JP4375773B2 - Ｗ／Ｏエマルジョンを含有するＴｈ２移行促進剤 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、生体内の免疫反応に関与しているヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）のサブセットであるＴｈ１型（以下、Ｔｈ１という）とＴｈ２型（以下、Ｔｈ２という）のバランスにおいて、Ｔｈ１からＴｈ２への移行を促進させる製剤に関する。本製剤は、例えば自己免疫疾患、各種アレルギー疾患、又は臓器移植時の拒絶反応等に対する予防又は治療剤として有用である。
背景技術
自己免疫疾患（例：臓器特異的自己免疫疾患等）、アレルギー疾患あるいは臓器移植拒絶反応等は、内在または外来抗原に対する過剰免疫反応であり、これらの疾患は自己あるいは非自己に対する免疫学的無反応性が破綻する現象として説明できる。これらの疾患に対する治療としては、薬物療法（免疫抑制剤、コルチコステロイド、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤など）が主に行われている。しかしながら、免疫抑制剤等は非特異的な免疫抑制を引き起こすので、感染症の併発、悪性腫瘍の発現等の重篤な副作用を伴う。また抗アレルギー剤等は単に対症療法的に使用されているのが現状である。他方、減感作療法などの特異的な免疫療法も試みられているが作用機序に関して不明な部分が多く、いまだ確立された治療方法とは言い難い。
このような状況下、最近、経口免疫寛容（経口トレランス）を自己免疫病等の治療に応用する試みが注目されている。例えば、バイスタンダー抗原と称しＴＧＦ−βなどの抑制性サイトカインを分泌する調節性細胞の増殖を誘導する物質を経口投与することにより誘導される経口免疫寛容を利用して上記疾患を治療する方法が報告されている（ＷＯ９３／１６７２４、ＷＯ９６／４０２３２、特表平８−５０４７４５等）。しかしこれらの方法では、経口投与される抗原に対してＤＤＳ製剤的な工夫はあまりなされておらず、基本的には抗原タンパク質の水溶液又は分散液を単に投与するのみである。従って、調製されるタンパク質製剤はきわめて不安定であるため投与効率が悪く、また安定した免疫寛容の効果が再現されにくいと予想される。また経口免疫寛容の誘導効率を高めるために、サイトカイン類、コレラトキシンＢ鎖あるいはリポ多糖体を併用する試みがなされているが、いずれも実用性の乏しいものである。
一方、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）のサブセットであるＴｈ１とＴｈ２のバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス）と各種疾患との関係も研究されおり、Ｔｈ１優位の免疫反応に基づくと考えられている自己免疫疾患等の治療方法の一つとして、Ｔｈ１優位の免疫応答からＴｈ２優位の免疫応答への変換が考えられている（日本臨牀５５巻６号（６，１９９７）；医学のあゆみＶｏｌ．１８２ Ｎｏ．９（１９９７），Ｐ５２３等）。しかしこれまでＴｈ１からＴｈ２への移行を促進してＴｈ２偏向の状態に効率よく到らしめる試みはあまりなされていない。例えば、ＷＯ９３／００１６０やＡＮＮＡＬＳ ＯＦ ＴＨＥ ＮＥＷ ＹＯＲＫ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ Ｖｏｌ．７７８（１９９６）等には、抗原タンパク質をＷ／Ｏ型エマルジョン又はＷ／Ｏ型の多相エマルジョンにして、経口免疫寛容を誘導する方法が記載されているが、実験的にはｔｏｔａｌの抗体価の変化を調べているだけである。ＩＮＦＥＣＴ．ＡＧＥＮＴＳＤＩＳ．（ＵＳＡ），２／２（５５−７３）（１９９３）には、マイクロスフェアーで経口免疫化した際にＴｈ２型優位になった旨記載されているが、エマルジョンによる投与時および経口免疫寛容時のＴｈ１／Ｔｈ２バランスについては何ら検討されていない。Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１３３，４２３−４２７（１９７０）；Ｅｎｔｅｒａｌ．Ｎｕｔｒ．１４，４５９−４６２（１９９０）；Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．２５，１９６−２０２（１９８２）；Ａｕｓｔ．Ｎ．Ｚ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．５７，３２３−３２９（１９８７）等には、非経口投与されたＷ／Ｏエマルジョンが免疫系を抑制する方向に機能する旨記載されている。しかしこれらのエマルジョンには抗原が含まれておらず、また経口投与した際のＴｈ１／Ｔｈ２バランスの変化については何ら考察されていない。
このように免疫応答反応におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスを調節し、特にＴｈ２への移行を促進して好ましくはＴｈ２偏向の状態に到らしめることにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが関係すると考えられる各種疾患を効率よく予防又は治療する方法は、未だ十分には検討されていなかった。
発明の開示
本発明者らは鋭意検討した結果、各種抗原を油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）に内包させて投与すれば、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ２へ移行されやすくなることを見出し、以下に示す本発明を完成した。
（１）抗原を含有するＷ／Ｏエマルジョンを含むことを特徴とする、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２への移行促進剤。
（２）抗原がタンパク質またはペプチドである、上記（１）記載の促進剤。
（３）経粘膜投与によって免疫寛容を誘導する、上記（１）又は（２）記載の促進剤。
（４）ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２のバランスが関係する疾患の予防又は治療剤である、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の促進剤。
（５）疾患がＴｈ１主体の免疫反応に起因する疾患、アレルギー疾患または臓器移植時の拒絶反応である、上記（４）記載の促進剤。
（６）Ｔｈ１主体の免疫反応に起因する疾患が自己免疫疾患である、上記（５）記載の促進剤。
（７）マウス経口投与時の“ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ”で示される抗体価比率の値が、対照の抗原含有生理食塩水を投与した場合に比べて約２倍以上である、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の促進剤。
（８）抗原をＷ／Ｏエマルジョンに含有させて経口投与することを特徴とする、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２への移行を促進する方法。
（９）請求項１〜７のいずれかに記載の促進剤を投与することを特徴とする、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２への移行を促進する方法。
（１０）ヘルパーＴ細胞のＴｈ２への移行を促進するために、抗原の投与剤形としてＷ／Ｏエマルジョンを使用する方法。
（１１）ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２のバランスが関係する疾患の予防又は治療剤を製造するために、抗原を含有するＷ／Ｏエマルジョンを使用する方法。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いるＷ／Ｏエマルジョンとしては種々のものが使用でき、マイクロエマルジョンであってもよい。そのサイズは通常、約０．００１〜１００μｍである。組成についても特に限定されるものではないが、水相としては、通常、水または弱酸性、中性、弱塩基性のいずれかの緩衝液等を使用でき、また安定化のためにゼラチン等で水相を固化しても良い。
油層としては通常、生理学的に受容される油類又はワックス類等を単独または組み合わせて使用すればよい。油類としては、以下に例示する植物油、動物油、脂肪酸エステル等が使用できる。
（植物油）硬化ヒマシ油、ピーナッツ油、ヒマワリ種子油、アーモンド油、ホホバ油、落花生油、ヤシ油、パーム油、紅花油、ククイ油、麦芽油、葡萄種子油、ナタネ油、コーン油、オリーブ油、綿実油、アボガド油、ツバキ油、トウモロコシ油、小麦胚芽油、コメヌカ油、カカオ脂、ゴマ油、月見草油、サザンカ油等が挙げられるが、好ましくはゴマ油等である。
（動物油）スクワレン、ラノリン、ミンク油、卵黄油、タートル油、プリスタン等が挙げられる。
（脂肪酸エステル）ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、オレイン酸オクチルドデシル、オレイン酸オレイル、オクタン酸イソステアリル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジオクタン酸ネオペンチルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジイソプロピル等が挙げられる。
ワックス類としては、植物ロウおよび動物ロウが挙げられ、好ましくはカルナウバロウ、ミツロウ、鯨ロウである。
上記の水相と油相との含有割合は、通常、水相：油相＝１：１〜１：５０（体積比）、好ましくは１：５〜１：２０（体積比）である。
本発明のエマルジョンは、任意に界面活性剤、アルコール、脂肪酸、多糖類、防腐剤、ｐＨ調整剤、粘性調整剤等、製剤上許容される添加物を含有し得る。
界面活性剤としては、イオン性又は非イオン性のものを単独または組み合わせて使用できる。好ましくは、ＨＬＢ値が２〜２０のものであり、具体的には、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、レシチン、カプリル酸モノグリセライド等であり、より好ましくはソルビタンセスキオレエートとポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０の組み合わせやカプリル酸モノグリセライドとレシチンとポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０の組み合わせである。
界面活性剤は、Ｔｈ２への移行促進には必ずしも必要な成分ではないが、エマルジョンの安定性等の点からは添加しておくのが好ましい。界面活性剤の添加量は、油相全体に対して通常、約１〜７５重量％、好ましくは約１〜３０重量％である。
本発明のＷ／Ｏエマルジョンの水相に含有される抗原としては、水溶解性が高くかつ生体内において免疫反応を起こし得る物質であればよく、例えばタンパク質、ペプチド、糖タンパク質等を用いることができるが、好ましくはタンパク質またはペプチドである。具体的には、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、サイトケラチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）、ＩＶ型コラーゲン、トランスグルタミナーゼ、ミエリン塩基性タンパク質、インシュリン、グルカゴン、Ｓ−抗原、ＭＨＣ抗原等を使用できる。抗原の含有量は、抗原や対象疾患の種類、投与のルートや時期等によって異なり一概には規定できないが、通常、水相全量に対して約０．０００１〜２０重量％、好ましくは約０．００１〜１０重量％である。
エマルジョンの製造方法は特に限定されないが、例えば以下のように行う。即ち、抗原、水相成分、油相成分からなる混合物を、所望により加温下で混合し、数分〜数十分間程度、超音波処理した後、氷冷する。あるいは、該混合物を室温下で振盪混合する等の方法でもよい。
本発明においてＴｈ１／Ｔｈ２バランスは、以下の試験例に示すように、Ｔｈ１の活性化により生産される抗体であるＩｇＧ２ａおよびＴｈ２の活性化により生産されるＩｇＧ１の各抗体価の比率を求めることにより調べた。即ち、ＩｇＧ１／ＩＧｇ２ａの値が大きくなればヘルパーＴ細胞におけるＴｈ２の割合が増加し、Ｔｈ２への移行が促進されたものと判断した。その結果、本発明のエマルジョン製剤をマウスに投与すると、対照の生理食塩水の製剤を投与した場合に比べてＴｈ２への移行が促進されることが判明した。またその際のトータルＩｇＧ抗体価は対照製剤の場合に比べて低下していたことから、液性免疫反応も抑制されて経口免疫寛容が誘導されていたことも判明した。
このＴｈ２への移行促進効果は、組成の異なる複数のＷ／Ｏエマルジョンにおいて確認されたことから、Ｗ／Ｏエマルジョンに共通する製剤的効果であることが示唆される。なお、本製剤によるＴｈ２への移行促進とは、免疫反応系のＴｈ１／Ｔｈ２バランスにおいて、Ｔｈ１の割合が減少してＴｈ２の割合が増大する変化を意味し、好ましくはＴｈ２の割合がＴｈ１を上回ってＴｈ２偏向の状態に到る変化を意味する。
本製剤は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが関係する疾患、特にＴｈ１優位の免疫反応によると考えられている自己免疫疾患（例：多発性硬化症、慢性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬、若年性糖尿病、慢性甲状腺炎、ぶどう膜炎等）や、Ｔ細胞が媒介するかあるいはＴ細胞に依存する各種アレルギー疾患（例：接触性皮膚炎等）、または臓器移植時の拒絶反応等の予防又は治療剤として有用である。またアトピー性皮膚炎等も、病態によってはＴｈ２優位の免疫反応が関与していることや、Ｔｈ２細胞の活性化によって皮膚組織中の自己抗原に対して抑制性サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β等）が分泌される等のことから、本製剤による予防又は治療効果が期待できる。本製剤の投与ルートについては特に限定されないが、例えば本製剤の使用による付随効果のひとつとして、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ：ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）を介して誘導される免疫寛容誘導等を期待する場合には、経口投与、経鼻投与または経肺投与等の経粘膜投与が行われ、好ましくは経口投与である。
実施例１（卵白アルブミン含有Ｗ／Ｏエマルジョンの経口投与）
抗原タンパク質として卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用い、７容積の水相｛ＯＶＡ含有水溶液（０．２６９〜２６．９ｍｇ／ｍｌ）｝と４０容積の油相｛６．７％（ｗ／ｗ）ＳＯ−１５（日光ケミカル）、１．７％（ｗ／ｗ）ＨＣＯ−６０（日光ケミカル）含有ゴマ油｝を５０℃において混合し、超音波処理（３００Ｗ，２６ｋＨｚ，５０℃，１ｍｉｎ）後氷冷することによりＯＶＡ含有Ｗ／Ｏエマルジョンを調製した。エマルジョン中のＯＶＡ最終濃度は、０．０４〜４ｍｇ／ｍｌであった。エマルジョンの粒度分布はＧＡＬＡＩ ＣＩＳ−１により測定し、５０〜６０ｍｍの粒子径を有していた。ＯＶＡ含有Ｗ／ＯエマルジョンまたはＯＶＡ生食溶液をＢＡＬＢ／ｃマウス（６Ｗ、雄）に５日間連日経口投与（０〜１ｍｇ ＯＶＡ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ，ｄａｙ０〜４）した後、ＯＶＡをフロイント完全アジュバンド（ＦＣＡ（Ｈ３７Ｒａ），ＤＩＦＣＯ社）とともに後肢足蹠に皮下免疫（２５μｇ／ｍｏｕｓｅ，ｄａｙ８）し、免疫後２１日目（ｄａｙ２９）のＯＶＡに対する血清抗体価（トータルＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により調べた。ＥＬＩＳＡの基本操作手順は既報｛Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６，８７３−８８４（１９９２）｝に準じ、第２抗体にはｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗マウスＩｇＧ１ウサギ抗体およびｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗マウスＩｇＧ２ａウサギ抗体を用いた。血清抗体価は、ＥＬＩＳＡにおいて４５０ｎｍにおける吸光度が０．１以上を示す最大希釈倍数として表した。結果を図１及び図２に示す。
（図１）
１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群マウスでは、Ｗ／Ｏエマルジョンおよび生食溶液ともにトータルＩｇＧ抗体価の低下が同程度であった。これに対して０．１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群マウスでは、Ｗ／Ｏエマルジョンのみが１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群と同程度にトータルＩｇＧ抗体価が低下しており、Ｗ／Ｏエマルジョンが生食溶液に比べＯＶＡに対する血清トータルＩｇＧ抗体価を有意に下げることを確認できた（Ｐ＜０．０５）。即ち、本製剤は、免疫寛容を誘導させた。
（図２）
ＯＶＡ含有Ｗ／Ｏエマルジョン投与群マウスでは、ＯＶＡ生食溶液投与群マウスに比べＩｇＧ２ａ抗体価（４〜５例の平均値）に対するＩｇＧ１抗体価（４〜５例の平均値）の比率（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）が約２倍高かった。また、Ｗ／Ｏエマルジョン投与群ではＯＶＡ含量の増加に伴い、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率も増大した。即ち、本製剤は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２への移行を促進させた。
実施例２（ＩＩ型コラーゲン含有Ｗ／Ｏエマルジョンの経口投与）
抗原タンパク質としてＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を用い、７容積の水相｛ＣＩＩ含有塩酸（０．００１Ｎ）溶液（０．２６９〜２．６９ｍｇ／ｍｌ）｝と４０容積の油相｛６．７％（ｗ／ｗ）ＳＯ−１５、１．７％（ｗ／ｗ）ＨＣＯ−６０含有ゴマ油｝を５０℃において混合し、超音波処理（３００Ｗ，２６ｋＨｚ，５０℃，１ｍｉｎ）後氷冷することによりＣＩＩ含有Ｗ／Ｏエマルジョンを調製した。エマルジョン中のＣＩＩ最終濃度は、０．０４〜０．４ｍｇ／ｍｌであった。エマルジョンの粒度分布はＧＡＬＡＩ ＣＩＳ−１により測定し、５０〜６０ｍｍの粒子径を有していた。ＣＩＩ含有Ｗ／ＯエマルジョンまたはＣＩＩ塩酸（０．００１Ｎ）溶液をＢＡＬＢ／ｃマウス（６Ｗ、雄）に５日間連日経口投与（０〜０．１ｍｇ ＣＩＩ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ，ｄａｙ０〜４）した後、ＣＩＩをＦＣＡ（Ｈ３７Ｒａ）とともに後肢足蹠に皮下免疫（１００μｇ／ｍｏｕｓｅ，ｄａｙ８）し、免疫後２１日目（ｄａｙ２９）のＣＩＩに対する血清抗体価（トータルＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により調べた。
（結果）
０．１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群マウスでは、Ｗ／Ｏエマルジョンおよび塩酸（０．００１Ｎ）溶液ともにトータルＩｇＧ抗体価の低下が同程度であったが、エマルジョンの０．０１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群では、１０倍量の塩酸（０．００１Ｎ）溶液投与群と同程度にトータルＩｇＧ抗体価が低下していた。また図３に示す通り、ＣＩＩ含有Ｗ／Ｏエマルジョン投与群マウスでは、ＣＩＩ含有塩酸（０．００１Ｎ）溶液投与群マウスに比べＩｇＧ２ａ抗体価（５〜６例の平均値）に対するＩｇＧ１抗体価（５〜６例の平均値）の比率（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）が約２倍高く、Ｔｈ２型優位の傾向を示した。また、Ｗ／Ｏエマルジョン投与群ではＣＩＩ含量の増加に伴い、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率も増大した。
実施例３（卵白アルブミン含有Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンの経口投与）
ＯＶＡ含有Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンの組成は、水相｛ＯＶＡ生食溶液（０．７５５〜７５．５ｍｇ／ｍｌ）｝：油相｛ＰＤＤ［６８％（ｗ／ｗ）］、ホモテックスＰＴ［８％（ｗ／ｗ）］、ＳＬＰ−ホワイトＳＰ［２％（ｗ／ｗ）］、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ［１７％（ｗ／ｗ）］｝＝５：９５（ｗ／ｗ）から成り、油層を振盪混合（ｒ．ｔ．，１０ｍｉｎ）した後水相を添加し、さらに振盪混合（ｒ．ｔ．，３ｍｉｎ）することにより調製した。実施例１と同様の操作を行い、ＯＶＡ含有Ｗ／ＯマイクロエマルジョンまたはＯＶＡ生食溶液の経口投与を施したＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫後２１日目におけるＯＶＡに対する血清抗体価（トータルＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により調べた。
（結果）
１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群マウスでは、Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンおよび生食溶液ともにトータルＩｇＧ抗体価の低下が同程度であった。これに対して０．１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群マウスでは、Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンのみが１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群と同程度にトータルＩｇＧ抗体価が低下していた。また図４に示す通り、ＯＶＡ含有Ｗ／Ｏマイクロエマルジョン投与群マウスでは、ＯＶＡ生食溶液投与群マウスに比べ５〜１０倍ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率が高く、Ｔｈ２優位の傾向を示した。この傾向は、Ｗ／Ｏマイクロエマルジョン中のＯＶＡ含量の増加に伴い増強した。
実施例４（サイトケラチン含有Ｗ／Ｏエマルジョンの経口投与）
抗原タンパク質として豚皮から陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製したサイトケラチン（ＣＫ）を用いた。この精製物中には、少なくともＮｏ．４，５，７，８，１７，１８のサイトケラチンが含まれることをイムノブロッティングにより確認した。７容積の水相｛ＣＫ含有水溶液（０．２６９ｍｇ／ｍｌ）｝と４０容積の油相｛６．７％（ｗ／ｗ）ＳＯ−１５（日光ケミカル）、１．７％（ｗ／ｗ）ＨＣＯ−６０（日光ケミカル）含有ゴマ油｝を５０℃において混合し、超音波処理（３００Ｗ，２６ｋＨｚ，５０℃，１ｍｉｎ）後氷冷することによりＣＫ含有Ｗ／Ｏエマルジョンを調製した。エマルジョン中のＣＫ最終濃度は、０．０４ｍｇ／ｍｌであった。エマルジョンの粒度分布はＧＡＬＡＩ ＣＩＳ−１により測定し、５０〜６０ｍｍの粒子径を有していた。このＣＫ含有Ｗ／ＯエマルジョンのＤＳ／Ｎｈマウス（Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．４６，２２５−２２９（１９９７））の自然発症皮膚炎に対する治療効果を調べた。実験は、４週齢ＤＳ／Ｎｈマウス（♂）を１２週間コンベンショナル環境下で飼育した後、皮膚炎スコアの偏りがないように群分けし、２ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）投与群、ＣＫ含有トリス緩衝液投与群（０．０１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ）、Ｗ／Ｏ空エマルジョン投与群及びＣＫ含有Ｗ／Ｏエマルジョン（０．０１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ）投与群の計４群（ｎ＝５〜６）を設けて、実験開始から５日間の連続経口投与を３週間間隔で計２回行った。投与開始から６週間経過した時点で実験を終了し、皮膚炎スコア（各個体の皮膚炎の重篤度により０〜５のスコア化）および掻痒感（観察５分間における掻爬行動の積算秒数）について評価を行った。
（結果）
結果を図５及び図６に示す。ＣＫ含有Ｗ／Ｏエマルジョン投与群では、トリス緩衝液、空エマルジョンおよびＣＫ含有トリス緩衝液各投与群に比べ、皮膚炎スコアの抑制ならびに皮膚炎の増悪に伴う掻痒感の増加が抑制された。
産業上の利用可能性
本製剤は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２のバランスが関係する各種疾患、例えば自己免疫疾患やアレルギー疾患等の治療または臓器移植時の拒絶反応等の抑制に有用である。
【図面の簡単な説明】
（図１） 卵白アルブミン（ＯＶＡ）含有Ｗ／Ｏエマルジョンをマウスに５日間連日経口投与後、ＯＶＡで皮下免疫してから２１日目に採取したの血清のＯＶＡに対するトータルＩｇ抗体価を示すグラフである（実施例１参照）。
（図２） 卵白アルブミン（ＯＶＡ）含有Ｗ／Ｏエマルジョンをマウスに５日間連日経口投与後、ＯＶＡで皮下免疫してから２１日目に採取した血清のＯＶＡに対する抗体価比率（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）を示すグラフである（実施例１参照）。
（図３） ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）含有Ｗ／Ｏエマルジョンをマウスに５日間連日経口投与後、ＣＩＩで皮下免疫してから２１日目に採取した血清のＣＩＩに対する抗体価比率（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）を示すグラフである（実施例２参照）。
（図４） 卵白アルブミン（ＯＶＡ）含有Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンをマウスに５日間連日経口投与後、ＯＶＡで皮下免疫してから２１日目に採取した血清のＯＶＡに対する抗体価比率（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）を示すグラフである（実施例３参照）。
（図５） サイトケラチン（ＣＫ）含有Ｗ／Ｏエマルジョン（０．０１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ）をマウスに対して５日間の連続経口投与を３週間間隔で計２回行った場合の皮膚炎スコア（５〜６例の平均値）の推移を示すグラフである（実施例４参照）。
（図６） サイトケラチン（ＣＫ）含有Ｗ／Ｏエマルジョン（０．０１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ）をマウスに対して５日間の連続経口投与を３週間間隔で計２回行った場合の掻痒感（観察５分間における掻爬行動の積算秒数：５〜６例の平均値）の推移を示すグラフである（実施例４参照）。
本発明は、生体内の免疫反応に関与しているヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）のサブセットであるＴｈ１型（以下、Ｔｈ１という）とＴｈ２型（以下、Ｔｈ２という）のバランスにおいて、Ｔｈ１からＴｈ２への移行を促進させる製剤に関する。本製剤は、例えば自己免疫疾患、各種アレルギー疾患、又は臓器移植時の拒絶反応等に対する予防又は治療剤として有用である。
背景技術
自己免疫疾患（例：臓器特異的自己免疫疾患等）、アレルギー疾患あるいは臓器移植拒絶反応等は、内在または外来抗原に対する過剰免疫反応であり、これらの疾患は自己あるいは非自己に対する免疫学的無反応性が破綻する現象として説明できる。これらの疾患に対する治療としては、薬物療法（免疫抑制剤、コルチコステロイド、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン剤など）が主に行われている。しかしながら、免疫抑制剤等は非特異的な免疫抑制を引き起こすので、感染症の併発、悪性腫瘍の発現等の重篤な副作用を伴う。また抗アレルギー剤等は単に対症療法的に使用されているのが現状である。他方、減感作療法などの特異的な免疫療法も試みられているが作用機序に関して不明な部分が多く、いまだ確立された治療方法とは言い難い。
このような状況下、最近、経口免疫寛容（経口トレランス）を自己免疫病等の治療に応用する試みが注目されている。例えば、バイスタンダー抗原と称しＴＧＦ−βなどの抑制性サイトカインを分泌する調節性細胞の増殖を誘導する物質を経口投与することにより誘導される経口免疫寛容を利用して上記疾患を治療する方法が報告されている（ＷＯ９３／１６７２４、ＷＯ９６／４０２３２、特表平８−５０４７４５等）。しかしこれらの方法では、経口投与される抗原に対してＤＤＳ製剤的な工夫はあまりなされておらず、基本的には抗原タンパク質の水溶液又は分散液を単に投与するのみである。従って、調製されるタンパク質製剤はきわめて不安定であるため投与効率が悪く、また安定した免疫寛容の効果が再現されにくいと予想される。また経口免疫寛容の誘導効率を高めるために、サイトカイン類、コレラトキシンＢ鎖あるいはリポ多糖体を併用する試みがなされているが、いずれも実用性の乏しいものである。
一方、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）のサブセットであるＴｈ１とＴｈ２のバランス（Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス）と各種疾患との関係も研究されおり、Ｔｈ１優位の免疫反応に基づくと考えられている自己免疫疾患等の治療方法の一つとして、Ｔｈ１優位の免疫応答からＴｈ２優位の免疫応答への変換が考えられている（日本臨牀５５巻６号（６，１９９７）；医学のあゆみＶｏｌ．１８２ Ｎｏ．９（１９９７），Ｐ５２３等）。しかしこれまでＴｈ１からＴｈ２への移行を促進してＴｈ２偏向の状態に効率よく到らしめる試みはあまりなされていない。例えば、ＷＯ９３／００１６０やＡＮＮＡＬＳ ＯＦ ＴＨＥ ＮＥＷ ＹＯＲＫ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ Ｖｏｌ．７７８（１９９６）等には、抗原タンパク質をＷ／Ｏ型エマルジョン又はＷ／Ｏ型の多相エマルジョンにして、経口免疫寛容を誘導する方法が記載されているが、実験的にはｔｏｔａｌの抗体価の変化を調べているだけである。ＩＮＦＥＣＴ．ＡＧＥＮＴＳＤＩＳ．（ＵＳＡ），２／２（５５−７３）（１９９３）には、マイクロスフェアーで経口免疫化した際にＴｈ２型優位になった旨記載されているが、エマルジョンによる投与時および経口免疫寛容時のＴｈ１／Ｔｈ２バランスについては何ら検討されていない。Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１３３，４２３−４２７（１９７０）；Ｅｎｔｅｒａｌ．Ｎｕｔｒ．１４，４５９−４６２（１９９０）；Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．２５，１９６−２０２（１９８２）；Ａｕｓｔ．Ｎ．Ｚ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．５７，３２３−３２９（１９８７）等には、非経口投与されたＷ／Ｏエマルジョンが免疫系を抑制する方向に機能する旨記載されている。しかしこれらのエマルジョンには抗原が含まれておらず、また経口投与した際のＴｈ１／Ｔｈ２バランスの変化については何ら考察されていない。
このように免疫応答反応におけるＴｈ１／Ｔｈ２バランスを調節し、特にＴｈ２への移行を促進して好ましくはＴｈ２偏向の状態に到らしめることにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが関係すると考えられる各種疾患を効率よく予防又は治療する方法は、未だ十分には検討されていなかった。
発明の開示
本発明者らは鋭意検討した結果、各種抗原を油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）に内包させて投与すれば、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ２へ移行されやすくなることを見出し、以下に示す本発明を完成した。
（１）抗原を含有するＷ／Ｏエマルジョンを含むことを特徴とする、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２への移行促進剤。
（２）抗原がタンパク質またはペプチドである、上記（１）記載の促進剤。
（３）経粘膜投与によって免疫寛容を誘導する、上記（１）又は（２）記載の促進剤。
（４）ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２のバランスが関係する疾患の予防又は治療剤である、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の促進剤。
（５）疾患がＴｈ１主体の免疫反応に起因する疾患、アレルギー疾患または臓器移植時の拒絶反応である、上記（４）記載の促進剤。
（６）Ｔｈ１主体の免疫反応に起因する疾患が自己免疫疾患である、上記（５）記載の促進剤。
（７）マウス経口投与時の“ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ”で示される抗体価比率の値が、対照の抗原含有生理食塩水を投与した場合に比べて約２倍以上である、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の促進剤。
（８）抗原をＷ／Ｏエマルジョンに含有させて経口投与することを特徴とする、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２への移行を促進する方法。
（９）請求項１〜７のいずれかに記載の促進剤を投与することを特徴とする、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２への移行を促進する方法。
（１０）ヘルパーＴ細胞のＴｈ２への移行を促進するために、抗原の投与剤形としてＷ／Ｏエマルジョンを使用する方法。
（１１）ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２のバランスが関係する疾患の予防又は治療剤を製造するために、抗原を含有するＷ／Ｏエマルジョンを使用する方法。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いるＷ／Ｏエマルジョンとしては種々のものが使用でき、マイクロエマルジョンであってもよい。そのサイズは通常、約０．００１〜１００μｍである。組成についても特に限定されるものではないが、水相としては、通常、水または弱酸性、中性、弱塩基性のいずれかの緩衝液等を使用でき、また安定化のためにゼラチン等で水相を固化しても良い。
油層としては通常、生理学的に受容される油類又はワックス類等を単独または組み合わせて使用すればよい。油類としては、以下に例示する植物油、動物油、脂肪酸エステル等が使用できる。
（植物油）硬化ヒマシ油、ピーナッツ油、ヒマワリ種子油、アーモンド油、ホホバ油、落花生油、ヤシ油、パーム油、紅花油、ククイ油、麦芽油、葡萄種子油、ナタネ油、コーン油、オリーブ油、綿実油、アボガド油、ツバキ油、トウモロコシ油、小麦胚芽油、コメヌカ油、カカオ脂、ゴマ油、月見草油、サザンカ油等が挙げられるが、好ましくはゴマ油等である。
（動物油）スクワレン、ラノリン、ミンク油、卵黄油、タートル油、プリスタン等が挙げられる。
（脂肪酸エステル）ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、オレイン酸オクチルドデシル、オレイン酸オレイル、オクタン酸イソステアリル、オクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジオクタン酸ネオペンチルグリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジイソプロピル等が挙げられる。
ワックス類としては、植物ロウおよび動物ロウが挙げられ、好ましくはカルナウバロウ、ミツロウ、鯨ロウである。
上記の水相と油相との含有割合は、通常、水相：油相＝１：１〜１：５０（体積比）、好ましくは１：５〜１：２０（体積比）である。
本発明のエマルジョンは、任意に界面活性剤、アルコール、脂肪酸、多糖類、防腐剤、ｐＨ調整剤、粘性調整剤等、製剤上許容される添加物を含有し得る。
界面活性剤としては、イオン性又は非イオン性のものを単独または組み合わせて使用できる。好ましくは、ＨＬＢ値が２〜２０のものであり、具体的には、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、レシチン、カプリル酸モノグリセライド等であり、より好ましくはソルビタンセスキオレエートとポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０の組み合わせやカプリル酸モノグリセライドとレシチンとポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０の組み合わせである。
界面活性剤は、Ｔｈ２への移行促進には必ずしも必要な成分ではないが、エマルジョンの安定性等の点からは添加しておくのが好ましい。界面活性剤の添加量は、油相全体に対して通常、約１〜７５重量％、好ましくは約１〜３０重量％である。
本発明のＷ／Ｏエマルジョンの水相に含有される抗原としては、水溶解性が高くかつ生体内において免疫反応を起こし得る物質であればよく、例えばタンパク質、ペプチド、糖タンパク質等を用いることができるが、好ましくはタンパク質またはペプチドである。具体的には、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、サイトケラチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）、ＩＶ型コラーゲン、トランスグルタミナーゼ、ミエリン塩基性タンパク質、インシュリン、グルカゴン、Ｓ−抗原、ＭＨＣ抗原等を使用できる。抗原の含有量は、抗原や対象疾患の種類、投与のルートや時期等によって異なり一概には規定できないが、通常、水相全量に対して約０．０００１〜２０重量％、好ましくは約０．００１〜１０重量％である。
エマルジョンの製造方法は特に限定されないが、例えば以下のように行う。即ち、抗原、水相成分、油相成分からなる混合物を、所望により加温下で混合し、数分〜数十分間程度、超音波処理した後、氷冷する。あるいは、該混合物を室温下で振盪混合する等の方法でもよい。
本発明においてＴｈ１／Ｔｈ２バランスは、以下の試験例に示すように、Ｔｈ１の活性化により生産される抗体であるＩｇＧ２ａおよびＴｈ２の活性化により生産されるＩｇＧ１の各抗体価の比率を求めることにより調べた。即ち、ＩｇＧ１／ＩＧｇ２ａの値が大きくなればヘルパーＴ細胞におけるＴｈ２の割合が増加し、Ｔｈ２への移行が促進されたものと判断した。その結果、本発明のエマルジョン製剤をマウスに投与すると、対照の生理食塩水の製剤を投与した場合に比べてＴｈ２への移行が促進されることが判明した。またその際のトータルＩｇＧ抗体価は対照製剤の場合に比べて低下していたことから、液性免疫反応も抑制されて経口免疫寛容が誘導されていたことも判明した。
このＴｈ２への移行促進効果は、組成の異なる複数のＷ／Ｏエマルジョンにおいて確認されたことから、Ｗ／Ｏエマルジョンに共通する製剤的効果であることが示唆される。なお、本製剤によるＴｈ２への移行促進とは、免疫反応系のＴｈ１／Ｔｈ２バランスにおいて、Ｔｈ１の割合が減少してＴｈ２の割合が増大する変化を意味し、好ましくはＴｈ２の割合がＴｈ１を上回ってＴｈ２偏向の状態に到る変化を意味する。
本製剤は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが関係する疾患、特にＴｈ１優位の免疫反応によると考えられている自己免疫疾患（例：多発性硬化症、慢性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬、若年性糖尿病、慢性甲状腺炎、ぶどう膜炎等）や、Ｔ細胞が媒介するかあるいはＴ細胞に依存する各種アレルギー疾患（例：接触性皮膚炎等）、または臓器移植時の拒絶反応等の予防又は治療剤として有用である。またアトピー性皮膚炎等も、病態によってはＴｈ２優位の免疫反応が関与していることや、Ｔｈ２細胞の活性化によって皮膚組織中の自己抗原に対して抑制性サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β等）が分泌される等のことから、本製剤による予防又は治療効果が期待できる。本製剤の投与ルートについては特に限定されないが、例えば本製剤の使用による付随効果のひとつとして、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ：ｍｕｃｏｓａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）を介して誘導される免疫寛容誘導等を期待する場合には、経口投与、経鼻投与または経肺投与等の経粘膜投与が行われ、好ましくは経口投与である。
実施例１（卵白アルブミン含有Ｗ／Ｏエマルジョンの経口投与）
抗原タンパク質として卵白アルブミン（ＯＶＡ）を用い、７容積の水相｛ＯＶＡ含有水溶液（０．２６９〜２６．９ｍｇ／ｍｌ）｝と４０容積の油相｛６．７％（ｗ／ｗ）ＳＯ−１５（日光ケミカル）、１．７％（ｗ／ｗ）ＨＣＯ−６０（日光ケミカル）含有ゴマ油｝を５０℃において混合し、超音波処理（３００Ｗ，２６ｋＨｚ，５０℃，１ｍｉｎ）後氷冷することによりＯＶＡ含有Ｗ／Ｏエマルジョンを調製した。エマルジョン中のＯＶＡ最終濃度は、０．０４〜４ｍｇ／ｍｌであった。エマルジョンの粒度分布はＧＡＬＡＩ ＣＩＳ−１により測定し、５０〜６０ｍｍの粒子径を有していた。ＯＶＡ含有Ｗ／ＯエマルジョンまたはＯＶＡ生食溶液をＢＡＬＢ／ｃマウス（６Ｗ、雄）に５日間連日経口投与（０〜１ｍｇ ＯＶＡ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ，ｄａｙ０〜４）した後、ＯＶＡをフロイント完全アジュバンド（ＦＣＡ（Ｈ３７Ｒａ），ＤＩＦＣＯ社）とともに後肢足蹠に皮下免疫（２５μｇ／ｍｏｕｓｅ，ｄａｙ８）し、免疫後２１日目（ｄａｙ２９）のＯＶＡに対する血清抗体価（トータルＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により調べた。ＥＬＩＳＡの基本操作手順は既報｛Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６，８７３−８８４（１９９２）｝に準じ、第２抗体にはｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗マウスＩｇＧ１ウサギ抗体およびｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ標識抗マウスＩｇＧ２ａウサギ抗体を用いた。血清抗体価は、ＥＬＩＳＡにおいて４５０ｎｍにおける吸光度が０．１以上を示す最大希釈倍数として表した。結果を図１及び図２に示す。
（図１）
１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群マウスでは、Ｗ／Ｏエマルジョンおよび生食溶液ともにトータルＩｇＧ抗体価の低下が同程度であった。これに対して０．１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群マウスでは、Ｗ／Ｏエマルジョンのみが１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群と同程度にトータルＩｇＧ抗体価が低下しており、Ｗ／Ｏエマルジョンが生食溶液に比べＯＶＡに対する血清トータルＩｇＧ抗体価を有意に下げることを確認できた（Ｐ＜０．０５）。即ち、本製剤は、免疫寛容を誘導させた。
（図２）
ＯＶＡ含有Ｗ／Ｏエマルジョン投与群マウスでは、ＯＶＡ生食溶液投与群マウスに比べＩｇＧ２ａ抗体価（４〜５例の平均値）に対するＩｇＧ１抗体価（４〜５例の平均値）の比率（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）が約２倍高かった。また、Ｗ／Ｏエマルジョン投与群ではＯＶＡ含量の増加に伴い、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率も増大した。即ち、本製剤は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ２への移行を促進させた。
実施例２（ＩＩ型コラーゲン含有Ｗ／Ｏエマルジョンの経口投与）
抗原タンパク質としてＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）を用い、７容積の水相｛ＣＩＩ含有塩酸（０．００１Ｎ）溶液（０．２６９〜２．６９ｍｇ／ｍｌ）｝と４０容積の油相｛６．７％（ｗ／ｗ）ＳＯ−１５、１．７％（ｗ／ｗ）ＨＣＯ−６０含有ゴマ油｝を５０℃において混合し、超音波処理（３００Ｗ，２６ｋＨｚ，５０℃，１ｍｉｎ）後氷冷することによりＣＩＩ含有Ｗ／Ｏエマルジョンを調製した。エマルジョン中のＣＩＩ最終濃度は、０．０４〜０．４ｍｇ／ｍｌであった。エマルジョンの粒度分布はＧＡＬＡＩ ＣＩＳ−１により測定し、５０〜６０ｍｍの粒子径を有していた。ＣＩＩ含有Ｗ／ＯエマルジョンまたはＣＩＩ塩酸（０．００１Ｎ）溶液をＢＡＬＢ／ｃマウス（６Ｗ、雄）に５日間連日経口投与（０〜０．１ｍｇ ＣＩＩ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ，ｄａｙ０〜４）した後、ＣＩＩをＦＣＡ（Ｈ３７Ｒａ）とともに後肢足蹠に皮下免疫（１００μｇ／ｍｏｕｓｅ，ｄａｙ８）し、免疫後２１日目（ｄａｙ２９）のＣＩＩに対する血清抗体価（トータルＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により調べた。
（結果）
０．１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群マウスでは、Ｗ／Ｏエマルジョンおよび塩酸（０．００１Ｎ）溶液ともにトータルＩｇＧ抗体価の低下が同程度であったが、エマルジョンの０．０１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群では、１０倍量の塩酸（０．００１Ｎ）溶液投与群と同程度にトータルＩｇＧ抗体価が低下していた。また図３に示す通り、ＣＩＩ含有Ｗ／Ｏエマルジョン投与群マウスでは、ＣＩＩ含有塩酸（０．００１Ｎ）溶液投与群マウスに比べＩｇＧ２ａ抗体価（５〜６例の平均値）に対するＩｇＧ１抗体価（５〜６例の平均値）の比率（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）が約２倍高く、Ｔｈ２型優位の傾向を示した。また、Ｗ／Ｏエマルジョン投与群ではＣＩＩ含量の増加に伴い、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率も増大した。
実施例３（卵白アルブミン含有Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンの経口投与）
ＯＶＡ含有Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンの組成は、水相｛ＯＶＡ生食溶液（０．７５５〜７５．５ｍｇ／ｍｌ）｝：油相｛ＰＤＤ［６８％（ｗ／ｗ）］、ホモテックスＰＴ［８％（ｗ／ｗ）］、ＳＬＰ−ホワイトＳＰ［２％（ｗ／ｗ）］、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ［１７％（ｗ／ｗ）］｝＝５：９５（ｗ／ｗ）から成り、油層を振盪混合（ｒ．ｔ．，１０ｍｉｎ）した後水相を添加し、さらに振盪混合（ｒ．ｔ．，３ｍｉｎ）することにより調製した。実施例１と同様の操作を行い、ＯＶＡ含有Ｗ／ＯマイクロエマルジョンまたはＯＶＡ生食溶液の経口投与を施したＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫後２１日目におけるＯＶＡに対する血清抗体価（トータルＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により調べた。
（結果）
１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群マウスでは、Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンおよび生食溶液ともにトータルＩｇＧ抗体価の低下が同程度であった。これに対して０．１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群マウスでは、Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンのみが１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ投与群と同程度にトータルＩｇＧ抗体価が低下していた。また図４に示す通り、ＯＶＡ含有Ｗ／Ｏマイクロエマルジョン投与群マウスでは、ＯＶＡ生食溶液投与群マウスに比べ５〜１０倍ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比率が高く、Ｔｈ２優位の傾向を示した。この傾向は、Ｗ／Ｏマイクロエマルジョン中のＯＶＡ含量の増加に伴い増強した。
実施例４（サイトケラチン含有Ｗ／Ｏエマルジョンの経口投与）
抗原タンパク質として豚皮から陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製したサイトケラチン（ＣＫ）を用いた。この精製物中には、少なくともＮｏ．４，５，７，８，１７，１８のサイトケラチンが含まれることをイムノブロッティングにより確認した。７容積の水相｛ＣＫ含有水溶液（０．２６９ｍｇ／ｍｌ）｝と４０容積の油相｛６．７％（ｗ／ｗ）ＳＯ−１５（日光ケミカル）、１．７％（ｗ／ｗ）ＨＣＯ−６０（日光ケミカル）含有ゴマ油｝を５０℃において混合し、超音波処理（３００Ｗ，２６ｋＨｚ，５０℃，１ｍｉｎ）後氷冷することによりＣＫ含有Ｗ／Ｏエマルジョンを調製した。エマルジョン中のＣＫ最終濃度は、０．０４ｍｇ／ｍｌであった。エマルジョンの粒度分布はＧＡＬＡＩ ＣＩＳ−１により測定し、５０〜６０ｍｍの粒子径を有していた。このＣＫ含有Ｗ／ＯエマルジョンのＤＳ／Ｎｈマウス（Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．４６，２２５−２２９（１９９７））の自然発症皮膚炎に対する治療効果を調べた。実験は、４週齢ＤＳ／Ｎｈマウス（♂）を１２週間コンベンショナル環境下で飼育した後、皮膚炎スコアの偏りがないように群分けし、２ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）投与群、ＣＫ含有トリス緩衝液投与群（０．０１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ）、Ｗ／Ｏ空エマルジョン投与群及びＣＫ含有Ｗ／Ｏエマルジョン（０．０１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ）投与群の計４群（ｎ＝５〜６）を設けて、実験開始から５日間の連続経口投与を３週間間隔で計２回行った。投与開始から６週間経過した時点で実験を終了し、皮膚炎スコア（各個体の皮膚炎の重篤度により０〜５のスコア化）および掻痒感（観察５分間における掻爬行動の積算秒数）について評価を行った。
（結果）
結果を図５及び図６に示す。ＣＫ含有Ｗ／Ｏエマルジョン投与群では、トリス緩衝液、空エマルジョンおよびＣＫ含有トリス緩衝液各投与群に比べ、皮膚炎スコアの抑制ならびに皮膚炎の増悪に伴う掻痒感の増加が抑制された。
産業上の利用可能性
本製剤は、ヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２のバランスが関係する各種疾患、例えば自己免疫疾患やアレルギー疾患等の治療または臓器移植時の拒絶反応等の抑制に有用である。
【図面の簡単な説明】
（図１） 卵白アルブミン（ＯＶＡ）含有Ｗ／Ｏエマルジョンをマウスに５日間連日経口投与後、ＯＶＡで皮下免疫してから２１日目に採取したの血清のＯＶＡに対するトータルＩｇ抗体価を示すグラフである（実施例１参照）。
（図２） 卵白アルブミン（ＯＶＡ）含有Ｗ／Ｏエマルジョンをマウスに５日間連日経口投与後、ＯＶＡで皮下免疫してから２１日目に採取した血清のＯＶＡに対する抗体価比率（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）を示すグラフである（実施例１参照）。
（図３） ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）含有Ｗ／Ｏエマルジョンをマウスに５日間連日経口投与後、ＣＩＩで皮下免疫してから２１日目に採取した血清のＣＩＩに対する抗体価比率（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）を示すグラフである（実施例２参照）。
（図４） 卵白アルブミン（ＯＶＡ）含有Ｗ／Ｏマイクロエマルジョンをマウスに５日間連日経口投与後、ＯＶＡで皮下免疫してから２１日目に採取した血清のＯＶＡに対する抗体価比率（ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ）を示すグラフである（実施例３参照）。
（図５） サイトケラチン（ＣＫ）含有Ｗ／Ｏエマルジョン（０．０１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ）をマウスに対して５日間の連続経口投与を３週間間隔で計２回行った場合の皮膚炎スコア（５〜６例の平均値）の推移を示すグラフである（実施例４参照）。
（図６） サイトケラチン（ＣＫ）含有Ｗ／Ｏエマルジョン（０．０１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙ）をマウスに対して５日間の連続経口投与を３週間間隔で計２回行った場合の掻痒感（観察５分間における掻爬行動の積算秒数：５〜６例の平均値）の推移を示すグラフである（実施例４参照）。
Claims (8)
- 抗原を含有するW/Oエマルジョンを含むことを特徴とする、ヘルパーＴ細胞のTh2への移行促進剤。
- 抗原がタンパク質またはペプチドである、請求項１記載の促進剤。
- 経粘膜投与によって免疫寛容を誘導する、請求項１又は２記載の促進剤。
- ヘルパーＴ細胞のTh1／Th2のバランスが関係する疾患の予防又は治療剤である、請求項１ないし３のいずれかに記載の促進剤。
- 疾患がTh1主体の免疫反応に起因する疾患、アレルギー疾患、又は臓器移植時の拒絶反応である、請求項４記載の促進剤。
- Th1主体の免疫反応に起因する疾患が自己免疫疾患である、請求項５記載の促進剤。
- マウス経口投与時の“1gG1／1gG2a”で示される抗体価比率の値が、対照の抗原含有生理食塩水を投与した場合に比べて約２倍以上である、請求項１ないし６のいずれかに記載の促進剤。
- ヘルパーＴ細胞のTh1／Th2のバランスが関係する疾患の予防又は治療剤を製造するために、抗原を含有するW/Oエマルジョンを使用する方法。
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