JP4551041B2 - 有用ポリペプチド - Google Patents

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Description

技術分野
本発明は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドを有効成分として含有する糖鎖合成剤、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する炎症、癌または癌転移検出剤、該ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を利用した該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドを用いた糖鎖または複合糖質の製造法、該形質転換体を利用した糖鎖または複合糖質の製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡより得られるオリゴヌクレオチドを用いた炎症、癌または癌転移の検出法、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いた免疫組織染色法、該抗体を含有する免疫組織染色剤、炎症、癌または癌転移の診断薬、該ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる化合物のスクリーニング法、該遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法、該遺伝子の転写を司るプロモーターＤＮＡ、該プロモーターＤＮＡによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング法、これらのスクリーニング法により得られる化合物、および該遺伝子を欠損または変異させたノックアウト動物等に関する。
背景技術
糖鎖は、発生・分化、細胞認識といった生命現象に関与しているほか、炎症、癌、感染症、自己免疫疾患、およびその他多くの病気の発生、進行に深く関係していると考えられている〔Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．，Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９２）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３，９７（１９９３）〕。
糖鎖は、タンパク質や脂質に付加して、糖タンパク質、プロテオグリカン、または糖脂質として存在するほか、オリゴ糖としても存在する。
Ｇａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３−結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性を有する酵素で、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖の合成に関与する。ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖は、糖タンパク質のＮ−グリコシド結合型糖鎖やＯ−グリコシド結合型糖鎖中に存在するほか、ネオラクト系やラクト系の糖脂質の糖鎖中やオリゴ糖中にも存在する。
Ｇａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素に関しては、これまでに部分精製の報告がある〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１１８（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１２４６１（１９８８）、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ．，４２，７７（１９８９）〕。また、これまでに２種のＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の遺伝子がクローン化されている〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，１４２９４（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，４０６（１９９９）〕。さらに別のＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が存在するかどうかについては明らかになっていない。
ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖は非常にたくさん存在することから、Ｇａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素に関しては、受容基質特異性や発現組織が異なる複数の酵素が存在し、それぞれ別の機能を担っている可能性が高いと考えられる。従って、これまでにクローン化された２種の酵素とは異なるＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素をクローン化し、受容基質特異性や発現分布を調べ、生物学的機能や疾患との関係を明らかにすることは重要な課題である。
ヒトの乳中にはラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）やラクト−Ｎ−テトラオース（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、あるいはそれらを母核とする構造を有する様々なオリゴ糖が存在することが知られている〔Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ，８２，９０３（１９９３）〕。該オリゴ糖は共通してＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有している。また、該オリゴ糖の中にはポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を有するオリゴ糖も含まれる。これらのオリゴ糖には、乳児がウイルスや微生物に感染するのを防ぐ働きや、毒素を中和する働きがあると考えられている。また、善玉の腸内細菌であるビフィズス菌の増殖を促す活性もある。
ヒトの乳中に含まれる上記オリゴ糖、あるいはそれらが含まれたミルクを効率よく生産することができれば、産業上非常に有用と思われる。ヒトの乳中に含まれる上記オリゴ糖の合成に関与するＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の遺伝子が取得できれば、上記オリゴ糖の効率的な合成に使用可能と考えられるが、該酵素は明らかになっていない。
多数存在するＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖の中で、特にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、多くの機能性糖鎖（セレクチンリガンド糖鎖、微生物やウイルスの受容体糖鎖、ＳＳＥＡ−１糖鎖、癌関連糖鎖など）の骨格糖鎖となっており、胚発生、細胞分化、あるいは炎症や癌などの疾患と深く関わっている。
それぞれの場面で機能しているポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は異なる可能性があるため、これまでにクローン化された２種の酵素とは異なるＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素をクローン化し、受容基質特異性や発現分布などからそれぞれの酵素の機能を推定することは重要な課題である。
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、ＧｌｃＮＡｃ β１，４−ガラクトース転移酵素とＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が交互に働くことにより合成される。β１，４−ガラクトース転移酵素に関しては、これまでに４種類の酵素（β４Ｇａｌ−Ｔ１、β４Ｇａｌ−Ｔ２、β４Ｇａｌ−Ｔ３、β４Ｇａｌ−Ｔ４）の遺伝子がクローン化され、それぞれの酵素の受容基質特異性が解析されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，３１９７９（１９９７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２９３３１（１９９７）〕。
従って、ＧｌｃＮＡｃ β１，４−ガラクトース転移酵素とＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を合成することができる。また、ＧｌｃＮＡｃ β１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子とＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を細胞中で共発現することにより、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖あるいは該糖鎖が付加した複合糖質を生産することができる。
ＧｌｃＮＡｃ β１，４−ガラクトース転移酵素はほとんどの細胞で発現しているため、Ｇａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子単独を細胞中で発現することによっても、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖あるいは該糖鎖が付加した糖質を生産することができる。
癌細胞では、対応する正常細胞に比較して、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を多く発現することが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１０８３４（１９８４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１０７７２（１９８６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１７７２（１９９１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，５７００（１９９２）〕。
シアリルルイスｘ糖鎖を有するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖は、セレクチンのアンタゴニストとして、抗炎症効果あるいは癌転移抑制効果を有する医薬品となることが期待される。
これらのオリゴ糖のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖部分の合成には、部分精製されたβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が利用されたが、この酵素の供給が律速となり、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を多量に合成することは難しい〔Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，７，４５３（１９９７）〕。
一方、化学合成によってもポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を合成可能であるが、その合成は非常に煩雑なステップを必要とする〔Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒ，２４，５２２３（１９９７）〕。
以上のことより、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の効率良い合成法が求められている。これまでにクローン化された２種のＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素や該酵素遺伝子を利用することもできるが、目的に応じて基質特異性や機能の異なる別のＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素や該酵素遺伝子を用いた方が効率がよい場合があると考えられる。
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖はタンパク質の安定化に寄与している〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，２０４７６（１９９０）〕ことから、任意のタンパク質に人為的にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を付加することにより、タンパク質を安定化できると考えられる。また、血中タンパク質の腎臓からのクリアランス速度は、タンパク質の実効分子量が大きいほど遅くなることから、任意のタンパク質に人為的にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を付加し、実効分子量を増加させることにより、腎臓からのクリアランス速度を低下させ、血中安定性を増加させることができると考えられる。さらに、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を付加することにより、任意のタンパク質を特定の細胞にターゲティングできる可能性もある。ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成能を増加させた例としては、以下に示した例があげられる。
Ｆ９細胞をレチノイン酸で処理した場合や、Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３細胞をＴＧＦ−βで処理した場合に、細胞の膜結合糖タンパク質の糖鎖にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付加することが示されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，１２４２（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２２１，３３０（１９９４）〕。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＮ−ｒａｓプロトオンコジーンを発現させると、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ１，４−ガラクトース転移酵素とβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の活性が増加し、膜タンパク質のＮ−結合型糖鎖中のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖量が増加することが示されている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２１６７４（１９９１）〕。
Ｔ細胞株ＥＬ−４中でコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子を発現させると、細胞表面の膜タンパク質であるＣＤ４３、ＣＤ４５、またはＣＤ４４の分子量が増加する〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１８７３２（１９９６）〕。これは、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素により合成された糖鎖が、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素のよい基質となるためと考えられる。
また、ＨＬ−６０細胞を２７℃で培養すると、ｌａｍｐ−１またはｌａｍｐ−２に付加するポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の量が増加することが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，２３１８５（１９９１）〕。
しかし、組換え糖タンパク質の生産に適した宿主細胞（例えばＮａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ＣＨＯ細胞など）において、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の付加された組換え糖蛋白質を効率よく生産させることに関してはこれまでに報告されていない。従って、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の付加された組換え糖蛋白質を効率よく生産することのできる方法の開発は、産業上重要な課題である。
炎症反応と癌転移の機構を考慮すると、白血球や癌細胞上のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現を抑制することによって、炎症反応を抑制したり癌転移を防止できることが期待される。白血球や癌細胞においてポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与しているＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の遺伝子が取得できれば、該遺伝子の発現を抑制することにより、白血球や癌細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現を抑制できる可能性がある。
また、白血球や癌細胞においてポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与しているＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の遺伝子が取得できれば、該遺伝子の発現量を調べたり、該遺伝子がコードするタンパク質の発現量を調べることにより、炎症性疾患や癌の悪性度を診断できる可能性がある。
特定の白血球や癌細胞においてポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与しているＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は異なることが考えられるため、これまでにクローン化された酵素とは異なる酵素をクローン化して調べる必要がある。
細胞や組織の抽出液を酵素源とした酵素学的解析では、複数のＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を発現している細胞や組織において発現しているＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の各々を特定すること、ならびにそれらのＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の各々についての酵素学的特性を明らかにすることはできない。
特定のＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の発現を検出するためには、特異的抗体を用いた免疫的検出法か、遺伝子の塩基配列に基づいた検出法（例えばノーザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法）を用いる必要がある。従って、これまでにクローン化された２種の酵素とは異なるＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素をクローン化し、発現を比較する必要がある。
発明の開示
本発明の課題は、新規なＧａｌ β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドを利用し、抗炎症、抗感染症、癌転移抑制等の医薬品、乳製品等の食品、および、タンパク質の改善法、炎症性疾患や癌の悪性度の診断法を提供することにある。
本発明は、以下の（１）〜（６２）に関する。
（１） 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）からなる群より選ばれるポリペプチドであり、かつポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドを有効成分として含有する、糖鎖合成剤。
（ａ） 配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ） 配列番号１記載のアミノ酸配列の４１番目から３９７番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｃ） 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ） 配列番号２記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｅ） 配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ） 配列番号３記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｇ） 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ） 配列番号４記載のアミノ酸配列の６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（２） ポリペプチドが、上記（１）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドである、上記（１）の糖鎖合成剤。
（３） ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性が、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性である、上記（１）または（２）の糖鎖合成剤。
（４） 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）からなる群より選ばれるポリペプチド。
（ａ） 配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ） 配列番号３記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｃ） 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ） 配列番号４記載のアミノ酸配列の６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（５） 配列番号４記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド。
（６） 以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドであり、かつポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド。
（ａ） 配列番号１記載のアミノ酸配列の４１番目から３９７番目のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１記載のアミノ酸配列の１番目から３３番目のアミノ酸配列を含まないポリペプチド。
（ｂ） 配列番号２記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含まないポリペプチド。
（７） ポリペプチドが、上記（６）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチド。
（８） ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性が、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性である、上記（４）〜（７）いずれか１つに記載のポリペプチド。
（９） ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である上記（８）のポリペプチド。
（１０） β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が、ｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）またはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミンまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミンまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である上記（８）または（９）のポリペプチド。
（１１） 以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）からなる群より選ばれるポリペプチドであり、かつポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有する糖転移酵素。
（ａ） 配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ） 配列番号１記載のアミノ酸配列の４１番目から３９７番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｃ） 配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ） 配列番号２記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｅ） 配列番号３記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｆ） 配列番号３記載のアミノ酸配列の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（ｇ） 配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｈ） 配列番号４記載のアミノ酸配列の６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（１２） ポリペプチドが、上記（１１）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与する活性を有するポリペプチドである、上記（１１）の糖転移酵素。
（１３） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１４） 配列番号７または８記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（１５） 配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１６） 上記（１３）〜（１５）いずれか１つのＤＮＡを含有する、炎症、癌または癌転移検出剤。
（１７） 上記（１３）〜（１５）いずれか１つのＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（１８） 組換え体ＤＮＡが、プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ４−２、ｐＡＭｏ−Ｇ７、ｐＡＭｏＦ２−Ｇ４、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４、ｐＢＳ−Ｇ４−２およびｐＴ７Ｂ−Ｇ７からなる群より選ばれるプラスミドである、上記（１７）の組換え体ＤＮＡ。
（１９） 上記（１７）または（１８）の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（２０） 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、非ヒトトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物からなる群から選ばれる形質転換体である、上記（１９）の形質転換体。
（２１） 微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である、上記（２０）の形質転換体。
（２２） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＭ２９４／ｐＢＳ−Ｇ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９４）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＭ２９４／ｐＢＳ−Ｇ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９５）、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＭ２９４／ｐＴ７Ｂ−Ｇ７（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６９６）。
（２３） 動物細胞が、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞およびヒト白血病細胞からなる群から選ばれる動物細胞である、上記（２０）の形質転換体。
（２４） 昆虫細胞が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞およびカイコの卵巣細胞からなる群から選ばれる昆虫細胞である、上記（２０）の形質転換体。
（２５） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該ポリペプチドを該培養物中に生成・蓄積させ、該培養物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（２６） 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞からなる群から選ばれる形質転換体である、上記（２５）の製造法。
（２７） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（２８） 生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、上記（２７）の製造法。
（２９） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（３０） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写・翻訳系により該ポリペプチドを合成することを特徴とする、該ポリペプチドの製造法。
（３１） 上記（１）または（２）の糖鎖合成剤を酵素源として用い、
（ａ）該酵素源、
（ｂ）ｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質、および
（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンが付与された糖鎖または複合糖質を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
（３２） 上記（３１）の方法により得られるＮ−アセチルグルコサミンが付与された反応産物を受容基質として用い、
（ａ）該受容基質、
（ｂ）ＧｌｃＮＡｃ β１，４−ガラクトース転移酵素、および
（ｃ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基にβ１，４結合でガラクトースが付与された糖鎖または複合糖質を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該ガラクトースが付与された糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該ガラクトースが付与された糖鎖または複合糖質の製造法。
（３３） 上記（１）または（２）の糖鎖合成剤を酵素源として用い、
（ａ）該酵素源、
（ｂ）ＧｌｃＮＡｃ β１，４−ガラクトース転移酵素、
（ｃ）ｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、ｉｉｉ）Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質、およびｉｖ）上記（３１）または（３２）の方法により得られる反応産物からなる群より選ばれる受容基質、
（ｄ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルラクトサミン、および
（ｅ）ウリジン−５’−二リン酸ガラクトースを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質の非還元末端にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された糖鎖または複合糖質を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付与された該糖鎖または複合糖質の製造法。
（３４） 上記（１）または（２）の糖鎖合成剤の有効成分であるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中に、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有する糖、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有しｎが１以上である糖、および（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
（３５） 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞である、上記（３４）の製造法。
（３６） 上記（１）または（２）の糖鎖合成剤の有効成分であるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有する糖、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有しｎが１以上である糖、および（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
（３７） 上記（１）または（２）の糖鎖合成剤の有効成分であるポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有する糖、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造を有しｎが１以上である糖、および（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
（３８） 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、およびステロイド化合物等に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、上記（３１）〜（３７）のいずれか１つに記載の製造法。
（３９） 生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、上記（３６）の製造法。
（４０） 上記（１３）〜（１５）いずれか１つのＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により、配列番号１〜４いずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
（４１） 配列番号８記載の塩基配列を有するＤＮＡの連続した６〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド。
（４２） オリゴヌクレオチドの誘導体が、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド誘導体である、上記（４１）のオリゴヌクレオチド。
（４３） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの有する塩基配列の連続した６〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチドを用い、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法により、上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現量を定量する方法。
（４４） 上記（４０）または（４３）の方法を用いた、炎症、癌または癌転移の検出法。
（４５） 上記（１３）〜（１５）いずれか１つのＤＮＡの有する塩基配列の連続した６〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチドを用い、上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写またはｍＲＮＡの翻訳を抑制する方法。
（４６） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの有する塩基配列の連続した６〜６０塩基と同じ配列を有するオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導体から選ばれるオリゴヌクレオチド。
（４７） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドを認識する抗体。
（４８） 上記（４８）の抗体を用いる、上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドの免疫学的検出法。
（４９） 上記（４７）の抗体を用い、上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドを検出することを特徴とする、免疫組織染色法。
（５０） 上記（４７）の抗体を含有する、免疫組織染色剤。
（５１） 上記（４７）の抗体を含有する、炎症、癌または癌転移の診断薬。
（５２） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる化合物のスクリーニング法。
（５３） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体またはレクチンを用い、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
（５４） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、上記（４７）の抗体を用い、該ポリペプチド含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
（５５） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする遺伝子の転写を司るプロモーターＤＮＡ。
（５６） プロモーターＤＮＡが、白血球細胞、小腸細胞、大腸細胞、膵臓細胞、胃細胞、大腸癌細胞、膵癌細胞および胃癌細胞から選ばれる細胞で機能しているプロモーターである、上記（５５）のプロモーターＤＮＡ。
（５７） プロモーターＤＮＡが、ヒトまたはマウス由来のプロモーターＤＮＡである、上記（５５）または（５６）のプロモーターＤＮＡ。
（５８） 上記（５５）〜（５７）のいずれか１つに記載のプロモーターＤＮＡおよび該プロモーターＤＮＡの下流に連結させたレポーター遺伝子を含有するプラスミドを用いて動物細胞を形質転換し、該形質転換体と被検試料とを接触させ、該レポーター遺伝子の翻訳産物の含量を測定することを特徴とする、該プロモーターによる転写の効率を変動させる化合物のスクリーニング法。
（５９） レポーター遺伝子が、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子より選ばれる遺伝子である、上記（５８）のスクリーニング法。
（６０） 上記（５２）〜（５４）、（５８）および（５９）のいずれか１つに記載のスクリーニング法により得られる化合物。
（６１） 上記（４）〜（１０）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡを欠損または変異させたノックアウト非ヒト動物。
（６２） ノックアウト非ヒト動物がマウスである、上記（６１）のノックアウト非ヒト動物。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）ＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１）のホモログ蛋白質をコードするＤＮＡの取得、ならびに該ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドの製造
β３Ｇａｌ−Ｔ１（別名ＷＭ１）はＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造の合成に関与するＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素である〔特開平６−１８１７５９〕。遺伝子データベースから、Ｂｌａｓｔ〔Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０）〕、ＦｒａｍｅＳｅａｒｃｈ法〔Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社製〕等のプログラムを利用して、本酵素遺伝子と相同性のある遺伝子または本酵素とアミノ酸レベルで相同性を有する蛋白質をコードする可能性のある遺伝子を検索する。データベースとしてはＧｅｎＢａｎｋ等の公的なデータベースを利用することもできるし、私的なデータベースも利用できる。各種臓器または各種細胞から調製した一本鎖ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型にして、該当する配列に特異的なプライマーを用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；以下、ＰＣＲと略記する）〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）およびＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕を行うことにより、該当する配列を有するＤＮＡの存在を検出することができる。また、同様にして該当する配列を有するＤＮＡ断片を取得することができる。
得られたＤＮＡ断片が不完全長の場合は、以下のようにしてその全長ｃＤＮＡを得ることができる。
上記で取得したＤＮＡ断片をプローブとして、該ＤＮＡが存在することが確認された臓器または細胞由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、全長ｃＤＮＡを取得することができる。
また、該ＤＮＡが存在することが確認された一本鎖ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、５’ＲＡＣＥ法と３’ＲＡＣＥ法を行うことにより、該当する配列を有するｃＤＮＡの５’末端側の断片と３’末端側の断片を取得することができる。両断片を連結することにより、全長ｃＤＮＡを取得できる。
各種臓器または各種細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡは、常法または市販されているキットに従って調製することができる。一例を以下に示す。
各種臓器または各種細胞から酸グアニジウム チオシアネート フェノール−クロロホルム法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６（１９８７）〕により全ＲＮＡを抽出する。必要に応じて、全ＲＮＡをデオキシリボヌクレアーゼＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理し、混入の可能性がある染色体ＤＮＡを分解する。得られた全ＲＮＡ各々について、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを用いてＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により一本鎖ｃＤＮＡを合成する。一本鎖ｃＤＮＡとしては、例えばヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣから上記の方法で作製した一本鎖ｃＤＭＡをあげることができる。
ｃＤＮＡライブラリーは常法により作製することができる。ｃＤＮＡライブラリー作製法としては、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ１：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えばスーパースクリプト・プラスミド・システム・フォー・ｃＤＮＡ・シンセシス・アンド・プラスミド・クローニング〔ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製〕やザップ−ｃＤＮＡ・シンセシス・キット〔ＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製〕を用いる方法等があげられる。各種臓器または各種細胞由来のｃＤＮＡライブラリーは、市販されているものを購入することによっても入手できる。
ｃＤＮＡライブラリーを作製するための、クローニングベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、ｐＢｌｕｅ ＩＩ ＳＫ（＋）〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、λｚａｐＩＩ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、λｇｔ１０〔ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λＴｒｉｐｌＥｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＴ７Ｔ３１８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２〔Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）〕、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕等をあげることができる。
宿主微生物としては、大腸菌に属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｙ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＯＬＲＴＭＳｔｒａｉｎ〔ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社より市販〕およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＬＥ３９２（モレキュラー・クローニング第２版）等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーとして、例えば以下のようにして作製したｃＤＮＡライブラリーをあげることができる。
ヒト胃粘膜のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡよりｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、その両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＳａｌＩ ａｄａｐｔｏｒ（Ｓｕｐｅｒ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を付加した後、クローニングベクターλＺＡＰ ＩＩ（λＺＡＰ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇを行うことにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。また、市販のｃＤＮＡライブラリーを購入して使用することもできる。
データベース検索で明らかになった候補遺伝子の塩基配列を基に、該遺伝子に特異的なプライマーを設計し、上記のようにして取得した一本鎖ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行う。増幅断片が得られた際には、該断片を適当なプラスミドにサブクローニングする。サブクローニングは、増幅ＤＮＡ断片をそのまま、あるいは制限酵素やＤＮＡポリメラーゼで処理後、常法によりベクターに組み込むことにより行うことができる。ベクターとしては、ｐＢｌｕｅ ＳＫ（−）、ｐＢｌｕｅ ＩＩ ＳＫ（＋）（いずれもＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，６０６９（１９９０）〕、ｐＣＲ−Ａｍｐ ＳＫ（＋）〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，６２６４（１９９２）〕、ｐＴ７Ｂｌｕｅ〔Ｎｏｖａｇｅｎ社製〕、ｐＣＲ ＩＩ〔Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，６５７（１９９１）〕、ｐＣＲ−ＴＲＡＰ〔Ｇｅｎｅｈｕｎｔｅｒ社製〕、ｐＮｏＴＡＴ７（５’→３’社製）などをあげることができる。
サブクローン化されたＰＣＲ増幅断片の塩基配列を決定することにより、目的のＤＮＡ断片が取得されたか確認する。塩基配列は、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製〕等の塩基配列分析装置を用いて決定することができる。
上記で作製したｃＤＮＡライブラリーに対して、該ＤＮＡ断片をプローブとしてコロニーハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング 第２版）を行うことにより、β３Ｇａｌ−Ｔ１とアミノ酸レベルで相同性を有する蛋白質をコードする可能性のあるｃＤＮＡを取得することができる。プローブとしては、該ＤＮＡ断片をアイソトープあるいはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）標識したものを使用することができる。
上記の方法により取得されたＤＮＡの塩基配列は、該ＤＮＡ断片をそのままあるいは適当な制限酵素等で切断後、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー〔ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製〕等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより決定することができる。
該方法により取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号１、２、３または４で表されるポリペプチドをコードするＤＮＡ等をあげることができ、具体的には、配列番号５、６、７または８で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。配列番号５のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、ｐＡＭｏ−Ｇ３、ｐＢＳ−Ｇ３をあげることができる。配列番号６のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、ｐＡＭｏ−Ｇ４、ｐＢＳ−Ｇ４をあげることができる。配列番号７のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、ｐＡＭｏ−Ｇ４−２、ｐＢＳ−Ｇ４−２をあげることができる。配列番号８のＤＮＡを含むプラスミドとしては、例えば、ｐＡＭｏ−Ｇ７、ｐＴ７Ｂ−Ｇ７をあげることができる。
また、上記方法で取得したＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択することにより、配列番号１、２、３または４記載のアミノ酸配列と比較して、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする目的のＤＮＡを取得することができる。例えば、他種（マウス、ラット、ウシ、サルなど）由来のｃＤＮＡライブラリーに対してスクリーニングを行うことにより、目的のＤＮＡを取得することができる。
該ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、上記で取得し、たＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第２版、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３−９８（１９９０）〕等を用いて計算したときに、上記で取得したＤＮＡと少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
該１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする目的のＤＮＡの取得は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより行うことができる。欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、公知のポリペプチドとならない範囲に限定され、１個から数十個、特に１個から数個のアミノ酸であることが好ましい。また、本発明のポリペプチドがβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するためには、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、例えば配列番号１記載のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
決定された新規糖転移酵素ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても目的のＤＮＡを調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２等を用いて行うことができる。
また、後述のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用い、これらＤＮＡに相補的なｍＲＮＡを発現している細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことによっても、目的とするＤＮＡを調製することができる。
上述の方法で取得した本発明のＤＮＡおよびＤＮＡ断片を用いて、モレキュラー・クローニング第２版等に記載の常法により、あるいは該ＤＮＡの塩基配列情報よりＤＮＡ合成機により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができ、具体的には、配列番号５、６、７または８で表される塩基配列中の連続した５〜６０塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡをあげることができる。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記記載のオリゴヌクレオチドが好ましい。具体的には配列番号９から２０等に示された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをあげることができる。
更に、これらオリゴヌクレオチドの誘導体（以下、オリゴヌクレオチド誘導体という）も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。
該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる〔細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕。
（２）取得ＤＮＡのコードするポリペプチドの活性測定
上記のようにして取得したＤＮＡを発現ベクターに組み込んで発現プラスミドを構築する。該プラスミドを適当な動物細胞に導入後、各種の糖鎖（ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖、シアリルルイスａ糖鎖、シアリルルイスｃ糖鎖）に特異的に結合する抗体やレクチンを用いたフルオレッセンス・アクティベーテッド・セル・ソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ；以下、ＦＡＣＳと略記する）解析により、該ＤＮＡが該糖鎖の合成に関与するかどうかを調べることができる。
該発現ベクターとしては、該ｃＤＮＡを組み込んで動物細胞で発現できるベクターであればいかなるものでも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＳＡ（特開平０５−３３６９６３）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）等を用いることができる。
ｃＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを、目的とするｃＤＮＡを選択可能な動物細胞に導入し、形質転換細胞を取得する。
該発現ベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等の方法をあげることができる。
動物細胞としては、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞のサブラインであるＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、２９３細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）をあげることができ、好ましくは、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞をあげることができる。
得られた形質転換細胞を常法により培養する。
具体的には、以下の形質転換体の培養方法をあげることができる。
該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
該培養により得られた形質転換細胞を、各種の糖鎖（ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖、シアリルルイスａ糖鎖、シアリルルイスｃ糖鎖）に特異的に結合する抗体やレクチンを用いて蛍光染色した後、ＦＡＣＳを用いて解析する。コントロールプラスミドを導入した形質転換細胞と比較して、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖量が増加していれば、該ＤＮＡのコードする新規ポリペプチドは、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有していると考えることができる。一方、シアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖量が増加していれば、該ＤＮＡのコードする新規ポリペプチドは、シアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖の合成に関与するβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を有していると考えることができる。
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体やレクチンとしては、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識するものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体としては抗ｉ抗体、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識するレクチンとしてはｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ（ＰＷＭと略す）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（ｔｏｍａｔｏ）ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＬＥＡと略す）、Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＤＳＡと略す）を用いることができる〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２，８１７９（１９８７）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，６２５３（１９８４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，１６０２（１９８７）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１２０，１８７（１９８３）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，１２０，２８３−２９２（１９８３）、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．７，３２３（１９９０）〕。
抗シアリルルイスａ糖鎖抗体または抗シアリルルイスｃ糖鎖抗体としては、シアリルルイスａ糖鎖またはシアリルルイスｃ糖鎖と反応する抗体であれば、いかなるものでも用いることができ、例えば、抗シアリルルイスａ糖鎖抗体である１９−９（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ社製）やＫＭ２３１（Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｅｘ社製）、あるいは抗シアリルルイスｃ糖鎖抗体であるＤＵ−ＰＡＮ−２（Ｋｙｏｗａ Ｍｅｄｅｘ社製）をあげることができる。
また、上記形質転換細胞の細胞抽出液を用いて、公知の測定法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１１８（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１２４６１（１９８８）、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ，４２，７７（１９８９）〕に準じてβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を測定することができる。コントロールプラスミドを導入した形質転換細胞に比較して、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が増加していれば、該ＤＮＡのコードする新規ポリペプチドは、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有していると考えることができる。
また、本発明のポリペプチドのβ１，３−ガラクトース転移酵素活性は、公知の測定法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，９８９３−９８９８（１９８３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１５６４９（１９８７）、Ａｒｃｈｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７０，６３０（１９８９）、Ａｒｃｈｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７４，１４（１９８９）、特開平０６−１８１７５９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，５８（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，４３３（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１２７７０（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２４９９（１９９９）〕に準じて測定することができる。
以上のようにして、取得した新規ｃＤＮＡのコードする新規ポリペプチドの活性を明らかにすることができる。
（３）新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ポリペプチドの製造
上記の方法により得られた本発明のＤＮＡを宿主細胞中で発現させ、本発明のポリペプチドを製造するために、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）等に記載された方法等を用いることができる。
即ち、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、該ベクターを宿主細胞に導入することにより、本発明のポリペプチドを発現する形質転換体を取得し、該形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
宿主細胞としては、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、動物個体や植物個体を用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合、新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素遺伝子、転写終結配列、より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社より市販）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅ ＩＩ ＳＫ（−）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）等を例示することができる。
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｄ−０１１０等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を例示することができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、クルイベロミセス属、トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８、ｐＡＧＥ１０７、ｐＲＥＰ４、ｐＡＧＥ１０３、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ、ｐＡＳ３−３等を例示することができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー・ミュリン・ロイケミア・ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、あるいはメタロチオネインのプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、ヒトの細胞であるＮａｍａｌｗａ細胞またはＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ヒト大腸癌細胞株等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３、２９３等、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ヒト大腸癌細胞株としてはＨＣＴ−１５等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。形質転換体の取得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるいは特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９２）〕、モレキュラー・バイオロジー ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー サプルメント１〜３８（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ ア・ラボラトリー・マニュアル）等、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
また、動物細胞にＤＮＡを導入する方法と同様の方法を用いて、昆虫細胞にＤＮＡを導入することもでき、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞または植物個体を宿主として用いる場合には、公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じてポリペプチドを生産することができる。
遺伝子発現に用いるプロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。また、プロモーターと発現させる遺伝子の間に、トウモロコシのアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン１等を挿入することにより、遺伝子の発現効率をあげることもできる。
宿主細胞としては、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、イネ、アブラナ、大豆、トマト、小麦、大麦、ライ麦、アルファルファ、亜麻等の植物細胞等をあげることができる。 組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）、特開昭６０−２５１８８７〕、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子を導入した植物の細胞や器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。また、遺伝子導入した植物細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された植物個体（トランスジェニック植物）を造成することもできる。
動物個体を用いて本発明のポリペプチドを生産することもできる。例えば、公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて、遺伝子を導入した動物中に本発明のポリペプチドを生産することができる。
プロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該組換え体ＤＮＡのコードする新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドを該植物中に生成蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドを製造することができる。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌等の真核生物である場合、これら生物を培養する培地は、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等がを用いることができる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６〜９６時間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
本発明のポリペプチド製造用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製〕、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製〕、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養条件としては、ｐＨ６〜７、培養温度２５〜３０℃がよく、培養時間は、通常１〜５日間である。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
遺伝子の発現方法としては、ポリペプチド全長を発現させる以外に、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する領域を含む部分ポリペプチドとして発現させることもできる。糖転移酵素は、一般にタイプＩＩ型の膜タンパク質のトポロジーを有し、Ｎ末端の数から数十アミノ酸からなる細胞質領域、疎水性の高いアミノ酸配列を有する膜結合領域、数から数十アミノ酸からなる幹領域（ｓｔｅｍｒｅｇｉｏｎ）、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなっている。幹領域と触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分は、ゴルジ体内腔に露出していると考えられる。幹領域と触媒領域の境界は、Ｎ末端を欠失させたポリペプチドを作製し、どこまで欠失させると活性がなくなるかを検討することにより、実験的に求めることができる。一方、幹領域と触媒領域に関する知見のある類似の糖転移酵素とアミノ酸配列を比較することにより、幹領域と触媒領域を予想することもできる。
本発明の新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素において、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｎ末端の９アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く１９アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなり、配列番号２および３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｎ末端の１１アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く２１アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなり、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、Ｎ末端の２９アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く２０アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると予想することができる。
幹領域は、他のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素やβ１，３−ガラクトース転移酵素とのアミノ酸配列上の相同性の比較、ならびに他のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素やβ１，３−ガラクトース転移酵素の幹領域に関する知見〔本願明細書実施例４、特開平６−１８１７５９〕を基に推定した。従って、配列番号１の４１番目から３９７番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号２および３の４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号４の６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは触媒領域を含むと考えられる。
上記のポリペプチド全長またはβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する領域（触媒領域）を含む部分ポリペプチドは、直接発現させる以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌タンパク質または融合タンパク質として発現させることもできる。融合させるタンパク質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔実験医学，１３，４６９（１９９５）〕。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
具体的には、触媒部位を含むと考えられるアミノ酸配列を有するポリペプチドの手前に、シグナルペプチドを付加して発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができると考えられる。さらに、シグナルペプチドと触媒領域を含むポリペプチドの間、または触媒領域を含むポリペプチドのＣ末端に、精製・検出用のタグを付加することもできる。
精製・検出用のタグとしては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明ポリペプチド製造用形質転換体の培養物から、本発明のポリペプチドを単離・精製するには、通常の酵素の単離・精製法を用いることができる。例えば、本発明のポリペプチドが本発明のポリペプチド製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、該細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該ポリペプチドを回収後、該ポリペプチドの不溶体をポリペプチド変性剤で可溶化する。該可溶化液を、ポリペプチド変性剤を含まないあるいはポリペプチド変性剤の濃度がポリペプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
細胞外に該ポリペプチドが分泌される場合には、該培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。該可溶性画分から、上記無細胞抽出液上清からの単離精製法と同様の手法により、該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
また、通常の糖転移酵素の精製方法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８〕に準じて精製できる。
また、本発明のポリペプチドを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる〔実験医学，１３，４６９（１９９５）〕。例えば、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１に記載の方法に準じて、本発明のポリペプチドをプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。また、本発明のポリペプチドをＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕。
更に、該ポリペプチド自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。
また、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６（１９９１）〕に準じて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いて本発明のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素を生産することができる。
更に、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。
精製した本発明のポリペプチドの構造解析は、蛋白質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。
本発明の新規ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性は、公知の測定法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１１８（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１２４６１（１９８８）、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ，４２，７７（１９８９）〕に準じて測定することができる。
本発明のポリペプチドのβ１，３−ガラクトース転移酵素活性は、公知の測定法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，９８９３（１９８３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１５６４９（１９８７）、Ａｒｃｈｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７０，６３０（１９８９）、Ａｒｃｈｉ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７４，１４（１９８９）、特開平０６−１８１７５９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，５８（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，４３３（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１２７７０（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２４９９（１９９９）〕に準じて測定することができる。
（４）Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造
上記（３）で取得した微生物、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞由来の形質転換体から選ばれる形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中にＮ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または複合糖質を採取することにより、該糖鎖または複合糖質を製造することができる。
Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造としては、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ構造、（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造［ｎ≧１］、または（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎＧａｌβ１−４Ｇｌｃ構造［ｎ≧１］等をあげることができる。
培養は上記（３）に準じて行うことができる。
上記形質転換体において、本発明のポリペプチドと任意の組換え糖タンパク質（例えば医薬用組換え糖タンパク質）を、糖鎖を合成可能な形質転換体中で同時に生産させることにより、該組換え糖タンパク質にＮ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖を付加することができる。
また、上記（３）で取得した動物個体または植物個体を用い、上記（３）の方法に準じて、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
即ち、動物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該生成物を採取することにより、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、卵等をあげることができる。
植物個体の場合、例えば、本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該生産物を採取することにより、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質を製造することができる。
上記（３）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、水性媒体中で、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基またはガラクトース単糖に、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合で付与された反応産物を、以下の方法で製造することができる。
即ち、ガラクトース単糖、ガラクトース残基を非還元末端に有するオリゴ糖、またはガラクトース残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質を受容基質として、上記（３）記載の方法で取得される本発明のポリペプチドを酵素源として用い、該受容基質、該酵素源およびＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のガラクトースまたはガラクトース残基にβ１，３結合でＮ−アセチルグルコサミンが付与された反応産物を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該反応産物を採取することにより、該反応産物を製造することができる。
酵素源は、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を基質として、３７℃で１分間に１μモルのＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを生成することのできる活性を１単位（Ｕ）として、０．１ｍＵ／ｌ〜１０，０００Ｕ／ｌであり、好ましくは１ｍＵ／ｌ〜１，０００Ｕ／ｌの濃度で用いる。
水性媒体としては、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類などをあげることができる。また、酵素源として用いた微生物の培養液を水性媒体として用いることができる。また、上記（２）記載の培養により得られた形質転換体の培養液、上記（２）記載の非ヒトトランスジェニック動物より得られたミルクを水性媒体として用いることもできる。水性媒体に、必要に応じて界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。
界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合でガラクトース残基に付加した構造を有する糖鎖または該糖鎖の付加した複合糖質の生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。
有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどが挙げられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとしては、市販品の他、微生物等の活性を利用して生成した反応液あるいは該反応液から精製したものを用いることができる。該ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは０．１〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いることができる。
上記において、ガラクトース残基を非還元末端に有するオリゴ糖としては、Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３（ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、またはこれらオリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有するオリゴ糖などをあげることができる。ガラクトース残基を糖鎖の非還元末端に有する複合糖質としては、上記オリゴ糖の構造のいずれか一つの構造を糖鎖の非還元末端に有する糖鎖を含有する複合糖質、あるいはアシアロ複合型Ｎ結合型糖鎖を含有する複合糖質などをあげることができる。
受容基質は０．０１〜５００ｍｍｏｌ／ｌの濃度で用いることができる。
該生成反応において、必要に応じてＭｎＣｌ２等の無機塩、β−メルカプトエタノール、ポリエチレングリコール等を添加することができる。
生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜８、２０〜５０℃の条件で１〜９６時間行う。
上記方法により生産される糖鎖または複合糖質より、公知の酵素的手法または化学的手法により糖鎖の一部を切り出すことができる〔日本生化学会編，続生化学実験講座，第４巻，複合糖質研究法Ｉ，ＩＩ，東京化学同人，（１９８６年）、谷口直之・鈴木明身・古川清・菅原和幸 監修，グリコバイオロジー実験プロトコール，秀潤社，（１９９６年）〕。
（５）本発明のＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドを用いた疾患の治療や診断等への利用
本発明のＤＮＡは、アンチセンスＲＮＡ／ＤＮＡ技術〔バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）〕あるいはトリプル・ヘリックス技術〔Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）〕を用いた炎症や癌転移の抑制等の疾病の治療に用いることができる。
また、ノーザンハイブリダイゼーション法（モレキュラー・クローニング第２版）、ＰＣＲ法〔ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕、Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法〔実験医学（増刊），１５，４６（１９９７）〕を用いて本発明のＤＮＡの発現量を測定することにより、炎症や癌の診断が可能である。特に、定量的ＰＣＲ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２７２５（１９９０）〕やＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法は定量性に優れている。例えば、上記（１）記載の本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を投与することにより、本発明のポリペプチドの生産を抑制することができる。
即ち、本発明のＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはその誘導体を用いて、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写の抑制、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳の抑制を行うことが可能である。
また、本発明のＤＮＡあるいは該ＤＮＡより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量を定量することができる。
更に、本発明のＤＮＡをプローブとして、公知の方法〔東京大学医科学研究所 制癌研究部編、新細胞工学実験プロトコール、秀潤社（１９９３）〕を用いて、該遺伝子のプロモーター領域を取得することが可能である。
現在、多くの機能未知のヒト染色体遺伝子の配列がデータベースに登録されている。従って、本発明のポリペプチドをコードするヒトｃＤＮＡの配列と、データベースに登録されてるヒト染色体遺伝子の配列とを比較することにより、本発明のポリペプチドをコードするヒト染色体遺伝子を同定し、その構造を明らかにできる可能性がある。ｃＤＮＡの配列と一致する染色体遺伝子配列が登録されていれば、ｃＤＮＡの配列と染色体遺伝子の配列を比較することにより、本発明のポリペプチドをコードする染色体遺伝子のプロモーター領域、エクソンおよびイントロン構造を決定することができる。
プロモーター領域としては、哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するすべてのプロモーター領域があげられる。
例えば、ヒト白血球細胞、ヒト大腸癌細胞あるいはヒト膵臓癌細胞で、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の転写に関与するプロモータ領域をあげることができる。
糖転移酵素遺伝子には多型や変異が存在することが知られている。例えば、ＡＢＯ式血液型の決定に関与する糖転移酵素に関しては、遺伝子多型に基づくアミノ酸配列の違いにより以下の３種の酵素が生成される。
Ａ型抗原の合成に関与するα１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｂ型抗原の合成に関与するα１，３−ガラクトース転移酵素、およびＯ（Ｈ）型糖鎖の生成に関与する活性を持たない酵素〔Ｎａｔｕｒｅ，３４５，２２９−２３３（１９９０）〕。
またルイス式血液型の決定に関与するα１，３−フコース転移酵素（Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ）の場合も、遺伝子多型に基づくアミノ酸配列の違いにより、活性が低下または消失した酵素が生成することが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２９２７１（１９９４）、Ｂｌｏｏｄ，８２，２９１５（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２０９８７（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２１９９４（１９９７）〕。
Ｆｕｃ−ＴＩＩＩ遺伝子の多型は、大腸癌における癌関連糖鎖抗原であるシアリルルイスａ糖鎖の発現と密接な関係があることが知られている〔Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６，３３０（１９９６）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８，５１２（１９９８）〕。
従って、Ｆｕｃ−ＴＩＩＩの多型を調べることにより、病気の診断や予後の予測を行うことができると考えられる。
本発明の新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素はポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与することから、白血球におけるシアリルルイスｘ糖鎖や、癌細胞における癌関連糖鎖（シアリルルイスｘ糖鎖、シアリルルイスａ糖鎖、シアリルルイスｃ糖鎖、ダイメリック・ルイスａ糖鎖）の合成に関与すると考えられる。従って、本遺伝子の発現量や多型を調べることにより、炎症、癌または癌転移の診断、あるいは癌の予後の予測が可能と考えられる。
また、本遺伝子の多型と、本遺伝子が発現している臓器における疾患との関連を調べることにより、他の疾患の診断にも利用できる。
本遺伝子の多型解析は、本遺伝子の遺伝子配列情報を用いて行うことができる。具体的には、サザンブロット法、ダイレクトシークエンス法、ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ法などを用いて遺伝子多型を解析することができる〔臨床検査，４２，１５０７（１９９８）、臨床検査，４２，１５６５（１９９８）〕。
（６）本発明のポリペプチドを認識する抗体の生産
（ｉ）ポリクローナル抗体の作製
上述（３）の方法により取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明の蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することによりポリクローナル抗体を作製することができる。
投与する動物として、ウサギ、ヤギ、３〜２０週令のラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。該抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。
抗原としてペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）や牛チログロブリンなどのキャリア蛋白に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。
該抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊（１９７６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕等で確認する。
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒトほ乳動物より血清を取得し、該血清を分離、精製することによりポリクローナル抗体を取得することができる。
分離、精製する方法としては、遠心分離、４０〜５０％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）〕、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡまたはＧ−カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体の作製
（ａ）抗体産性細胞の調製
免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として供する。
該抗体価を示したラットに抗原物質を最終投与した後３〜７日目に、脾臓を摘出する。該脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の脾細胞をトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去した後、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、得られた脾細胞を抗体産生細胞として用いる。
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットから取得した株化細胞を使用する。
例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（以下、Ｐ３−Ｕ１と略す）〔Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１（１９７８）、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，５１１（１９７６）〕、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）〕等を用いることができる。
これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）（ＣＳＬ社製、１０％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地で培養し、融合には該細胞を２×１０７個以上用いる。
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム １．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水 １リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨てる。
得られた沈澱画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、３７℃で、１０８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍｌおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．７ｍｌを混合した溶液を０．２〜１ｍｌ添加し、更に１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回添加する。添加後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるように調製する。
該調製液を９００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清を捨てる。
得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／ｌ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。
該懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとりアンチボディイズ〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４（１９８８）〕等に述べられている酵素免疫測定法により、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。
酵素免疫測定法の具体的例として、以下の方法をあげることができる。
免疫の際、抗原に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドを適当なプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清もしくは後述の（ｄ）で得られる精製抗体を第一抗体として反応させ、さらに第二抗体としてビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗ラットまたは抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させた後に標識物質に応じた反応を行ない、本発明のポリペプチドに特異的に反応するものを本発明のポリペプチドモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマとして選択する。
該ハイブリドーマを用いて、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものを本発明のポリペプチドの抗ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明のポリペプチドモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞５〜２０×１０６細胞／匹を腹腔内に注射する。１０〜２１日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該腹水癌化したマウスから腹水を採取し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して固形分を除去する。
得られた上清より、ポリクローナルで用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行う。蛋白質量は、ローリー法あるいは２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（７）本発明の抗体の利用
（ａ）本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドを検出することができる。 具体的にはマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法等を用いた検出法をあげることができる。
（ｂ）本発明の抗体を用いて、本発明のポリペプチドを発現する細胞の免疫組織染色に利用できる。
（ｃ）本発明の抗体は、炎症や癌の診断に利用することができる。
（８）スクリーニング法への応用
本発明の新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ポリペプチドは、各種細胞において、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成に関与することから、該ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を増強または阻害する化合物を用いて、細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成量を増加または低下させることが可能である。
また、該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写過程、あるいは転写産物からタンパク質への翻訳過程を促進または抑制する化合物は、該ポリペプチドの発現を制御し、細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成量を制御することが可能である。
ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖上に存在するシアリルルイスｘ糖鎖やシアリルルイスａ糖鎖は、セレクチンのリガンドとなることが知られていることから、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成量を抑制する化合物は、抗炎症や癌転移抑制に有用と考えられる。一方、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成量を増加させる化合物は、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成やポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が付加した複合糖質の生産に有用と考えられる。
該化合物は、以下（ａ）〜（ｅ）に示す方法により取得可能である。
（ａ）上記（３）で記載した方法を用いて調製した本発明の新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチド（精製物あるいは該ポリペプチドを発現する形質転換体の細胞抽出液または培養上清）を酵素として用い、被験試料の存在下、公知の方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１１８（１９９３）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１２４６１（１９８８）、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ，４２，７７（１９８９）〕を用いてβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を測定し、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する細胞または上記（３）で記載した形質転換体を、被験試料の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞表面のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の量を、該糖鎖を認識する抗体（抗ｉ抗体、抗Ｉ抗体）やレクチン（ＬＥＡ、ＰＷＭ、ＤＳＡ）を用いて測定し、該糖鎖量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
上記抗体やレクチンを用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法をあげることができる。また、ＦＡＣＳを用いて測定することもできる。
（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を、被験試料の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリペプチド量を、上記（５）で記載した本発明の抗体を用いて測定し、該ポリペプチド量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
本発明の抗体を用いた測定法としては、例えば、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色等を用いた検出法をあげることができる。
（ｄ）本発明のポリペプチドを発現する細胞を、被験試料の存在下、上記（２）で記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中の該ポリペプチドをコードする遺伝子転写産物の量を、上記（４）で記載したノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法等の方法を用いて測定し、該転写産物量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
（ｅ）上記（４）で取得したプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結したＤＮＡを組み込んだプラスミドを公知の方法により作製し、上記（３）記載の動物細胞に、上記（２）および（３）に記載の方法に準じて導入し、形質転換体を取得する。該形質転換体を、被験試料の存在下、上記（２）記載の培養法で２時間から１週間培養後、細胞中のレポーター遺伝子の発現量を、公知の方法〔東京大学医科学研究所 制癌研究部編，新細胞工学実験プロトコール，秀潤（１９９３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０，９１４（１９９６）、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，４９，４５３（１９９６）、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０，４４８（１９９５）、細胞工学，１６，５８１（１９９７）〕を用いて測定し、該発現量を増加または低下させる活性を有する化合物を選択・取得する。
レポーター遺伝子としては、例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン（ＧＦＰ）遺伝子等をあげることができる。
（９）ノックアウト動物の作製
本発明のＤＮＡを含むベクターを用い、目的とする動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ニワトリ、マウス等の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）において染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを公知の相同組換えの手法〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３２６，６１１０，２９５（１９８７）、Ｃｅｌｌ，５１，３，５０３（１９８７）等〕により不活化または任意の配列と置換した変異クローンを作成することができる〔例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３５０，６３１５，２４３（１９９１）〕。
このようにして作成した胚性幹細胞クローンを用い、動物の受精卵の胚盤胞（ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を作成することができる。このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、全身の細胞の染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに任意の変異を有する個体を得ることができ、さらにその個体の掛け合わせにより相同染色体の双方に変異が入った、ホモ個体（ノックアウト動物）を得ることができる。
このようにして動物個体において、染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの任意の位置へ変異の導入が可能である。例えば染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳領域中への塩基置換、欠失、挿入等の変異を導入することにより、その産物の活性を変化させることができる。
またその発現制御領域への同様な変異の導入により、発現の程度、時期、組織特異性等を改変させることも可能である。さらにＣｒｅ−ｌｏｘＰ系との組合せにより、より積極的に発現時期、発現部位、発現量等を制御することも可能である。
このような例としては脳のある特定の領域で発現されるプロモータを利用して、その領域でのみ目的遺伝子を欠失させた例〔Ｃｅｌｌ，８７，７，１３１７（１９９６）〕やＣｒｅを発現するアデノウィルスを用いて、目的の時期に、臓器特異的に目的遺伝子を欠失させた例〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７８，５３３５，（１９９７）〕が知られている。
従って染色体上の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡについてもこのように任意の時期や組織で発現を制御できる、または任意の挿入、欠失、置換をその翻訳領域や、発現制御領域に有する動物個体を作成することが可能である。
このような動物は任意の時期、任意の程度または任意の部位で、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の症状を誘導することができる。
従って、本発明のノックアウト動物は、本発明のポリペプチドに起因する種々の疾患の治療や予防において極めて有用な動物モデルとなる。特にその治療薬、予防薬、また機能性食品、健康食品等の評価用モデルとして非常に有用である。発明を実施するための最良の形態
以下実施例を示す。遺伝子操作的手法として、特に断らない限りモレキュラー・クローニング第２版に記載された公知の方法を用いた。
実施例１ ＧｌｃＮＡｃβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１）のホモログ蛋白質をコードする可能性のある候補遺伝子の検索
β３Ｇａｌ−Ｔ１（別名ＷＭ１）はＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造の合成に関与するβ１，３−ガラクトース転移酵素である〔特開平６−１８１７５９〕。遺伝子データベースから、Ｂｌａｓｔ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，（１９９０）〕およびＦｒａｍｅＳｅａｒｃｈ法〔Ｃｏｍｐｕｇｅｎ社製〕のプログラムを利用して、本酵素遺伝子と相同性のある遺伝子または本酵素とアミノ酸レベルで相同性を有する蛋白質をコードする可能性のある遺伝子を検索した結果、複数のＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）配列を見出した。それらは配列上３種に分類されたことから、３種の候補遺伝子が存在すると考えられた。各候補遺伝子をそれぞれＧ３、Ｇ４、Ｇ７と命名した。遺伝子データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースと特許配列データベースであるＧＥＮＥＳＥＱ（Ｄｅｒｗｅｎｔ社）を利用した。
上記３種の配列に特異的なプライマーセットを設計し、候補遺伝子断片のクローン化を試みた。プライマーセットとしては、Ｆ−３−５とＲ−３−５、Ｆ−４−５とＲ−４−５、およびＦ−７−５ａとＲ−７−３ａを使用した。各プライマーの配列は配列番号９〜１４に示した。
実施例２ 候補遺伝子Ｇ３のクローン化
（１）候補遺伝子Ｇ３のｃＤＮＡ断片のクローン化
候補遺伝子Ｇ３に特異的なプライマー（Ｆ−３−５とＲ−３−５：配列は配列番号９、１０に示す）を作製し、各種臓器または各種細胞から調製した一本鎖ｃＤＮＡ、あるいは各種ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、該当する配列を有するｃＤＮＡの存在について検討した。その結果、白血球のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）または胃粘膜ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とした時に約６００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。具体的な方法を以下に示す。
白血球ｃＤＮＡライブラリー（ファージライブラリー：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を約４万種の独立クローン毎にプール分けした後、各プールのファージ（約１×１０７個）を鋳型としてＰＣＲを行った。９９℃で１０分間熱処理したファージ（約１×１０７個）を含む反応溶液４９．５μｌ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．２μｍｏｌ／ｌ遺伝子特異的プライマー〕を９７℃で５分間加熱後、氷上で５分間冷却した。次いで、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社製）を加え、９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、３０サイクルの反応を行った。
ヒト胃粘膜ｃＤＮＡライブラリーは以下のように作製した。ヒト胃粘膜のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡよりｃＤＮＡ合成システム（ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、その両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＳａｌＩ ａｄａｐｔｏｒ（Ｓｕｐｅｒ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を付加した後、クローニングベクターλＺＡＰ ＩＩ（λＺＡＰ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇを行うことにより、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
該胃粘膜ｃＤＮＡライブラリー（ファージライブラリー）を約５万種の独立クローン毎にプール分けした後、各プールのファージ（約１×１０７個）を鋳型としてＰＣＲを行った。方法は上記で述べた方法と同じ。
白血球ｃＤＮＡライブラリーから増幅された約６００ｂｐのＤＮＡ断片をＴ−ベクターであるｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込み、プラスミドｐＴ７Ｂ−Ｇ３ＦＲを造成した。ｐＴ７Ｂ−Ｇ３ＦＲが含むｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した結果、該ｃＤＮＡ断片の配列が実施例１で見出されたＥＳＴ配列の１種と一致することが確認された。塩基配列の決定には、ＬＩ−ＣＯＲ社のＤＮＡシークエンサー（ｄＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ）、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社のＤＮＡシークエンサー３７７、ならびに各シークエンサー用の反応キットを使用した。
（２）候補遺伝子Ｇ３の完全長ｃＤＮＡのクローン化
Ｇ３の完全長ｃＤＮＡを取得するために、ＰＣＲ ＤＩＧ ｐｒｏｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて、ジゴキシゲニン標識プローブの作製を行った。１μｇのｐＴ７Ｂ−Ｇ３ＦＲと各０．２μｍｏｌ／ｌのプライマー（Ｆ−３−５とＲ−３−５）を含む反応溶液３９μｌを９７℃で５分間加熱後、氷上で５分間冷却した。次いで、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １ユニット（ＴａＫａＲａ社製）を加え、９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を１サイクルとして、３０サイクルの反応を行った。反応液の組成はキット添付の説明書に従った。
上記（１）で増幅が見られた該胃粘膜ｃＤＮＡライブラリーのプール（約５万独立クローン）について、ジゴキシゲニン標識プローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを行った。
プラーク由来のＤＮＡをトランスファーしたフィルターを、５倍濃度のＳＳＰＥ〔１倍濃度のＳＳＰＥの組成は、１８０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／ｌ リン酸二水素ナトリウム、１ｍｍｏｌ／ｌ エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）よりなる（ｐＨ７．４）〕、５倍濃度のデンハルト溶液〔１倍濃度のデンハルト溶液の組成は、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン、０．０２％（Ｗ／Ｖ）フィコール４００、０．０２％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリドンよりなる〕、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２０μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡよりなる緩衝液（以下ハイブリダイゼーション用緩衝液と呼ぶ）２５ｍｌに浸し、６５℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。
次いで、該フィルターを上記で作製したジゴキシゲニン標識プローブ５μｌを含むハイブリダイゼーション用緩衝液１０ｍｌに浸し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
その後、フィルターを、２倍濃度のＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳよりなる緩衝液中で６５℃、１０分間浸漬する条件で２回、１倍濃度のＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中で６５℃、１５分間浸漬する条件で１回、０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中で６５℃、１０分間浸漬する条件で２回洗浄した。
該プラークハイブリダイゼーションの結果、ハイブリダイズする１個の独立したクローンが得られた。Ｑｉａｇｅｎ社製のキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｌａｍｂｄａ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、該クローンからファージＤＮＡを調製した。該ファージＤＮＡをＸｂａＩとＳａｌＩで切断し、約１．９ｋｂのＸｂａＩ−ＳａｌＩ断片を、ｐＢｌｕｅ ＩＩ ＳＫ（＋）のＸｂａＩ−ＳａｌＩ間にサブクローニングした。このようにして造成したプラスミドをｐＢＳ−Ｇ３と呼ぶ。
（３）プラスミドｐＢＳ−Ｇ３中に挿入されているｃＤＮＡの塩基配列の決定
上記（２）で得られたｐＢＳ−Ｇ３が含むｃＤＮＡの全塩基配列を、以下の方法で決定した。
ｐＢｌｕｅ ＩＩ ＳＫ（＋）中の配列に特異的なプライマー（Ｍ１３−２０ ＰｒｉｍｅｒおよびＲｉｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ）を用いて、該ｃＤＮＡの５’側および３’側の配列を決定した。決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。
塩基配列の決定には、ＬＩ−ＣＯＲ社のＤＮＡシークエンサー（ｄＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ）と反応キット（Ｓｅｑｕｉｔｈｅｒｍ ＥＸＣＥＬ ＩＩＴＭ Ｌｏｎｇ−ＲｅａｄＴＭ ＤＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ−Ｌｃ：ＡＲ ＢＲＯＷＮ社）、またはＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。ｐＢＳ−Ｇ３が含むｃＤＮＡの全塩基配列（１９１２ｂｐ）を配列番号５に示した。
該ｃＤＮＡは、糖転移酵素に特徴的な構造を有する３９７アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。このポリペプチドをＧ３ポリペプチドと呼び、アミノ酸配列を配列番号１に示す。
該ポリペプチドはこれまでにクローン化された５種のヒトβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３、β３Ｇａｌ−Ｔ４、β３Ｇａｌ−Ｔ５）とアミノ酸レベルで１９％〜２４％の相同性を示した〔特開平６−１８１７５９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，５８（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，４３３（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１２７７０（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２４９９（１９９９）〕。
相同性解析は、配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１のＳｅａｒｃｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｙを用いて行った。
また、該ポリペプチドはこれまでにクローン化されたヒトβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３ＧｎＴ）とアミノ酸レベルで約１５％の相同性を示し〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，４０６（１９９９）〕、Ｎ末端の９アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く１９アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。
また、相同性を有する上記糖転移酵素とのアミノ酸配列の比較、ならびに上記糖転移酵素の幹領域と触媒領域に関する知見〔特開平６−１８１７５９〕を基に、幹領域は少なくとも１２アミノ酸からなると予想された。従って、４１番目から３９７番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、触媒領域を含むと考えられる。
これらの結果および後述する実施例８の結果より該ポリペプチドは新規なβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であると考えられた。
配列番号５の塩基配列は、ＷＯ９８／４４１１２で公開された配列とほぼ一致していた。また該配列がコードするポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号１）は、ＷＯ９８／４４１１２で公開された配列と一致していた。
しかし、該公開特許では該ポリペプチドを分泌タンパク質と予想しているが、実際はタイプＩＩ型の膜タンパク質であり、明らかに間違っている。また、該公開特許では他のタンパク質へのホモロジーから、該ポリペプチドを骨格筋由来成長因子スーパーファミリーに属するＣａｒｄｉａｃ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎと予想しているが、実際の活性については何ら明らかにしていない。該特許においては、該ポリペプチドを大腸菌、昆虫細胞、動物細胞で生産させる一般的な手法について記載されているが、実際にポリペプチドを発現させたデータは記載されていない。該ポリペプチドがβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であることを明らかにし、糖鎖合成への有用性を示したのは今回が最初である。
ｐＢＳ−Ｇ３を含む大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＭ２９４／ｐＢＳ−Ｇ３は、平成１１年４月７日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号 郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６６９４として寄託されている。
実施例３ 候補遺伝子Ｇ４のクローン化
（１）候補遺伝子Ｇ４のｃＤＮＡ断片のクローン化
候補遺伝子Ｇ４に特異的なプライマー（Ｆ−４−５とＲ−４−５：配列は配列番号１１、１２に示す）を作製し、各種臓器または各種細胞から調製した一本鎖ｃＤＮＡ、あるいは各種ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、該当する配列を有するｃＤＮＡの存在について検討した。その結果、胃粘膜ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とした時に約２００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。具体的な方法は、プライマーを変更した以外は実施例１で記載した方法と同じである。
増幅された約２００ｂｐのＤＮＡ断片をＴ−ベクターであるｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込み、プラスミドｐＴ７Ｂ−Ｇ４ＦＲを造成した。ｐＴ７Ｂ−Ｇ４ＦＲが含むｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定した結果、該ｃＤＮＡ断片の配列が実施例１で見出されたＥＳＴ配列の１種と一致することが確認された。塩基配列の決定には、ＬＩ−ＣＯＲ社のＤＮＡシークエンサー（ｄＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ）、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社のＤＮＡシークエンサー３７７、ならびに各シークエンサー用の反応キットを使用した。
（２）候補遺伝子Ｇ４の完全長ｃＤＮＡのクローン化
Ｇ４の完全長ｃＤＮＡを取得するために、ＰＣＲ ＤＩＧ ｐｒｏｂｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて、ジゴキシゲニン標識プローブの作製を行った。１μｇのｐＴ７Ｂ−Ｇ４ＦＲと各０．２μｍｏｌ／ｌのプライマー（Ｆ−４−５とＲ−４−５）を含む反応溶液３９μｌを９７℃で５分間加熱後、氷上で５分間冷却した。次いで、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １ユニット（ＴａＫａＲａ社製）を加え、９４℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で１分間からなる反応を１サイクルとして、３０サイクルの反応を行った。反応液の組成はキット添付の説明書に従った。
上記（１）で増幅が見られた該胃粘膜ｃＤＮＡライブラリーのプール（約５万独立クローン）について、ジゴキシゲニン標識プローブを用いてプラークハイブリダイゼーションを行った。
プラーク由来のＤＮＡをトランスファーしたフィルターを、ハイブリダイゼーション用緩衝液２５ｍｌに浸し、６５℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。次いで、該フィルターを上記で作製したジゴキシゲニン標識プローブ５μｌを含むハイブリダイゼーション用緩衝液１０ｍｌに浸し、６５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。その後、フィルターを、２倍濃度のＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳよりなる緩衝液中で６５℃、１０分間浸漬する条件で２回、１倍濃度のＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中で６５℃、１５分間浸漬する条件で１回、０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中で６５℃、１０分間浸漬する条件で２回洗浄した。
該プラークハイブリダイゼーションの結果、ハイブリダイズする１個の独立したクローンが得られた。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のマニュアルに従ってｉｎ ｖｉｖｏ ｅｘｃｉｓｉｏｎを行い、該クローンよりプラスミドｐＢＳ−Ｇ４−２を回収した。
同様にしてヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを作製し、該ライブラリーよりプラスミドｐＢＳ−Ｇ４を取得した。
（３）プラスミドｐＢＳ−Ｇ４およびｐＢＳ−Ｇ４−２中に挿入されているｃＤＮＡの塩基配列の決定
上記（２）で得られたｐＢＳ−Ｇ４およびｐＢＳ−Ｇ４−２が含むｃＤＮＡの全塩基配列を、以下の方法で決定した。
ｐＢｌｕｅ ＳＫ（−）中の配列に特異的なプライマー（Ｍ１３ −２０ ＰｒｉｍｅｒおよびＲｉｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、該ｃＤＮＡの５’側および３’側の配列を決定した。決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。
塩基配列の決定には、ＬＩ−ＣＯＲ社のＤＮＡシークエンサー（ｄＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ）と反応キット（Ｓｅｑｕｉｔｈｅｒｍ ＥＸＣＥＬ ＩＩＴＭ Ｌｏｎｇ−ＲｅａｄＴＭ ＤＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ−Ｌｃ：ＡＲ ＢＲＯＷＮ社）、またはＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。
ｐＢＳ−Ｇ４が含むｃＤＮＡの全塩基配列（２２０５ｂｐ）を配列番号６に示した。該ｃＤＮＡは、糖転移酵素に特徴的な構造を有する３７２アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。このポリペプチドをＧ４ポリペプチドと呼び、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
ｐＢＳ−Ｇ４−２が含むｃＤＮＡの全塩基配列（２１８０ｂｐ）を配列番号７に示した。該ｃＤＮＡは、糖転移酵素に特徴的な構造を有する３７２アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。このポリペプチドをＧ４−２ポリペプチドと呼び、アミノ酸配列を配列番号３に示す。
ｐＢＳ−Ｇ４が含むｃＤＮＡをＧ４ｃＤＮＡ、ｐＢＳ−Ｇ４−２が含むｃＤＮＡをＧ４−２ｃＤＮＡと呼ぶ。
Ｇ４ｃＤＮＡとＧ４−２ｃＤＮＡとでは、５’非翻訳領域の塩基配列が異なっていた他、複数の塩基の置換が見られた（図１〜４参照）。翻訳領域中では、Ｇ４ｃＤＮａＡの１１１１番目の塩基はアデニンであるが、Ｇ４−２ｃＤＮＡではこれに相当する塩基はグアニンに置換していた。その結果、Ｇ４ポリペプチドでは３２８番目のアミノ酸がＨｉｓであるのに対し、Ｇ４−２ポリペプチドでは、３２８番目のアミノ酸がＡｒｇに置換している。
Ｇ４ｃＤＮＡとＧ４−２ｃＤＮＡで５’非翻訳領域の塩基配列が異なっていることは、胎盤と胃では異なるプロモーターが働いていることを示唆している。それ以外の塩基置換は、個人差、体細胞変異あるいは逆転写酵素のエラーに由来すると推定される。下記の実施例で示すように、Ｇ４ｃＤＮＡとＧ４−２ｃＤＮＡのコードするタンパク質は、いずれもβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有していた。
Ｇ４およびＧ４−２ポリペプチドは、これまでにクローン化された５種のヒトβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３、β３Ｇａｌ−Ｔ４、β３Ｇａｌ−Ｔ５）とアミノ酸レベルで２２％〜２６％の相同性を示した〔特開平６−１８１７５９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，５８（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，４３３（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１２７７０（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２４９９（１９９９）〕。相同性解析は、配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１のＳｅａｒｃｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｙを用いて行った。
また、該ポリペプチドはこれまでにクローン化されたヒトβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３ＧｎＴ）とアミノ酸レベルで１７．５％の相同性を示した。〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，４０６（１９９９）〕。該ポリペプチドのＮ末端の１１アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く２１アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。相同性を有する上記糖転移酵素とのアミノ酸配列の比較、ならびに上記糖転移酵素の幹領域と触媒領域に関する知見〔特開平６−１８１７５９〕を基に、幹領域は少なくとも１２アミノ酸からなると予想された。従って、４５番目から３７２番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、触媒領域を含むと考えられる。
以上の結果および後述する実施例８，９，１０および１２の結果から、該ポリペプチドは新規なβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であると考えられた。
配列番号６または７の塩基配列は、ＷＯ９８／４４１１２で公開された配列とほぼ一致していた。また、配列番号６のコードするポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）は、ＷＯ９８／２１３２８で公開された配列と一致していた。しかし、該公開特許では該ポリペプチドがタイプＩＩ型の膜タンパク質であると記載しているのみで、該ポリペプチドの実際の活性については何ら明らかにしていない。該ポリペプチドがβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であることを明らかにし、糖鎖合成への有用性を示したのは今回が最初である。
ｐＢＳ−Ｇ４−２を含む大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＭ２９４／ｐＢＳ−Ｇ４は、平成１１年４月７日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号 郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６６９５として寄託されている。
実施例４ 候補遺伝子Ｇ７のクローン化
（１）候補遺伝子Ｇ７のｃＤＮＡ断片のクローン化
候補遺伝子Ｇ７に特異的なプライマー（Ｆ−７−５ａとＲ−７−３ａ：配列は配列番号１３、１４に示す）を作製し、各種臓器または各種細胞から調製した一本鎖ｃＤＮＡ、あるいは各種ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、該当する配列を有するｃＤＮＡの存在について検討した。その結果、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とした時に約１．３ｋｂのＤＮＡ断片が増幅された。具体的な方法を以下に示す。
ＳＫ−Ｎ−ＭＣはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手した。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞から常法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７７）〕に従って全ＲＮＡを調製した。５μｇの全ＲＮＡから、キット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；ＢＲＬ社製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。反応は２１μｌで行い、反応後の溶液を水で５０倍希釈し、使用するまで−８０℃で保管した。
上記一本鎖ｃＤＮＡ１０μｌを含む反応溶液４０μｌ〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．２μｍｏｌ／ｌ遺伝子特異的プライマー〕を９７℃で５分間加熱後、氷上で５分間冷却した。次いで、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １ユニット（ＴａＫａＲａ社製）を加え、９４℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、３０サイクルの反応を行った。
増幅された約１．３ｋｂのＤＮＡ断片をＴ−ベクターであるｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込み、プラスミドｐＴ７Ｂ−Ｇ７を造成した。
（２）プラスミドｐＴ７Ｂ−Ｇ７中に挿入されているｃＤＮＡの塩基配列の決定 上記（２）で得られたｐＴ７Ｂ−Ｇ７が含むｃＤＮＡの全塩基配列を、以下の方法で決定した。
ｐＴ７Ｂｌｕｅ中の配列に特異的なプライマー（Ｍ１３−２０ ＰｒｉｍｅｒおよびＲｉｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を用いて、該ｃＤＮＡの５’側および３’側の配列を決定した。決定された配列に特異的な合成ＤＮＡを調製し、それをプライマーとして用い、さらに先の塩基配列を決定した。該操作を繰り返すことにより、該ｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。
塩基配列の決定には、ＬＩ−ＣＯＲ社のＤＮＡシークエンサー（ｄＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ４０００Ｌ）と反応キット（Ｓｅｑｕｉｔｈｅｒｍ ＥＸＣＥＬ ＩＩＴＭ Ｌｏｎｇ−ＲｅａｄＴＭ ＤＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ−Ｌｃ：ＡＲ ＢＲＯＷＮ社）、またはＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社のＤＮＡシークエンサー３７７と反応キット（ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ＢｉｇＤｙｅＴＭ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用した。
ｐＴ７Ｂ−Ｇ７が含むｃＤＮＡの全塩基配列（１２９６ｂｐ）を配列番号８に示した。
該ｃＤＮＡは、糖転移酵素に特徴的な構造を有する３７８アミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。このポリペプチドをＧ７ポリペプチドと呼び、アミノ酸配列を配列番号４に示す。
Ｇ７ポリペプチドはこれまでにクローン化された５種のヒトβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３、β３Ｇａｌ−Ｔ４、β３Ｇａｌ−Ｔ５）とアミノ酸レベルで２２％〜２５％の相同性を示した〔特開平６−１８１７５９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，５８（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，４３３（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１２７７０（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２４９９（１９９９）〕。
相同性解析は、配列解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ １０．１のＳｅａｒｃｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｙを用いて行った。
また、該ポリペプチドはこれまでにクローン化されたヒトβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３ＧｎＴ）とアミノ酸レベルで１４．８％の相同性を示し〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，４０６（１９９９）〕、Ｎ末端の２９アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く２０アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。相同性を有する上記糖転移酵素とのアミノ酸配列の比較、ならびに上記糖転移酵素の幹領域と触媒領域に関する知見〔特開平６−１８１７５９〕を基に、幹領域は少なくとも１２アミノ酸からなると予想された。従って、６２番目から３７８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、触媒領域を含むと考えられる。
以上の結果および後述する実施例８の結果から、該ポリペプチドは新規なβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であると考えられた。
ｐＴ７Ｂ−Ｇ７を含む大腸菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＭＭ２９４／ｐＴ７Ｂ−Ｇ７は、平成１１年４月７日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（目本国茨城県つくば市東１丁目１番３号 郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６６９６として寄託されている。
実施例５ アミノ酸配列上の相同性解析
Ｇ３、Ｇ４−２およびＧ７ポリペプチドのアミノ酸配列、既知のヒトβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３、β３Ｇａｌ−Ｔ４、β３Ｇａｌ−Ｔ５）のアミノ酸配列、ならびに既知のヒトβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３ＧｎＴ）のアミノ酸配列を用いて、デンドログラムを作成した（図５参照）。デンドログラムは、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｉｇｂｍｃ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／ｐｕｂ／ＣｌｕｓｔａｌＸ／）を用いて作成した。その結果、Ｇ３、Ｇ４−２およびＧ７ポリペプチドは、１つのサブグループを形成していることが判明した。Ｇ３ポリペプチドは、Ｇ４−２およびＧ７ポリペプチドとそれぞれ３９．６％および４４．５％の相同性を示した。Ｇ４−２ポリペプチドは、Ｇ７ポリペプチドと４２．５％の相同性を示した。
実施例６ 動物細胞用発現プラスミドの造成
実施例２〜４で取得したＧ３、Ｇ４、Ｇ４−２およびＧ７ｃＤＮＡがコードする各ポリペプチドを動物細胞で発現させるために、各ｃＤＮＡを発現ベクターｐＡＭｏ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２（１９９３）、別名ｐＡＭｏＰＲＣ３Ｓｃ（特開平０５−３３６９６３）〕に組み込み、発現プラスミドの造成を行った。
（１）Ｇ３ポリペプチドを発現させるためのプラスミドｐＡＭｏ−Ｇ３の造成（図６参照）
ｐＢＳ−Ｇ３を制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼ・クレノー断片により平滑末端に変換した。その後、ＳｆｉＩリンカー（配列番号１５、１６）を付与し、１．９ｋｂのＳｆｉＩ断片を取得した。一方、ｐＡＭｏをＳｆｉＩとＢａｍＨＩで切断後、８．７ｋｂのＳｆｉＩ断片を取得した。上記２断片を結合することにより、発現プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ３を造成した。
ＳｆｉＩリンカー（配列番号１５、１６）の合成とリン酸化は、常法に従って行った（特開平０５−３３６９６３）。
（２）Ｇ４ポリペプチドを発現させるためのプラスミドｐＡＭｏ−Ｇ４の造成（図７参照）
ｐＢＳ−Ｇ４−２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｔＥＩＩで切断後、０．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を取得した。また、ｐＴ７Ｂ−Ｇ４ｓｅｃを制限酵素ＢｓｔＥＩＩとＮｏｔＩで切断後、０．９ｋｂのＢｓｔＥＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＴ７Ｂ−Ｇ４ｓｅｃは後述する実施例９の（１）で示した方法で造成した。一方、ｐＡＭｏをＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断後、８．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。上記３断片を結合することにより、発現プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ４を造成した。
（３）Ｇ４−２ポリペプチドを発現させるためのプラスミドｐＡＭｏ−Ｇ４−２の造成（図８参照）
ｐＢＳ−Ｇ４−２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｔＥＩＩで切断後、０．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片を取得した。また、ｐＢＳ−Ｇ４−２を制限酵素ＢｓｔＥＩＩとＮｏｔＩで切断後、１．５ｋｂのＢｓｔＥＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。一方、ｐＡＭｏをＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断後、８．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。上記３断片を結合することにより、発現プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ４−２を造成した。
（４）Ｇ７ポリペプチドを発現させるためのプラスミドｐＡＭｏ−Ｇ７の造成（図９参照）
ｐＴ７Ｂ−Ｇ７を制限酵素ＳｍａＩとＨｉｎｃＩＩで切断後、ＳｆｉＩリンカー（配列番号１５、１６）を付与し、１．３ｋｂのＳｆｉＩ断片を取得した。一方、ｐＡＭｏをＳｆｉＩとＢａｍＨＩで切断後、８．７ｋｂのＳｆｉＩ断片を取得した。上記２断片を結合することにより、発現プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ７を造成した。
実施例７ Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２、Ｇ７の各ポリペプチドを発現するプラスミドを導入したヒト培養細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成
（１）安定形質転換株の取得
コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）および実施例６で造成した各発現プラスミド（ｐＡＭｏ−Ｇ３、ｐＡＭｏ−Ｇ４、ｐＡＭｏ−Ｇ４−２、ｐＡＭｏ−Ｇ７）を、それぞれ１μｇ／μｌになるように１０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン４酢酸ナトリウム）からなる緩衝液（以下、ＴＥ緩衝液と略記する）に溶解した後、エレクトロポレーション法〔サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）〕によりＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）〕に導入し、形質転換細胞を得た。１．６×１０６細胞あたり４μｇのプラスミドを導入した後、８ｍｌのＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地［７．５％ＮａＨＣＯ３を１／４０量、２００ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−グルタミン溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を３％、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ社製、５０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ペニシリン、５０００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン）を０．５％、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルフォニック・アシッド（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−３−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＨＥＰＥＳ）（１０ｍｍｏｌ／ｌ）、インシュリン（３μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、ピルビン酸ナトリウム（５ｍｍｏｌ／ｌ）、亜セレン酸ナトリウム（１２５ｎｍｏｌ／ｌ）、ガラクトース（１ｍｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）］に懸濁し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で２４時間培養した。その後、Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように添加し、さらに１４日間培養して安定形質転換株を取得した。該形質転換株は、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＲＰＭＩ１６４０・ＩＴＰＳＧ培地で継代した。
（２）各形質転換細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現量の測定
該形質転換細胞におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の発現量は、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体やレクチンを用いた蛍光染色後、ＦＡＣＳを用いて解析することができる。ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体としては抗ｉ抗体（Ｄｅｎ）を使用できる。ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識するレクチンとしてはＬＥＡ、ＰＷＭ、およびＤＳＡを使用できる。
以下、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識するレクチン（ＬＥＡ、ＰＷＭ）を用いた具体例を示す。
上記形質転換細胞（各５×１０６個）を、２０ｍＵのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、ＳＩＧＭＡ社製 Ｎ ２１３３）を含む１００μｌのＰＢＳ（８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ、１．１５ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４（無水）、０．２ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４）に懸濁して、３７℃で１時間反応することにより、形質転換細胞のシアリダーゼ処理を行った
上記細胞（約１×１０６個）をマイクロチューブ（１．５ｍｌ：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）にとり、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により細胞を集めた。
該細胞を０．９ｍｌの０．１％のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝液ＰＢＳ（Ａ−ＰＢＳ：８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ、１．１５ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４（無水）、０．２ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％アジ化ナトリウム）で洗浄した後、該洗浄細胞に、Ａ−ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したＦＩＴＣ標識ＬＥＡ（ＥＹ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）またはＡ−ＰＢＳで１００μｇ／ｍｌに希釈したＦＩＴＣ標識ＰＷＭ（ＥＹ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を２０μｌ加えて懸濁し、４℃で１時間反応させた。
反応後、細胞を０．９ｍｌのＡ−ＰＢＳで１回洗浄した後、０．６ｍｌのＡ−ＰＢＳに懸濁し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＵＳＡ社製）を用いてＦＡＣＳ（フルオレッセンス・アクティベーティド・セル・ソーター）解析を行なった。また対照実験として、レクチンの代わりにＡ−ＰＢＳを用いて同様の解析を行なった。
ｐＡＭｏ−Ｇ３、ｐＡＭｏ−Ｇ４、ｐＡＭｏ−Ｇ４−２またはｐＡＭｏ−Ｇ７を導入した細胞においては、ｐＡＭｏを導入した細胞に比べて、ＬＥＡへの反応性が増加していた（図１０）。また、ｐＡＭｏ−Ｇ３、ｐＡＭｏ−Ｇ４、ｐＡＭｏ−Ｇ４−２またはｐＡＭｏ−Ｇ７を導入した細胞においては、ｐＡＭｏを導入した細胞に比較して、ＰＷＭへの反応性が増加していた（図１０）。
これらの結果は、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２あるいはＧ７のｃＤＮＡをＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞で発現させることにより、細胞表面の糖タンパク質あるいは糖脂質の糖鎖上にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が新たに合成されていることを意味している。
また、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２あるいはＧ７のｃＤＮＡを発現させた細胞から分泌される糖タンパク質やオリゴ糖の糖鎖にも、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖が新たに合成されることを示している。従って、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２あるいはＧ７のｃＤＮＡを発現させた細胞を宿主として有用な糖タンパク質を分泌生産することにより、分泌生産される糖タンパク質にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミンを含有する糖鎖を付与することが可能である。
一方、上記形質転換細胞に対して、シアリルルイスｃ糖鎖に対する抗体であるＤＵ−ＰＡＮ−２を用いて蛍光染色を行った時には抗体の反応性は変化しなかった。方法は常法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１２４９９（１９９９）〕に従った。
実施例８ Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２またはＧ７ポリペプチドを発現するプラスミドを導入したヒト培養細胞におけるβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定
上記実施例７で取得した、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２またはＧ７ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した安定形質転換細胞の細胞抽出液を用いて、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を調べた。
上記形質転換細胞（約２×１０７個）をマイクロチューブ（１．５ｍｌ：Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）にとり、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により細胞を集めた。該細胞を０．９ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、該洗浄細胞を２０ｍｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、１％ ＴｒｉｒｏｎＸ−１００からなる溶液（１００μｌ）に懸濁し、超音波破砕機（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ；Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社製）を用いて細胞を破砕した。４℃で１時間放置した後、遠心分離（５５０×ｇ、７分間）により上清を取得した。該上清を酵素サンプルとした。該酵素サンプルを用いて、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を測定した。
ピリジルアミノ化した糖鎖基質の調製や活性測定は、既知の方法〔特開平６−１８１７５９、特開平０６−８２３０２１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１４７３０（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２９９４（１９９２）〕に準じて行った。
具体的には、３０μｌのアッセイ溶液〔２００ｍｍｏｌ／ｌ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、０．３％ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、５０μＭピリジルアミノ化糖鎖基質、上記細胞溶解液１０μｌ〕中で３７℃、１６時間反応後、生産物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により検出した。
基質としては、アミノピリジンで蛍光標識したラクト−Ｎ−ネオテトラオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下、ＬＮｎＴと略記する）を使用した。
ＬＮｎＴはＯｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。オリゴ糖の蛍光標識は、常法〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，２１６９（１９９０）〕に従って行った。
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（糖供与体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いて反応を行った後、ＨＰＬＣで解析し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。
反応が終了したアッセイ溶液は、１００℃で５分間処理後、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して上清を取得し、その一部（５μｌ）をＨＰＬＣに供した。
ＨＰＬＣは、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（４．６×３００ｍｍ；東ソー）を使用し、溶出液として０．０２Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）を用い、溶出温度５０℃、流速０．５ｍｌ／分の条件で行った。
生成物の検出は、蛍光スペクトルフォトメーターＦＰ−９２０（日本分光）を用いて行った（励起波長３２０ｎｍ、放射波長４００ｎｍ）。生成物の同定は、スタンダード糖鎖と溶出時間が一致することを指標とした。スタンダード糖鎖としては、アミノピリジル化したＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを使用した。
生成物の定量は、アミノピリジル化したラクトースをスタンダードとして用い、蛍光強度を比較することにより行った。
コントロールプラスミド（ｐＡＭｏ）および各発現プラスミド（ｐＡＭｏ−Ｇ３、ｐＡＭｏ−Ｇ４、ｐＡＭｏ−Ｇ４−２、ｐＡＭｏ−Ｇ７）を導入した安定形質転換細胞の細胞抽出液を用いて活性測定を行った結果、生産物（ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）に転換された基質（ＬＮｎＴ）の割合は、コントロールプラスミドを導入した細胞では１．８％であったのに対し、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２またはＧ７ポリペプチドの発現プラスミドを導入した細胞では、順に２．７％、２．８％、２．８％、２．３％に増加していた。すなわち、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２またはＧ７ポリペプチドの発現プラスミドを導入した細胞では、コントロールプラスミドを導入した細胞に比較して、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が増加していることが判明した。
以上の結果から、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２またはＧ７ポリペプチドは、新規なβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であることが証明された。この結果は、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２またはＧ７ポリペプチドを用いて、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基に、Ｎ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合で付加した糖鎖を合成可能なことを示している。
実施例９ Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞を宿主としたＦＬＡＧペプチド融合型β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）の分泌生産
（１）ＦＬＡＧペプチド融合型分泌ベクターｐＡＭｏＦ２の造成
ＦＬＡＧペプチド（配列番号１７）を任意のタンパク質のＮ末端に付加した形で分泌発現するための分泌ベクターｐＡＭｏＦ２の造成を行った。免疫グロブリンκのシグナル配列およびＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡは、６種の合成ＤＮＡを用いて作製した。
ｐＡＭｏをＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８で切断することにより、約８．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を取得した。ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＡｓｐ７１８切断部位を連結するためのリンカーとして以下の６種のＤＮＡ［ＩｇＫ−１（配列番号１８）、ＩｇＫ−２（配列番号１９）、ＩｇＫ−３（配列番号２０）、ＩｇＫ−４（配列番号２１）、ＩｇＫ−５（配列番号２２）、ＩｇＫ−６（配列番号２３）］を合成した。なお、これらのＤＮＡによって構築されるリンカー中にはＰｍａＣＩ、ＳｔｕＩ、ＳｎａＢＩの各制限酵素切断部位が組み込まれている。６種のＤＮＡはそれぞれＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８０Ａ・ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成したＤＮＡは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴａＫａＲａ社製、以下同じ）を用いてリン酸化した後に使用した。
上記で取得した６種のリン酸化合成ＤＮＡと約８．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−Ａｓｐ７１８断片を結合することにより、プラスミドｐＡＭｏＦ２を構築した。
（２）プラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓの造成
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列番号２４で示されるＤＮＡ（以下、Ｃ１２−７と呼ぶ）および配列番号２５で示されるＤＮＡ（以下、Ｃ１２−９と呼ぶ）を合成した（サワディー・テクノロジーから購入することも可能）。
Ｃ１２−７にはＢａｍＨＩサイトがＣ１２−９にはＮｏｔＩサイトが導入されるようにデザインされている。
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ社製のキット（ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて行った。反応液の調製はキットの方法に従って行い、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＣＥＴＵＳ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ；ＴａＫａＲａ社販売）を用いて、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を１０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間反応させた。鋳型としてはプラスミドｐＡＭｏ−ｉ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４，１４２９４（１９９７）〕を１０ｎｇ使用した。該ＰＣＲにより、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。
約１．１ｋｂのＰＣＲ増幅ＤＮＡ断とＴ−ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を結合することにより、プラスミドｐＴ７Ｂ−ｉ５２Ｓ Ｎｏ．３を構築した。
次いでプラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓの造成を行った。
ｐＡＭｏＦ２をＳｔｕＩとＢａｎＩＩＩで切断し、約７．２ｋｂのＳｔｕＩ−ＢａｎＩＩＩ断片を取得した。ｐＡＭｏをＢａｎＩＩＩとＮｏｔＩで切断し、約１．７ｋｂのＢａｎＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＴ７Ｂ−ｉ５２Ｓ Ｎｏ．３をＢａｍＨＩで切断後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ・クレノー断片を用いてＢａｍＨＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変え、引き続きＮ ｏｔＩで切断することにより、約１．１ｋｂのＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＮｏｔＩ断片を取得した。
上記で得た、約７．２ｋｂのＳｔｕＩ−ＢａｎＩＩＩ断片、約１．７ｋｂのＢａｎＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片および約１．１ｋｂのＢａｍＨＩ（平滑末端）−ＮｏｔＩ断片を結合し、プラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓを構築した。
（３）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドの分泌発現用プラスミドｐＡＭｏＦ２−Ｇ４の造成（図１１参照）
クローン化したβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）は、その一次配列から、Ｎ末端の１１アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く２１アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。
そこで、Ｇ４ポリペプチドのＮ末端の１１アミノ酸からなる細胞質領域、２１アミノ酸からなる膜結合領域、および幹領域の一部（５アミノ酸）を除去し、該除去領域に免疫グロブリンのシグナル配列ならびにＦＬＡＧペプチドを付加することによりＧ４ポリペプチドの分泌発現を試みた。
まず、Ｇ４ポリペプチドの触媒活性を有すると考えられる領域〔配列番号２の３８番目のグルタミン酸から３７２番目のチロシンまで〕をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲを用いて調製し、Ｔ−ベクターであるｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込むことにより、プラスミドｐＴ７Ｂ−Ｇ４ｓｅｃを造成した。以下具体的方法を記す。
ＰＣＲ用のプライマーとして、Ｇ４−ＳＦとＧ４−ＳＲ（各配列を配列番号２６、２７に示す）を合成した（サワディー・テクノロジーから購入することも可能）。
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ社製のキット（ＧｅｎｅＡｍｐＴＭ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いて行った。反応液の調製はキットの方法に従って行い、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＣＥＴＵＳ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ；ＴａＫａＲａ社販売）を用いて、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を１０サイクル行った後、さらに７２℃で７分間反応させた。鋳型としては、上記実施例３で造成したプラスミドｐＢＳ−Ｇ４を２０ｎｇ使用した。
該反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。該ＤＮＡ断片をＴ−ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組み込むことにより、ｐＴ７Ｂ−Ｇ４ｓｅｃ（Ｎｏ．１３）を造成した。
ｐＴ７Ｂ−Ｇ４ｓｅｃ（Ｎｏ．１３）中に組み込まれたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、ＰＣＲによるエラーがないことを確認した。
Ｇ４−ＳＦにはＢａｍＨＩサイトが、Ｇ４−ＳＲにはＮｏｔＩサイトが導入されるようにデザインされているため、ｐＴ７Ｂ−Ｇ４ｓｅｃ（Ｎｏ．１３）を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断することにより、ＰＣＲ増幅断片部分を切り出すことができる。ｐＴ７Ｂ−Ｇ４ｓｅｃ（Ｎｏ．１３）を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断することにより、Ｇ４ポリペプチドの触媒活性を有すると考えられる領域〔配列番号２の３８番目のグルタミン酸から３７２番目のチロシンまで〕をコードする１．０ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。一方、プラスミドｐＡＭｏＦ２−ｉ５２Ｓを制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断することにより、８．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。上記２断片を結合することにより、ｐＡＭｏＦ２−Ｇ４を造成した（図１１）。
（４）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドのＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞での分泌生産
コントロールプラスミドｐＡＭｏＦ２および上記で造成したＧ４ポリペプチドのＦＬＡＧペプチド融合型分泌発現プラスミドｐＡＭｏＦ２−Ｇ４をキィアジェン（Ｑｉａｇｅｎ社製のプラスミド調製キット（／ｐｌａｓｍｉｄ／ｍａｘｉ ｋｉｔ；商標番号４１０３１）を用いて調製した。
調製取得したプラスミドはエタノール沈殿の後、１μｇ／μｌになるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
実施例７に記載した方法を用いて、各プラスミドをそれぞれＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞に導入し、安定形質転換体を取得した。
取得した形質転換体を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍｌ、牛胎児血清を２％含むＲＰＭＩ１６４０培地３０ｍｌに５×１０４細胞／ｍｌになるように懸濁し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃、１０日間培養した。
培養後、１６０×ｇ、１０分間および１５００×ｇ、１０分間の条件で遠心分離することにより細胞を除き、上清を回収した。該培養上清は、−８０℃で保存することが可能で、使用時に解凍して用いることができる。
プラスミドｐＡＭｏＦ２−Ｇ４のコードするβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、ＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として分泌発現されるので、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲル（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社）を用いて、容易に精製が可能である。
上記で取得した培養上清にアジ化ナトリウム、塩化ナトリウム、および塩化カルシウムを、それぞれ最終濃度０．１％、１５０ｍｍｏｌ／ｌ、および２ｍｍｏｌ／ｌになるように添加した後、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲル（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社）を３０μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。攪拌後、１６０×ｇで１０分間、遠心分離することにより抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを回収し、該ゲルを５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウムを含む緩衝液１ｍｌで２回洗浄した。
洗浄後、該ゲルに５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを含む緩衝液３０μｌを添加し、４℃で３０分間処理することにより、ゲルに吸着したタンパク質を溶出した。その後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。該ゲルに再度５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを含む緩衝液３０μｌを添加し、４℃で１０分間処理した後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。その後、上記の操作を再度行い、合計３回溶出操作を行った。該溶出液には、最終濃度が４ｍｍｏｌ／ｌになるように１ｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウムを添加した。
（５）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定
上記（４）で調製した溶出液１５μｌを用いて、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞で分泌発現させたＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定を行った。活性測定は上記実施例８の方法を用いた。その結果、ｐＡＭｏＦ２−Ｇ４を導入したＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞の培養上清由来の溶出液を使用した際には、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が検出された。生産物へ転換された基質の割合は０．５１％であった。一方、ベクターであるｐＡＭｏＦ２を導入したＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞の培養上清由来の溶出液を使用した際には、活性は全く検出されなかった。
以上の結果より、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞で分泌発現させたＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドはβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有することが示された。この結果は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）をＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として動物細胞で分泌生産可能なこと、また生産された融合タンパク質は抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いて容易に精製可能であることを示している。また、生産した融合タンパク質を用いて糖鎖合成が可能なことを示している。
実施例１０ 昆虫細胞を宿主としたＦＬＡＧペプチド融合型β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）の分泌生産
実施例８で示したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドの昆虫細胞での分泌発現を行った。
（１）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドを昆虫細胞で分泌発現するための組換えウィルスの作製
目的タンパク質をコードするＤＮＡをトランスファーベクターと呼ばれる特殊なプラスミドに組み込む工程（工程１）と、工程１で作製した目的ＤＮＡを組み込んだトランスファーベクターと野生型ウィルスとを昆虫細胞にコトランスフェクションし、相同組み換えにより組換えウィルスを取得する工程（工程２）の２工程で、組換えウィルスを作製した。該工程は、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製バキュロゴールドスターターキット（製品番号ＰＭ−２１００１Ｋ）を用い、該キットのマニュアルに従い以下の手順で行った。
（工程１）ＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ４ポリペプチドをコードするＤＮＡのトランスファーベクターへの組み込み（図１２）
トランスファーベクターｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）のＢａｍＨＩサイトとＮｏｔＩサイトの間に、実施例９で示したＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ４ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４の造成を行った。
実施例９で作製したｐＡＭｏＦ２−Ｇ４を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＮｏｔＩで切断し、１．０５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片を得た。
ｐＶＬ１３９３由来を制限酵素ＢａｍＨＩとＢｓｔＰＩで切断し、３．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｓｔＰＩ断片を得た。
ｐＶＬ１３９３由来を制限酵素ＮｏｔＩとＢｓｔＰＩで切断し、６．４ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｔＰＩ断片を得た。
ＢａｍＨＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトを連結するためのリンカーとして配列番号２８、２９に示すＤＮＡを合成し、Ｔ４ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅを用いて５’末端のリン酸化を行った。
上記３断片とリンカーを結合することにより、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４を造成した（図１２）。
（工程２）組換えウィルスの作製
ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウム（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）を用いて培養した昆虫細胞Ｓｆ９（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）に、線状バキュロウィルスＤＮＡ〔バキュロゴールド・バキュロウィルスＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ）、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製〕および上記プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４をリポフェクチン法〔蛋白質核酸酵素、３７，２７０１（１９９２）〕により導入することにより、以下のようにして組換えバキュロウィルスを作製した。
１〜５μｇのｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４および１５ｎｇの線状バキュロウィルスＤＮＡを１２μｌの蒸留水に溶解後、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）６μｌ（６μｇ）と蒸留水６μｌとを混和したものを添加し、室温で１５分間放置した。
約２×１０６個のＳｆ９細胞を２ｍｌのＳｆ９００−ＩＩ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）に懸濁し、直径３５ｍｍの細胞培養用プラスチックシャーレに入れた後、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４、線状バキュロウィルスＤＮＡ、およびリポフェクチンの混和溶液全量を添加し、２７℃で３日間培養した。
該培養液より、組換えウィルスを含む培養上清１ｍｌを採取した。
該培養上清を取得したシャーレには、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを新たに１ｍｌ加え、更に２７℃で４日間培養した。培養後、同様にして組換えウィルスを含む培養上清を更に１．５ｍｌ取得した。
（２）組み換えウィルス溶液の取得
約８×１０６個のＳｆ９細胞を５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地（ＪＲＨ社製）に懸濁し、２５ｃｍ２フラスコ（ＧＲＥＩＮＥＲ社製）に入れ、室温で３０分放置して細胞をフラスコに付着させた後、上清を除き、該フラスコに１ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地と上記（１）で取得した組換えウィルスを含む培養上清１ｍｌを添加した。
添加後、室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた後、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを４ｍｌ加え、２７℃で４日間培養した。
該培養液を１５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、組換えウイルスの感染したＳｆ９細胞および組換えウィルス溶液５．５ｍｌを得た。
約２×１０７個のＳｆ９細胞を１５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地に懸濁し、７５ｃｍ２フラスコ（ＧＲＥＩＮＥＲ社製）に入れ、室温で３０分放置して細胞をフラスコに付着させた後、上清を除き、該フラスコに５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地と上記で取得した組み換えウィルス溶液１ｍｌを添加した。
添加後、室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた後、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを１０ｍｌ加え、２７℃で４日間培養した。 該培養液を１５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、換えウイルスが感染したＳｆ９細胞および組み換えウィルス溶液１５ｍｌを得た。
該組み換えウイルス溶液のウィルスの力価は以下の方法で算定することができる〔ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製バキュロゴールドスターターキット・マニュアル〕。
約６×１０６個のＳｆ９細胞を４ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地に懸濁し、直径６０ｍｍの細胞培養用プラスチックシャーレに入れ、室温で３０分間放置して細胞をシャーレに付着させた後、上清を除き、該シャーレにＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地４００μｌおよびＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地で１０−４または１０−５に希釈した上記組み換えウィルス溶液１００μｌを添加する。
添加後、該シャーレを室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させる。
接触後、シャーレより培地を除去し、該シャーレに、２％低融点アガロース〔アガープラーク・アガロース（Ａｇａｒｐｌａｑｕｅ Ａｇａｒｏｓｅ）；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製〕を含む２ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地（４２℃に保温）と、２ｍｌのＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウム（４２℃に保温）の混合液を流し込み、室温で１５分間放置する。
放置後、乾燥を防ぐために該シャーレにビニルテープをまき、密閉可能なプラスチック製容器に該シャーレを入れ、２７℃で５日間培養する。
培養後、該シャーレに０．０１％ニュートラルレッドを含むＰＢＳ緩衝液１ｍｌを加え、更に１日培養した後、出現したプラークの数を数える。
（３）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドの分泌生産と精製
プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４由来の組換えウイルスのコードするＧ４ポリペプチドは、ＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として分泌発現されるので、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲル（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ）を用いて、容易に精製が可能である。
約２×１０７個のＳｆ２１細胞を１５ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地に懸濁し、７５ｃｍ２フラスコ（ＧＲＥＩＮＥＲ社製）に入れ、室温で３０分放置して細胞をフラスコに付着させた後、上清を除き、該フラスコに４ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ４００培地と上記（２）で取得した組み換えウィルス溶液１ｍｌを添加した。
添加後、室温で１時間緩やかに振とうすることにより、細胞とウイルスを十分に接触させた後、ＴＮＭ−ＦＨインセクトメディウムを１０ｍｌ加え、２７℃で４日間培養した。該培養液を１５００×ｇで１０分間遠心分離することにより、分泌型Ｇ４を含むと思われる培養上清を１５ｍｌを得た。
上記で取得した培養上清３０ｍｌにアジ化ナトリウム、塩化ナトリウム、および塩化カルシウムを、それぞれ最終濃度０．１％、１５０ｍｍｏｌ／ｌ、および２ｍｍｏｌ／ｌになるように添加した後、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲル（Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ１ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ；Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ社）を３０μｌ添加し、４℃で一晩ゆっくり攪拌した。
攪拌後、１６０×ｇで１０分間、遠心分離することにより抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを回収し、該ゲルを５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、１ｍｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウムを含む緩衝液１ｍｌで２回洗浄した。
洗浄後、該ゲルに５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを含む緩衝液８０μｌを添加し、４℃で３０分間処理することにより、ゲルに吸着したタンパク質を溶出した。その後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。該ゲルに再度５０ｍｍｏｌ／ｌ トリス−塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、２ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを含む緩衝液８０μｌを添加し、４℃で１０分間処理した後、１６０×ｇで１０分間遠心分離することにより上清を取得した。その後、上記の操作を再度行い、合計３回溶出操作を行った。該溶出液には、最終濃度が４ｍｍｏｌ／ｌになるように１ｍｏｌ／ｌ 塩化カルシウムを添加した。
このようにして調製した溶出液の１５μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、クーマジ・ブリリアント・ブルーを用いて染色を行った（図１３）。
ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から調製した溶出液を使用した際には、４３〜４８ｋＤのブロードなバンドが確認された。一方、ベクターであるｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から調製した溶出液を使用した際には、該バンドは検出されなかった。
以上の結果より、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドが培養上清中に分泌生産され、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いて容易に精製可能であることが示された。
（４）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定
上記（３）で調製した溶出液１５μｌを用いて、昆虫細胞で分泌生産させたＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定を行った。活性測定は上記実施例８の方法を用いた。その結果、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４を導入した昆虫細胞の培養上清由来の溶出液を使用した際には、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が検出された。生産物へ転換された基質の割合は、１２．１％であった。
溶出前のレジンを用いた場合もβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素が検出された。生産物へ転換された基質の割合は、２１．０％であった。この結果は、レジンに酵素を吸着した状態でも、糖鎖合成が可能なことを示している。
一方、ベクターであるｐＶＬ１３９３を導入した昆虫細胞の培養上清由来の溶出液を使用した際には活性は検出されなかった。
以上の結果より、昆虫細胞で分泌発現させたＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドはβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有することが示された。この結果は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）をＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として昆虫細胞で分泌生産可能なこと、また生産された融合タンパク質は抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いて容易に精製可能であることを示している。また、生産した融合タンパク質を用いて糖鎖合成が可能なことを示している。
以上の結果から、Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞で生産させた場合に比較して、昆虫細胞で生産させた場合は、生産量が高いことが明らかになった。
実施例１１ 分泌型β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（分泌型Ｇ４）の基質特異性の検討
上記実施例１０で分泌生産したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドを用いて、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）の基質特異性の検討を行った。
（１）アミノピリジル化オリゴ糖を基質とした解析
活性測定法は、上記実施例８で示した方法を用いた。具体的には、３０μｌのアッセイ溶液〔２００ｍｍｏｌ／ｌ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、５０μｍｏｌ／ｌ ピリジルアミノ化糖鎖基質、上記溶出液１５μｌ〕中で３７℃、１４．５時間反応後、生産物をＨＰＬＣにより検出した。基質としては、ＬＮｎＴ、ラクト−Ｎ−テトラオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｔｅｔｒａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下ＬＮＴと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ ＩＩ，Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下ＬＮＦＰ−ＩＩと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ ＩＩＩ，Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下ＬＮＦＰ−ＩＩＩと略記する）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ Ｖ，Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ；以下ＬＮＦＰ−Ｖと略記する）、およびラクト−Ｎ−ダイフコヘキサオースＩＩ（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｄｉｆｕｃｏｈｅｘａｏｓｅ ＩＩ，Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ；以下ＬＮＤＦＨ−ＩＩと略記する）［いずれもＯｘｆｏｒｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｓｔｅｍｓ社製］を、アミノピリジンで蛍光標識したものを使用した。基質の蛍光標識は、常法〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５４，２１６９（１９９０）〕に従って行った。
それぞれの基質について、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（糖供与体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いて反応後、ＨＰＬＣで解析しＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。
反応が終了したアッセイ溶液は、１００℃で５分間処理後、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して上清を取得し、その一部（５μｌ）をＨＰＬＣに供した。
ＨＰＬＣは、ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０Ｔｓカラム（４．６×３００ｍｍ；東ソー）を使用し、溶出液として０．０２ｍｏｌ／ｌ 酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）を用い、溶出温度５０℃、流速０．５ｍｌ／分の条件で行った。
生成物の検出・定量は、蛍光スペクトルフォトメーターＦＰ−９２０（日本分光）を用いて行った（励起波長３２０ｎｍ、放射波長４００ｎｍ）。
ＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００％とした時の相対活性を第１表に示した。ＬＮｎＴを基質とした時の基質の生産物への転換効率は１２．９％であった。β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）は、ＬＮｎＴに加えて、ＬＮＴやＬＮＦＰ−Ｖも良い基質とすることが判明した。既知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、ＬＮｎＴは良い基質とするが、ＬＮＴはほとんど基質としないことが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１１８（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，４０６（１９９９）〕。従って、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）は、既知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素とは明らかに基質特異性が異なる酵素であることが判明した。
大腸癌組織や大腸癌細胞株においては、ｄｉｍｅｒｉｃ Ｌｅｗｉｓ ａ糖鎖抗原〔Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃ〕を有する癌関連糖鎖が発現することが知られており、例えばＧａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３（Ｆｕｃα１−４）ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３Ｇｌｃ−Ｃｅｒという構造を有する糖脂質が存在することが明らかになっている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，８４３９−８４４６（１９９１）〕。β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）は、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造の末端のガラクトース残基にも効率よくＮ−アセチルグルコサミンを転移できることから、上記ｄｉｍｅｒｉｃ Ｌｅｗｉｓ ａ糖鎖の骨格糖鎖の合成には、既知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ではなく、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）が関与していると考えられる。下記の実施例１３の（３）で詳細に述べるように、Ｇ４転写物は大腸癌細胞株で高発現している。
Figure 0004551041
（２）無標識オリゴ糖を基質とした解析
糖転移酵素反応は以下のようにして行った。４０μｌのアッセイ溶液〔５０ｍｍｏｌ／ｌ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／ｌ糖鎖基質、上記溶出液１０μｌ〕中で３７℃、１６時間反応した。次いで、１００℃で５分間処理後、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を取得し、その一部をＨＰＡＥ／ＰＡＤ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ａｎｉｏｎ Ｐｕｌｓｅｄ Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｏｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＤＩＯＮＥＸ社）を用いて解析した。具体的方法は常法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９，１５１（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，４３３（１９９８）〕に準じて行った。
基質としては、以下の無標識のオリゴ糖を用いた：ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ，Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ，Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ；以下ＬａｃＮＡｃと略記することがある）、ＬＮｎＴ、ＬＮＴ、ラクト−Ｎ−ネオヘキサオース（Ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｈｅｘａｏｓｅ，Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ；以下ＬＮｎＨと略記する）。
それぞれの基質について、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（糖供与体）を含むアッセイ溶液と含まないアッセイ溶液を用いて反応後、ＨＰＡＥ／ＰＡＤを用いて解析、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含むアッセイ溶液でのみ出現するピークを生成物とした。生成物の同定は、スタンダード糖鎖と溶出時間が一致することを指標とした。スタンダード糖鎖としては、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを使用した。
ＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００％とした時の相対活性を第２表に示した。
ＬＮｎＴを基質とした時の基質の生産物への転換効率は１．７％であった。β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）は、ＬＮｎＴに加えて、ＬＮＴ、ＬＮｎＨやＧａｌβ１−４Ｇｌｃも良い基質とすることが判明した。一方、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃは基質としなかった。既知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃもＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃも良い基質とすることが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１１８（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，４０６（１９９９）〕。従って、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４）は、既知の酵素とは明らかに基質特異性が異なる酵素であることが判明した。
Figure 0004551041
一方、ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを受容基質として、分泌型Ｇ４のβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を測定した結果、活性は検出されなかった。
糖転移酵素反応は以下のようにして行った。４０μｌのアッセイ溶液〔５０ｍｍｏｌ／ｌ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−Ｇａｌ（ＳＩＧＭＡ社）、５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／ｌ 糖鎖基質、上記溶出液１０μｌ〕中で３７℃、１６時間反応した。次いで、１００℃で５分間処理後、１０，０００×ｇで２０分間遠心分離して上清を取得し、その一部をＨＰＡＥ／ＰＡＤ（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ａｎｉｏｎ Ｐｕｌｓｅｄ Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｏｒｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＤＩＯＮＥＸ社）を用いて解析した。具体的方法は常法〔Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８９，１５１（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，４３３（１９９８）〕に準じて行った。
実施例１２ 分泌型β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（分泌型Ｇ４）を用いたポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成
実施例１０で分泌生産したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドとβ１，４−ガラクトース転移酵素を用いて、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成を行った。
（１）２段階反応
ＬＮｎＴに実施例１０で分泌生産したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドを作用させることにより、ＬＮｎＴの非還元末端のガラクトース残基にＮ−アセチルグルコサミンがβ１，３結合で付加した糖鎖（ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を合成した。次いで、該糖鎖にウシミルクより精製したβ１，４−ガラクトース転移酵素（ＳＩＧＭＡ社製）を作用させることにより、該糖鎖の非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基にガラクトースがβ１，４結合で付加した糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を合成した。同様にして、ＬＮＴを基質として、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを合成した。また、ＬＮＦＰ−Ｖ〔Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ〕を基質として、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃを合成した。具体的な反応は以下のように行った。
３０μｌの反応溶液〔２００ｍｍｏｌ／ｌ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、５０μｍｏｌ／ｌ ピリジルアミノ化糖鎖基質、上記溶出液１５μｌ〕中で３７℃、１４．５時間反応した。基質としては、ＬＮｎＴ、ＬＮＴまたはＬＮＦＰ−Ｖを使用した。実施例１１記載の方法と同様にして、生産物の生成をＨＰＬＣにより確認後、β１，４−ガラクトース転移酵素（２０ｍＵ）とＵＤＰ−Ｇａｌ（２０ｍｍｏｌ／ｌ）を添加し、３７℃、１４．５時間反応した。生産物の生成はＨＰＬＣにより確認した。
（２）ｏｎｅ−ｐｏｔ反応
ＬＮｎＴに実施例１０で分泌生産したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ４ポリペプチドとウシミルクより精製したβ１，４−ガラクトース転移酵素（ＳＩＧＭＡ社製）を同時に作用させることにより、該糖鎖の非還元末端にＮ−アセチルラクトサミンが付加した糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）を合成した。同様にして、ＬＮＴを基質として、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを合成した。また、ＬＮＦＰ−Ｖ〔Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃ〕を基質として、Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）Ｇｌｃを合成した。具体的な反応は以下のように行った。
３０μｌの反応溶液〔２００ｍｍｏｌ／ｌ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−Ｇａｌ（ＳＩＧＭＡ社）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、５０μｍｏｌ／ｌ ピリジルアミノ化糖鎖基質、上記溶出液１０μｌ、β１，４−ガラクトース転移酵素２０ｍＵ〕中で３７℃、１４．５時間反応した。基質としては、ＬＮｎＴ、ＬＮＴまたはＬＮＦＰ−Ｖを使用した。生産物の生成はＨＰＬＣにより確認した。
実施例１３ Ｇ３、Ｇ４、Ｇ７の各遺伝子の転写産物の各種細胞における発現量の検討
Ｇ３、Ｇ４（Ｇ４−２）、Ｇ７の各遺伝子の転写産物の定量は、常法〔ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕に従って半定量的ＰＣＲ法により行った。また、どの細胞でも同程度発現していると考えられるβ−アクチンの転写産物の定量も同時に行い、細胞間でのｍＲＮＡ量の違いや、サンプル間での逆転写酵素によるｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡへの変換効率に大差ないことを確認した。
β−アクチン転写産物の定量は、常法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８７，２７２５（１９９０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９〕に従って定量的ＰＣＲ法により行った。
（１）各種細胞および細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡの合成
細胞株としては、大腸癌細胞株（ＷｉＤＲ、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０、ＤＬＤ−１）、肺癌細胞株（ＱＧ９０、ＨＬＣ−１、ＰＣ９）、膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２）、前立腺癌細胞株ＰＣ−３、胃癌細胞株ＫＡＴＯＩＩＩ、Ｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＳＢ−２、ＰＥＥＲ、Ｍｏｌｔ−３、Ｍｏｌｔ−４、ＨＵＴ７８、ＨＰＢ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞株（Ｎａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１、Ｄａｕｄｉ、Ｗａ、ＣＣＲＦ−ＳＢ、Ｊｉｙｏｙｅ、ＲＰＭＩ１７８８、ＲＰＭＩ８２２６、ＨＯ３２８−８、ＢＡＬＬ−１、ＫＯＰＮ−Ｋ、ＩＭ−９）、メラノーマ細胞株ＷＭ２６６−４、顆粒球／単球系細胞株（ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０、Ｕ−９３７）、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣを用いた。ＱＧ９０、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｗａ、ＳＷ１１１６およびＪｕｒｋａｔは愛知癌センターより入手した。ＨＬＣ−１は大阪大学癌研究所より入手した。ＨＯ３２８−８は九州大学農学部食糧化学より入手した。ＫＯＰＮ−Ｋは埼玉中央病院より入手した。ＫＡＴＯ ＩＩＩおよびＰＣ−９は免疫生物研究所よりより入手した。ＣＣＲＦ−ＳＢ、ＲＰＭＩ８２２６は大日本製薬より入手した。ＢＡＬＬ−１、ＰＥＥＲ、Ｍｏｌｔ−４、Ｄａｕｄｉ、ＩＭ−９、ＫＹ８２１はＪＣＲＢより入手した。それ以外の細胞は、ＡＴＣＣより入手した。
ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ）および１２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ １３−ａｃｅｔａｔｅ（ＴＰＡ）で刺激したＪｕｒｋａｔ細胞の調製は以下のようにして行った。１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、４×１０５細胞／ｍｌでシードしたＪｕｒｋａｔ細胞に、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｐおよび５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡを添加し、３時間、１２時間、または２４時間培養後、細胞を回収した。
また、健康な成人の末梢血よりナイコメッド・ファーマ（Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ）社製のキットであるＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐＴＭを用いて多形核白血球と単核球を分離取得した。取得した単核球は常法〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３０，７０６（１９８３）〕に従ってさらに単球およびリンパ球に分離して取得した。
各細胞の全ＲＮＡは常法〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４（１９７７）〕に従って調製した。全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡの合成はキット（ＳＵＰＥＲＴＭ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；ＢＲＬ社製）を用いて行った。細胞株については５μｇの全ＲＮＡから、血球細胞については、１μｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、それぞれ水で５０倍および１０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを用いた。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０、ＤＬＤ−１、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２に関しては、ランダムプライマーを使用した。それ以外はオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用した。
また、ヒト各種臓器由来のｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）から同様にして一本鎖ｃＤＮＡを合成した。１μｇのｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、水で２４０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。ｍＲＮＡとしては、以下の３５種の臓器由来のｍＲＮＡを使用した。
１副腎、２脳、３尾状核、４海馬、５黒質、６視床、７腎、８膵臓、９脳下垂体、１０小腸、１１骨髄、１２扁桃体、１３小脳、１４脳梁、１５胎児脳、１６胎児腎、１７胎児肝臓、１８胎児肺、１９心臓、２０肝臓、２１肺、２２リンパ節、２３乳腺、２４胎盤、２５前立腺、２６唾液腺、２７骨格筋、２８脊髄、２９脾臓、３０胃、３１精巣、３２胸腺、３３甲状腺、３４気管、３５子宮。
（２）定量的ＰＣＲ用のスタンダードおよび内部コントロールの調製
ｐＢＳ−Ｇ３、ｐＢＳ−Ｇ４−２、ｐＴ７Ｂ−Ｇ７を、ｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素で切断して直鎖状ＤＮＡに変換した後、定量用のスタンダードとして用いた。各プラスミドが完全に切断された事を確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。具体的には、ｐＢＳ−Ｇ３はＮｏｔＩとＳａｌＩで、ｐＢＳ−Ｇ４−２はＮｏｔＩで、ｐＴ７Ｂ−Ｇ７はＨｉｎｃＩＩとＳｍａＩで切断した。
また、ｐＵＣ１１９−ＡＣＴおよびｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄをｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８）で切断して直鎖状ＤＮＡに変換した後、それぞれβ−アクチンの転写産物定量用のスタンダードおよび内部コントロールとして用いた〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９〕。各プラスミドが完全に切断された事を確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
（３）ＰＣＲ法を用いたＧ３、Ｇ４、Ｇ７の各遺伝子の転写産物の定量
上記（１）で調製した各種細胞および細胞株由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ用のプライマーとしてはＧ３転写物検出用にはＦ−３−５とＲ−３−５を、Ｇ４転写物検出用にはＦ−４−５とＲ−４−５を、Ｇ７転写物検出用にはＦ−７−３ａ（配列番号３０）とＲ−７−３ａを使用した。また、上記（２）で作製したスタンダードを鋳型として同様にＰＣＲを行うことにより検量線を作製した。
ＰＣＲ反応は、Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ社製のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｇｅｎｅ Ｔａｑ）と添付の１０×Ｇｅｎｅ Ｔａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒおよび２．５ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅを用いて、説明書に従って行った。反応は２０μｌで行い、その際、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を最終濃度が５％になるように加えた。
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ以外を加えた反応液（１９μｌ）をＭＪ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社のサーマル・サイクラー（ＤＮＡ Ｅｎｚｉｎｅ ＰＴＣ−２００ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）を用いて、９７℃で３分間処理した後、氷中で急冷した。次いで、該反応液に５分の１に希釈したＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを１μｌを加えた後、ＭＪ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社のサーマル・サイクラーを用いて、９４℃で３０秒間、６０℃で１分間、７２℃で２分間の反応を２６〜３０サイクル行った。該反応液の一部（７μｌ）をアガロースゲル電気泳動に供した後、ゲルをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）で染色した。増幅されたＤＮＡ断片のパターンをフルオロイメージャー（ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ＳＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）で解析することにより、増幅されたＤＮＡ断片の量を測定した。より正確な転写産物の定量を行なうため、ＰＣＲのサイクル数を変えて同様のＰＣＲを行った。スタンダードの量はＰＣＲのサイクル数に応じて変化させた。
β−アクチンの転写産物の定量については既報〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９〕と同様に行った。
Ｇ３転写産物は、発現量は少ないながら調べた３５種全てのヒト臓器で発現していた（図１４）。また、ヒトの各種血球細胞株、ならびにヒト抹消血から調製した多型核白血球、単球、リンパ球においても発現がみられた（図１５）。
Ｇ４転写産物は、（１）に示した３５種のヒト臓器の中では、気管、胎盤および胃のみで少量発現していた（図１６）。ヒトの各種血球細胞株、ならびにヒト抹消血から調製した多型核白血球およびリンパ球においては発現がみられなかった（図１７）。
一方、大腸癌細胞株（ＷｉＤＲ、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０、ＤＬＤ−１）、肺癌細胞株（ＱＧ９０、ＨＬＣ−１、ＰＣ９）、膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２）、および胃癌細胞株ＫＡＴＯＩＩＩにおいては、比較的多量の発現がみられた（図１８）。一例として、以下に定量結果を示す。ＷｉＤＲ、ＱＧ９０、ＰＣ−３、ＨＬＣ−１、ＰＣ９、ＫＡＴＯＩＩＩ、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０、ＤＬＤ−１、Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２におけるＧ４転写物の発現量を、β−アクチン転写物の発現量に対する割合（％）で示した値は、順に０．４９、０．２９、０．０６９、０．３４、０．３５、０．９４、０．０２７、０．００３７、０．１０、４．６、０．９５、０．８５、０．６７、０．９２である。
Ｇ７転写産物は、（１）に示した３５種のヒト臓器の中では、脳、尾状核、海馬、腎、扁桃体、小脳、および胎児脳で少量発現していた（図１９）。ヒト抹消血から調製した多型核白血球、単球およびリンパ球においてはほとんど発現がみられなかった（図２０）。Ｔ細胞株においてはＪｕｒｋａｔとＨＰＢ−ＡＬＬでのみ少量の発現が見られ、Ｂ細胞株においては発現は見られなかった（図２０）。
一方、神経芽細胞腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣおよび前立腺癌細胞株ＰＣ−３においては比較的多量の発現がみられた。大腸癌細胞株（Ｃｏｌｏ２０５、ＳＷ１１１６、ＬＳ１８０）、膵臓癌細胞株（Ｃａｐａｎ−１、Ｃａｐａｎ−２）においては少量の発現が見られた。
以上の結果から、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ７の各遺伝子の発現分布は異なることが明らかになった。従って、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ７の３種の遺伝子は、いずれもβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素をコードしているが、各遺伝子は異なる組織で異なる機能を担っていると考えられる。
白血球においては、Ｇ３転写物の発現量が多いことから、白血球におけるポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成にはＧ３が関与していることが示唆された。従って、Ｇ３転写物やＧ３ポリペプチドの発現量を調べることにより、炎症の診断ができる可能性がある。また、Ｇ３遺伝子の発現を抑制したり、Ｇ３ポリペプチドの活性を阻害することにより炎症を抑制できる可能性もある。
また、乳腺においてはＧ３転写物が発現していることから、人乳中に含まれるＬＮｎＴやラＬＮＴなどのＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有するオリゴ糖の合成には、Ｇ３が関与している可能性がある。
Ｇ４転写物に関しては、大腸癌、膵臓癌、胃癌由来の細胞株で発現量が増加していることから、Ｇ４転写物やＧ４ポリペプチドの発現量を調べることにより、癌の診断ができる可能性がある。また、Ｇ４遺伝子の発現を抑制したり、Ｇ４ポリペプチドの活性を阻害することにより、癌細胞の転移を抑制できる可能性もある。
Ｇ７転写物に関しても、神経芽細胞腫、前立腺癌、大腸癌、膵臓癌由来の細胞株で発現量が増加していることから、Ｇ７転写物やＧ７ポリペプチドの発現量を調べることにより、癌の診断ができる可能性がある。また、Ｇ７遺伝子の発現を抑制したり、Ｇ７ポリペプチドの活性を阻害することにより、癌細胞の転移を抑制できる可能性もある。
また、これまでにクローン化された２種のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素の各種細胞や組織における発現分布は、今回取得した３種の新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３、Ｇ４、Ｇ７）とは異なることから、今回取得した３種の新規β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、既知の酵素とは異なる機能を有していると考えられる。
実施例１４ 昆虫細胞を宿主としたＦＬＡＧペプチド融合型β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３）の分泌生産
上記実施例１０と同様にして、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドの昆虫細胞での分泌発現を行った。
（１）プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ３の造成
Ｇ３ポリペプチドは、その一次配列から、Ｎ末端の９アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く１９アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。そこで、Ｇ３ポリペプチドのＮ末端の９アミノ酸からなる細胞質領域、１９アミノ酸からなる膜結合領域、および幹領域の一部（２アミノ酸）を除去し、該除去領域に免疫グロブリンのシグナル配列ならびにＦＬＡＧペプチドを付加することによりＧ３ポリペプチドの分泌発現を試みた。
まず、Ｇ３ポリペプチドの触媒活性を有すると考えられる領域〔配列番号１の３１番目のセリンから３９７番目のシステインまで〕をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲを用いて調製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み込むことにより、プラスミドｐＢｌｕｎｔ−Ｇ３を造成した。以下具体的方法を記す。
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列番号３１で示されるＤＮＡ（以下、Ｇ３−１と呼ぶ）および配列番号３２で示されるＤＮＡ（以下、Ｇ３−２と呼ぶ）を合成した。Ｇ３−１にはＢａｍＨＩサイトがＧ３−２にはＮｏｔＩサイトが導入されるようにデザインされている。
ＰＣＲ反応はＴａＫａＲａ社製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと添付の１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒおよび２．５ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅを用いて、説明書に従って行った。ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＣＥＴＵＳ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ；ＴａＫａＲａ社製）を用いて、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を１６サイクル行った後、さらに７２℃で１０分間反応させた。鋳型としては上記実施例２で造成したプラスミドｐＢＳ−Ｇ３を２０ｎｇ使用した。該ＰＣＲにより、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターに組み込むことにより、プラスミドｐＢｌｕｎｔ−Ｇ３を造成した。ｐＢｌｕｎｔ−Ｇ３中に組み込まれたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、ＰＣＲによるエラーがないことを確認した。
ｐＢｌｕｎｔ−Ｇ３を制限酵素ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断することにより、Ｇ３ポリペプチドの触媒活性を有すると考えられる領域〔配列番号１の３１番目のセリンから３９７番目のシステインまで〕をコードする１．１ｋｂのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＶＬ１３９３を制限酵素ＮｏｔＩとＢｓｔＰＩで切断し、６．４ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｔＰＩ断片を取得した。実施例１０で造成したｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４を制限酵素ＢａｍＨＩとＢｓｔＰＩで切断し、３．３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｓｔＰＩ断片を取得した。上記３断片を結合することにより、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ３を造成した。
（２）組換えウィルスの作製
ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドを昆虫細胞で分泌発現させるための組換えウィルスの作製を行った。昆虫細胞Ｓｆ９に、線状バキュロウィルスＤＮＡと上記（１）で造成したプラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ３をリポフェクチン法により導入することにより、組換えバキュロウィルスを作製した。方法は、上記実施例１０に記載の方法を用いた。
（３）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドの分泌生産と精製
上記（２）で作製した組換えウィルスを用いて、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドを昆虫細胞で分泌生産させた。次いで、該ポリペプチドを含有する培養上清から該ポリペプチドを精製した。方法は、上記実施例１０に記載の方法を用いた。
精製サンプルの１５μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、クーマジ・ブリリアント・ブルーを用いて染色を行った（図２１）。ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ３由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から精製したサンプルを使用した際には、５１〜５６ｋＤのバンドが確認された。各バンドの分子量の違いは付加する糖鎖の数や大きさの違いに由来すると考えられる。Ｇ３ポリペプチドには、Ｎ結合型糖鎖の付加が可能な部位が５個所存在している。一方、ベクターであるｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスを感染させたＳＦ２１の培養上清から同様に精製したサンプルを使用した際には、該バンドは検出されなかった。
以上の結果より、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドが昆虫細胞の培養上清中に分泌生産され、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いて容易に精製可能であることが示された。
（４）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定
上記（３）で調製した精製サンプル１５μｌを用いて、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定を行った。活性測定は上記実施例８の方法を用いた。その結果、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が検出された。生産物へ転換された基質の割合は、１００％であった。一方、ベクターであるｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスを感染させたＳＦ２１の培養上清から同様に精製したサンプルを使用した際には、活性は検出されなかった。
以上の結果より、昆虫細胞で分泌発現させたＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドはβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有することが示された。この結果は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３）をＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として昆虫細胞で分泌生産可能であり、また、生産した融合タンパク質を用いて糖鎖合成が可能なことを示している。
実施例１５ 分泌型β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（分泌型Ｇ３）の基質特異性の検討
実施例１４で精製したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドを用いて、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３）の基質特異性の検討を行った。
（１）ピリジルアミノ化オリゴ糖を基質とした解析
上記実施例１１の（１）で示した方法を用いて、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドの基質特異性の検討を行った。酵素反応は３７℃で２時間行った。
ピリジルアミノ化ＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００％とした時の相対活性を第３表に示した。ＬＮｎＴを基質とした時の基質の生産物への転換効率は８２．５％であった。β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３）は、ＬＮｎＴは良い基質とするが、ＬＮＴはほとんど基質としないことが判明した。一方、ＬＮＴ中のグルコース残基にフコースがα１、３結合で付加したオリゴ糖であるＬＮＦＰ−Ｖは、Ｇ３の比較的よい基質となることが明らかとなった。ＬＮｎＴ中の非還元末端から２番目に存在するＧｌｃＮＡｃ残基にフコースがα１、３結合で付加したオリゴ糖であるＬＮＦＰ−ＩＩＩは、Ｇ３の基質にならないことも明らかになった。また、ＬＮＴ中の非還元末端から２番目に存在するＧｌｃＮＡｃ残基にフコースがα１、４結合で付加したオリゴ糖であるＬＮＦＰ−ＩＩやＬＮＤＦＨ−ＩＩは、Ｇ３の基質にならないことも明らかになった。
第１表、第３表および後述の第５表を比較することにより、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３）は、本発明で取得した他のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４、Ｇ７）とは明らかに基質特異性が異なる酵素であることも判明した。
Figure 0004551041
（２）無標識オリゴ糖を基質とした解析
実施例１１の（２）で示した方法を用いて、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドの基質特異性の検討を行った。酵素反応は３７℃で２時間行った。
ＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００％とした時の相対活性を第４表に示した。ＬＮｎＴを基質とした時の基質の生産物への転換効率は４．６％であった。β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３）は、４糖のＬＮｎＴに加えて、２糖のＬａｃｔｏｓｅ、および６糖のＬＮｎＨも良い基質とすることが判明した。以上のことから、Ｇ３はポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を効率よく合成できると考えられる。ＬＮｎＴ、Ｌａｃｔｏｓｅ、ＬＮｎＨに対する活性と比較すると活性は低いが、Ｇ３はＬａｃＮＡｃおよびＬＮＴも基質とした。既知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、ＬａｃｔｏｓｅよりもＬａｃＮＡｃを良い基質とすることが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１１８（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，４０６（１９９９）〕。従って、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３）は、既知の酵素とは明らかに基質特異性が異なる酵素であることが判明した。一例として、クローン化されたβ３ＧｎＴの基質特異性（文献値）を第４表に合わせて示す〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，４０６（１９９９）〕。
第２表、第４表および後述の第６表との比較からも、実施例１４の結果同様、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３）は、本発明で取得した他のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４、Ｇ７）とは明らかに基質特異性が異なる酵素であることも確認された。
Figure 0004551041
一方、ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを受容基質として、分泌型Ｇ３のβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を測定した際には、活性は検出されなかった。従って、Ｇ３はβ１，３−ガラクトース転移酵素活性は有していないことが明らかになった。方法は実施例１１の（２）に記載の方法を用いた。
実施例１６ 分泌型β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（分泌型Ｇ３）を用いたポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成
実施例１４で精製したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドとβ１，４−ガラクトース転移酵素を用いて、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成を行った。
（１）ｏｎｅ−ｐｏｔ反応
上記実施例１２の（２）で示した方法を用いて、ＬＮｎＴに、上記実施例１４で精製したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ３ポリペプチドとウシミルクより精製したβ１，４−ガラクトース転移酵素（ＳＩＧＭＡ社製）を同時に作用させることにより、ＬＮｎＴの非還元末端に、Ｎ−アセチルラクトサミンが付加した糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、およびＬＮｎＴの非還元末端にポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎ（ｎ≧２）が付加した糖鎖を合成した。
具体的な反応は以下のように行った。
３０μｌの反応溶液〔２００ｍｍｏｌ／ｌ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＳＩＧＭＡ社製）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＵＤＰ−Ｇａｌ（ＳＩＧＭＡ社製）、２０ｍｍｏｌ／ｌ ＭｎＣｌ２、５０μｍｏｌ／ｌ ピリジルアミノ化糖鎖基質、実施例１４で精製したＧ３ポリペプチド１０μｌ、β１，４−ガラクトース転移酵素２０ｍＵ〕中で３７℃、５時間反応した。基質としては、ピリジルアミノ化したＬＮｎＴを使用し、生産物の生成はＨＰＬＣにより確認した。
方法は、上記実施例１１の（１）で示した方法に従った。
その結果、ピリジルアミノ化したＬＮｎＴの非還元末端に（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３）ｎ（ｎ＝１、２、３または４）が付加した糖鎖が合成された。従って、Ｇ３ポリペプチドとβ１，４−ガラクトース転移酵素を用いたｏｎｅ−ｐｏｔ反応により、効率よくポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を合成可能なことが明らかとなった。酵素量、基質量、反応時間を増加させることにより、さらに長いポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成も可能と考えられる。
実施例１７ 昆虫細胞を宿主としたＦＬＡＧペプチド融合型β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ７）の分泌生産
実施例１０と同様にして、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドの昆虫細胞での分泌発現を行った。
（１）プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ７の造成
ポリペプチドＧ７は、その一次配列から、Ｎ末端の２９アミノ酸からなる細胞質領域、それに続く２０アミノ酸からなる疎水性に富む膜結合領域、少なくとも１２アミノ酸からなる幹領域、および触媒領域を含む残りの大半のＣ末端部分からなると考えられた。そこで、Ｇ７ポリペプチドのＮ末端の２９アミノ酸からなる細胞質領域、２０アミノ酸からなる膜結合領域、および幹領域の一部（６アミノ酸）を除去し、該除去領域に免疫グロブリンのシグナル配列ならびにＦＬＡＧペプチドを付加することによりＧ７ポリペプチドの分泌発現を試みた。
まず、Ｇ７ポリペプチドの触媒活性を有すると考えられる領域〔配列番号４の５６番目のアラニンから３７８番目のアルギニンまで〕をコードするＤＮＡ領域をＰＣＲを用いて調製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターに組み込むことにより、プラスミドｐＢｌｕｎｔ−Ｇ７を造成した。以下具体的方法を記す。
ＰＣＲ用のプライマーとして、配列番号３３で示されるＤＮＡ（以下、Ｇ７Ｓ−１と呼ぶ）および配列番号３４で示されるＤＮＡ（以下、Ｇ７Ｓ−２と呼ぶ）を合成した。
Ｇ７Ｓ−１にはＢｇｌＩＩサイトがＧ７Ｓ−２にはＮｏｔＩサイトが導入されるようにデザインされている。
ＰＣＲ反応はＴａＫａＲａ社製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと添付の１０×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ Ｂｕｆｆｅｒおよび２．５ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅを用いて、説明書に従って行った。ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＣＥＴＵＳ ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ；ＴａＫａＲａ社販売）を用いて、９４℃で３０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を１６サイクル行った後、さらに７２℃で１０分間反応させた。鋳型としては上記実施例４で造成したプラスミドｐＴ７Ｂ−Ｇ７を２０ｎｇ使用した。該ＰＣＲにより、約１．０ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターに組み込むことにより、プラスミドｐＢｌｕｎｔ−Ｇ７を造成した。ｐＢｌｕｎｔ−Ｇ７中に組み込まれたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、ＰＣＲによるエラーがないことを確認した。
ｐＢｌｕｎｔ−Ｇ７を制限酵素ＢｇｌＩＩとＮｏｔＩで切断することにより、Ｇ７ポリペプチドの触媒活性を有すると考えられる領域〔配列番号４の５６番目のアラニンから３７８番目のアルギニンまで〕をコードする１．０ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ断片を取得した。ｐＶＬ１３９３を制限酵素ＮｏｔｌとＢｓｔＰＩで切断し、６．４ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｔＰＩ断片を取得した。実施例１０で造成したｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４を制限酵素ＢａｍＨＩとＢｓｔＰＩで切断した、３．３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢｓｔＰＩ断片を取得した。上記３断片を結合することにより、ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ７を造成した。
（２）組換えウィルスの作製
ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドを昆虫細胞で分泌発現させるための組換えウィルスの作製を行った。昆虫細胞Ｓｆ９に、線状バキュロウィルスＤＮＡと上記（１）で造成したプラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ７をリポフェクチン法により導入することにより、組換えバキュロウィルスを作製した。方法は、上記実施例１０に記載の方法を用いた。
（３）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドの分泌生産と精製
上記（２）で作製した組換えウィルスを用いて、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドを昆虫細胞で分泌生産させた。次いで、該ポリペプチドを含有する培養上清から該ポリペプチドを精製した。方法は、実施例１０に記載の方法を用いた。
精製サンプルの１５μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、クーマジ・ブリリアント・ブルーを用いて染色を行った（図２２）。ｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ７由来の組換えウイルスを感染させたＳｆ２１の培養上清から精製したサンプルを使用した際には、４０〜４２ｋＤ付近にＧ７ポリペプチドと推定されるバンドが確認された。各バンドの分子量の違いは付加する糖鎖の数や大きさの違いに由来すると考えられる。Ｇ７ポリペプチドには、Ｎ結合型糖鎖の付加が可能な部位が３個所存在している。
以上の結果より、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドが昆虫細胞の培養上清中に分泌生産され、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いて容易に精製可能であることが示された。
（４）ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定
上記（３）で調製した精製サンプル１５μｌを用いて、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドのβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性の測定を行った。活性測定は上記実施例８の方法を用いた。その結果、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性が検出された。生産物へ転換された基質の割合は、２．１％であった。一方、ベクターであるｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスを感染させたＳＦ２１の培養上清から同様に精製したサンプルを使用した際には、活性は検出されなかった。
以上の結果より、昆虫細胞で分泌発現させたＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドはβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有することが示された。この結果は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ７）をＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として昆虫細胞で分泌生産可能であり、また、生産した融合タンパク質を用いて糖鎖合成が可能なことを示している。
実施例１８ 分泌型β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（分泌型Ｇ７）の基質特異性の検討
実施例１７で精製したＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドを用いて、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ７）の基質特異性の検討を行った。
（１）ピリジルアミノ化オリゴ糖を基質とした解析
実施例１１の（１）で示した方法を用いて、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドの基質特異性の検討を行った。酵素反応は３７℃で１６時間行った。
ピリジルアミノ化ＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００％とした時の相対活性を第５表に示した。ＬＮｎＴを基質とした時の基質の生産物への転換効率は３．７６％であった。β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ７）は、非還元末端にＩＩ型糖鎖（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）を有するＬＮｎＴは良い基質とするが、非還元末端にＩ型糖鎖（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）を有するＬＮＴやＬＮＦＰ−Ｖはほとんど基質としないことが判明した。また、ＬＮｎＴ中の非還元末端から２番目に存在するＧｌｃＮＡｃ残基にフコースがα１、３結合で付加したオリゴ糖であるＬＮＦＰ−ＩＩＩは、Ｇ７の基質になりにくいことも明らかになった。ＬＮＴ中の非還元末端から２番目に存在するＧｌｃＮＡｃ残基にフコースがα１、４結合で付加したオリゴ糖であるＬＮＦＰ−ＩＩやＬＮＤＦＨ−ＩＩは、Ｇ７の基質にならないことも明らかになった。以上のことから、Ｇ７は非還元末端に未修飾のＩＩ型糖鎖を有する糖鎖を良い基質とすると考えられた。
第１表、第３表および第５表を比較することにより、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ７）は、本発明で取得した他のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３、Ｇ４）とは明らかに基質特異性が異なる酵素であることも判明した。
Figure 0004551041
（２）無標識オリゴ糖を基質とした解析
上記実施例１１の（２）で示した方法を用いて、ＦＬＡＧペプチド融合型Ｇ７ポリペプチドの基質特異性の検討を行った。酵素反応は３７℃で１５．５時間行った。
ＬＮｎＴを基質とした時の活性を１００％とした時の相対活性を第６表に示した。
ＬＮｎＴを基質とした時の基質の生産物への転換効率は３．０７％であった。β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ７）は、４糖のＬＮｎＴを最もよい基質とした。Ｇ７は２糖のＬａｃｔｏｓｅも比較的よい基質としたが、６糖のＬＮｎＨはほとんど基質としなかった。Ｇ７は２糖のＬａｃＮＡｃも基質としたが、Ｌａｃｔｏｓｅに比較すると活性は低かった。一方、Ｇ７はＬＮＴを基質としなかった。
以上のことから、Ｇ７は６糖までのポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖の合成は可能だが、８糖以上のポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を合成する活性は非常に弱いと考えられた。既知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素は、ＬａｃｔｏｓｅよりもＬａｃＮＡｃを良い基質とすることが知られている〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２７１１８（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，４０６（１９９９）〕。従って、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ７）は、既知の酵素とは明らかに基質特異性が異なる酵素であることが判明した。一例として、クローン化されたβ３ＧｎＴの基質特異性（文献値）を第６表に合わせて示す〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，４０６（１９９９）〕。 第２表、第４表および第６表を比較することにより、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ３）は、本発明で取得した他のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｇ４、Ｇ７）とは明らかに基質特異性が異なる酵素であることも判明した。
Figure 0004551041
一方、ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを受容基質として、分泌型Ｇ７のβ１，３−ガラクトース転移酵素活性を測定した際には、活性は検出されなかった。従って、Ｇ７はβ１，３−ガラクトース転移酵素活性は有していないことが明らかになった。方法は実施例１１の（２）に記載の方法を用いた。
実施例１９ Ｇ３、Ｇ４、Ｇ７の各遺伝子転写産物の各種癌組織における発現量の検討
各種癌組織と該癌組織周辺の正常組織における、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ７の各遺伝子転写産物の発現量の検討を行った。方法は文献〔Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，８３，７０（１９９９）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９，６０７（１９９９）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７８，７９７（１９９８）〕に従った。
（１）各種正常組織および癌組織由来の一本鎖ｃＤＮＡの合成
大腸癌（１０例）、胃癌（７例）、および肺癌（６例）の患者から、癌組織と癌組織周辺の正常組織を採取した。上記の各組織から、ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法を用いて全ＲＮＡは調製し、該全ＲＮＡを鋳型として一本鎖ｃＤＮＡの合成を行った。キット（ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、５μｇの全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、各々水で５０倍希釈してＰＣＲの鋳型として使用した。プライマーとしては、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。
（２）スタンダードおよび内部コントロールの調製
ｐＢＳ−Ｇ３、ｐＢＳ−Ｇ４−２、ｐＴ７Ｂ−Ｇ７を用いて、スタンダードおよび内部コントロールの造成を行った〔下記（ａ）〜（ｆ）参照〕。
β−アクチン転写産物の定量においては、ｐＵＣ１１９−ＡＣＴおよびｐＵＣ１１９−ＡＣＴｄをｃＤＮＡ部分を切り出す制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩとＡｓｐ７１８）で切断して直鎖状ＤＮＡに変換した後、それぞれスタンダードおよび内部コントロールとして用いた〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１４７３０（１９９４）、特開平０６−１８１７５９〕。各プラスミドが完全に切断された事を確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
（ａ）Ｇ３転写産物定量用スタンダードの調製
ｐＢＳ−Ｇ３を制限酵素ＢｇｌＩＩで切断し、４．５ｋｂのＢｇｌＩＩ断片を取得した。該断片を結合することにより、ｐＢＳ−Ｇ３Ｓを造成した。ｐＢＳ−Ｇ３Ｓを制限酵素ＸｂａＩとＡｃｃＩで切断し、Ｇ３ｃＤＮＡ部分を直鎖状ＤＮＡとしたものを定量用のスタンダードとして用いた。プラスミドが完全に切断されたことを確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
（ｂ）Ｇ３転写産物定量用内部コントロールの調製
上記（ａ）で造成したｐＢＳ−Ｇ３Ｓにおいて、Ｇ３ｃＤＮＡ中のＥｃｏ８１Ｉ−ＰｆＩＭＩ間２２９ｂｐを欠失させることによりｐＢＳ−Ｇ３Ｓｄを作製した。ｐＢＳ−Ｇ３Ｓを制限酵素Ｅｃｏ８１ＩとＰｆＩＭＩで切断し、４．３ｋｂのＥｃｏ８１Ｉ−ＰｆＩＭＩ断片を取得した。該断片を結合することにより、ｐＢＳ−Ｇ３Ｓｄを造成した。ｐＢＳ−Ｇ３Ｓｄを制限酵素ＸｂａＩとＡｃｃＩで切断し、Ｇ３ｃＤＮＡ部分を直鎖状ＤＮＡとしたものを定量用の内部コントロールとして用いた。プラスミドが完全に切断されたことを確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
（ｃ）Ｇ４転写産物定量用スタンダードの調製
実施例３で取得したｐＢＳ−Ｇ４−２を制限酵素ＸｂａＩとＣｌａＩで切断し、Ｇ４ｃＤＮＡ部分を直鎖状ＤＮＡとしたものを定量用のスタンダードとして用いた。プラスミドが完全に切断されたことを確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
（ｄ）Ｇ４転写産物定量用内部コントロールの調製
実施例３で取得したｐＢＳ−Ｇ４−２において、Ｇ４ｃＤＮＡ中のＢｓｔＥＩＩ−ＰｍｌＩ間１８０ｂｐを欠失させることによりｐＢＳ−Ｇ４−２ｄを作製した。ｐＢＳ−Ｇ４−２を制限酵素ＢｓｔＥＩＩとＰｍｌＩで切断し、４．９ｋｂのＢｓｔＥＩＩ−ＰｍｌＩ断片を取得した。該断片を結合することにより、ｐＢＳ−Ｇ４−２ｄを造成した。ｐＢＳ−Ｇ４−２ｄをＸｂａＩとＣｌａＩで切断し、Ｇ４ｃＤＮＡ部分を直鎖状ＤＮＡとしたものを定量用の内部コントロールとして用いた。プラスミドが完全に切断されたことを確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
（ｅ）Ｇ７転写産物定量用スタンダードの調製
実施例４で取得したｐＴ７Ｂ−Ｇ７を制限酵素Ｔｔｈ１１１ＩとＮａｒＩで切断し、Ｇ４ｃＤＮＡ部分を直鎖状ＤＮＡとしたものを定量用のスタンダードとして用いた。プラスミドが完全に切断されたことを確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
（ｆ）Ｇ７転写産物定量用内部コントロールの調製
実施例４で取得したｐＴ７Ｂ−Ｇ７において、Ｇ７ｃＤＮＡ中のＴｔｈ１１１Ｉ−ＮａｒＩ間２０８ｂｐを欠失させることによりｐＴ７Ｂ−Ｇ７ｄを作製した。ｐＴ７Ｂ−Ｇ７を制限酵素Ｔｔｈ１１１ＩとＮａｒＩで切断し、４．０ｋｂのＴｔｈ１１１Ｉ−ＮａｒＩ断片を取得した。該断片を結合することにより、ｐＴ７Ｂ−Ｇ７ｄを造成した。ｐＴ７Ｂ−Ｇ７ｄをＨｉｎｃＩＩとＳｍａＩで切断し、Ｇ７ｃＤＮＡ部分を直鎖状ＤＮＡとしたものを定量用の内部コントロールとして用いた。プラスミドが完全に切断されたことを確認後、酵母のトランスファーＲＮＡを１μｇ／ｍｌで含む水で段階的に希釈して使用した。
（３）定量的ＰＣＲ法を用いたＧ３、Ｇ４、Ｇ７の各遺伝子の転写産物の定量
（１）で調製した正常組織および癌組織由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲ用プライマーとしては、Ｇ３転写物検出用にはＣＢ４８９（配列番号３５）とＣＢ４９０（配列番号３６）を、Ｇ４転写物検出用にはＣＢ４９５（配列番号３７）とＣＢ５２３（配列番号３８）を、Ｇ７転写物検出用にはＣＢ４９３（配列番号３９）とＣＢ５２５（配列番号４０）を使用した。。また、（２）で作製したスタンダードと内部コントロールを鋳型として同様にＰＣＲを行うことにより検量線を作製した。
上記各組織由来のｃＤＮＡ １０μｌおよび内部コントロール用プラスミド１０μｌ（１０ｆｇ）を含む５０μｌの反応溶液〔１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ １．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．２ｍｍｏｌ／ｌ ｄＮＴＰ、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．２μｍｏｌ／ｌ 遺伝子特異的プライマー〕で、ＤＮＡポリメラーゼＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）を用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、以下の条件で行った。
Ｇ３転写産物定量の際は、９５℃で１１分間の加熱後、９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、４２サイクル行った。
Ｇ４転写産物定量の際は、９５℃で１１分間の加熱後、９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、４２サイクル行った。
Ｇ７転写産物定量の際は、９５℃で１１分間の加熱後、９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、４４サイクル行った。
β−アクチン転写産物定量の際は、９５℃で１１分間の加熱後、９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分間からなる反応を１サイクルとして、２４サイクル行った。
ＰＣＲ後の溶液のうち１０μｌを１％のアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、写真を撮影した。写真をＮＩＨイメージシステムによりスキャニングすることにより増幅した断片の染色の強さを測定し、増幅量とした。より正確な転写産物の定量を行なうため、ＰＣＲのサイクル数を変えて同様のＰＣＲを行った。スタンダードおよび内部コントロールの量はＰＣＲのサイクル数に応じて変化させた。
細胞由来の一本鎖ｃＤＮＡのかわりに上記（ａ）、（ｃ）、（ｅ）で調製したスタンダードを１．２５ｆｇ、２．５ｆｇ、５ｆｇ、１０ｆｇ、２０ｆｇ、４０ｆｇ用いてＰＣＲを行い、増幅断片の増幅量を測定し、ｃＤＮＡの量と断片の増幅量をプロットして検量線を作成した。
上記Ｇ３転写産物定量用プライマーを用いた場合は、Ｇ３転写産物およびＧ３のスタンダードからは６４７ｂｐのＤＮＡ断片が、Ｇ３の内部コントロールからは４１８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅する。
上記Ｇ４転写産物定量用プライマーを用いた場合は、Ｇ４転写産物およびＧ４のスタンダードからは４９８ｂｐのＤＮＡ断片が、Ｇ４の内部コントロールからは３１８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅する。
上記Ｇ７転写産物定量用プライマーを用いた場合は、Ｇ７転写産物およびＧ７のスタンダードからは６１９ｂｐのＤＮＡ断片が、Ｇ７の内部コントロールからは４１１ｂｐのＤＮＡ断片が増幅する。
上記検量線と各組織由来ｃＤＮＡでの断片の増幅量から、各組織でのｃＤＮＡ量を計算し、転写産物量とした。なお、β−アクチンは各組織で普遍的に発現している遺伝子と考えられるため、どの組織においてもその発現量は同程度と考えられる。従って、各組織におけるβ−アクチン転写物の発現量の差は、ｃＤＮＡ合成反応の効率の差と考えられるため、各遺伝子の発現量を比較する際にはβ−アクチン転写物の発現量も考慮した。
大腸癌患者（１０例）の癌組織とその周辺の正常組織におけるＧ３、Ｇ４およびＧ７転写産物の量を、β−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として、第７表に示した。
大腸癌患者の癌組織とその周辺の正常組織では、ほとんどの場合Ｇ３およびＧ４転写物の発現がみられたが、癌組織と正常組織における発現量に相関はみられなかった。一方、Ｇ７転写物は癌組織および正常組織いずれにおいてもほとんど発現していなかった。発現量（相対値）が１以下の場合、ほとんど発現していないととらえることができる。
Figure 0004551041
胃癌患者（７例）の癌組織とその周辺の正常組織におけるＧ３、Ｇ４およびＧ７転写産物の量を、β−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として、第８表に示した。
胃癌患者の癌組織とその周辺の正常組織では、ほとんどの場合Ｇ３およびＧ４転写物の発現がみられたが、癌組織と正常組織における発現量に相関はみられなかった。一方、Ｇ７転写物は癌組織および正常組織いずれにおいてもほとんど発現していなかった。
Figure 0004551041
肺癌患者（６例）の癌組織とその周辺の正常組織におけるＧ３、Ｇ４およびＧ７転写産物の量を、β−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として、第９表に示した。
肺癌患者の癌組織とその周辺の正常組織では、全ての場合でＧ３転写物の発現がみられたが、癌組織と正常組織における発現量に相関はみられなかった。Ｇ７転写物は癌組織および正常組織いずれにおいてもほとんど発現していなかった。Ｇ４転写物に関しては、正常組織ではほとんど発現がみられなかったのに対し、６例中５例の癌組織において明らかな発現がみられた。これは、癌化に伴ってＧ４転写産物が発現することを示唆している。
Figure 0004551041
そこで、さらに肺癌患者１６例についても同様の解析を行った。上記６例の結果と合せ、肺癌患者（２２例）の癌組織とその周辺の正常組織におけるＧ３、Ｇ４およびＧ７転写産物の発現量を、β−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として第１０表に示した。
肺癌の分類ごとに整理して発現量を示した。
肺癌患者（２２例）の癌組織とその周辺の正常組織におけるＧ３、Ｇ４およびＧ７転写産物量。β−アクチンの転写産物の量を１０００とした時の相対値として示した。
Figure 0004551041
発現量（相対値）が１以上のものを発現しているとすると、正常組織でＧ４転写物が発現していたのは全２２例中１例で、この場合の発現量も１と低い。一方、癌組織でＧ４転写物が発現していたのは全２２例中１７例である。また、正常組織でＧ４転写物の発現がみられた１例（表中のＬＣ１４）においても、癌組織での発現量は７．６と、癌化に伴って明らかに増加していた。Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎａｍａだけをみると、全１５例中１４例（図中のＬＣ２４以外）においては、癌化に伴いＧ４転写産物の発現量が増加していることがわかる。Ｓｑｕａｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎａｍａにおいては、４例中２例で癌化とＧ４転写産物の発現量に相関がみられた。
以上の結果は、肺癌（特にＡｄｅｎｏｃａｒｃｉｎａｍａ）においては、癌化に伴ってＧ４転写産物が発現することを示している。正常組織でＧ４転写物の発現がみられた１例（図中のＬＣ１４）においては、正常組織に癌組織が混じっていた可能性も考えられる。Ｇ４遺伝子は、正常の肺組織でほとんど発現しておらず、癌化に伴ってはじめて発現してくる遺伝子であると考えられる。従って、肺組織におけるＧ４遺伝子やＧ４蛋白質の発現量を調べることにより、肺癌の診断が可能と考えられる。
産業上の利用可能性
本発明は、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドの製造法、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが組み込まれた組換え体ベクター、該組換え体ベクターを保有する形質転換体、該ポリペプチドを認識する抗体、該抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法および免疫染色法、該ポリペプチドを用いたＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法、該組換え体ベクターを保有する形質転換体を用いたＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌ構造を有する糖鎖、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖および該糖鎖を含有する複合糖質の製造法、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質のスクリーニング法、該ポリペプチドの有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる物質のスクリーニング法、該ＤＮＡあるいは該抗体を用いた炎症や癌（大腸癌、膵臓癌、胃癌など）の診断法、該ＤＮＡ、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる物質あるいは該ポリペプチドの有するβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる物質を用いた炎症や癌（大腸癌、膵臓癌、胃癌など）の治療法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号８−Ｇ７ｃＤＮＡの塩基配列
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：ＦＬＡＧペプチドのアミノ酸配列
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図：第１図は、Ｇ４ｃＤＮＡの１〜４７７番目までの塩基配列とＧ４−２ｃＤＮＡの１〜４５１番目までの塩基配列を比較した図である。
第２図：第２図は、Ｇ４ｃＤＮＡの４７８〜１０７７番目までの塩基配列とＧ４−２ｃＤＮＡの４５２〜１０５１番目までの塩基配列を比較した図である。
第３図：第３図は、Ｇ４ｃＤＮＡの１０７８〜１６７７番目までの塩基配列とＧ４−２ｃＤＮＡの１０５２〜１６５１番目までの塩基配列を比較した図である。
第４図：第４図は、Ｇ４ｃＤＮＡの１６７８〜２２０５番目までの塩基配列とＧ４−２ｃＤＮＡの１６５２〜２１８０番目までの塩基配列を比較した図である。
第５図：第５図は、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ４−２およびＧ７ポリペプチド、既知のβ１，３−ガラクトース転移酵素（β３Ｇａｌ−Ｔ１、β３Ｇａｌ−Ｔ２、β３Ｇａｌ−Ｔ３、β３Ｇａｌ−Ｔ４、β３Ｇａｌ−Ｔ５）、ならびに既知のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（β３ＧｎＴ）のアミノ酸配列を比較したデンドログラムである。相同性がみられた領域のアミノ酸配列のみを用いて比較している。すなわち、細胞質領域、膜結合領域、および幹領域と思われる部分は除いて比較している。
第６図：第６図は、プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ３の造成工程を示す図である。
第７図：第７図は、プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ４の造成工程を示す図である。
第８図：第８図は、プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ４−２の造成工程を示す図である。
第９図：第９図は、プラスミドｐＡＭｏ−Ｇ７の造成工程を示す図である。
第１０図：第１０図は、発現プラスミド（ｐＡＭｏ−Ｇ３、ｐＡＭｏ−Ｇ４、ｐＡＭｏ−Ｇ４−２またはｐＡＭｏ−Ｇ７）およびコントロールプラスミドｐＡＭｏをそれぞれＮａｍａｌｗａ ＫＪＭ−１細胞に導入し、ＬＥＡレクチン（太線）、ＰＷＭレクチン（太線）またはＡ−ＰＢＳ（細線）を用いた間接蛍光抗体染色の後、ＦＡＣＳを用いて解析した結果である。
第１１図：第１１図は、プラスミドｐＡＭｏＦ２−Ｇ４の造成工程を示す図である。
第１２図：第１２図は、プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４の造成工程を示す図である。
第１３図：第１３図は、プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ４由来の組換えウイルスが感染したＳｆ２１細胞の培養上清から、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いてＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ４を精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示した図である（レーン２）。コントロールとして、プラスミドｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスが感染したＳｆ２１細胞の培養上清から同様にしてサンプルを調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した（レーン１）。矢印は、生産された分泌型Ｇ４ポリペプチドの位置を示している。
第１４図：第１４図は、ＰＣＲ法を用いて、３５種のヒト臓器におけるＧ３転写物の発現量を調べた結果を示した電気泳動の図である。ＰＣＲのサイクル数は２６である。矢印は目的の増幅断片（５６４ｂｐ）の位置を示している。
第１５図：第１５図は、ＰＣＲ法を用いて、ヒトの各種血球細胞株、ヒト多型核白血球（ＰＭＮ）、ヒト単球およびヒトリンパ球におけるＧ３転写物の発現量を調べた結果を示した電気泳動の図である。ＰＣＲのサイクル数は２８である。矢印は目的の増幅断片（５６４ｂｐ）の位置を示している。
第１６図：第１６図は、ＰＣＲ法を用いて、３５種のヒト臓器におけるＧ４転写物の発現量を調べた結果を示した電気泳動の図である。ＰＣＲのサイクル数は２６である。矢印は目的の増幅断片（２０２ｂｐ）の位置を示している。
第１７図：第１７図は、ＰＣＲ法を用いて、ヒトの各種血球細胞株、ヒト多型核白血球（ＰＭＮ）、ヒト単球およびヒトリンパ球におけるＧ４転写物の発現量を調べた結果を示した電気泳動の図である。ＰＣＲのサイクル数は２８である。矢印は目的の増幅断片（２０２ｂｐ）の位置を示している。ＰＭＮおよびリンパ球でみられるバンドは目的のバンドではない。
第１８図：第１８図は、ＰＣＲ法を用いて、ヒトの各種癌細胞株におけるＧ４転写物の発現量を調べた結果を示した電気泳動の図である。ＰＣＲのサイクル数は２７である。矢印は目的の増幅断片（２０２ｂｐ）の位置を示している。
第１９図：第１９図は、ＰＣＲ法を用いて、３５種のヒト臓器におけるＧ７転写物の発現量を調べた結果を示した電気泳動の図である。ＰＣＲのサイクル数は２６である。矢印は目的の増幅断片（４５６ｂｐ）の位置を示している。
第２０図：第２０図は、ＰＣＲ法を用いて、ヒトの各種血球細胞株、ヒト多型核白血球（ＰＭＮ）、ヒト単球およびヒトリンパ球におけるＧ７転写物の発現量を調べた結果を示した電気泳動の図である。ＰＣＲのサイクル数は２８である。矢印は目的の増幅断片（４５６ｂｐ）の位置を示している。
第２１図：第２１図は、プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ３由来の組換えウイルスが感染したＳｆ２１細胞の培養上清から、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いてＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ３を精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示した図である（レーン２）。コントロールとして、プラスミドｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスが感染したＳｆ２１細胞の培養上清から同様にしてサンプルを調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した（レーン１）。矢印は、生産された分泌型Ｇ３ポリペプチドの位置を示している。
第２２図：第２２図は、プラスミドｐＶＬ１３９３−Ｆ２Ｇ７由来の組換えウイルスが感染したＳｆ２１細胞の培養上清から、抗ＦＬＡＧ Ｍ１アフィニティーゲルを用いてＦＬＡＧペプチド融合分泌型Ｇ７を精製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示した図である（レーン２）。コントロールとして、プラスミドｐＶＬ１３９３由来の組換えウイルスが感染したＳｆ２１細胞の培養上清から同様にしてサンプルを調製し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した（レーン１）。矢印は、生産された分泌型Ｇ７ポリペプチドであると予測される位置を示している。
符号の説明
ｂｐ： 塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ）
ｋｂ： キロ塩基対（ｋｉｌｏｂａｓｅ ｐａｉｒｓ）
Ｇ４１８／Ｋｍ： トランスポゾン５（Ｔｎ５）由来Ｇ４１８、カナマイシ
ン耐性遺伝子
Ａｐ： ｐＢＲ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子
Ｔｃ： ｐＢＲ３２２由来テトラサイクリン耐性遺伝子
Ｐ１： ｐＢＲ３２２由来Ｐ１プロモーター
Ｐｔｋ： ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ
ｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ；ＨＳＶチミジンキナーゼ（
ｔｋ）遺伝子プロモーター
Ｓｐ．ＢＧ： ラビットβグロビン遺伝子スプライシングシグナル
Ａ．ＢＧ： ラビットβグロビン遺伝子ポリＡ付加シグナル
Ａ．ＳＥ： シミアン・ウィルス（ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ）４０
（ＳＶ４０）初期遺伝子ポリＡ付加シグナル
Ａ．Ａｔｋ： ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ
ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ；ＨＳＶ）チミジンキナー
ゼ（ｔｋ）遺伝子のポリＡ付加シグナル
Ｐｍｏ： モロニー・マウス白血病ウイルスのロング・ターミナル
・リピート（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａ
ｔ：ＬＴＲ）プロモーター
ＥＢＮＡ−１： エプシュタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）のＥＢＮＡ−１遺伝子
ｏｒｉＰ： エプシュタイン・バール・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−
Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）の複製開始点
Ｓ： 免疫グロブリンκのシグナルペプチドをコードする遺伝
子部分
Ｆ： ＦＬＡＧペプチドをコードする遺伝子部分
Ｇ３： 本発明で取得したβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン
転移酵素Ｇ３をコードするＤＮＡ（全長または部分長）
Ｇ４： 本発明で取得したβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン
転移酵素Ｇ４またはβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミ
ン転移酵素Ｇ４−２をコードするＤＮＡ（全長または部
分長）
Ｇ７： 本発明で取得したβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン
転移酵素Ｇ７をコードするＤＮＡ（全長または部分長）

Claims (13)

  1. 以下の（ａ）および（ｂ）からなる群より選ばれるβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドを用いることを特徴とする、糖鎖合成方法。
    （ａ） 配列番号１記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （ｂ） 配列番号１記載のアミノ酸配列の４１番目から３９７番目のアミノ酸
    配列を含むポリペプチド
  2. 請求項１記載のポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性を有するポリペプチドを用いることを特徴とする、糖鎖合成方法。
  3. ポリペプチドのβ1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性が、糖鎖の非還元末端に存在するガラクトース残基にβ1,3結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項１または２記載の糖鎖合成方法。
  4. β1,3-N-アセチルグルコサミン転移酵素活性が、 i)Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ1-4GlcNAc）またはラクトース（Galβ1-4Glc）、 ii) Ｎ−アセチルラクトサミンまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、 およびiii) Ｎ−アセチルラクトサミンまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質の非還元末端に存在するガラクトース残基に、β1,3結合でＮ−アセチルグルコサミンを転移する活性である請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖鎖合成方法。
  5. 請求項１または２記載のポリペプチドを酵素源として用い、
    （ａ）該酵素源、
    （ｂ）i)Ｎ−アセチルラクトサミン（Galβ1-4GlcNAc）、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース（Galβ1-4Glc）、 ii) Ｎ−アセチルラクトサミン、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース構造を非還元末端に有するオリゴ糖、 およびiii) Ｎ−アセチルラクトサミン、Galβ1-3GlcNAcまたはラクトース構造を非還元末端に有する複合糖質から選ばれる受容基質、および
    （ｃ）ウリジン−５’−二リン酸Ｎ−アセチルグルコサミンを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に、該受容基質のガラクトース残基にβ1,3結合でＮ−アセチルグルコサミンが付与された糖鎖または複合糖質を生成・蓄積させ、該水性媒体中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
  6. 請求項１または２記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培養液中で培養し、該培養物中に、 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc構造を有する糖、(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4GlcNAc構造を有しｎが１以上である糖、および（Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4Glc構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該培養物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
  7. 形質転換体が、微生物、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞からなる群から選ばれる形質転換体である、請求項６記載の製造法。
  8. 請求項１または２記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該動物中に、 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc構造を有する糖、(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4GlcNAc構造を有しnが１以上である糖、および(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4Glc構造を有しnが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該動物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
  9. 請求項１または２記載のポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡを保有するトランスジェニック植物を栽培し、該植物中に、 GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc構造を有する糖、GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc構造を有する糖、(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4GlcNAc構造を有しｎが１以上である糖、および(Galβ1-4GlcNAcβ1-3)nGalβ1-4Glc構造を有しｎが１以上である糖からなる群より選ばれる糖よりなる糖鎖、または該糖鎖を含有する複合糖質を生成・蓄積させ、該植物中より該糖鎖または複合糖質を採取することを特徴とする、該糖鎖または複合糖質の製造法。
  10. 複合糖質が、糖蛋白質、糖脂質、プロテオグリカン、グリコペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、およびステロイド化合物等に糖鎖が結合した配糖体から選ばれる複合糖質である、請求項５〜９のいずれか１項に記載の製造法。
  11. 生成・蓄積が動物のミルク中であることを特徴とする、請求項８記載の製造法。
  12. 請求項１または２に記載のポリペプチドと被験試料とを接触させることを特徴とする、該ポリペプチドの有するβ１,３-Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を変動させる化合物のスクリーニング法。
  13. 請求項１または２に記載のポリペプチドを発現する細胞と被験試料とを接触させ、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖を認識する抗体またはレクチンを用い、ポリ−Ｎ−アセチルラクトサミン糖鎖含量を測定することを特徴とする、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を変動させる化合物のスクリーニング法。
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