JP4503263B2 - スフィンゴ糖脂質の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、植物素材からスフィンゴ糖脂質を高濃度に含有するスフィンゴ糖脂質含有物の効率的な製造方法に関するものであり、得られたスフィンゴ糖脂質含有物は、動物由来ではなく植物由来でありしかもその製造工程において飲食品において使用が認められていない有機溶媒を使用しないという特徴を有するため、安全性が高く、化粧品等の用途はもちろんのこと、飲食品や経口摂取物にも利用できるという特筆すべき利点を有するものである。

従来、天然のスフィンゴ糖脂質は、牛脳から有機溶媒抽出され、化粧品などに使用されてきたが、近年、狂牛病の問題をかわきりに安全な素材として、スフィンゴ糖脂質を比較的多く含む植物由来の素材からの分離の検討がされるようになった。そのような植物由来素材として、米糠、大豆粕、大豆胚芽、小麦フスマ、醤油粕、芋類などが検討されている。しかしながら、それらのスフィンゴ糖脂質の抽出分離法は、一般に食品に用いてはいけない有機溶媒（クロロホルム、メタノール、アセトニトリル、ピリジンなど）を使用したもの、例えば、大豆油さいでのクロロホルム（特許文献１）、ビール粕でのメタノール（特許文献２）などがあり、このようにして抽出分離されたスフィンゴ糖脂質は化粧品など限られた用途しか用いることができず、飲食品用途には使用できない。

また、このようにして動物由来ではなく、植物由来素材から有機溶媒により抽出分離しても、それぞれの植物由来素材が持つ脂質、及び有機溶媒に可溶な成分が、スフィンゴ糖脂質を含めてすべて抽出されることになり、その後の有機溶媒による分離精製においても容易にスフィンゴ糖脂質の濃度を高めることは困難となっており、スフィンゴ糖脂質含有物中のスフィンゴ糖脂質含有量も少ないものとなっている。そのため、有機溶媒抽出の後に、高速クロマトグラフィーによるもの（特許文献３）、加水分解とシリカゲルクロマトグラフィーによるもの（特許文献４）などスフィンゴ糖脂質の精製法が提案されているが、製造の煩雑さや設備投資などで工業的利用には困難さがあることは避けられない。
特開平４−２８２３１７号公報 特開平１１−１９３２８３号公報 特開２００２−２９４２７４号公報 特開２００２−３００９３号公報

本発明は、このような技術の現状に鑑みなされたものであって、化粧品はもとより飲食品用にも供することのできる安全性にすぐれたしかもスフィンゴ糖脂質を高濃度に含有するスフィンゴ糖脂質含有物を効率的に工業生産する技術を新たに開発することを目的としてなされたものである。

本発明は上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者らは、安全性、飲食品への利用性の面から、動物由来でなく植物由来の素材に着目し、飲食品においてその使用が認められている溶媒を使用することとして、各方面から検討を行った。

すなわち、本発明者らは、スフィンゴ糖脂質を比較的多く含む植物由来の素材を対象として、スフィンゴ糖脂質の抽出を、有機溶媒として、食品で用いて良いとされるエタノール、アセトン、ヘキサンの３種に限定して用い、高純度のスフィンゴ糖脂質含有物の簡易な製造方法を鋭意検討した結果、エタノール抽出液を冷凍処理することにより、高純度のスフィンゴ糖脂質含有物が効率的に得られる知見を得て、本発明を完成するに至った。

本発明は、植物由来素材を有機溶媒抽出し、分離した有機溶媒溶液を冷凍処理して、スフィンゴ糖脂質含有物の沈殿を得ることにより、スフィンゴ糖脂質濃度の高い同含有物を製造する方法に関するものであって、有機溶媒としては、アルコール、特にエタノールが好適であり、本発明には、例えば次のような方法が包含される。

本発明は、例えば、乾燥した植物由来素材１重量部に対して、エタノールを２〜５重量部を加えて、５０〜６０℃にて抽出した後、固形分を分離し、得られたエタノール抽出液を零下２０℃以下に１２時間以上保存して、スフィンゴ糖脂質含有物の沈殿物を得るスフィンゴ糖脂質含有物の製造方法を包含するものである。また更に、得られたスフィンゴ糖脂質含有物の沈殿物を、エタノール液より分離し、その沈殿物をアセトン及び／又はヘキサンにより混合洗浄して、スフィンゴ糖脂質以外の脂質を除去することによる高純度のスフィンゴ糖脂質含有物の製造方法を包含するものである。

後者の具体的態様としては、次のものが例示される。すなわち、素材をエタノール処理及び冷凍処理し、得られたスフィンゴ糖脂質含有物の沈殿が含まれるエタノール含有物を、下記する（１）〜（５）の工程の少なくともひとつで処理すること、を特徴とするスフインゴ糖脂質の製造方法。
（１）固液分離して、エタノール溶液部と沈殿物を分離した後、沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とする。
（２）固液分離して、エタノール溶液部と沈殿物を分離した後、沈殿物をアセトン及び／又はヘキサンにて洗滌した後、乾燥して、固体又は粉体とする。
（３）工程（２）において、アセトン及び／又はヘキサンにて洗滌処理した後、固液分離し、分離して得た沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とする。
（４）工程（１）において得た固体又は粉体をアセトン及び／又はヘキサンにて洗滌した後、乾燥して、固体又は粉体とする
（５）工程（２）において、アセトン及び／又はヘキサンにて洗滌処理した後、固液分離し、分離して得た沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とする。

本発明に用いる原料素材は、植物由来のものであれば良く、スフィンゴ糖脂質を比較的多く含む、米糠、大豆胚芽、小麦フスマ、甜菜パルプ、醤油粕、ポテトパルプ、こんにゃくトビ粉、芋類や、脱脂後の脱脂米糠、大豆粕など一般に食用として用いられていない植物由来の副産物を対象としている。

原料素材の中で特に注目されるのは、甜菜糖製造の際多量に産生される甜菜パルプである。他の原料素材に比べ他の脂質含量が少なく、純粋なスフィンゴ糖脂質を得るのに適しており、多量に産生される副産品の利用の観点からも有利である。

甜菜由来のパルプから得られたスフィンゴ糖脂質は主にセラミド、グルコセラミド、スルファチドや更に単糖結合より糖鎖の大きい、ガングリオシド、ラクトシルセラミド、グロボシセラミド等からなるものと考えられる。例えば甜菜パルプから製造されるビートファイバーを用いると水分、粒度等が均一に保持されているため取扱は容易である。ビートファイバーは、甜菜糖製造の過程で蔗糖等可溶性成分を十分抽出除去した甜菜パルプ、つまり甜菜根を細片状に切断するかあるいは磨砕、搾汁し、次いで温湯に浸漬し、主として蔗糖よりなる可溶性成分を十分に抽出除去した残渣を、更に処理したものである。

すなわち、ビートファイバーは、甜菜パルプを脱水、脱色、脱臭、乾燥、粉砕、篩別などの必要な処理を施して得た繊維状含有物である。ビートファイバーとしては、上記した繊維状含有物であれば市販品を含めてすべてのものが使用可能であるが、５０メッシュスルー、好ましくは３０メッシュスルー、更に好ましくは１０メッシュスルーの粉末体（水分２５％以下、好ましくは１５％以下、更に好ましくは１０％（重量）以下）として使用するのが好適である。

本発明の製造方法によれば、簡単な操作で植物由来素材からスフィンゴ糖脂質を高純度で含有するスフィンゴ糖脂質含有物を得ることができ、また、食品及び化粧品用として安心なスフィンゴ糖脂質を得ることができる。

また、従来スフィンゴ糖脂質の純度が４％程度のものが市販されているが、その純度を大幅にあげたスフィンゴ糖脂質含有物を提供でき、例えば甜菜パルプ又はビートファイバーに由来し、重合した糖の糖鎖及び脂肪酸を有する基本骨格を持ち、アルコールに可溶なスフィンゴ糖脂質を提供することができ、化粧品はもとより飲食品用にも使用可能である。

以下、本発明について更に詳しく説明する。
本発明を実施するには、植物由来素材を有機溶媒で抽出する必要があるが、本発明で使用するスフィンゴ糖脂質の抽出用有機溶媒としては、アルコール、特にエタノールが好適である。エタノールは水分がない市販のものが好ましいが、回収したエタノールでも水分５％以下のものであれば使用が可能である。エタノールの添加量は、原料素材１重量部に対して１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。エタノールの添加量が少なければ、その後の操作が容易になるが、あくまでも各素材のスフィンゴ糖脂質の抽出率を高くする添加量を選ぶべきである。

抽出温度は、室温程度から７０℃、さらに望ましくは５０〜６０℃の範囲がよい。抽出時間は、１〜２４時間、望ましくは２〜５時間程度である。抽出中の攪拌などで時間を短縮でき、溶剤によって抽出時間が異なってくる。次に、抽出残渣の分離除去を行う。分離方法は特に限定されたものではなく、固液分離装置、例えば、遠心分離機、フィルタープレス、シリンダープレスなどによれば良い。

このようにして得られたエタノール抽出液は、本発明の冷凍処理を行う。冷凍処理は、冷凍温度は−２０℃以下、好ましくは−５０℃以下が好ましい。そして、その冷凍温度にてエタノール抽出液を静置状態にて６〜２４時間、好ましくは１２〜２４時間保存する。この冷凍処理により、エタノール抽出液中にスフィンゴ糖脂質を含む沈殿物が生成してくる。

表１に、各植物素材１部に対してエタノール３部を加え、６０℃、５時間抽出し、得られたエタノール抽出液を、更に凍結処理（−５０℃、１２時間）して得られた沈殿の乾燥物、及びエタノール抽出液のエバポレーターによる濃縮乾固物、重量％（対植物素材）と前記沈殿の乾燥物中及びエバポレーター濃縮乾固物中スフィンゴ糖脂質含量％を示した。なお、スフィンゴ糖脂質は後記する実施例１の方法により求めた。

注１）植物素材の粗脂肪含量％（ＡＯＡＣ法）
注２）凍結処理により得られた沈殿物の乾燥した重量％（対植物素材）
注３）凍結処理により得られた沈殿物の乾燥物中のスフィンゴ糖脂質の含量％
注４）エタノール抽出液の濃縮乾固物の重量％（対植物素材）
注５）エタノール抽出液の濃縮乾固物中のスフィンゴ糖脂質の含量％

上記結果から明らかなように、エタノール抽出液の凍結処理による沈殿物と、エタノール抽出液の濃縮乾固物を比べると、各植物素材とも、凍結処理による沈殿物の重量（％）は格段に少なくなっているにも拘わらず、スフィンゴ糖脂質の含量％（対植物素材）はほぼ同じであり、本発明のこの凍結処理が、スフィンゴ糖脂質の精製に優れていることを示している。また、従来の有機溶媒抽出後の有機溶媒除去における蒸発などの処理に比べ、製造コストは大幅に低減でき、凍結処理による沈殿物を分離すれば、本発明の目的であるスフィンゴ糖脂質含有物を得ることができる。

このようにして、エタノール抽出液の凍結処理によって沈殿を生成せしめ、これを固液分離システムによって液体（エタノール溶液部）と沈殿物に分離する。なお、本明細書においては、生成した沈殿を液体部と分離して得たものを沈殿物といい、液体部と分離しないものは単に沈殿という。

上記によって得られた凍結処理による沈殿物（すなわち、凍結処理によって生成した沈殿を分離した物）は、そのままあるいは乾燥して（固体及び／又は粉末化してもよい）スフィンゴ糖脂質含有液として提供することができる。

また、更に純度を高めたスフィンゴ糖脂質含有物を得るためには、凍結処理による沈殿物、及び／又は、これを乾燥したもの（固体あるいは所望に応じて粉末化したもの）をアセトン及び／又はヘキサン洗浄すればよい。洗浄処理は、沈殿物及び／又はその乾燥物にアセトン及び／又はヘキサンを添加、混合、攪拌した後、固液分離して液状部を除去し、その残部（沈殿物という）を取得すればよい。例えば、凍結処理による沈殿物の場合、沈殿物１重量部にアセトン及び／又はヘキサンの１〜２０重量部、好ましくは５〜１０重量部と混合攪拌して、その後液状部を除去することにより、純度を高めることができる。乾燥物の洗浄の場合も、上記した沈殿物の洗浄にならって適宜実施すればよい。

このようにして洗浄した後、沈殿物はそのままスフィンゴ糖脂質含有物として提供できるが、上記と同様にこれを乾燥して（固体及び／又は粉末化して）もよい。なお、洗浄溶媒としてアセトンとヘキサンの混液を使用する場合には、等量混合を含む１：９９〜９９：１の比率で混合した混液を使用することができる。

表２に、エタノール液凍結処理による沈殿物１重量部にアセトン８重量部を混合攪拌（アセトン洗浄）後、アセトン液を遠心分離により除去し、沈殿物のスフィンゴ糖脂質含量を測定した結果を示した。

注１）凍結処理により得られた沈殿物の乾燥した重量％（対植物素材）
注２）凍結処理により得られた沈殿物の乾燥物中のスフィンゴ糖脂質の含量％
注３）沈殿物をアセトン洗浄後の乾固物の重量％（対植物素材）
注４）沈殿物をアセトン洗浄後の乾固物中のスフィンゴ糖脂質の含量％

上記結果からも明らかなように、植物素材の小麦フスマ、脱脂米糠とも、エタノール抽出液の凍結処理により得られた沈殿物をアセトン洗浄することにより、大幅に沈殿の重量（％）が低下した。しかし、スフィンゴ糖脂質量％（対植物素材）はほぼ同じで、アセトン洗浄によりスフィンゴ糖脂質含有物の純度が高まったことが示される。

また、本発明で得られたスフィンゴ糖脂質含有物は、そのまま、スプレードライ、凍結乾燥などの方法により、固形化、粉末化して用いることが出来る。本発明によれば、スフィンゴ糖脂質含有量が高いスフィンゴ糖脂質含有物質を得ることができ、例えば原料として甜菜パルプ及び／又はビートファイバーを使用した場合には、３０％以上のスフィンゴ糖脂質含有物を得ることができ、５０％以上の高含有物も得ることができる。

本発明においては、食品添加物として認可されている有機溶媒（エタノール、アセトン、ヘキサン）のみを用いて、エタノール抽出液の凍結処理（沈殿物の取得）、アセトン及び／又はヘキサンによる洗浄処理を行うことにより、容易に食用の高純度スフィンゴ糖脂質含有物を得ることを見出し、本発明を完成させた。また、スフィンゴ糖脂質含有物のスフィンゴ糖脂質純度を更に上げるためには、クロマトグラフィー等の処理を施せばよい。

クロマトグラフィー処理は、常法にしたがって行えばよく、例えばクロマト分離法としては、その分離装置は固定床方式（ワンパス方式）、連続方式（疑似移動床方式）、半連続方式（固定床方式と連続方式の組合）が適用できる。その装置の充填イオン交換樹脂としては、クロマト用のＮａ形、Ｋ形、Ｃａ形等の強酸性イオン交換樹脂が使用される。その樹脂は均一粒径のスチレンジビニルベンゼン系樹脂等が用いられる。イオン交換樹脂のメーカーから種々のクロマト用樹脂が販売されているので、適宜選択してクロマト処理すればよい。

以下、本発明を実施例を用いて説明するが、まず、以下の実施例に用いた測定装置、測定方法について説明する。

（１）測定装置
シリカゲル薄層クロマトグラフィープレート：メルク社製Ｓｉｌｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４タイプ層厚０．５ｍｍ、デンシトメーター：島津製作所製ＣＳ−９３００ＰＣ

（２）測定方法
スフィンゴ糖脂質成分の確認及び定量：試薬グルコトルセラミド標準品のクロロホルム−メタノール混液（２：１）溶液とともに、抽出物のクロロホルム−メタノール混液（２：１）溶液をシリカゲルの薄層クロマトグラフィープレートにスポットし、クロロホルム−メタノール−水混合溶媒（６５：２５：４）で展開した。アンスロン液噴霧加熱により、標準品と同じＲｆ値のものをスフィンゴ糖脂質のスポットとした。また、スフィンゴ糖脂質の定量は、シグマ社製試薬を標準品として、その濃度の違いによる薄層クロマトグラフの発色強度をデンシトメーターにより検量線を作成し、当該サンプルの発色強度を測定後、検量線より、スフィンゴ糖脂質量を計算により求めた。

小麦フスマ１ｋｇを密閉式攪拌槽に投入し、そこにエタノール２Ｌを加え、６０℃で５時間攪拌した。その後、吸引ろ過により抽出液と残渣を分離した。エタノール抽出液は冷凍庫（一５０℃）にて１２時間保存した。冷凍処理により得たエタノール抽出液中の沈殿物は遠心分離にて分取し、減圧乾燥機（５０℃）にて乾燥して褐色の蝋状乾固物３８．２ｇを得た

また、比較として小麦フスマ１ｋｇを、同様の処理でエタノール抽出液を得、ロータリーエバポレーターにて濃縮乾固し、褐色の蝋状乾固物７３．２ｇを得た。これらの乾固物を上記測定法に基づき、スフィンゴ糖脂質類の存在確認と定量を行った。結果を表３に示す。

表３の結果から明らかなように、小麦フスマからエタノール抽出して得られたエタノール抽出液を、凍結処理して沈殿の乾固物は、スフィンゴ糖脂質含量が２．４６％と、エタノール抽出液を直接濃縮して得られた乾固物１．３０％と比べ格段に純度が上昇した。すなわち、エタノール抽出液中のスフィンゴ糖脂質以外の脂質、及びエタノールに可溶な成分のかなりの部分が、冷凍処理による沈殿へ移行していないことが判明される。

実施例２で得られた乾固物（冷凍沈殿、濃縮乾固）を各３０ｇをとり、アセトン２００ｍｌと攪拌混合後、不溶物を遠心分離して遠心分離にて分取し、減圧乾燥機（５０℃）にて乾燥して白褐色の粉末乾固物６．３９ｇ、及び４．８１ｇを得た。これらの粉末乾固物を上記測定法に基づき、スフィンゴ糖脂質類の存在確認と定量を行った。結果を表４に示す。

表４の結果から明らかなように、本発明の冷凍処理によって得られた沈殿物をアセトン洗浄することにより、実施例１よりも更に純度が１１、４％と高いスフィンゴ糖脂質含有物が得られた。また、エタノール抽出液を直接濃縮して得た乾固物をアセトン洗浄した乾固物より、回収率、及び純度で勝っていた。

大豆粕１ｋｇ、およびこんにゃくトビ粉１ｋｇを各々を密閉式攪拌槽に投入し、そこにエタノール２．５Ｌを加え、６０℃で６時間攪拌した。その後、吸引ろ過により抽出液と残渣を分離した。エタノール抽出液は冷凍庫（−５０℃）にて１２時間保存した。冷凍処理により得たエタノール抽出液中の沈殿物は遠心分離にて分取し、沈殿物１４．２ｇ、および３．１８ｇ（固形分換算値）を得た。この各々の沈殿物にアセトン１００ｍｌを加え攪拌混合後、不溶物を遠心分離にて分取し、減圧乾燥機（５０℃）にて乾燥して白褐色の粉末乾固物５．２３ｇ、および１．９１ｇを得た。この各々の粉末乾固物を上記測定法に基づき、スフィンゴ糖脂質類の存在確認と定量を行った。結果を表５に示す。

表５から明らかなように、大豆粕、およびこんにゃくトビ粉を本発明の冷凍処理、及び有機溶媒洗浄することにより、スフィンゴ糖脂質含量が１３．３％、および３０．１％と高純度のスフィンゴ糖脂質含有物が得られた。

甜菜パルプ１ｋｇを各々密閉式攪拌槽に投入し、そこにエタノール２．５Ｌを加え、６０℃で６時間攪拌した。その後、吸引ろ過により抽出液と残渣を分離した。エタノール抽出液は冷凍庫（−５０℃）にて１２時間保存した。冷凍処理により得たエタノール抽出液中の沈殿物は遠心分離にて分取し、沈殿物３．７ｇ（固形分換算値）を得た。この沈殿物にアセトン１００ｍｌを加え攪拌混合後、不溶物を遠心分離にて分取し、減圧乾燥機（５０℃）にて乾燥して白褐色の粉末乾固物２．１ｇを得た。この粉末乾固物を上記測定法に基づき、スフィンゴ糖脂質類の存在確認と定量を行った。結果を表６に示す。

甜菜パルプは、表２の小麦フスマ、脱脂米糠、及び、実施例４の大豆粕と較べ、エタノール抽出による濃縮物は少ないが、その後のアセトン洗浄では小麦フスマ等の素材と同様の濃縮物収量があり、またその濃縮物中のスフィンゴ糖脂質含量は５２．６％と際だって高いものであった。この表６に示された如く、甜菜パルプは、有機溶媒抽出でのスフィンゴ糖脂質以外の不純物が極めて少なく、また一般に抽出に用いられている食品添加物の有機溶媒（エタノール、アセトン、ヘキサン）にて、簡単な抽出・分離方法により５０％以上の高純度のスフィンゴ糖脂質含有物を得ることが出来る植物由来の素材である。

また、甜菜パルプの原料である甜菜（ビート）は、アレルギー表示の特定原材料ではなく、また遺伝子組替えとは無縁の植物であるため、甜菜パルプからのスフィンゴ糖脂質は安全性が高いものといえる。

また、得られたスフィンゴ糖脂質含有物は、液状（溶解状、懸濁状）又はスプレードライ、凍結乾燥などの方法により、固形化、粉末化して用いることが出来る。

スフィンゴ糖脂質は、肌荒れ、皮膚老化防止、アトピー皮膚炎等に効果的とされているばかりではなく食品への利用技術も多数報告されている。例えば、血圧上昇抑制剤、リパーゼ阻害剤、免疫機能活性剤、加熱調理用油脂組成物、ガン細胞増殖抑制剤、界面活性剤等の利用が考えられる。本発明は、甜菜糖製造課程で多量に産出される副産物である甜菜パルプから簡単な操作で多量にスフィンゴ糖脂質含有物を工業的に製造できるものであり、社会に大きく貢献できるものである。

Claims (6)

1. 甜菜パルプをエタノール抽出し、分離したエタノール溶液を零下２０℃以下に１２時間以上保存する冷凍処理をして、スフィンゴ糖脂質含有物の沈殿を得て、その沈殿物又はこれを乾燥したものをアセトン洗浄処理すること、を特徴とするスフィンゴ糖脂質含有量が３０％以上の甜菜パルプ由来スフィンゴ糖脂質含有物の多量製造方法。
2. 冷凍処理が、零下５０℃以下に１２時間以上保存し、スフィンゴ糖脂質含有物の沈殿を得ることを特徴とする請求項１に記載のスフィンゴ糖脂質含有物の多量製造方法。
3. 請求項１又は２に記載のアセトン洗浄処理が、下記する（１）〜（３）の工程の少なくともひとつであること、を特徴とするスフィンゴ糖脂質含有物の多量製造方法。
   （１）固液分離して、エタノール溶液部と沈殿物を分離した後、沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とし、これをアセトンにて洗浄した後、乾燥して、固体又は粉体とする。
   （２）固液分離して、エタノール溶液部と沈殿物を分離した後、沈殿物をアセトンにて洗浄した後、乾燥して、固体又は粉体とする。
   （３）工程（２）において、洗浄処理した後、固液分離し、分離して得た沈殿物を乾燥して、固体又は粉体とする。
4. 固液分離が遠心分離であること、を特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 甜菜パルプが水分１０％（重量）以下のビートファイバーであること、を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. スフィンゴ糖脂質含有量が５０％以上のスフィンゴ糖脂質含有物を製造すること、を特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。