JP4077514B2 - サイクリン依存キナーゼ結合性化合物 - Google Patents

Description

発明の属する分野
本発明は、サイクリン依存キナーゼ（cdk）に結合する特性を有する物質（substances）、特に、p16タンパク質のフラグメントの分析から導かれたこの特性を有する物質に関する。また本発明は、これらの物質を含む製薬組成物、及びそれらの医療処置方法における、特に過剰増殖疾患の処置における使用にも関する。また本発明は、これらの物質の、関連する活性を具備する化合物の同定における方法または使用にも関する。
発明の背景
Rb遺伝子産物（pRb）の、サイクリン依存キナーゼ（cdk）ファミリーの成員によるリン酸化は、有糸分裂を受ける細胞コミットメントにおいて重要な段階である。この段階は、細胞周期のＧ１相後期に調節され、抑制（R）点として知られている（6）。cdkは鍵となる調節因子であり、それを介して、正及び負に作用する両方の細胞シグナル導入因子が合流される。有糸分裂促進刺激は、Ｇ１後期におけるpRbリン酸化が可能なＤ-サイクリンとcdk4またはcdk6の間の活性複合体を誘発する。これらのキナーゼは、接触阻害、成長因子飢餓又はＴＮＦ-βから生ずる細胞成長阻害シグナルの標的でもある。この阻害シグナルは、キナーゼまたはサイクリン−キナーゼ複合体のいずれかを直接妨害するINK4及びp21/KIP cdk阻害剤の２つの速やかに延長されるファミリーの異なる成員の産生または活性を誘発することにより、キナーゼ活性をブロックしうる（7）。これまでに同定されているINKタンパク質のファミリーは、p15、p16、p18及びp19である（20、22、23）。
しかしながら、p53転写刺激（8）を介する腫瘍抑制活性に間接的に結合したp21^Cipl/WAF1とは異なり、INK4p16遺伝子は、多数のヒト腫瘍においてそれ自身が欠失又は突然変異している（9-15）。INK4p16における生殖系列突然変異は、黒色腫発育の危険の増大を伴う（9、10）。INK4p16の１５６アミノ酸産物は、CDKN2またはp16 INK4a（この出願では、”p16”と呼称する）として知られている。
発明の概要
我々は、cdk4及びcdk6といったサイクリン依存キナーゼ（cyclin dependent kinase）と相互作用するp16の領域を同定し研究することを開始し、これらの特性、特にp16のこの領域に基づくペプチドを有する物質によるcdk類の結合が、Rbタンパク質のリン酸化を阻害することによる腫瘍抑制に使用できる可能性を試した。
小さなペプチドは、タンパク質−タンパク質相互作用及び生物学的活性に含まれるタンパク質の領域を同定するのに強力な道具になることがる（16-19）。この発明において、我々は、p16アミノ酸配列に渡ってオーバーラップする一連の２０アミノ酸（aa）ペプチドを合成紙、ビオチニル化した各ペプチドの、ラビット網状赤血球溶解物中で発現した³⁵Ｓ−ラベルしたcdk4及びcdk6と相互作用する能力を試験した。
これらの実験により、cdk4及びcdk6と相互作用し、cdk4−サイクリンＤ１に媒介されたin vitroでのRbタンパク質のリン酸化を阻害するp16の残基８４から１０３に相当する２０アミノ酸の合成ペプチドが同定された。アラニン置換の連続により、cdk4及びcdk6相互作用並びにRbリン酸化の阻害にとって重要なアミノ酸残基が決定された。この出願では、p16の残基８４から１０３は、図１Ｃの最初に記載した配列、即ち、DAAREGFLDTLVVLHRAGARに相当する。
さらに、小さなペプチドキャリア分子と結合し、組織培養媒質に直接適用したとき、p16誘導ペプチドは、血清餓死ヒトTaCaT細胞及び平常にサイクルする他のタイプの細胞の両方において、細胞周期のＳ相へ入ることをブロックする。これは、in vivoでのpRbリン酸化の阻害を伴う。これらの結果は、小さなキャリア分子に結合したp16由来合成ペプチドが、全長p16タンパク質の過剰発現に伴うＧ１相抑制を擬態できることを示している。
従って、第１の態様において、本発明は、サイクリン依存キナーゼ（cdk）に結合する特性を有する物質であって、
(i)全長p16タンパク質のアミノ酸残基８４から１０３、あるいは、その活性部分または誘導体を含むペプチド、または、
(ii)そのフラグメント、活性部分または誘導体の機能的類似物を含有し、
全長p16、p15、p18及びp19タンパク質以外である物質を提供する。
好ましくは、サイクリン依存タンパク質（cdk）はcdk4またはcdk6である。また、この物質は、cdkとサイクリンＤとの間に形成された複合体によって媒介されるRbリン酸化を阻害する特性を有する。さらに、これは細胞がＳ相に入ることを阻止することによる細胞分化のブロックに使用できる。これらの物質はサイクリン依存キナーゼに結合するので、cdk類とサイクリンＤとの複合体の形成を阻止するのにも使用でき、細胞中でのサイクリンＤレベルを向上させるさらなる生物学的効果も有する。cdk4及びcdk6に依存するpRbのリン酸化のブロッキングと同様に、ここに述べる物質は、pRbファミリーの成員であるp107及びp103、又は、cdk4及びcdk6媒介調節の標的である他の基質を含む他の細胞物質を標的とすることもできる。
本発明において、「活性部分」は、上記フラグメントの全長アミノ酸配列より短いが、サイクリン依存キナーゼ（cdk）に結合する特性は保持しているペプチドの部分を意味する。好ましくは、このペプチドは、pRbリン酸化の阻害特性も有する。
本発明では、「誘導体」は、タンパク質のアミノ酸配列を、例えば、該タンパク質をコードする拡散の操作、又は該タンパク質自体を変化させることにより、変えることによって修飾したタンパク質である。天然アミノ酸配列のそのような誘導体は、１又はそれ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失又は置換を含むが、当該タンパク質に必要な活性を根本的に変えることはない。一例として、９２位のアスパラギン酸がアラニンに置換されたペプチド６は、cdk4及びcdk6への結合においてペプチド６（残基８４から１０３）より強いことがわかり、pRbリン酸化をより阻害する。他の誘導体は、アミノ酸モチーフFLDとLVVLの間に１又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入を含む。
本発明では、「機能的類似物（functional mimetic）」は、p16アミノ酸配列のフラグメントまたは活性部分を含まなくてもよく、ペプチドでなくてもよいが、p16フラグメントの一部又は全部の特性、特に、サイクリン依存タンパク質への結合及び／またはpRbリン酸化の阻害特性を有する物質を意味する。
好ましい実施態様では、ペプチドは、全長p16タンパク質の残基８９から９７を含む。より好ましくは、ペプチドは、全長p16タンパク質のアミノ酸残基９０から９２に相当するアミノ酸モチーフFLD、及び／または、全長p16タンパク質のアミノ酸残基９４から９７に相当するLVVLを含む。また、我々は、
ペプチドのＤ及びＬ異性体の両方が、cdkへの結合及び／またはpRbリン酸化阻害特性を持つことを見出した。
さらなる態様では、本発明は、キャリア分子に結合した上記の物質を含む化合物であって、in vivoで当該化合物を細胞に輸送可能にした化合物を提供する。一実施態様では、キャリア分子は、アンテナペディア（Antennapedia）のホメオドメインから誘導された１６aaペプチド配列（例えば、ペネトラチン（Penetratin）という名前で販売されているもの）であり、上記の物質の１つと末端Cys残基を介して結合できる。ペネトラチン分子及びその特性は、WO 91/18981に記載されている。
さらなる実施態様では、上記ペプチドの１つを含む物質は、他のペプチド配列に結合することによって安定化される。好ましくは、これにより、ペプチドは、全長p16により類似したコンホメーションを持ち、典型的には、例えば、ペプチドフラグメントが全長p16に近接したあるいは超越した活性をゆうするといった、該ペプチドの活性を非結合ペプチドに比較して向上させるという利点を持つ。
さらなる態様では、本発明は、上記の物質の１つ又はそれ以上を含む製薬組成物、及びその組成物の医療処置方法における使用を提供する。好ましい実施態様では、本発明は、これらの物質の、ガン、乾癬または動脈発生（arteriogenesis）といった過剰増殖疾患の処置用医薬の調製における使用に関する。特に、p16陰性またはcdkの過剰発現を伴う癌は、上記物質の１つ又はそれ以上を含む組成物に格別に良好に反応するようである。
本発明の製薬組成物、及び本発明の使用は、上記の物質の１つに加えて製薬上許容される賦形剤、キャリア、バッファ、安定化剤、またはこの分野で当業者に知られている他の材料を含んでいてもよい。そのような材料は、非毒性でなければならず、活性成分の有効性を阻害してはならない。キャリア又は他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔、筋肉内、腹膜間経路に依存する。そのような投与について、腸管外に許容される水溶液が用いられ、それは発熱因子を含まず、安定したｐＨ、等張性及び安定性を有する。当業者は、適当な溶液を調製することができるであろう。必要ならば、保存剤、安定化剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤を含んでもよい。投与レベルは、当業者によって、処置すべき疾患、個々の患者の状態、運ばれる部位、投与方法および実務者に知られた他の要因を考慮して決定される。上記の技術及びプロトコールは、RemingtonのPharmaceutical Science,16th edition, Osol, A.(ed), 1980に見出すことができる。
また、物質がタンパク質である実施態様では、本発明は、これらのタンパク質をコードする核酸も提供する。当業者は、ここに開示されたアミノ酸配列から、核酸配列を発現するのに用いられるホストのコドン優先などの要因を考慮して、そのような核酸配列を容易に構成することができる。本発明の、タンパク質がキャリアタンパク質に結合した実施態様では、キャリアタンパク質をコードする核酸は、ペプチドをコードする配列に結合されていてもよく、その配列は融合物として発現される。
さらなる態様では、本発明は上記の核酸を取り込んだベクター、及び、そのベクターで形質転換されたホストを提供する。
さらなる態様において、本発明は、上記の物質の、(i)前記物質の生物学的活性の１又はそれ以上を有する化合物、または、(ii)前記物質の結合パートナーである化合物、例えば、p16またはp16類似物に特異的な抗体または相補的配列をスクリーニングする方法における使用を提供する。好ましくは、その物質はp16タンパク質のペプチドフラグメントである。類似物又は結合パートナーのスクリーニング方法の例は、
(a)p16フラグメントを個体基質上に固定化し、当該基質をラベル化ペプチドまたは他の候補となる化合物のライブラリに曝し、次いで、該ペプチドまたは候補化合物のp16フラグメントへの結合を検出すること；
(b)ラベルしたcdk及びラベルしない候補化合物またはペプチドを用いること；
(c)固相基質の他の組み合わせ及び結合測定；
(d)p16タンパク質のフラグメント及び該フラグメントから生じた抗体を用いたウェスタンブロット及び候補化合物による抗体の置換の測定；
(e)p16ペプチドまたはp16フラグメントから誘導されたオリゴヌクレオチドに結合する候補ペプチドを検出するための酵母２ハイブリッドスクリーンの使用（酵母２ハイブリッドスクリーンの説明は、我々の先願WO96/14334参照）；
(f)フラグメントまたは候補化合物がRbのリン酸化を阻害及び／又は周期からの細胞の阻止をするか否かを決定するための細胞系におけるp16タンパク質のフラグメント及び／又は候補化合物の使用；
(g)フラグメントまたは候補化合物が腫瘍の発生の阻害、腫瘍サイズの縮小、腫瘍成長の阻害及び／又は腫瘍細胞移動の阻害をするか否かを決定するための腫瘍成長の動物モデルにおけるp16タンパク質のフラグメント及び／又は候補化合物の使用を含む。
さらなる態様において、本発明は、上記の物質の１つと競合する化合物を同定する方法を提供し、この方法は、
(a)予め設定した量の検出可能なラベルをした物質をサイクリン依存キナーゼ（cdk）に結合させ、
(b)候補となる化合物を添加し、そして、
(c)cdkに結合したままのレベル化合物の量、あるいは、候補となる化合物で置換されたラベル化合物の量を測定することを含んでなる。
さらなる態様で、本発明は、上記の物質の１つと類似物を同定する方法を提供し、この方法は、
(a)１またはそれ以上の候補となる化合物を個体基質上に固定化し、
(b)該基質をラベル化サイクリン依存キナーゼ（cdk）に曝し、
(c)cdkに結合した候補化合物を選択することを含んでなる。
上記の態様で、好ましくは、サイクリン依存キナーゼが、cdk4またはcdk6である。好ましくは、この物質はp16タンパク質であり、より好ましくは、前述のFLD及びLVVLモチーフである。便宜的に、候補化合物は合成結合ライブラリ（synthetic combinatorial library）から選択できる。
本発明は、候補化合物のpRbリン酸化の阻害特性について試験すること、及び／または該化合物の細胞がＳ相へ入ることを阻害する特性について試験することを更に含んでもよい。
さらなる態様では、本発明は、全長p16タンパク質のアミノ酸残基９０から９２に相当するアミノ酸モチーフFLD、及び／または、全長p16タンパク質のアミノ酸残基９４から９７に相当するLVVLを含むp16タンパク質のフラグメントの、前記アミノ酸モチーフの三次元構造に類似するようにモデル化された有機化合物の設計における使用であって、当該有機化合物が、サイクリン依存タンパク質に結合する、及び／またはpRbリン酸化を阻害する特性を有する使用を提供する。
周知の製薬的に活性な化合物の類似物の設計は、「先行（lead）」化合物に基づく製薬の開発で既知の方法である。これは、活性化合物を合成するのが困難または高価である場合、あるいは、特定の投与方法に不適である場合に好適であり、例えば、ペプチドは、消化管内でプロテアーゼによって即座に分解され易いので経口組成物の活性成分としては不適である。類似物の設計、合成及び試験は、一般に、目的とする特性のための多数の分子のスクリーニングを避けるようにされる。
与えられた目的とする特性を有する化合物からの類似物の設計において共通に用いられる数種の工程がある。第１に、化合物の目的とする特性を決定するのに決定的及び／又は重要な特定の部分が同定される。ペプチドの場合、そのペプチドのアミノ酸残基を系統的に換えることにより、例えば、各残基を順番に置換することにより行うことができる。これらの部分又は残基は、その「薬物中心（pharmacophore）」として知られる活性領域である。
薬物中心が見出されれば、その構造は、例えばスペクトル技術、Ｘ線回折データ及びＮＭＲ等の広範な情報源からのデータを用いた、例えば、立体化学、結合、大きさ及び／又は電荷等のその物理的特性に従ってモデル化できる。このモデル化工程には、（原子間の結合ではなく、薬物中心の電荷及び／又は容量をモデル化する）コンピュータ分析類似性マッピング、及び他の技術も用いることができる。
この方法の変形例では、リガンド及びその結合パートナーの三次元構造がモデル化される。これは特に、リガンド及び／又は結合パートナーが、結合時にコンホメーションを変える場合に有用であり、類似物の設計において、このことを考慮したモデルを作ることができる。
次いで、テンプレート分子が選択され、その上に、薬物中心に類似させる化学基がグラフトされる。テンプレート分子及びその上にグラフトされた化学基は、従来から、類似物の合成が容易で、製薬上許容され、in vivoで分解しない一方、先行化合物の生物学的活性を保持するように選択される。この方法で見出された類似物（群）は、目的とする特性の有無、又はそれをどの程度発揮するかを見るためにスクリーニングされる。次いで、さらなる最適化又は修正が行われ、in vivo又は臨床試験用の１又はそれ以上の最終的な類似物に到達する。
ここで本発明を、添付図面を参照しながら例を挙げてさらに詳細に説明する。以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、請求の範囲を制限するように解釈されるべきものではない。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及びＢは、p16由来ペプチドの、in vivo発現されたcdk4又はcdk6への相対的結合を示す。
図１Ｃは、p16タンパク質のアミノ酸８４から１０３に相当するペプチド６を示す。
図１Ｄ及びＥは、ペプチド６アミノ酸のアラニン置換シリーズの、in vitroで翻訳されたcdk4及びcdk6に対する類似の結合を示す。アラニンで置換されたアミノ酸残基が表示され、かつ、各ペプチドで沈降したcdk4及びcdk6の相対的量を示した。アミノ酸８９−９０及び９４−９７に相当する疎水性残基のアラニンへの置換は、ペプチド６の両方のキナーゼへの結合を低下させたが、Asp92の置換は、相互作用をかなり増加させた。
図１Ｆは、cdk4を含有するSf9昆虫細胞溶解物を、次のビオチニル化ペプチドとともにインキュベートした実験からの結果を示す：ペプチド６（レーン１及び４）、ペプチド１（レーン２及び５）、並びにペプチド１０（レーン３及び８）。複合体は、ストレプトアビディン被覆アガロースビーズで沈降させた。cdkバンドの低下は、抽出方法に関連する（材料及び方法参照）。これらの結果は、ペプチドの添加前にcdk4に昆虫細胞溶解物を含むサイクリンＤ１が添加されると、ペプチドを含む抽出物がcdk4に結合しないことを示す。しかし、Ｄ１より前にペプチドを添加するとペプチドはCDk4に結合し、ペプチドはサイクリンＤとcdkとの結合の阻害を起こすことができることを示唆している。
図２Ａは、大腸菌の発現され精製された全長Rbタンパク質のリン酸化の阻害を示す。p16由来野生型ペプチド（ペプチド１、６及び１０）またはペプチド６のアラニン置換シリーズが、それらのpRbリン酸化を阻害する能力について、cdk4を含むSf9昆虫細胞溶解物によって試験された。p16シリーズのペプチド１及び１０は、CDk4又はcdk6を沈降させず、pRbリン酸化に影響を与えない。ペプチド６はCDk4及びcdk6に結合し、pRbリン酸化のレベルをかなり低下させる。アラニンで置換されたペプチド６のアミノ酸残基が表示され、かつ、各ペプチド存在下でのpRbリン酸化のレベルを示す。残基９２（Ala92）におけるAla-Asp置換は、野生型ペプチド６より高い効率で全長Ｒｂタンパク質のリン酸化を阻害し、そのcdk4及びcdk6へのより高い結合能を反映している。９０及び９５−９７位の疎水性残基又は近接した残基のアラニン置換は、阻害能をバックグラウンドのレベルまで低下させた。
図２Ｂは、ペプチド６、ala92及びAla94の量の増加のpRbリン酸化への影響を示す。50μMにおいて、Ala92によるcdk4-サイクリン依存性pRbリン酸化のブロックは、ほぼ完全になる。
図３は、小さなペプチドキャリアに結合したペプチド６によるヒトケラチン細胞由来HaCaT細胞のＳ相への導入の阻害を示す。細胞は、血清及び10μMのBrdUが添加される前に、72時間の血清飢餓によってＧ０で同期された。図３Ａは、100nMのペネトラチンキャリア分子に結合したペプチド６が組織培養媒質に添加されたときの、血清刺激後の表示された時点を示す。表示されたデータは、血清のみとインキュベートした細胞に対する、ペネトラチンキャリアに結合したペプチド６とインキュベートした後の細胞のＳ相導入の％阻害％を示す。
図３Ｂは、ErdUラベルによる細胞合成ＤＮＡを示すパネルＡ、Ｃ、Ｅ及びＧと、同じ領域で細胞をヘキストで染色したパネルＢ、Ｄ、Ｆ及びＨを示す。血清刺激後にBrdUを取り込んだ細胞の比率は、24時間で71％（Ｅ及びＦ）、3時間で14％（Ｇ及びＨ）であった。24時間でのErdU取り込み細胞の数は、ペネトラチンキャリア分子に結合したペプチドを12時間で添加した場合（パネルＡ及びＢ）の方が、14時間の場合（パネルＣ及びＤ）に比較してかなり減少した。ペネトラチンのみによるＤＮＡ合成への影響は見られなかった（図示せず）。
図４Ａは、in vivoでのpRbのリン酸化を示す。低リン酸化された（hypophosphorylated）pRbは、低リン酸化されたサブタイプに比較して各区画に対する親和性が低く、Triton X-100（26）を含む低張バッファを用いて核から抽出できる。パネルＡ、Ｃ及びＥは抗pRbモノクローナル抗体での染色を示し、Ｂ、Ｄ及びＦは、ヘキストで染色した同じ範囲を示す。HaCaT細胞は、72時間の血清飢餓された後に血清を添加された。ペネトラチンに結合したペプチド６（パネルＣ）またはペネトラチン自身（パネルＡ）は、血清添加後8時間に100nMで添加され、リン酸化されたpRbは、23時間において、非抽出染色（パネルＥ）に比較した抽出性（パネルＡ及びＥ）を決定することによって評価した。
図４Ｂは、ウェスタンブロット分析で決定したHaCaT全細胞抽出物におけるpRbリン酸化の状態を示す。細胞は、血清添加前に72時間飢餓とされ、表示した時点で採取した。ペネトラチンに結合したペプチド６またはペネトラチン自身は、記載したように10時間目に添加した。
図５Ａは、p16、他のINKファミリーの成員の対応領域からの関連ペプチド、及び、p16のフラグメントによるpRbリン酸化の相対的阻害を示す。特に、pRbリン酸化に対するp16フラグメントのサイズの縮小の影響を示す。図５Ｂ及び５Ｃは、INKファミリーの成員及びフラグメントのcdk4及びcdk6に対する結合の対応する測定を示す。
図６Ａ及び６Ｂは、cdk−サイクリンＤキナーゼ活性に対する、ペプチド２０及び２１（図６Ａ）及びwt p16及びV95、96A p16（図６Ｂ）の濃度の増加の影響を示すグラフである。ペプチド２０は、３６aa長の合成ペプチドであってD92A突然変異を持ち、ペプチド２１はVV95、96AA突然変異を持つ。
図７は、３つの異なるペプチドで処理したHaCaT細胞のＦＡＣＳ分析結果を示し、それらのペプチドは、２０aaペプチドに結合した１６aaペネトラチン配列からなる３６aaペプチド（ペプチド６、V95,96A及びD92A突然変異p16ペプチド）であり、該ペネトラチン配列は２０aaペプチドのＮ末端にあるようにされている（例えば、Ｎ−ペネトラチン-p16-Ｃ）。これらの実験で、細胞は、10％ＦＣＳ及びペプチドが添加される前に72時間飢餓とされ、その2時間後に分析した。
詳細な説明
材料及び方法
ペプチド沈降
（最初の８Ｎ−末端残基以外の）p16と5aaのオーバーラップを持つ２０aaペプチドライブラリを、ビオチン基が結合するＮ−末端にSGSGリンカーを付加して合成した。ペプチド６のアラニン置換シリーズも同様にして合成した。ペプチドは、アガロースビーズ上に固定されたストレプトアビディンに結合され、PBSで４回洗浄された後、³⁵Ｓ−メチオニンでラベルしたcdk4又はcdk6を含有するウサギの網状赤血球溶解物（Promega）とともに氷上でインキュベートした。ビーズは、0.2％Triton X-100を含む1.2xPBSで４回洗浄した後、SDS付加バッファを添加し、12％SDSポリアクリルアミドゲルに適用した。ゲルは、オートラジオグラフィーフィルムに曝し、cdk4及びcdk6に相当するバンドを濃度計で分析した。
in vitroでのpRbリン酸化
ペプチドは、50mMのHepes pH7.4、10mMのMgCl₂、2.5mMのEGTA、1mMのDTT、10mMのβ-グリセロホスフェート、1mMのNaF及び1mMのNa₃VO₄、及び、10mMのHepes pH7.4、10mMのNaCl、1mMのEDTA及び0.5mMのPMSF中に溶解したヒトcdk4発現バクロウィルス（baculovirus）で感染させたSf9昆虫細胞からの抽出物3mlを含有するバッファ中、25mMの濃度でインキュベートした。混合物は、氷上で60分間インキュベートした。Sf9溶解物（3ml）を含む上記のヒトサイクリンＤは、0.6mgの精製した組み換え全長Rbタンパク質及び2.5mM³²P ATPとともに、ATPの最終濃度50mMで添加して、+30℃で10分間インキュベートし、反応はSDS付加バッファの添加によって終了させ、8％のSDSポリアクリルアミドゲル上に添加した。ゲルは、オートラジオグラフィーフィルムに曝し（図２Ａ）、また、pRbリン酸化のレベルをリン酸画像化によって評価した（図２Ｂ）。
細胞周期阻害
システイン残基を、ペプチド６のＣ末端に付加し、アンテナペディア ホメオドメイン（24）の16アミノ酸長ペネトラチンペプチド（アミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKK）へのジスルフィド結合を用いた結合に用いた。細胞は、FCS無しのDMEM媒質中での72時間の飢餓に先立ってカバースリップ上に播種した。媒質を、10％のFCSとBrdUを含むDMEMに置換した。血清刺激後の異なる時点で結合したペプチドを添加した。Ｓ相に入る細胞の数を、アセトン／メタノール（１：１）中で細胞をカバースリップ上に固定し、1MのHCl中で30分間インキュベートし、PBSで６回洗浄し、次いで、抗BrdUモノクローナル抗体及び二次抗体を複合しMowiol含有ヘキストに載せたテキサスレッドとともにインキュベートすることにより、24時間におけるBrdUを取り込んだ細胞数を見積もることにより決定した。少なくとも２回繰り返された各１回の実験について、３つの異なるカバースリップ上の少なくとも６の異なる領域が計数された。図３Ａに示した値は１つの代表例である。
ＦＡＣＳ分析
採取前20分に、細胞は10μMのBrdUとともにインキュベートした。トリプシン化した細胞は、次いでPBS中で洗浄し、1mlのPBS中に再懸濁し、3mlの96％EtOHと注意深く混合し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞は、1mg/mlのペプスタチンを含む2mlの30mMのHCl中、37℃で30分間インキュベートした後、2MのHCl中で15分間インキュベートした。PBSで６回注意深く洗浄した後、細胞は、200μl（１：５）の抗BrdU（Becton Dickinson）中、室温で1時間インキュベートした。PBSで洗浄後、細胞は、FITC複合抗マウスIgG（１：８０）（Sigma）中で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞は、25μg/mlのプロピジウムヨーディン（propidium Iodine）を含有するPBSに再懸濁し、ＦＡＣＳで分析した。
in vivoでのpRbリン酸化
過リン酸化（hyperphosphorylated）pRbを、アセトン／メタノール（１：１）での固定（26）の前に、0.1％のTriton X-100を含む低張バッファで細胞を処理することによりカバースリップ上で培養した細胞から抽出した。固定した細胞は、抗pRbモノクローナル抗体IF8と1時間インキュベートし、PBSで３回洗浄し、テキサスレッド複合二次抗体と45分間インキュベートした後、カバースリップをMowiol含有ヘキストに添加した。
ウェスタンブロット分析のために、細胞を、50mMのTris pH8.0、150mMのNaCl、1.0％のNP-40、0.5％のDOC、0.1％のSDS及び0.1mMのPMSFを含むRIPAバッファ中、+4℃で30分間溶解させた。タンパク質濃度を測定した後、サンプルをSDS付加バッファ中で煮沸し、8％SDSポリアクリルアミドゲル上に広げ、ニトロセルロース膜に移した。フィルターは、まず抗pRbモノクローナル抗体IF8とインキュベートした後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）複合二次抗体（DAKO）とインキュベートし、ＥＣＬ（Amersham）で展開した。
部位指向性突然変異
VV95、96AA突然変異を、Promegaからの形質転換部位指向性突然変異源キットを用い、その製造者の指示に従って、his標識した野生型p16タンパク質に導入した。突然変異は、対応するコドンをGTG GTGをGCG GCGに換えることにより導入し、次いで、配列をＤＮＡシークエンスによって確認した。
結果
p16のcdkに結合する領域の同定
図１Ａ及びＢは、p16のaa８４から１０３に相当するペプチド（ペプチド６）が、ストレプトアビディンアガロースビーズに結合したとき、網状赤血球溶解物からcdk4及びcdk6の両方の抽出に使用できることを示している。このペプチドのアラニン置換シリーズ（図１Ｃ）は、残基８９から９６の間の領域における疎水性アミノ酸の置換が、ペプチドのcdk4及びcdk6の両方に結合する能力を低下させることを示した。興味深いことに、アスパラギン酸９２のアラニンによる置換は、ペプチドの両方のキナーゼへの結合をかなり増加させる（図１Ｄ及びＥ）。
p16フラグメント及びpRbリン酸化の阻害
p16ペプチドとサイクリン依存キナーゼとの相互作用の機能的重要性を研究するために、我々は、p16由来のペプチド並びにペプチド６のアラニン置換シリーズが、cdk4−サイクリンＤのin vitroアッセイにおいてpRbをリン酸化する能力に影響を与えるか否かを調査した（図２）。p16由来のシリーズの中でペプチド６のみがpRbリン酸化を有意に低下させた（ペプチド１、６及び１０の結果のみを示した）。アラニン置換シリーズの種々のペプチドのcdk4及びcdk6に結合する能力と、cdk4−サイクリンＤ１活性の阻害との間に相関が見られた。
p16結合ドメインにおける突然変異の影響
最も重要なのは、全長p16タンパク質のaa８９から９６に相当する残基の間に位置する２つの疎水性領域の中、又はその近隣のアミノ酸の置換が、ペプチド６に誘発されるpRbリン酸化の阻害を低下させることである。興味深いことに、アスパラギン酸９２のアラニンへの置換は、cdk4キナーゼ活性の阻害においてペプチド６より有効なペプチドをもたらす。連続した希釈により、50μMのペプチド濃度で、Ala92ペプチド及びペプチド６により、pRbリン酸化がほぼ完全にブロックされることがわかった。対照的に、１置換Ala94は、このアッセイにおけるペプチド６の機能を完全に不活性化する（図２Ｂ）。Ala92ペプチドの向上した結合性と、そのキナーゼ阻害剤としての大きな有効性との関係は刺激的であり、ペプチド６配列のさらなる突然転位体が、おそらく天然のp16タンパク質の活性阻害部位に類似したコンホメーションをとることを促進することにより、より大きな活性を有する可能性があることを示唆している。ペプチド６及び他の関連タンパク質で表されるp16の阻害領域の同定におけるここに述べた研究の比較は、キナーゼ阻害剤p15（20、21）に相当するドメインに同一のモチーフが存在し、密に関連したp18（21）及びp19（22、23）阻害剤内に保持されていることを示しているが、この発明以前には、この類似性及びその意義は当業者に認識されていなかった。
p16遺伝子における点突然変異は、遺伝性及び第一期黒色腫からの腫瘍、並びに食道及び膀胱からの腫瘍に見られる（9、10、14、15）。これらの突然変異体は、ペプチド６に囲まれた領域内又はその近隣に密集し、細胞増殖及びpRbリン酸化を阻害するそれらの能力を失っていることが示された（3、4、12）。これは、p16タンパク質機能に対するこの領域の重要性をさらに支持している。
p16タンパク質の不活性化を招き、cdkへの結合を媒介する上記の領域以外の突然変異は、p16タンパク質の全体的なコンホメーション変化を誘導することを示すか、あるいは、温度感受性であり、これらの突然変異が我々が結合を媒介すると示唆したドメインの構造に影響を与えることを示す。さらに、p16Ｎ−またはＣ−末端の欠失は、ともにp16の不活性化を招き、p16の構造が感受性であるとの推論を支持する。
p16の細胞増殖に対する影響及びキャリアペプチドの使用
培養細胞におけるp16の過発現は、Ｓ相への導入をブロックするので（1-4）、我々は、ペプチド６が細胞増殖に影響を与えうるかを見出すことを試みた。生物学的膜を通して速くエネルギー非依存的な方法で転位することが知られているアンテナペディア ホメオドメインの１６aa領域（24）を、キャリアとしてペプチド６に結合し、血清飢餓のヒトケラチン細胞由来のHaCaT細胞の組織培養媒質に添加した。
図３は、キャリア分子に結合したp16ペプチドの0.1μMを、血清添加と同時または12時間後までに添加したとき、血清添加後24時間にBrdU取り込みによれば、Ｓ相に入る細胞数が極端に減少することを示している。しかし、結合したペプチドを、血清添加後14時間で添加すると、Ｓ相に入る細胞数は、ペプチドで処理していない細胞に見られる数と同等であった。このことは、ペプチドの影響が、Ｇ１後期に相当する細胞周期の狭い窓に限られることを示唆している。これは、血清刺激及びタンパク質合成が、もはやＳ相への導入を確かめることを必要とせず、pRbリン酸化の臨界点であることが示唆されている制限（R）点を含む（6、25）。
飢餓とされた細胞が、血清添加後10時間にキャリア分子に結合したp16ペプチド又はキャリア分子単独とともにインキュベートされたとき、23時間目に測定するとpRb抽出能の相違が観察された（26）。抗pRbモノクローナル抗体で染色されたペプチド６とインキュベートした細胞の約60％は、キャリアのみとのインキュベートのわずか14％に匹敵する（図４Ａ）。この観察は、同様の方法で処理した全HaCaT細胞抽出物のウェスタンブロット分析によって確認した（図４Ｂ）。これらの結果は、低リン酸化されたpRbを持つ細胞の数が、キャリアペプチドに結合したペプチド６を12時間以前に添加したとき、血清刺激後23時間で有意に減少することを示唆している。また、Sf9細胞抽出物に感染したバクロウィルスで観察されたcdk4−サイクリンＤ活性の阻害（図２）が、in vivoでも起こることを示唆している。
0から12時間の間の結合したペプチドの添加後のＳ相導入の確実な阻害は、ペプチドの影響が永続的であり、キャリアに結合したペプチドは細胞内で即座に分解されないことを示唆している。このことは、アンテナペディア ホメオドメインキャリアペプチドが細胞内のタンパク質分解から保護されることを示唆する報告（24）によって支持されている。
p16のCDk結合モチーフの精製及び他のタンパク質との比較
上記の結果は、p16の第３のアンキリン様リピートから誘導された２０aaペプチドが、例えば、in vitroでのサイクリン依存キナーゼcdk4及びcdk6への結合及びcdk4−サイクリンＤ１キナーゼ活性の阻害、並びに細胞周期進行のブロックといった、全長タンパク質と類似の特徴を持つことを示す。この領域は、全長p16タンパク質のaa８４から１０３に相当するペプチド配列を含み、p15の対応領域と同一であり、p18及びp19並びにマウスp16に高度に保持された。
キナーゼ阻害剤のINKファミリーの成員は、CDK−サイクリンＤキナーゼ活性を、cdk4及びcdk6との直接的相互作用により特異的に阻害するので、我々は、この活性が、これらのタンパク質間に共有される高度に保持された１つのドメインに決定できるかを見出すことを試みた。それは、腫瘍抑制活性を持つINKファミリーの主にp16、より少ない程度でp15であるので、これらの異なるタンパク質が、同じドメインを通して類似の方法でCDK−サイクリンＤキナーゼ複合体を阻害するか否かを知り、それらの作用の平均ではなく、これらの異なるタンパク質の発現の調節が、それらの腫瘍抑制剤としての役割を決定することを示唆するのは重要である。よって、我々は、合成腫瘍抑制ペプチドのモデルとしての能力を向上させるために、このペプチドドメインを、さらに最小化及びプロテアーゼ分解に不活性である修飾アミノ酸残基で置換できるか否かを見出すための実験を行った。
ペプチドのcdk4及びcdk6への結合性を研究するために、我々は³⁵Ｓラベルしたメチオニンの存在下で、結合したin vitro網状赤血球翻訳システムにおいてタンパク質を発現させた。ペプチドのＮ−末端でSer-Gly-Ser-Gly-リンカーに結合したビオチン基は、ストレプトアビディン被覆アガロースビーズに結合し、細胞溶解物とともにインキュベートした。図５Ａは、pRbリン酸化測定結果を示し、図５Ｂ及び５Ｃは、INKの成員の結合及びp16ペプチドフラグメントのcdk4及びcdk6への結合の測定を示す。
図５Ａ−Ｃは、p18及びマウスp16から誘導された、p16の８４−１０３領域に相当するペプチドが、pRbリン酸化を阻害することを示し、それらのcdk4及びサイクリンＤ１を過発現するSf9昆虫細胞溶解物によるpRbリン酸化を阻害する能力を反映し、cdk4及びcdk6の両方に同様に結合する。
次いで、我々は、Ｎ−又はＣ−末端から同時に２つの残基を欠失させることによって作製したp16ペプチド欠失シリーズを試験した。我々は、Ｎ−末端（図５Ａ−Ｃのペプチド６）において２つの残基を取り除くことが、cdk結合性及びキナーゼ阻害高価の両方をかなり低下させ、この活性は、いずれかの末端で他の２つの残基を欠失させることによって回復することを見出した。ペプチド１０のみが、アンキリン様リピートの間に保持されたモチーフに相当する１０の残基を持ち、密な二次螺旋構造を形成すると予想される。このペプチドは、その結合能力の一部を失っているが、未だに良好なキナーゼ阻害剤であり、ｐ１６ペプチド原型の２０アミノ酸が、少なくとも１０残基に減少させることができ、なおかつCDK−サイクリンＤ１キナーゼ活性を阻害することを示している。この欠失シリーズ及びアラニン走査は、ペプチドにおいて、我々が、結合性とキナーゼ阻害性との間に強い相関があることを実験したことを示す。
R87P置換がペプチドの機能を阻害しないことを記すのは興味あることである。この突然変異は、検出される殆どのp16突然変異と同様に、ペプチドとcdkとの相互作用に重要であることが示された領域の外側にあるので、これらの突然変異が、タンパク質のコンホメーション変化を誘発し、それが中心のアンキリン様ドメインに影響することを示唆している。この仮説は、P114及びG101Wがタンパク質の全体的なコンホメーション変化を起こすこと、及び、R87P突然変異が温度感受性であることを示した最近のＮＭＲ研究によって強化された。
同様の説明は、ペプチドは、２つの残基がＮ−末端を離れるとその効果を失うという驚くべき観察に対する答えも与えることができ、これらの欠失がペプチドのコンホメーション変化を起こすことを示唆している。最小の結合ペプチド（ペプチド１０）は、基本的に極性残基に囲まれた２つの疎水性領域を有し、これは両親媒性の螺旋回転を形成する。p18ペプチドは、p16ペプチドに比較すると８つの置換基を有し、９５及び９６位のQTは第２の疎水性ポケットを壊すので、これらがまずペプチドの結合ドメインを妨害すると思われる。しかし、このペプチドは、９７及び９８位に、極性基で囲まれているが２つの疎水性残基を有し、また、無傷のGFLD領域並びにロイシン９８を有するので、第２の疎水性ポケットが、cdk結合性に影響を与えずにＣ−末端方向に向けて数残基分移動できることを示唆している。
即ち、これらの結果は、p16フラグメントのサイズの初期の減少の後では、cdk阻害性の幾分の低下をもたらすが（ペプチド６）、p16フラグメントのサイズのさらなる減少では、阻害性が再び増大する（ペプチド７から１０）ことを示している。このことは、１６aa（ペプチド７）、１４aa（ペプチド８）、１２aa（ペプチド９）及び１０aa（ペプチド１０）を含む小さなペプチドが、全長p16と同等又は類似の生物学的活性を維持できることを示している。また、これらの結果は、p16の２つのモチーフ、ELDモチーフ及びLVVLモチーフが、キナーゼ結合性にとって重要であるという考えを支持している。
従って、これらの結果は、上述のp16の２０aaフラグメント（残基８４から１０３）は、少なくとも50％の大きさで作製でき、なおかつ活性を維持できることを示す。
９５及び９６位におけるアラニン置換
p16ペプチドのアラニン走査置換シリーズからの上記の結果は、９５及び９６位の２つのバリンが、ペプチドのcdkに対する結合性及びキナーゼ阻害性にとって重要であること、及び、アスパラギン酸９２のアラニンへの置換は結合性とキナーゼ阻害性の両方を向上させることを示唆している。また、ペプチド欠失シリーズから、これらの残基が、ペプチドの結合を媒介する１０残基の中にあることは明らかである。
従って、このことをさらに実験するために、我々は、VV95；96AA及びD92A突然変異を、高度に精製したペプチドに導入したが、このペプチドは、生物学的膜を通した転位のためのアンテナベディアホメオドメインの第３のドメインに結合され、cdk4及びcdk6へのペプチド結合性に重要と思われる残基が、全長タンパク質の離脱にも影響を与えるか否化を見るために、VV95;96AAは全長タンパク質に導入された。VV95;96AA突然変異は、His標識された野生型p16に導入され、大腸菌で発現され、対応するペプチドは99.9％の純度で合成された。
図６Ａ及び６Ｂは、これらの実験の結果を示す。結果は、VV９５、96AAの２つの置換を持つペプチド２１が、in vivoにおいてかなり低い活性を持つことを示している。また、同じペプチドは、in vitroでのcdk−サイクリンＤキナーゼ活性の阻害においても活性が低かった。このことは、これらの残基がペプチドのcdk4及びcdk6に対する結合性にとって重要であることを示唆した上述の最初のアラニン走査の結果を確認するものである。
His標識した野生型のp16タンパク質に同じ置換を施すと、類似のキナーゼ阻害活性の喪失が観察された（いずれの場合も、50％キナーゼ活性阻害濃度は、約５倍に上昇した）。我々は、特定の理論に結びつけるつもりはないが、これらの結果は、これらの残基が、p16のペプチドフラグメント並びに全長タンパク質のcdk4及びcdk6への直接結合に含まれる、即ち、キナーゼ阻害の機構は全長p16とここで述べたペプチドフラグメントとで同じであるという見方をさらに支持する。
in vivoにおいて、同じ濃度で、ペプチド２０は、HaCaT細胞のＳ相への導入を殆ど完全にブロックするが、ペプチド２１は、10μMのペプチド濃度で、加減に近い効果を有するのみである。
異なる細胞系におけるp16に対する反応
上述のペネトラチンに結合したp16ペプチドに対する反応について、p16（-/-）であるマウス（knockouts）及び平常マウスp16（+/+）からのマウス胚繊維芽細胞（MEF）を試験した。ペネトラチンに結合したp16ペプチドの同量で12時間処理した後、Ｇ１における細胞集団の増加が、（+/+）は9％であったのに比較して、（-/-）では42％であった。２４時間後、図は5％に対して22％であった。同時に、Ｓ相における減少は、30％（+/+）に対して33％であった。これらの結果を考え合わせると、p16（-/-）MEFは、p16ペプチドに対して（+/+）より感受性が高いことを示唆されている。
また我々は、他の数種の細胞系を試験し、繊維芽、上皮及び筋肉由来の細胞において効果を見たところ、これらは、p16ペプチドに対して類似の成長阻害を示した。比較のための（pRb陰性細胞系である）Saos 2において成長阻害が観察されないことから、p16の生物学的活性がpRbリン酸化の阻害を介することが確かめられた。これらの結果は表１にまとめた。
我々は、p16ペプチドが、マウス筋芽細胞（C2C12細胞）の筋管への分化を阻害するか否かを見る実験も行った。これらの結果は、C2C12細胞を0.5％のFCS媒質中に置くと、それらは多核性筋管から成長を停止した。しかし、それらをp16ペプチドで処理すると、成長停止に加えて、0.5％のFCS存在下での多核性筋管の形成も阻害した。

また我々は、p16ペプチドで処理された上皮細胞が細胞コロニーのモルホロジーをより密に変化させ、会合して表現系となることを観察した。これは、細胞培養皿への細胞接着性の向上を伴い、トリプシン処理後に細胞が剥離する前の時間を６倍に増大させ、ペプチドが細胞接着性を変化させることを示している。細胞接着性の修正は、腫瘍が広がって二次腫瘍を形成することの防止、腫瘍細胞の侵襲性を修正する方法の提供という応用ができる。
最後に、Beta-Galアッセイでの測定によると、予備的な結果は（ペプチドが、ヒトのケラチン細胞由来の細胞（HaCaT細胞）における老化を伴うことを示唆している。また、p16タンパク質の生理学的機能の１つは老化機構を含み、それはin vivoでの腫瘍抑制機能と関連している可能性があるので、これは重要である。細胞における老化を測定するアッセイは、Dimri, et al., P.N.A.S., 1995, 9396頁以降に記載されている。
ＦＡＣＳ分析
図７は、２０aaペプチド（ペプチド６、V95,96AA及びD92A突然変異p16ペプチド）と１６aaのペネトラチン配列に結合した３６aaペプチドである３つの異なるペプチドで処理したHaCaT細胞のＦＡＣＳ分析結果を示す。これらのグラフは、FCSを得ていない細胞はＧ１相にあり、ペプチドの添加によって完全に停止することを示している。
結論
これらの結果は、p16タンパク質の残基８４から１０３に相当する２０aaの合成ペプチドが、全長野生型p16タンパク質について記述されている本質的な生化学的及び生物学的特性を擬態することができることを示す。最も重要なのは、小さなキャリア分子に結合したペプチドが、組織培養媒質に直接炭化した後に、in vivoにおいて細胞増殖を阻害する能力を持つことを見出したことである。この方法は一般的に、in vivoでの生物学的事象の研究における小さな分子の応用に広げることができ、この場合、治療的応用における特定の抑制遺伝子機能の置換、新規な抗増殖薬に対する標的の同定のためのモデルとしての提供が可能となる。
多数の異なる腫瘍が、pRbリン酸化調節過程において、cdk4及びサイクリンＤ１の過発現を含む欠陥を露呈するのと同様に、p16機能の低下を示している。これら全ての腫瘍は、in vivoでのcdk-サイクリンＤ活性を阻害する薬剤のための候補となり得る。
参考文献
この出願で挙げた参考文献は、ここに全て参考として取り入れる。

Claims (22)

1. (a)アミノ酸配列DAAREGFLDTLVVLHRAGARからなるペプチド、あるいは(b)前記アミノ酸配列(a)に対して１つ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失、または置換を含むが、アミノ酸モチーフFLD及び／またはLVVLを保持するアミノ酸配列を有し、かつサイクリン依存キナーゼ（cdk）4またはcdk6に結合する特性を保持する、当該ペプチド(a)の活性部分、
   である、cdk4またはcdk6に結合する特性を有する２０以下のアミノ酸長のペプチド。
2. 前記ペプチド(a)の活性部分であって、前記アミノ酸モチーフFLD及び／またはLVVLを含む、請求項１記載のペプチド。
3. 前記ペプチド(a)の活性部分であって、前記アミノ酸モチーフFLD及びLVVLを含み、それらが１以上のアミノ酸残基で離間している、請求項２記載のペプチド。
4. 前記ペプチド(a)の誘導体であって、ここで、前記アミノ酸モチーフFLDのアスパラギン酸残基が、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項１から３のいずれか一項記載のペプチド。
5. 前記疎水性アミノ酸残基がアラニンである、請求項４記載のペプチド。
6. 前記ペプチド(a)の活性部分であり、以下のもの：
   (a)DAAREGFLDTLVVLHR
   (b)EGFLDTLVVLHRAGAR
   (c)FLDTLVVLHRAGAR
   (d)FLDTLVVLHRAG
   (e)FLDTLVVLHR
   からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１から５のいずれか一項記載のペプチド。
7. 前記ペプチドがL異性体で存在する、請求項１から６のいずれか一項記載のペプチド。
8. 前記ペプチドがD異性体で存在する、請求項１から６のいずれか一項記載のペプチド。
9. 結合パートナーに結合した、請求項１から８のいずれか一項記載のペプチド。
10. 前記結合パートナーがキャリア分子であり、当該ペプチドが細胞に輸送され得うるようにされた、請求項９記載のペプチド。
11. 前記キャリア分子が、アンテナペディアホメオドメインから誘導されたペプチドを含む、請求項１０記載のペプチド。
12. 請求項１から１１のいずれか一項記載のペプチドの１以上を、生理学的に許容されるキャリアとともに含有してなる製薬組成物。
13. 医療的処置方法における使用のための、請求項１から１１のいずれか一項記載のペプチド。
14. 過剰増殖疾患の処置用医薬の調製における、請求項１から１１のいずれか一項記載のペプチドの使用。
15. 過剰増殖疾患が、癌、乾癬または動脈発生である、請求項１４記載の使用。
16. 前記癌が、p16陰性である、請求項１５記載の使用。
17. 請求項１から７または９から１１のいずれか一項記載のペプチドをコードする単離された核酸。
18. 発現調節配列に調節可能に結合した請求項１７記載の核酸分子を取り込んだベクター。
19. 請求項１から１１のいずれか一項記載のペプチドの、(i)前記ペプチドとサイクリン依存キナーゼ（cdk）4またはcdk6への結合について競合する特性を持つ化合物のための、または、(ii)前記ペプチドの結合パートナーである化合物のための、in vitroスクリーニング方法における使用。
20. 請求項１から１１のいずれか一項記載のペプチドと、サイクリン依存キナーゼ（cdk）4またはcdk6への結合について競合する化合物を同定する方法であって、
    (a)予め設定した量の検出可能なラベルをしたペプチドをcdk4またはcdk6に結合させ、
    (b)候補となる化合物を添加し、そして、
    (c)cdk4またはcdk6に結合したままのラベル化合物の量、あるいは、候補となる化合物で置換されたラベル化合物の量を測定することを含んでなる方法。
21. cdk4またはcdk6が網状赤血球溶解物から生成される、請求項２０記載の方法。
22. 候補化合物のpRbリン酸化の阻害特性について試験すること、及び／または該化合物の細胞がＳ期へ入ることを阻害する特性について試験することを更に含む、請求項２０または２１記載の方法。

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