JP4490104B2 - 脱髄性疾患における腫瘍壊死因子とインターフェロンの組み合わせ - Google Patents

Description

発明の属する技術分野
本発明は神経疾患の分野におけるものである。本発明は脱髄性疾患の（ＴＮＦ）活性を有する、刺激する、又は維持する物質とインターフェロンの組み合わせの利用に関する。特に、本発明は多発性硬化症（ＭＳ）などの脱髄性疾患の治療及び／又は予防のためのＴＮＦ−アルファとＩＦＮ−ベータの組み合わせの利用に関する。本発明はさらに、脱髄性疾患、特に多発性硬化症（ＭＳ）、の治療及び／又は予防のための医薬の製造における、腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＢＰ）とインターフェロン（ＩＦＮ）の組み合わせの利用に関する。
発明の背景
脱髄性疾患は、神経系のミエリン鞘に関する疾患である。多くの神経線維を被覆するミエリン鞘は、生命の初期に形成されるリポタンパク質から構成される。ミエリンはＣＮＳにおけるオリゴデンドログリアによって形成され、軸索に沿った神経インパルスの伝送を促進する。

多くの先天性代謝疾患（例えば、フェニルケトン尿症やその他のアミノ酸尿症；テイサックス病、ニーマンピック病、及びゴーシェ病；フルラー症候群；クラッベ病及びその他の白質萎縮症）は、発生しつつある、主にＣＮＳにおけるミエリン鞘に影響を及ぼす。生化学的な欠陥が矯正又は補償できない場合、恒久的な、しばしば広範囲にわたる、神経的な欠損が生ずる。

生命のその後の時期における脱髄は、多くの神経疾患の特徴である；それは、局所的な傷害、虚血、有毒物質、又は代謝障害による神経又はミエリンの損傷によって生ずる。広範なミエリン損失に続いて、通常、軸索の萎縮、及び多くの場合細胞本体の萎縮が生じ、どちらも不可逆的なものになることがある。しかし、多くの場合に、ミエリンの再生が起こり、神経機能の修理、再生、及び完全な回復が速やかに見られる。回復は、しばしば、多くの末梢神経病理を特徴づける筋性脱髄の後に見られる；このプロセスによって、多発性硬化症（ＭＳ）の悪化と寛解が説明できるかもしれない。中枢脱髄（すなわち、脊髄、脳、又は視神経の脱髄）は、病因が分かっていない一次（primary）脱髄性疾患の主要な所見である。最も良く知られている脱髄性疾患はＭＳ（以下を見よ）である。

その他の脱髄性疾患としては次のようなものがあげられる：
急性播種性脳脊髄炎、これは血管周囲のＣＮＳ脱髄によって特徴づけられ、自然発生することもあるが、通常はウイルス感染又はウイルス・ワクチン接種の後で起こる；
急性炎症性末梢ニューロパシー、これはウイルス・ワクチン接種又はギラン−バレー症候群に続いて起こり、末梢構造にだけに影響を及ぼす；
副腎脳白質ジストロフィー及び副腎ミエロニューロパシー、これは副腎の機能失調と神経系の脱髄によって特徴づけられる稀なＸ−連鎖性劣性代謝疾患である；
遺伝的なレーベル視神経萎縮症と関連ミトコンドリア疾患、主として中心視覚の対称的な低下によって特徴づけられ、ＭＳにおける視神経炎に似ている；及び
ＨＴＬＶ関連ミエロパシー、ヒトＴ−細胞リンパ向行ウイルスによる感染に関連したゆっくりと進行する脊髄疾患、両足の痙性筋力低下によって特徴づけられる。

多発性硬化症（ＭＳ）とは、脳と脊髄における播種性パッチの形での脱髄を特徴とするゆっくりと進行するＣＮＳ疾患であり、多数の多様な神経症状と徴候を生じ、それが寛解したり悪化したりする（Merck Manual Home Edition, www.merck.com を見よ）。

原因は分かっていないが、免疫異常が疑われている。しかし、現在、特定のメカニズムを示す手がかりはほとんどない。原因についての仮説としては、遅発性の潜伏ウイルスによる感染、及び酵素によるミエリンの溶解、などがある。ＣＳＦでは、通常、ＩｇＧレベルが高くなっており、高い濃度（titers）は、麻疹ウイルスを含むいろいろなウイルスと結びつけられてきた。これらの所見、及び報告されているＨＬＡアロタイプ及びＴ細胞の数の変化との関連の意味ははっきりしておらず、証拠は多少矛盾している。家族での発生が多いことは遺伝的な発病し易さを示唆している；男性よりも女性の方が少し発病し易い。環境的要因が存在しているように思われる。発病年齢は一般に２０歳から４０歳までであるが、ＭＳは患者の最初の１５年が過ごされた地理的区域と結びつけられている。１５歳以後の移住はリスクを変化させない。

オリゴデンドログリアが破壊され血管周囲に炎症が生じた脱髄のプラーク又は島は、ＣＮＳ中に、主に白質に、特に側方及び後方のカラム（column）（特に頸部及び背部領域）、視神経、及び心室周囲（perventricular）区域に、散在する。中脳の神経路（tracts），橋、及び小脳にも脱髄が生じ、脳と脊髄の灰白質にも生ずることがある。

細胞の本体（body）及び軸索は、通常、特に初期の病巣では、保存される。後には、軸索も破壊され、特に長い神経路の軸索は破壊され、繊維状のグリオーシスが神経路に「硬化している」外観を与える。初期の病巣と後期の病巣が同時に見られるコトモアル。プラークの内部及び周囲でミエリンの脂質とタンパク質構成成分の変化が示されている。

この疾患は、寛解と再発悪化を含むＣＮＳ機能障害のいろいろな症状と徴候によって特徴づけられる。もっともよく見られる症状は、四肢の１つ以上、胴部、及び顔の片側における錯感覚；足又は手の筋力低下とぎごちなさ；又は視覚の乱れ、例えば、片目の部分的失明と痛み（球後視神経炎）、視野の暗さ、又は暗点；などである。初期によく見られるその他の症状は、二重視（複視）を生ずる軽い眼球麻痺、１つ以上の四肢の一時的な筋力低下、手足のわずかなこわばり又は異常な疲れ易さ、軽い歩行障害、膀胱コントロールの困難、めまい、及び軽い情緒障害、などである；いずれも散在するＣＮＳの関与を示し、しばしばこの疾患がそれと認識されるよりも何ヶ月又は何年も前に起こる。

経過はきわめて多様であり、予測不可能で、多くの患者で、寛解する。最も苛酷な症例以外では、寿命はこれによって縮まることはないであろう。最初は、特にこの病気が球後視神経炎で始まる場合は、数ヶ月又は数年の寛解が、エピソード的な発病の間に挟まる。寛解は１０年以上も続くことがある。しかし、一部の患者は、頻繁に発作が起こり、急速に廃疾状態になる；少数の、特に中年で発病した男性患者の場合、経過は急速に進行することがある。熱病又は環境によって高熱にさらされると、症状が悪化することがある。

診断は間接的なものであり、臨床的な特徴と検査の特徴からの推論による。最も感度が高い診断画像技術であるＭＲＩはプラークを示すことがある。ガドリニウムによるコントラストの増強によって、アクティブな炎症の区域を古い脳プラークから区別することができる。ＭＳ病巣は、また、ヨウ素の量を２倍にしてスキャンを遅らせることによって感度を高めるコントラスト増強ＣＴスキャン（ダブルドーズ・ディレイドＣＴスキャン）によっても見ることができる。

多数の患者において、ＣＳＦは異常である。ＩｇＧは１３％を超えることがあり、リンパ球とタンパク質含有量はわずかに増加する。血液−脳関門におけるＩｇＧ合成を示すオリゴクローナル・バンドが、ＭＳの患者の９０％までにおいて、ＣＳＦのアガロース電気泳動で検出されるが、このバンドが検出されない場合でもＭＳの可能性を排除することはできない。ＩｇＧレベルは病気の重篤さと相関する。ミエリンの塩基性タンパク質は、脱髄が活発なときには増加することがある。

自然寛解と症状の変動は、治療を評価することを困難にする。コルチコステロイドが主な治療の形態である。コルチコステロイドは、長期的な廃疾には影響を及ぼさないかもしれないが、発作時の症候の期間を短縮することができる。急性の重い視神経炎の症状を示している患者は、高い用量のIVコルチコステロイドを用いることによってＭＳの発病を遅らせることができる。

免疫抑制剤（メトトレキセート、アザチオピン、シクロホスファミド、クラドリビン）が、一般に、重篤な進行性の形態に対して用いられる。インターフェロン−βによる免疫修飾治療法は、ＭＳにおける再発の頻度を低下させる。まだ研究中のその他の治療法で期待がもてそうなものとしては、体が自分自身のミエリンを攻撃しないようにするための他のインターフェロン、経口ミエリン、グラチラマー、などがある。グラチラマーは、ミエリンの塩基性タンパク質と類似した合成コポリマーであり、毎日の皮下注射によって投与される。その主な作用は、ミエリンに対する免疫応答を抑制して免疫寛容性を高めることであると考えられる（Clegg and Bryant, 2001）。

インターフェロンはサイトカイン、すなわち、細胞間でメッセージを伝達し、感染を引き起こす微生物を破壊し、生じた損傷を修復して免疫システムで不可欠な役割を演ずる可溶タンパク質、である。インターフェロンは感染した細胞によって自然に分泌されるものであり、１９５７年に初めて同定された。その名前は、ウイルスの複製と産生を「妨害する（interfere）」ことから由来する。

インターフェロンは、抗ウイルス活性と抗増殖活性を示す。天然に発生するヒトのインターフェロンは、生化学的性質と免疫的性質に基づいて、３つの主なクラスにグループ分けされる：すなわち、インターフェロン−アルファ（白血球）、インターフェロン−ベータ（繊維芽細胞）、及びインターフェロン−ガンマ（免疫）である。アルファ−インターフェロンは、現在、アメリカ及びその他の国で、ヘアリー・セル白血病、尖形コンジローム、カポジ肉腫（普通、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の患者がかかる癌）、及び非Ａ、非Ｂ型慢性肝炎、の治療に関して承認されている。

さらに、インターフェロン（ＩＦＮｓ）は、体によってウイルス感染に応答して産生される糖タンパク質である。これらのインターフェロンは、防護された細胞におけるウイルスの増殖を阻害する。ＩＦＮｓは、低分子量のタンパク質から成り、その作用は著しく非特異的である、すなわち、あるウイルスによって誘発されるＩＦＮは、広範囲の他のウイルスに対しても効力を有する。しかし、これは種−特異的である、すなわち、ある種によって産生されるＩＦＮは、同じ種又は近縁の種の細胞でのみ抗ウイルス活性を刺激する。ＩＦＮｓは、その抗腫瘍、及び抗ウイルス活性が利用されることになるサイトカインの最初のグループであった。

３つの主要なＩＦＮｓは、インターフェロン−α、インターフェロン−β、及びインターフェロン−γと呼ばれる。これらの主要な種類のＩＦＮｓは、最初はその起源である細胞（白血球、繊維芽細胞、又はＴ細胞）によって分類された。しかし、いくつかのタイプが１つの細胞によって産生されることが明らかになった。そのため、白血球ＩＦＮは、現在はＩＦＮ−αと呼ばれ、繊維芽細胞ＩＦＮはＩＦＮ−β、Ｔ細胞ＩＦＮはＩＦＮ−γと呼ばれている。４番目のタイプのＩＦＮ、リンパ芽球ＩＦＮ、もあり、（Burkittリンパ種から得られた）「Namalwa」細胞ラインによって産生され、白血球ＩＦＮと繊維芽細胞ＩＦＮの混合物を産生しているように思われる。

インターフェロン単位、又は国際インターフェロン単位（国際単位はＵ、又はＩＵ）が、ウイルスによる損傷に対して５０％の細胞を防護するために必要な量として定義されるＩＦＮ活性の尺度として記載されている。生物活性を測定するために用いられる分析方法は、（Rubinstein, et al. 1981; Familletti, P. C. et al. 1981）に記載されているような細胞変性効果阻害分析である。このインターフェロンに関する抗ウイルス分析では、約１単位／ｍｌのインターフェロンが、５０％の細胞変性効果を生ずるのに必要な量である。単位は、National Institute of Healthから提供されるＨｕ−ＩＦＮ−ベータに関する国際参照標準に対して決定される（Peska, S. 1986）。

ＩＦＮのどのクラスもいくつかの異なるタイプを含んでいる。ＩＦＮ−βとＩＦＮ−γはそれぞれ単一遺伝子の産物である。

ＩＦＮｓ−αとして分類されるタンパク質は最も多様なグループであり、約１５のタイプを含んでいる。第９染色体にはＩＦＮ−α遺伝子のクラスターがあり、少なくとも２３のメンバーを含み、そのうち１５がアクティブであり転写される。成熟ＩＦＮｓ−αはグリコシル化されていない。

ＩＦＮｓ−αとＩＦＮ−βは全て同じ長さ（１６５又は１６６アミノ酸）であり、生物学的活性も同様である。ＩＦＮ−γは、長さが１４６アミノ酸であり、α及びβクラスとそれほど良く似ていない。ＩＦＮｓ−γだけがマクロファージを活性化する又はキラーＴ細胞の成熟を誘発することができる。実際、これらの新しいタイプの治療物質は、腫瘍に対する生物の応答に影響を及ぼし、免疫調節によって認識に影響を及ぼすので、生物的応答調節物質と呼ぶことができる。

特に、ヒト繊維芽細胞インターフェロン（ＩＦＮ−β）は、抗ウイルス活性を有し、新生細胞に対抗してナチュラル・キラー細胞を刺激することができる。それはウイルスと二本鎖ＲＮＡｓによって誘発される約２０，０００Ｄａのポリペプチドである。組み換えＤＮＡテクノロジーによってクローニングされた繊維芽細胞インターフェロンの遺伝子のヌクレオチド配列から、（Derynk et al. 1980）は、このタンパク質の完全なアミノ酸配列を導出した。その長さは１６６アミノ酸である。

Shepard et al. (1981)は、抗ウイルス活性を失わせる塩基８４２における突然変異（位置１４１でのＣｙｓ→Ｔｙｒ）、及びヌクレオチド１１１９−１１２１が欠失した変異体クローンを記載した。

Mark et al.は、位置１７におけるアミノ酸の切り替え、Ｃｙｓ→Ｓｅｒ、を引き起こす塩基４６９（Ｔ）を（Ａ）で置き換える人工的な突然変異を挿入した。得られたＩＦＮ−βは、「原生」ＩＦＮ−βと同じような活性を有し、長期の貯蔵で安定である（−７０℃）と報告された。

Rebif「登録商標」（組み換えヒト・インターフェロン−β）は、多発性硬化症（ＭＳ）のインターフェロン治療における最近の展開であり、治療における顕著な前進である。Rebif「登録商標」は、哺乳類細胞ラインから産生されるインターフェロン（ＩＦＮ）−ベータ１ａである。インターフェロン（ＩＦＮ）−ベータ１ａを週に３回、皮下注射で投与すると、再発し寛解する多発性硬化症（ＲＲ−ＭＳ）の治療に効果があることが確立された。インターフェロン（ＩＦＮ）−ベータ１ａは、再発の回数と重篤性（severity）を減少させ、この病気の負担を減らし、ＭＲＩで測定される疾患の活動を減少させることによって、ＭＳの長期的な経過にプラスの効果を及ぼすことができる（The Lancet 1998）。

腫瘍壊死因子、又はＴＮＦ、は、以前はCachectinと呼ばれたものであるが、活性化されたＴ細胞及びマクロファージによって放出される多面的な作用を有するサイトカインである。ＴＮＦは、インターフェロン、インターロイキン、及びコロニー刺激因子サイトカイン・ネットワークのメンバーであり、他のサイトカイン及び付着分子の産生など、いくつかの向炎症性の変化を誘発することによって、多くの感染性及び炎症性疾患の病因に関連して信号伝達で重要な役割を演ずる（Fiers, 1991）。

便宜上、ＴＮＦという用語で、本出願明細書の全文にわたって、動物又はヒトからの腫瘍壊死因子−アルファと腫瘍壊死因子−ベータの両方を、天然に見られるその対立因子を合わせて、意味するものとする（Pennica et al., 1984, Wallach et al., 1986, Beutler, B. and Cerami, A. (1987)）。ＴＮＦ−ベータは、リンフォトキシンとも呼ばれ、同じような活性を有するが、異なる細胞タイプ（リンパ球とナチュラル・キラー細胞）から、抗原又はミトゲンの刺激に応答して産生される（Gray et al. 1984）。

このように、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）とリンフォトキシン（ＴＮＦ−β）は、細胞にいろいろな影響を及ぼすサイトカインである。その影響のいくつかは、生物に取って有益なものであると考えられる；例えば、サイトカインは、腫瘍細胞やウイルス感染細胞を破壊し、顆粒細胞の抗バクテリア活性を増強する。このようにして、ＴＮＦは、感染因子に対する生物の防衛、及び傷害からの回復に寄与する。しかし、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βは、また、有害な影響を及ぼすということも記載されている。ＴＮＦ−αの過剰な産生は、いくつかの病気で主要な病原的役割を演ずるという証拠がある。いくつかの病気では、ＴＮＦは、脂肪性細胞の活動を抑制し、食欲を減退させることによって過剰な体重減少（悪液質）を引き起こすことがあり、ＴＮＦ−αはカチェクティン（cachectin）と呼ばれていた。また、リュウマチ疾患では組織への損傷を媒介すると記載されていたし、移植片対宿主反応で観測される損傷の主要な媒介因子であると記載されていた。

ＴＮＦは、トリマーとして活動する成熟した１７ｋＤａのタンパク質であるとされる。この錯体は細胞表面のレセプターを寄せ集めることによって生物的活性を発揮し、それらがいろいろな器官や組織において特異的な効果を媒介する。

ＴＮＦは、ｐ５５ＴＮＦレセプター１，文献ではまたＴＮＦ−ＲIと定義されるもの、及びｐ７５ＴＮＦレセプター，文献ではまたＴＮＦ−ＲIIと定義されるもの（Bazzoni and Beutler, 1996）、などの膜に結合したレセプター分子のファミリーと結合することによって、免疫システムの正常な発現と機能のために必要なその活性を発揮する。ＴＮＦ信号を伝達するさいのＴＮＦ−ＲIの優位性は、このレセプターに特異的な敵対的抗体がＴＮＦで誘発される応答の多くを模倣できることに示されている（Shalaby et al., 1990）。膜結合レセプターと結合することによって、ＴＮＦは、ＴＲＡＤＤとＴＲＡＰ−１（ＴＮＦ−ＲIの場合）、又はＴＲＡＦ−１とＴＲＡＦ−２（ＴＮＦ−ＲIIの場合）、などの細胞質媒介因子を通る信号伝達経路を解発し、Ｔ細胞増殖、in vitroでの腫瘍細胞溶解、皮膚の壊死、インシュリン抵抗性、アポトーシス、などのいろいろな細胞応答に導く。両方のＴＮＦレセプターの細胞外部分を切り取ることができ、この可溶なレセプターはＴＮＦと結合する能力を保っているので、高アフィニティー錯体を形成することによってＴＮＦを不活性化し、標的細胞の膜レセプターとのＴＮＦの結合を減少させることができる（Nophar et al. 1990）。

ＴＮＦ−アルファの免疫反応性が、ＭＳ病巣で高レベルで見出されるという所見に基づいて、ＴＮＦが多発性硬化症の病因である役割を演じているということが言われた（Darlington, 1999）。したがって、ＭＳを治療するためにはＴＮＦをブロックする又は減少させるべきであると一般に考えられるので、多発性硬化症の治療のためのＴＮＦブロッキング物質が提案された（Selmaj et al., 1995）。しかし、ＴＮＦが欠落しているマウス、いわゆるＴＮＦ−／−マウス、を用いた実験は、タンパク質ＭＯＧによってＭＳ様の疾患を誘導したときに、これらのマウスは広範な炎症と脱髄を伴う深刻な神経の損傷を発現することを示した（Lieu et al. 1998）。

上記のＴＮＦ−ＲI（ｐ５５）及びＴＮＦ−ＲII（ｐ７５）レセプターの切断された形態は、例えばＥＰ９１４４３１に記載されている。これらの可溶なレセプターは、それぞれ、ＴＢＰI及びＴＢＰIIと呼ばれる（Engelmann et al., 1990）。天然及び組み換え可溶ＴＮＦレセプター分子、及びその生成方法、は、例えば欧州特許ＥＰ３０８ ３７８，ＥＰ３９８ ３２７，及びＥＰ４３３ ９００，に記載されている。ＥＰ３９８ ３２７はＴＢＰｓが、ＴＮＦ活性の阻害因子であるだけでなく、ＴＮＦの有益な効果も保持していると述べている。また、可溶なＴＮＦレセプターは、ＴＮＦの生物活性を安定化し、そのいくつかの効果を増強すると記述されている（Aderka et al., 1992）。

ＴＮＦ様の活性は、また、ＴＮＦレセプターの可溶形態に向けられた抗体に関しても示された（Engelmann et al., 1990）。

その他に、ＥＰ８８０ ９７０は、多発性硬化症の治療のためのＴＢＰｓの利用も開示している。
発明の要約
本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）をインターフェロン（ＩＦＮ）と組み合わせて投与すると、ミエリンの再生（remyelination）に効果があり、かつ多発性硬化症のin vivoモデルでこの病気の臨床的な徴候を減少させるという知見に基づいている。驚くべきことに、ＴＮＦは多発性硬化症におけるＩＦＮの治療効果を増強することが見出された。さらに、インターフェロンは、ＴＮＦと組み合わせて投与されると、治療での用量よりも低い用量でも有益な効果を示すことが見出された。

したがって、本発明の第一の目的は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）活性を有する、刺激する、又は維持する物質を、インターフェロン（ＩＦＮ）、又はアイソフォーム、突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性部分又はその塩、と組み合わせて、脱髄性疾患の治療及び／又は予防のための、同時、順次、又は別に使用される医薬の製造のために利用することである。

本発明の第二の目的は、ＴＮＦ活性を有する、刺激する、又は維持する物質を、１つ以上の医薬的に受容される賦形剤の存在下で、有効な量のＩＦＮと組み合わせて含む医薬組成物を提供することである。
発明の詳細な説明
本発明によって、驚くべきことに、ＴＮＦとインターフェロンは、組み合わせて投与される場合、多発性硬化症の臨床的な重篤性に顕著な有益な効果を及ぼすことが見出された。ＴＮＦは、多発性硬化症のin vivoモデルにおいてＩＦＮの治療活性を増強することが示された。

したがって、本発明は脱髄性疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造における腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）活性を有する、刺激する、又は維持する物質の利用に関する。本発明によれば、ＴＮＦ活性を有する、刺激する、又は維持する物質とインターフェロンを、同時に、順次に、又は別に使用することができる。

「ＴＮＦ活性を有する、刺激する、又は維持する物質」という用語は、ＴＮＦ様の活性を有する、又はＴＮＦの産生及び／又は放出を解発又は刺激する、又はＴＮＦレセプターによる信号伝達を増強する、例えば、タンパク質、ペプチド、又は小さな分子量の化合物、などである。このような物質はまた、例えば、ＴＮＦの劣化を防止する。また、ＴＮＦ活性を増強する、強化する、又は刺激する物質であってもよい。さらに、ＴＮＦ活性を有する、刺激する、又は維持する物質は、ＴＮＦ活性を安定化する又は保存する物質であってもよい。このような物質の例としては、例えば、ＴＮＦレセプターの可溶な形態、ＴＮＦ結合タンパク質（ＴＢＰｓ）と呼ばれるもの、に向けられた抗体などがある。

本発明の文脈における「予防」という用語は、この疾病又はその１つ以上の症状の完全な予防だけでなく、疾病の発病前又は発病の初期におけるその影響の部分的又は実質的な予防、減衰、減少、低下、又は低減も指す。

本発明の文脈における「治療」という用語は、発病後の病気の進展における減衰、減少、低下又は低減を含む疾病の進行に対する有益な作用を指す。

本発明の文脈において用いられる場合、「脱髄性疾患」とは、「発明の背景」で詳しく述べたような、神経系のミエリン鞘の異常、特にミエリンの破壊、に関わる疾患である。

本明細書で用いられる場合、「インターフェロン」又は「ＩＦＮ」とは、文献でそのように定義されている分子を含むものとし、例えば、上の「発明の背景」の節であげたようなタイプのＩＦＮｓを含む。特に、上記の定義にはＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、及びＩＦＮ−γが含まれる。ＩＦＮ−βが、本発明によると好ましいＩＦＮである。ヒト起源のＩＦＮの使用も本発明によれば好ましい。本明細書で用いられるインターフェロンという用語は、その塩、機能的誘導体、変異体、類似体、及び活性画分を含むものとする。

本明細書で用いられる場合、「インターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）」とは、生物学的流体からの単離によって得られた、又は原核又は真核ホスト細胞からＤＮＡ組み換え技術によって得られたヒト繊維芽細胞インターフェロン、並びにその塩、機能的誘導体、変異体、類似体、及び活性画分、を含むものとする。

本明細書で用いられる場合、「腫瘍壊死因子」又は「ＴＮＦ」とは、動物又はヒトからの腫瘍壊死因子−アルファ及び／又は腫瘍壊死因子−ベータ、並びに天然に発生するその対立因子（Pennica et al. 1984）、並びにその塩、機能的誘導体、変異体、類似体、及び活性画分、を意味するものとする。本発明によれば、ヒトＴＮＦの使用が好ましい。

ある好ましい実施の形態では、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）活性を有する、刺激する、又は維持する物質は、ＴＮＦ、又はそのアイソフォーム、突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分又は塩である。

腫瘍壊死因子結合タンパク質（ＴＢＰ）は、ＴＮＦの長時間の有益な効果を維持することが示された。したがって、別の好ましい実施の形態では、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）活性を有する、刺激する、又は維持する物質は、インターフェロン（ＩＦＮ）、又はそのアイソフォーム、突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分又は塩、と組み合わせられたＴＢＰ、又はそのアイソフォーム、突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分又は塩、である。

本明細書で用いられる場合、「ＴＢＰ」、又は「ＴＢＰｓ」、という用語は、ｐ５５ＴＮＦレセプターの細胞外部分を含むＴＮＦ結合タンパク質I、及びｐ７５ＴＮＦレセプターの細胞外部分を含むＴＮＦ結合タンパク質II、の両方、又は両者の混合物、に関する。本発明によると、インターフェロンは単独のＴＢＰI又はＴＢＰII、又は両方との組み合わせで用いることができる。これらの成分は同時に、順次に、又は別々に用いることができる。

本発明によれば、ＩＦＮと組み合わせて投与されるＴＢＰはＴＢＰIであってもよい。ある好ましい実施の形態では、それはＴＢＰIIである。

「ＴＮＦ結合タンパク質」又は「ＴＢＰ」は、２つの知られているＴＮＦレセプターのどちらかの細胞外領域の全部又は一部を含む可溶な断片であってもよい。好ましくは、それは、「発明の背景」で上述したようなＴＢＰI又はＴＢＰIIである。

本発明によれば、ＴＮＦ活性を有する、刺激する、又は維持する物質は、また、ＴＮＦの一方又は両方を刺激する分子であってもよい。このような分子の例としては、例えば、リポ多糖類、グルカン、又はＩＬ−１，などがあげられる。

以下では、ＴＮＦ活性を有する、刺激する、又は維持する物質、そして特にＴＮＦ及びＩＦＮ及びＴＢＰ、はまた、「本発明の物質」と呼ばれることがある。

本明細書で用いられる場合、「突然変異タンパク質」とは、本発明による物質の類似体であって、本発明の天然物質の１つ以上のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基に置き換えられ、又は欠失し、又は本発明の天然物質に１つ以上のアミノ酸残基が付け加えられ、得られた生成物の活性が本発明の野生型物質に比べて大きく変化していないものを指す。これらの突然変異タンパク質は、公知の合成方法及び／又は部位特異的突然変異誘発方法によって、又は他の何らかの適当な方法によって調製される。

好ましくは、このような突然変異タンパク質は、本発明の物質と実質的に同様な活性、又はさらに優れた活性が得られるほどの、本発明の物質のアミノ酸配列と十分に重複するアミノ酸配列を有する。インターフェロン及びＴＮＦの生物的な機能は当業者には周知であり、生物学的な標準は確立しており、例えば、National Institute of Biological Standards and Control （http://immunology.org/links/NIBSC）から入手できる。

ＩＦＮ又はＴＮＦ又はＴＢＰ活性を測定する生物分析は文献に記載されている。例えば、ＩＦＮ分析は、Rubinstein et al. 1981によって記載されたように行うことができる。ＴＮＦの細胞毒物活性は、例えば、Flick and Gifford, 1984に従って測定することができる。ＴＢＰの効果は、ＥＰ３０８ ３７８又はＥＰ３９８ ３２７に記載されているようにしてテストすることができる。ある突然変異タンパク質が、ＩＦＮ又はＴＮＦと実質的に同様な、又はもっと優れた活性を有するかどうかは、日常作業としての実験によって決定できる。

本発明による突然変異タンパク質で、本発明に従って使用できるもの、又はそれをコードする核酸、は、置換ペプチド又はポリヌクレオチドとして実質的に対応している配列の有限なセットを含み、それは本発明の教示と指針に基づいて、当業者によって過度な実験を必要とせずにルーチン作業によって得られる。

本発明による突然変異タンパク質での好ましい変化は、「同類」置換として知られているようなものである。本発明のポリペプチド又はタンパク質の同類アミノ酸置換としては、物理化学的な性質が十分に近い、あるグループ内の同義アミノ酸が含まれ、そのグループのメンバー間の置換は分子の生物的機能が保存される。上で定義された配列におけるアミノ酸の挿入や欠失も、その機能を変化させることなく可能である、特に挿入や欠失が少数のアミノ酸に関わり、例えば、３０個よりも少ない、好ましくは１０個よりも少ないアミノ酸に関わり、機能的なコンフォメーションに不可欠なアミノ酸、例えば、システイン残基、を除去あるいは移動させない場合には可能である、ということは明らかである。このような欠失及び／又は挿入によって生成されるタンパク質及び突然変異タンパク質は本発明の範囲に含まれる。

好ましくは、同義アミノ酸グループは、表Iに定義されているようなものである。さらに好ましくは、同義アミノ酸グループは、表IIに定義されているようなものであり、最も好ましくは、同義アミノ酸グループは、表IIIに定義されているようなものである。

本発明で用いられる、本発明の物質としての突然変異タンパク質を得るために用いることができるタンパク質におけるアミノ酸置換の生成の例としては、U.S, Patents No. 4,959,314, 4,588,585, and 4,737,462 to Mark et al; 5,116,943 to Koths et al; 4,965,195 to Namen et al; 4,879,111 to Chong et al; and 5,017,691 to Lee et al; に開示されているような公知の方法、及びU.S, Patent No. 4,904,584 (Shaw et al)に開示されているリジン置換されたタンパク質、などがあげられる。ＴＮＦ−アルファの具体的な突然変異タンパク質は、例えば、U.S, Patent No.5,891,679に記載されている。ＩＦＮ−ベータの具体的な突然変異タンパク質は、例えば、Mark et al 1984に記載されている。

「融合タンパク質」という用語は、本発明の物質を含むポリペプチド、又はその突然変異タンパク質、が、例えば体液内で長時間滞留する別のタンパク質と融合したものを指す。本発明の物質は、このように別のタンパク質、ポリペプチド、など、例えば免疫グロブリン又はその断片、と融合させることができる。

本明細書で用いられる場合、「機能的誘導体」とは、本発明の物質の誘導体、及びその突然変異タンパク質及び融合タンパク質であって、残基の側鎖として、又はＮ−又はＣ−末端基として含まれる官能基から当業者に公知の手段で調製され、医薬的に受容されるものとしてとどまる限り、すなわち、本発明の物質の活性と実質的に同様なタンパク質の活性を破壊せず、それを含む組成物に毒性を付与しない限り、本発明に含められるもの、を指す。そのような誘導体としては、例えば、抗原部位をマスクし、本発明の物質の体液中の滞留を長引かせるポリエチレン・グリコール側鎖などがあげられる。その他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、カルボキシル基のアンモニア又は第一級又は第二級アミンとの反応によるアミド、アミノ酸残基の遊離アミノ基とアシル部分（例えば、アルカノイル又は炭素環アロイル基）によるＮ−アシル誘導体、又は遊離ヒドロキシル基（例えば、セリル又はトレオニル残基）とアシル部分で形成されるＯ−アシル誘導体、などがあげられる。

本発明の物質、又は突然変異タンパク質及び融合タンパク質、の「活性画分」として、本発明は、タンパク質分子のポリペプチド鎖の断片又は前駆物質を単独で、又はそれに結合した関連分子又は残基、例えば、糖又はリン酸塩残基、と合わせて、又はタンパク質分子の集合体、又は糖残基自身、を含める、ただし、該部分が本発明の物質に比べて活性が減少していないものとする。

本明細書における「塩」という用語は、上述のタンパク質又はその類似体のカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当業者に公知の方法によって形成され、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、又は亜鉛の塩、など、及び有機塩基との塩、例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、又はリシン、ピペリジン、プロカイン、などのアミンによって形成される塩、を含む。酸付加塩は、例えば、鉱物酸、例えば、塩酸や硫酸、との塩、及び有機酸、例えば、酢酸やシュウ酸、との塩、を含む。もちろん、そのような塩は、本発明に関わるタンパク質（それぞれ、ＩＦＮ及びＴＮＦ）の生物的活性、すなわち、対応するレセプターと結合しレセプター信号伝達を開始させる能力、を保持していなければならない。

本発明による脱髄性疾患は、例えば、序論で述べたような、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、急性炎症性末梢ニューロパシー、副腎脳白質ジストロフィー及び副腎ミエロニューロパシー、遺伝的なレーベル視神経萎縮症、又はＨＴＬＶ関連ミエロパシー、などである。好ましくは、それらはミエリン鞘の異常を含むニューロパシーである。それらは抹消又は中枢神経系に関わる。

最もよく見られる脱髄性疾患は多発性硬化症である。したがって、本発明のある好ましい実施の形態では、ＴＮＦ又はＴＢＰとＩＦＮの組み合わせが多発性硬化症（ＭＳ）の治療及び／又は予防のために用いられる。本発明によれば、ＭＳは、慢性的な進行性の疾病として展開されることがある。また、再発し寛解する多発性硬化症もある。

本発明にしたがって、組み換えヒトＩＦＮ−ベータと組み換えヒトＴＮＦ−アルファを用いることが特に好ましい。

別の実施の形態では、組み換えヒトＩＦＮ−ベータと組み換えＴＢＰI又はIIを用いることが好ましい。

最近、特別な種類のインターフェロン変異体が報告された。いわゆる「コンセンサス・インターフェロン」は天然には見られないＩＦＮの変異体である（US 6,013,253）。コンセンサス・インターフェロンは多発性硬化症の治療に効果的であることが示された。

したがって、本発明のある好ましい実施の形態では、ＴＮＦがコンセンサス・インターフェロンと組み合わせて用いられる。

本明細書で用いられる場合、ヒト・インターフェロン・コンセンサス（ＩＦＮ−ｃｏｎ）とは、天然には見られないポリペプチドであって、天然に見られるヒト白血球インターフェロン・サブタイプ配列の多数を代表するＩＦＮ−アルファのサブセットに共通するアミノ酸残基を主に含み、全てのサブタイプに共通するアミノ酸がない１つ以上の位置で、その位置で多く見られるアミノ酸を含み、いかなる場合も少なくとも１つの天然に見られるサブタイプでその位置に存在しないアミノ酸残基を含まないポリペプチドを忌みするものとする。ＩＦＮ−ｃｏｎは、U.S. 4,695,623, 4,897,471, 及び5,541,293で開示されているＩＦＮ−ｃｏｎ１、ＩＦＮ−ｃｏｎ２、及びＩＦＮ−ｃｏｎ３と呼ばれるアミノ酸配列を包含するが、それだけに限定されない。ＩＦＮ−ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列は、上記の特許に記載されているように、又は他の標準的な方法で生成できる。

別の好ましい実施の形態では、融合タンパク質は、融合Ｉｇを含む。融合は、直接であっても、短いリンカー・ペプチドを介してであってもよく、リンカーは長さが１乃至３アミノ酸残基という短いものであっても、もっと長くて１３アミノ酸残基という長さであってもよい。前記リンカーは、例えば、Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）という配列のトリペプチド、又はＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔという１３−アミノ酸リンカー配列の形で、本発明の物質の配列と免疫グロブリン配列の間に導入される。得られる融合タンパク質は性質が向上する、例えば、体液に滞留する時間（半減期）が延びたり、特異的活性が増加したり、発現レベルが高くなったり、融合タンパク質の精製が容易になったりする。

ある好ましい実施の形態では、ＩＦＮ及び／又はＴＮＦがあるＩｇ分子の定常領域に融合される。好ましくは、それはＨ鎖領域に、例えば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３領域、に融合される。本発明による融合タンパク質の生成には、Ｉｇ分子の他のアイソフォームも適当である、例えば、ＩｇＧ₂やＩｇＧ₄、又は他のＩｇクラス、例えば、ＩｇＭやＩｇＡ、も適当である。融合タンパク質は、モノマー、マルチマー、ヘテロ又はホモ−マルチマーである。

本発明は、ＴＮＦ及び／又はＴＢＰとＩＦＮの組み合わせ治療に関する。これらの治療単位（entities）を互いに結合させて、モノマーであれマルチマーであれ、２つ又は３つの別々の分子としてでなく単一分子として投与することもできるであろう。マルチマーの融合タンパク質は、Ｉｇ部分に融合されたＴＮＦ、並びにＩｇ部分に融合されたＩＦＮを含むことができる。一緒に発現されると、得られた融合タンパク質は、ＴＮＦとＩＦＮ又はＴＢＰとＩＦＮをそれぞれ含むであろう。本発明の化合物はさらに他の架橋物質又は部分によって、例えば、ポリエチレン分子などによって結合されることもできる。

別の好ましい実施の形態では、機能的誘導体は、アミノ酸残基の１つ以上の側鎖として現れる１つ以上の官能基に付着した少なくとも１つの部分（moiety）を含む。好ましくは、この部分はポリエチレン部分である。ＰＥＧｙ化は、公知の方法、例えば、WO 99/55377に記載されている方法によって行うことができる。

再発し寛解するＭＳの治療で現在用いられるヒトＩＦＮ−ベータの標準的投与量は、１日あたり80 000 IU/kgから200 000 IU/kg、又は１日１人あたり６MIU から１２MIU、又は１人あたり２２から４４ｍｇ、の範囲にある。本発明によって、驚くべきことに、確立された多発性硬化症のモデルでＴＮＦがＩＦＮの治療効果を増強するということが示された。したがって、本発明によれば、ＩＦＮは、１人当たる１日に約１乃至５０ｍｇ、好ましくは約１０乃至３０ｍｇ、さらに好ましくは約１０乃至２０ｍｇという投与量で、ＴＮＦと合わせて投与される。好ましい投与ルートは、皮下投与であり、週に３回投与される。別の好ましい投与ルートは、筋肉内投与であり、週に１回投与される。

ＴＮＦ−アルファ治療はこれまで癌の治療に用いられた。癌患者の研究から、ｒ−ＴＮＦ−アルファ治療の毒性はばらつきがあり、必ずしも量に依存しないことが知られている。肝臓及び心臓血管系への毒性は、量の増加と共に一般に増加することが見出されているが、熱、悪寒、硬直などの全身症状は量と関連していないように見える。３０分間にわたって静脈内に投与されるｒ−ＴＮＦ−アルファの最大許容投与量は１００から３００μｇ／ｍ²の間であると報告されている（Feinberg et al., 1988; Gamm et al., 1991; Schiller et al., 1991）。

したがって、別の好ましい実施の形態では、ＴＮＦ−アルファが毒性のない（Ｓｕｂ−Ｔｏｘｉｃ）濃度で投与される。さらに好ましくは、この毒性のない濃度は１００μｇ／ｍ²未満であり、好ましくは５０μｇ／ｍ²未満、さらに好ましくは１０μｇ／ｍ²未満、最も好ましくは１μｇ／ｍ²未満、である。

本発明に従って、ＴＢＰは１人あたり１日約１乃至３００ｍｇという用量で用いられる。ＴＢＰは、１人あたり１日約１５０ｍｇ、１人あたり１日約１００ｍｇ、１人あたり１日約５０ｍｇ、１人あたり１日約３５ｍｇ、１人あたり１日約２５ｍｇ、又は１人あたり１日約１０ｍｇ、という用量で用いることができる。

ＴＢＰは、毎日、又は１日おきに投与することができる。ＴＢＰは、例えば、毎日１人あたり１日１０ｍｇという用量で投与することができる。さらに、ＴＢＰは週に２回又は３回投与することもできる。この場合、ＴＢＰは、例えば、１人あたり１日２５，３５，又は５０ｍｇという用量で投与することができる。

このような活性成分の投与は、静脈内、筋肉内、又は皮下ルートで行うことができる。ＩＦＮ及び／又はＴＮＦの投与の好ましいルートは、皮下ルートである。ＴＮＦの場合、別の好ましいルートは静脈内投与である。

脱髄性疾患の治療では、コルチコステロイドが治療的に効果がある。したがって、本発明の医薬はさらに、コルチコステロイドを、同時、順次、又は別々に使用するように含むことができる。コルチコステロイド治療としては、例えば、経口プレドニソンを６０から１００ｍｇ／日、２乃至３週にわたって少しずつ変えて投与する、又はIVメチルプレドニソン５００乃至１０００ｍｇ／日を３乃至５日間投与することができる。

グラチラマーは、ミエリンの塩基性タンパク質と類似した合成コポリマーであり、皮下注射によって毎日投与される。これも多発性硬化症で治療効果があることが立証されている。本発明のある好ましい実施の形態では、この医薬はさらにグラチラマーを、順次、別々の、又は同時使用するように含む。

本発明はさらに、ＴＮＦ活性を有する、刺激する、又は維持する物質を、ＩＦＮと組み合わせて、１つ以上の医薬的に受容される賦形剤の存在下で含む医薬組成物に関する。好ましくは、本発明の医薬組成物はＴＮＦ又はＴＢＰをインターフェロンと組み合わせて含む。

本発明の医薬組成物は、さらにコルチコステロイド及び／又はグラチラマーを含むことができる。

「医薬的に受容される」という用語は、活性成分の生物的活性を妨害せず、投与されるホストに対する毒性もないキャリアを包含するものとする。例えば、非経口投与の場合、活性タンパク質は食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン、及びRinger溶液などのビヒクルによって注射するための単位用量形態に製剤することができる。

本発明による医薬組成物の活性成分は、いろいろな仕方で個体に投与することができる。投与ルートは、皮膚内、皮膚経由（例えば、緩慢放出製剤で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、硬膜上、局所施用、及び鼻腔内などのルートがある。治療に効果的なその他の任意のルートを用いることができる。例えば、上皮又は内皮組織による吸収、又は遺伝子治療による投与を用いることができる。遺伝子治療による投与では、活性成分をコードするＤＮＡ分子が（例えば、あるベクターによって）患者に投与され、そこで活性物質が発現され、in vivoに分泌される。さらに、本発明によるタンパク質は生物的に活性な他の成分、例えば、医薬的に受容される界面活性剤、賦形剤、キャリア、希釈剤、及びビヒクルと共に投与することができる。

本発明によれば、皮下ルートが好ましい。

本発明を実施する別の可能性は、本発明の化合物、すなわちＴＮＦ及び／又はＩＦＮに関する遺伝子を体内で活性化させることである。この場合、ＴＮＦ及び／又はＩＦＮの発現に関して通常は沈黙している細胞、又は十分でない量のＴＮＦ及び／又はＩＦＮ歯科発現しない細胞において、ＴＮＦ及び／又はＩＦＮの体内産生を誘発する及び／又は増強するためのベクターが脱髄性疾患の治療のために用いられる。ベクターは、ＴＮＦ及び／又はＩＦＮを発現させたいと望む細胞で機能する調節配列を含む。調節配列は、例えば、プロモーター又はエンハンサーである。調節配列は相同的組み替えによってゲノムの正しい座に導入され、発現を誘発又は増強する必要がある遺伝子とその調節配列が効果的にリンクされる。このテクノロジーは通常、「内因性遺伝子活性化」（Ｅ．Ｇ．Ａ）と呼ばれ、例えば、WO 91/09955に記載されている。

本発明はさらに、神経疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造において、ＩＦＮ及び／又はＴＮＦを産生するように遺伝的に修飾された細胞の利用に関する。

非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与では、活性タンパク質は溶液、懸濁液、エマルジョン、又は乾燥凍結された粉末として、医薬的に受容される非経口ビヒクル（例えば、水、食塩水、デキストロース溶液）及び等張性を維持する添加剤（例えば、マンニトール）又は化学的な安定性のための添加剤（例えば、防腐剤及びバッファー）と一緒に製剤することができる。製剤は、通常用いられる方法によって無菌化される。

本発明の活性タンパク質の生物学的利用率は、例えば、ＰＣＴ特許出願WO 92/13095に記載されているように、分子をポリエチレン・グリコールに結合して人体内での分子の半減期を延ばす抱合手順を用いて向上させることができる。

個人に対して、単一投与又は複数投与として投与される用量は、薬物動力学的性質、投与ルート、患者の状態や特性（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、同時に行っている治療、治療の頻度、及び望まれる効果、などいろいろな因子によって異なる。

本発明の物質は、毎日投与しても、１日おきに、又はもっと間隔をあけて投与してもよい。好ましくは、１つ以上の本発明の物質は、週に１回、２回又は３回投与される。

１日の用量は、通常、所望の結果を得るために効果的な分割投薬量又は持続放出形態で与えられる。二回目又は以後の投与は、その人に投与された最初の又は前回の用量と同じ、それより少ない、又は多い用量で行われる。二回目又は以後の投与は、疾患の間、又は発病の前に投与することができる。

本発明によれば、本発明の物質は、他の治療体制又は物質の前に、同時に、又は順次に（例えば、多重投薬体制で）治療的に有効な量で、個人に対して予防的又は治療的に投与することができる。他の治療物質と同時に投与される活性物質は、同じ組成又は異なる組成で投与することができる。

本発明はさらに、脱髄性疾患の治療及び／又は予防の方法であって、治療的に効果的な量の、ＴＮＦ活性を有する、刺激する、又は維持する物質、及び治療的に効果的な量のインターフェロンを、それを必要とするホストに投与するステップを含む方法に関する。

本明細書において引用された全ての参照文献は、学術誌の論文及びアブストラクト、公開又は未公開の米国又は外国の特許出願、付与された米国又は外国の特許、又はその他の参照文献を含めて、引用された参照文献に示されている全てのデータ、表、図、及び本文を含む全体が参照によって本明細書に取り込まれる。さらに、引用された参照文献の中で引用された参照文献の内容全体も、参照によって全体が本明細書に取り込まれる。

公知の方法ステップ、従来の方法ステップ、公知の方法、又は従来の方法への言及は、いかなる意味でも、本発明の何らかの様態、記載、又は実施の形態が関連する技術で開示、教示、又は示唆されているということを認めるものではない。

個別の実施の形態についてのこれまでの記述は、本発明の一般的な性質を十分に明らかにしているので、他の人たちは、当業者がもつ知識を（ここで引用された参照文献の内容を含めて）応用することによって、いろいろな目的に対して、過大な実験の負担なしに、本発明の一般的概念から逸脱することなく、これら個別の実施の形態を容易に変更する及び／又は適合させることができる。したがって、そのような適合及び変更は、ここで示された教示と指針に基づいて、開示された実施の形態の意味と範囲に含まれるものとする。本明細書における言い回し又は用語は、説明のためであって限定することを目的としていないので、本明細書における言い回し又は用語は、ここに示された教示と指針に照らして当業者の知識と組み合わせて解釈すべきものであることは言うまでもない。

本発明について説明してきたが、本発明は、本発明を制限するためでなく本発明を説明するために用意された以下の実施例を参照することによってさらに用意に理解されるであろう。
実施例
多発性硬化症のin vivoモデルにおけるＴＮＦ−アルファ単独の、又はＩＦＮ−ベータとの組み合わせの効果
多発性硬化症（ＭＳ）の確立された動物モデルを用いて、疾病の進展に対するＴＮＦ−アルファの、単独での又はＩＦＮ−ベータとの組み合わせでの、効果が分析された。実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルはマウス慢性脱髄モデルである。

ＥＡＥ誘導手順
マウスのグループに、実験的な自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）が次のようにして誘導された：Ｃ５７ブラック６／Ｊ雌マウスのグループが、第０日に、５ｍｇ／ｍｌのＨ３７ＲＡヒト型結核菌を含む完全フロインド・アジュバント中に２００μｇのミエリン・オリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ ３５−５５（Neosystem, Strasbourg, France））二対応する合成ペプチドを含む２００μｌのエマルジョンによって右脇腹に皮下的に免疫化された。

ただちに、及び第２日に、動物は、４００μｌの百日咳バッファー（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，０．０１７％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）二溶解された５００ｎｇの百日咳毒素の腹腔内注射を受けた。第７日に、動物は、完全フロインドアジュバント中に２００μｇのＭＯＧ ３５−５５ペプチドを含む同量（２００μｌ）のエマルジョンのブーストを左脇腹に受けた。

全ての薬剤による治療は、各動物で個別に、臨床スコア≧１に到達したときに開始された。これらの動物は、毎日２００μｌの以下の物質で治療された：
１）リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）、ｓ．ｃ．（皮下）及びｉ．ｖ．（静脈内）に投与；
２）２０，０００Ｕ／マウスのマウスｍＩＦＮ−ベータ、ｓ．ｃ．に投与；
３）５，０００Ｕ／マウスのマウスｍＩＦＮ−ベータ、ｓ．ｃ．に投与；
４）０．１μｇ／マウスのｒ−ｍＴＮＦａ、ｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．に投与；
５）ｒ−ｍＴＮＦ−アルファ（０．１μｇ／マウス、それぞれ、ｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．）とｍＩＦＮ−ベータ（５，０００Ｕ／マウス、ｓ．ｃ．）の組み合わせ。

ＴＮＦ−アルファについては２つの投与ルートが選ばれた。ｉ．ｖ．ルートはLieu et al.（Nature Medicine 1998, 4; 78-83）によって発表された結果に基づいて選ばれた。ｉ．ｐ．ルートはＴＮＦ−アルファの高用量での研究中に遭遇した毒性の問題を解決するために選ばれた。

ＰＢＳがビヒクルとして用いられ、全ての物質は首に皮下注射され、２つの物質で治療されるグループは２つの異なる部位で２回注射された。動物は毎日、下に示すような尺度によって神経的な徴候に関して点数（スコア）がつけられた。個々の動物の体重減少と臨床スコアは、疾病の開始から第３５日目まで、以下の規準による国際採点基準を用いて毎日モニターされた：
０＝疾病の徴候なし
１＝尾の弱さ又は麻痺
２＝尾の麻痺＋後肢の弱さ又は部分的麻痺
３＝尾の麻痺＋後肢の完全麻痺
３．５＝尾の麻痺＋後肢の麻痺＋失禁
４＝尾の麻痺＋後肢の麻痺＋前肢の弱さ又は麻痺
５＝瀕死
臨床スコアの時間経過における実験グループの間の差は、Kruskal-Wallisテストによって分析され、その後、有意な場合、各測定時間におけるpairwise Wilcoxon テストによって分析された。

組織学的分析
治療期間の終わりに、各動物はナトリウム・ペントバルビタール（約５０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔され、血液サンプリングの後、左心室を通して４％パラホルムアルデヒドによって心臓を経由して灌流−固定された。固定された脊髄は注意深く切り出された。脊髄スライス（１匹あたり１０乃至１２スライス）がパラフィン・ブロックに埋め込まれ、切片が作成され、炎症の徴候を調べるためにヘマトキシリンとエオシンで染色され、ミエリンの破壊を検出するためにKluver-PAS染色法（Luxol Fast Blue プラスPeriodic Acid Schiff 染色法）で染色された。脊髄では、全てのスライスの全面積が、各動物について、グリッドあたり０．４×０．４ｍｍの拡大率で１０×１０グリッドの交点として測定された。各スライスで血管周囲の炎症性浸潤（ＰII）ガカウントされ、各動物について合計値が求められ、ｍｍ²あたりの浸潤の数として評価された。脱髄は、グリッドあたり０．１×０．１ｍｍの拡大率で１０×１０グリッドの交点として測定されたようなものであり、スライスの全面積に対する全脱髄（Ｄｅｍ）面積のパーセンテージとして表された。実験グループ間の差は、片側ＡＮＯＶＡ、続いてNewman-Keulsテストによって評価された。

結果
最終的な研究手順を見出すための実験で、１日おきに１及び１０μｇ／マウスという用量でｉ．ｖ．でｒ−ｍＴＮＦ−アルファによって治療されたとき最初の動物たちは病気になった。１回又は２回の投与の後に治療された全ての動物が死んだので、用量を０．１μｇ／マウスに減らし、化合物を２つの実験グループに、それぞれ、ｉ．ｐ．及びｉ．ｖ．で投与することにした。

次のような研究手順が用いられた：

図１は、２０，０００ＩＵ／マウスのインターフェロン−ベータを毎日、皮下注射で投与した場合のポジティブ対照実験の結果を示している。ビヒクルのみを投与した場合に比べて、予期されたように、ＩＦＮ−ベータは第１２日以降の疾病の進展に、臨床スコアの顕著な減少に見られるような有益な効果を示した（白い四角）。

４倍低い量の、すなわち、５，０００ＩＵ／マウスのＩＦＮ−ベータを静脈内に投与した場合の結果が図２と３に示されている。結果を評価するのに２つのやり方が用いられた；１つのやり方では、死亡した動物に、死亡した日から実験の終わりまで、臨床スコア５が割り当てられた。このやり方でデータを評価した結果が図２に示されている。もう１つのデータ評価の仕方は、動物に死亡するまでスコアを割り当てるが、死亡した後はその動物を完全にドロップアウトさせるというものであった。結果は図３に示されている。

図２／３Ａは、このシリーズの実験における死亡率を示している。この動物モデルで予期されるように、死亡率は変動していた。しかし、驚くほど低い死亡率がＴＮＦ−アルファとＩＦＮ−ベータの両方の投与を受けた動物で達成された。

図２／３Ｂは、３５日間の実験期間にわたる臨床スコアの変化を示している。毎日ｓ．ｃ．で５，０００ＩＵ／マウスを投与した場合は、臨床スコアの改善は生じなかった（白いダイヤ）。０．１μｇ／マウスのＴＮＦ−アルファの静脈内に投与した場合（図２Ｂ、黒い三角）、ビヒクルと比べて臨床スコアがわずかに、特に疾病の後期ステージで改善された（図３Ｂ）。しかし、この改善は統計的に有意ではなかった、特にＴＮＦ−アルファのみを投与されたマウスの高い死亡率を考えると有意でなかった。

ＴＮＦ−アルファ（ｉ．ｖ．）とＩＦＮ−ベータ（ｓ．ｃ．）を組み合わせた投与は、３５日間のテスト期間に臨床スコアの顕著な改善を生じた（図２Ｂで第６−１４日及び１７−３５日、図３Ｂの第６日から第３５日まで）（白い三角）。

組織分析は図２／３Ｃに示されている。脊髄の組織検査は、ＩＦＮ−ベータだけによる治療、及びＴＮＦ−アルファとＩＦＮ−ベータを組み合わせた治療が、炎症のひろがりの減少（ビヒクル処理グループに比べてｐ<０．０１、組み合わせ治療のみ）及び脱髄の減少を生じたことを示した。

図４／５は、５，０００ＩＵ／マウスのＩＦＮ−ベータｓ．ｃ．と０．１μｇ／マウスのＴＮＦ−アルファｉ．ｐ．が、単独で、又は組み合わせて投与された実験を示している。図４は、死亡した動物を臨床スコア５とカウント下場合のデータ分析を示し、図５は同じ実験の分析で、死んだ動物はもはや全くカウントされなかった場合の分析を示している。

ＩＦＮ−ベータをＴＮＦ−アルファと組み合わせて投与した場合（白い四角）、ビヒクルのみを投与した場合と比べて、臨床スコアに、すなわち、疾病の進展でわずかな改善が見られた（図４Ｂの区間第６−９日、及び図５Ｂの第４−１５，１６及び２１−３５日に有意な改善）。組み合わせ治療の有益な効果は、また、脊髄の組織分析にも見られ（図４／５Ｃ）、特に炎症のひろがりが有意に減少した（ｐ<０．０１）。合わせて考えると、ＴＮＦ−アルファは、静脈内に投与した場合と比べて、腹腔内に投与した場合には効果が小さいように思われる。

結論
治療には足りない量のＩＦＮ−ベータを、毒性がない量のＴＮＦ−アルファと組み合わせて投与すると、臨床スコアの減少、並びに動物の脊髄における炎症と脱髄の減少に示されるような顕著な永続的な疾病の改善が生じた。したがって、上で示した結果はＴＮＦ−アルファとＩＦＮ−ベータを組み合わせた治療が、ＭＯＧで免疫化されたマウスにおける慢性ＥＡＥの臨床的徴候を減少させるという、明らかに有益な効果を示している。したがって、ＴＮＦは多発性硬化症におけるインターフェロンの治療効果を増強する。このように、多発性硬化症などの脱髄性疾患の治療として、ＴＮＦとＩＦＮによる組み合わせ治療が示唆される。

３５日間にわにわたる実験期間に、２００００Ｕ／マウスのマウスＩＦＮ−ベータ（白い正方形）又はビヒクル（黒いダイヤ）を毎日皮下に（ｓ．ｃ．）投与した後のマウスＥＡＥモデルにおいて毎日測定された臨床スコアを示す。 マウスＥＡＥモデルにおいて、ＩＦＮ−ベータ（皮下への毎日投与）又はＴＦＮ−アルファ（静脈内投与、１日おき）を単独で又は組み合わせて投与した後の疾病の展開を示す。図２Ａは、この実験における死亡率を示す。図２Ｂは、３５日間の実験期間で、ビヒクルの皮下（ｓ．ｃ．）及び静脈内（ｉ．ｖ．）投与（黒いダイヤ）、５，０００Ｕ／マウスのマウスＩＦＮ−ベータのｓ．ｃ．投与（白いダイヤ）、０．１μｇ／マウスのマウスＴＮＦ−アルファの静脈内（ｉ．ｖ．）投与（黒い三角）、又は０．１μｇ／マウスのｍＴＮＦ−アルファのｉ．ｖ．と５，０００Ｕ／マウスのｍＩＦＮ−ベータのｓ．ｃ．の両方の投与（白い三角）の後の臨床スコアを示す。死んだ動物には、死亡した日から実験の終わりまで、臨床スコア５を割り当てた（図２Ｂ）。図２Ｃは、脊髄の組織分析の結果を示しており、炎症の程度（水平線の影）を血管周囲の炎症浸潤の数（ＰII）で表し、脱髄の程度（垂直線の影）を脱髄のパーセント（％Ｄｅｍ）で表して示している。Ｎ．Ｅ．＝評価せず。 図２のデータを異なる仕方で評価したものである。実験期間中に死んだ動物は、スコアを割り当てられず、完全にドロップアウトさせた。 マウスＥＡＥモデルにおいて、ＩＦＮ−ベータ（皮下への毎日投与）又はＴＦＮ−アルファ（腹腔内投与、１日おき）を単独で又は組み合わせて投与した後の疾病の展開を示す。図４Ａは、この実験における死亡率を示す。図４Ｂは、３５日間の実験期間で、ビヒクルの皮下（ｓ．ｃ．）及び腹腔内（ｉ．ｐ．）投与（黒いダイヤ）、５，０００Ｕ／マウスのマウスＩＦＮ−ベータのｓ．ｃ．投与（白いダイヤ）、０．１μｇ／マウスのマウスＴＮＦ−アルファの腹腔内（ｉ．ｐ．）投与（黒い四角）、又は０．１μｇ／マウスのｍＴＮＦ−アルファのｉ．ｐ．と５，０００Ｕ／マウスのｍＩＦＮ−ベータのｓ．ｃ．の両方の投与（白い四角）の後の臨床スコアを示す。死んだ動物には、死亡した日から実験の終わりまで、臨床スコア５を割り当てた（図４Ｂ）。図４Ｃは、脊髄の組織分析の結果を示しており、炎症の程度（水平線の影）を血管周囲の炎症浸潤の数（ＰII）で表し、脱髄の程度（垂直線の影）を脱髄のパーセント（％Ｄｅｍ）で表して示している。Ｎ．Ｅ．＝評価せず。 図４のデータを異なる仕方で評価したものである。実験期間中に死んだ動物は、スコアを割り当てられず、完全にドロップアウトさせた。

Claims (19)

1. 多発性硬化症の治療及び／又は予防のための医薬組成物であって、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）タンパク質、あるいはそのアイソフォーム、突然変異タンパク質、若しくは塩と、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−ベータ）タンパク質、あるいはその突然変異タンパク質、若しくは塩、とを含んで成り、前記突然変異タンパク質は、天然物質の１０個以下のアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基に置き換えられ、又は欠失し、あるいは天然物質に１０個以下のアミノ酸残基が付け加えられているものであって、当該天然物質の生物的機能を保存しているものであり、これらの成分が同時、順次、又は別々に投与される、医薬組成物。
2. 前記ＩＦＮ−ベータが組み換えヒトＩＦＮ−ベータであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ＴＮＦ−アルファが組み換えヒトＴＮＦ−アルファであることを特徴とする請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 前記ＩＦＮ−ベータが１日１人あたり１乃至５０ｍｇの用量で投与されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. 前記用量が１日１人あたり１０乃至３０ｍｇである、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 前記用量が１日１人あたり１０乃至２０ｍｇである、請求項４に記載の医薬組成物。
7. 前記ＩＦＮ−ベータが毎日投与されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 前記ＩＦＮ−ベータが１日おきに投与されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
9. 前記ＩＦＮ−ベータが週に２回投与されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. 前記ＩＦＮ−ベータが週に３回投与されることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 前記ＴＮＦ−アルファが１００μｇ／ｍ²未満の濃度で投与されることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. 前記濃度が５０μｇ／ｍ²未満である、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 前記濃度が１０μｇ／ｍ²未満である、請求項１１に記載の医薬組成物。
14. 前記濃度が１μｇ／ｍ²未満である、請求項１１に記載の医薬組成物。
15. 前記ＩＦＮ−ベータ及び／又は前記ＴＮＦ−アルファが皮下に投与されることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
16. 前記ＩＦＮ−ベータ及び／又は前記ＴＮＦ−アルファが筋肉内に投与されることを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
17. 前記ＴＮＦ−アルファが静脈内に投与されることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
18. 前記医薬がさらに、同時、順次、又は別々に使用されるコロチコステロイドを含む請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
19. 前記医薬がさらに、同時、順次、又は別々に使用されるグラチラマーを含む請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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