27 Csl Ltd polipeptídeo modificado que se liga ao fator viii, complexo, composição farmacêutica, métodos para tratar uma coagulopatia, para produzir um polipeptídeo que compreende um vwf modificado e para aumentar a afinidade de ligação ao fator viii do vwf e a meia-vida do fator viii, uso de um polipeptídeo modificado ou de um complexo, polinucleotídeo, plasmídeo ou vetor, e, célula hospedeira.
DK3262071T3 (da) 2014-09-23 2020-06-15 Hoffmann La Roche Fremgangsmåde til anvendelse af anti-CD79b-immunkonjugater
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
CA2978374A1 (en) 2015-03-06 2016-09-15 Csl Behring Recombinant Facility Ag Modified von willebrand factor having improved half-life
SG10201910896UA (en) 2015-05-22 2020-01-30 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
US10772936B2 (en) 2015-05-22 2020-09-15 CSL Behring Lengnau AG Methods for preparing modified von Willebrand factor
CA2989269C (en) 2015-06-15 2020-09-22 Robert Yongxin Zhao Hydrophilic linkers for conjugation of a cytotoxic agent or chromophore molecule to a cell-binding molecule
EP3319936B1 (en) 2015-07-12 2025-12-17 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Bridge linkers for conjugation of cell-binding molecules
US9839687B2 (en) 2015-07-15 2017-12-12 Suzhou M-Conj Biotech Co., Ltd. Acetylenedicarboxyl linkers and their uses in specific conjugation of a cell-binding molecule
IL257231B (en) 2015-08-03 2022-09-01 Bioverativ Therapeutics Inc Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
TWI823830B (zh) 2015-11-13 2023-12-01 日商武田藥品工業股份有限公司 用於ａ型血友病基因治療之編碼表現增加之重組ｆｖｉｉｉ變異體之病毒載體
CN116479001A (zh) 2015-11-13 2023-07-25 武田药品工业株式会社 用于血友病a的基因治疗的具有增加的表达的编码重组fviii变体的病毒载体
AU2017205776B2 (en) 2016-01-07 2020-09-10 CSL Behring Lengnau AG Mutated von Willebrand factor
MX2018008337A (es) 2016-01-07 2018-09-17 CSL Behring Lengnau AG Factor de von willebrand truncado mutado.
KR20180118659A (ko) 2016-02-01 2018-10-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 최적화된 viii 인자 유전자
JP6877469B2 (ja) 2016-06-24 2021-05-26 モガム・インスティテュート・フォー・バイオメディカル・リサーチＭｏｇａｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｖｉｉｉおよびｖｗｆ因子を含むキメラタンパク質、ならびにそれらの使用
TW201828974A (zh) 2016-11-11 2018-08-16 瑞士商Ｃｓｌ貝林重組技能公司 用於血管外施予以治療或預防凝血疾病之截短型類血友病因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）多肽類
KR20190085021A (ko) 2016-11-11 2019-07-17 체에스엘 베링 렝나우 아게 혈우병을 치료하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드
AU2016429272A1 (en) 2016-11-14 2019-05-02 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Conjugation linkers, cell binding molecule-drug conjugates containing the likers, methods of making and uses such conjugates with the linkers
JP2019536794A (ja) 2016-12-02 2019-12-19 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
BR112020002394A2 (pt) 2017-08-09 2020-07-28 Bioverativ Therapeutics Inc. moléculas de ácidos nucleicos e usos das mesmas
AU2019215063B2 (en) 2018-02-01 2025-10-16 Bioverativ Therapeutics, Inc. Use of lentiviral vectors expressing Factor VIII
WO2019195055A1 (en) 2018-04-04 2019-10-10 Sigilon Therapeutics, Inc. Implantable particles and related methods
SI3793588T1 (sl) 2018-05-18 2025-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Postopki zdravljenja hemofilije A
KR20210034013A (ko) 2018-07-16 2021-03-29 박스알타 인코퍼레이티드 발현이 증가된 재조합 fviii 변이체들을 인코딩하는 바이러스 벡터를 이용한 혈우병의 유전적 치료법
KR102925832B1 (ko) 2018-08-09 2026-02-11 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 핵산 분자 및 비바이러스 유전자 치료를 위한 이의 용도
UY38389A (es) 2018-09-27 2020-04-30 Sigilon Therapeutics Inc Dispositivos implantables para terapia celular y métodos relacionados
TWI851647B (zh) 2019-01-16 2024-08-11 日商武田藥品工業股份有限公司 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體
BR112021025426A2 (pt) 2019-06-19 2022-06-21 Bioverativ Therapeutics Inc Fator recombinante viii-fc para tratamento de hemofilia e baixa densidade mineral óssea
US12403164B2 (en) 2019-09-30 2025-09-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Lentiviral vector formulations
CN114981299A (zh) 2019-12-12 2022-08-30 武田药品工业株式会社 使用编码具有增加的表达的重组fviii变体的病毒载体的a型血友病的基因疗法
KR20230074703A (ko) 2020-06-24 2023-05-31 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 유리 인자 viii을 상기 단백질이 발현되도록 변형된 렌티바이러스 벡터의 제제로부터 제거하는 방법
US20240269241A1 (en) 2021-06-14 2024-08-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
IL310997A (en) 2021-08-23 2024-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc Factor VIII gene optimization
EP4408874A1 (en) 2021-09-30 2024-08-07 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acids encoding factor viii polypeptides with reduced immunogenicity
CN117980327A (zh) 2021-11-03 2024-05-03 杭州多禧生物科技有限公司 抗体的特异性偶联
CN120035657A (zh) 2022-10-11 2025-05-23 西吉隆医疗股份有限公司 用于治疗疾病的经工程化的细胞和可植入元件
TW202517669A (zh) 2023-07-05 2025-05-01 日商武田藥品工業股份有限公司 用於Ａ型血友病之基因療法的編碼表現增加之重組ＦＶｌｌｌ變異體的病毒載體

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59172425A (ja) * 1983-03-18 1984-09-29 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤
US4970300A (en) * 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
SE8501050D0 (sv) * 1985-03-05 1985-03-05 Kabivitrum Ab Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof
DE3717210C2 (de) * 1987-05-22 1993-11-25 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
SE465222C5 (sv) * 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
WO1992016555A1 (en) * 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5169627A (en) * 1991-10-28 1992-12-08 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Oral pharmaceutical composition containing a polyethylene glycol-immunoglobulin G conjugate for reconstitution of secretory immunity and method of reconstituting secretory immunity
GB9225448D0 (en) * 1992-12-04 1993-01-27 Erba Carlo Spa Improved synthesis of polymer bioactive conjugates
WO1994015625A1 (en) * 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
PT871649E (pt) 2003-04-30
BR9610695A (pt) 1999-07-06
ATE228531T1 (de) 2002-12-15
ES2236396T3 (es) 2005-07-16
DE69634373D1 (de) 2005-03-24
DE69625085D1 (de) 2003-01-09
DE69633952T2 (de) 2006-03-02
EP1258497A2 (en) 2002-11-20
ES2238522T3 (es) 2005-09-01
EP1260582B1 (en) 2004-11-24
JPH11513378A (ja) 1999-11-16
EP1258497A3 (en) 2002-11-27
CA2231801A1 (en) 1997-04-03
NO981408L (no) 1998-03-27
NO981408D0 (no) 1998-03-27
HUP9901203A2 (hu) 1999-07-28
NO20051950L (no) 1998-03-27
ZA968139B (en) 1997-05-29
AU706246B2 (en) 1999-06-10
PT1258497E (pt) 2005-06-30
WO1997011957A1 (en) 1997-04-03
ES2187676T3 (es) 2003-06-16
PL325958A1 (en) 1998-08-17
NO321096B1 (no) 2006-03-13
HUP9901203A3 (en) 2000-02-28
EP0871649B1 (en) 2002-11-27
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29
HU221208B1 (en) 2002-08-28
DE69633952D1 (de) 2004-12-30
DE69634373T2 (de) 2005-12-29
DK0871649T3 (da) 2003-03-24
CA2231801C (en) 2010-07-27
ATE289321T1 (de) 2005-03-15
EP1258497B1 (en) 2005-02-16
AU7151796A (en) 1997-04-17
DE69625085T2 (de) 2003-07-17
ATE283351T1 (de) 2004-12-15
PT1260582E (pt) 2005-03-31
DK1260582T3 (da) 2005-03-29
DK1258497T3 (da) 2005-06-06
EP1260582A1 (en) 2002-11-27
US6048720A (en) 2000-04-11
EP0871649A1 (en) 1998-10-21
NZ319322A (en) 1998-08-26
JP3911023B2 (ja) 2007-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3911023B2 (ja) ポリペプチドと生体適合性ポリマーとのコンジュゲート
CN103102406B (zh) Fviii的位点定向修饰
JP3495365B2 (ja) ブタ第ｖｉｉｉ因子ａ２ドメインをコードするｄｎａ
CN103497246B (zh) 缀合的因子viii分子
US4743680A (en) Method for purifying antihemophilic factor
EP0792281B1 (en) Process for purification of factor viii
FI106721B (fi) Menetelmä ihmisen standardisoidun, korkean puhtauden omaavan von Willebrand -tekijän konsentraatin valmistamiseksi
US20020019036A1 (en) Von willebrand factor derivatives and methods of isolating proteins that bind to von willebrand factor
Podlasek et al. Streptokinase binds to lactate dehydrogenase subunit-M, which shares an epitope with plasminogen.
MXPA98002416A (es) Conjugados de un polipeptido y un polimero biocompatible