JP4132810B2 - Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、及び該遺伝子の発現による耐塩性の向上 - Google Patents
Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、及び該遺伝子の発現による耐塩性の向上 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4132810B2 JP4132810B2 JP2001390491A JP2001390491A JP4132810B2 JP 4132810 B2 JP4132810 B2 JP 4132810B2 JP 2001390491 A JP2001390491 A JP 2001390491A JP 2001390491 A JP2001390491 A JP 2001390491A JP 4132810 B2 JP4132810 B2 JP 4132810B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antiporter
- apnhap
- cells
- dna
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000084 Antiporters Proteins 0.000 title claims description 105
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 57
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 title description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 title description 4
- 102000003669 Antiporters Human genes 0.000 claims description 94
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 80
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- 239000013535 sea water Substances 0.000 claims description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 15
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims description 14
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 241001464430 Cyanobacterium Species 0.000 claims description 8
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims description 7
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000192705 Aphanothece Species 0.000 claims description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 140
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 80
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 45
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 40
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 39
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 37
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 34
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 27
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 25
- 241001247255 Aphanothece halophytica Species 0.000 description 21
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 18
- 101100348553 Aphanothece halophytica apnhaP gene Proteins 0.000 description 17
- 101001054266 Homo sapiens Delta and Notch-like epidermal growth factor-related receptor Proteins 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 description 15
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 15
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 101150111658 katE gene Proteins 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 9
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 9
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical group OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 6
- 108010060806 Photosystem II Protein Complex Proteins 0.000 description 6
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 6
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 5
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 101100278084 Nostoc sp. (strain PCC 7120 / SAG 25.82 / UTEX 2576) dnaK1 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000192560 Synechococcus sp. Species 0.000 description 4
- 101100117145 Synechocystis sp. (strain PCC 6803 / Kazusa) dnaK2 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 101150067812 apnhaP gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100404726 Arabidopsis thaliana NHX7 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 101150039148 NHX1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010010522 Phycobilisomes Proteins 0.000 description 3
- 102000057028 SOS1 Human genes 0.000 description 3
- 108700022176 SOS1 Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 101100197320 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPL35A gene Proteins 0.000 description 3
- 101150100839 Sos1 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 3
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 210000002306 phycobilisome Anatomy 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- -1 sugar Chemical class 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 2
- 101100438526 Alkalimonas amylolytica caxA gene Proteins 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 2
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 2
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 2
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 2
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000192589 Synechococcus elongatus PCC 7942 Species 0.000 description 2
- 241000192581 Synechocystis sp. Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- VJLOFJZWUDZJBX-UHFFFAOYSA-N bis(2-hydroxyethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].OCC[NH2+]CCO VJLOFJZWUDZJBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 101150047443 chaA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 2
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000448 lactic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 101150073796 nhaA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150000399 nhaB gene Proteins 0.000 description 2
- 230000001033 osmoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 102100024085 Alpha-aminoadipic semialdehyde dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049668 Betaine-Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 102000000161 Calsequestrin Human genes 0.000 description 1
- 108010080437 Calsequestrin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058733 Choline dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100032363 Choline dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101100165287 Chromohalobacter salexigens (strain ATCC BAA-138 / DSM 3043 / CIP 106854 / NCIMB 13768 / 1H11) betI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100165288 Chromohalobacter salexigens (strain ATCC BAA-138 / DSM 3043 / CIP 106854 / NCIMB 13768 / 1H11) betI2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N D-threitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000702479 Homo sapiens Sodium/hydrogen exchanger 1 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100381562 Rhizobium meliloti (strain 1021) betB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091006275 SLC5A7 Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100022897 Sodium/hydrogen exchanger 10 Human genes 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102100032891 Superoxide dismutase [Mn], mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 101150113996 bet gene Proteins 0.000 description 1
- 101150014855 betB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150085184 betI gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010014156 cytochrome C-550 Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 125000004119 disulfanediyl group Chemical group *SS* 0.000 description 1
- 101150115114 dnaJ gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 101150053330 grpE gene Proteins 0.000 description 1
- 102000052674 human SLC9A1 Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000019948 ion homeostasis Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910052746 lanthanum Inorganic materials 0.000 description 1
- FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N lanthanum atom Chemical compound [La] FZLIPJUXYLNCLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 108010045815 superoxide dismutase 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 108091092194 transporter activity Proteins 0.000 description 1
- 102000040811 transporter activity Human genes 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、特に、耐塩性藍藻（らん色細菌：Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、及び該遺伝子の発現による耐塩性の向上に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、世界中の耕作地の20％、灌漑地のほぼ半分が高塩度の被害を受けているといわれている。高塩度は植物のイオン不均衡および高浸透圧によるストレスを誘発する。高塩度環境で生き延びる生物は内部浸透圧を調節する特異な機序を有している。そのような機序のひとつが砂糖、ある種のアミノ酸、第四アンモニウム化合物などの低分子量有機化合物の溶質を蓄える能力である。高塩度に適応するもうひとつの機序はＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターおよびＮａ＋-ATPアーゼの一機能として提唱されている細胞からのＮａ＋排出である。塩ストレスは、このような毒性作用のほかに、酸化ストレスも誘発する。従って、近年、遺伝子工学を利用して植物の耐塩性の改善が試みられている。
【０００３】
Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターは細胞膜を介してＮａ＋をＨ＋に交換する反応を触媒し（Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性）、細胞質内のpH、細胞容積、細胞質内ナトリウム濃度の制御など種々の機能を果たしている（1-3）。Escherichia coliでは、3種のアンチポーター（NhaA, NhaB, ChaA）が知られており、その機能的特徴も十分に解明されている（1）。動物では6種の相同Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター（交換）（NHE1-6）が判明している（2）。植物および酵母では、空胞型（NHX1およびAtNHX1）（4-6）と形質膜型（SOD2およびSOS1）（7,8）のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターが報告されている。E. coliアンチポーターと真核細胞アンチポーターの相同性はきわめて低く、Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子は別々に進化が独立したことが示唆される。
【０００４】
このようなＮａ＋／Ｈ＋ アンチポーター遺伝子を用いると、植物の耐塩性が向上するという報告が、最近（１９９９年、Science、２００１年Nature Biotechnology）にカナダBlumbald他によりなされた。Blumbald他はアラビドプシスの液胞膜のＮａ＋／Ｈ＋ アンチポーター遺伝子を、アラビドプシスの液胞膜(Science 1999)、トマトの液胞膜(2001 Nature Biotechnology)で発現させることにより、ともに０．２Ｍ ＮａＣｌ中でも生育することを報告している。これは、細胞の中にある液胞膜の内側にＮａＣｌを蓄積させることにより耐塩性を向上させるものである。
【０００５】
このように、遺伝子工学の技術によって植物の耐塩性を改善する少なからぬ努力が行われているが、実用化にこぎつけるほど十分な結果は得られていない。
さて、植物に比べると単細胞のらん食細胞は単純であり、光合成生物における耐塩性を担う因子を解明するためには適切なモデルである。藍藻は太陽エネルギーおよび無機体炭素ＣＯ２を利用して増殖できる酸素を発生する光合成生物である。このような生物はきわめて低濃度から海水よりも高濃度まで塩を含有する水中などほぼすべての生息地で確認される。しかし、どの遺伝子が異なる塩度への適応に関与するのか、不明である。そこで、高塩度に対応するマスター調節遺伝子を同定することは、藍藻の耐塩性の機序を理解するばかりでなく、作物の収穫量を向上させる点で植物への応用にも重要である。
【０００６】
本発明者等はこれまでの試験で（9）、藍藻Synechocystis sp. PCC6803にはＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターSynNhaP１が存在し、真核細胞および原核細胞（Pseudomonas aeruginosa由来NhaP）のアンチポーターと相同であるが、NhaA, NhaBおよびChaAとは相同でないことを明らかにしてきた。さらに、SynNhaPには膜貫通（TM）領域に保存されたＡｓｐ１３８と比較的長いC末端親水性テールがあり、いずれも担体活性に重要であることも示してきた。長いC末端テールは動物の輸送活性を制御する働きがあると考えられている（2,10）。このような知見から、藍藻のアンチポーターは真核細胞のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの構造的特性と機能的特性を試験するためのモデル系になることがわかる。
【０００７】
現在までに、Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター蛋白質ではごくわずかな機能性アミノ酸残基、特に陽イオン輸送に関わるアミノ酸残基が特定されている。SynNhaPのＡｓｐ１３８（9）、NhaAのＡｓｐ１３３, Ａｓｐ１６３, Ａｓｐ１６４（11,12）の重要性が報告されている。Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターはＨ＋とＮａ＋またはＬｉ＋との間を特異的に交換するが、Ｈ＋とＬｉ＋との交換活性が弱いアンチポーターもいくつかある（13）。E. Coli ChaAはアルカリ性pHでＣａ２＋とＨ＋、Ｎａ＋とＨ＋の交換活性を有すると報告されているが、詳細に調べられたことがない。どの因子によってイオン特異性が決まるのか不明である。Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターの陽イオン輸送のための保存配列を特定するためには、新たなイオン特異性を有するアンチポーターのクローニングが欠かせない。
【０００８】
Aphanothece halophyticaは0.25〜3.0M ＮａＣｌと広範な塩度条件下で増殖可能な耐塩性藍藻である（15,16）。A. halophyticaは高塩度で浸透圧保護物質グリシンベタインを蓄積し（15）、A. halophyticaのDnaK蛋白は、他のDnaK/Hsp７０ファミリー（17）より長いC末端セグメントを有しており、高塩度できわめて強い蛋白質折りたたみ活性を示すことが報告されている（18）。A. halophytica由来DnaK蛋白によるタバコの形質転換によって、耐塩性が増強されることも判明している（19）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、遺伝子工学の技術によって植物の耐塩性を向上させることのできる有用な遺伝子を見出し、該遺伝子を利用して、耐塩性作物を開発、創出して食料生産の向上に寄与する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、A. halophyticaに独特のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター（ApNhaP）があるかどうか研究した結果、真核細胞に相同であるが、新たなイオン特異性を有するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子を単離することに成功し、更にそのイオン特異性がC末端領域によって変化することも明らかにした。
【００１１】
更に、淡水藍藻Synechococcus sp. PCC7942において8種のプラスミドを過剰発現させ、耐塩性を試験した。その結果、ベタイン合成、カタラーゼおよびシャペロンに関与する遺伝子を比較して、耐塩性藍藻由来のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子を過剰発現することによって、このSynechococcus細胞を0.5M NaClを含有するBG11培地でも海水中でも増殖することが判明し、淡水藍藻の耐塩性を大きく改善することに成功した。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の各態様に係る。
（１）耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡ。
（２）全ｐＨ領域においてＬｉ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を実質的に示さず、中性及びアルカリ性ｐＨ領域においてＣａ２＋／Ｈ＋アンチポーター活性を示すことを特徴とする、藍藻由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡ。
（３）藍藻が耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica)である、２記載のＤＮＡ。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含有するＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質。
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１における第７９６〜２３６１番目の塩基対からなる塩基配列、
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（６）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ビークル。
（７）大腸菌由来プラスミドベクターである６に記載の組換え発現ビークル。
（８）大腸菌／淡水藍藻シャトルベクターである６に記載の組換え発現ビークル。
（９）６、７又は８に記載の発現ビークルによって形質転換された形質転換体。
（１０）細菌である９に記載の形質転換体。
（１１）大腸菌である１０に記載の形質転換体。
（１２）大腸菌がアンチポーター欠損株である１０に記載の形質転換体。
（１３）Ｎａ＋感受性表現型及びＣａ２＋感受性表現型が相補された１２に記載の形質転換体。
（１４）藍藻である９に記載の形質転換体。
（１５）藍藻が淡水性藍藻である１４に記載の形質転換体。
（１６）海水中で増殖可能な淡水性藍藻である１５に記載の形質転換体。
（１７）植物である９に記載の形質転換体。
（１８）植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、１７に記載の形質転換体。
（１９）Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターを過剰発現することを特徴とする、１４乃至１８のいずれか一項に記載の形質転換体。
（２０）Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が増加した、１４乃至１８のいずれか一項に記載の形質転換体。
（２１）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることから成る、該宿主の耐塩性を向上させる方法。
（２２）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ビークルによって宿主を形質転換し、該ＤＮＡを宿主細胞内で発現させることから成る、該宿主の耐塩性を向上させる方法。
（２３）細胞外にＮａＣｌを排出させることにより耐塩性を向上させる、２１又は２２に記載の方法。
（２４）宿主が植物である、２１、２２又は２３に記載の方法。
（２５）植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、２４に記載の方法。
（２６）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることから成る、耐塩性生物の創出方法。
（２７）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ビークルによって宿主を形質転換し、該ＤＮＡを宿主細胞内で発現させることから成る、耐塩性生物の創出方法。
（２８）宿主が植物である、２６又は２７に記載の方法。
（２９）植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、２８に記載の形質転換体。
（３０）６乃至２０に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターを単離及び精製することから成る、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターの調製方法。
（３１）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質。
（３２）３０に記載の調製方法で得られる組換えＮａ＋／Ｈ＋アンチポータータンパク質。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡは、以下の実施例に示すように、公知である複数のＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター間に高度に保存された２つのポリペプチド領域をもとにプライマーを作成し、一方、当業者に公知の方法でA. halophytica培養し、それから単離したゲノムを鋳型として、当業者に周知のＰＣＲを用いて調製することが出来る。
【００１４】
本発明ＤＮＡにコードされるＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターは、全ｐＨ領域においてＬｉ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を実質的に示さず、中性及びアルカリ性ｐＨ領域においてＣａ２＋／Ｈ＋アンチポーター活性を示すことを特徴とする。
【００１５】
より具体的には、本発明ＤＮＡは、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含有するＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質、である。
更に、本発明ＤＮＡは、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１における第７９６〜２３６１番目の塩基対からなる塩基配列、
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、である。
ここで、部分配列とは、例えば、上記Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターのＣ末端領域（配列番号２に示されるアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸残基Gluから５２１番目のアミノ酸残基Gluまでの領域）に該当する配列を意味し、この部分はイオン特異性に関与する部分であることが本発明によって明らかにされた領域である。
【００１６】
当業者であれば、本明細書で開示された配列情報に基づいて、当該技術分野における周知手段を用いた化学合成等によっても調製することが可能である。更に、当業者であれば、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が実質的に保持されるように、配列番号２における特定のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することも、当該技術分野における周知手段を用いて容易に実施することができる。Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が実質的に保持されるためには、アミノ酸配列における相同性が、６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９．５％より高いものを挙げることができる
【００１７】
本発明において、特定の遺伝子又はＤＮＡは、当業者に周知の緩衝液中で、適当な温度及び塩濃度等の諸条件下のストリンジェントな条件でハイブリダイズさせることができる。このようなストリンジェントな条件下で本発明の遺伝子又はＤＮＡとハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性と実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの例として、例えば、それぞれの対応する遺伝子と相同性が、９０％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９．５％より高いようなＤＮＡを挙げることができる。
【００１８】
更に、本発明は別な態様として、上記の本発明遺伝子の少なくとも一つの遺伝子を含有する組換え発現ビークルに係る。組換え発現ビークルには各種ベクター等の当業者に公知の任意のものが含まれるが、特に、大腸菌由来の各種プラスミドベクター、大腸菌／淡水らん食細菌シャトルベクター、及びアグロバクテリウムのＴｉプラスミドベクターが好適である。
該組換え発現ビークルには、遺伝子組換え操作において当業者に公知である様々な配列、例えば、原核細胞である大腸菌等が有する転写因子である各種σサブユニットに対する結合ドメインである各種プロモーター、及びエンハンサーなどの各種転写調節要素、制限酵素部位、並びにカナマイシン耐性マーカー等の選択マーカー（マーカー酵素等）遺伝子を任意に含むことが出来、当業者に公知の方法によって容易に調製することが出来る。
【００１９】
本発明の発現ビークルによって形質転換される宿主としては、特に、大腸菌及び藍藻等の各種細菌、並びにイネ、タバコ等の植物を挙げることが出来る。これらの形質転換体には、本発明のＤＮＡが発現された結果、Ｎａ＋感受性表現型及びＣａ２＋感受性表現型が相補されたものや、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターが過剰発現された結果、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が増加したもの等がある。
【００２０】
本発明のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることによって、該宿主の耐塩性を向上させることが出来る。耐塩性の向上は、主に、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターによって細胞外にＮａＣｌが排出されることによるものである。導入方法としては、例えば、上記組換え発現ビークルによって宿主を形質転換することによって、本発明ＤＮＡを導入することが出来る。他にも、燐酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、及びパーティクルガン法等、当業者に公知の任意の手段及び条件を用いることが出来る。
【００２１】
このようにして、本発明のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることによって、耐塩性生物、例えば、海水中でも増殖することが出来る淡水藍藻を遺伝子工学的手法によって創出することが出来る。
【００２２】
更に、上記の形質転換体を培養し、得られる培養物からＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターを単離及び精製することによって、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターを調製することが出来る。培養、単離及び精製等に関する諸条件は、使用するベクター、宿主及びその他の各因子の種類等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００２３】
本発明は、上記の本発明ＤＮＡにコードされるタンパク質にかかる。このようなタンパク質は、当業者に公知の方法で、A. halophytica培養物から精製及び単離することができる。或いは、上記調製方法によって、得られる組換えタンパク質として、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターを得ることも可能である。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２５】
【実施例１】
A. halophytica 培養
A. halophytica細胞はBG11培地に18 mM ＮａＮＯ３のほか、Turk Island塩溶液を加えて、光独立栄養的に増殖させた。Turk Islandの塩溶液は、培地のＮａＣｌ濃度を適宜0.25〜2.5Mの範囲に調節したことを除き、これまでに発表されている方法で調製した（15-17）。培地200 mlを入れて綿栓をした500 mlの三角フラスコを用いて、濃縮ＣＯ２を補充することなく往復振盪機で振盪した。連続して白色蛍光を照射しながら培養フラスコを28℃でインキュベートした（30 microeinsteins ｍ−２ｓ−１）。
【００２６】
A. halophytica のＮａ ＋ / Ｈ ＋ アンチポーター単離
A.halophyticaゲノムＤＮＡは発表されている方法で単離した（17）。複数のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター間の高度に保存された2つのポリペプチド領域をもとに、部分的に変性したオリゴヌクレオチドを特定した（9）。正方向のプライマーであるNP-Fはポリペプチドの伸張部Phe-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Phe-Glu-Alaの後に特定された（SynNhaPのアミノ酸残基73〜81）。逆方向のプライマーであるNP-Rには、Glu-Gly-Glu-Ser-Leu-Phe-Asn-Asp-Glyに相当する相補配列を含む（SynNhaPのアミノ酸残基160〜168）。全プライマーの配列を以下の表１に示す。予測した大きさ（〜0.3 kb）の増幅ＤＮＡ断片を入手し、配列決定した。決定したヌクレオチド配列を用いて、逆転写ポリメラーゼチェーン反応（PCR）法によって未知の隣接ＤＮＡ領域を増幅した（20）。そのために、Sau3AIによる部分消化やEcoRIまたはAseIによる完全消化で得たＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動で大きさごとに分画した。1〜5 kbの断片はライゲーションキット（宝酒造、滋賀県）を用いて自己連結し、特異なＤＮＡ断片を増幅して配列決定した。A. halophyticaのＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子（apnhaP）の配列全体をカバーする約2.4 kbのヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡ配列はABI310遺伝子分析機（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて決定し、DNASISプログラム（日立ソフトウェアエンジニアリング、神奈川県）によって解析した。
【００２７】
その結果、配列番号１に示される、全体が2431 bpのヌクレオチドが配列決定された（図２）。この配列分析からオープンリーディングフレームと思われる796〜2361に位置するapnhaPが明らかになった。この予測遺伝子産物は配列番号２に示される521個のアミノ酸からなり、分子量は56,881 Daである（ApNhaP）。最初のMetの上流配列には-10（ATGAAT）および-35（TACACT）のコンセンサス配列の存在が明らかになった（図２）。さらに上流領域である185〜676には、光化学系II（チトクロムｃ５５０）に関与する低電位チトクロムcをコード化する別のオープンリーディングフレームがみつかった。ヌクレオチド配列から推定されたチトクロムｃ５５０のアミノ酸配列は、ラン色細菌、藻類および植物から得られた配列と相同性が高かった。
【００２８】
図３に示されるように、ホモロジー検索によってApNhaPが真核細胞（SOS1, NHEs, AtNHX1およびNHX1）と原核細胞（NhaP, SynNhaPおよびSynNhaP2）に由来するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターにきわめて相同していることが明らかになった。SynNhaP2はSynechocystis sp. PCC 6803で確認された2つめのNhaP型アンチポーターである（9）。ApNhaPはSynNhaPと最も相同性が高かった（アミノ酸が61％まで同一）。親水性プロット解析（23）およびTM予測プログラムTopPredII（24）によって、ApNhaPの推定上のTMセグメントを11個特定した。ApNhaPのAsp１３９は膜貫通領域に保存されたイオン化アミノ酸であり、交換活性に対するその重要性はSynNhaPの突然変異誘発による分析で示されている（9）。尚、ApNhaPには長い親水性C末端テールがあるが、これは真核細胞のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの場合であり、P. aeruginosa由来NhaPには認められない。このようなデータは、耐塩性ラン色細菌A. halophyticaに真核細胞に相同なＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターがあることを示唆している。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【実施例２】
発現プラスミドの構築
apnhaPのコーディング領域をPCR反応により単離した。正方向のプライマーであるANP-NcoIは開始コドンATGとNcoI切断部位を含む。逆方向のプライマーであるANP-HindIIIにはHindIII制限部位が含まれる。増幅断片はpTrcHis2CプラスミドのNcoI/HindIII切断部位に連結した。得られたプラスミドpANhaPはインフレームでヒスチジンヘキサマー融合ApNhaPをコード化し、まずE. coli DH5α細胞に導入し、次にnhaA, nhaB, chaA遺伝子が欠失するTO114細胞に導入した（21）。
【００３１】
このpANhaPのほかpSNhaPをNhaA, NhaB, ChaAが欠失したE. coli宿主細胞（TO114）に発現させた（9,21）。膜分画をウェスタンブロッティング法で分析し、pANhaPおよびpSNhaPで形質転換したE. coli細胞に〜53 kDaに相当する交叉反応を示すバンドがひとつあることが明らかになったが、ベクター単独（pTrcHis2C）で形質転換したE. coli細胞はまったくバンドがなかった。このような結果はApNhaPが発現し、E. coliの膜に集っている可能性を示唆するものである。 尚、SDS-PAGEおよび免疫ブロッティングは公知の方法（17）によって実施し、Lowryらの方法によって蛋白質を定量した（25）。ヒスチジンヒキサマー（His６タグ）に対して産生される抗体はR&D Systems Inc.（Minneapolis, MN）から得た。
【００３２】
pANhaPで形質転換したE. coli TO114細胞がpH 7.0 37℃のLBK培地のなかでpTrcHis2CおよびpSNhaPで形質転換したTO114細胞とほぼ同じ速度で増殖したことを図４（Ａ）に示す。しかし、TO114細胞にはＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子（nhaA, nhaB, chaA）が欠損するため、pTrcHis2Cで形質転換したE. coli細胞は0.2 M ＮａＣｌの存在下で増殖することができない（図４（Ｂ））。これに対して、pANhaPまたはpSNhaPで形質転換したE.coli細胞は増殖可能であった（図４（Ｂ））。興味深いことに、pANhaPで形質転換したTO114細胞はpSNhaPで形質転換した細胞に比べて若干速く増殖した（図４（Ｂ））。
【００３３】
更に、ApNhaPとSynNhaPとでは相補する力が異なることが図４（Ｂ）からわかる。2種のアンチポーターにおける相補性の差をさらに明確にするために他の条件でも試験した。図５（Ａ）では増殖温度を30℃にして、pANhaPで形質転換したTO114細胞がLBK培地のアルカリ性pHのもとpSNhaPで形質転換した細胞よりも若干速く増殖できたことを示す。このような条件下、増殖培地に0.2 M ＮａＣｌを含む場合、ApNhaPはTO114細胞の塩感受性表現型を相補するが、SynNhaPは相補できない（図５（Ｂ）。0.5 M ＮａＣｌの存在下でも、pANhaPで形質転換したTO114細胞は増殖可能であった（図５（Ｃ））。相補性の差はpHが小さいと観察されなかった。上のような結果はApNhaPがアルカリ性pHでSynNhaPに比して効果的に相補できることを示唆する。
【００３４】
【実施例３】
Ｎａ ＋ / Ｈ ＋ アンチポーター活性
これまでに発表された方法（9,22）でLBK培地（ＮａＣｌの代わりにKClを用いるLuriaブロス）で増殖させた細胞から調製した反転膜小胞によって、Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性を調べた。簡潔に説明すると、3000×gで4℃、10分間遠心分離してE. coli細胞を収集し、浮遊用緩衝液TCDS（10 mMトリスHCl（pH7.5）、0.14 M塩化コリン、0.5 mMジチオスレイトール、0.25 Mスクロース）で洗浄した。このペレットをTCDS 緩衝液10 mlに浮遊させ、フレンチプレスにかけた（4000 p.s.i.）。次に、この溶液を12,000×gで4℃、10分間遠心分離した。この上清を110,000×gで4℃、60分間遠心分離し、ペレットをTCDS緩衝液600μlに浮遊させた。 アンチポーター活性は、10mMトリス緩衝液（規定pHになるまでHClを加えた）、5 mM ＭｇＣｌ２、0.14 M塩化コリン、1μMアクリジンオレンジ、膜小胞（蛋白質50μg）を含む2 mlの反応混合物に塩を加えて、ΔpH（膜内外のpH勾配）の変化によって評価した。ΔpHは励起492 nmおよび発光525 nmで得られるアクリジンオレンジの蛍光によってモニタリングした。塩を加える前に、呼吸による蛍光クエンチング（Q）を惹起するためにトリス-DL-乳酸（2 mM）を加えた。乳酸は小胞を賦活化し、小胞内にＨ＋を蓄積させるが、これは色素の蓄積と乳酸誘導性蛍光クエンチング（Q）を誘発する。塩（5 mM）の追加によって、アンチポーターによるＨ＋の排出のために蛍光性が増強し、クエンチングしていない蛍光、即ち、塩誘導性蛍光デクエンチング（ΔQ）をモニタリングした。次にＮＨ４Ｃｌ（25 mM）を加えてΔpHを放散させた。
【００３５】
その結果、図６上段に示すように、ApNhaP発現細胞にＮａＣｌを加えるとデクエンチング（ΔQ×100/Q）が観察されたが、対照（pTrcHis2C）細胞では観察されなかった。これはApNhaPがＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性を有することを示している。図６（Ａ）は、pH5〜9の広範囲にわたりApNhaPによる蛍光デクエンチングが観察されたことを示しており、これはSynNhaPによるデクエンチング（9）とほぼ同じであるが、E. coli NhaAによるデクエンチングとはまったく異なる。E. coli NhaAではアンチポーター活性がpH7.5以下で観察されることはなく、pHが上昇するにつれて活性が増強した（1）。
【００３６】
更に、ApNhaPのイオン特異性を調べるために、異なる陽イオンを加えてデクエンチングを測定した。Ｌｉ＋とＨ＋との交換を触媒できるほとんどのＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターに比べて、ApNhaPは種々のpH値でＬｉ＋/Ｈ＋アンチポーターの活性をほとんど示さなかった（図６（Ｂ））。又、ApNhaPが中性及びアルカリ性のpHでＣａ２＋アンチポーター活性を示すことがわかったが（図６（Ｃ））、Ｋ＋/Ｈ＋ではごくわずかなアンチポーター活性を示し、Ｍｇ２＋/Ｈ＋ではまったく示さなかった。このような結果はApNhaPが新たなイオン特異性を有するアンチポーターであることを示唆している。
【００３７】
【実施例４】
上記結果から、ApNhaPがＣａ２＋とＨ＋の交換活性を有するが、Ｌｉ＋とＨ＋の交換活性はないことが示唆されるために、このようなイオン特異性がE. coli変異体細胞の塩感受性表現型を相補するかどうか、さらに試験した。その結果、図７（Ａ）に示されるように、pH 8で4 mM LiClを含むLBK培地でApNhaPを発現するTO114細胞は増殖できないが、SynNhaPを発現するTO114は増殖できた。これに対して図７（Ｂ）に示すように、pH 8.0で0.1 M ＣａＣｌ２を含むトリスE培地ではApNhaPを発現するTO114細胞が良好に増殖するが（26）、SynNhaPを発現するTO114は緩やかに増殖した。いずれも、対照細胞（ベクターのみ）では増殖不能であった。Ｃａ２＋含有培地でのSynNhaP発現細胞の増殖速度はSynNhaPのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性から予測される速度より遅いが（図７（Ｂ）及び図６（Ｃ））、このような結果は、実施例３で得られたApNhaPとSynNhaPのＬｉ＋/Ｈ＋およびＣａ２＋/Ｈ＋アンチポーター活性の結果に一致する（図６（Ｂ）及び図６（Ｃ））。
【００３８】
E. coli ChaAはＮａ＋またはＣａ２＋によるプロトン／カチオン交換活性を有するが、Ｌｉ＋またはＫ＋による活性はないと報告されているが（14,21）、これは基本的にApNhaPと同じイオン特異性である。ただし、ChaAはApNhaPと何ら相同性が認めらなかった。ChaAにはカルセケストリン、カルレティキュリンなど複数のＣａ２＋結合蛋白やＮａ＋/Ｃａ２＋イオン交換体に保存される酸性モチーフGlu２００-His-Glu-Asp-Asp-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp２０９を有するが（14）、ApNhaPにはこの酸性モチーフが欠けている。ChaAの親水性プロットによると、ApNhaPでは長い親水性C末端尾部がないことがわかる。ApNhaPは酵母（27）および植物（28）由来の空胞Ｃａ２＋/Ｈ＋交換体とまったく相同していなかった。このようなすべてのデータは、ApNhaPがChaAとは異なる構造を有するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターであることを示している。
【００３９】
【実施例５】
ApNhaP と SynNhaP のキメラ遺伝子構築
これまでに、C末端テールが一部欠失するとSynNhaPのＮａ＋/Ｈ＋対向輸送活性が減弱することがわかっている（9）。ApNhaPはSynNhaPに相同性が最も高いが、この2種のアンチポーターのC末端テールにかかる電荷は有意に異なり、ApNhaPは22個の塩基性アミノ酸と14個の酸性アミノ酸、SynNhaPは15個の塩基性アミノ酸と24個の酸性アミノ酸である。そのためわれわれは、図８に示されるようなASNhaPとSANhaPのキメラアンチポーターを構築し、そのなかでApNhaPの長いC末端テールをSynNhaPのテールに、SynNhaPの長いC末端テールをApNhaPのテールにそれぞれ置換した。反転膜小胞を用いてキメラの交換活性を評価した。
【００４０】
即ち、ApNhaPのTM領域（アミノ酸残基Met１−Ile４０１）とSynNhaPのC末端領域細胞質領域（アミノ酸残基Gln４０１−Ser５２７）をコード化するキメラ遺伝子を次のように構築した（図1）。ApNhaPのTM領域とSynNhaPのC末端領域に相当するヌクレオチドをそれぞれ正方向／逆方向プライマーセットであるANP-NcoI/ANP-N-RおよびSNP-C-F/SNP-C-Rによって増幅した。前者ヌクレオチドの鋳型はpANhaPであり、後者ヌクレオチドの鋳型はsynnhaP遺伝子がpTrcHis2CのNcoI/EcoRI部位に結合したpSNhaPであった（9）。正方向のプライマーであるSNP-C-Fにはポリペプチドの伸長部であるApNhaPのGln３９８-Thr-Val-Ile４０１とSynNhaPのGln４０１-Phe-Val-Leu４０４に相当する配列が含まれており、逆方向のプライマーであるANP-N-RはSNP-C-Fの相補配列である。逆方向のプライマーSNP-C-RにはpSNhaPの終止コドンの直前にEcoRI切断部位がある。両方のPCR産物を合わせて、正方向のANP-NcoIプライマーと逆方向のSNP-C-Rプライマーを用いてキメラ遺伝子apsynnhaPを増幅し、プラスミドpASNhaPを作製したpTrcHis2CのNcoI/EcoRI消化部位に結合させた。
【００４１】
次に、SynNhaPのTM領域（アミノ酸残基Met１−Thr４００）とApNhaPのC末端領域（アミノ酸残基Glu４０２−Glu５２１）をコード化するキメラ遺伝子構築のために、SNP-N-F/SNP-N-RおよびANP-C-F/ANP-HindIIIの正方向／逆方向プライマーセットによって各ヌクレオチドを増幅した。本実施例で用いる逆方向プライマーであるSNP-N-RはANP-C-Fの相補的配列である。両方のPCR産物を合わせて、正方向SNP-N-Fおよび逆方向ANP-HindIIIプライマーを用いてキメラ遺伝子synapnhaPを増幅させ、プラスミドpSANhaPを作製したpTrcHis2CのNcoI/HindIII消化部位に結合させた。
【００４２】
その結果、図９に示すように、ASNhaPキメラは図６に示す親ApNhaPのＮａ＋/Ｈ＋、Ｌｉ＋/Ｈ＋、Ｃａ２＋/Ｈ＋交換活性に匹敵する活性を示した。興味深いことに、ApNhaPではまず検出不能なＬｉ＋/Ｈ＋交換活性が（図６（Ｂ））、ASNhaPキメラでは明らかに観察された（図９（Ｂ））。その一方でSANhaPキメラは親SynNhaPに比して、Ｎａ＋/Ｈ＋およびＬｉ＋/Ｈ＋の両方の交換活性が減弱した（図９と図６）。更に、SANhaPキメラのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性はpH依存的で、pHが中性またはアルカリ性の場合に活性の増強が観察されるようである（図９（Ｃ））。これはpHには関係なく相対的に活性が変化しない親SynNhaPでの観察とは対照的である（図６（Ｃ））。活性化のデータには矛盾もみられるが、このような結果はC末端領域がApNhaPおよびSynNhaPのイオン特異性にある種の働きをすることを示唆している。たとえば、SANhaPキメラはApNhaPおよびSynNhaPに比べてＮａ＋/Ｈ＋交換活性が低く（図９（Ａ）と図６（Ａ））、ASNhaPキメラのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性はpH依存的であるが、これは親ApNhaPと同じであるがSynNhapとは異なる（図９（Ｃ））。このような結果は、ApNhaPおよびSynNhaPのイオン特異性もTM領域の構造によって変化し、ほとんどのＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターにも同じことが考えられることを示唆している（1）。
【００４３】
キメラの交換活性データは相補性解析によってさらに実証された。図１０に示されるように、ASNhaPキメラはE. coli変異体のＮａ＋、Ｌｉ＋およびＣａ２＋感受性表現型を相補するが、SANhaPキメラがE. coli変異体のＮａ＋およびＬｉ＋感受性表現型を相補することはまずない。SANhaPを発現するE. coli変異体細胞の増殖速度はSANhaPキメラのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性から予測される速度よりも遅かった（図１０（Ｃ）及び図９（Ｃ））。
【００４４】
【実施例６】
次に、淡水らん色細菌Synechococcus sp. PCC7942において8種のプラスミドを過剰発現させ、耐塩性を試験した。
即ち、耐塩性らん色細菌Aphanothece halophytica（A. halophytica）由来のＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体ApNhaPの発現プラスミドpUC303-ApNhaP(33)、A. halophytica由来の分子シャペロンDnaKの発現プラスミドpUC303-DnaK(34)、E. coli由来のカタラーゼの発現プラスミドpUC303-KatE(35,36)、E. coli由来のベタイン合成遺伝子の発現プラスミドpUC303-Bet(37,38)と、それを組み合わせたものである。これらはそれぞれイオンホメオスタシス、蛋白質の折りたたみ、活性酸素のクエンチ、浸透圧保護物質として機能すると考えられている。E. coliでは4つの遺伝子がベタイン合成に関与しており(37)、betA, betB、betTがそれぞれコリンデヒドロゲナーゼ、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ、コリン輸送体をコード化し、betIは調節遺伝子をコード化する。発現プラスミドpUC303-DnaK(34)ではgrpEおよびdnaJが部分遺伝子であり、dnaKは機能性蛋白質をコード化する。このすべての遺伝子が自らのプロモーター配列を使用する。Synechococcus sp. PCC7942細胞はpUC303-Bm（対照）、pUC303-ApNhaP, pUC303-KatE, pUC303-Bet, pUC303-DnaK, pUC303-KatE/Bet, pUC303-ApNhaP/KatE, pUC303-ApNhap/KatE/Betプラスミドで形質導入された（図11）。
【００４５】
発現ベクターの構築
発現プラスミドpUC303-DnaKの構築のために、A. halophytica由来dnaK遺伝子(34)を含む3kbpの断片をSspIおよびEcoRVで消化して平滑断端にし、pUC303-BmをEcoRI-およびSalI-二重消化して平滑断端にした部位へ結合させた。耐塩性らん色細菌A. halophytica由来のＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体の発現プラスミドで、自身のプロモーターを含有するプラスミドを次のように調製した。テンプレートとしてpANhaPを用いるPCR法で、apnhaP遺伝子の539位にあるEcoRI切断部位からpTrHis2CのHisタグ配列の直後にある終止コドンまでのＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体断片を増幅した(33)。正方向のプライマーであるApNhEcF1 5’-TGGGAATTCCCCTCGGAA-3’にはEcoRI部位が含まれ、逆方向のプライマーであるApNhBmR1 5’-GTGGATCCTCAATGATGATGATGATG-3’には終止コドンの後にBamHI切断部位が含まれる。増幅断片をpBluescript IISK+のEcoRV部位に結合する。-194からEcoRI切断部位がある539までの別のＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体断片はA. halophyticaをテンプレートとしてゲノム遺伝子を用いたPCR法で増幅した。正方向のApNhEcF 2,5’-CTGAATTCGATCGCGGCTCATATT-3’にはEcoRI切断部位が含まれ、逆方向のプライマーApNhEcR2 5’-GGGAATTCCCACTAATAGA-3’にも539にEcoRI切断部位がある。amnhaP遺伝子のC末端部がすでに結合しているpBluescript II SK+のEcoRI消化部位に増幅断片を結合させた。配向を確認した後、正しく結合したプラスミドpBApNhaPをBamHIによって消化し、E.coli/SynechococcusシャトルベクターpUC303-BmのBamHI消化部位に結合させた(38)。これで得られたプラスミドをpUC303-ApNhaPと呼ぶ。apnhaPおよびkatE遺伝子の共発現のために、E. coli由来のkatE遺伝子をSaII/BamHI消化部位に結合させて、プラスミドpUC303-KatEを用いた。KatE遺伝子はカナダのManitoba UniversityのP.C. Loewen教授から分譲していただいたものである(35)。プラスミドpUC303-KatEをXbaIで消化し、平滑断端にした。apnhaP遺伝子はBamHIでpUC303-ApNhaPを消化し、平滑断端して調製した。得られたapnhaP遺伝子はXbaI消化pUC303-KatEに結合させ、プラスミドpUC303-ApNhaP/KatEを調製した。apnhaP, katEおよびbet遺伝子の共発現のために、プラスミドpUC303-KatE/BeTを用いた。pUC303-KatE/BeTはXbaIで消化して平滑断端してから、そこにBamHIで切断して平滑断端にしたapnhaP遺伝子を結合させた。これで得られたプラスミドをpUC303-ApNhaP/KatE/BeTと呼ぶ。Synechococcus細胞を形質変換するためにこのプラスミドを用いた(38)。
【００４６】
ストレス下でのらん色細菌の増殖
連続白色蛍光を照射（30μＥｍ−２ｓ−１）の下、10μgml−１ストレプトマイシンを補充したBG11液体培地に気泡を送りながら、Synechococcus細胞を30℃で継代培養した(359)。bet遺伝子が発現すると、100μMコリンを添加した。塩ストレスをかけるために、種々の濃度のNaCl（0〜0.6M）を含有する新鮮培地に後期対数増殖期の細胞を移した。この培養物を数日間インキュベートした。この期間中に、Shimadzu UV-160Aを用いて730nmの吸収を測定しながら、細胞増殖をモニタリングした。SDS-PAGEおよび免疫ブロッティング法をこれまでに発表された方法で実施した(34)。6-ヒスチジン（6×Hisタグ）に対して産生される抗体をR&D Systems, Inc.（USA）から得た。DnaK蛋白を免疫ブロッティング法で検出した(34)。TOF-MS（モデルKOMPACT MALDI IV tDE Shimdzu／Kratos）を用いてグリシンベタインを測定し、活性染色によってカタラーゼ活性を評価した(35)。
【００４７】
その結果、すべての形質転換体がほぼ同じ速度で増殖でき、この形質転換体が低塩度条件下で増殖を損なわないことが示された（図１２A）。高塩度では、淡水らん色細菌Synechococcus PCC7942（対照細胞）の増殖速度が低下し、0.375M NaClより高濃度では明らかに増殖が認められなくなった。0.4M NaClでは、対照細胞およびdnaK発現細胞は増殖せず、betまたはkatE発現細胞は増殖できたが、その速度はapnhaP発現細胞よりも遅かった（図１２B）。katEおよびbetを共発現するSynechococcus細胞はkat発現細胞またはBet単独よりも若干増殖が速かった。このような結果はこれまでの報告と一致しており(35,38,39)、betまたはkatEの過剰発現によって塩ストレスに対する耐性を獲得したことを示している。apnhaP, katEおよびbetを共発現した細胞はapnhaP発現細胞に比べて増殖速度が若干低かった。katE(35), bet(38)およびdnaK(34)の発現は上記要領で確認した。NaClの濃度を0.5Mに上げると、種々の形質転換体でさらに増殖速度の低下が観察された。対照およびdnaK発現細胞のほかに、katEおよび／またはbetを発現する細胞も増殖できなかった（図１２C）。apnhaP発現細胞のみが、apnhaPおよびkatE共発現細胞やapnhaP, katEおよびbet共発現細胞に比べて増殖速度が速かった。このようなデータから、ApNhaPの過剰発現によってSynechococcus細胞の耐塩性が向上し、他の関連蛋白によるApNhaPの共発現ではApNhaP発現細胞の耐塩性が向上しなかった。
【００４８】
Ｎａ ＋ / Ｈ ＋ 対向輸送体活性の測定
ApNhaP蛋白はapnhaP発現細胞で検出されており、0.3M NaClで増殖した対照細胞では検出されなかった（図１3A）。1日でApNhaPの最高濃度に達した。従って、apnhaP発現細胞の高塩度に対する耐性がApNhaP蛋白の活性によるものと考えられる。
そこで、次に、実際に、Ｎａ＋/Ｈ＋活性を基本的にNakamuraら(40)の方法にしたがって測定した。簡潔に説明すると、50ｍMジエタノールアミン-HClを含有する0.15MNaCl（pH9.3）にSynechococcus sp.PCC 7942細胞を浮遊させた。この処置によって、細胞内Ｋ＋はＫ＋/Ｈ＋対向輸送体の働きによってジエタノールアミンに代わった。20mM HEPES-NaOH緩衝液を含む0.15M NaCl（ｐH8.5）を用いて、アミン負荷細胞を洗浄した。この段階で細胞内部はジエタノールアミンの放出によって酸性になり、Ｎａ＋はＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体によってＨ＋に交換しようとする負荷がかかった。Ｎａ＋/Ｈ＋対向輸送体活性を測定する前に、0.2％グルコースを添加して細胞を賦活化し、次に50ｍMのジエタノールアミン-HCl（pH8.5）を加えた。適宜、細胞を濾過によって回収し、Shimdzu Personal Ion Analyzer PIA-1000によってフィルター上のＮａ＋イオンを測定した(35)。
【００４９】
その結果得られた、ジエタノールアミンの添加によるＮａ＋負荷細胞のＮａ＋排出活性を図１３B〜Dに示す840)。中性ジエタノールアミンは細胞を貫通し、プロトン化した。必要なプロトンはＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体を介して、Ｎａ＋の交換によって、細胞外から取り込まなければならない。このようにＮａ＋の排出活性はＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体活性を反映している。対照とApNhaP発現細胞が異なる塩度条件下で異なるＮａ＋排出活性を示すかどうか調べた。図１３B〜Dに、ジエタノールアミンを添加して細胞内Ｎａ＋が最初の数分できわめて急速に減少し、その後緩徐に減少していった。細胞内Ｎａ＋が最も大きく減少したのは、0.3M NaClを含有するBG11培地で増殖する細胞（図１３C）であり、これに続いて何も添加しない培地（図１３B）、次に0.5M NaClを含有する培地（図１３D）で増殖する細胞であった。対照とNaClが不在で増殖したApNhaP発現細胞との間にＮａ＋排出活性の差はなかった（図１３B）。0.3M NaClで増殖させた場合、対照細胞に比して、ApNhaP発現細胞ではやや強いＮａ＋排出活性が観察され（図１３C）、0.5M NaClで増殖させた場合さらに大きい差が観察された（図１３D）。このようなすべての結果から、ApNhaP発現細胞が対照細胞に比して高塩度で対向輸送体活性が高いことが示された。
【００５０】
次に、ApNhaP発現細胞の増殖速度に対する塩の刺激作用を調べた。塩刺激（0.65M NaCl）によって、ApNhaP発現細胞は10時間後まで増殖可能であったが、対照細胞はそれより遅い速度で3時間までしか増殖しなかった（図１４A）。細胞死はApNhaP発現細胞に比べて対照細胞で高速かつ早期に検出された。1.2時間の塩ショック後に、ジエタノールアミンを添加すると対照細胞に比してApNhaP発現細胞で強いＮａ＋排出活性が観察された（30％と75％、15分）（図１４B）。
【００５１】
光合成活性の評価
塩ストレスは数種の光合成生物で光合成活性を損なうことがわかっている(39)。ApNhaPの発現は塩刺激後の光合成活性を増強させるかどうかを調べるために、現在作用している光化学系II（PS II）の割合を以下にしめすように、R値で表して測定した。
即ち、光化学系II（PSII）における見かけ上の量子収量をPAM 蛍光光度計（Walz, Effeltrich,ドイツ）を用いて測定した(35)。650nmのピーク発光で光発光ダイオードからパルス変調励起を得た。変調した蛍光をλ>710nmで測定した（Schott RG9ロングパスフィルタ）。PAM-102およびPAM-103の付属モジュールはそれぞれ照射光（actinic light）と飽和パルスの管理に用いた。測定前に、10分間細胞を暗室におき、連続光（200μＥｍ−２ｓ−１）のもとPSIIの量子収量を測定した。PSIIの量子収量をF/Fm’=（Fm’-F）/Fm’の式で計算した。式中、FおよびFm’はそれぞれ飽和フラッシュ前後の照射下の蛍光レベルを表す。フラッシュの強度と持続時間は、それぞれ7000μＥｍ−２ｓ−１と800msであった。
その結果、図１４Cに示すように、塩刺激前は対照のR値もApNhaP発現細胞のR値もほぼ同じ0.90と0.85であった。しかし、塩刺激から1.2時間後、この値はそれぞれ0.32と0.64に減少した。これを図１４Bの結果と総合すると、光合成活性を強く維持する細胞の力は有効なＮａ＋排出に左右されることが判った。
【００５２】
ApNhaP 発現細胞の海水中での増殖
更に、図１５Aに示すように、ApNhaP発現細胞が海水中で増殖できるということを実際に確認した。海水は愛知県三河地方で採取したものであり、その塩度は30.4psuであった。Betおよび／またはKatEのいずれかを発現する形質転換細胞は海水中で増殖できなかった。ApNhaPおよびKatEの共発現はApNhaP発現細胞の増殖速度に比べて速かったが、0.5M NaClを含有するBG11を増殖培地として用いた図１２Cの結果とは対照的である。ApNhaP発現細胞に比べて増殖速度は遅かったものの、ApNhaP, KatEおよびBetを共発現するSynechococcus細胞は海水中でも増殖を維持することができた。このような結果から、ApNhaPの過剰発現によって淡水らん色細菌Synechococcus細胞が海水中で増殖できるほどの耐塩性を獲得したことは明確である。海水中でSynechococcus細胞が増殖する間、対照とApNhaP発現細胞との吸収スペクトルの差が認められた。図１５Bに示すように、ApNhaP発現細胞は630 〜680nmの領域で典型的な吸収速度を示した。これに対して、対照細胞は680nm領域に比べて630nm領域での吸収性は有意に低いことがわかる。この吸収ピークはそれぞれフィコビリソームとクロロフィルを表しているので、上記データは対照細胞のフィコビリソームの変性がクロロフィルよりも早く生じたことを示しており、フィコビリソームが高塩度による損傷を受けやすいターゲットであることがわかる。
【００５３】
Synechococcus細胞は低塩度でのＮａ＋とＨ＋の交換能が十分であることが上記データから判明した。高塩度では、Ｎａ＋排出活性が弱いためにSynechococcus細胞がＮａ＋流入にうまく対応できず、増殖が中止した。Synechococcus細胞でのApNhaPの過剰発現によって、高塩度培地および海水中において増殖を再開できた。これは淡水らん色細菌Synechococcus sp.PCC7942が遺伝子工学によって海水中で生存できたことを示す最初の報告である。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によって、新たなイオン特異性を有するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子を単離することに成功し、該遺伝子で形質転換したアンチポーター欠損株である大腸菌においてＮａ＋感受性表現型及びＣａ２＋感受性表現型が相補されることが判明した。更に、該遺伝子で形質転換された淡水らん色細菌Synechococcus細胞内におけるApNhaPの過剰発現によって、淡水らん色細菌が海水中で増殖できるほどの耐塩性を獲得出来ることが判明した。
従って、本発明は、該遺伝子を利用して、耐塩性作物を開発、創出して食料生産の向上に寄与することの出来る、有力な方法を提供するものである。
【００５５】
引用文献
1. Padan, E., and Schuldiner, S.(1996) in Handbook of Biological Physics (Konings, W. N., Kaback, H. R., and Lolkema, J. S., eds) vol.2, pp.501-531, Elsevier Science, Amsterdam
2. Orlowski, J., and Grinstein, S.(1997) J. Biol. Chem. 272, 22373-22376
3. Blumwald, E.,Aharon, G. S., and Apse, M. P.(2000) Biochim. Biophys. Acta 1465, 140-151
4. Nass, R., Cunningham, K. W., Rao, R. (1997) J. Biol. Chem. 272, 26145-26152
5. Nass, R., and Rao, R. (1998) J. Biol. Chem. 274, 21054-21060
6. Gaxiola, R. A., Rao, R., Scherman, A., Grisafi, P., Alper, S. L., and fink, G. R. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96,1480-1485
7. Jia, Z. P., McCullough, N., Martel, R., Hemmingsen, S., and Young, P. G.(1992) EMBO J. 11,1631-1640
8. Shi, H., Ishitani, M., Kim, C., and Zhu, J. K. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6896-6901
9. Hamada, A., Hibino, T., Nakamura, T., and Takabe. T. (2001) Plant Physiol. 125, 437-446
10. Wakabayashi, S., Fafournoux, P., Sardet, C., and Pouyssegur, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 2424-2428
11. Inoue, H., Noumi, T., Tsuchiya, T., and Kanazawa, H. (1995) FEBS Lwtt.363, 264-268
12. Nakamura, T., Komano, Y., and Unemoto, R. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1230, 170-176
13. Utsugi, J., Inaba, K., Kuroda, T., Tsuda, M., and Tsuchiya, T. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1398, 330-334
14. Ivey, D. M., Guffanti, A. A., Zemsky. J., Pinner, E., Karpel, R., Padan, E., Schuldiner, S., and Krulwich, A. (1994) J. Biol. Chem. 268.11296-11303
15. Ishitani, M., Takabe, T., Kojima, K., and Takabe, T. (1993) Aust. J. Plant Physiol. 20, 693-703
16. Takabe, T., Incharoensakdi, A., Arakawa, K., and Takabe, T. (1997) Plant Physiol. 88, 1120-1124
17. Lee, B. H., Hibino, T., Jo, J. Viale, A. M., and Takabe, T. (1997) Plant Mol. Biol. 35, 763-775
18. Hibino, T., Kaku, N., Yoshikawa, H., Takabe, T., and Takabe, T. (1999) Plant Mol. Biol. 40, 409-418
19. Sugino, M., Hibino, T., Tanaka, Y., Nii, N., Takabe, T. and Takabe, T. (1999) Plant Sci, (Shannon) 137, 81-88
20. Triglia, T., Peterson, M. G., and Kemp, D. J. (1998) Nucleic Acids Res. 25, 8186
21. Ohyama, T., Igarashi, K., and Kobayashi, H. (1995) J. Bacteriol. 176, 4311-4315
22. Rosen, B. P. (1986) Methods Enzymol.125, 328-336
23. Kyte, J., and Doolittle, R. F. (1982) J. Mol. Biol 157, 105-132
24. Hofmann, K., and Stoffel, W. (1992) Comput. Appl. Biosci. 8, 331-337
25. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A. L., and Randall, R.J. (1951) J. Bio;. Chem. 193, 265-275
26. Brockman, R. W., and Heppel, L. A. (1968) Biochemistry 7, 2554-2562
27. Cunningham, K. W., and Fink, G. R. (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 2226-2237
28. Ueoka-Nakanishi, H., Nakanishi, Y., Tanaka, Y., and Maeshima, M. (1999) Eur. J. Biochem. 262, 417-425
29. Biemesderfer, D., DeGray, B., and Aronson, P. S. (1998) J. Biol. Chem. 273, 12391-12396
30. Wells, K. M., and Rao, R. (2001) J. Biol. Chem. 276, 3401-3407
31. Ono, K., Hibino, T., Kohinata, T., Suzuki, S., Tanaka, Y., Nakamura, T., Takabe, T., and Takabe, T. (2001) Plant Sci. (Shannon) 160, 455-461
32. Apse, M. P., Aharon, G. S., Snedden, W. A., and Blumwald, E. (1999) Science 285, 1256-1258
33. Waditee，R．et al. Halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica，cotains an Na+/H+ antiporter, homologous to eukaryoticones,with novel ion specificity affected by C-terminal tail.(2001) J．Biol．Chem．in press
34. Lee, B. H., Hibino, T., Jo, J., Viale, A. M. and takabe, T. (1997) Plant. Mol. Biol. 35, 763-775
35. Kaku, N. et al (2000) Plant Science 159, 281-288
36. Ossowski, I., Mulvey, M. R., Leco, P.A., Borys, A. and Loewen, P. C. (1991) J. Bacteriol. 173 514-520
37. Lamark, T., Kaasen, I., Eshoo, M. W., McDougall, J. and Strom, A. P. (1991) Mol. Microbiol. 5, 1049-1064
38. Nomura, M., Ishitani, M., Takabe, T., Rai, A. K. and Takabe, T. (1995) Plant Physiol. 107, 703-708
39. Deshnium, P., Los, D. A., Hayashi, H., Mustardy, L. and Murata, N. (1995) Plant Mol Biol. 29, 897-907
40. Nakamura, T., Komano, Y. and Unemoto, T. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1230, 170-176
41. Kaku, N. et al. (1999) Plant Cell Physiol. 40, 557-564
42. Sugino, M., Hibino, T., Nii, N., Takabe, T., and Takabe, T. (1999) Plant Science 146, 81-88
43. Ono, K. et al. (2001) Plant Science 160, 455-461
44. Kishitani, S. et al. (2000) Plant Cell Environ. 23, 107-114
45. Takabe, T. et al. (1998) Glycinebetaine and the genetic engineering ofsalinity tolerance in plants. In Stress Responses of Photosynthetic Organisms. Edited by Satoh, K. and Murata, N. pp.115-131. Elsevier Science, Amsterdam.
46. Tanaka, T. et al. (1999) Plant Science 148, 131-138
【００５６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 pASNhaPとpSANhaPのキメラプラスミド構築に関する概略図（B）を示す。
【図２】 A. halophyticaのapnhaP座のゲノム構造 A：遺伝子と制限部位 B：apnhaPとチトクロムｃ５５０の接合部のヌクレオチド配列。apnhaPとチトクロムｃ５５０のヌクレオチド配列から演繹したapnhaPの推定上の-10（ATGAAT）および-35（TACACT）コンセンサス配列とアミノ酸配列も示す。
【図３】 Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターの推定アミノ酸配列の比較 A：8種の生物に由来するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの推定アミノ酸配列のアラインメント。この配列はプログラムClustalWによって整列化した。このアラインメントはSOS1、ヒトNHE1、酵母NHX1のN末端の550個のアミノ酸残基をもとにしている。すべての配列に保存されたアミノ酸残基を黒で強調表示し、保存的置換を点で示した。保存Asp（ApNhaPのAsp１３９）をアスタリスクで示す。予測される膜貫通領域をアラインメントの上に示す。 B：8個のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの系統学的解析。複数の配列アラインメントと系統樹の作製はそれぞれClustalWおよびTreeViewソフトを用いた。
【図４】 3種のE. coli細胞の増殖速度に対するＮａＣｌの作用 LBK培地における対数増殖期の対照細胞と形質転換細胞を指示されたＮａＣｌ濃度を含む新鮮LBK培地（pH 7.0）に移した。 A：LBK培地における増殖の推移 B：0.2 M ＮａＣｌを含有するLBKにおける増殖の推移 丸：対照細胞 四角：ApNhaP発現細胞
三角：SynNhaP発現細胞。各値は3つの測定値の平均である。
【図５】 3種のE. coli細胞の増殖速度に対するpHとＮａＣｌの作用 LBK培地における対数増殖期の対照細胞と形質転換細胞を指示されたＮａＣｌ濃度を含み、指示されたpHの新鮮LBK培地に移した。増殖温度は30℃であった。0 M ＮａＣｌ（A）、0.2 M ＮａＣｌ（B）0.5 M ＮａＣｌ（C）を含むLBK培地での増殖の推移。白四角：ApNhaP発現細胞、pH 8.0。網掛けした四角：pH 8.5。黒四角：pH 9.0。白三角：SynNhaP発現細胞、pH 8.0。網掛けした三角：pH 8.5。黒三角：pH9.0。白丸：対照細胞、pH 8.0。網掛けした丸：ph 8.5。黒丸：pH 9.0。各値は3つの測定値の平均である。
【図６】 アクリジンオレンジ蛍光クエンチング法で測定したＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性 対照E. coli細胞とApNhaPおよびSynNhaPを発現するE. coli細胞を塩を追加することなくLBK培地で増殖させた。この細胞から反転膜小胞を調製した。アンチポーター活性は実施例に記載した要領で測定した。上段にはApNhaP発現細胞と対照細胞（pTrcHis2C）の典型的なクエンチングパターンを示す。A, B, Cにはそれぞれ、Ｎａ＋/Ｈ＋, Ｌｉ＋/Ｈ＋,Ｃａ２＋/Ｈ＋アンチポーター活性のpH依存性を示した。塩（ＮａＣｌ, LiCl, ＣａＣｌ２）の最終濃度は5 mMであった。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図７】 3種のE. coli細胞の増殖速度に対するLiClおよびＣａＣｌ２の作用 規定のLiClまたはＣａＣｌ２濃度のLBKまたはトリスE培地に、LBK培地で対数増殖期にある対照細胞および形質転換細胞をそれぞれ移した。他の実験条件は図４の説明に記載したとおりである。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図８】 キメラＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの副次的構造モデル キメラＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターを実施例に記載の要領で構築した。C末端親水性尾部にかかる陽性電荷と陰性電荷の数を示す。
【図９】 キメラアンチポーターの活性 ASNhaPキメラとSANhaPキメラを発現するE. coli細胞は塩を追加することなくLBK培地で増殖させた。この細胞から反転膜小胞を調製した。アンチポーター活性は実施例に記載の要領で構築した。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図１０】 ASNhaPキメラとSANhaPキメラを発現するE. coli細胞の増殖速度に対するＮａＣｌ, LiCl, ＣａＣｌ２の作用 LBK培地で対数増殖期にあるASNhaPキメラとSANhaPキメラを発現するE. coli細胞を0.2 M ＮａＣｌを含むLBK培地、0.4 mM LiClを含むLBK培地、0.1 M ＣａＣｌ２を含むトリスE培地に移した。他の実験条件は図４の説明に記載した要領と同じである。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図１１】 発現ベクターの概略図を示す。
【図１２】 対照と形質転換Synechococcus細胞の増殖速度に対する塩ストレスの作用。規定のNaCl濃度を含む新鮮培地にBG11培地で対数増殖期にある対照と形質転換細胞を含浸して、塩ストレスをかけた。
【図１３】 ApNhaPの蓄積量（A）とＮａ＋負荷細胞からのＮａ＋排出量（B,C,D）。Aでは、対照とApNhaP発現細胞をBG11培地で増殖し、0.3M NaCl含有培地に移した。規定時間インキュベートした後、細胞を回収し、免疫学的分析を行った。B,C,Dでは、対照（白丸）とApNhaP発現細胞（黒丸）を規定濃度のNaClを含むBG11培地のなかで１日増殖させた。次に、Ｎａ＋排出を誘発するジエタノールアミン（EA）を測定した。
【図１４】 対照とApNhaP発現Synechococcus細胞における増殖速度（A）、Ｎａ＋排出活性（B）、光合成電子輸送活性（C）に対する塩刺激の作用。BG11培地で対数増殖期の対照およびApNhaP発現細胞を回収し、0.65M NaClを含有する新たな培地に移した。
【図１５】 海水中の対照と形質変換Synechococcus細胞の増殖曲線（A）と吸収スペクトル（B）。BG11培地で対数増殖期の対照および形質転換細胞を海水に移した。海水に移して3日後に、対照およびApNhaP発現細胞の吸収スペクトル（B）を測定した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、特に、耐塩性藍藻（らん色細菌：Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、及び該遺伝子の発現による耐塩性の向上に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今日、世界中の耕作地の20％、灌漑地のほぼ半分が高塩度の被害を受けているといわれている。高塩度は植物のイオン不均衡および高浸透圧によるストレスを誘発する。高塩度環境で生き延びる生物は内部浸透圧を調節する特異な機序を有している。そのような機序のひとつが砂糖、ある種のアミノ酸、第四アンモニウム化合物などの低分子量有機化合物の溶質を蓄える能力である。高塩度に適応するもうひとつの機序はＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターおよびＮａ＋-ATPアーゼの一機能として提唱されている細胞からのＮａ＋排出である。塩ストレスは、このような毒性作用のほかに、酸化ストレスも誘発する。従って、近年、遺伝子工学を利用して植物の耐塩性の改善が試みられている。
【０００３】
Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターは細胞膜を介してＮａ＋をＨ＋に交換する反応を触媒し（Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性）、細胞質内のpH、細胞容積、細胞質内ナトリウム濃度の制御など種々の機能を果たしている（1-3）。Escherichia coliでは、3種のアンチポーター（NhaA, NhaB, ChaA）が知られており、その機能的特徴も十分に解明されている（1）。動物では6種の相同Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター（交換）（NHE1-6）が判明している（2）。植物および酵母では、空胞型（NHX1およびAtNHX1）（4-6）と形質膜型（SOD2およびSOS1）（7,8）のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターが報告されている。E. coliアンチポーターと真核細胞アンチポーターの相同性はきわめて低く、Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子は別々に進化が独立したことが示唆される。
【０００４】
このようなＮａ＋／Ｈ＋ アンチポーター遺伝子を用いると、植物の耐塩性が向上するという報告が、最近（１９９９年、Science、２００１年Nature Biotechnology）にカナダBlumbald他によりなされた。Blumbald他はアラビドプシスの液胞膜のＮａ＋／Ｈ＋ アンチポーター遺伝子を、アラビドプシスの液胞膜(Science 1999)、トマトの液胞膜(2001 Nature Biotechnology)で発現させることにより、ともに０．２Ｍ ＮａＣｌ中でも生育することを報告している。これは、細胞の中にある液胞膜の内側にＮａＣｌを蓄積させることにより耐塩性を向上させるものである。
【０００５】
このように、遺伝子工学の技術によって植物の耐塩性を改善する少なからぬ努力が行われているが、実用化にこぎつけるほど十分な結果は得られていない。
さて、植物に比べると単細胞のらん食細胞は単純であり、光合成生物における耐塩性を担う因子を解明するためには適切なモデルである。藍藻は太陽エネルギーおよび無機体炭素ＣＯ２を利用して増殖できる酸素を発生する光合成生物である。このような生物はきわめて低濃度から海水よりも高濃度まで塩を含有する水中などほぼすべての生息地で確認される。しかし、どの遺伝子が異なる塩度への適応に関与するのか、不明である。そこで、高塩度に対応するマスター調節遺伝子を同定することは、藍藻の耐塩性の機序を理解するばかりでなく、作物の収穫量を向上させる点で植物への応用にも重要である。
【０００６】
本発明者等はこれまでの試験で（9）、藍藻Synechocystis sp. PCC6803にはＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターSynNhaP１が存在し、真核細胞および原核細胞（Pseudomonas aeruginosa由来NhaP）のアンチポーターと相同であるが、NhaA, NhaBおよびChaAとは相同でないことを明らかにしてきた。さらに、SynNhaPには膜貫通（TM）領域に保存されたＡｓｐ１３８と比較的長いC末端親水性テールがあり、いずれも担体活性に重要であることも示してきた。長いC末端テールは動物の輸送活性を制御する働きがあると考えられている（2,10）。このような知見から、藍藻のアンチポーターは真核細胞のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの構造的特性と機能的特性を試験するためのモデル系になることがわかる。
【０００７】
現在までに、Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター蛋白質ではごくわずかな機能性アミノ酸残基、特に陽イオン輸送に関わるアミノ酸残基が特定されている。SynNhaPのＡｓｐ１３８（9）、NhaAのＡｓｐ１３３, Ａｓｐ１６３, Ａｓｐ１６４（11,12）の重要性が報告されている。Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターはＨ＋とＮａ＋またはＬｉ＋との間を特異的に交換するが、Ｈ＋とＬｉ＋との交換活性が弱いアンチポーターもいくつかある（13）。E. Coli ChaAはアルカリ性pHでＣａ２＋とＨ＋、Ｎａ＋とＨ＋の交換活性を有すると報告されているが、詳細に調べられたことがない。どの因子によってイオン特異性が決まるのか不明である。Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターの陽イオン輸送のための保存配列を特定するためには、新たなイオン特異性を有するアンチポーターのクローニングが欠かせない。
【０００８】
Aphanothece halophyticaは0.25〜3.0M ＮａＣｌと広範な塩度条件下で増殖可能な耐塩性藍藻である（15,16）。A. halophyticaは高塩度で浸透圧保護物質グリシンベタインを蓄積し（15）、A. halophyticaのDnaK蛋白は、他のDnaK/Hsp７０ファミリー（17）より長いC末端セグメントを有しており、高塩度できわめて強い蛋白質折りたたみ活性を示すことが報告されている（18）。A. halophytica由来DnaK蛋白によるタバコの形質転換によって、耐塩性が増強されることも判明している（19）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、遺伝子工学の技術によって植物の耐塩性を向上させることのできる有用な遺伝子を見出し、該遺伝子を利用して、耐塩性作物を開発、創出して食料生産の向上に寄与する方法を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、A. halophyticaに独特のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター（ApNhaP）があるかどうか研究した結果、真核細胞に相同であるが、新たなイオン特異性を有するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子を単離することに成功し、更にそのイオン特異性がC末端領域によって変化することも明らかにした。
【００１１】
更に、淡水藍藻Synechococcus sp. PCC7942において8種のプラスミドを過剰発現させ、耐塩性を試験した。その結果、ベタイン合成、カタラーゼおよびシャペロンに関与する遺伝子を比較して、耐塩性藍藻由来のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子を過剰発現することによって、このSynechococcus細胞を0.5M NaClを含有するBG11培地でも海水中でも増殖することが判明し、淡水藍藻の耐塩性を大きく改善することに成功した。
【００１２】
即ち、本発明は、以下の各態様に係る。
（１）耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡ。
（２）全ｐＨ領域においてＬｉ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を実質的に示さず、中性及びアルカリ性ｐＨ領域においてＣａ２＋／Ｈ＋アンチポーター活性を示すことを特徴とする、藍藻由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡ。
（３）藍藻が耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica)である、２記載のＤＮＡ。
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含有するＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質。
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１における第７９６〜２３６１番目の塩基対からなる塩基配列、
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（６）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ビークル。
（７）大腸菌由来プラスミドベクターである６に記載の組換え発現ビークル。
（８）大腸菌／淡水藍藻シャトルベクターである６に記載の組換え発現ビークル。
（９）６、７又は８に記載の発現ビークルによって形質転換された形質転換体。
（１０）細菌である９に記載の形質転換体。
（１１）大腸菌である１０に記載の形質転換体。
（１２）大腸菌がアンチポーター欠損株である１０に記載の形質転換体。
（１３）Ｎａ＋感受性表現型及びＣａ２＋感受性表現型が相補された１２に記載の形質転換体。
（１４）藍藻である９に記載の形質転換体。
（１５）藍藻が淡水性藍藻である１４に記載の形質転換体。
（１６）海水中で増殖可能な淡水性藍藻である１５に記載の形質転換体。
（１７）植物である９に記載の形質転換体。
（１８）植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、１７に記載の形質転換体。
（１９）Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターを過剰発現することを特徴とする、１４乃至１８のいずれか一項に記載の形質転換体。
（２０）Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が増加した、１４乃至１８のいずれか一項に記載の形質転換体。
（２１）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることから成る、該宿主の耐塩性を向上させる方法。
（２２）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ビークルによって宿主を形質転換し、該ＤＮＡを宿主細胞内で発現させることから成る、該宿主の耐塩性を向上させる方法。
（２３）細胞外にＮａＣｌを排出させることにより耐塩性を向上させる、２１又は２２に記載の方法。
（２４）宿主が植物である、２１、２２又は２３に記載の方法。
（２５）植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、２４に記載の方法。
（２６）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることから成る、耐塩性生物の創出方法。
（２７）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ビークルによって宿主を形質転換し、該ＤＮＡを宿主細胞内で発現させることから成る、耐塩性生物の創出方法。
（２８）宿主が植物である、２６又は２７に記載の方法。
（２９）植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、２８に記載の形質転換体。
（３０）６乃至２０に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターを単離及び精製することから成る、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターの調製方法。
（３１）１乃至５のいずれか一項に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質。
（３２）３０に記載の調製方法で得られる組換えＮａ＋／Ｈ＋アンチポータータンパク質。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターをコードするＤＮＡは、以下の実施例に示すように、公知である複数のＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター間に高度に保存された２つのポリペプチド領域をもとにプライマーを作成し、一方、当業者に公知の方法でA. halophytica培養し、それから単離したゲノムを鋳型として、当業者に周知のＰＣＲを用いて調製することが出来る。
【００１４】
本発明ＤＮＡにコードされるＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターは、全ｐＨ領域においてＬｉ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を実質的に示さず、中性及びアルカリ性ｐＨ領域においてＣａ２＋／Ｈ＋アンチポーター活性を示すことを特徴とする。
【００１５】
より具体的には、本発明ＤＮＡは、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含有するＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質、である。
更に、本発明ＤＮＡは、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列又はその部分配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１における第７９６〜２３６１番目の塩基対からなる塩基配列、
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、である。
ここで、部分配列とは、例えば、上記Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターのＣ末端領域（配列番号２に示されるアミノ酸配列における４０２番目のアミノ酸残基Gluから５２１番目のアミノ酸残基Gluまでの領域）に該当する配列を意味し、この部分はイオン特異性に関与する部分であることが本発明によって明らかにされた領域である。
【００１６】
当業者であれば、本明細書で開示された配列情報に基づいて、当該技術分野における周知手段を用いた化学合成等によっても調製することが可能である。更に、当業者であれば、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が実質的に保持されるように、配列番号２における特定のアミノ酸配列における１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加することも、当該技術分野における周知手段を用いて容易に実施することができる。Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が実質的に保持されるためには、アミノ酸配列における相同性が、６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９．５％より高いものを挙げることができる
【００１７】
本発明において、特定の遺伝子又はＤＮＡは、当業者に周知の緩衝液中で、適当な温度及び塩濃度等の諸条件下のストリンジェントな条件でハイブリダイズさせることができる。このようなストリンジェントな条件下で本発明の遺伝子又はＤＮＡとハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性と実質的に同等の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの例として、例えば、それぞれの対応する遺伝子と相同性が、９０％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９．５％より高いようなＤＮＡを挙げることができる。
【００１８】
更に、本発明は別な態様として、上記の本発明遺伝子の少なくとも一つの遺伝子を含有する組換え発現ビークルに係る。組換え発現ビークルには各種ベクター等の当業者に公知の任意のものが含まれるが、特に、大腸菌由来の各種プラスミドベクター、大腸菌／淡水らん食細菌シャトルベクター、及びアグロバクテリウムのＴｉプラスミドベクターが好適である。
該組換え発現ビークルには、遺伝子組換え操作において当業者に公知である様々な配列、例えば、原核細胞である大腸菌等が有する転写因子である各種σサブユニットに対する結合ドメインである各種プロモーター、及びエンハンサーなどの各種転写調節要素、制限酵素部位、並びにカナマイシン耐性マーカー等の選択マーカー（マーカー酵素等）遺伝子を任意に含むことが出来、当業者に公知の方法によって容易に調製することが出来る。
【００１９】
本発明の発現ビークルによって形質転換される宿主としては、特に、大腸菌及び藍藻等の各種細菌、並びにイネ、タバコ等の植物を挙げることが出来る。これらの形質転換体には、本発明のＤＮＡが発現された結果、Ｎａ＋感受性表現型及びＣａ２＋感受性表現型が相補されたものや、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターが過剰発現された結果、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性が増加したもの等がある。
【００２０】
本発明のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることによって、該宿主の耐塩性を向上させることが出来る。耐塩性の向上は、主に、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターによって細胞外にＮａＣｌが排出されることによるものである。導入方法としては、例えば、上記組換え発現ビークルによって宿主を形質転換することによって、本発明ＤＮＡを導入することが出来る。他にも、燐酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション法、及びパーティクルガン法等、当業者に公知の任意の手段及び条件を用いることが出来る。
【００２１】
このようにして、本発明のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることによって、耐塩性生物、例えば、海水中でも増殖することが出来る淡水藍藻を遺伝子工学的手法によって創出することが出来る。
【００２２】
更に、上記の形質転換体を培養し、得られる培養物からＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターを単離及び精製することによって、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターを調製することが出来る。培養、単離及び精製等に関する諸条件は、使用するベクター、宿主及びその他の各因子の種類等に応じて当業者が適宜選択することが出来る。
【００２３】
本発明は、上記の本発明ＤＮＡにコードされるタンパク質にかかる。このようなタンパク質は、当業者に公知の方法で、A. halophytica培養物から精製及び単離することができる。或いは、上記調製方法によって、得られる組換えタンパク質として、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターを得ることも可能である。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００２５】
【実施例１】
A. halophytica 培養
A. halophytica細胞はBG11培地に18 mM ＮａＮＯ３のほか、Turk Island塩溶液を加えて、光独立栄養的に増殖させた。Turk Islandの塩溶液は、培地のＮａＣｌ濃度を適宜0.25〜2.5Mの範囲に調節したことを除き、これまでに発表されている方法で調製した（15-17）。培地200 mlを入れて綿栓をした500 mlの三角フラスコを用いて、濃縮ＣＯ２を補充することなく往復振盪機で振盪した。連続して白色蛍光を照射しながら培養フラスコを28℃でインキュベートした（30 microeinsteins ｍ−２ｓ−１）。
【００２６】
A. halophytica のＮａ ＋ / Ｈ ＋ アンチポーター単離
A.halophyticaゲノムＤＮＡは発表されている方法で単離した（17）。複数のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター間の高度に保存された2つのポリペプチド領域をもとに、部分的に変性したオリゴヌクレオチドを特定した（9）。正方向のプライマーであるNP-Fはポリペプチドの伸張部Phe-Leu-Pro-Pro-Leu-Leu-Phe-Glu-Alaの後に特定された（SynNhaPのアミノ酸残基73〜81）。逆方向のプライマーであるNP-Rには、Glu-Gly-Glu-Ser-Leu-Phe-Asn-Asp-Glyに相当する相補配列を含む（SynNhaPのアミノ酸残基160〜168）。全プライマーの配列を以下の表１に示す。予測した大きさ（〜0.3 kb）の増幅ＤＮＡ断片を入手し、配列決定した。決定したヌクレオチド配列を用いて、逆転写ポリメラーゼチェーン反応（PCR）法によって未知の隣接ＤＮＡ領域を増幅した（20）。そのために、Sau3AIによる部分消化やEcoRIまたはAseIによる完全消化で得たＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動で大きさごとに分画した。1〜5 kbの断片はライゲーションキット（宝酒造、滋賀県）を用いて自己連結し、特異なＤＮＡ断片を増幅して配列決定した。A. halophyticaのＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子（apnhaP）の配列全体をカバーする約2.4 kbのヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡ配列はABI310遺伝子分析機（Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて決定し、DNASISプログラム（日立ソフトウェアエンジニアリング、神奈川県）によって解析した。
【００２７】
その結果、配列番号１に示される、全体が2431 bpのヌクレオチドが配列決定された（図２）。この配列分析からオープンリーディングフレームと思われる796〜2361に位置するapnhaPが明らかになった。この予測遺伝子産物は配列番号２に示される521個のアミノ酸からなり、分子量は56,881 Daである（ApNhaP）。最初のMetの上流配列には-10（ATGAAT）および-35（TACACT）のコンセンサス配列の存在が明らかになった（図２）。さらに上流領域である185〜676には、光化学系II（チトクロムｃ５５０）に関与する低電位チトクロムcをコード化する別のオープンリーディングフレームがみつかった。ヌクレオチド配列から推定されたチトクロムｃ５５０のアミノ酸配列は、ラン色細菌、藻類および植物から得られた配列と相同性が高かった。
【００２８】
図３に示されるように、ホモロジー検索によってApNhaPが真核細胞（SOS1, NHEs, AtNHX1およびNHX1）と原核細胞（NhaP, SynNhaPおよびSynNhaP2）に由来するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターにきわめて相同していることが明らかになった。SynNhaP2はSynechocystis sp. PCC 6803で確認された2つめのNhaP型アンチポーターである（9）。ApNhaPはSynNhaPと最も相同性が高かった（アミノ酸が61％まで同一）。親水性プロット解析（23）およびTM予測プログラムTopPredII（24）によって、ApNhaPの推定上のTMセグメントを11個特定した。ApNhaPのAsp１３９は膜貫通領域に保存されたイオン化アミノ酸であり、交換活性に対するその重要性はSynNhaPの突然変異誘発による分析で示されている（9）。尚、ApNhaPには長い親水性C末端テールがあるが、これは真核細胞のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの場合であり、P. aeruginosa由来NhaPには認められない。このようなデータは、耐塩性ラン色細菌A. halophyticaに真核細胞に相同なＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターがあることを示唆している。
【００２９】
【表１】
【実施例２】
発現プラスミドの構築
apnhaPのコーディング領域をPCR反応により単離した。正方向のプライマーであるANP-NcoIは開始コドンATGとNcoI切断部位を含む。逆方向のプライマーであるANP-HindIIIにはHindIII制限部位が含まれる。増幅断片はpTrcHis2CプラスミドのNcoI/HindIII切断部位に連結した。得られたプラスミドpANhaPはインフレームでヒスチジンヘキサマー融合ApNhaPをコード化し、まずE. coli DH5α細胞に導入し、次にnhaA, nhaB, chaA遺伝子が欠失するTO114細胞に導入した（21）。
【００３１】
このpANhaPのほかpSNhaPをNhaA, NhaB, ChaAが欠失したE. coli宿主細胞（TO114）に発現させた（9,21）。膜分画をウェスタンブロッティング法で分析し、pANhaPおよびpSNhaPで形質転換したE. coli細胞に〜53 kDaに相当する交叉反応を示すバンドがひとつあることが明らかになったが、ベクター単独（pTrcHis2C）で形質転換したE. coli細胞はまったくバンドがなかった。このような結果はApNhaPが発現し、E. coliの膜に集っている可能性を示唆するものである。 尚、SDS-PAGEおよび免疫ブロッティングは公知の方法（17）によって実施し、Lowryらの方法によって蛋白質を定量した（25）。ヒスチジンヒキサマー（His６タグ）に対して産生される抗体はR&D Systems Inc.（Minneapolis, MN）から得た。
【００３２】
pANhaPで形質転換したE. coli TO114細胞がpH 7.0 37℃のLBK培地のなかでpTrcHis2CおよびpSNhaPで形質転換したTO114細胞とほぼ同じ速度で増殖したことを図４（Ａ）に示す。しかし、TO114細胞にはＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子（nhaA, nhaB, chaA）が欠損するため、pTrcHis2Cで形質転換したE. coli細胞は0.2 M ＮａＣｌの存在下で増殖することができない（図４（Ｂ））。これに対して、pANhaPまたはpSNhaPで形質転換したE.coli細胞は増殖可能であった（図４（Ｂ））。興味深いことに、pANhaPで形質転換したTO114細胞はpSNhaPで形質転換した細胞に比べて若干速く増殖した（図４（Ｂ））。
【００３３】
更に、ApNhaPとSynNhaPとでは相補する力が異なることが図４（Ｂ）からわかる。2種のアンチポーターにおける相補性の差をさらに明確にするために他の条件でも試験した。図５（Ａ）では増殖温度を30℃にして、pANhaPで形質転換したTO114細胞がLBK培地のアルカリ性pHのもとpSNhaPで形質転換した細胞よりも若干速く増殖できたことを示す。このような条件下、増殖培地に0.2 M ＮａＣｌを含む場合、ApNhaPはTO114細胞の塩感受性表現型を相補するが、SynNhaPは相補できない（図５（Ｂ）。0.5 M ＮａＣｌの存在下でも、pANhaPで形質転換したTO114細胞は増殖可能であった（図５（Ｃ））。相補性の差はpHが小さいと観察されなかった。上のような結果はApNhaPがアルカリ性pHでSynNhaPに比して効果的に相補できることを示唆する。
【００３４】
【実施例３】
Ｎａ ＋ / Ｈ ＋ アンチポーター活性
これまでに発表された方法（9,22）でLBK培地（ＮａＣｌの代わりにKClを用いるLuriaブロス）で増殖させた細胞から調製した反転膜小胞によって、Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性を調べた。簡潔に説明すると、3000×gで4℃、10分間遠心分離してE. coli細胞を収集し、浮遊用緩衝液TCDS（10 mMトリスHCl（pH7.5）、0.14 M塩化コリン、0.5 mMジチオスレイトール、0.25 Mスクロース）で洗浄した。このペレットをTCDS 緩衝液10 mlに浮遊させ、フレンチプレスにかけた（4000 p.s.i.）。次に、この溶液を12,000×gで4℃、10分間遠心分離した。この上清を110,000×gで4℃、60分間遠心分離し、ペレットをTCDS緩衝液600μlに浮遊させた。 アンチポーター活性は、10mMトリス緩衝液（規定pHになるまでHClを加えた）、5 mM ＭｇＣｌ２、0.14 M塩化コリン、1μMアクリジンオレンジ、膜小胞（蛋白質50μg）を含む2 mlの反応混合物に塩を加えて、ΔpH（膜内外のpH勾配）の変化によって評価した。ΔpHは励起492 nmおよび発光525 nmで得られるアクリジンオレンジの蛍光によってモニタリングした。塩を加える前に、呼吸による蛍光クエンチング（Q）を惹起するためにトリス-DL-乳酸（2 mM）を加えた。乳酸は小胞を賦活化し、小胞内にＨ＋を蓄積させるが、これは色素の蓄積と乳酸誘導性蛍光クエンチング（Q）を誘発する。塩（5 mM）の追加によって、アンチポーターによるＨ＋の排出のために蛍光性が増強し、クエンチングしていない蛍光、即ち、塩誘導性蛍光デクエンチング（ΔQ）をモニタリングした。次にＮＨ４Ｃｌ（25 mM）を加えてΔpHを放散させた。
【００３５】
その結果、図６上段に示すように、ApNhaP発現細胞にＮａＣｌを加えるとデクエンチング（ΔQ×100/Q）が観察されたが、対照（pTrcHis2C）細胞では観察されなかった。これはApNhaPがＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性を有することを示している。図６（Ａ）は、pH5〜9の広範囲にわたりApNhaPによる蛍光デクエンチングが観察されたことを示しており、これはSynNhaPによるデクエンチング（9）とほぼ同じであるが、E. coli NhaAによるデクエンチングとはまったく異なる。E. coli NhaAではアンチポーター活性がpH7.5以下で観察されることはなく、pHが上昇するにつれて活性が増強した（1）。
【００３６】
更に、ApNhaPのイオン特異性を調べるために、異なる陽イオンを加えてデクエンチングを測定した。Ｌｉ＋とＨ＋との交換を触媒できるほとんどのＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターに比べて、ApNhaPは種々のpH値でＬｉ＋/Ｈ＋アンチポーターの活性をほとんど示さなかった（図６（Ｂ））。又、ApNhaPが中性及びアルカリ性のpHでＣａ２＋アンチポーター活性を示すことがわかったが（図６（Ｃ））、Ｋ＋/Ｈ＋ではごくわずかなアンチポーター活性を示し、Ｍｇ２＋/Ｈ＋ではまったく示さなかった。このような結果はApNhaPが新たなイオン特異性を有するアンチポーターであることを示唆している。
【００３７】
【実施例４】
上記結果から、ApNhaPがＣａ２＋とＨ＋の交換活性を有するが、Ｌｉ＋とＨ＋の交換活性はないことが示唆されるために、このようなイオン特異性がE. coli変異体細胞の塩感受性表現型を相補するかどうか、さらに試験した。その結果、図７（Ａ）に示されるように、pH 8で4 mM LiClを含むLBK培地でApNhaPを発現するTO114細胞は増殖できないが、SynNhaPを発現するTO114は増殖できた。これに対して図７（Ｂ）に示すように、pH 8.0で0.1 M ＣａＣｌ２を含むトリスE培地ではApNhaPを発現するTO114細胞が良好に増殖するが（26）、SynNhaPを発現するTO114は緩やかに増殖した。いずれも、対照細胞（ベクターのみ）では増殖不能であった。Ｃａ２＋含有培地でのSynNhaP発現細胞の増殖速度はSynNhaPのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性から予測される速度より遅いが（図７（Ｂ）及び図６（Ｃ））、このような結果は、実施例３で得られたApNhaPとSynNhaPのＬｉ＋/Ｈ＋およびＣａ２＋/Ｈ＋アンチポーター活性の結果に一致する（図６（Ｂ）及び図６（Ｃ））。
【００３８】
E. coli ChaAはＮａ＋またはＣａ２＋によるプロトン／カチオン交換活性を有するが、Ｌｉ＋またはＫ＋による活性はないと報告されているが（14,21）、これは基本的にApNhaPと同じイオン特異性である。ただし、ChaAはApNhaPと何ら相同性が認めらなかった。ChaAにはカルセケストリン、カルレティキュリンなど複数のＣａ２＋結合蛋白やＮａ＋/Ｃａ２＋イオン交換体に保存される酸性モチーフGlu２００-His-Glu-Asp-Asp-Ser-Asp-Asp-Asp-Asp２０９を有するが（14）、ApNhaPにはこの酸性モチーフが欠けている。ChaAの親水性プロットによると、ApNhaPでは長い親水性C末端尾部がないことがわかる。ApNhaPは酵母（27）および植物（28）由来の空胞Ｃａ２＋/Ｈ＋交換体とまったく相同していなかった。このようなすべてのデータは、ApNhaPがChaAとは異なる構造を有するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターであることを示している。
【００３９】
【実施例５】
ApNhaP と SynNhaP のキメラ遺伝子構築
これまでに、C末端テールが一部欠失するとSynNhaPのＮａ＋/Ｈ＋対向輸送活性が減弱することがわかっている（9）。ApNhaPはSynNhaPに相同性が最も高いが、この2種のアンチポーターのC末端テールにかかる電荷は有意に異なり、ApNhaPは22個の塩基性アミノ酸と14個の酸性アミノ酸、SynNhaPは15個の塩基性アミノ酸と24個の酸性アミノ酸である。そのためわれわれは、図８に示されるようなASNhaPとSANhaPのキメラアンチポーターを構築し、そのなかでApNhaPの長いC末端テールをSynNhaPのテールに、SynNhaPの長いC末端テールをApNhaPのテールにそれぞれ置換した。反転膜小胞を用いてキメラの交換活性を評価した。
【００４０】
即ち、ApNhaPのTM領域（アミノ酸残基Met１−Ile４０１）とSynNhaPのC末端領域細胞質領域（アミノ酸残基Gln４０１−Ser５２７）をコード化するキメラ遺伝子を次のように構築した（図1）。ApNhaPのTM領域とSynNhaPのC末端領域に相当するヌクレオチドをそれぞれ正方向／逆方向プライマーセットであるANP-NcoI/ANP-N-RおよびSNP-C-F/SNP-C-Rによって増幅した。前者ヌクレオチドの鋳型はpANhaPであり、後者ヌクレオチドの鋳型はsynnhaP遺伝子がpTrcHis2CのNcoI/EcoRI部位に結合したpSNhaPであった（9）。正方向のプライマーであるSNP-C-Fにはポリペプチドの伸長部であるApNhaPのGln３９８-Thr-Val-Ile４０１とSynNhaPのGln４０１-Phe-Val-Leu４０４に相当する配列が含まれており、逆方向のプライマーであるANP-N-RはSNP-C-Fの相補配列である。逆方向のプライマーSNP-C-RにはpSNhaPの終止コドンの直前にEcoRI切断部位がある。両方のPCR産物を合わせて、正方向のANP-NcoIプライマーと逆方向のSNP-C-Rプライマーを用いてキメラ遺伝子apsynnhaPを増幅し、プラスミドpASNhaPを作製したpTrcHis2CのNcoI/EcoRI消化部位に結合させた。
【００４１】
次に、SynNhaPのTM領域（アミノ酸残基Met１−Thr４００）とApNhaPのC末端領域（アミノ酸残基Glu４０２−Glu５２１）をコード化するキメラ遺伝子構築のために、SNP-N-F/SNP-N-RおよびANP-C-F/ANP-HindIIIの正方向／逆方向プライマーセットによって各ヌクレオチドを増幅した。本実施例で用いる逆方向プライマーであるSNP-N-RはANP-C-Fの相補的配列である。両方のPCR産物を合わせて、正方向SNP-N-Fおよび逆方向ANP-HindIIIプライマーを用いてキメラ遺伝子synapnhaPを増幅させ、プラスミドpSANhaPを作製したpTrcHis2CのNcoI/HindIII消化部位に結合させた。
【００４２】
その結果、図９に示すように、ASNhaPキメラは図６に示す親ApNhaPのＮａ＋/Ｈ＋、Ｌｉ＋/Ｈ＋、Ｃａ２＋/Ｈ＋交換活性に匹敵する活性を示した。興味深いことに、ApNhaPではまず検出不能なＬｉ＋/Ｈ＋交換活性が（図６（Ｂ））、ASNhaPキメラでは明らかに観察された（図９（Ｂ））。その一方でSANhaPキメラは親SynNhaPに比して、Ｎａ＋/Ｈ＋およびＬｉ＋/Ｈ＋の両方の交換活性が減弱した（図９と図６）。更に、SANhaPキメラのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性はpH依存的で、pHが中性またはアルカリ性の場合に活性の増強が観察されるようである（図９（Ｃ））。これはpHには関係なく相対的に活性が変化しない親SynNhaPでの観察とは対照的である（図６（Ｃ））。活性化のデータには矛盾もみられるが、このような結果はC末端領域がApNhaPおよびSynNhaPのイオン特異性にある種の働きをすることを示唆している。たとえば、SANhaPキメラはApNhaPおよびSynNhaPに比べてＮａ＋/Ｈ＋交換活性が低く（図９（Ａ）と図６（Ａ））、ASNhaPキメラのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性はpH依存的であるが、これは親ApNhaPと同じであるがSynNhapとは異なる（図９（Ｃ））。このような結果は、ApNhaPおよびSynNhaPのイオン特異性もTM領域の構造によって変化し、ほとんどのＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターにも同じことが考えられることを示唆している（1）。
【００４３】
キメラの交換活性データは相補性解析によってさらに実証された。図１０に示されるように、ASNhaPキメラはE. coli変異体のＮａ＋、Ｌｉ＋およびＣａ２＋感受性表現型を相補するが、SANhaPキメラがE. coli変異体のＮａ＋およびＬｉ＋感受性表現型を相補することはまずない。SANhaPを発現するE. coli変異体細胞の増殖速度はSANhaPキメラのＣａ２＋/Ｈ＋交換活性から予測される速度よりも遅かった（図１０（Ｃ）及び図９（Ｃ））。
【００４４】
【実施例６】
次に、淡水らん色細菌Synechococcus sp. PCC7942において8種のプラスミドを過剰発現させ、耐塩性を試験した。
即ち、耐塩性らん色細菌Aphanothece halophytica（A. halophytica）由来のＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体ApNhaPの発現プラスミドpUC303-ApNhaP(33)、A. halophytica由来の分子シャペロンDnaKの発現プラスミドpUC303-DnaK(34)、E. coli由来のカタラーゼの発現プラスミドpUC303-KatE(35,36)、E. coli由来のベタイン合成遺伝子の発現プラスミドpUC303-Bet(37,38)と、それを組み合わせたものである。これらはそれぞれイオンホメオスタシス、蛋白質の折りたたみ、活性酸素のクエンチ、浸透圧保護物質として機能すると考えられている。E. coliでは4つの遺伝子がベタイン合成に関与しており(37)、betA, betB、betTがそれぞれコリンデヒドロゲナーゼ、ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ、コリン輸送体をコード化し、betIは調節遺伝子をコード化する。発現プラスミドpUC303-DnaK(34)ではgrpEおよびdnaJが部分遺伝子であり、dnaKは機能性蛋白質をコード化する。このすべての遺伝子が自らのプロモーター配列を使用する。Synechococcus sp. PCC7942細胞はpUC303-Bm（対照）、pUC303-ApNhaP, pUC303-KatE, pUC303-Bet, pUC303-DnaK, pUC303-KatE/Bet, pUC303-ApNhaP/KatE, pUC303-ApNhap/KatE/Betプラスミドで形質導入された（図11）。
【００４５】
発現ベクターの構築
発現プラスミドpUC303-DnaKの構築のために、A. halophytica由来dnaK遺伝子(34)を含む3kbpの断片をSspIおよびEcoRVで消化して平滑断端にし、pUC303-BmをEcoRI-およびSalI-二重消化して平滑断端にした部位へ結合させた。耐塩性らん色細菌A. halophytica由来のＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体の発現プラスミドで、自身のプロモーターを含有するプラスミドを次のように調製した。テンプレートとしてpANhaPを用いるPCR法で、apnhaP遺伝子の539位にあるEcoRI切断部位からpTrHis2CのHisタグ配列の直後にある終止コドンまでのＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体断片を増幅した(33)。正方向のプライマーであるApNhEcF1 5’-TGGGAATTCCCCTCGGAA-3’にはEcoRI部位が含まれ、逆方向のプライマーであるApNhBmR1 5’-GTGGATCCTCAATGATGATGATGATG-3’には終止コドンの後にBamHI切断部位が含まれる。増幅断片をpBluescript IISK+のEcoRV部位に結合する。-194からEcoRI切断部位がある539までの別のＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体断片はA. halophyticaをテンプレートとしてゲノム遺伝子を用いたPCR法で増幅した。正方向のApNhEcF 2,5’-CTGAATTCGATCGCGGCTCATATT-3’にはEcoRI切断部位が含まれ、逆方向のプライマーApNhEcR2 5’-GGGAATTCCCACTAATAGA-3’にも539にEcoRI切断部位がある。amnhaP遺伝子のC末端部がすでに結合しているpBluescript II SK+のEcoRI消化部位に増幅断片を結合させた。配向を確認した後、正しく結合したプラスミドpBApNhaPをBamHIによって消化し、E.coli/SynechococcusシャトルベクターpUC303-BmのBamHI消化部位に結合させた(38)。これで得られたプラスミドをpUC303-ApNhaPと呼ぶ。apnhaPおよびkatE遺伝子の共発現のために、E. coli由来のkatE遺伝子をSaII/BamHI消化部位に結合させて、プラスミドpUC303-KatEを用いた。KatE遺伝子はカナダのManitoba UniversityのP.C. Loewen教授から分譲していただいたものである(35)。プラスミドpUC303-KatEをXbaIで消化し、平滑断端にした。apnhaP遺伝子はBamHIでpUC303-ApNhaPを消化し、平滑断端して調製した。得られたapnhaP遺伝子はXbaI消化pUC303-KatEに結合させ、プラスミドpUC303-ApNhaP/KatEを調製した。apnhaP, katEおよびbet遺伝子の共発現のために、プラスミドpUC303-KatE/BeTを用いた。pUC303-KatE/BeTはXbaIで消化して平滑断端してから、そこにBamHIで切断して平滑断端にしたapnhaP遺伝子を結合させた。これで得られたプラスミドをpUC303-ApNhaP/KatE/BeTと呼ぶ。Synechococcus細胞を形質変換するためにこのプラスミドを用いた(38)。
【００４６】
ストレス下でのらん色細菌の増殖
連続白色蛍光を照射（30μＥｍ−２ｓ−１）の下、10μgml−１ストレプトマイシンを補充したBG11液体培地に気泡を送りながら、Synechococcus細胞を30℃で継代培養した(359)。bet遺伝子が発現すると、100μMコリンを添加した。塩ストレスをかけるために、種々の濃度のNaCl（0〜0.6M）を含有する新鮮培地に後期対数増殖期の細胞を移した。この培養物を数日間インキュベートした。この期間中に、Shimadzu UV-160Aを用いて730nmの吸収を測定しながら、細胞増殖をモニタリングした。SDS-PAGEおよび免疫ブロッティング法をこれまでに発表された方法で実施した(34)。6-ヒスチジン（6×Hisタグ）に対して産生される抗体をR&D Systems, Inc.（USA）から得た。DnaK蛋白を免疫ブロッティング法で検出した(34)。TOF-MS（モデルKOMPACT MALDI IV tDE Shimdzu／Kratos）を用いてグリシンベタインを測定し、活性染色によってカタラーゼ活性を評価した(35)。
【００４７】
その結果、すべての形質転換体がほぼ同じ速度で増殖でき、この形質転換体が低塩度条件下で増殖を損なわないことが示された（図１２A）。高塩度では、淡水らん色細菌Synechococcus PCC7942（対照細胞）の増殖速度が低下し、0.375M NaClより高濃度では明らかに増殖が認められなくなった。0.4M NaClでは、対照細胞およびdnaK発現細胞は増殖せず、betまたはkatE発現細胞は増殖できたが、その速度はapnhaP発現細胞よりも遅かった（図１２B）。katEおよびbetを共発現するSynechococcus細胞はkat発現細胞またはBet単独よりも若干増殖が速かった。このような結果はこれまでの報告と一致しており(35,38,39)、betまたはkatEの過剰発現によって塩ストレスに対する耐性を獲得したことを示している。apnhaP, katEおよびbetを共発現した細胞はapnhaP発現細胞に比べて増殖速度が若干低かった。katE(35), bet(38)およびdnaK(34)の発現は上記要領で確認した。NaClの濃度を0.5Mに上げると、種々の形質転換体でさらに増殖速度の低下が観察された。対照およびdnaK発現細胞のほかに、katEおよび／またはbetを発現する細胞も増殖できなかった（図１２C）。apnhaP発現細胞のみが、apnhaPおよびkatE共発現細胞やapnhaP, katEおよびbet共発現細胞に比べて増殖速度が速かった。このようなデータから、ApNhaPの過剰発現によってSynechococcus細胞の耐塩性が向上し、他の関連蛋白によるApNhaPの共発現ではApNhaP発現細胞の耐塩性が向上しなかった。
【００４８】
Ｎａ ＋ / Ｈ ＋ 対向輸送体活性の測定
ApNhaP蛋白はapnhaP発現細胞で検出されており、0.3M NaClで増殖した対照細胞では検出されなかった（図１3A）。1日でApNhaPの最高濃度に達した。従って、apnhaP発現細胞の高塩度に対する耐性がApNhaP蛋白の活性によるものと考えられる。
そこで、次に、実際に、Ｎａ＋/Ｈ＋活性を基本的にNakamuraら(40)の方法にしたがって測定した。簡潔に説明すると、50ｍMジエタノールアミン-HClを含有する0.15MNaCl（pH9.3）にSynechococcus sp.PCC 7942細胞を浮遊させた。この処置によって、細胞内Ｋ＋はＫ＋/Ｈ＋対向輸送体の働きによってジエタノールアミンに代わった。20mM HEPES-NaOH緩衝液を含む0.15M NaCl（ｐH8.5）を用いて、アミン負荷細胞を洗浄した。この段階で細胞内部はジエタノールアミンの放出によって酸性になり、Ｎａ＋はＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体によってＨ＋に交換しようとする負荷がかかった。Ｎａ＋/Ｈ＋対向輸送体活性を測定する前に、0.2％グルコースを添加して細胞を賦活化し、次に50ｍMのジエタノールアミン-HCl（pH8.5）を加えた。適宜、細胞を濾過によって回収し、Shimdzu Personal Ion Analyzer PIA-1000によってフィルター上のＮａ＋イオンを測定した(35)。
【００４９】
その結果得られた、ジエタノールアミンの添加によるＮａ＋負荷細胞のＮａ＋排出活性を図１３B〜Dに示す840)。中性ジエタノールアミンは細胞を貫通し、プロトン化した。必要なプロトンはＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体を介して、Ｎａ＋の交換によって、細胞外から取り込まなければならない。このようにＮａ＋の排出活性はＮａ＋/Ｈ＋対向輸送体活性を反映している。対照とApNhaP発現細胞が異なる塩度条件下で異なるＮａ＋排出活性を示すかどうか調べた。図１３B〜Dに、ジエタノールアミンを添加して細胞内Ｎａ＋が最初の数分できわめて急速に減少し、その後緩徐に減少していった。細胞内Ｎａ＋が最も大きく減少したのは、0.3M NaClを含有するBG11培地で増殖する細胞（図１３C）であり、これに続いて何も添加しない培地（図１３B）、次に0.5M NaClを含有する培地（図１３D）で増殖する細胞であった。対照とNaClが不在で増殖したApNhaP発現細胞との間にＮａ＋排出活性の差はなかった（図１３B）。0.3M NaClで増殖させた場合、対照細胞に比して、ApNhaP発現細胞ではやや強いＮａ＋排出活性が観察され（図１３C）、0.5M NaClで増殖させた場合さらに大きい差が観察された（図１３D）。このようなすべての結果から、ApNhaP発現細胞が対照細胞に比して高塩度で対向輸送体活性が高いことが示された。
【００５０】
次に、ApNhaP発現細胞の増殖速度に対する塩の刺激作用を調べた。塩刺激（0.65M NaCl）によって、ApNhaP発現細胞は10時間後まで増殖可能であったが、対照細胞はそれより遅い速度で3時間までしか増殖しなかった（図１４A）。細胞死はApNhaP発現細胞に比べて対照細胞で高速かつ早期に検出された。1.2時間の塩ショック後に、ジエタノールアミンを添加すると対照細胞に比してApNhaP発現細胞で強いＮａ＋排出活性が観察された（30％と75％、15分）（図１４B）。
【００５１】
光合成活性の評価
塩ストレスは数種の光合成生物で光合成活性を損なうことがわかっている(39)。ApNhaPの発現は塩刺激後の光合成活性を増強させるかどうかを調べるために、現在作用している光化学系II（PS II）の割合を以下にしめすように、R値で表して測定した。
即ち、光化学系II（PSII）における見かけ上の量子収量をPAM 蛍光光度計（Walz, Effeltrich,ドイツ）を用いて測定した(35)。650nmのピーク発光で光発光ダイオードからパルス変調励起を得た。変調した蛍光をλ>710nmで測定した（Schott RG9ロングパスフィルタ）。PAM-102およびPAM-103の付属モジュールはそれぞれ照射光（actinic light）と飽和パルスの管理に用いた。測定前に、10分間細胞を暗室におき、連続光（200μＥｍ−２ｓ−１）のもとPSIIの量子収量を測定した。PSIIの量子収量をF/Fm’=（Fm’-F）/Fm’の式で計算した。式中、FおよびFm’はそれぞれ飽和フラッシュ前後の照射下の蛍光レベルを表す。フラッシュの強度と持続時間は、それぞれ7000μＥｍ−２ｓ−１と800msであった。
その結果、図１４Cに示すように、塩刺激前は対照のR値もApNhaP発現細胞のR値もほぼ同じ0.90と0.85であった。しかし、塩刺激から1.2時間後、この値はそれぞれ0.32と0.64に減少した。これを図１４Bの結果と総合すると、光合成活性を強く維持する細胞の力は有効なＮａ＋排出に左右されることが判った。
【００５２】
ApNhaP 発現細胞の海水中での増殖
更に、図１５Aに示すように、ApNhaP発現細胞が海水中で増殖できるということを実際に確認した。海水は愛知県三河地方で採取したものであり、その塩度は30.4psuであった。Betおよび／またはKatEのいずれかを発現する形質転換細胞は海水中で増殖できなかった。ApNhaPおよびKatEの共発現はApNhaP発現細胞の増殖速度に比べて速かったが、0.5M NaClを含有するBG11を増殖培地として用いた図１２Cの結果とは対照的である。ApNhaP発現細胞に比べて増殖速度は遅かったものの、ApNhaP, KatEおよびBetを共発現するSynechococcus細胞は海水中でも増殖を維持することができた。このような結果から、ApNhaPの過剰発現によって淡水らん色細菌Synechococcus細胞が海水中で増殖できるほどの耐塩性を獲得したことは明確である。海水中でSynechococcus細胞が増殖する間、対照とApNhaP発現細胞との吸収スペクトルの差が認められた。図１５Bに示すように、ApNhaP発現細胞は630 〜680nmの領域で典型的な吸収速度を示した。これに対して、対照細胞は680nm領域に比べて630nm領域での吸収性は有意に低いことがわかる。この吸収ピークはそれぞれフィコビリソームとクロロフィルを表しているので、上記データは対照細胞のフィコビリソームの変性がクロロフィルよりも早く生じたことを示しており、フィコビリソームが高塩度による損傷を受けやすいターゲットであることがわかる。
【００５３】
Synechococcus細胞は低塩度でのＮａ＋とＨ＋の交換能が十分であることが上記データから判明した。高塩度では、Ｎａ＋排出活性が弱いためにSynechococcus細胞がＮａ＋流入にうまく対応できず、増殖が中止した。Synechococcus細胞でのApNhaPの過剰発現によって、高塩度培地および海水中において増殖を再開できた。これは淡水らん色細菌Synechococcus sp.PCC7942が遺伝子工学によって海水中で生存できたことを示す最初の報告である。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によって、新たなイオン特異性を有するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター遺伝子を単離することに成功し、該遺伝子で形質転換したアンチポーター欠損株である大腸菌においてＮａ＋感受性表現型及びＣａ２＋感受性表現型が相補されることが判明した。更に、該遺伝子で形質転換された淡水らん色細菌Synechococcus細胞内におけるApNhaPの過剰発現によって、淡水らん色細菌が海水中で増殖できるほどの耐塩性を獲得出来ることが判明した。
従って、本発明は、該遺伝子を利用して、耐塩性作物を開発、創出して食料生産の向上に寄与することの出来る、有力な方法を提供するものである。
【００５５】
引用文献
1. Padan, E., and Schuldiner, S.(1996) in Handbook of Biological Physics (Konings, W. N., Kaback, H. R., and Lolkema, J. S., eds) vol.2, pp.501-531, Elsevier Science, Amsterdam
2. Orlowski, J., and Grinstein, S.(1997) J. Biol. Chem. 272, 22373-22376
3. Blumwald, E.,Aharon, G. S., and Apse, M. P.(2000) Biochim. Biophys. Acta 1465, 140-151
4. Nass, R., Cunningham, K. W., Rao, R. (1997) J. Biol. Chem. 272, 26145-26152
5. Nass, R., and Rao, R. (1998) J. Biol. Chem. 274, 21054-21060
6. Gaxiola, R. A., Rao, R., Scherman, A., Grisafi, P., Alper, S. L., and fink, G. R. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96,1480-1485
7. Jia, Z. P., McCullough, N., Martel, R., Hemmingsen, S., and Young, P. G.(1992) EMBO J. 11,1631-1640
8. Shi, H., Ishitani, M., Kim, C., and Zhu, J. K. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6896-6901
9. Hamada, A., Hibino, T., Nakamura, T., and Takabe. T. (2001) Plant Physiol. 125, 437-446
10. Wakabayashi, S., Fafournoux, P., Sardet, C., and Pouyssegur, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 2424-2428
11. Inoue, H., Noumi, T., Tsuchiya, T., and Kanazawa, H. (1995) FEBS Lwtt.363, 264-268
12. Nakamura, T., Komano, Y., and Unemoto, R. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1230, 170-176
13. Utsugi, J., Inaba, K., Kuroda, T., Tsuda, M., and Tsuchiya, T. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1398, 330-334
14. Ivey, D. M., Guffanti, A. A., Zemsky. J., Pinner, E., Karpel, R., Padan, E., Schuldiner, S., and Krulwich, A. (1994) J. Biol. Chem. 268.11296-11303
15. Ishitani, M., Takabe, T., Kojima, K., and Takabe, T. (1993) Aust. J. Plant Physiol. 20, 693-703
16. Takabe, T., Incharoensakdi, A., Arakawa, K., and Takabe, T. (1997) Plant Physiol. 88, 1120-1124
17. Lee, B. H., Hibino, T., Jo, J. Viale, A. M., and Takabe, T. (1997) Plant Mol. Biol. 35, 763-775
18. Hibino, T., Kaku, N., Yoshikawa, H., Takabe, T., and Takabe, T. (1999) Plant Mol. Biol. 40, 409-418
19. Sugino, M., Hibino, T., Tanaka, Y., Nii, N., Takabe, T. and Takabe, T. (1999) Plant Sci, (Shannon) 137, 81-88
20. Triglia, T., Peterson, M. G., and Kemp, D. J. (1998) Nucleic Acids Res. 25, 8186
21. Ohyama, T., Igarashi, K., and Kobayashi, H. (1995) J. Bacteriol. 176, 4311-4315
22. Rosen, B. P. (1986) Methods Enzymol.125, 328-336
23. Kyte, J., and Doolittle, R. F. (1982) J. Mol. Biol 157, 105-132
24. Hofmann, K., and Stoffel, W. (1992) Comput. Appl. Biosci. 8, 331-337
25. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A. L., and Randall, R.J. (1951) J. Bio;. Chem. 193, 265-275
26. Brockman, R. W., and Heppel, L. A. (1968) Biochemistry 7, 2554-2562
27. Cunningham, K. W., and Fink, G. R. (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 2226-2237
28. Ueoka-Nakanishi, H., Nakanishi, Y., Tanaka, Y., and Maeshima, M. (1999) Eur. J. Biochem. 262, 417-425
29. Biemesderfer, D., DeGray, B., and Aronson, P. S. (1998) J. Biol. Chem. 273, 12391-12396
30. Wells, K. M., and Rao, R. (2001) J. Biol. Chem. 276, 3401-3407
31. Ono, K., Hibino, T., Kohinata, T., Suzuki, S., Tanaka, Y., Nakamura, T., Takabe, T., and Takabe, T. (2001) Plant Sci. (Shannon) 160, 455-461
32. Apse, M. P., Aharon, G. S., Snedden, W. A., and Blumwald, E. (1999) Science 285, 1256-1258
33. Waditee，R．et al. Halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica，cotains an Na+/H+ antiporter, homologous to eukaryoticones,with novel ion specificity affected by C-terminal tail.(2001) J．Biol．Chem．in press
34. Lee, B. H., Hibino, T., Jo, J., Viale, A. M. and takabe, T. (1997) Plant. Mol. Biol. 35, 763-775
35. Kaku, N. et al (2000) Plant Science 159, 281-288
36. Ossowski, I., Mulvey, M. R., Leco, P.A., Borys, A. and Loewen, P. C. (1991) J. Bacteriol. 173 514-520
37. Lamark, T., Kaasen, I., Eshoo, M. W., McDougall, J. and Strom, A. P. (1991) Mol. Microbiol. 5, 1049-1064
38. Nomura, M., Ishitani, M., Takabe, T., Rai, A. K. and Takabe, T. (1995) Plant Physiol. 107, 703-708
39. Deshnium, P., Los, D. A., Hayashi, H., Mustardy, L. and Murata, N. (1995) Plant Mol Biol. 29, 897-907
40. Nakamura, T., Komano, Y. and Unemoto, T. (1995) Biochim. Biophys. Acta. 1230, 170-176
41. Kaku, N. et al. (1999) Plant Cell Physiol. 40, 557-564
42. Sugino, M., Hibino, T., Nii, N., Takabe, T., and Takabe, T. (1999) Plant Science 146, 81-88
43. Ono, K. et al. (2001) Plant Science 160, 455-461
44. Kishitani, S. et al. (2000) Plant Cell Environ. 23, 107-114
45. Takabe, T. et al. (1998) Glycinebetaine and the genetic engineering ofsalinity tolerance in plants. In Stress Responses of Photosynthetic Organisms. Edited by Satoh, K. and Murata, N. pp.115-131. Elsevier Science, Amsterdam.
46. Tanaka, T. et al. (1999) Plant Science 148, 131-138
【００５６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 pASNhaPとpSANhaPのキメラプラスミド構築に関する概略図（B）を示す。
【図２】 A. halophyticaのapnhaP座のゲノム構造 A：遺伝子と制限部位 B：apnhaPとチトクロムｃ５５０の接合部のヌクレオチド配列。apnhaPとチトクロムｃ５５０のヌクレオチド配列から演繹したapnhaPの推定上の-10（ATGAAT）および-35（TACACT）コンセンサス配列とアミノ酸配列も示す。
【図３】 Ｎａ＋/Ｈ＋アンチポーターの推定アミノ酸配列の比較 A：8種の生物に由来するＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの推定アミノ酸配列のアラインメント。この配列はプログラムClustalWによって整列化した。このアラインメントはSOS1、ヒトNHE1、酵母NHX1のN末端の550個のアミノ酸残基をもとにしている。すべての配列に保存されたアミノ酸残基を黒で強調表示し、保存的置換を点で示した。保存Asp（ApNhaPのAsp１３９）をアスタリスクで示す。予測される膜貫通領域をアラインメントの上に示す。 B：8個のＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの系統学的解析。複数の配列アラインメントと系統樹の作製はそれぞれClustalWおよびTreeViewソフトを用いた。
【図４】 3種のE. coli細胞の増殖速度に対するＮａＣｌの作用 LBK培地における対数増殖期の対照細胞と形質転換細胞を指示されたＮａＣｌ濃度を含む新鮮LBK培地（pH 7.0）に移した。 A：LBK培地における増殖の推移 B：0.2 M ＮａＣｌを含有するLBKにおける増殖の推移 丸：対照細胞 四角：ApNhaP発現細胞
三角：SynNhaP発現細胞。各値は3つの測定値の平均である。
【図５】 3種のE. coli細胞の増殖速度に対するpHとＮａＣｌの作用 LBK培地における対数増殖期の対照細胞と形質転換細胞を指示されたＮａＣｌ濃度を含み、指示されたpHの新鮮LBK培地に移した。増殖温度は30℃であった。0 M ＮａＣｌ（A）、0.2 M ＮａＣｌ（B）0.5 M ＮａＣｌ（C）を含むLBK培地での増殖の推移。白四角：ApNhaP発現細胞、pH 8.0。網掛けした四角：pH 8.5。黒四角：pH 9.0。白三角：SynNhaP発現細胞、pH 8.0。網掛けした三角：pH 8.5。黒三角：pH9.0。白丸：対照細胞、pH 8.0。網掛けした丸：ph 8.5。黒丸：pH 9.0。各値は3つの測定値の平均である。
【図６】 アクリジンオレンジ蛍光クエンチング法で測定したＮａ＋/Ｈ＋アンチポーター活性 対照E. coli細胞とApNhaPおよびSynNhaPを発現するE. coli細胞を塩を追加することなくLBK培地で増殖させた。この細胞から反転膜小胞を調製した。アンチポーター活性は実施例に記載した要領で測定した。上段にはApNhaP発現細胞と対照細胞（pTrcHis2C）の典型的なクエンチングパターンを示す。A, B, Cにはそれぞれ、Ｎａ＋/Ｈ＋, Ｌｉ＋/Ｈ＋,Ｃａ２＋/Ｈ＋アンチポーター活性のpH依存性を示した。塩（ＮａＣｌ, LiCl, ＣａＣｌ２）の最終濃度は5 mMであった。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図７】 3種のE. coli細胞の増殖速度に対するLiClおよびＣａＣｌ２の作用 規定のLiClまたはＣａＣｌ２濃度のLBKまたはトリスE培地に、LBK培地で対数増殖期にある対照細胞および形質転換細胞をそれぞれ移した。他の実験条件は図４の説明に記載したとおりである。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図８】 キメラＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターの副次的構造モデル キメラＮａ＋/Ｈ＋アンチポーターを実施例に記載の要領で構築した。C末端親水性尾部にかかる陽性電荷と陰性電荷の数を示す。
【図９】 キメラアンチポーターの活性 ASNhaPキメラとSANhaPキメラを発現するE. coli細胞は塩を追加することなくLBK培地で増殖させた。この細胞から反転膜小胞を調製した。アンチポーター活性は実施例に記載の要領で構築した。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図１０】 ASNhaPキメラとSANhaPキメラを発現するE. coli細胞の増殖速度に対するＮａＣｌ, LiCl, ＣａＣｌ２の作用 LBK培地で対数増殖期にあるASNhaPキメラとSANhaPキメラを発現するE. coli細胞を0.2 M ＮａＣｌを含むLBK培地、0.4 mM LiClを含むLBK培地、0.1 M ＣａＣｌ２を含むトリスE培地に移した。他の実験条件は図４の説明に記載した要領と同じである。各値は3つの個別測定値の平均である。
【図１１】 発現ベクターの概略図を示す。
【図１２】 対照と形質転換Synechococcus細胞の増殖速度に対する塩ストレスの作用。規定のNaCl濃度を含む新鮮培地にBG11培地で対数増殖期にある対照と形質転換細胞を含浸して、塩ストレスをかけた。
【図１３】 ApNhaPの蓄積量（A）とＮａ＋負荷細胞からのＮａ＋排出量（B,C,D）。Aでは、対照とApNhaP発現細胞をBG11培地で増殖し、0.3M NaCl含有培地に移した。規定時間インキュベートした後、細胞を回収し、免疫学的分析を行った。B,C,Dでは、対照（白丸）とApNhaP発現細胞（黒丸）を規定濃度のNaClを含むBG11培地のなかで１日増殖させた。次に、Ｎａ＋排出を誘発するジエタノールアミン（EA）を測定した。
【図１４】 対照とApNhaP発現Synechococcus細胞における増殖速度（A）、Ｎａ＋排出活性（B）、光合成電子輸送活性（C）に対する塩刺激の作用。BG11培地で対数増殖期の対照およびApNhaP発現細胞を回収し、0.65M NaClを含有する新たな培地に移した。
【図１５】 海水中の対照と形質変換Synechococcus細胞の増殖曲線（A）と吸収スペクトル（B）。BG11培地で対数増殖期の対照および形質転換細胞を海水に移した。海水に移して3日後に、対照およびApNhaP発現細胞の吸収スペクトル（B）を測定した。
Claims (15)
- 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質。 - 以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列を含むＤＮＡ：
（ａ）配列番号１における第７９６〜２３６１番目の塩基対からなる塩基配列、
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 - 耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica) 由来Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質をコードする請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
- Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質が、全ｐＨ領域においてＬｉ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を示さず、中性及びアルカリ性ｐＨ領域においてＣａ２＋／Ｈ＋アンチポーター活性を示すことを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のＤＮＡ。
- 請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＮＡを含有する組換え発現ベクター。
- 請求項５に記載の発現ベクターによって形質転換された形質転換細菌。
- 形質転換体宿主が藍藻である請求項６に記載の形質転換細菌。
- 藍藻が海水中で増殖可能な淡水性藍藻である請求項７に記載の形質転換細菌。
- 請求項５に記載の発現ベクターによって形質転換された形質転換植物。
- 植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、請求項９に記載の形質転換植物。
- 請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＮＡを宿主細胞に導入し、該ＤＮＡを発現させることから成る、耐塩性植物の創出方法。
- 植物がイネ及びタバコから成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
- 請求項６〜８のいずれか一項に記載の形質転換細菌を培養し、得られる培養物からＮａ＋／Ｈ＋アンチポーターを単離及び精製することから成る、Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターの調製方法。
- 請求項１乃至４のいずれか一項に記載のＤＮＡにコードされるＮａ＋／Ｈ＋アンチポーター活性を有するタンパク質。
- 請求項１３に記載の調製方法で得られる組換えＮａ＋／Ｈ＋アンチポータータンパク質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001390491A JP4132810B2 (ja) | 2001-12-21 | 2001-12-21 | Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、及び該遺伝子の発現による耐塩性の向上 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001390491A JP4132810B2 (ja) | 2001-12-21 | 2001-12-21 | Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、及び該遺伝子の発現による耐塩性の向上 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003180373A JP2003180373A (ja) | 2003-07-02 |
| JP4132810B2 true JP4132810B2 (ja) | 2008-08-13 |
Family
ID=27598393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001390491A Expired - Fee Related JP4132810B2 (ja) | 2001-12-21 | 2001-12-21 | Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、及び該遺伝子の発現による耐塩性の向上 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4132810B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0574923U (ja) * | 1992-03-13 | 1993-10-12 | 関東自動車工業株式会社 | 自動車のモール取付用クリップ |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7593608B2 (ja) * | 2020-02-19 | 2024-12-03 | 学校法人 東洋大学 | Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターの特異的阻害剤スクリーニング方法 |
| CN119708178B (zh) * | 2025-01-06 | 2026-02-17 | 东北农业大学 | 突变体NhaM-T11D的基因、编码的蛋白及应用 |
-
2001
- 2001-12-21 JP JP2001390491A patent/JP4132810B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0574923U (ja) * | 1992-03-13 | 1993-10-12 | 関東自動車工業株式会社 | 自動車のモール取付用クリップ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003180373A (ja) | 2003-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ohta et al. | Introduction of a Na+/H+ antiporter gene from Atriplex gmelini confers salt tolerance to rice | |
| Wallis et al. | Expression of a synthetic antifreeze protein in potato reduces electrolyte release at freezing temperatures | |
| AU2009284619B2 (en) | Genes, proteins and vectors for increaseing tolerance of plants and microbes to abiotic stresses and the use thereof | |
| Lopez et al. | Accumulation of a 22‐kDa protein and its mRNA in the leaves of Raphanus sativus in response to salt stress or water deficit | |
| MX2007007567A (es) | El factor de transcripcion genetico osnacx del arroz y su uso para mejorar la tolerancia de plantas a la seguia y al estres salino. | |
| AU2010283592B2 (en) | Stress tolerant plants | |
| WO2001006006A1 (fr) | Gene de resistance au stress ambiant | |
| BRPI0618328A2 (pt) | método para melhorar caracterìsticas de crescimento de planta em relação às plantas do tipo selvagem correspondentes, construção, célula hospedeira, método para produzir uma planta transgênnica, parte de planta ou célula de planta tendo caracterìsticas de crescimento de planta melhoradas em relação às plantas do tipo selvagem correspondentes, e, usos de uma construção e de um ácido nucleico | |
| CA2390719A1 (en) | Method of transforming plants with vacuolar pyrophosphatase and stress-resistant oversized plants produced by the method | |
| NL2005620C2 (en) | Plants with increased tolerance to metal ions. | |
| US8168864B2 (en) | Transgenic pollen expressing exogenous plant vacuolar pyrophosphatase and methods for increasing seed production in plants | |
| KR20010104316A (ko) | 나트륨/프로톤 대향수송체 유전자 | |
| JPWO2000037644A1 (ja) | ナトリウム／プロトン対向輸送体遺伝子 | |
| JP4132810B2 (ja) | Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーター遺伝子、及び該遺伝子の発現による耐塩性の向上 | |
| Hossain et al. | Root specific expression of Na+/H+ antiporter gene from Synechocystis sp. PCC 6803 confers salt tolerance of tobacco plant | |
| KR101431124B1 (ko) | ｎｒｄＨ 유전자가 형질전환된 저온 내성 및 내염성이 증진된 형질전환 식물체 및 그 제조방법 | |
| Roychoudhury et al. | Structural aspects and functional regulation of late embryogenesis abundant (LEA) genes and proteins conferring abiotic stress tolerance in plants | |
| CN111979253B (zh) | TrFQR1基因及其克隆、表达载体构建方法和应用 | |
| CN108610402A (zh) | 花生膜联蛋白基因AhANN6在提高植物及微生物抗高温和抗氧化胁迫中的应用 | |
| KR101431125B1 (ko) | ｇｒｘＣ 유전자가 형질전환된 저온 내성이 증진된 형질전환 식물체 및 그 제조방법 | |
| CA2559093C (en) | Proteins imparting boron-tolerance and genes thereof | |
| CN110317827A (zh) | 齿肋赤藓早期光诱导蛋白基因ScELIP1和ScELIP2的用途 | |
| CN103993020B (zh) | 一种植物强耐盐基因SseNHX1及其编码蛋白和应用 | |
| CN113046375A (zh) | SpCPK33基因及其编码蛋白在调控番茄耐旱性中的应用 | |
| CN115747225B (zh) | 一种山新杨PdbGRF1基因及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20031031 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20040129 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040908 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070213 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070416 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071106 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080107 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20080229 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080303 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20080520 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080602 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110606 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110606 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140606 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |