JP4465741B2 - 二本鎖ｄｎａ断片の末端での連結 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子操作に関し、より具体的にはＤＮＡの連結方法、該連結方法で得ることのできる環状ＤＮＡ構成体および遺伝子のクローニング用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子操作においては、遺伝子を所望する部位で切断する方法および各遺伝子（またはＤＮＡ）断片を選択的に連結する方法が必須である。前者の典型的なものとしては、所望する部位の近傍に制限酵素の認識する部位が存在する場合には、対応する制限酵素で切断し、必要に応じて、さらにエキソヌクレアーゼを用いてさらにモノヌクレオチドを順次切断していく方法が知られる。
【０００３】
一方、後者における特定部位間の連結方法としては、適当な場合には制限酵素によるＤＮＡ切断フラグメントの付着末端を利用するか、あるいはＤＮＡの平滑、末端をそのまま、もしくは該平滑末端に適当なアダプターを付加した末端を利用し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結する方法が知られている。
【０００４】
付着末端を利用する方法は標的のＤＮＡ断片に対応する制限酵素部位が存在しなければ適用できず、また平滑末端を利用する方法は連結の方向性が特定できないために、目的の連結体を他の連結体から分離する操作等を必要とする。
【０００５】
アダプターを利用する方法は、連結しようとするＤＮＡの塩基配列の種類により制限されることなく適用できるが、例えば、アダプターのライゲーション、未反応アダプターの除去、リン酸化等の多段操作を必要とするため、操作が煩雑であり、また操作に熟練が要求される。殊に、ＰＣＲ産物から目的の遺伝子のみをクローニングする場合、ＰＣＲの性質上、目的とするＰＣＲ産物に混在する副産物の処理が必要となり、上記操作がより複雑になる。勿論、ＰＣＲにより得られた平滑末端を有するＤＮＡをそのままライゲーションに供することもできるが、この場合には、上記副産物の処理の必要性に加えて、上述のようにライゲーションの方向性がランダムになるとの問題も生じる。
【０００６】
C. Aslanidis ら、Nucleic Acids Research, Vol.１８（１９９０），６０６９−６０７３には、制限酵素やＤＮＡリガーゼを使用することなく、特有の反復配列を有するプライマーを用いて増幅されたＰＣＲ産物と同様に増幅されたプラスミドベクターを、それぞれ特殊の方法で一本鎖化（ｓｓ）されたテイルを介して二分子会合体（環状）を形成し、次いで該会合体を細菌に導入し、次いで環状体のみを選択的に取得する方法が提案されている。しかし、この方法は、特有の反復配列を有するベクターＤＮＡおよび対応する配列を有するＰＣＲプライマーの使用、さらにＰＣＲ後の酵素によるＰＣＲ産物の末端の一本鎖化が必要であり、必ずしも汎用性のある方法とはいえない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、適当な制限酵素部位の存在を必要とせず、簡易に操作でき、しかも汎用性のあるＤＮＡ断片の連結方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、生体内でのＤＮＡの相同組換えに興味をもち、研究してきた。その結果、生体外でＲｅｃＡタンパク質を介して形成されるＤＮＡ複合体が多方面に利用できることを見出した。本発明は、その一環として、二本鎖ＤＮＡ断片における一本鎖（ｓｓ）部末端と該ｓｓ部末端に相同性もしくは相補性の末端配列を有する二本鎖（ｄｓ）部末端とが、ＲｅｃＡタンパク質の作用下で三本鎖部を形成して安定な連結体をもたらすことおよびその広範な適用性が存在するとの知見に基づき完成されたものである。
【０００９】
したがって、本発明は、一本鎖部（ｓｓ部）末端を有する二本鎖ＤＮＡのｓｓ部末端と、一方の鎖が前記ｓｓ部の塩基配列に対して相同性の配列を含む二本鎖部（ｄｓ部）末端を有する二本鎖ＤＮＡのｄｓ部末端とを、相同的組換えタンパク質の存在下で接触させて前記ｓｓ部末端とｄｓ部末端とを含んでなる三本鎖ＤＮＡ構造の複合体を形成することを特徴とする二本鎖ＤＮＡのｓｓ部末端とｄｓ部末端との連結方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、かような連結方法によって形成することのできる特定の環状ＤＮＡ構成体が一定の生体外の環境下で安定に存在しうるとの知見に基づき提供される、環状ＤＮＡ構成体であって、一本鎖部（ｓｓ部）末端と一方の鎖が前記ｓｓ部の塩基配列に対して相同性の配列を含む二本鎖部（ｄｓ部）末端とからなる三本鎖構造部分を少なくとも一箇所有するＤＮＡ構成体に関する。
【００１１】
また、本発明は、上記連結方法、さらには上記環状ＤＮＡ構成体の形成を介する手段が、所望の遺伝子、殊にＰＣＲ産物のクローニングに適していることから、そのようなクローニングに用いられるキットにも関する。
【００１２】
【発明の具体的な態様】
本発明にいう「相同性」は、２種の一本鎖ＤＮＡ間における広義の配列相同性に相当し、本発明に従って、例えば、後述する三本鎖構造を形成するのに十分な配列の同一性を意味する。したがって、２種の一本鎖ＤＮＡ間の塩基配列が完全に一致することまで要求するものでなく、好ましくは９５％以上の同一であればよく、また２種の一本鎖ＤＮＡ配列間で鎖長が若干異なる場合も本発明にいう相同性があるとされる。また、「相補性」とは、２種の一本鎖ＤＮＡ間で相互に塩基対を形成するか、あるいはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーゼンを起こしうる関係にあることを意味する。したがって、相補性は、両ＤＮＡ配列間で、少なくとも９５％以上が本来の塩基対を形成できるような関係にあることを意味し、また２種の一本鎖ＤＮＡ配列間で鎖長が若干異なる場合も相補性があるとされる。
【００１３】
本発明によれば、一本鎖部（ｓｓ部）末端を有する二本鎖ＤＮＡのｓｓ部末端と、一方の鎖が前記ｓｓ部の塩基配列に対して相同性の配列（したがって、もう一方の鎖は該塩基配列に対して相補性である）を有する二本鎖部（ｄｓ部）末端を有する二本鎖ＤＮＡのｄｓ部末端との連結方法が提供される。この連結は直鎖状ＤＮＡ分子において１箇所または、複数部位で同時にもしくは連続して起こることも想定されているが、２箇所で起こる場合が好ましい。１個または複数のＤＮＡ断片の各末端において、１箇所または複数箇所で連結が起きた結果、環状または直鎖状のＤＮＡ連結体が形成される。限定されるものでないが、好ましくは、環状ＤＮＡ連結体が形成される場合が、特に好ましいものとして企図されている。ＤＮＡ連結体は、明細書では、ＤＮＡ構成体またはＤＮＡ組換え体とも称されるが、１個の二本鎖ＤＮＡ断片または複数の二本鎖ＤＮＡ断片から構築されるものを意味する。
【００１４】
本発明に従う「連結」は、これに拘束されるものでないが、典型的には図１に略図的に示されているような様式で起こる。図１によれば、ＤＮＡ断片１とＤＮＡ断片２の二本鎖部（ｄｓ部）末端と一本鎖部（ｓｓ部）末端との間の連結が示されているが、これらのｄｓ部末端とｓｓ部末端は、同一または２種以上のＤＮＡ分子上に存在してもよい。同一の分子（すなわち、ＤＮＡ断片１とＤＮＡ断片２が一つの断片となる）上にｄｓ部末端とｓｓ部末端が存在する場合には、連結の結果として環状ＤＮＡ構成体が形成し、三本鎖構造部分は１箇所になる。
【００１５】
２種以上のＤＮＡ分子（または断片）にｓｓ部末端および／またはｄｓ部末端が存在する場合には、図１に示されるように、（ｉ） ＤＮＡ断片１においてｄｓ部末端が、そしてＤＮＡ断片２においてｓｓ部末端がそれぞれ１個ずつ存在するか、（ｉｉ） ＤＮＡ断片１の５′末端と３′末端の両末端にｄｓ部末端がそれぞれ存在し、そしてＤＮＡ断片２の５′末端と３′末端の両末端にｓｓ部末端がそれぞれ存在するか、あるいは（ｉｉｉ）または（ｉｖ） ＤＮＡ断片１の５′末端もしくは３′末端にｄｓ部末端が存在し、３′末端もしくは５′末端にｓｓ部末端が存在し、そしてＤＮＡ断片２の３′末端もしくは５′末端にｓｓ部末端が存在し、５′末端もしくは３′末端にｄｓ部末端が存在しうる。本発明によれば、以上のＤＮＡ断片１とＤＮＡ断片２とが逆の関係にある場合、さらに１種以上の追加のＤＮＡ断片がそれらの両末端または片末端にｄｓ部および／またはｓｓ部を有する場合の連結も包含される。
【００１６】
好ましいものとしては、上記（ｉｉ）〜（ｉｖ）に記載したような、２種のＤＮＡ断片間の連結を挙げることができる。この場合、ＤＮＡ断片１および／またはＤＮＡ断片２に存在する２つのｄｓ部末端は同一または異なる塩基配列をもつことができ、同様に２つのｓｓ部末端は前記ｄｓ部末端にそれぞれ対応する同一または異なる塩基配列をもつことができる。「それぞれ対応する」とは、連結されるべきｄｓ部末端とｓｓ部末端とが、本発明に従って三本鎖構造を形成できる関係にあることを意味する。すなわち、連結されるべきｄｓ部末端におけるセンス鎖（例えば、図１の二本鎖ＤＮＡ断片の上部の一本鎖ＤＮＡに相当する鎖を本明細書では便宜的に、このように称する。また、もう一方の下部の鎖は、アンチセンス鎖と称する）の塩基配列と、ｓｓ部末端のセンス鎖（上記と同様の意味を表すものとして用いている）の塩基配列が相同性であることを意味する。「相同性」については、上記定義を参照されたい。
【００１７】
本発明に従えば、上記２つのｓｓ部末端は、異なる塩基配列、殊に相互に相補性でないことが好ましい。このような構成を採用すれば、２つのｓｓ部末端間で起こる結合を避けることができ、各ｓｓ部末端はそれらの対応する各ｄｓ部末端と三本鎖構造を形成するために優先して利用されうる。２つのｓｓ部末端は、特に、後述する遺伝子のクローニング等に本発明を適用する場合には、それぞれ同一のＤＮＡ断片の５′および３′末端を構成していることが好ましく、また、ｓｓ部末端は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに存在してもよいが、同一のＤＮＡ断片における、センス鎖の３′末端もしくは５′末端とアンチセンス鎖の３′もしくは５′末端に、それぞれｓｓ部末端をもつことが好ましい。
【００１８】
上記ｓｓ部末端の塩配列の長さは、限定されるものでないが、少なくとも６ｍｅｒの、好ましくは１３ｍｅｒ以上からなる。６ｍｅｒ未満の場合、本発明に従う連結を達成するのに必要な三本鎖構造が安定性を欠く場合がある。上記長さには、理論上、上限はないが、一般的に５００ｍｅｒ（またはｂａｓｅ）以下、好ましくは１００ｍｅｒ以下である。
【００１９】
本発明の方法に適用されるＤＮＡ断片は、それらの起源を問うことなく、いずれのＤＮＡ断片であってもよい。しかし、例えば、２種の断片を連結させる場合、一方は、適当なコンピテント細胞内に導入でき、そして該細胞内で自律複製できるベクターに由来するものが好ましい。このようなベクターは、その後連結体が導入させるコンピテント細胞によって選ばれるが、該細胞として大腸菌を使用する場合には、市販されている、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＳＰ６４、ｐＧＥＭ−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）、等のベクターまたはプラスミドを挙げることができる。また、該細胞として酵母を使用する場合には、ＹＥｐ２４、ＹＬｐ５等の、さらにバチルスを使用する場合にはｐＨＹ３００、ＰＬＫ等のベクターまたはプラスミドを挙げることができる。
【００２０】
他方、もう一方のＤＮＡ断片としては、微生物、または動植物のゲノムもしくはミトコンドリア等に由来する断片を、特に企図しているが、合成もしくは半合成ＤＮＡ、すでに遺伝子操作が施されたＤＮＡ等に由来するものであってもよい。
【００２１】
本発明の方法を、例えば、遺伝子のクローニングに使用する場合には、目的とする遺伝子またはその一部を含む断片の両ｄｓ部末端における塩基配列に対応する配列をもつｓｓ部末端が上記ベクターに由来するＤＮＡ断片の両末端にそれぞれ結合された態様のものを、一方のＤＮＡ断片として選ぶ。上記両ｄｓ部末端は、生来の遺伝子が有する塩基配列そのものであってもよいが、例えば、上記ｓｓ部末端の一部または全部に対応する塩基配列を有するように調製されたものであってもよい。このように調製されたものとしては、例えば、２つのｓｓ部末端配列に続けて目的とする遺伝子の５′もしくは３′末端部の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ産物が挙げられる。
【００２２】
上記のＤＮＡ断片は、本発明の目的に沿い、そして本発明の作用効果を奏するものである限り、それらの鎖長に制限がない。当業者であれば、本明細書の記載全体または後述する実施例を参照すれば、あるいは該実施例に沿って実験を行うことで、上記鎖長の適当な範囲を理解できるであろう。
【００２３】
本発明では、上記のｄｓ部末端とｓｓ部末端を、適当な液体媒質中の相同的組換えタンパク質の存在下で接触させる。かような相同的組換えタンパク質（または普遍的組換えに関与する多機能性タンパク質）としては、その存在下で上記ｄｓ部末端と上記ｓｓ部末端が、該タンパク質を介して安定な複合体を形成しうるものであれば、起源を問うことなく、いかなるタンパク質も使用できる。しかし、かようなタンパク質の具体的なものとしては、大腸菌（Escherichia coli）に由来するＲｅｃＡタンパク質、耐熱性細菌（Thermus thermophilus）、他の腸内細菌において、ＲｅｃＡ遺伝子によりコードされている多機能性タンパク質、また、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、メチロフィルス メチロトローファス（Methylophilus methylotrophus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ウスティラゴ メイディス（Ustilago maydis）等に由来する、それ自体既知のＲｅｃＡ類似タンパク質が挙げられる。その他、酵母（Saccharomyces cerevisiae）やヒトに由来するＲｅｃＡ類似タンパク質も、上記相同的組換えタンパク質に包含される。これらのうち、入手容易性、安定性、機能性の観点から、大腸菌に由来するＲｅｃＡタンパク質またはそれに類似する機能を有するタンパク質（例えば、該タンパク質に由来する改変タンパク質もしくはその断片）を使用することが好ましい。改変タンパク質としては、ＲｅｃＡ遺伝子の部位特異的変異誘発等により作出されたＲｅｃＡ遺伝子産物であって、ＲｅｃＡタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲｅｃＡタンパク質と同様に上記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうる機能を有するものを挙げることができる。数個のアミノ酸が欠失したものには、ＲｅｃＡタンパク質の一本鎖ＤＮＡへの結合ドメインを含むタンパク質もしくはペプチドが包含される。このようなペプチドの例としては、Voloshin et al., Science, Vol. ２７２，１９９６：８６８−８７２に記載されているものを挙げることができる。なお、以上より理解できるように、本発明にいうタンパク質の語は、ペプチドをも包含する概念で使用している。
【００２４】
また、上記接触に際し、ヌクレオシド三リン酸を共存させることが好ましいか、もしくは必要である。このようなヌクレオシド三リン酸としては、アデノシン５′−三リン酸（ＡＴＰ）またはその類縁体、例えばアデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ＡＴＰ−γＳ）、あるいはｄＡＴＰ、ＵＴＰ、ｄＵＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰまたはＧＴＰなどを挙げることができる。なお、上記複合体を形成する系において、例えば、ＡＴＰが生物学的な分解を伴うような場合には、ＡＴＰ−γＳを使用するのが好ましい。
【００２５】
上記接触は、適当な液体媒質、例えば、適当な緩衝剤によって緩衝化されていてもよい水溶液中で行う。緩衝剤を使用する場合は、例えばトリス［すなわち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］と適当な酸（例えば酢酸、塩酸、等）とによりｐＨを６.５〜７.５、好ましくは約７.２に調節したトリス系の緩衝液を使用する。緩衝剤は一般に１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭで使用する。このような液体媒質中に、連結されるべき上記のＤＮＡ断片を溶解し、さらには相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸を加えて得られる混合液をインキュベートすることにより、上記接触が行われる。
【００２６】
連結されるべきＤＮＡ断片は、それぞれの末端が適正に連結するのに悪影響が生じない範囲であれば、それらの使用割合はいずれであってもよい。しかし、本発明の方法が特定の遺伝子のクローニングに使用される場合には、遺伝子の全部またはその一部を含む断片に対し、連結すべきもう一方の断片をほぼ等モルで使用するのが好ましい。また、相同的組換えタンパク質の使用割合は、ｓｓ部の鎖長に依存して変動するので限定できないが、一般的にｓｓ部を構成するヌクレオチド数を上回るモル量で、好ましくはヌクレオチド３個に対してほぼ１モル量とするのがよい。
【００２７】
さらに、上記のように調製される混合液は、４〜５４℃、好ましくは約３７℃において１５分以上、一般的に約３０分間インキュベートすることにより、本発明にいう「接触」を完了することができ、その結果、三本鎖構造部分を少なくとも１箇所有するＤＮＡ断片の連結体（またはＤＮＡ構成体）が形成される。
【００２８】
こうして形成されるＤＮＡ構成体は、通常、少なくとも三本鎖構造部分に相同的組換えタンパク質が結合した複合体の形態で存在する。このような複合体は、適当な精製法、例えば、フェノール・クロロホルム抽出、ゲル濾過法、各種電気泳動法等により反応混合液から分離することができる。こうして分離された複合体は、生体外の通常の生理学的な条件下で安定であり、複合体を構成するＤＮＡ配列または遺伝子の解析に利用できる。
【００２９】
また、上記複合体は、その形成された反応混合液から分離することなく（もしくは場合によって分離して）、プロティナーゼ（例えば、プロティナーゼＫ）で処理することにより、相同的組換えタンパク質を複合体から除去することができる。こうして、除タンパク質処理されたＤＮＡ構成体も、安定である。特に、２種のＤＮＡ断片の連結により形成され、２箇所に三本鎖構造を有するものは、特に安定であり、しかも、常法によりコンピテント細胞へ効率よく導入できる。なお、導入に先立って、一本鎖核酸に特異的に作用するエンドヌクレアーゼにより三本鎖構造部分（図１参照）を、二本鎖構造に変換したＤＮＡ構成体とすると、さらにコンピテント細胞への導入効率を高めることができる。
【００３０】
この導入は、ＤＮＡ断片の一方に使用するベクター由来の断片の出発原料（ベクター）の種類により、適当に選ぶことができるが、例えば、コンピテント細胞として大腸菌を選び、そしてベクターまたはプラスミドとして大腸菌で自律複製できるベクターを選ぶ場合には、エレクトロポレーション法、カルシウム処理法などにより実施できる。こうして上記ＤＮＡ構成体が導入された細胞を培養すれば、上記三本鎖構造部分（存在する場合には）が二本鎖構造部分（この構造部分は、上記ｄｓ部末端からｓｓ部末端に相当するヌクレオチド配列が除去された状態で、ｄｓ部末端とｓｓ部末端がリン酸ジェステル結合を介して共有結合しているものと推定される）に変換した環状ＤＮＡ構成体を増幅することができる。
【００３１】
上記のコンピテント細胞への遺伝子導入の常法に従えば、環状ＤＮＡ構成体が直鎖状ＤＮＡ構成体に比し、著しく高い効率でコンピテント細胞に導入されうる。したがって、例えば、２種のｓｓ部末端の塩基配列に対応する配列を有し、それに続けてクローニングすべき遺伝子の５′もしくは３′末端部の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、該遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行って得られるＰＣＲ産物をｄｓ部末端を有するＤＮＡ断片として本発明の方法を適用すると、ＰＣＲにより適正な伸長が行われていない副産物は上記環状ＤＮＡ構成体を形成しないため、コンピテント細胞に導入されない。こうして、本発明の方法によれば、クローニングすべき遺伝子が、ＰＣＲ法により適正に増幅されたＰＣＲ産物のみを取得することができる。
【００３２】
また、上述の環状ＤＮＡ構成体は、適当なコンピテント細胞内で自律複製できるので、それら自体またはその複製体を用いて、その中に含まれるＤＮＡ配列または遺伝子の構造ないしは機能の解析にも利用できる。したがって、本発明の別の態様として、環状ＤＮＡ構成体であって、一本鎖部（ｓｓ部）末端と一方の鎖が前記ｓｓ部の塩基配列に対して相同性の配列を含む二本鎖部（ｄｓ部）末端とからなる三本鎖構造部分を少なくとも一箇所有するＤＮＡ構成体が提供される。かようなＤＮＡ構成体としては、上述の２つのＤＮＡ断片から構成されており、その１つの断片がコンピテント細胞内で自律複製できる塩基配列を有し、もう１つの断片がクローニングすべき遺伝子の全部または一部を含むものであって、かつ三本鎖構造部分を２箇所有するものが好ましい。「遺伝子の一部」は、その遺伝子を他の遺伝子と識別できる塩基配列をもっている限り、そのサイズを問わない。また、遺伝子は２種以上の遺伝子が含まれていてもよい。
【００３３】
本発明の方法は、上述のように遺伝子のクローニングに適用できる。また、かようなクローニングは、さらに別の態様として提供する、下記の遺伝子のクローニング用のキットにより都合よく実施できるであろう。このようなキットは、少なくとも
（Ａ） 一本鎖部（ｓｓ部）を両末端に有する二本鎖ＤＮＡ断片であって、これらのｓｓ部における塩基配列が非相補性であり、かつ二本鎖部にコンピテント細胞内で自律複製できる機能を提供しうるＤＮＡ配列が存在するＤＮＡ断片、と
（Ｂ） 上記各ｓｓ部における塩基配列に相同性の配列をそれぞれ５′末端の一部として有し、それぞれさらにクローニングすべき遺伝子の片末端の配列の一部ともう一方の片末端の配列の一部を連続した配列として有する２種のオリゴヌクレオチドのプライマーとの組み合わせ物を含んでなる遺伝子のクローニング用キットである。
【００３４】
上記のｓｓ部における塩基配列の長さおよび二本鎖部（すなわち、コンピテント細胞内で自律複製できるベクターまたはプラスミドに由来）は、既に記述したとおりである。また、クローニングすべき遺伝子の片末端の配列の一部ともう一方の片末端の配列の一部は、該遺伝子を鋳型とし、そしてそれぞれ上記ｓｓ部と一緒になって、ＰＣＲのプライマーとして機能する長さの配列である。
【００３５】
本発明のキットの一使用態様によれば、（Ａ）のＤＮＡ断片と、（Ｂ）のプライマーを用いて増幅されたＰＣＲ産物（ｄｓ部末端を有するＤＮＡ断片に相当する）とにより連結が行われる。上述したように、連結は、相同的組換えタンパク質、ヌクレオシド三リン酸の存在下、適当に緩衝化された水溶液中で行われる。したがって、上記ＤＮＡ試料の他に、上記タンパク質、ヌクレオシド三リン酸、緩衝剤を本発明のキットに含めてもよい。さらには、連結して得られたＤＮＡ構成体に結合した上記タンパク質を除去するためのプロティナーゼを含めてもよい。
【００３６】
以上のような本発明の連結法は、以下のような特徴を有する。
【００３７】
（ｉ） 連結すべきＤＮＡ断片に適当な制限酵素認識部位が存在していなくても、連結が可能である。
【００３８】
（ii） 連結酵素を使用しないので、ベクターＤＮＡの自己連結反応が起こらず、遺伝子のクローニングにおいて望ましくない副産物の混入を避けることができる。
【００３９】
（iii） 連結部位は、その後導入されるコンピテント細胞内で修復されるので、必ずしもライゲーションを行う必要がない。
【００４０】
（iv） 限定されるものでないが、例えば、ＰＣＲ産物のクローニングに適用する場合には、ＰＣＲ副産物はコンピテント細胞内に導入されないので、バックグラウンドが低くなる。
【００４１】
（ｖ） 相同的組換えタンパク質（例えば、ＲｅｃＡタンパク質）を使用するために、連結に塩基特異性および方向特異性をもたらすことが可能である。
【００４２】
（vi） 形質転換は従来法より同程度以上の効率で行うことができる。
【００４３】
（vii） 上述の C. Aslanidis らの方法のように、特別なベクターを使用する必要がないので、汎用性が高い。
【００４４】
したがって、本発明は、遺伝子操作を伴う技術分野において、極めて有用である。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【００４６】
実施例１： ＲｅｃＡタンパク質を用いるＤＮＡ断片のクローニング（モデル実験系）
ベクターＤＮＡとして、直鎖状ベクターＤＮＡの両末端が、１３ｍｅｒ（配列Ａ）と１４ｍｅｒ（配列Ｂ）の３′突出末端を持つものを用意した。配列Ａを５′末端にもち、それに続いて、ヒトのｐ５３ｇｅｎｅのエクソン１１の片末端配列をもつオリゴヌクレオチド１と、配列Ｂを５′末端にもち、それに続いて、もう一方の末端配列をもつオリゴヌクレオチド２を用いて、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、取得した増幅産物をインサートＤＮＡ断片として用意した。上記、ベクターＤＮＡ断片と、インサートＤＮＡ断片との間でＲｅｃＡ組み換え中間体形成（三本鎖構造部形成）反応を行った。この反応には、２つの反応液ＡとＢ（それぞれ２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、２００ｎｇインサートＤＮＡ断片、６.０μｇのＲｅｃＡタンパク、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれている。反応液Ｂには、１μｇのベクターＤＮＡ断片、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれている。反応液ＡとＢを、それぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１５分間インキュベートした後、６０μｌのＴＥ緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０μｌの蒸留水に溶かした。これらの適量を、エレクトロポレーションの常法により大腸菌株ＤＨ１０Ｂに形質転換した。アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌを含む寒天培地で１晩培養し、生じてきたインサートを含む白いコロニーから、プラスミドを調製し、それに含まれるインサートＤＮＡを調べた。制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位が、インサートＤＮＡのほぼ中央とベクターＤＮＡのインサートを組込み部位の近傍にあることを確認した。次いで、ＢａｍＨＩを使ってインサートＤＮＡを切り出すと同時に、インサートＤＮＡが目的とするものであるかどうかを確認するためにアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ断片の泳動パターンの解析を行った。結果を図２に示す。この図のレーン１からレーン５は、培養の結果生じた白色コロニーから調製したプラスミドに由来するものを示し、そしてレーン６からレーン７は、培養によって出てきた青色コロニーから調製したプラスミドに由来するものである。レーン８は、用いたベクターＤＮＡに由来する。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで切断したものである。
【００４７】
図から、約６００ｂｐのところに切り出されたインサートＤＮＡのバンドがみられ、ベクターＤＮＡにもインサートＤＮＡの一部が方向性をもって連結されたことがわかる。また、インサートを含まない青色コロニーのプラスミドは、インサートを含まないことがわかる。
オリゴヌクレオチド１（配列番号：１）
5′-gacgacgacaaga c acctgaagtc caaaaagggt cagtc-3′
オリゴヌクレオチド２（配列番号：２）
5′-gaggagaagcccgg tggcag caaagtttta ttgtaaaata-3′
（上記配列において、それぞれ１４番目のＣ以降および１５番目のｔ以降がヒトゲノムＤＮＡの配列に相当する。）
実施例２：連結されたＤＮＡの確認
図３のレーン１は、実施例１で大腸菌に形質転換する前のＤＮＡ混合物を、１.０％アガロースゲル電気泳動したものである。レーン２は、実施例１に記載したインサートＤＮＡが、配列Ａはもつが、配列Ｂを片側末端に含まないものを使って反応を行ったＤＮＡ混合物であって、大腸菌に形質転換する前のＤＮＡ混合物を同様に電気泳動したものである。レーン３は、実施例１に記載したインサートＤＮＡが、配列Ｂはもつが、配列Ａを片側末端に含まないものを使って反応を行ったＤＮＡ混合物であって、大腸菌に形質転換する前のＤＮＡ混合物を同様に電気泳動したものである。レーン４は、実施例１に記載したインサートＤＮＡが、配列Ａと配列Ｂともそれぞれの末端に含まないもの（それぞれ、オリゴヌクレオチド３および４）を使って反応を行ったＤＮＡ混合物であって、大腸菌に形質転換する前のＤＮＡ混合物を同様に電気泳動したものである。レーン５は、レーン１で用いたインサートＤＮＡのみを電気泳動した結果である。レーン６は、レーン２で用いたインサートＤＮＡのみを電気泳動した結果である。レーン７は、レーン３で用いたインサートＤＮＡのみを電気泳動した結果である。レーン８は、レーン４で用いたインサートＤＮＡのみを電気泳動した結果である。レーン９は、用いたベクターＤＮＡである。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断したものである。
【００４８】
図より、ＲｅｃＡの反応により、配列特異的にＤＮＡ断片が連結されることがわかる。
オリゴヌクレオチド３（配列番号：３）
5′-c acctgaagtc caaaaagggt cagtc-3′
オリゴヌクレオチド４（配列番号：４）
5′-tggcag caaagtttta ttgtaaaata-3′
実施例３：連結反応の酵素依存性
図４のレーン１は、実施例１で大腸菌に形質転換する前のＤＮＡ混合物を、１.０％アガロースゲル電気泳動したものである。レーン２は、ＡＴＰ−γＳを加えないでレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、ＲｅｃＡを加えないでレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断したものである。
【００４９】
図より、目的ＤＮＡ断片の連結には、ＲｅｃＡによる酵素反応が必要不可欠である。
【００５０】
実施例４：連結したＤＮＡの、安定性を調べる実験
三本鎖構造の形成を介して連結したＤＮＡの安定性を調べた。必要に応じて、連結したＤＮＡを大腸菌に形質転換する前に、各種ＤＮＡ修飾酵素で処理することが可能であるかどうか調べた。ここで調べたのは修飾酵素の１つである、耐熱性ＤＮＡライゲース（アンプリガーゼ）について調べた。その具体的な反応は、実施例１で記載した反応で、反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした後、その反応液に等量のライゲーション反応混合溶液を混ぜ、５５℃で１時間インキュベートした。ラーゲーション反応液の組成は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１.０ｍＭ ＮＡＤ、０.０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ８.３、４０ｕｎｉｔｓアンプリガーゼ（Ampligase）である。次に、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートした後、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０μｌの蒸留水に溶かした。その適量について１.０％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後に、エチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を取りＤＮＡを観察した。図５のレーン１が、その結果を示す。レーン２は、アンプリガーゼを加えないでレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、ラーゲション反応を上記反応液の代わりに、蒸留水を用いたことと、ライゲーションのインキュベーションを行わないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、インサートＤＮＡを示す。レーン５は、ベクターＤＮＡを示す。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断したものである。
【００５１】
図より、連結されたＤＮＡサンプルを、アンプリガーゼ反応緩衝液中で、５５℃で１時間インキュベートしても、電気泳動ゲルでのバンドパターンには大きな変化は見られなかった。レーン２およびレーン３の結果から、本発明によってできるＤＮＡ複合体は、非常に安定であることがわかる。このことから、必要ならば、ＲｅｃＡタンパクの存在下で、ＤＮＡリガーゼによるライゲーションを行うことが可能である。これは、インサートＤＮＡを共有結合でベクターＤＮＡに組み込むことが可能になり、また、ＤＮＡに入っていつニックを修復することも可能である。また、他の耐熱性ＤＮＡ修復酵素を用いてあらゆる連結ＤＮＡ複合体の修飾も可能である。
【００５２】
実施例５：三本鎖構造形成反応における、各反応成分の依存性
ターゲットＤＮＡとしてＭ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで直鎖状にしたものと、そのターゲットＤＮＡの末端部位の配列を持つ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド５を用意した。このオリゴヌクレオチドは、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで５′末端を標識した。ターゲットＤＮＡとオリゴヌクレオチド３との間の三本鎖構造形成反応には、２つの反応液Ａ（２０μｌ）と反応液Ｂ（２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、１ｐｍｏｌの標識オリゴヌクレオチド５、６.０μｇのＲｅｃＡタンパク、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液Ｂには、２００ｎｇのターゲットＤＮＡ、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での三本鎖構造形成反応を終えた反応液４０μｌに、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、除ＲｅｃＡ処理を行った。その半分量については１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。結果を図６（Ｂ）に示す。その後、ゲルをろ紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた。シグナルの検出は、乾燥させたゲルのオートラジオグラムをとり、Ｘ線フィルム上に記録した。その結果を図６（Ａ）のレーン１に示す。比較実験として、次のことを行った。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで５′末端標識したものである。レーン２は、ＲｅｃＡを加えないで反応を行った以外は、レーン１と同じである。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを加えないで反応を行った以外は、レーン１と同じである。レーン４は、逆相補オリゴヌクレオチド６を用いて反応を行った以外はレーン１と同じである。レーン５は、オリゴヌクレオチドを加えないで反応を行った以外はレーン１と同じである。レーン６は、オリゴヌクレオチド７を用いて反応を行った以外はレーン１と同じである。レーン７は、ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａｌで切断したターゲットＤＮＡに対するオリゴヌクレオチド７を用いて、反応を行ったサンプル。レーン７は、ターゲットＤＮＡとして、ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａｌで切断したものを用いたことと、その末端部位の配列をもつ標識オリゴヌクレオチド７を用いたこと以外は、レーン１と同じ反応を行ったものである。
【００５３】
図より、（Ａ）のレーン１に示すように、三本鎖構造形成には、全ての反応成分が反応に加えられる必要があることがわかる。また、逆相補オリゴヌクレオチドと逆相同オリゴヌクレオチドでは、三本鎖構造形成体は得られないことから、オリゴヌクレオチドの方向性は一方のみである。
オリゴヌクレオチド５（配列番号：５）
5′-agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac- 3′
オリゴヌクレオチド６（配列番号：６）
5′-gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct caaagcctct- 3′
オリゴヌクレオチド７（配列番号：７）
5′-cact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagt-3′
実施例６：三本鎖構造形成反応における、用いるオリゴヌクレオチドの配列方向性
図７（Ａ）のレーン１は、図１３（Ａ）のレーン１と同じ反応を行ったものである。レーン２は、逆相補な配列をもつ標識オリゴヌクレオチド４を用いた以外は、レーン１と同じ反応を行ったものである。レーン３は、標識オリゴヌクレオチド８を用いた以外は、レーン１と同じ反応を行ったものである。レーン４は、標識オリゴヌクレオチド９を用いた以外は、レーン１と同じ反応を行ったものである。（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【００５４】
図より、直鎖状ターゲットＤＮＡの両末端部位で三本鎖形成が可能であり、そのとき用いるオリゴヌクレオチドは、ターゲットの両末端配列の一方の方向を持った相同配列でなければならない。
オリゴヌクレオチド８（配列番号：８）
5′-tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta gtggcattac-3′
オリゴヌクレオチド９（配列番号：９）
5′-gtaatgccac tacgaaggca ccaacctaaa acgaaagagg cgaaagaata cactaaaaca-3′
実施例７：三本鎖構造形成反応における、オリゴヌクレオチド配列の熱安定性図８（Ａ）のレーン１と同じ反応を行ったサンプル１０μｌに２０ｍＭ ＮａＣｌを加えて、熱処理（３７℃、１０分）を行ったサンプル。レーン２は、熱処理（４５℃、１０分）のサンプル。レーン３は、熱処理（５５℃、１０分）のサンプル。レーン４は、熱処理（６５℃、１０分）のサンプル。レーン５は、熱処理（７５℃、１０分）のサンプル。レーン６は、熱処理（８５℃、１０分）のサンプル。（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。（Ｃ）は、（Ａ）と同じ実験を、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断したターゲットＤＮＡの末端領域の配列を持つ、４０−ｍｅｒの長さのオリゴヌクレオチド１０を用いて行った。（Ｄ）は（Ｃ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
オリゴヌクレオチド１０（配列番号：１０）
5′-actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3′
図より、６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド５を用いた三本鎖の熱安定性は、８５℃付近がほぼ限界で、４０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いた場合には、７５℃付近がほぼ限界であることがわかる。オリゴの長さが６０−ｍｅｒ以上であると、三本鎖の熱安定性は、極めて高いことがわかる。
【００５５】
実施例８：ＲｅｃＡ反応による、長鎖ｃＤＮＡ断片のクローニング
ベクターＤＮＡとして、プラスミド pBluescript （ＳＫ＋）を制限酵素 Notlと Sall で切断したものを、さらに、キロシークエンス用ディリーションキット（タカラ酒造社）を用いて、両端を５′突出末端化した。その方法は、制限酵素 Notl と Sall で５′突出末端化したベクターＤＮＡ３００ｎｇを含むエキソヌクレアーゼ反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８.０、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１８０ｕｎｉｔ Exonuclease lll）１００μｌを、３７℃で１分間反応させた。フェノール・クロロフォルム抽出−エタノール沈殿を行い、酵素の失活とＤＮＡの濃縮を行った。また、インサートＤＮＡとして、７ｋｂの長さをもつラットｃＤＮＡ断片（Ohara, O. et al., Brain Res. Mol. Brain Brain Res. 57(2) 181-192(1998)参照；GenBank の accession no.AB008551）を用いた。このｃＤＮＡ断片の両末端には、それぞれ５４ｂｐと５５ｂｐの長さの、ベクターＤＮＡの末端領域とオーバラップした配列を持っている。上記、ベクターＤＮＡと、インサートＤＮＡとの間でＲｅｃＡ組み換え中間体形成（三本鎖構造形成）反応を行った。三本鎖構造形成反応は、２つの反応液ＡとＢ（それぞれ２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、２００ｎｇインサートＤＮＡ、６.０μｇのＲｅｃＡタンパク、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液Ｂには、１μｇのターゲットＤＮＡ、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１５分間インキュベートした後、６０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０μｌの蒸留水に溶かした。その適量を、１.０％アガロースゲル電気泳動した結果を、図９のレーン１に示す。レーンＭは、ｋｂＤＮＡ lader maker を示す。レーン２は、エキソヌクレアーゼ反応を２分間行ったこと以外はレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【００５６】
図より、Ｅｘｏ−処理ベクターとインサートに対するＲｅｃＡ反応で複合体形成がみられる。ｅｘｏ−処理は１分でも２分でも問題ない。本鎖化された領域の長さは直接は測定していないが、１分当たり１００−２００塩基程度だろうと推定される。
【００５７】
実施例９：連結したＤＮＡの修復反応。
【００５８】
実施例１で記載した反応で、電気泳動する前のサンプルを、Ｔ４ ＤＮＡ Polymerase 反応液と、クレノウ反応液に混ぜ、３７℃で１５分間反応させた。Ｔ４ ＤＮＡ Ｐolymerase 反応液には、０.２５ｍＭ ４ｄＮＴＰｓ、３３ｍＭ Ｔｒｉｓ-acetate、ｐＨ７、６６ｍＭ ＣＨ３Ｃ Ｋ、１０ｍＭ（ＣＨ３Ｃｏｏ）２Ｍｇ、０.５ｍＭ ＤＴＴ、０.０１％ ＢＳＡ、４ｕｎｉｔ Ｔ４ ＤＮＡ Polymerase を含む。反応後に、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０μｌの蒸留水に溶かした。その適量について１.０％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後に、エチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を取りＤＮＡを観察した。図１０のレーン１は、反応を行う前のＤＮＡを示す。レーン２は、Ｔ４ ＤＮＡ Polymerase で反応させた結果を示す。レーンＭは、ｋｂＤＮＡ lader maker を示す。
【００５９】
図より、Ｔ４ ｐｏｌ.処理で６ｋｂ付近の同定のバンドは消失するが、１０ｋｂ付近のベクター／インサート複合体らしきバンドはなくならない。
【００６０】
実施例１０：連結されたＤＮＡの確認
結果を図１１に示す。レーンＭは、ｋｂＤＮＡ lader maker を示す。図１０のレーン１と同じサンプルを、大腸菌株ＤＨ１０Ｂに形質転換した。アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌを含む寒天培地で１晩培養し、プレート上の５００クローンからプラスミドを回収して、アガロースゲル電気泳動した。その結果をレーン１に示す。レーン２は、図１０のレーン２と同じサンプルについてレーン１と同じ処理を行った結果を示す。レーン３は、図１０のレーン３と同じサンプルについてレーン１と同じ処理を行った結果を示す。
【００６１】
図より、Ｔ４ ｐｏｌ．処理を行っても、ＤＮＡ断片はクローニングされている。
【００６２】
実施例１１：
ＤＮＡ連結複合体のエンドヌクレアーゼ処理の効果
連結したＤＮＡ（部分的に三本鎖構造を有する）を大腸菌に形質転換する前に、各種エンドヌクレアーゼ処理を行い、その後の形質転換効率の変動を調べた。実施例１で示した方法により、三本鎖構造の形成によって連結させたＤＮＡ複合体を、実験１：Cleavase(R)VII（Third Wave Technologies, inc.）反応（反応液組成未公表に混ぜ、全量２０μｌとし、５４度６０分インキュベーション）実験２：マングビーンヌクレアーゼ反応（３０ units Mung Bean Nuclease（宝酒造社）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ（ＣＨ3ＣＯＯ）2Ｚｎ、５％グリセロールを含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量２０μｌとし、３７度３０分インキュベーション、実験３：Ｓ１ヌクレアーゼ反応（１０ units Ｓ１ Nuclease（宝酒造社）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.６）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、を含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量２０μｌとし、３７度で１０分間インキュベーション）、実験４：ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ反応（１０ units ＢＡＬ３１ Nuclease（宝酒造社）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、６００ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ ＣａＣｌ2、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、を含むＢＡＬ３１ Nuclease 反応液に混ぜ、全量２０μｌとし、２０℃で３０分間インキュベーション）、実験５：処理なし。ＤＮＡ連結複合体を、以上の各種酵素で反応後に、８０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０μｌの蒸留水に溶かした。その適量を、大腸菌株ＤＨ１０Ｂに形質転換した。アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌを含む寒天倍地で１晩培養し、出てきたインサートを含む白いコロニー数を数えた。
【００６３】
その結果を、下記表１に示す。
【００６４】
【表１】
表１より、形質転換前のエンドヌクレアーゼ処理は、本発明に従うＤＮＡ構成体による形質転換効率を向上させることが確認できる。
【００６５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、ＤＮＡ断片のクローニング法の反応模式図を示す。
【図２】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、ＤＮＡ断片のクローニングを行った実施例１のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、連結されたＤＮＡの確認を行った実施例２のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】ｒｅｃＡ三本鎖形成によって連結されたＤＮＡ断片の連結反応の酵素依存性について調べた実施例３のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】ｒｅｃＡ三本鎖形成によって連結された連結したＤＮＡの、熱安定性を調べた実施例４のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図６】オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ末端型三本鎖形成反応における、各反応成分の依存性を調べた実施例５のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ末端型三本鎖形成反応における、オリゴヌクレオチドの配列方向性を調べた実施例６のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】ＤＮＡ末端型三本鎖形成反応における、オリゴヌクレオチド配列の熱安定性を調べた実施例７のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図９】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、長鎖ｃＤＮＡ断片のクローニングを行った実施例８のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１０】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、連結長鎖ｃＤＮＡ複合体の修飾酵素を用いた修復反応による効果について調べた実施例９のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１１】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、連結された長鎖ｃＤＮＡ断片の確認を行った実施例１０のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子操作に関し、より具体的にはＤＮＡの連結方法、該連結方法で得ることのできる環状ＤＮＡ構成体および遺伝子のクローニング用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子操作においては、遺伝子を所望する部位で切断する方法および各遺伝子（またはＤＮＡ）断片を選択的に連結する方法が必須である。前者の典型的なものとしては、所望する部位の近傍に制限酵素の認識する部位が存在する場合には、対応する制限酵素で切断し、必要に応じて、さらにエキソヌクレアーゼを用いてさらにモノヌクレオチドを順次切断していく方法が知られる。
【０００３】
一方、後者における特定部位間の連結方法としては、適当な場合には制限酵素によるＤＮＡ切断フラグメントの付着末端を利用するか、あるいはＤＮＡの平滑、末端をそのまま、もしくは該平滑末端に適当なアダプターを付加した末端を利用し、ＤＮＡリガーゼを用いて連結する方法が知られている。
【０００４】
付着末端を利用する方法は標的のＤＮＡ断片に対応する制限酵素部位が存在しなければ適用できず、また平滑末端を利用する方法は連結の方向性が特定できないために、目的の連結体を他の連結体から分離する操作等を必要とする。
【０００５】
アダプターを利用する方法は、連結しようとするＤＮＡの塩基配列の種類により制限されることなく適用できるが、例えば、アダプターのライゲーション、未反応アダプターの除去、リン酸化等の多段操作を必要とするため、操作が煩雑であり、また操作に熟練が要求される。殊に、ＰＣＲ産物から目的の遺伝子のみをクローニングする場合、ＰＣＲの性質上、目的とするＰＣＲ産物に混在する副産物の処理が必要となり、上記操作がより複雑になる。勿論、ＰＣＲにより得られた平滑末端を有するＤＮＡをそのままライゲーションに供することもできるが、この場合には、上記副産物の処理の必要性に加えて、上述のようにライゲーションの方向性がランダムになるとの問題も生じる。
【０００６】
C. Aslanidis ら、Nucleic Acids Research, Vol.１８（１９９０），６０６９−６０７３には、制限酵素やＤＮＡリガーゼを使用することなく、特有の反復配列を有するプライマーを用いて増幅されたＰＣＲ産物と同様に増幅されたプラスミドベクターを、それぞれ特殊の方法で一本鎖化（ｓｓ）されたテイルを介して二分子会合体（環状）を形成し、次いで該会合体を細菌に導入し、次いで環状体のみを選択的に取得する方法が提案されている。しかし、この方法は、特有の反復配列を有するベクターＤＮＡおよび対応する配列を有するＰＣＲプライマーの使用、さらにＰＣＲ後の酵素によるＰＣＲ産物の末端の一本鎖化が必要であり、必ずしも汎用性のある方法とはいえない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、適当な制限酵素部位の存在を必要とせず、簡易に操作でき、しかも汎用性のあるＤＮＡ断片の連結方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、生体内でのＤＮＡの相同組換えに興味をもち、研究してきた。その結果、生体外でＲｅｃＡタンパク質を介して形成されるＤＮＡ複合体が多方面に利用できることを見出した。本発明は、その一環として、二本鎖ＤＮＡ断片における一本鎖（ｓｓ）部末端と該ｓｓ部末端に相同性もしくは相補性の末端配列を有する二本鎖（ｄｓ）部末端とが、ＲｅｃＡタンパク質の作用下で三本鎖部を形成して安定な連結体をもたらすことおよびその広範な適用性が存在するとの知見に基づき完成されたものである。
【０００９】
したがって、本発明は、一本鎖部（ｓｓ部）末端を有する二本鎖ＤＮＡのｓｓ部末端と、一方の鎖が前記ｓｓ部の塩基配列に対して相同性の配列を含む二本鎖部（ｄｓ部）末端を有する二本鎖ＤＮＡのｄｓ部末端とを、相同的組換えタンパク質の存在下で接触させて前記ｓｓ部末端とｄｓ部末端とを含んでなる三本鎖ＤＮＡ構造の複合体を形成することを特徴とする二本鎖ＤＮＡのｓｓ部末端とｄｓ部末端との連結方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、かような連結方法によって形成することのできる特定の環状ＤＮＡ構成体が一定の生体外の環境下で安定に存在しうるとの知見に基づき提供される、環状ＤＮＡ構成体であって、一本鎖部（ｓｓ部）末端と一方の鎖が前記ｓｓ部の塩基配列に対して相同性の配列を含む二本鎖部（ｄｓ部）末端とからなる三本鎖構造部分を少なくとも一箇所有するＤＮＡ構成体に関する。
【００１１】
また、本発明は、上記連結方法、さらには上記環状ＤＮＡ構成体の形成を介する手段が、所望の遺伝子、殊にＰＣＲ産物のクローニングに適していることから、そのようなクローニングに用いられるキットにも関する。
【００１２】
【発明の具体的な態様】
本発明にいう「相同性」は、２種の一本鎖ＤＮＡ間における広義の配列相同性に相当し、本発明に従って、例えば、後述する三本鎖構造を形成するのに十分な配列の同一性を意味する。したがって、２種の一本鎖ＤＮＡ間の塩基配列が完全に一致することまで要求するものでなく、好ましくは９５％以上の同一であればよく、また２種の一本鎖ＤＮＡ配列間で鎖長が若干異なる場合も本発明にいう相同性があるとされる。また、「相補性」とは、２種の一本鎖ＤＮＡ間で相互に塩基対を形成するか、あるいはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーゼンを起こしうる関係にあることを意味する。したがって、相補性は、両ＤＮＡ配列間で、少なくとも９５％以上が本来の塩基対を形成できるような関係にあることを意味し、また２種の一本鎖ＤＮＡ配列間で鎖長が若干異なる場合も相補性があるとされる。
【００１３】
本発明によれば、一本鎖部（ｓｓ部）末端を有する二本鎖ＤＮＡのｓｓ部末端と、一方の鎖が前記ｓｓ部の塩基配列に対して相同性の配列（したがって、もう一方の鎖は該塩基配列に対して相補性である）を有する二本鎖部（ｄｓ部）末端を有する二本鎖ＤＮＡのｄｓ部末端との連結方法が提供される。この連結は直鎖状ＤＮＡ分子において１箇所または、複数部位で同時にもしくは連続して起こることも想定されているが、２箇所で起こる場合が好ましい。１個または複数のＤＮＡ断片の各末端において、１箇所または複数箇所で連結が起きた結果、環状または直鎖状のＤＮＡ連結体が形成される。限定されるものでないが、好ましくは、環状ＤＮＡ連結体が形成される場合が、特に好ましいものとして企図されている。ＤＮＡ連結体は、明細書では、ＤＮＡ構成体またはＤＮＡ組換え体とも称されるが、１個の二本鎖ＤＮＡ断片または複数の二本鎖ＤＮＡ断片から構築されるものを意味する。
【００１４】
本発明に従う「連結」は、これに拘束されるものでないが、典型的には図１に略図的に示されているような様式で起こる。図１によれば、ＤＮＡ断片１とＤＮＡ断片２の二本鎖部（ｄｓ部）末端と一本鎖部（ｓｓ部）末端との間の連結が示されているが、これらのｄｓ部末端とｓｓ部末端は、同一または２種以上のＤＮＡ分子上に存在してもよい。同一の分子（すなわち、ＤＮＡ断片１とＤＮＡ断片２が一つの断片となる）上にｄｓ部末端とｓｓ部末端が存在する場合には、連結の結果として環状ＤＮＡ構成体が形成し、三本鎖構造部分は１箇所になる。
【００１５】
２種以上のＤＮＡ分子（または断片）にｓｓ部末端および／またはｄｓ部末端が存在する場合には、図１に示されるように、（ｉ） ＤＮＡ断片１においてｄｓ部末端が、そしてＤＮＡ断片２においてｓｓ部末端がそれぞれ１個ずつ存在するか、（ｉｉ） ＤＮＡ断片１の５′末端と３′末端の両末端にｄｓ部末端がそれぞれ存在し、そしてＤＮＡ断片２の５′末端と３′末端の両末端にｓｓ部末端がそれぞれ存在するか、あるいは（ｉｉｉ）または（ｉｖ） ＤＮＡ断片１の５′末端もしくは３′末端にｄｓ部末端が存在し、３′末端もしくは５′末端にｓｓ部末端が存在し、そしてＤＮＡ断片２の３′末端もしくは５′末端にｓｓ部末端が存在し、５′末端もしくは３′末端にｄｓ部末端が存在しうる。本発明によれば、以上のＤＮＡ断片１とＤＮＡ断片２とが逆の関係にある場合、さらに１種以上の追加のＤＮＡ断片がそれらの両末端または片末端にｄｓ部および／またはｓｓ部を有する場合の連結も包含される。
【００１６】
好ましいものとしては、上記（ｉｉ）〜（ｉｖ）に記載したような、２種のＤＮＡ断片間の連結を挙げることができる。この場合、ＤＮＡ断片１および／またはＤＮＡ断片２に存在する２つのｄｓ部末端は同一または異なる塩基配列をもつことができ、同様に２つのｓｓ部末端は前記ｄｓ部末端にそれぞれ対応する同一または異なる塩基配列をもつことができる。「それぞれ対応する」とは、連結されるべきｄｓ部末端とｓｓ部末端とが、本発明に従って三本鎖構造を形成できる関係にあることを意味する。すなわち、連結されるべきｄｓ部末端におけるセンス鎖（例えば、図１の二本鎖ＤＮＡ断片の上部の一本鎖ＤＮＡに相当する鎖を本明細書では便宜的に、このように称する。また、もう一方の下部の鎖は、アンチセンス鎖と称する）の塩基配列と、ｓｓ部末端のセンス鎖（上記と同様の意味を表すものとして用いている）の塩基配列が相同性であることを意味する。「相同性」については、上記定義を参照されたい。
【００１７】
本発明に従えば、上記２つのｓｓ部末端は、異なる塩基配列、殊に相互に相補性でないことが好ましい。このような構成を採用すれば、２つのｓｓ部末端間で起こる結合を避けることができ、各ｓｓ部末端はそれらの対応する各ｄｓ部末端と三本鎖構造を形成するために優先して利用されうる。２つのｓｓ部末端は、特に、後述する遺伝子のクローニング等に本発明を適用する場合には、それぞれ同一のＤＮＡ断片の５′および３′末端を構成していることが好ましく、また、ｓｓ部末端は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれに存在してもよいが、同一のＤＮＡ断片における、センス鎖の３′末端もしくは５′末端とアンチセンス鎖の３′もしくは５′末端に、それぞれｓｓ部末端をもつことが好ましい。
【００１８】
上記ｓｓ部末端の塩配列の長さは、限定されるものでないが、少なくとも６ｍｅｒの、好ましくは１３ｍｅｒ以上からなる。６ｍｅｒ未満の場合、本発明に従う連結を達成するのに必要な三本鎖構造が安定性を欠く場合がある。上記長さには、理論上、上限はないが、一般的に５００ｍｅｒ（またはｂａｓｅ）以下、好ましくは１００ｍｅｒ以下である。
【００１９】
本発明の方法に適用されるＤＮＡ断片は、それらの起源を問うことなく、いずれのＤＮＡ断片であってもよい。しかし、例えば、２種の断片を連結させる場合、一方は、適当なコンピテント細胞内に導入でき、そして該細胞内で自律複製できるベクターに由来するものが好ましい。このようなベクターは、その後連結体が導入させるコンピテント細胞によって選ばれるが、該細胞として大腸菌を使用する場合には、市販されている、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系（例えば、ｐＵＣ１８、ｐＳＰ６４、ｐＧＥＭ−３、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）、等のベクターまたはプラスミドを挙げることができる。また、該細胞として酵母を使用する場合には、ＹＥｐ２４、ＹＬｐ５等の、さらにバチルスを使用する場合にはｐＨＹ３００、ＰＬＫ等のベクターまたはプラスミドを挙げることができる。
【００２０】
他方、もう一方のＤＮＡ断片としては、微生物、または動植物のゲノムもしくはミトコンドリア等に由来する断片を、特に企図しているが、合成もしくは半合成ＤＮＡ、すでに遺伝子操作が施されたＤＮＡ等に由来するものであってもよい。
【００２１】
本発明の方法を、例えば、遺伝子のクローニングに使用する場合には、目的とする遺伝子またはその一部を含む断片の両ｄｓ部末端における塩基配列に対応する配列をもつｓｓ部末端が上記ベクターに由来するＤＮＡ断片の両末端にそれぞれ結合された態様のものを、一方のＤＮＡ断片として選ぶ。上記両ｄｓ部末端は、生来の遺伝子が有する塩基配列そのものであってもよいが、例えば、上記ｓｓ部末端の一部または全部に対応する塩基配列を有するように調製されたものであってもよい。このように調製されたものとしては、例えば、２つのｓｓ部末端配列に続けて目的とする遺伝子の５′もしくは３′末端部の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲ産物が挙げられる。
【００２２】
上記のＤＮＡ断片は、本発明の目的に沿い、そして本発明の作用効果を奏するものである限り、それらの鎖長に制限がない。当業者であれば、本明細書の記載全体または後述する実施例を参照すれば、あるいは該実施例に沿って実験を行うことで、上記鎖長の適当な範囲を理解できるであろう。
【００２３】
本発明では、上記のｄｓ部末端とｓｓ部末端を、適当な液体媒質中の相同的組換えタンパク質の存在下で接触させる。かような相同的組換えタンパク質（または普遍的組換えに関与する多機能性タンパク質）としては、その存在下で上記ｄｓ部末端と上記ｓｓ部末端が、該タンパク質を介して安定な複合体を形成しうるものであれば、起源を問うことなく、いかなるタンパク質も使用できる。しかし、かようなタンパク質の具体的なものとしては、大腸菌（Escherichia coli）に由来するＲｅｃＡタンパク質、耐熱性細菌（Thermus thermophilus）、他の腸内細菌において、ＲｅｃＡ遺伝子によりコードされている多機能性タンパク質、また、アグロバクテリウム ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、メチロフィルス メチロトローファス（Methylophilus methylotrophus）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、ウスティラゴ メイディス（Ustilago maydis）等に由来する、それ自体既知のＲｅｃＡ類似タンパク質が挙げられる。その他、酵母（Saccharomyces cerevisiae）やヒトに由来するＲｅｃＡ類似タンパク質も、上記相同的組換えタンパク質に包含される。これらのうち、入手容易性、安定性、機能性の観点から、大腸菌に由来するＲｅｃＡタンパク質またはそれに類似する機能を有するタンパク質（例えば、該タンパク質に由来する改変タンパク質もしくはその断片）を使用することが好ましい。改変タンパク質としては、ＲｅｃＡ遺伝子の部位特異的変異誘発等により作出されたＲｅｃＡ遺伝子産物であって、ＲｅｃＡタンパク質において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＲｅｃＡタンパク質と同様に上記三重鎖ＤＮＡ部分を有する複合体を形成しうる機能を有するものを挙げることができる。数個のアミノ酸が欠失したものには、ＲｅｃＡタンパク質の一本鎖ＤＮＡへの結合ドメインを含むタンパク質もしくはペプチドが包含される。このようなペプチドの例としては、Voloshin et al., Science, Vol. ２７２，１９９６：８６８−８７２に記載されているものを挙げることができる。なお、以上より理解できるように、本発明にいうタンパク質の語は、ペプチドをも包含する概念で使用している。
【００２４】
また、上記接触に際し、ヌクレオシド三リン酸を共存させることが好ましいか、もしくは必要である。このようなヌクレオシド三リン酸としては、アデノシン５′−三リン酸（ＡＴＰ）またはその類縁体、例えばアデノシン（γ−チオ）−三リン酸（ＡＴＰ−γＳ）、あるいはｄＡＴＰ、ＵＴＰ、ｄＵＴＰ、ＣＴＰ、ｄＣＴＰまたはＧＴＰなどを挙げることができる。なお、上記複合体を形成する系において、例えば、ＡＴＰが生物学的な分解を伴うような場合には、ＡＴＰ−γＳを使用するのが好ましい。
【００２５】
上記接触は、適当な液体媒質、例えば、適当な緩衝剤によって緩衝化されていてもよい水溶液中で行う。緩衝剤を使用する場合は、例えばトリス［すなわち、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］と適当な酸（例えば酢酸、塩酸、等）とによりｐＨを６.５〜７.５、好ましくは約７.２に調節したトリス系の緩衝液を使用する。緩衝剤は一般に１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭで使用する。このような液体媒質中に、連結されるべき上記のＤＮＡ断片を溶解し、さらには相同的組換えタンパク質およびヌクレオシド三リン酸を加えて得られる混合液をインキュベートすることにより、上記接触が行われる。
【００２６】
連結されるべきＤＮＡ断片は、それぞれの末端が適正に連結するのに悪影響が生じない範囲であれば、それらの使用割合はいずれであってもよい。しかし、本発明の方法が特定の遺伝子のクローニングに使用される場合には、遺伝子の全部またはその一部を含む断片に対し、連結すべきもう一方の断片をほぼ等モルで使用するのが好ましい。また、相同的組換えタンパク質の使用割合は、ｓｓ部の鎖長に依存して変動するので限定できないが、一般的にｓｓ部を構成するヌクレオチド数を上回るモル量で、好ましくはヌクレオチド３個に対してほぼ１モル量とするのがよい。
【００２７】
さらに、上記のように調製される混合液は、４〜５４℃、好ましくは約３７℃において１５分以上、一般的に約３０分間インキュベートすることにより、本発明にいう「接触」を完了することができ、その結果、三本鎖構造部分を少なくとも１箇所有するＤＮＡ断片の連結体（またはＤＮＡ構成体）が形成される。
【００２８】
こうして形成されるＤＮＡ構成体は、通常、少なくとも三本鎖構造部分に相同的組換えタンパク質が結合した複合体の形態で存在する。このような複合体は、適当な精製法、例えば、フェノール・クロロホルム抽出、ゲル濾過法、各種電気泳動法等により反応混合液から分離することができる。こうして分離された複合体は、生体外の通常の生理学的な条件下で安定であり、複合体を構成するＤＮＡ配列または遺伝子の解析に利用できる。
【００２９】
また、上記複合体は、その形成された反応混合液から分離することなく（もしくは場合によって分離して）、プロティナーゼ（例えば、プロティナーゼＫ）で処理することにより、相同的組換えタンパク質を複合体から除去することができる。こうして、除タンパク質処理されたＤＮＡ構成体も、安定である。特に、２種のＤＮＡ断片の連結により形成され、２箇所に三本鎖構造を有するものは、特に安定であり、しかも、常法によりコンピテント細胞へ効率よく導入できる。なお、導入に先立って、一本鎖核酸に特異的に作用するエンドヌクレアーゼにより三本鎖構造部分（図１参照）を、二本鎖構造に変換したＤＮＡ構成体とすると、さらにコンピテント細胞への導入効率を高めることができる。
【００３０】
この導入は、ＤＮＡ断片の一方に使用するベクター由来の断片の出発原料（ベクター）の種類により、適当に選ぶことができるが、例えば、コンピテント細胞として大腸菌を選び、そしてベクターまたはプラスミドとして大腸菌で自律複製できるベクターを選ぶ場合には、エレクトロポレーション法、カルシウム処理法などにより実施できる。こうして上記ＤＮＡ構成体が導入された細胞を培養すれば、上記三本鎖構造部分（存在する場合には）が二本鎖構造部分（この構造部分は、上記ｄｓ部末端からｓｓ部末端に相当するヌクレオチド配列が除去された状態で、ｄｓ部末端とｓｓ部末端がリン酸ジェステル結合を介して共有結合しているものと推定される）に変換した環状ＤＮＡ構成体を増幅することができる。
【００３１】
上記のコンピテント細胞への遺伝子導入の常法に従えば、環状ＤＮＡ構成体が直鎖状ＤＮＡ構成体に比し、著しく高い効率でコンピテント細胞に導入されうる。したがって、例えば、２種のｓｓ部末端の塩基配列に対応する配列を有し、それに続けてクローニングすべき遺伝子の５′もしくは３′末端部の塩基配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、該遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行って得られるＰＣＲ産物をｄｓ部末端を有するＤＮＡ断片として本発明の方法を適用すると、ＰＣＲにより適正な伸長が行われていない副産物は上記環状ＤＮＡ構成体を形成しないため、コンピテント細胞に導入されない。こうして、本発明の方法によれば、クローニングすべき遺伝子が、ＰＣＲ法により適正に増幅されたＰＣＲ産物のみを取得することができる。
【００３２】
また、上述の環状ＤＮＡ構成体は、適当なコンピテント細胞内で自律複製できるので、それら自体またはその複製体を用いて、その中に含まれるＤＮＡ配列または遺伝子の構造ないしは機能の解析にも利用できる。したがって、本発明の別の態様として、環状ＤＮＡ構成体であって、一本鎖部（ｓｓ部）末端と一方の鎖が前記ｓｓ部の塩基配列に対して相同性の配列を含む二本鎖部（ｄｓ部）末端とからなる三本鎖構造部分を少なくとも一箇所有するＤＮＡ構成体が提供される。かようなＤＮＡ構成体としては、上述の２つのＤＮＡ断片から構成されており、その１つの断片がコンピテント細胞内で自律複製できる塩基配列を有し、もう１つの断片がクローニングすべき遺伝子の全部または一部を含むものであって、かつ三本鎖構造部分を２箇所有するものが好ましい。「遺伝子の一部」は、その遺伝子を他の遺伝子と識別できる塩基配列をもっている限り、そのサイズを問わない。また、遺伝子は２種以上の遺伝子が含まれていてもよい。
【００３３】
本発明の方法は、上述のように遺伝子のクローニングに適用できる。また、かようなクローニングは、さらに別の態様として提供する、下記の遺伝子のクローニング用のキットにより都合よく実施できるであろう。このようなキットは、少なくとも
（Ａ） 一本鎖部（ｓｓ部）を両末端に有する二本鎖ＤＮＡ断片であって、これらのｓｓ部における塩基配列が非相補性であり、かつ二本鎖部にコンピテント細胞内で自律複製できる機能を提供しうるＤＮＡ配列が存在するＤＮＡ断片、と
（Ｂ） 上記各ｓｓ部における塩基配列に相同性の配列をそれぞれ５′末端の一部として有し、それぞれさらにクローニングすべき遺伝子の片末端の配列の一部ともう一方の片末端の配列の一部を連続した配列として有する２種のオリゴヌクレオチドのプライマーとの組み合わせ物を含んでなる遺伝子のクローニング用キットである。
【００３４】
上記のｓｓ部における塩基配列の長さおよび二本鎖部（すなわち、コンピテント細胞内で自律複製できるベクターまたはプラスミドに由来）は、既に記述したとおりである。また、クローニングすべき遺伝子の片末端の配列の一部ともう一方の片末端の配列の一部は、該遺伝子を鋳型とし、そしてそれぞれ上記ｓｓ部と一緒になって、ＰＣＲのプライマーとして機能する長さの配列である。
【００３５】
本発明のキットの一使用態様によれば、（Ａ）のＤＮＡ断片と、（Ｂ）のプライマーを用いて増幅されたＰＣＲ産物（ｄｓ部末端を有するＤＮＡ断片に相当する）とにより連結が行われる。上述したように、連結は、相同的組換えタンパク質、ヌクレオシド三リン酸の存在下、適当に緩衝化された水溶液中で行われる。したがって、上記ＤＮＡ試料の他に、上記タンパク質、ヌクレオシド三リン酸、緩衝剤を本発明のキットに含めてもよい。さらには、連結して得られたＤＮＡ構成体に結合した上記タンパク質を除去するためのプロティナーゼを含めてもよい。
【００３６】
以上のような本発明の連結法は、以下のような特徴を有する。
【００３７】
（ｉ） 連結すべきＤＮＡ断片に適当な制限酵素認識部位が存在していなくても、連結が可能である。
【００３８】
（ii） 連結酵素を使用しないので、ベクターＤＮＡの自己連結反応が起こらず、遺伝子のクローニングにおいて望ましくない副産物の混入を避けることができる。
【００３９】
（iii） 連結部位は、その後導入されるコンピテント細胞内で修復されるので、必ずしもライゲーションを行う必要がない。
【００４０】
（iv） 限定されるものでないが、例えば、ＰＣＲ産物のクローニングに適用する場合には、ＰＣＲ副産物はコンピテント細胞内に導入されないので、バックグラウンドが低くなる。
【００４１】
（ｖ） 相同的組換えタンパク質（例えば、ＲｅｃＡタンパク質）を使用するために、連結に塩基特異性および方向特異性をもたらすことが可能である。
【００４２】
（vi） 形質転換は従来法より同程度以上の効率で行うことができる。
【００４３】
（vii） 上述の C. Aslanidis らの方法のように、特別なベクターを使用する必要がないので、汎用性が高い。
【００４４】
したがって、本発明は、遺伝子操作を伴う技術分野において、極めて有用である。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。
【００４６】
実施例１： ＲｅｃＡタンパク質を用いるＤＮＡ断片のクローニング（モデル実験系）
ベクターＤＮＡとして、直鎖状ベクターＤＮＡの両末端が、１３ｍｅｒ（配列Ａ）と１４ｍｅｒ（配列Ｂ）の３′突出末端を持つものを用意した。配列Ａを５′末端にもち、それに続いて、ヒトのｐ５３ｇｅｎｅのエクソン１１の片末端配列をもつオリゴヌクレオチド１と、配列Ｂを５′末端にもち、それに続いて、もう一方の末端配列をもつオリゴヌクレオチド２を用いて、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行い、取得した増幅産物をインサートＤＮＡ断片として用意した。上記、ベクターＤＮＡ断片と、インサートＤＮＡ断片との間でＲｅｃＡ組み換え中間体形成（三本鎖構造部形成）反応を行った。この反応には、２つの反応液ＡとＢ（それぞれ２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、２００ｎｇインサートＤＮＡ断片、６.０μｇのＲｅｃＡタンパク、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれている。反応液Ｂには、１μｇのベクターＤＮＡ断片、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれている。反応液ＡとＢを、それぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１５分間インキュベートした後、６０μｌのＴＥ緩衝液１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０μｌの蒸留水に溶かした。これらの適量を、エレクトロポレーションの常法により大腸菌株ＤＨ１０Ｂに形質転換した。アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌを含む寒天培地で１晩培養し、生じてきたインサートを含む白いコロニーから、プラスミドを調製し、それに含まれるインサートＤＮＡを調べた。制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位が、インサートＤＮＡのほぼ中央とベクターＤＮＡのインサートを組込み部位の近傍にあることを確認した。次いで、ＢａｍＨＩを使ってインサートＤＮＡを切り出すと同時に、インサートＤＮＡが目的とするものであるかどうかを確認するためにアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ断片の泳動パターンの解析を行った。結果を図２に示す。この図のレーン１からレーン５は、培養の結果生じた白色コロニーから調製したプラスミドに由来するものを示し、そしてレーン６からレーン７は、培養によって出てきた青色コロニーから調製したプラスミドに由来するものである。レーン８は、用いたベクターＤＮＡに由来する。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ IIIで切断したものである。
【００４７】
図から、約６００ｂｐのところに切り出されたインサートＤＮＡのバンドがみられ、ベクターＤＮＡにもインサートＤＮＡの一部が方向性をもって連結されたことがわかる。また、インサートを含まない青色コロニーのプラスミドは、インサートを含まないことがわかる。
オリゴヌクレオチド１（配列番号：１）
5′-gacgacgacaaga c acctgaagtc caaaaagggt cagtc-3′
オリゴヌクレオチド２（配列番号：２）
5′-gaggagaagcccgg tggcag caaagtttta ttgtaaaata-3′
（上記配列において、それぞれ１４番目のＣ以降および１５番目のｔ以降がヒトゲノムＤＮＡの配列に相当する。）
実施例２：連結されたＤＮＡの確認
図３のレーン１は、実施例１で大腸菌に形質転換する前のＤＮＡ混合物を、１.０％アガロースゲル電気泳動したものである。レーン２は、実施例１に記載したインサートＤＮＡが、配列Ａはもつが、配列Ｂを片側末端に含まないものを使って反応を行ったＤＮＡ混合物であって、大腸菌に形質転換する前のＤＮＡ混合物を同様に電気泳動したものである。レーン３は、実施例１に記載したインサートＤＮＡが、配列Ｂはもつが、配列Ａを片側末端に含まないものを使って反応を行ったＤＮＡ混合物であって、大腸菌に形質転換する前のＤＮＡ混合物を同様に電気泳動したものである。レーン４は、実施例１に記載したインサートＤＮＡが、配列Ａと配列Ｂともそれぞれの末端に含まないもの（それぞれ、オリゴヌクレオチド３および４）を使って反応を行ったＤＮＡ混合物であって、大腸菌に形質転換する前のＤＮＡ混合物を同様に電気泳動したものである。レーン５は、レーン１で用いたインサートＤＮＡのみを電気泳動した結果である。レーン６は、レーン２で用いたインサートＤＮＡのみを電気泳動した結果である。レーン７は、レーン３で用いたインサートＤＮＡのみを電気泳動した結果である。レーン８は、レーン４で用いたインサートＤＮＡのみを電気泳動した結果である。レーン９は、用いたベクターＤＮＡである。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断したものである。
【００４８】
図より、ＲｅｃＡの反応により、配列特異的にＤＮＡ断片が連結されることがわかる。
オリゴヌクレオチド３（配列番号：３）
5′-c acctgaagtc caaaaagggt cagtc-3′
オリゴヌクレオチド４（配列番号：４）
5′-tggcag caaagtttta ttgtaaaata-3′
実施例３：連結反応の酵素依存性
図４のレーン１は、実施例１で大腸菌に形質転換する前のＤＮＡ混合物を、１.０％アガロースゲル電気泳動したものである。レーン２は、ＡＴＰ−γＳを加えないでレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、ＲｅｃＡを加えないでレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断したものである。
【００４９】
図より、目的ＤＮＡ断片の連結には、ＲｅｃＡによる酵素反応が必要不可欠である。
【００５０】
実施例４：連結したＤＮＡの、安定性を調べる実験
三本鎖構造の形成を介して連結したＤＮＡの安定性を調べた。必要に応じて、連結したＤＮＡを大腸菌に形質転換する前に、各種ＤＮＡ修飾酵素で処理することが可能であるかどうか調べた。ここで調べたのは修飾酵素の１つである、耐熱性ＤＮＡライゲース（アンプリガーゼ）について調べた。その具体的な反応は、実施例１で記載した反応で、反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした後、その反応液に等量のライゲーション反応混合溶液を混ぜ、５５℃で１時間インキュベートした。ラーゲーション反応液の組成は、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１.０ｍＭ ＮＡＤ、０.０２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ８.３、４０ｕｎｉｔｓアンプリガーゼ（Ampligase）である。次に、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートした後、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０μｌの蒸留水に溶かした。その適量について１.０％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後に、エチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を取りＤＮＡを観察した。図５のレーン１が、その結果を示す。レーン２は、アンプリガーゼを加えないでレーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン３は、ラーゲション反応を上記反応液の代わりに、蒸留水を用いたことと、ライゲーションのインキュベーションを行わないで、レーン１と同じ反応を行った結果を示す。レーン４は、インサートＤＮＡを示す。レーン５は、ベクターＤＮＡを示す。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断したものである。
【００５１】
図より、連結されたＤＮＡサンプルを、アンプリガーゼ反応緩衝液中で、５５℃で１時間インキュベートしても、電気泳動ゲルでのバンドパターンには大きな変化は見られなかった。レーン２およびレーン３の結果から、本発明によってできるＤＮＡ複合体は、非常に安定であることがわかる。このことから、必要ならば、ＲｅｃＡタンパクの存在下で、ＤＮＡリガーゼによるライゲーションを行うことが可能である。これは、インサートＤＮＡを共有結合でベクターＤＮＡに組み込むことが可能になり、また、ＤＮＡに入っていつニックを修復することも可能である。また、他の耐熱性ＤＮＡ修復酵素を用いてあらゆる連結ＤＮＡ複合体の修飾も可能である。
【００５２】
実施例５：三本鎖構造形成反応における、各反応成分の依存性
ターゲットＤＮＡとしてＭ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで直鎖状にしたものと、そのターゲットＤＮＡの末端部位の配列を持つ６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド５を用意した。このオリゴヌクレオチドは、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで５′末端を標識した。ターゲットＤＮＡとオリゴヌクレオチド３との間の三本鎖構造形成反応には、２つの反応液Ａ（２０μｌ）と反応液Ｂ（２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、１ｐｍｏｌの標識オリゴヌクレオチド５、６.０μｇのＲｅｃＡタンパク、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液Ｂには、２００ｎｇのターゲットＤＮＡ、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。この時点での三本鎖構造形成反応を終えた反応液４０μｌに、０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１０分間インキュベートすることにより、除ＲｅｃＡ処理を行った。その半分量については１％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後にエチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録した。結果を図６（Ｂ）に示す。その後、ゲルをろ紙の上に載せてゲル乾燥器で乾燥させた。シグナルの検出は、乾燥させたゲルのオートラジオグラムをとり、Ｘ線フィルム上に記録した。その結果を図６（Ａ）のレーン１に示す。比較実験として、次のことを行った。レーンＭは、ＤＮＡサイズマーカーで、図面の左端にそのサイズを示す。このサイズマーカーは、λＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断し、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで５′末端標識したものである。レーン２は、ＲｅｃＡを加えないで反応を行った以外は、レーン１と同じである。レーン３は、ＡＴＰ−γＳを加えないで反応を行った以外は、レーン１と同じである。レーン４は、逆相補オリゴヌクレオチド６を用いて反応を行った以外はレーン１と同じである。レーン５は、オリゴヌクレオチドを加えないで反応を行った以外はレーン１と同じである。レーン６は、オリゴヌクレオチド７を用いて反応を行った以外はレーン１と同じである。レーン７は、ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａｌで切断したターゲットＤＮＡに対するオリゴヌクレオチド７を用いて、反応を行ったサンプル。レーン７は、ターゲットＤＮＡとして、ｐＢＲ３２２ ＤＮＡを制限酵素Ｓｃａｌで切断したものを用いたことと、その末端部位の配列をもつ標識オリゴヌクレオチド７を用いたこと以外は、レーン１と同じ反応を行ったものである。
【００５３】
図より、（Ａ）のレーン１に示すように、三本鎖構造形成には、全ての反応成分が反応に加えられる必要があることがわかる。また、逆相補オリゴヌクレオチドと逆相同オリゴヌクレオチドでは、三本鎖構造形成体は得られないことから、オリゴヌクレオチドの方向性は一方のみである。
オリゴヌクレオチド５（配列番号：５）
5′-agaggctttg aggactaaag actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac- 3′
オリゴヌクレオチド６（配列番号：６）
5′-gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct caaagcctct- 3′
オリゴヌクレオチド７（配列番号：７）
5′-cact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagt-3′
実施例６：三本鎖構造形成反応における、用いるオリゴヌクレオチドの配列方向性
図７（Ａ）のレーン１は、図１３（Ａ）のレーン１と同じ反応を行ったものである。レーン２は、逆相補な配列をもつ標識オリゴヌクレオチド４を用いた以外は、レーン１と同じ反応を行ったものである。レーン３は、標識オリゴヌクレオチド８を用いた以外は、レーン１と同じ反応を行ったものである。レーン４は、標識オリゴヌクレオチド９を用いた以外は、レーン１と同じ反応を行ったものである。（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
【００５４】
図より、直鎖状ターゲットＤＮＡの両末端部位で三本鎖形成が可能であり、そのとき用いるオリゴヌクレオチドは、ターゲットの両末端配列の一方の方向を持った相同配列でなければならない。
オリゴヌクレオチド８（配列番号：８）
5′-tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta gtggcattac-3′
オリゴヌクレオチド９（配列番号：９）
5′-gtaatgccac tacgaaggca ccaacctaaa acgaaagagg cgaaagaata cactaaaaca-3′
実施例７：三本鎖構造形成反応における、オリゴヌクレオチド配列の熱安定性図８（Ａ）のレーン１と同じ反応を行ったサンプル１０μｌに２０ｍＭ ＮａＣｌを加えて、熱処理（３７℃、１０分）を行ったサンプル。レーン２は、熱処理（４５℃、１０分）のサンプル。レーン３は、熱処理（５５℃、１０分）のサンプル。レーン４は、熱処理（６５℃、１０分）のサンプル。レーン５は、熱処理（７５℃、１０分）のサンプル。レーン６は、熱処理（８５℃、１０分）のサンプル。（Ｂ）は（Ａ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。（Ｃ）は、（Ａ）と同じ実験を、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦ ＤＮＡを制限酵素ＳｎａＢＩで切断したターゲットＤＮＡの末端領域の配列を持つ、４０−ｍｅｒの長さのオリゴヌクレオチド１０を用いて行った。（Ｄ）は（Ｃ）と同じアガロースゲルの、ＤＮＡ全染色写真。
オリゴヌクレオチド１０（配列番号：１０）
5′-actttttcat gaggaagttt ccattaaacg ggtaaaatac-3′
図より、６０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド５を用いた三本鎖の熱安定性は、８５℃付近がほぼ限界で、４０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを用いた場合には、７５℃付近がほぼ限界であることがわかる。オリゴの長さが６０−ｍｅｒ以上であると、三本鎖の熱安定性は、極めて高いことがわかる。
【００５５】
実施例８：ＲｅｃＡ反応による、長鎖ｃＤＮＡ断片のクローニング
ベクターＤＮＡとして、プラスミド pBluescript （ＳＫ＋）を制限酵素 Notlと Sall で切断したものを、さらに、キロシークエンス用ディリーションキット（タカラ酒造社）を用いて、両端を５′突出末端化した。その方法は、制限酵素 Notl と Sall で５′突出末端化したベクターＤＮＡ３００ｎｇを含むエキソヌクレアーゼ反応液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８.０、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１８０ｕｎｉｔ Exonuclease lll）１００μｌを、３７℃で１分間反応させた。フェノール・クロロフォルム抽出−エタノール沈殿を行い、酵素の失活とＤＮＡの濃縮を行った。また、インサートＤＮＡとして、７ｋｂの長さをもつラットｃＤＮＡ断片（Ohara, O. et al., Brain Res. Mol. Brain Brain Res. 57(2) 181-192(1998)参照；GenBank の accession no.AB008551）を用いた。このｃＤＮＡ断片の両末端には、それぞれ５４ｂｐと５５ｂｐの長さの、ベクターＤＮＡの末端領域とオーバラップした配列を持っている。上記、ベクターＤＮＡと、インサートＤＮＡとの間でＲｅｃＡ組み換え中間体形成（三本鎖構造形成）反応を行った。三本鎖構造形成反応は、２つの反応液ＡとＢ（それぞれ２０μｌ）を準備した。反応液Ａには、２００ｎｇインサートＤＮＡ、６.０μｇのＲｅｃＡタンパク、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳ、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液Ｂには、１μｇのターゲットＤＮＡ、０.４８ｍＭ ＡＴＰ−γＳを、３０ｍＭ酢酸トリス（ｐＨ７.２）、２.１５ｍＭ酢酸マグネシウムが含まれる。反応液ＡとＢをそれぞれ３７℃で１５分間インキュベートした後、２つを混ぜ合わせて、さらに３７℃で３０分間インキュベートした。０.５％（Ｗ／Ｖｏｌ）ＳＤＳ、０.７ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫを加え、３７℃で１５分間インキュベートした後、６０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０μｌの蒸留水に溶かした。その適量を、１.０％アガロースゲル電気泳動した結果を、図９のレーン１に示す。レーンＭは、ｋｂＤＮＡ lader maker を示す。レーン２は、エキソヌクレアーゼ反応を２分間行ったこと以外はレーン１と同じ反応を行った結果を示す。
【００５６】
図より、Ｅｘｏ−処理ベクターとインサートに対するＲｅｃＡ反応で複合体形成がみられる。ｅｘｏ−処理は１分でも２分でも問題ない。本鎖化された領域の長さは直接は測定していないが、１分当たり１００−２００塩基程度だろうと推定される。
【００５７】
実施例９：連結したＤＮＡの修復反応。
【００５８】
実施例１で記載した反応で、電気泳動する前のサンプルを、Ｔ４ ＤＮＡ Polymerase 反応液と、クレノウ反応液に混ぜ、３７℃で１５分間反応させた。Ｔ４ ＤＮＡ Ｐolymerase 反応液には、０.２５ｍＭ ４ｄＮＴＰｓ、３３ｍＭ Ｔｒｉｓ-acetate、ｐＨ７、６６ｍＭ ＣＨ３Ｃ Ｋ、１０ｍＭ（ＣＨ３Ｃｏｏ）２Ｍｇ、０.５ｍＭ ＤＴＴ、０.０１％ ＢＳＡ、４ｕｎｉｔ Ｔ４ ＤＮＡ Polymerase を含む。反応後に、２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０μｌの蒸留水に溶かした。その適量について１.０％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後に、エチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を取りＤＮＡを観察した。図１０のレーン１は、反応を行う前のＤＮＡを示す。レーン２は、Ｔ４ ＤＮＡ Polymerase で反応させた結果を示す。レーンＭは、ｋｂＤＮＡ lader maker を示す。
【００５９】
図より、Ｔ４ ｐｏｌ.処理で６ｋｂ付近の同定のバンドは消失するが、１０ｋｂ付近のベクター／インサート複合体らしきバンドはなくならない。
【００６０】
実施例１０：連結されたＤＮＡの確認
結果を図１１に示す。レーンＭは、ｋｂＤＮＡ lader maker を示す。図１０のレーン１と同じサンプルを、大腸菌株ＤＨ１０Ｂに形質転換した。アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌを含む寒天培地で１晩培養し、プレート上の５００クローンからプラスミドを回収して、アガロースゲル電気泳動した。その結果をレーン１に示す。レーン２は、図１０のレーン２と同じサンプルについてレーン１と同じ処理を行った結果を示す。レーン３は、図１０のレーン３と同じサンプルについてレーン１と同じ処理を行った結果を示す。
【００６１】
図より、Ｔ４ ｐｏｌ．処理を行っても、ＤＮＡ断片はクローニングされている。
【００６２】
実施例１１：
ＤＮＡ連結複合体のエンドヌクレアーゼ処理の効果
連結したＤＮＡ（部分的に三本鎖構造を有する）を大腸菌に形質転換する前に、各種エンドヌクレアーゼ処理を行い、その後の形質転換効率の変動を調べた。実施例１で示した方法により、三本鎖構造の形成によって連結させたＤＮＡ複合体を、実験１：Cleavase(R)VII（Third Wave Technologies, inc.）反応（反応液組成未公表に混ぜ、全量２０μｌとし、５４度６０分インキュベーション）実験２：マングビーンヌクレアーゼ反応（３０ units Mung Bean Nuclease（宝酒造社）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ（ＣＨ3ＣＯＯ）2Ｚｎ、５％グリセロールを含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量２０μｌとし、３７度３０分インキュベーション、実験３：Ｓ１ヌクレアーゼ反応（１０ units Ｓ１ Nuclease（宝酒造社）、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.６）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＺｎＳＯ4、を含むＳ１ヌクレアーゼ反応液に混ぜ、全量２０μｌとし、３７度で１０分間インキュベーション）、実験４：ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ反応（１０ units ＢＡＬ３１ Nuclease（宝酒造社）、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、６００ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ ＣａＣｌ2、１２ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、を含むＢＡＬ３１ Nuclease 反応液に混ぜ、全量２０μｌとし、２０℃で３０分間インキュベーション）、実験５：処理なし。ＤＮＡ連結複合体を、以上の各種酵素で反応後に、８０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、１００μｌとした。フェノール・クロロフォルム抽出を１回、クロロフォルム抽出を１回行った後、エタノール沈殿法を行い、含まれるＤＮＡ分子を濃縮分離した。ＤＮＡ沈殿を１０μｌの蒸留水に溶かした。その適量を、大腸菌株ＤＨ１０Ｂに形質転換した。アンピシリン、ＩＰＴＧ、Ｘ−Ｇａｌを含む寒天倍地で１晩培養し、出てきたインサートを含む白いコロニー数を数えた。
【００６３】
その結果を、下記表１に示す。
【００６４】
【表１】
【００６５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、ＤＮＡ断片のクローニング法の反応模式図を示す。
【図２】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、ＤＮＡ断片のクローニングを行った実施例１のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図３】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、連結されたＤＮＡの確認を行った実施例２のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】ｒｅｃＡ三本鎖形成によって連結されたＤＮＡ断片の連結反応の酵素依存性について調べた実施例３のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図５】ｒｅｃＡ三本鎖形成によって連結された連結したＤＮＡの、熱安定性を調べた実施例４のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図６】オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ末端型三本鎖形成反応における、各反応成分の依存性を調べた実施例５のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図７】オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ末端型三本鎖形成反応における、オリゴヌクレオチドの配列方向性を調べた実施例６のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図８】ＤＮＡ末端型三本鎖形成反応における、オリゴヌクレオチド配列の熱安定性を調べた実施例７のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図９】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、長鎖ｃＤＮＡ断片のクローニングを行った実施例８のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１０】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、連結長鎖ｃＤＮＡ複合体の修飾酵素を用いた修復反応による効果について調べた実施例９のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１１】ｒｅｃＡ三本鎖形成反応による、連結された長鎖ｃＤＮＡ断片の確認を行った実施例１０のゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。
Claims (2)
- （ａ）（ｉ）ｓｓ部末端を両端に有する二本鎖ＤＮＡ断片と、（ｉｉ）一方の鎖に（ｉ）のｓｓ部の塩基配列に対して、それぞれ相同性の配列を含むｄｓ部末端を両端に有する二本鎖ＤＮＡ断片とを、または
（ｂ）（ｉ）ｓｓ部末端およびｄｓ部末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片と、（ｉｉ）一方の鎖に（ｉ）のｓｓ部の塩基配列に対して相同性の配列を含むｄｓ部末端および（ｉ）のｄｓ部の一方の鎖の塩基配列に対して相同性の配列を含むｓｓ部末端を有する二本鎖ＤＮＡ断片とを、
ＲｅｃＡタンパク質の存在下で接触させて、（ａ）または（ｂ）の（ｉ）と（ｉｉ）におけるｓｓ部末端とｄｓ部末端とを連結することにより二箇所に三本鎖構造を有する環状のＤＮＡ複合体を形成する工程、ならびに
前記工程で形成された環状のＤＮＡ複合体をコンピテント細胞内に導入し、こうして得られた形質転換体を培養して三本鎖構造部分が二本鎖構造に変換した環状ＤＮＡを形成する工程
を含むことを特徴とする二本鎖ＤＮＡのｓｓ部末端とｄｓ部末端との連結方法。 - 形成される二箇所に三本鎖構造を有する環状のＤＮＡ複合体を、予めエンドヌクレアーゼで処理することにより三本鎖構造部分を二本鎖構造に変換した後、さらにコンピテント細胞に導入し、こうして得られた形質転換体を培養して、環状ＤＮＡを増幅する請求項１に記載の連結方法。
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