JP4705000B2 - 免疫学的検定のための製品およびプロセス - Google Patents

Description

本出願は、２００６年４月２７日出願の米国仮特許出願第６０／７９５，４５２号および２００５年１１月３日出願の米国仮特許出願第６０／７３２，９９４号に基づき優先権を主張する。

本発明は、ブロッティング膜中に含まれる物質の位置、または存在／不在を検出するための実験室デバイスおよびそのデバイスを使用するプロセスに関する。より詳しくは、それは、ブロッティング膜に試薬および洗浄溶液を施し、真空または正圧を使用することによって、この検出を迅速に達成するための技術に関する。

現在、ゲル電気泳動の使用は、生体物質を分離するための、どこにでもある技術である。非生体物質は、ゲルまたは他のクロマトグラフの支援もまた使用して分離することもできるが、生体物に関する取り組み範囲は、より広い。通常の用途では、配列決定との関連または同質異像の検出のどちらかで様々なサイズの核酸フラグメントの分離、または他の観点からのサイズの検証が含まれる。さらに、しばしば実施されるのは、タンパク質および糖タンパク質の分離、同質性または純度の検証時のゲル分離の実施である。

これらの手順すべてにおいて、生物学的存在の混合サンプルが、電気泳動のゲルに施されて、成分が、ゲル両端間に加えられた電界によって分離される。ゲルを発現させる方法にかかわらず、その結果得られたサンプル中に含まれた物質の移動パターンは、何らかの方法で検出する必要がある。

これを検出するために、通常、物質がゲル上に現れるパターンと同じパターンで物質が移送されるブロッティング膜に、ゲル担体を接触させる。次いで、タンパク質または浄化液を用いて膜を遮断し、非特異性結合を減少させることによって（そうでなければ、ノイズのレベルが高く、検出レベルが低くなる）、「スポット」が少なくとも検出される。通常の遮断剤には、ＴＢＳ−ＴまたはＰＢＳ−Ｔ溶液中に一般に約１〜５％のカゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および脱脂粉乳が含まれる。次いで、生物学的存在が、膜上で抗原に特異的な抗体を用いて培養される。次いで、膜は、十分に洗浄されて、すべての汚染物質（ゲル残留物など）、非結合遮断タンパク質や抗体その他が除去される。次いで、膜は、再び全体に洗浄され、すべての非結合二次抗体が除去される。次いで、一般に着色性、化学発光、蛍光性、放射性物質やストレプトアビジンの標識材料であり、酵素複合体と結合する、またはその基質である検出試薬が施される。最後に、適切な検出デバイスが、生物学的存在の存在、不在、位置、量等を決定するために使用される。一般に、上記の６つのステップが、選択された試薬と膜および生物学的存在との反応速度に依存して、３〜６時間から一晩までかかる。プロセスには、揺動プラットフォーム上で、膜について複数の培養期間が必要である。それは、大部分の研究者が嫌悪し、大量の試薬を消費（浪費）する長いプロセスである。

幾人かの研究者は、膜を通して残存流動体を引き出し、殊に洗浄ステップのプロセスの速度を向上させるために、ろ過紙など膜の下に配置する吸収材料の毛管現象を使用することを提案している。

米国特許第５，１５５，０４９号には、Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社から市販されているＨｙｂｒｉｄ−Ｅａｓｅの混成チャンバと呼ばれるシステムが言及されている。このチャンバは、膜を挟む２つの格子を備える。格子プレートが、膜を囲繞する所定の位置に嵌め込まれ、注射器が、格子によって生成された開いたスペース中に嵌め込まれる。一方の注射器は、試薬および洗浄剤を施し、他方は、余分を回収するために使用される。システムは、動作するために大量の液体が必要であり、使用するには煩わしく、さらにとても時間がかかる。また、その特許は、ＥＬＩＳＡ検定など、いくつかの特定の検定では、小容積のウェル（９６ウェルのマイクロタイタープレートなど）中に、洗浄ステップ中、１つまたは複数の膜を通して液体を引き出すために、真空が使用されていることを述べている。しかし、この試みが、小容積の用途のみで利用でき、また制御不能なものとして、軽視されている。彼等は、その代わり、より良好な方法は、ろ過紙および被覆層の上部上に膜を有する人力プレスを使用し、次いで２つのプレート間に挟まれた膜を押圧して、膜を通して紙中に液体を搾り出すことであると示唆している。

ブロッティング膜上の生物学的材料または存在を検出するためのより効率的な方法が必要であることは、明らかである。本発明は、ブロッティング膜中の生物学的存在をより有効で効率的に検出することを可能にする。
米国特許第５，１５５，０４９号

ブロッティング膜上の１つまたは複数の生物学的存在を検出する迅速、効率的で好都合な方法が提供される。この検出は、１つまたは複数の膜上の生物学的物質の位置、性質やその量に関し得る。本発明の方法は、試薬を供給し除去するための正圧または真空に支援されるレジメントから選択される圧力支援レジメントを含み、ならびに極めてわずかな量の液体を使用して、検出する膜中に埋もれた物質から汚染物質の洗浄を可能にする。この方法によって、ブロッティング品質を損なうことなく、遮断、洗浄および抗体結合のステップを約３０〜４５分で終了させることが可能になる。

したがって、一態様では、本発明は、抗体溶液、検出試薬や洗浄溶液などの液体を、検出する１つまたは複数の生物学的物質がその中に埋もれている１つまたは複数の膜に通過させる方法を対象とする。膜は、たとえば、電気泳動ゲル上で分離されるサンプルの移動パターンに対応し得る。膜は、特異結合検定の固体支持体になることもできる。

この方法は、サンプル中に含まれる材料の電気泳動分離または純度検証のために使用されているゲル支持体のブロッティングから得られる膜について、殊に有益である。

他の態様では、本発明は、本発明の方法を実施するのに有益な装置を対象とする。このデバイスは、ブロッティング膜の１つまたは複数の層の下にある多孔性支持体層と、１つまたは複数のブロッティング膜の上にある分流器と、所望領域で液体を収容し、そのような液体の始動容積をより低くすることを可能にするための、分流器上のウェルとを含むいくつかの層から構成される。好ましくは、分流器は、０．２２ミクロン膜など、非結合または低結合の多孔性膜である。

デバイスは、分流器と支持体の間に取り付けられる１つまたは複数のブロッティング膜を有し、次いで適切な寸法の真空マニホルド上またはその中に配置される、あるいは加圧チャンバが分流器の上部の上に嵌め込まれる。次いでプロセスが、必要なステップ間で真空または正圧を使用し、膜を通して液体を移動させて実施される。

本発明の目的は、真空支援の免疫学的検定を実施するためのデバイスであって、多孔性支持体と、多孔性支持体の上部上に配置される分流器と、分流器の上部上に取り付けられる１つまたは複数の試薬ウェルとを含むデバイスを提供することである。

本発明の他の目的は、正圧支援の免疫学的検定を実施するためのデバイスであって、多孔性支持体と、多孔性支持体の上部上に配置される分流器と、分流器の上部上に取り付けられる１つまたは複数の試薬ウェルとを含むデバイスを提供することである。

本発明の他の目的は、真空支援の免疫学的検定を実施するためのデバイスであって、真空マニホルドと、真空マニホルド上に取り付けられる多孔性支持体と、多孔性支持体の上部上に配置される分流器と、分流器の上部上に取り付けられる１つまたは複数の試薬ウェルとを含むデバイスを提供することである。

本発明のさらなる目的は、正圧支援の免疫学的検定を実施するためのデバイスであって、マニホルドと、マニホルド上に取り付けられる多孔性支持体と、多孔性支持体上に配置される１つまたは複数のブロッティング膜と、１つまたは複数の多孔性膜の上部上に配置される分流器と、分流器の上部上に取り付けられる１つまたは複数の試薬ウェルと、分流器の上部上に取り外し可能に取り付けられる正圧デバイスとを含むデバイスを提供することである。

本発明のさらなる目的は、真空支援の免疫学的検定を実施するための、次のステップを含むプロセスを提供することである。
ａ．真空マニホルドと、真空マニホルド上に配置される多孔性支持体と、多孔性支持体上に配置される、検定する１つまたは複数の生物学的存在を含む１つまたは複数の膜と、膜の上部上に配置される分流器と、分流器の上部上に配置される１つまたは複数のウェルとを設けるステップ。
ｂ．１つまたは複数のウェルに１つまたは複数の試薬を加え、試薬を膜中に引き入れるために真空を施すステップ。
ｃ．１つまたは複数のウェルに１つまたは複数の洗浄剤を加え、洗浄剤およびすべての非結合試薬を分流器、膜および多孔性支持体を通して真空マニホルド中に引き入れるために真空を施すステップ。
ｄ．所望または必要に応じてステップｂおよびｃを１または複数の追加の回数、繰り返すステップ。

本発明の他の目的は、真空支援の免疫学的検定を実施するための、次のステップを含むプロセスを提供することである。
ａ．真空マニホルドと、真空マニホルド上に配置される多孔性支持体と、多孔性支持体上に配置される、検定する１つまたは複数の生物学的存在を含む１つまたは複数の膜と、膜の上部上に配置される分流器と、分流器の上部上に配置される１つまたは複数のウェルとを設けるステップ。
ｂ．１つまたは複数のウェルに１つまたは複数の試薬を加え、試薬を膜中に引き入れるために真空を施すステップ。
ｃ．１つまたは複数のウェルに１つまたは複数の洗浄剤を加え、洗浄剤およびすべての非結合試薬を、分流器、膜および多孔性支持体を通して真空マニホルド中に引き入れるために真空を施すステップ。
ｄ．ステップｂおよびｃを１または複数の追加の回数、繰り返すステップ。

本発明の目的は、洗浄液または試薬を含有する液体を、その中の少なくとも１つを検出する１つまたは複数の生物学的存在を含むブロッティング膜に通過させるプロセスであって、次の事項を含むプロセスを提供することである。
ａ．真空マニホルドと、真空マニホルド上に配置される多孔性支持体と、分流器と、分流器の上部上に配置される１つまたは複数のウェルとを設けるステップ。
ｂ．１つまたは複数の生物学的存在を含む１つまたは複数のブロッティング膜を多孔性支持体上に配置するステップ。
ｃ．１つまたは複数のブロッティング膜の上部上に分流器を配置するステップ。
ｄ．分流器のウェルに液体を加え、分流器、１つまたは複数のブロッティング膜および多孔性支持体を通して液体をマニホルド中に引き出すために真空を施すステップ。

本発明の目的は、洗浄液または試薬含有液体を、その中の少なくとも１つを検出する１つまたは複数の生物学的存在を含む１つまたは複数のブロッティング膜に通過させるプロセスであって、次の事項を含むプロセスを提供することである。
ａ．マニホルドと、マニホルド上に配置される多孔性支持体と、分流器と、分流器の上部上に配置される１つまたは複数のウェルとを設けるステップ。
ｂ．１つまたは複数の生物学的存在を含む１つまたは複数のブロッティング膜を多孔性支持体上に配置するステップ。
ｃ．１つまたは複数のブロッティング膜の上部上に分流器を配置するステップ。
ｄ．分流器のウェルに液体を加え、分流器、１つまたは複数のブロッティング膜および多孔性支持体を通して液体をマニホルド中に移動させるために正圧を分流器に施すステップ。

本発明を実施するために、本発明によるデバイスが使用される。図１に示すように、デバイス２は、多孔性支持体４から構成される。好ましくは、支持体は、マニホルド８（以下で述べる）中にまたはその上に嵌め込まれるように設計された縁部６または取り付けピースを有して形成される。ブロッティング膜１０の１つまたは複数の層は、支持体４の上部上に配置される。次いで、分流器１２は、ブロッティング膜１０の上部上に配置または取り付けられる。分流器は、所望なら、分流器１２の上部表面１６に取り付けられた１つまたは複数のウェル１４（この実施形態では１つを示す）を有することができるか、あるいは、それは、分流器１２の上部上に単に取り付けるまたは配置する別個の部品（図示せず）とすることができる。

図１に示すように、この実施形態のマニホルド８は、真空源２０に取り付けられるポート１８を有する真空マニホルドである。あるいは、真空の代わりに正圧（以下にさらに述べる）を使用して、ろ過／洗浄プロセスを実施することができる。ポート１８は、多孔性支持体４の下に位置決めされる。廃物回収デバイス２２が、この例では容器であり、マニホルドの下に、または所望ならマニホルド中に（図示せず）取り付けられて、デバイス２から引き出された液体を回収する。あるいは、廃物回収デバイスは、廃物ドレインや当業者に知られるような他の類似のデバイスとすることができる。

分流器１２は、多孔性構造である。一実施形態（図示せず）では、構造全体が多孔性である。図２に示される他の実施形態では、分流器１２Ａは、１つまたは複数のウェル１４内の領域２４中のみ多孔性である。非多孔性の分流器１２の領域１７は、その領域１７中の微細孔を、プラスチックや糊などの非多孔性材料で充填することによって、その領域１７中の微細孔を、この分野でよく知られた熱および／または圧力および／または溶剤を用いて崩壊させるによって、あるいは１つまたは複数のウェル１４の外側寸法のサイズに一致するように分流器１２を形成し、その外側寸法に沿って１つまたは複数のウェル１４の底部に分流器１２を液密に密封することによって、そのようにすることができる。

分流器１２は、その面全体にわたって液体を均一に配給し、真空の影響下にあって容易な移動を可能にするのに十分多孔性であり、液体からの凝集体、粒子や他の破片をろ過除去することもできる、任意の多孔性構造とすることができる。

分流器は、任意の所望のサイズにすることができる。ゲルは、約７×８ｃｍから２０×２０ｃｍまでの範囲で様々な「標準」サイズで入ってくる。

そのような材料には、これらに限定されないが、ＴＹＶＥＫ（登録商標）またはＴＹＰＡＲ（登録商標）ペーパなど織布、不織布や繊維の多孔性ろ過材、米国マサチューセッツ州ビルリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製のＭＩＬＬＩＳＴＡＫ＋（登録商標）ろ過材などのセルロース誘導体材料、微小孔性膜などの膜、ＰＯＲＥＸ（登録商標）ろ過材などの焼結膜その他が含まれる。好ましいのは、膜、殊にプラスチックの微小孔性膜である。

そのような膜の好ましい孔径は、約０．１と約０．６５マイクロメートルの範囲であり、好ましくは０．２と約０．４５マイクロメートルの範囲であり、より好ましくは約０．２２マイクロメートルである。

さらに、好ましいろ過材または膜は、使用量を最小にするために、使用する試薬に対して低結合特性を有している。ろ過材または膜は一般に生体物質とともに使用されるので、親水性であり、低タンパク質結合特性を有することがより好ましい。１つのそのような分流器は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製の、ＰＶＤＦから形成される親水性ＤＵＲＡＰＯＲＥ（登録商標）膜である。他は、同社製のＭＩＬＬＩＰＯＲＥ ＥＸＰＲＥＳＳの親水性ＰＥＳ膜である。

多孔性支持体４は、簡単なスクリーン、格子、またはＰＯＲＥＸ（登録商標）膜などの焼結多孔性構造または不織布のペーパなど粗いまたは大きい、穴あけされた微小孔性ろ過材、ポリプロピレンまたはポリエチレンの繊維、または１〜１０ミクロンの微小孔性ろ過材とすることができる。そのような支持体は、ポリマー、セラミックまたは、金属材料、これらに限定されないが、たとえば、ステンレス鋼、鋼、合金鋼、アルミニウムなどの金属、およびポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン、スチレン、ナイロンなどのポリマーから製作することができる。

図３に、標準真空マニホルド３０を使用する実施形態を示す。この例では、マニホルドは、プラスチックまたは金属の格子、あるいはプラスチックまたは金属の多孔性焼結シート、あるいは真空技術の分野でよく知られる他の同様なデバイスなどの多孔性支持体構造３２を有する。ブロッティング膜３４は、やはり支持体３２の上部上に配置され、図１および２の実施形態について上記で述べたように、分流器３６およびウェル構造３８によって覆われる。

図４に、本発明中で使用することができる正圧システムを示す。構成要素が図１〜３の構成要素と同じである範囲で、同じ参照番号が使用されている。

図４に示すように、デバイス２Ａは、多孔性支持体４から構成される。好ましくは、支持体は、マニホルド８中にまたはその上に嵌め込まれるように設計された縁部６または取り付けピースを有して形成される。ブロッティング膜１０の１つまたは複数の層（１つを示す）は、支持体４の上部上に配置される。次いで、分流器１２は、ブロッティング膜１０の上部上に配置または取り付けられる。分流器１２は、分流器１２の上部表面１６に取り付けられた１つまたは複数のウェル１４（この実施形態では１つを示す）を有することができるか、あるいは、それは、分流器１２の上部上に単に取り付けるまたは配置する別個の部品（図示せず）とすることができる。正圧マニホルドまたはカバー１３が、ウェル１４および／または分流器１２の上に配置され、好ましくはそれらに取り外し可能に固定される。正圧マニホルド１３は、チューブ１７を介して正圧源に接続されるポート１５を有する。正圧は、ポンプ、与圧ガス源（タンク、小型容器その他）や実験室または産業で使用されるよく知られる他の源から送ることができる。

図４に示すように、マニホルド８は、過剰圧を逃がすために使用することができるポート１８を有する、単に回収マニホルドである。所望の場合、マニホルド８は、汚染の侵入を防ぐために、エアフィルタを含むことができる。ポート１８は、多孔性支持体４の下に位置決めされる。廃物回収デバイス２２は、この例では、容器であり、マニホルドの下に、または所望ならマニホルド中に（図示せず）取り付けられ、デバイス２から引き出された液体を回収する。あるいは、廃物回収デバイスは、廃物ドレインまたは当業者に知られる他の同様なデバイスとすることができる。

本発明では様々な方法を使用することができる。キー要素は、それらすべてが、過去に行われたような静的拡散でなく、真空または正圧に駆動される液体ろ過作用に頼っているということである。

最も簡単な方法は、１つまたは複数の洗浄サイクルを実施するために、単に本発明を使用することである。通常、各洗浄サイクルは、１つまたは複数の洗浄ステップから構成される。一般に、２〜５のステップが１サイクル当たり実施される。

他の方法は、抗体の培養後または洗浄ステップ中など、ブロッティング膜から液体を除去することが必要である各ステップで、本発明を使用することである。

これらのプロセスすべてにおいて、デバイスからマニホルド中に１つまたは複数の液体を移動するのに適した任意の圧力を使用することができる。これは、ブロッティングに選択される膜、分流器、使用するマニホルド、ろ過作用の所望速度および研究者に利用できる真空または正圧源に依存して変えることができる。

一般に、使用できる真空は、１００から７６０ｍｍＨｇ（１３３ミリバール〜１０１３ミリバール）の範囲で変えることができる。バルブや圧力絞りその他の使用については、使用する膜の許容範囲内に真空を保つために、使用することもできる。本発明の一実施形態の好ましい真空マニホルドは、ＳＴＥＲＩＣＵＰ（登録商標）の真空ベースのデバイスであり、約１００ｍｍＨｇ（１３３ミリバール）の真空を使用する。他の適切な真空マニホルドには、これらに限定されないが、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製のＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮ（登録商標）およびＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮ（登録商標）_ＨＴＳ真空マニホルドが含まれる。

一般に、正圧は、約２から１５ｐｓｉ（１３．８×１０^３Ｐａ〜１０３×１０^３Ｐａ）の範囲の圧力で送気管から供給される。バルブや圧力リストリクタその他の使用については、使用する膜の許容範囲内に圧力を保つために、使用することもできる。そのような圧力システムには、これらに限定されないが、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製のＡｍｉｃｏｎ（登録商標）のセル撹拌デバイスおよび米国マサチューセッツ州ホプキントン（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ）のＣａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の正圧ろ過ユニットが含まれる。

図５Ａ〜５Ｃに、ブロック図で通常のプロセスを示す。

図５Ａにおいて，ステップ５０で、本発明によるデバイスが設けられ、真空マニホルドおよび真空源に取り付けられる。ステップ５２で、１つまたは複数のブロッティング膜は、適切な位置でデバイス中に配置される。好ましくは、ステップ５２の１つまたは複数のブロッティング膜は、予め湿らせる（図示せず）。ステップ５４で、真空がオンにされ、洗浄液などを含んだ液体が、１つまたは複数のウェル中にセットされる。ステップ５６で、液体がデバイスから引き出されるまで、真空状態が継続され、次いで真空がオフにされる。１つより多いブロッティング膜を使用するとき、それらは、互いの上部上に順次配列することができ、１回のプロセスステップで、同じ所望の試薬を含む十分な液体を複数の層を通して容易に移動することができる。一般に、１層より多い層を使用するとき、同時に、２から１０層の範囲で、好ましくは２から５層の範囲で使用することが好ましい。あるいは、複数のウェルを有する分流器を使用し、１つより多いブロッティング膜を互いに並行に使用することができ、それぞれが分流器中にそれ自体のウェルを有し、それぞれが、その特定の目的のために必要なそれ自体の一式の試薬を有する。所望なら、隣接したウェル中で複数の層を使用することさえできる。

図５Ｂでは、ステップ５４が省略されて、液体は、ステップ５８で真空でない状態で加えられ、一次または二次抗体によって必要になることがあるので、培養が可能にされる。次いで、ステップ６０で、真空がオンにされる。

図５Ｃでは、図５Ａおよび５Ｂのステップが、連続するステップとして組み合わされる。どちらか、または両方のステップは、必要とあれば繰り返すことができ、または適切なプロセスを実施するのに望ましい異なる順序に配列することができる。

任意選択で、所望であれば、膜の支持体の下に、好ましくはマニホルド自体中にパンまたは単一ウェルデバイスを配置することができる。次いで、それは、高価であることがあり、将来の検定に再使用することができる単一の非結合試薬を回収するために使用することができる。任意選択で、それは、２つ以上のサブトレイに分割することができる。

他のプロセスは、本発明のデバイスとともに使用することもできる。

使用する抗体濃度は、実験設計に依存して変わるが、１０〜１，０００ｎｇ／ｍＬが、標準方法のための典型的な範囲である。必要な溶液量は、典型的には、遮断、抗体反応および洗浄それぞれについて、０．１ｍＬ／ｃｍ^２、０．０３ｍＬ／ｃｍ^２および１．０ｍＬ／ｃｍ^２である。

膜は、その間隔に、検出する１つまたは複数の物質を含む。一般に、これらの物質は、通常抗体や特定タンパク質など特別のタイプの材料の存在、不在やその量を検出する、すなわち上記で述べたようにドットブロット式（Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ ｔｙｐｅ）の検定の目的で、電気泳動またはクロマトグラフのために固体支持体からブロッティングされたことによって、あるいは直接施されたことによって、どちらかの間隔に存在する。しかし、膜の定義は、これらの例に限定されないが、１つまたは複数の膜が、その間隔に検出する１つまたは複数の物質を含む、任意のケースに適用される。本発明中で使用されると想定される膜のタイプに含まれるのは、ニトロセルロースなどの電気泳動ゲル、ナイロンや、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製のＩＭＭＯＢＩＬＯＮ（登録商標）膜として市販される膜など、様々な他の重合体膜をブロッティングするために通常使用される膜である。

この技術分野で理解されているように、様々なサンプル上で行われる電気泳動ゲルの結果を複写するために、様々な材料を使用することができる。最も一般的には、サンプルは、個々のタンパク質、抗体、核酸、オリゴヌクレオチドや複合糖質その他などの生物学的存在を含むが、技術の応用はこれらの物質に限定されない。本発明の技術は、膜の化学的組成または目標とされる物質にかかわらず、その中に検出する物質を含む任意の膜に適用可能である。

電気泳動の結果の転写を表す膜を使用するとき、ゲルから膜への検出する物質の移送は、移送バッファを含む膜を使用することによって、電子溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）、電子ブロッティング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）によって、またはゲルの半乾燥ブロットによって、実施することができる。これらの移送のための技術は、この技術でよく理解され、本明細書の本発明の一部分を構成しない。

供給される液体は、検出試薬を含むことができ、または単に洗浄液として供給することができる。もちろん、検出試薬の性質は、検出する物質に依存する。通常、タンパク質は、抗原と抗体の間の免疫反応、またはその免疫反応性部分によって検出され、通常、核酸フラグメントの存在が、適切なオリゴヌクレオチドプローブによって検出される。検出する物質との直接または固有の反応に関与する検出物質は、必要ならラベルによってさらに補足することができ、検出試薬の多様な応用が、必要になることがあり、たとえばプロトコルが、酵素、たとえば通常ホースラディシュ・ペルオキシダーゼによってラベル付けられる抗体を供給することによって、抗原の検出を含むことができ、次いで、この結合が、この酵素のための基質を供給することによって、検出される。試薬の適用では、好ましくはないが、正に押圧されたドナーマトリックスのみを使用して、定められた期間、膜のこの構成要素を暴きだすことが可能である。

室温で本発明の方法を実施することが、最も好都合であるが、温度を上げる、または下げることもできる。これは、デバイスや、その周囲環境（加熱ボックスまたは冷却ボックス中にして）を加熱することによって、達成することができる。

ブロットは、本デバイスおよびプロセスで、既に結合した抗体をブロットから剥離し、次いでその後に他の目標タンパク質に特異的な抗体または他のプローブを用いて培養することによって、複数の抗体やプローブを用いて連続的に解析することができる。剥離プロセスは、抗原・抗体の結合を崩壊させ、抗体を囲繞バッファ中に溶解させる。これは、通常、洗浄剤および熱の組み合わせによって、または高または低ｐＨどちらかに曝すことによって達成される。デバイスは、分流器と共同して、高または低ｐＨ法を使用してブロットの剥離を可能にする。ブロットのそれに続く再精査は、直接（たとえば剥離に使用された分流器と同じ分流器を使用する）または保管後に続いていずれかで、最初の精査と同じプロトコルを使用することになる。ブロットを剥離するための適切なキットは、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．から入手できる、商標が、ＲｅＢｌｏｔ Ｐｌｕｓキット（カタログ＃２５００）、ＲｅＢｌｏｔ Ｐｌｕｓ−Ｍｉｌｄ溶液（カタログ＃２５０２）およびＲｅＢｌｏｔ Ｐｌｕｓ−Ｓｔｒｏｎｇ溶液（カタログ＃２５０４）である。

標準のウェスタンブロットでは、抗原または目標は、１つまたは複数の膜支持体に移送され、抗体、タンパク質（たとえばタンパク質Ａ）やレクチン（炭水化物の構成成分と結合するタンパク質または糖タンパク質）など適切なプローブを用いて精査される。いくつかの応用では、逆フォーマット（たとえば逆アレイ）が使用され、抗体または他のプローブが、１つまたは複数の膜上にまたは他の支持体上に（通常、アレイフォーマットで）点として現れ、抗原または目標は、アレイ上に固定された抗体で提示される。目標プローブの結合事象の視覚化は、抗原または目標のラベル付けによって、または目標に特異的な二次抗体を使用することによって達成することができる。逆アレイは、目標の混合物、たとえば異なる蛍光色でラベル付けられた溶解物をしばしば用いて、並行処理を可能にする。逆検定は、本発明によって実施することもできる。

図１のデバイスは、真空マニホルドとしてＳＴＥＲＩＣＵＰ（登録商標）デバイス（米国マサチューセッツ州ビルリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）のベースと、多孔性支持体としてＰｏｒｅｘ（登録商標）多孔性プラスチックのピースと、分流器として孔径０．２２ミクロンのＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）親水性膜（ＧＶＰＰ）と、ポリスチレンのストリップを９０°で折り曲げて４つの隅部を形成し、（Ｌｏｃｔｉｔｅ社製の３２１１光硬化式接着剤）を使用してそのストリップの末端部を互いに封止して形成されるポリスチレンストリップウェル（通常、膜サイズより４ｍｍ大きい。たとえば、７２ｍｍ（Ｌ）×８２ｍｍ（Ｗ）に対して７６ｍｍ（Ｌ）×８６ｍｍ（Ｗ）×２５ｍｍ（Ｈ））とを使用して製作された。このウェルは、Ｌｏｃｔｉｔｅ社製の３２１１光硬化式接着剤を使用して膜表面に接着された。

ベースは、バルブ付きの真空ラインにその真空ポートを介して接続された。

ウシの肝臓の溶解物のサンプルを含む予め湿潤させた（１００％メタノール中、次いで水中で予め湿潤）ブロッティング膜（米国マサチューセッツ州ビルリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製のＩＭＭＯＢＩＬＩＯＮ（登録商標）Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング膜）が、ベース上に置かれて、ベースと膜の間の気泡がすべて除去された。分流器が、ブロッティング膜の上部上に配置された。ベースと膜の間の気泡は、すべて除去された。１３３ミリバール（１００ｍｍＨｇ）の真空が施され、次いで遮断溶液（ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩およびＴｗｅｅｎ（登録商標）―２０界面活性剤；２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．６、０．８％塩化ナトリウム、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）―２０界面活性剤）中に１％のカゼイン）１０ｍＬがウェルに加えられた。次いで真空がオフにされた。希釈されたウサギ抗ＥＲＫ一次抗体１ｍＬ（ＴＢＳ−Ｔ中１％カゼインを用いて１：２，０００に希釈）がウェルに加えられ、どのような真空状態でもなく１０分間放置して培養された。１３３ミリバール（１００ｍｍＨｇ）の真空を施して残された抗体溶液を濾過した。ＴＢＳ−Ｔ洗浄液３０ｍＬが加えられ、真空下で濾過された（乾燥するまで）。それぞれＴＢＳ−Ｔ洗浄液３０ｍＬ、３回ＴＢＳ−Ｔ洗浄溶液を追加して順番に加え、真空下で濾過した。次いで、真空がオフにされて、希釈された二次抗体（アルカリ性リン酸塩合成ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体）（ＴＢＳ−Ｔ中１％カゼインを用いて１：１，０００に希釈）１ｍＬがウェルに加えられ、真空状態でなく１０分間放置して培養された。次いで真空が１３３ミリバール（１００ｍｍＨｇ）で施され、残された二次抗体溶液が分流器を通して濾過された。４回連続して洗浄溶液、それぞれＴＢＳ−Ｔ洗浄溶液３０ｍＬが加えられ、真空下で濾過され、次いで真空がオフにされた。基質（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ ＡＰ試薬）がウェルに加えられ、検出した。膜が、Ｘ線フィルムに１分間曝され、フィルムがフィルム現像液によって処理されて仕上げられた。

従来の方法、同じタイプの膜、タンパク質（ＥＲＫ）および試薬を使用して比較例が３時間を越えて実施された。
１．１時間、１％カゼイン／ＴＢＳ−Ｔ中で膜を遮断する（０．１ｍＬ／ｃｍ^２膜）。
２．抗ＥＲＫ抗体（ＴＢＳ−Ｔ中１％カゼインを用いて１：１０，０００に希釈）を１時間加える（０．１ｍＬ／ｃｍ^２膜）。
３．ＴＢＳ−Ｔで５分間４回洗浄する（１．０ｍＬ／ｃｍ^２膜）。
４．二次抗体（アルカリ性リン酸塩合成抗ウサギＩｇＧ；ＴＢＳ−Ｔ中１％カゼインを用いて１：５，０００に希釈）を１時間加える（０．１ｍＬ／ｃｍ^２膜）。
５．ＴＢＳ−Ｔで５分間４回洗浄する（１．０ｍＬ／ｃｍ^２膜）。
６．Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ ＡＰ試薬を加え、５分間培養する（０．０５ｍＬ／ｃｍ^２膜）。
７．Ｘ線フィルムに１分間曝し、次いでフィルム現像に進む。

図６に、比較例と本発明のデバイスおよびプロセスによる実施例を示す。この図によって、３０分間のみで得られる高品質の検出が実証される。さらに、使用する抗体量は、従来のプロセスに比べて、従来例の１／１０の容積で濃度が５倍増加したにもかかわらず、本発明のプロセスでは半分に減少した。これによって、研究者がより多く実験することが可能になるだけでなく、より少ない試薬を用いて実験しより高い品質の結果が得られる。さらに、バックグランドノイズが、従来方法に比べて著しく減少した。

本発明によるデバイスの第１の実施形態を示す断面図である。 本発明によるデバイスの第２の実施形態を示す断面図である。 本発明によるデバイスの第３の実施形態を示す断面図である。 本発明によるデバイスの第４の実施形態を示す断面図である。 本発明によるプロセスの実施形態をブロック図の形で示す図である。 本発明によるプロセスの実施形態をブロック図の形で示す図である。 本発明によるプロセスの実施形態をブロック図の形で示す図である。 従来技術および本発明によって処理されたブロットの実施例の結果を示す図である。

符号の説明

２、２Ａ デバイス
４ 多孔性支持体
６ 縁部
８ マニホルド
１０、３４ ブロッティング膜
１２、３６ 分流器
１３ 正圧マニホルドまたはカバー
１４ ウェル
１５、１８ ポート
１６ 上部表面
１７ チューブ
２０ 真空源
２２ 廃物回収デバイス
３０ 標準真空マニホルド
３２ 多孔性支持体構造
３８ ウェル構造

Claims (17)

1. 免疫学的検定を実施するためのデバイスであって、
   ブロッティング膜の１つまたは複数の層を支持する多孔性支持体（４）と、多孔性支持体の上部上に配置される多孔性分流器であって、該多孔性分流器はろ過材または膜であり、該ろ過材または膜は、親水性であり、低タンパク質結合特性を有し、その面全体にわたって液体を均一に配給する多孔性分流器（１２）と、分流器の上部上に取り付けられる１つまたは複数の試薬ウェル（１４）とを含む、デバイス。
2. 分流器および１つまたは複数の試薬ウェルが、一体ユニットである、請求項１に記載のデバイス。
3. 分流器が膜であり、分流器および１つまたは複数の試薬ウェルが、一体ユニットである、請求項１に記載のデバイス。
4. デバイスが、さらに、試薬回収のために、ホルダの下に回収トレイを含んでいる、請求項１に記載のデバイス。
5. デバイスが、さらに、試薬回収のために、ホルダの下に回収トレイを含み、トレイが、２つ以上の別個のサブトレイに分割されている、請求項１に記載のデバイス。
6. デバイスが、真空マニホルド（８）をさらに含む、真空支援の免疫学的検定を実施するための、請求項１に記載のデバイス。
7. デバイスが、検定する１つまたは複数の生物学的存在を含み、多孔性支持体の上部上に取り付けられる１つまたは複数の膜（１０）をさらに含み、分流器は１つまたは複数の膜の上部上にある、真空支援の免疫学的検定を実施するように構成された、請求項１に記載のデバイス。
8. デバイスが、回収マニホルド（２２）と、検定する１つまたは複数の生物学的存在を含み、多孔性支持体の上部上に位置付けられた１つまたは複数の膜（１０）とをさらに含み、分流器は１つまたは複数の膜の上部上に配置され、デバイスがさらに、１つまたは複数の試薬ウェルの上部上に取り外し可能に密封され、正圧ガス源に接続されるその内部への入口を含む加圧キャップ（１３）を含む、圧力支援の免疫学的検定を実施するように構成された、請求項１に記載のデバイス。
9. デバイスが複数の試薬ウェル（１４）を含み、各ウェルが、別々のそれ自身の分流器を有している、請求項１から８のいずれか一項に記載のデバイス。
10. 真空支援の免疫学的検定を実施するためのプロセスであって、
    ａ．真空マニホルド（８）と、真空マニホルド上に配置される多孔性支持体（４）と、検定する１つまたは複数の生物学的存在を含み、多孔性支持体上に配置される１つまたは複数の膜（１０）と、１つまたは複数の膜の上部上に配置される多孔性分流器であって、該多孔性分流器はろ過材または膜であり、該ろ過材または膜は、親水性であり、低タンパク質結合特性を有し、その面全体にわたって液体を均一に配給する多孔性分流器（１２）と、分流器の上部上に配置される１つまたは複数のウェル（１４）とを設けるステップと、
    ｂ．１つまたは複数のウェルに１つまたは複数の試薬を加え、試薬を１つまたは複数の膜中に引き入れるために真空を施すステップと、
    ｃ．１つまたは複数のウェルに１つまたは複数の洗浄剤を加え、洗浄剤およびすべての非結合試薬を、分流器、１つまたは複数の膜および多孔性支持体を通じて真空マニホルド中に引き入れるために真空を施すステップとを含む、プロセス。
11. ステップ（ｂ）および（ｃ）が、１または複数回繰り返される、請求項１０に記載のプロセス。
12. プロセスが、さらに、１つまたは複数の生物学的存在を検出するステップ（ｄ）を含む、請求項１０に記載のプロセス。
13. プロセスが、さらに、放射性存在および比色分析存在からなる群から選択する検出メカニズムによる、１つまたは複数の生物学的存在を検出するステップ（ｄ）を含む、請求項１０に記載のプロセス。
14. ステップ（ｂ）の際、試薬が抗体であり、設定時間の間、真空を施すことなく１つまたは複数のブロッティング膜上またはブロッティング膜中で培養が可能になる、請求項１０に記載のプロセス。
15. 洗浄液または試薬含有液を、少なくとも１つは検出される１つまたは複数の生物学的存在を含む１つまたは複数のブロッティング膜に通過させるプロセスであって、
    ａ．真空マニホルド（８）と、真空マニホルド上に配置される多孔性支持体（４）と、多孔性分流器であって、該多孔性分流器はろ過材または膜であり、該ろ過材または膜は、親水性であり、低タンパク結合性を有し、面全体にわたって液体を均一に配給する多孔性分流器（１２）と、分流器の上部上に配置される１つまたは複数のウェルとを設けるステップと、
    ｂ．１つまたは複数の生物学的存在を含む１つまたは複数のブロッティング膜（１０）を多孔性支持体上に配置するステップと、
    ｃ．１つまたは複数のブロッティング膜の上部上に分流器を配置し、分流器のウェルに液体を加えるステップと、
    ｄ．１つまたは複数のブロッティング膜を通じて液体を引き出すために真空を施すステップとを含む、プロセス。
16. 洗浄液または試薬含有液を、少なくとも１つは検出される１つまたは複数の生物学的存在を含むブロッティング膜に通過させるプロセスであって、
    ａ．回収マニホルド（２２）と、多孔性支持体（４）と、支持体の上部上に配置される多孔性分流器であって、該多孔性分流器はろ過材または膜であり、該ろ過材または膜は、親水性であり、低タンパク結合性を有し、その面全体にわたって液体を均一に配給する多孔性分流器（１２）と、分流器の上部上に配置される１つまたは複数のウェル（１４）と、正圧ガス源に接続されるその内部中への入口（１５）を有し、１つまたは複数のウェルの上部上に取り外し可能に取り付けられる加圧キャップ（１３）とを含むデバイスを設けるステップと、
    ｂ．１つまたは複数の生物学的存在を含むブロッティング膜（１０）の１つまたは複数の層を多孔性支持体上に配置するステップと、
    ｃ．ブロッティング膜の１つまたは複数の層の上部上に分流器を配置し、分流器の１つまたは複数のウェルに液体を加えるステップと、
    ｄ．入口からキャップに正圧を加え、ウェルからブロッティング膜の１つまたは複数の層を通してマニホルド中に液体を移動するステップとを含む、プロセス。
17. プロセスが複数のウェル（１４）を設けることを含み、各ウェルが、別々のそれ自身の分流器を有している、請求項１０から１６のいずれか一項に記載のプロセス。

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