JP4708568B2 - 選択されたインテグリンアンタゴニストを使用して脳腫瘍成長を阻止する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は全般に腫瘍成長の阻止、具体的には脳腫瘍成長の阻止に関する。
【０００２】
（先行技術の説明）
本出願を通して種々参照文献は全て括弧内に記す。これらの出版物の開示全てを引用により本出願の一部とし、本発明が属する技術状況をより十分に記載する。参照した引用文献は全て本出願の末尾、請求の範囲の前に記載している。
【０００３】
脳腫瘍は他の充実性腫瘍と同様、１ないし２ｍｍ^３を越える継続的な成長を維持するために血液供給を永続的に増加させる必要がある（１、２）。これは腫瘍細胞により放出される内皮性成長因子に応答して生じる過程である脈管形成により達成される。脈管形成は静止期の微小血管系からの内皮細胞増殖の誘導、腫瘍床への新生内皮の遊走、および最終的には新規毛細管ネットワークへの成熟化に関与する（３）。脳腫瘍は全てのヒト新形成のうち最も脈管形成的である。最も一般的な悪性脳腫瘍である神経膠芽細胞腫および神経髄芽細胞腫の患者の組織切片におけるインシトゥーハイブリダイゼーションかまたは特異的抗体のいずれかにより示される主要な脈管形成因子は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）および塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である（４ないし７）。実際膠腫瘍のＶＥＧＦ発現および微小血管密度は悪性の程度および全体的な予後の程度と直接的に相関する（８ないし９）。
【０００４】
最近の知見により、内皮細胞インテグリン、すなわちアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）に結合することにより細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質への細胞の付着を指示する膜貫通レセプターのファミリーの活性化により、脈管形成が制御されることが示唆される（１０）。ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦに応答して、内皮細胞はインテグリンα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５各々の発現を上方制御する（１１ないし１３）。神経膠芽細胞腫およびそれに関係する血管内皮がインテグリンα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５を発現するのが見出されている（１４、１５）。インテグリンが媒介する付着により細胞の生存性、増殖、致死および毛細管新芽形成を促進する細胞内シグナルが伝達される（１６、１７）。これらのインテグリンがリガンドと結合し損なうことにより内皮細胞アポトシスに至る（１８、１９）。マトリックス糖タンパク質、ビトロネクチンがα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５のリガンドとして提供され、悪性神経膠細胞腫による侵襲縁の先端で生成される（１５、２０）。またこれらの知見は腫瘍細胞、悪性脳腫瘍が連続的に脈管形成および成長するための脳ＥＣＭおよび内皮細胞インテグリン間の複合パラクリン相互作用を示唆する。
【０００５】
インテグリン−ＥＣＭ相互作用を防御する、抗α_ｖβ_３抗体、ＬＭ−６０９またはα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５のＲＧＤ環状ペプチドアンタゴニストを用いる研究では鶏漿尿膜（ＣＡＭ）およびマウスキメラモデルにおける抗脈管形成応答が示されている（２１ないし２３）。脈管形成経路の別の部位に作用する別の物質も、例えばＶＥＧＦに対する抗体またはそのチロシンキナーゼレセプター適合も、脈管形成阻害に効果がある（２４、２５）。
【０００６】
先行の研究では乳房癌腫、黒色腫およびＨＴ２９−Ｄ４結腸腺癌細胞のビトロネクチンへの付着は各々α_ｖ、α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に依存することが示されている（５１ないし５３）。腫瘍および内皮細胞により生成されるビトロネクチンはα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５により認識され、腫瘍侵襲および新生血管形成の部位で見出されるＥＣＭタンパク質である（５４ないし５５）。このように、ビトロネクチン発現は、α_ｖライゲーションにより内皮細胞生存を、したがって脈管形成を補助するのに加えて、α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５インテグリンを発現する腫瘍および内皮細胞の付着をさらに増強し、それによりこれらの侵襲を促進しよう。ＳＣＩＤマウス／ヒトキメラモデルを用いる乳癌に関するある研究では、抗α_ｖβ_３抗体ＬＭ−６０９の投与後、腫瘍侵襲がかなり低減され、α_ｖβ_３遮断が腫瘍細胞生物学に直接影響することを示唆している（５６）。
【０００７】
脳腫瘍は高度な侵襲性および脈管形成のために、腫瘍の進行におけるインテグリンの重要性をさらに研究するための優れたモデルを提供する。複数の研究により微小血管密度が星状細胞腫における予後および悪性度に相関することが示された（５７ないし５９）。脈管形成インヒビター（例えばＴＮＰ−４７０）、トロンボスポンジン−１および血小板第４因子は、実験的脳腫瘍導入により、腫瘍成長を阻止するのが示された（６０ないし６２）。しかしながら、現在までのところ、脳腫瘍侵襲および脈管形成に及ぼすインテグリン拮抗作用の影響は研究されていない。従って、その影響を研究し、脳腫瘍を処置するための新規方法を提供する必要がある。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、インテグリンの、具体的にはα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５の、標的化拮抗作用がインビボで脳腫瘍形成を実質的に阻止できるという驚くべき知見に基づいている。本発明はまた、脳腫瘍の微環境が腫瘍の挙動およびかかる生物学的に導かれた治療に対する応答性の決定に重大であるという知見にも基づいている。本発明はさらにインテグリン拮抗作用が抗脈管形成に依存しない抗腫瘍形成効果を有し、これが協働して腫瘍成長を遅延させることができるという知見に基づいている。例えばインテグリン拮抗作用は直接的に脳腫瘍細胞死を引き起こすことができることは本発明の知見である。
【０００９】
従って、本発明の一つの態様は宿主の脳における腫瘍成長を阻止する方法を提供する。その方法はかかる阻止を必要とする宿主に治療上有効量のインテグリンアンタゴニストを投与することを含む。
【００１０】
本発明の一つの態様では、インテグリンはα_ｖβ_３またはα_ｖβ_５である。アンタゴニストはα_ｖのポリペプチドアンタゴニスト、α_ｖβ_３に対する抗体、α_ｖβ_５に対する抗体または各々α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に対する抗体の組み合わせである。
【００１１】
本発明の別の態様は宿主の脳に位置する腫瘍組織において脈管形成を阻止する方法を提供する。その方法は脈管形成を阻止する用量のα_ｖインテグリンのアンタゴニストを含んでなる組成物を宿主に投与することを含む。
【００１２】
本発明の一つの態様では、インテグリンはα_ｖβ_３またはα_ｖβ_５である。アンタゴニストはα_ｖのポリペプチドアンタゴニスト、α_ｖβ_３に対する抗体、α_ｖβ_５に対する抗体または各々α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に対する抗体の組み合わせである。
【００１３】
本発明のさらなる態様は宿主の脳で成長する脳腫瘍細胞のＥＣＭ依存性細胞付着を阻止する方法を提供する。その方法は治療上有効量の、α_ｖインテグリン、すなわちインテグリンα_ｖβ_３またはα_ｖβ_５アンタゴニストを宿主に投与することを含む。本発明の一つの態様ではアンタゴニストはα_ｖのポリペプチドアンタゴニスト、または各々α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に対する抗体の組み合わせである。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は宿主の脳で成長する脳腫瘍細胞のビトロネクチン依存性細胞遊走を阻止する方法を提供する。その方法は治療上有効量のα_ｖに対するアンタゴニストを宿主に投与することを含む。
【００１５】
本発明の一つの態様では、アンタゴニストはα_ｖのポリペプチドアンタゴニスト、またはα_ｖβ_３に対する抗体である。
【００１６】
本発明のさらなる態様は宿主の脳で成長する腫瘍細胞においてアポプトシスを誘起する方法を提供する。その方法は治療上有効量のインテグリンのアンタゴニストを宿主に投与することを含む。
【００１７】
本発明の一つの態様では、インテグリンはα_ｖβ_３またはα_ｖβ_５である。アンタゴニストはα_ｖのポリペプチドアンタゴニストである。
【００１８】
本発明の方法はインビボで脳腫瘍の処置に使用するのによく適している。本発明は脳腫瘍を処置するための新規治療アプローチを提供する。
【００１９】
（図面の説明）
本発明の前記のおよびその他の特徴並びにそれを得る方法は添付の図面と組み合わせて以下の説明を参照することによりより明白になり、よく理解できるようになろう。これらの図面は本発明の典型的な態様のみを表し、従ってその範囲を限定するものではない。これらは具体性および詳細な説明を加えるために提示するものである：
図１ａおよび１ｂはα_ｖアンタゴニストによるＣＡＭにおける（ａ）脈管形成および（ｂ）腫瘍成長の阻止を示す。
【００２０】
図２はＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧ細胞の脳内注射後の腫瘍の大きさ（Ａ）マウス生存性（Ｂ）を示す。
【００２１】
図３ａおよびｂは不活性（Ａ）または活性（ＢないしＤ）ペプチドで毎日処置した、同所注射した脳腫瘍細胞ＤＡＯＹ（ａ）およびＵ８７ＭＧ（ｂ）の組織病理学を示す。対照動物では大きな脳内腫瘍（矢印）が肉眼観察できるが（Ａ）、α_ｖアンタゴニスト処置動物では腫瘍が認められない（Ｂ）かまたは顕微鏡的な残存腫瘍（矢印）しか検出されない（ＣおよびＤ）。
【００２２】
図４は活性かまたは不活性のいずれかのペプチドを投与されたマウスの同所脳腫瘍移植後の生存性を示す。
【００２３】
図５は同所（脳）および異所（皮下組織）移植したＤＡＯＹ細胞に及ぼすα_ｖアンタゴニストの影響を示す。
【００２４】
図６ａないし６ｄは脳腫瘍および脳毛細管内皮細胞に関する（ａ）インテグリンプロファイル、（ｂ）ビトロネクチンへの付着に及ぼすα_ｖアンタゴニストの効果、（ｃ）ビトロネクチンによる遊走に及ぼすα_ｖアンタゴニストの効果、および（ｄ）ビトロネクチンによる細胞生存性に及ぼすα_ｖアンタゴニストの効果、を示す。
【００２５】
図７はＥＣＭタンパク質に付着する腫瘍細胞に及ぼす環状ペンタペプチドの影響を示す。
【００２６】
図８は脳腫瘍細胞および脳毛細管細胞の両方における細胞死（アポプトシス）に至る付着の阻止の効果を示す。この効果はＥＣＭビトロネクチンおよびテネイシンに限定されている。
【００２７】
図９は前脳にＵ８７脳腫瘍異物移植し、活性（抗α_ｖ）または対照ペプチドを投与したヌードマウスの免疫組織化学を示す。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明の一つの態様は宿主の脳における腫瘍成長を阻止する方法であって、かかる阻止を必要とする宿主に治療上有効量のインテグリンアンタゴニストを投与することを含む方法を提供する。
【００２９】
脳における腫瘍の成長がインテグリンとそのリガンドとの相互作用を必要とする限り、本発明の方法を用いて脳で成長するいずれかの腫瘍を処置することができる。かかる腫瘍の例としては神経膠芽細胞腫、神経髄芽細胞腫（星状細胞腫、その他の初期神経外胚葉細胞腫および脳幹神経膠癌）などがあるが、これらに限定するものではない。本発明の目的のためには、好ましくは腫瘍成長は宿主の脳の脳内に位置する。宿主はラットおよびヒトなど（これらに限定するものではない）のいずれかの哺乳動物でよい。腫瘍成長が処置により損なわれれば、腫瘍成長は阻止される。
【００３０】
本発明の目的のためにはインテグリンは相同性ヘテロ二量体膜貫通レセプターの特定のファミリーのいずれかのメンバーである。アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）に結合することによりレセプターは細胞付着を指示する。レセプターは腫瘍細胞および正常細胞の両方で発現され得る。インテグリンの特性は当該分野で周知であり、詳しく特徴づけされており、引用した参考文献に詳細に記載されており（１、２）、その内容は引用により本明細書の一部とする。インテグリンの例としてはα_ｖファミリー例えばα_ｖβ_３、α_ｖβ_５、α_ｖβ_１、α_ｖβ_６、α_ｖβ_８等が挙げられるが、これらの限定するものではない。
【００３１】
インテグリンのアンタゴニストは、レセプターであるインテグリンへの、例えばビトロネクチン、テネイシン、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩなど（これらに限定するものではない）の種々のマトリックスタンパク質であるリガンドの結合活性を阻止することにより、インテグリンの生理学的または薬理学的活性を遮断または阻止する分子である。本発明の一つの態様では、インテグリンのアンタゴニストはインテグリンα_ｖβ_３またはインテグリンα_ｖβ_５のアンタゴニストでよい。好ましいインテグリンアンタゴニストはモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメントまたはペプチドのいずれかでよい。
【００３２】
例えば、α_ｖβ_３のアンタゴニストはα_ｖβ_３のその複数のリガンドの一つ、すなわちビトロネクチンまたはテネイシンへの結合を阻止するいずれかの因子でよい。α_ｖβ_３のアンタゴニストの例はＰＣＴ出願ＷＯ９６／３７４９２およびＷＯ９７／４５１３７に記載されており、その内容は引用により本明細書の一部とする。
【００３３】
同様に、α_ｖβ_５のアンタゴニストはα_ｖβ_５のそのリガンドすなわちビトロネクチンへの結合を阻止するいずれかの因子でよい。α_ｖβ_５のアンタゴニストの例はＰＣＴ出願ＷＯ９７／０６７９１に記載されており、その内容は引用により本明細書の一部とする。
【００３４】
本発明の一つの態様では、アンタゴニストはα_ｖのポリペプチドのアンタゴニスト、すなわちα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５のポリペプチドアンタゴニストである。好ましくはポリペプチドはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）含有ポリペプチドである。一つの態様では、ポリペプチドアンタゴニストはα_ｖのＲＧＤ環状ペンタペプチドアンタゴニストである。
【００３５】
本発明の別の態様によれば、アンタゴニストはα_ｖβ_３またはα_ｖβ_５に免疫特異的なモノクローナル抗体でよい。また別に、それは各々α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に対する抗体の組み合わせでよい。一つの態様では、α_ｖβ_３に免疫特異的なモノクローナル抗体はＬＭ−６０９と称するモノクローナル抗体の免疫反応特性を有する。本発明の別の態様では、α_ｖβ_５に免疫特異的なモノクローナル抗体はＰ１−Ｆ６と称するモノクローナル抗体の免疫反応特性を有する。ＬＭ−６０９抗体およびＰ１−Ｆ６抗体は共に産業上周知であり、ケミコン、テメキュラ、カリフォルニアより市販されている。
【００３６】
本発明の目的のためには、脳における腫瘍成長を阻止するための本発明の方法において、アンタゴニストを単独で、または互いに組み合わせて用いることができる。
【００３７】
治療上有効量とは、処置する宿主の脳において腫瘍成長を測定できる程度に阻止するのに十分なのアンタゴニスト量である。腫瘍成長の阻止は、本明細書に記載するように、マウス脳ＭＲＩスキャニングにより、または３Ｈ−チミジン取り込みにより染色した後顕微鏡測定により決定でき、この方法は当業者に周知である。
【００３８】
インテグリンアンタゴニストがＲＧＤ含有ペプチド、抗α_ｖβ_３モノクローナル抗体もしくはそのフラグメント、抗α_ｖβ_５モノクローナル抗体もしくはそのフラグメントまたはα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５のモノクローナル抗体の組み合わせの形態をとり得る限り、「治療上有効量」の効力、従って発現が変化し得ることは理解されよう。しかしながら、本発明のアッセイ法により示されるように、当業者は本発明の候補アンタゴニストの効力を容易に評価できる。
【００３９】
アンタゴニストの効力はＣＡＭアッセイ、インビボ脳腫瘍アッセイにおける脈管形成の阻止など（これらに限定するものではない）の種々の手段により、および本明細書に記載するα_ｖβ_３またはα_ｖβ_５のごときインテグリンへの天然のリガンドの結合の阻止を測定することにより測定できる。
【００４０】
アンタゴニストの投与量範囲はアンタゴニストの形態および特定のインテグリンに対するその効力に依存する。当業者は過度の実験をせずとも本発明の開示に鑑み、特定のアンタゴニストに適切な用量を見出すことができる。投与量は脳における腫瘍成長を阻止する望ましい効果を生じるのに十分多くすべきである。例えば本発明のインテグリンアンタゴニストがポリペプチドの形態で投与される場合、投与量は副作用、例えば脳浮腫すなわち例えばカヘキシアなどの脳腫瘍からのサイトカインの急速な放出を引き起こすほど多くすべきではない。体重ｋｇあたりの用量は１日１回またはそれ以上、１日または数日または無期限に投与する場合、１ないし２０ｍｇに変化できる。本発明のインテグリンアンタゴニストをモノクローナル抗体の形態で投与する場合、１回投与を週１ないし２回を無期限に投与するとき、用量は１ないし２０ｍｇ／ｋｇに変化できる。
【００４１】
本発明のポリペプチドまたはモノクローナル抗体を注射により、または時間をかけて徐々に注入することにより非経口的に投与できる。組織はたいてい腹腔内または皮下（抗体）投与により処置されるが、本発明のアンタゴニストはまた眼内、静脈内、筋肉内、腔内、経皮的にも投与でき、蠕動手段により分配することができる。
【００４２】
投与処方に適合する手段で、および治療上有効量で組成物を投与する。投与する量および投与の時期は処置する対象、活性成分を利用する対象のシステムの容量、および望まれる治療効果の程度に依存する。投与する必要のある活性成分の正確な量は医師の判断に依存し、各個体に特有である。しかしながら、全身適用のための適当な用量範囲は本明細書で開示され、投与経路に依存する。投与のための適当なレジュメもまた変化するが、最初の投与、続いてその後の注射またはその他の投与により１時間またはそれ以上の間隔で反復投与することにより類型化される。
【００４３】
本発明の態様によれば、本発明はまた本明細書に記載する治療方法を実行するのに有用な医薬用組成物をも提供する。組成物は本発明のアンタゴニストを医薬上許容される担体と組み合わせて含有する。本発明で用いる「医薬上許容される」「生理学的耐性のある」およびその文法的に変化した用語は、組成物、担体、希釈剤および試薬に言及する場合、互換的に用いられ、物質が望ましくない生理学的影響を生じずに哺乳動物にまたは哺乳動物において投与できることを意味する。
【００４４】
本発明のペプチドまたは抗体の非経口投与用製剤には滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液および乳液などがある。非水溶性溶媒の例としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油例えばオリーブ油および注射可能な有機エステル例えばオレイン酸エチルなどがある。水性担体には水、アルコール性／水溶液、乳液または懸濁液、例えばセイラインおよび緩衝溶媒などがある。非経口用ベヒクルには塩化ナトリウム溶液、デキストロースリンガー液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンガー液または固定油などがある。静脈内投与用のベヒクルには液体および栄養補給物質、電解質補給物質（例えばデキストロースリンガー液を基盤とするもの）等がある。保存剤およびその他の添加物、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性気体等をも含んでよい。
【００４５】
本発明の別の態様は宿主の脳に位置する腫瘍組織における脈管形成を阻止する方法を提供する。この方法はインテグリンのアンタゴニストの脈管形成阻止用量を含んでなる組成物を宿主に投与することを含む。
【００４６】
発明の背景のセクションで記載したように、脈管形成は、既存の宿主血管から新生血管のネットワークを形成することであり、１ないし２ｍｍ^３を越える腫瘍成長に必要である。本発明の目的のためには、脈管形成により媒介される脈管形成および疾患の症状が改善されれば、脈管形成は阻止される。
【００４７】
本発明の一つの態様では、腫瘍組織は宿主の脳の大脳内に位置する。宿主はいずれかの哺乳動物でよい。宿主の実例にはマウス、ラットおよびヒトなどがあるが、これらに限定するものではない。
【００４８】
アンタゴニストの投与の用量範囲はアンタゴニストの形態および特定のインテグリンに対する効力に依存する。当業者は過度の実験をせずに本発明の開示に鑑み、特定のアンタゴニストの適切な用量を見出すことができる。用量は脈管形成により媒介される脈管形成および疾患の症状が改善される望ましい効果を生じるのに十分多くするべきである。用量は副作用、例えばサイトカイン放出または出血を伴う急速な腫瘍溶解による脳浮腫を引き起こすほど多くすべきでない。
【００４９】
本発明の一つの態様では、インテグリンのアンタゴニストはインテグリンα_ｖβ_３またはインテグリンα_ｖβ_５のアンタゴニストでよい。好ましいインテグリンアンタゴニストはモノクローナル抗体またはペプチドのいずれかでよい。本発明の一つの態様では、アンタゴニストはα_ｖのポリペプチドアンタゴニスト、すなわちα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５のポリペプチドアンタゴニストである。好ましくはポリペプチドはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）含有ポリペプチドである。一つの態様では、ポリペプチドアンタゴニストはα_ｖのＲＧＤ環状ペンタペプチドアンタゴニストである。
【００５０】
本発明の別の態様によれば、アンタゴニストはα_ｖβ_３に対する抗体および各々α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に対する抗体の組み合わせでよい。
【００５１】
治療上有効量は処置する組織において脈管形成を測定可能な程度に阻止するのに十分なアンタゴニスト量、すなわち脈管形成阻止量である。脈管形成の阻止は本明細書に記載する免疫組織化学により、または当業者に周知のその他の方法によりインシトゥー測定できる。
【００５２】
本発明の一つの態様によれば、本発明はまた本明細書に記載する治療方法を実行するのに有用な医薬用組成物をも提供する。組成物は本発明のアンタゴニストを医薬上許容される担体と組み合わせて含有する。
【００５３】
本発明のさらなる態様は宿主の脳で成長する脳腫瘍細胞においてＥＣＭ依存性細胞付着を阻止する方法であって、治療上有効量のインテグリンα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に対するアンタゴニストを宿主に投与することを含む方法を提供する。
【００５４】
本発明の目的のためには、ＥＣＭ依存性細胞付着には、ＥＣＭ依存性であり、α_ｖインテグリンに媒介されるいずれかの細胞付着などがある。かかる付着の例としてはビトロネクチン依存性細胞付着およびテネイシン依存性細胞付着などがあるが、これらに限定するものではない。ヒト脳腫瘍がビトロネクチンおよびテネイシンを生成し、ＥＣＭがインテグリンとの相互作用による腫瘍細胞付着および遊走において重要な役割を果たすことは本発明の知見である。本発明の目的のためには、ＥＣＭに対する腫瘍細胞付着が低減されれば、阻止が達成される。
【００５５】
本明細書で用いる「治療上有効量」なる用語はＥＣＭ媒介腫瘍細胞付着が低減されるのに十分なアンタゴニスト量を示す。本明細書に記載する方法により、および当業界で一般的な方法により細胞付着を測定できる。
【００５６】
本発明の一つの態様によれば、アンタゴニストはα_ｖのアンタゴニストまたは各々α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に対する抗体の組み合わせでよい。例えばアンタゴニストはα_ｖのＲＧＤ環状ペンタペプチドアンタゴニストまたはＬＭ−６０９およびＰ１−Ｆ６と称するモノクローナル抗体の組み合わせでよい。
【００５７】
本発明の別の態様は宿主の脳で成長する脳腫瘍細胞におけるビトロネクチン依存性細胞遊走を阻止する方法であって、治療上有効量のα_ｖβ_３に対するアンタゴニストを宿主に投与することを含む方法を提供する。
【００５８】
本発明の目的のためには、腫瘍細胞遊走が低減されれば、阻止は達成される。
【００５９】
本明細書で用いる「治療上有効量」なる用語はビトロネクチンに媒介される腫瘍細胞遊走が低減されるのに十分なアンタゴニスト量を示す。本明細書に記載する方法により、および当業界で一般的な方法により細胞遊走を測定できる。
【００６０】
本発明の一つの態様によれば、アンタゴニストはα_ｖのポリペプチドアンタゴニストまたはα_ｖβ_３に対して免疫的に活性であるモノクローナル抗体でよい。例えばアンタゴニストがα_ｖのＲＧＤ環状ペンタペプチドアンタゴニストまたはＬＭ−６０９と称するモノクローナル抗体でよい。
【００６１】
本発明はまた宿主の脳において成長する腫瘍細胞のアポプトシスを誘導する方法をも提供する。その方法は治療上有効量のインテグリンアンタゴニストを宿主に投与することを含む。
【００６２】
本発明の目的のためには、アンタゴニストの投与後、脳における腫瘍細胞アポプトシスの量の増加が観察される場合、脳腫瘍細胞アポプトシスが誘導される。治療上有効量は処置する宿主の脳において測定できる程度の細胞アポプトシスを生じるのに十分なアンタゴニスト量である。脳における腫瘍細胞アポプトシスは本明細書に記載する方法または当業界で周知の方法により測定できる。
【００６３】
本発明の一つの態様において、インテグリンはα_ｖ、α_ｖβ_３またはα_ｖβ_５でよい。アンタゴニストはα_ｖのポリペプチドアンタゴニストでよい。
【００６４】
実施例
材料および方法
材料：
活性な環状ＲＧＤペンタペプチドＥＭＤ１２１９７４、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）および不活性対照ペプチドｃＲＡＤ（ＥＭＤ１３５９８１）はＡ．Ｊｏｎｃｚｙｋ，Ｐｈ．Ｄ．、Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツにより提供された。モノクローナル抗体ＬＭ６０９およびＰ１Ｆ６については記載されている（１３）。脳腫瘍セルラインＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧをＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州より購入した。ヒト毛細管内皮細胞の初代培養物はＭ．Ｓｔｉｎｓ、Ｐｈ，Ｄ．，チルドレンズ・ホスピタル、ロサンジェルス（４９）により提供された。ヒトビトロネクチンはプロメガ、マジソン、ウィスコンシン州より購入した。
【００６５】
ＦＡＣＳ分析：
ＦＡＣスキャンサイトメーター（ベックトン・ディッケンソン、サンジョーズ）を用いた。条件は前記するとおりである（４３）。１次抗体はＬＭ６０９およびＰ１Ｆ６を１：１００で用い、２次抗体はＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ、１：２５０であった。アポプトシスの決定は製造者の指示書に従った（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州、アポ・アラート・アネクシンＶ−ＦＩＴＣアポプトシスキット）。
【００６６】
付着：
アッセイ条件は前記したとおりである（１５）。非組織培養物で処理したウェルをビトロネクチンと共に４℃で一晩インキュベートし（１ないし１０μｇ／ｍｌ ＰＢＳ）、洗浄し、ＰＢＳ中１％熱変性ＢＳＡで３０分間遮断し、続いてＰＢＳで洗浄した。３０分間付着バッファー中試験物質（２０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃でプレインキュベートした対照および試験細胞をウェルに載せ（５ｘ１０^４セル／ウェル）、３７℃で１時間インキュベートした。付着バッファーでウェルを穏やかに洗浄した後、付着細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、染料をメタノールに溶解し、６００°ＡでＯＤを測定した。
【００６７】
遊走：
トランスウェルポリカーボネートフィルター（孔径８μ）をＰＢＳ中ビトロネクチンと共に３７℃で３０分間インキュベートし（上側は１μｇ／ｍｌ、底側は１０μｇ／ｍｌ）、１％熱変性ＢＳＡで３０分間遮断し、ＰＢＳで洗浄した。試験細胞（５ｘ１０^５／ウェル）を指示した試験物質（２０μｇ／ｍｌ）を含有する付着バッファーに加え、付着バッファーを含有する下部チャンバーで３７℃で４時間インキュベートした。上部チャンバーの細胞を綿棒で除去し、フィルターの底部の細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、遊走細胞数を計数することにより決定した。
【００６８】
アポプトシス：
付着条件は、ビトロネクチンおよび５ｘ１０^５セル／ウェルで被覆した１２ウェルプレートを付着バッファー中に置く以外は前記のとおりであった。３７℃で３０分間インキュベートした後、付着バッファーを活性ｃＲＧＤまたは不活性ｃＲＡＤペプチド２０μｇ／ｍｌを含有するバッファーで置換し、さらに４時間インキュベートした。付着した細胞をトリプシン消化し、上澄中の剥離した細胞と組み合わせ、次いでアポ・アラート・アネクシン・Ｖ−ＦＩＴＣアポプトシスキット（クロンテック）を用いてアポプトシス細胞の存在を試験した。
【００６９】
ＣＡＭアッセイ：
卵提供者および調製物については前記した（２３）。腫瘍細胞は、ＤＡＯＹに関しては４ｘ１０^６セル／卵およびＵ８７ＭＧに関しては３．５ｘ１０^６セル／卵でＰＢＳ５０μｌ中に置いた。細胞を７日間腫瘍に成長させ、次いで滅菌条件下回収し、類似の大きさにトリミングし、１０日齢胚のＣＡＭ上で繰り返した。翌日活性または不活性ペプチド（１００μｇ／卵）をＣＡＭ静脈に注射した。成長の７日後腫瘍をインシトゥー写真撮影し、次いで回収し、重量測定し、４％ 緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した。連続切断した後、スライドをヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【００７０】
脳腫瘍モデル：
モデルの詳細については我々が記載した（３１）。腫瘍細胞（１０^６／１０μｌＰＢＳ）を記載した条件で脳内に注射した。活性ｃＲＧＤまたは不活性ｃＲＡＤペプチド（１００μｇ／５０μｌ／マウス）を用いる腹腔内処置はＵ８７ＭＧに関しては移植の３日後、ＤＡＯＹ細胞に関しては１０日後に開始し、悪液質および／または瀕死の状態を生じるまで毎日繰り返した。次いでＣＯ_２麻酔により動物を屠殺し、脳を取出し、液体窒素中スナップ凍結するか、または緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、切片に切断し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。
【００７１】
皮下腫瘍成長：
皮下腫瘍成長のためには細胞（１０^６マウス）を右肩肉趾の下にｓ．ｃ．注射し、その直後脳内注射をした。
【００７２】
動物実験：
ＮＩＨガイドラインに従って動物実験を行い、地方動物保護委員会（ｌｏｃａｌ ａｎｉｍａｌ ｃａｒｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に承認された。
【００７３】
実験
ＣＡＭにおける脈管形成
脈管形成に関与する脳腫瘍に及ぼすα_ｖ拮抗作用の影響を評価するために、ＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧヒト脳腫瘍細胞を雛鶏漿尿膜（ＣＡＭ）で成長させた。腫瘍を７日間成長させた後、除去し、新鮮ＣＡＭに再移植した。移動の２４時間後、活性ｃＲＧＤペプチドまたは対照ペプチド（ｃＲＡＤ）のいずれかを１００μｇＣＡＭ静脈に注射した。腫瘍をさらに６日間成長させ、次いで重量を測定し、血管形成に関して分析した。双眼立体顕微鏡試験により対照ペプチドを投与された腫瘍が広範な脈管形成を呈し、一方α_ｖアンタゴニストで処置した腫瘍は脈管形成の著明な抑制を示した（図１ａ）。腫瘍成長もまたα_ｖアンタゴニストによって阻止された。重量で８０％の増加した対照腫瘍に比較して、α_ｖアンタゴニスト処置した腫瘍は重量で３０％減少した（図１ｂ）。これらのデータはα_ｖ拮抗作用による腫瘍成長の阻止は、腫瘍に伴う脈管形成の崩壊の結果であることを示唆している。
【００７４】
図１ａおよび１ｂはα_ｖアンタゴニストによるＣＡＭにおける（ａ）脈管形成、および（ｂ）腫瘍成長の阻止を示している。ＣＡＭで成長する脳腫瘍を回収し、類似の大きさに切断し、１０日齢の鶏卵の新鮮ＣＡＭ上に置いた。翌日、活性α_ｖインヒビターまたは対照ペプチド１００μｇを鶏静脈に注射し、さらに６日間成長させた。対照ペプチドを投与した卵は著明な脈管形成（ａ）（ＤＡＯＹ＝ＡおよびＵ８７ＭＧ＝Ｃ）を示したが、活性ペプチドを投与した卵（ＤＡＯＹ＝ＢおよびＵ８７ＭＧ＝Ｄ）では新生血管形成の著名な抑制が観察された。ＣＡＭ上に置いた腫瘍を実験の始めと終わりに重量測定した（ｂ）。対照ペプチドで処置した腫瘍の重量は両方の腫瘍の型で８０％増加した（左、ｎ＝８）が、一方活性ペプチドを投与した場合約３０％減少した（右、ｎ＝８）。
【００７５】
同所腫瘍モデル
ＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧ細胞（１０^６セル／マウス）をｎｕ／ｎｕマウスの右前頭皮質に定位で注射し、脳微環境を再現するシステムを確立した。この方法によりヒト脳腫瘍形成の高度に再現性のあるモデルが可能になり、α_ｖ拮抗作用を導入する前に経時的な腫瘍成長およびマウス生存性の測定が可能になった（図２ａおよび２ｂ）。図２はＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧ細胞を脳内注射した後の腫瘍の大きさ（Ａ）およびマウス生存性（Ｂ）を示す。Ｕ８７ＭＧ細胞は急速な成長を示し、６週で約６ｍｍのプラトーに達し、一方ＤＡＯＹ細胞は緩徐な成長を示し、９週で直径５．５ｍｍに達する（Ａ）。全動物は９週までに死亡する（Ｂ）。各時間でポイントｎ＝５または６である。
【００７６】
このモデルにおけるｃＲＧＤペプチドの影響を試験するために、腫瘍を最初に７日間（ＤＡＯＹ）または３日間（Ｕ８７ＭＧ）成長させた後、α_ｖアンタゴニスト（１００μｇ／マウス）またはその不活性対照をさらに３週間毎日ｉ．ｐ．投与した。屠殺時に（腫瘍成長の全時間４週）、対照マウスは顕著な肉眼観察できる、平均３ｍｍ（ＤＡＯＹ）および５．５ｍｍ（Ｕ８７ＭＧ）の大きさの脳腫瘍を有した。処置マウスは腫瘍がないか、または脳室および硬膜表面に沿って顕微鏡的に凝集して見出される極わずかの残存腫瘍細胞を有するかのいずれかであった（図３ａおよび３ｂ）。図３ａおよび３ｂは毎日不活性（Ａ）または活性ペプチド（ＢないしＤ）で処置した、同所注射した脳腫瘍細胞ＤＡＯＹ（ａ）およびＵ８７ＭＧ（ｂ）の組織病理学を示す。対照動物（Ａ）では大きな脳内腫瘍（矢印）が肉眼観察され、一方α_ｖアンタゴニスト処置動物においては腫瘍が検出されない（Ｂ）か、または顕微鏡的な残存腫瘍（矢印）のみが検出される（ＣおよびＤ）。
【００７７】
処置マウスはまた基底体重２１ｇを維持したが；しかしながら、ＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧ対照マウスでは体重が各々１６ｇおよび１５ｇであり、基底体重から５ないし６ｇの減少を示している（表１を参照のこと）。対照群での神経学的症状の発現までの平均時間は対照群で、Ｕ８７ＭＧマウスに関しては２．５週、ＤＡＯＹマウスに関しては４．５週であり、一方処置動物ではいずれの時間でも神経学的症状の証拠は認められなかった。
【００７８】
【表１】

【００７９】
別の動物で生存性に関して試験した。瀕死の状態であるためにマウスの屠殺を必要とした時点で生存性を測定した。対照動物は全て腫瘍成長の６週より前に屠殺し、両対照群の大部分（＞５０％）を３ないし４週までに屠殺した（図４）。図４は活性または不活性ペプチドを投与した、すなわちＵ８７ＭＧ細胞に関しては３日に、ＤＡＯＹ細胞に関しては７日にｉ．ｐ．処置（１００μｇ／マウス／日）を開始した、同所脳腫瘍移植後のマウスの生存性を示す。ＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧ対照に関するＮは各々マウス１６匹であり、ＤＡＯＹ処置に関しては３２匹、Ｕ８７ＭＧ処置に関しては２４匹である。図４は処置動物では屠殺を必要としたものはなく、今のところ腫瘍注射してからＤＡＯＹ処置マウスで２４週まで、Ｕ８７ＭＧマウスで１５週まで生存した。処置動物で神経学的徴候を進展させたものはなく、全て正常に成長を続けた。
【００８０】
異所腫瘍モデル
α_ｖ拮抗作用に供した腫瘍成長に及ぼす微環境の影響を決定するために、同一のヒト脳腫瘍細胞を皮下注射し（１０^６セル／ヌードマウス）、その後、腫瘍細胞注射後３日（Ｕ８７ＭＧ）および７日（ＤＡＯＹ）に活性および対照ペプチド（１００μｇ／マウス、毎日ｉ．ｐ．）を用いる処置を開始した。これらの条件下、活性ペプチドにより腫瘍成長は阻止されず、６週後、処置および未処置群の腫瘍は肉眼的および顕微鏡的の両方で同等に見られ、各々広範な脈管形成の存在が示された（データは示していない）。これは試験した脳腫瘍細胞の本来備わっている特性がｃＲＧＤペプチドアンタゴニストの活性に対する感受性を腫瘍細胞に付与するのに十分ではなく、むしろ脳微環境に独特の条件が必要とされることを示唆している。
【００８１】
この知見をさらに研究するために、同所モデルの概要にそってペプチドでの処置を開始する前にＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧ細胞を脳内および皮下に同時に注射した。図５は同所（脳）および異所（皮下）に移植したＤＡＯＹ細胞に及ぼすα_ｖアンタゴニストの影響を示す。腫瘍細胞（１０^６）を脳および皮下に注射し、不活性（ａ）または活性（ｂ）ペプチドでの処置を７日に開始した。４週で写真撮影をした。不活性（ａ）または活性（ｂ）ペプチドのいずれかを投与した動物は類似の大きさの皮下腫瘍（Ａ）および血管形成（Ｂ）を示した。両方の条件でｓ．ｃ．腫瘍は下層の筋肉層内まで成長した（矢印）（Ｃ）。それに比して、対照動物では大きな脳腫瘍に進行したが（矢印）、一方活性ペプチドを投与したマウスでは疾患が認められないか、または顕微鏡的な残存疾患が認められた（Ｄ）。従って、図５は対照および処置群共に皮下腫瘍が明らかに広範な血管形成を伴う平均１８ｍｍ^３の大きさまで成長したことを示している（図５）。対照マウスではまた以前に同所腫瘍モデルで観察されたのと類似の大きさの大きな脳腫瘍に進行し、神経学的な無防備状態の臨床所見も同様であった（表１）。対照的に、活性ペプチドを投与されたマウスは明らかな神経学的徴候もなく生存し、剖検により脳内腫瘍がないか、または顕微鏡的な残存性腫瘍細胞クラスターのみが示された（図５）。しかしながら、この群では皮下腫瘍が進行性の成長を示し、１０週後に屠殺する必要があった。これにより脳内で成長する腫瘍は環状ＲＧＤペプチドを用いる処置に応答するが、皮下で成長した同一の腫瘍は応答しないことが確認された。
【００８２】
インテグリン発現
ビトロネクチンは脳および皮下区画で観察される異なる生物学的応答に影響するマトリックスタンパク質である。これは神経外部位に豊富に存在するが、通常神経膠およびニューロン組織により生成されない（１５、２０）。しかし、悪性神経膠腫細胞は、ビトロネクチンを合成し、このビトロネクチンは、ひるがえって、悪性神経膠腫細胞の付着および蔓延にとって決定的となる（１５）。また別に、ビトロネクチンは内皮細胞付着および腫瘍床への遊走を促進し、脈管形成を増強する。細胞のビトロネクチンへの付着はインテグリンα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５により媒介されるので、ヒトＤＡＯＹ神経髄芽細胞腫、Ｕ８７ＭＧ神経膠芽細胞腫およびヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ）の初代培養物がインテグリンα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５のを発現するかどうかを決定するためにＦＡＣＳ分析を実施した（図６ａ）。
【００８３】
図６ａないし６ｄは脳腫瘍および脳毛細管内皮細胞に関する（ａ）インテグリンプロファイル、（ｂ）ビトロネクチンへの付着に及ぼすα_ｖアンタゴニストの影響、（ｃ）ビトロネクチンにおける遊走および（ｄ）ビトロネクチンにおける細胞生存性を示す。ＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧの両方の腫瘍細胞および脳毛細管細胞はインテグリンα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５を発現する（ａ）。ビトロネクチンへの付着は活性ペプチドにより、およびα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に対する抗体の組み合わせにより著明に阻止されたが、対照ペプチドでも特異的抗α_ｖβ_３または抗α_ｖβ_５抗体単独でも著明な効果は全くなかった。ビトロネクチングラジエントにおける細胞遊走はα_ｖβ_３抗体およびα_ｖアンタゴニストにより阻止されたが、対照ペプチドまたはα_ｖβ_５に対する抗体には阻止効果は全くなかった。ビトロネクチンに１時間細胞を付着させることにより細胞生存性を試験し、次いでそれを対照ペプチドまたはα_ｖアンタゴニスト（２０μｇ／ｍｌ）に４時間暴露した（ｄ）。付着および浮遊細胞を組み合わせ、ＦＡＣＳにより、ＦＩＴＣ標識抗アネクシンＶおよびヨウ化プロピジウムを用いてアポプトシスに関して試験した。対照ペプチドに暴露した培養物ではアポプトシスはほとんど観察されなかったが（ｄ、左）、脳毛細管内皮細胞およびＤＡＯＹ細胞の両方では有意な数のアポプトシス細胞が認められた（ｄ、右）。
【００８４】
図６ａないし６ｄはＵ８７ＭＧ細胞がＤＡＯＹ細胞に比較して高レベルのα_ｖβ_３を発現するが、後者は高量のα_ｖβ_５を発現する。ＶＥＧＦ含有培地で成長したＨＢＥＣ細胞は高量のα_ｖβ_５を発現するが、細胞の５０％は短時間培養でα_ｖβ_３インテグリンを発現する。またビトロネクチンで被覆したプレート上で培養物中２日間成長させた後、ＦＡＣＳ分析により細胞を試験した。これらの条件下ではα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５の発現は変化しなかった（データは示していない）。
【００８５】
ビトロネクチン付着
α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５がビトロネクチンに対するＤＡＯＹ、Ｕ８７ＭＧおよびＨＢＥＣ付着を制御するかどうかを決定するために、細胞をビトロネクチンで被覆したウェルに載せ、α_ｖβ_３（ＬＭ−６０９）およびα_ｖβ_５（Ｐ１−Ｆ６）のいずれかの遮断抗体またはｃＲＧＤペプチドの存在下または不在下で付着させる。Ｐ１−Ｆ６はＤＡＯＹ細胞の付着を最低限に阻止するが、ＬＭ−６０９はいずれの細胞の付着にも影響を及ぼさなかった。Ｐ１−Ｆ６およびＬＭ−６０９を一緒に、またはｃＲＧＤ単独でインキュベートすることにより、細胞の付着の著明な阻止が観察された（図６ｂ）。これらのデータはどちらかのインテグリンを別個に遮断するのは不十分であり、試験した細胞により示されるビトロネクチン依存性付着を有意に崩壊するにはα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５の二重遮断が必要であることを示している。
【００８６】
ビトロネクチン遊走
α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５が付着とは独立してビトロネクチンにおける遊走を変調するかどうかを調べるために、ボイデンチャンバーで、遮断抗体またはｃＲＧＤの存在下、ビトロネクチン被覆膜において同一の細胞を試験した。Ｐ１−Ｆ６は遊走に影響しない；しかしながら、ＬＭ−６０９およびｃＲＧＤは三つの細胞型全ての遊走を著明に阻止した（図６ｃ）。Ｐ１−Ｆ６の不在下ではＬＭ−６０９が付着を遮断できなかったので、この抗遊走効果は付着に寄与する力に依存しない明確な経路により媒介されるにちがいない。さらにＬＭ−６０９はｃＲＧＤと同様に遊走を遮断し、これはα_ｖβ_３媒介細胞シグナル発信が試験する脳腫瘍および脳内皮細胞の遊走の決定において重大な構成要素であることを示唆している。
【００８７】
アポプトシス
等級の高い星状細胞腫が侵襲縁先端でビトロネクチンを生成し、これはこのタンパク質が脳腫瘍細胞付着、遊走およびおそらく細胞生存性において重要な役割を果たすことを示唆している（１５）。我々は以前に脳腫瘍または毛細管細胞をｃＲＧＤペプチドまたは抗α_ｖβ_３および抗α_ｖβ_５抗体の組み合わせと共にプレインキュベーションすることによりビトロネクチンへの細胞付着を防御することを示した。マトリックスタンパク質へのインテグリン依存性付着が同様に阻止された後、内皮および黒色腫細胞アポプトシスが示された（２６ないし２８）。従って、これらの細胞がビトロネクチンから剥離された後、α_ｖアンタゴニストがこれらの細胞のアポプトシスを誘起するかどうかを決定するのは興味深かった。ＤＡＯＹ細胞および１次ＨＢＥＣをビトロネクチン被覆ウェルの付着バッファーに播種し（１μｇ／ｍｌ）、３７℃で３０分間付着させた。次いでバッファーをｃＲＧＤまたはｃＲＡＤペプチド（対照）を２０μｇ／ｍｌで含有するバッファーと交換し、さらに４時間インキュベートした。付着した細胞をトリプシン消化した後、浮遊細胞と組み合わせ、抗アネクシンＶ−ＦＩＴＣ抗体およびヨウ化プロピジウムを用いてＦＡＣＳによりアポプトシス細胞数を測定した（クロンテック・アポ・アラート・アネクシン・Ｖ−ＦＩＴＣ検出アポプトシスキット）。対照ペプチドｃＲＡＤに暴露した細胞はほとんどアポプトシスを示さないが、ＤＡＯＹおよびＨＢＥＣ ｃＲＧＤ処置細胞は共に著明なアポプトシスを示した（図６ｄ）。これらのデータはｃＲＧＤペプチドがビトロネクチンからこれらの細胞を剥離するだけでなく、続いてこれらのアポプトシスを誘起することを示している。
【００８８】
異なるＥＣＭ基質への脳腫瘍細胞付着に及ぼすペンタペプチドの影響
図７はＥＣＭタンパク質への腫瘍細胞付着に及ぼす環状ペンタペプチドの影響を示す。組織不含培養皿をビトロネクチン、テネイシン、フィブロネクチンまたはコラーゲンＩ（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。洗浄後、５ｘ１０^５セル／ウェルを載せ、３７℃で１６時間インキュベートした。次いで培養物を洗浄し、２０μｇ／ｍｌのペンタペプチドまたは対照ペプチドを含有する付着バッファーを加え、さらに２ないし２４時間インキュベートした。ついで培養物を付着バッファーで２回洗浄し、クリスタルバイオレットで染色し、ＯＤ６００を測定した。付着細胞が多く存在するほどＯＤは高くなる。データは８時間のインキュベーション後の付着細胞を示している。Ｕ８７＝神経膠芽細胞腫およびＤＡＯＹ＝神経髄芽細胞腫。
【００８９】
図７に示すように、腫瘍細胞はコラーゲンおよびフィブロネクチンから（α_ｖインテグリンと相互作用しない）ではなく、ビトロネクチンおよびテネイシンから（その付着はα_ｖインテグリンにより媒介されている）剥離した。脳毛細管細胞でも同様のデータが得られた（示していない）。
【００９０】
細胞生存性に及ぼす細胞剥離の影響
図８はＥＣＭにおいて成長し、ペンタペプチドに暴露した脳腫瘍細胞および毛細管細胞のアポプトシスを示す。トリプシン消化後剥離細胞および付着細胞を組み合わせた以外は，試験条件は図７のとおりである。ついで細胞を洗浄し、５０μｌＰＢＳに懸濁し、ガラスカバースライド（サイトスピン）で遠心した。４％ パラホルムアルデヒドで固定した後、ベーリンガーアポプトシスキットを用いて、アポプトシスに関して細胞を染色した。結果を細胞全数に対するアポプトシス細胞のパーセンテージとして表す。ペプチドと共に２４時間インキュベートした後試験した。
【００９１】
細胞生存性に及ぼす細胞剥離の影響を図８に示す。示すように、活性ペプチドに２４時間暴露し、ビトロネクチンまたはテネイシンにおいて成長させた細胞は対照細胞と比較して、細胞死数の増加が示された。対照的に、ペンタペプチドはコラーゲンＩまたはフィブロネクチンで成長させた細胞の生存性を変化しなかった。腫瘍細胞および脳毛細管細胞の両方の型で生存細胞の減少が観察された。細胞表面に発現される細胞死の初期マーカーに関して細胞を染色した場合、類似のデータが得られた（アネクシンＶ、データは示していない）。このように、活性ペンタペプチドはビトロネクチンおよびテネイシンに付着する脳腫瘍細胞および毛細管細胞の両方において細胞剥離および細胞死を誘起する。
【００９２】
ヒト脳腫瘍におけるＥＣＭタンパク質の生成
前記で概要を示すように、ヒトにおいて脳腫瘍はビトロネクチンおよびテネイシンを生成し、これらの物質は腫瘍細胞の生存性を改善し、侵襲性を増強すると考えられている。我々は脳腫瘍モデルにおいてこれらのタンパク質の生成に関して試験した。
【００９３】
図９はヌードマウスの前脳に異物移植し、活性（抗α_ｖ）または対照ペプチドで処置したＵ８７脳腫瘍の免疫組織化学を示す。マウスに腫瘍細胞（１０^６／セル／マウス）を注射し、注射後７日に活性または不活性ペプチド（１００μｇ／マウス／日）による処置を開始した。処置の２週後腫瘍を除去し、緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、５μｍ切片を得た。モノクローナルラット抗マウス抗体（ファルミンゲン）、モノクローナルマウス抗ヒトビトロネクチン抗体（シグマ）、マウス抗ヒトテネイシン抗体（ネオ・マーカー）および死細胞を試験するためのベーリンガーアポプトシスキットを用いてＣＤ３１発現（毛細管細胞のマーカー）に関して切片を試験した。ＣＤ３１＝毛細管マーカー、ＶＮ＝ビトロネクチン、ＴＮ＝テネイシンおよびＡＰＯ＝アポプトシス。
【００９４】
図９に示すように、脳腫瘍は実際にビトロネクチンおよびテネイシンを生成し、ヒトタンパク質に特異的な抗体を用いて腫瘍細胞からのこれら細胞の起源が解明された。活性ペンタペプチドの投与はこれらのタンパク質の合成には影響を及ぼさなかった。さらに、脳腫瘍細胞が組織培養においてこれらのタンパク質を生成することも示すことができた（データは示していない）。このように、マウスモデルはヒト脳腫瘍の状況を擬似する。
【００９５】
ペンタペプチドの抗脈管形成効果を図９の上図に示し、ここでは毛細管細胞の特異的マーカーすなわちＣＤ３１に関して組織切片を染色した。対照ペプチドで処置した腫瘍は複数の血管（このマーカーに関して陽性に染色される）を有したが、活性ペンタペプチドで処置した腫瘍ではかかる血管が極わずかであり（ｐ＜０．００５）、これは毛細管成長の抑制を示している。図９の最下図はアポプトシス（死）細胞に関する染色を示している。方法は図８に記載した方法に類似している。活性ペンタペプチドで処置した腫瘍は対照ペプチドで処置した腫瘍よりも死細胞が著明に多かった（ｐ＜０．０２）。神経膠芽細胞腫Ｕ８７を写真撮影したが、神経髄芽細胞腫ＤＡＯＹと類似のデータが得られた（データは示していない）。
【００９６】
細胞死と腫瘍細胞アポプトシスとの関係
この細胞死の増加は直接的な腫瘍細胞アポプトシスに依るものであり、毛細管成長の抑制の結果ではないことを示すために、マウス脳にα_ｖインテグリンαを発現する（Ｍ２１Ｌα_ｖ陽性）または発現しない（Ｍ２１Ｌα_ｖ陰性）のいずれかのマウス脳黒色腫細胞を移植した。α_ｖ陽性細胞を移植し、活性ペンタペプチドで処置したマウスは対照ペプチドで処置したマウスよりも長く生存し、故に直接的な腫瘍細胞アポプトシスが原因に違いない。
【００９７】
表２はＲＧＤｆＶで処置した、α_ｖβ_３陰性および陽性腫瘍を有するマウスの生存性を示す。腫瘍細胞（１０^６）を６週齢ヌードマウスの前脳に注射し、活性または対照ペプチド（１００μｇ／マウス／日）を用いる処置を３日に開始した。悪液質になったときにマウスを屠殺し、腫瘍の存在を剖検により確認した。
【００９８】
【表２】

【００９９】
表２に示すように、α_ｖ陰性黒色腫細胞を移植したマウスは受けた処置に関わらず１５日間生存した。対照的にα_ｖ陽性腫瘍を有するマウスの寿命は対照ペプチドで処置した場合、１７日であるのに比較して、活性ペンタペプチドで処置した場合、３６日まで増す。これは直接的な腫瘍細胞アポプトシスが腫瘍細胞死に寄与するにちがいないことを示している。
【０１００】
結論として、前記で論じたデータは環状ペンタペプチドが直接的な腫瘍細胞死を引き起こすという仮定を支持している。
【０１０１】
考察
脳腫瘍は高度に脈管形成性であり、持続的に成長するために新生血管形成に依存している。したがって抗脈管形成はこれらの悪性腫瘍に対抗することを目的とする潜在的に重要な治療ストラテジーである。インテグリンα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５は、内皮におけるその発現が脈管形成中に活性化されるので、抗脈管形成の標的候補である（１２、１３）。ＣＡＭにおいてｂＦＧＦおよびＴＮＦαにより誘導される脈管形成をα_ｖβ_３遮断抗体ＬＭ６０９かまたはα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５のＲＧＤ環状ペプチドアンタゴニストのいずれかの存在下で破壊できるということを示す研究により新生血管形成の役割が前記で確認された（２１、２３）。各々の場合、本質的なα_ｖマトリックスタンパク質結合相互作用の阻止の結果、内皮細胞アポプトシスの誘導により抗脈管形成効果を生じると考えられている（２８ないし３０）。この研究では、α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５の、同様に特異的なＲＧＤ環状ペプチドアンタゴニストを用い（ＥＭＤ１２１９７４）、二つのヒト脳腫瘍セルラインＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧにより誘導されるＣＡＭ脈管形成を阻止する能力を示した。ｃＲＧＤ処置によりＣＡＭ脈管形成が抑制されたのみならず、続いて腫瘍壊死、および腫瘍退行に至った。
【０１０２】
類似の応答が脳微環境を再現するモデルで達成できるかどうかを調べるために、脳腫瘍細胞をヌードマウス前脳に同所注射した。Ｕ８７ＭＧ神経膠細胞腫およびＤＡＯＹ神経髄芽細胞腫がＣＡＭアッセイにおいてこのペプチドに応答性であることおよび先に示された（３１、３２）広範な侵襲性および脈管形成性であることの故に、Ｕ８７ＭＧ神経膠細胞腫およびＤＡＯＹ神経髄芽細胞腫を選択した。この同所モデルでは、ｃＲＧＤは再度Ｕ８７ＭＧおよびＤＡＯＹ脳腫瘍成長を著明に阻止した。対照マウスは腫瘍の進行に屈し、平均３ｍｍ^３よりも大きな高度に侵襲性の腫瘍を有することが見出された。ｃＲＧＤ処置マウスは明白な病的状態もなく生存し、移植部位に沿ってわずかな残存細胞があるかまたは脳質および硬膜表面に沿って小さなクラスターがある以外は、肉眼観察できる腫瘍は検出されなかった。処置群の残存腫瘍病巣は全て１ｍｍ^３よりも小さく、故に宿主脈管形成応答は獲得しなかった。また別の脈管形成インヒビター、例えばトロンボスポンジン−１、ＴＮＰ−４７０および血小板第４因子もまた実験的脳腫瘍成長の阻止を示したが、これらの結果のほとんどが皮下異物移植片に限定されるか、または定位注射による腫瘍床への直接的な薬物分配が必要であった（３２ないし３４）。ＳＣＩＤマウス／ラット・レイディグ細胞皮下腫瘍モデルにおいてα_ｖβ_３のペプチドアンタゴニストが腹腔内投与後腫瘍成長を８０％まで阻止することが示された（３５）。アンジオスタチンは依然作用メカニズムが明らかではない抗脈管形成薬であり、これもまた頭蓋内のＣ６および９Ｌラット神経膠細胞腫異種移植片の成長をかなり阻止することが示された（３６）。我々の研究と対照的に、アンジオスタチン（１ｍｇ／マウス／日）またはペプチド擬似アンタゴニスト（２ｍｇ／マウス／日）を用いる処置を腫瘍細胞移植の直後に開始した。我々の研究により確立された腫瘍異種移植片がほとんど除去されることが示され、インテグリン拮抗作用により頭蓋内脳腫瘍成長および脈管形成が阻止されることが初めて示された。
【０１０３】
興味深いことに、我々の研究では皮下で同時に成長したＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧ腫瘍にはｃＲＧＤ処置がほとんどまたは全く効果を示さなかった。これは宿主腫瘍細胞インテグリン応答の制御における細胞外環境の重要性を強調するものである。アンジオスタチンはｓ．ｃ．およびｉ．ｃ．注射した脳腫瘍細胞の成長を同等に阻止することが見出され、これはこの化合物がＲＧＤペプチドとは異なるメカニズムにより脈管形成を抑制することを示している（３６）。ｃＲＧＤ成長阻止におけるその差異に関するある可能な説明によると、皮下組織の内皮細胞はＣＮＳ微小血管系の内皮細胞とは本質的に異なり、脈管形成のインテグリン拮抗作用に対する感受性が低くなる。これはα_ｖノックアウトマウスでは脳および腸の毛細管細胞のみが異常であるが、循環系は損傷されずにあるという最近の知見により支持される（３７）。また別に、内皮細胞インテグリンのリガンドとして提供されるマトリックスタンパク質は同所または異所配置に依存して腫瘍細胞により優先的に発現され得る。例えば皮下に移植されたヒト神経膠芽細胞腫はビトロネクチンを生成しないことが見出されたが、脳内微環境の位置ではビトロネクチン遺伝子の発現を誘導する（１５）。正常な脳組織は同様に侵襲性神経膠細胞腫細胞に応答してＥＣＭタンパク質の発現を変化させ得る（３８）。神経外部位とは異なり、ビトロネクチンは通常脳には存在せず、従ってＣＮＳ内でのこのタンパク質濃度の小さな変化が細胞応答性を大きく変化させ得る。実験は内皮細胞の移動がビトロネクチン濃度および細胞の蔓延を可能にする細胞−マトリックスの接点間の距離に依存することを示している（３９、４０）。
【０１０４】
われわれの研究における抗腫瘍形成効果は、一般に他の抗脈間形成薬で観察される効果よりも大きかった。多くの腫瘍はまたα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５インテグリンを発現するので（Ｕ８７ＭＧおよびＤＡＯＹを含む）、インテグリンアンタゴニストの効果は宿主内皮に限定されないが、腫瘍細胞応答における特異的インテグリンの重要性はあまり明らかになっていない（４１）。先行の研究では神経膠細胞腫、乳癌、黒色腫およびＨＴ２９−Ｄ４結腸腺癌細胞のビトロネクチンへの付着はα_ｖインテグリンに依存することが示されている（４２ないし４５）。ビトロネクチンは腫瘍および間質細胞により生成され、悪性脳腫瘍などの腫瘍侵襲部位および新生血管形成部位に最も豊富に存在する（４６、４７）。このようにビトロネクチンは内皮細胞の生存性を維持するのに加え、α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５を発現する腫瘍細胞の付着および侵襲を増強するのにも重大である。乳癌に関するＳＣＩＤマウス／ヒトキメラモデルでは、抗α_ｖβ_３抗体ＬＭ−６０９の投与後、腫瘍侵襲が著しく低減し、これは脈管形成に依存しない腫瘍に及ぼす直接的なα_ｖβ_３遮断効果を示唆している（４８）。
【０１０５】
この疑問を調べるために、ＤＡＯＹ、Ｕ８７ＭＧおよび単離された１次ヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ）（４９）を用いて、α_ｖアンタゴニストの存在下、ビトロネクチンにおける細胞付着および遊走を試験した。抗α_ｖβ_３抗体ＬＭ６０９はビトロネクチンにおけるＵ８７ＭＧ、ＤＡＯＹおよびＨＢＥＣ遊走を阻止し、抗α_ｖβ_５抗体Ｐ１−Ｆ６と組み合わせてこれらの細胞のビトロネクチンへの付着を阻止した。ｃＲＧＤ単独で三つの細胞型全てでビトロネクチンへの付着およびビトロネクチンにおける遊走を著明に阻止した。類似の研究では、黒色細胞腫細胞侵襲はビトロネクチンにより増強され、ＲＧＤペプチドにより遮断された（５０）。最終的には、ｃＲＧＤ処置によりＨＢＥＣ細胞においてのみならず、ＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧ腫瘍細胞においても同様にアポプトシスを増加させるに至った。これらの結果はｃＲＧＤが、その抗脈管形成機能に加えて、腫瘍侵襲および増殖を直接的に阻止するように作用することを示唆している。
【０１０６】
我々のデータはさらに環状ペンタペプチドが脳腫瘍細胞のビトロネクチンまたはテネイシンのごとき異なるＥＣＭ基質への付着を阻止できることを示唆している。かかる付着阻止効果は脳腫瘍細胞および脳毛細管細胞の両方における細胞死（アポプトシス）を招いた。この効果はＥＣＭビトロネクチンおよびテネイシンに限定されている。我々は細胞死の増加が直接腫瘍細胞アポプトシスによるものであり、毛細管成長の抑制の結果ではないことをも示している。換言すれば、環状ペンタペプチドが直接腫瘍細胞死を誘導するというのは本発明の知見である。
【０１０７】
要約すれば、本研究は、α_ｖβ_３およびα_ｖβ_５に特異的なインテグリンの標的化拮抗作用は実質的にインビボ脳腫瘍形成を阻止でき、従って脳腫瘍の重要な新規治療アプローチを示し得ることを明確にしている。我々の結果はまた微環境が腫瘍の挙動に、およびかかる生物学的に導かれた治療に対する応答性の決定において重大であることをも示唆している。最終的に、我々はインテグリン拮抗作用が抗脈管形成に依存しない抗腫瘍形成効果を有することができ、これは協働して腫瘍成長を遅延させることができることを示す。
【０１０８】
前記は発明の範囲を説明するものであって、限定するものではないことを意味する。実際に、当業者は過度に実験することなく本明細書の教示に基づいてさらなる態様を容易に想定および製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】 図１ａはα_ｖアンタゴニストによるＣＡＭにおける脈管形成の阻止を示す。
【図１ｂ】 図１ｂはα_ｖアンタゴニストによるＣＡＭにおける腫瘍成長の阻止を示す。
【図２ａ】 図２ａはＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧ細胞の脳内注射後の腫瘍の大きさを示す。
【図２ｂ】 図２ｂはＤＡＯＹおよびＵ８７ＭＧ細胞の脳内注射後のマウス生存性を示す。
【図３ａ】 図３ａは不活性（Ａ）または活性（ＢないしＤ）ペプチドで毎日処置した、同所に注射した脳腫瘍細胞ＤＡＯＹの組織病理学を示す。
【図３ｂ】 図３ｂは不活性（Ａ）または活性（ＢないしＤ）ペプチドで毎日処置した、同所に注射した脳腫瘍細胞Ｕ８７ＭＧの組織病理学を示す。
【図４】 図４は活性かまたは不活性のいずれかのペプチドを投与されたマウスの同所脳腫瘍移植後の生存性を示す。
【図５ａ】 図５ａは同所に（脳）および異所（皮下組織）移植したＤＡＯＹ細胞に及ぼす不活性α_ｖアンタゴニストの影響を示す。
【図５ｂ】 図５ｂは同所に（脳）および異所（皮下組織）移植したＤＡＯＹ細胞に及ぼす活性α_ｖアンタゴニストの影響を示す
【図６ａ】 図６ａは脳腫瘍および脳毛細管内皮細胞に関するインテグリンプロファイルを示す。
【図６ｂ】 図６ｂは脳腫瘍および脳毛細管内皮細胞に関するビトロネクチンへの付着に及ぼすα_ｖアンタゴニストの効果を示す。
【図６ｃ】 図６ｃは脳腫瘍および脳毛細管内皮細胞に関するビトロネクチンによる遊走に及ぼすα_ｖアンタゴニストの効果を示す。
【図６ｄ】 図６ｄは脳腫瘍および脳毛細管内皮細胞に関するビトロネクチンによる細胞生存性に及ぼすα_ｖアンタゴニストの効果を示す。
【図７】 図７はＥＣＭタンパク質に付着する腫瘍細胞に及ぼす環状ペンタペプチドの影響を示す。
【図８】 図８は脳腫瘍細胞および脳毛細管細胞の両方における細胞死（アポプトシス）に至る付着の阻止効果を示す。
【図９】 図９は前脳にＵ８７脳腫瘍異物移植し、活性（抗α_ｖ）または対照ペプチドを投与したヌードマウスの免疫組織化学を示す。

Claims (4)

1. シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）であるα _ｖ インテグリンアンタゴニストを有効成分とする脳内腫瘍成長阻止用医薬組成物。
2. シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）であるα _ｖ インテグリンアンタゴニストを有効成分とする脳内腫瘍細胞における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）依存性細胞付着阻止用医薬組成物。
3. シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）であるα _ｖ β _３ に対するアンタゴニストを有効成分とする脳内腫瘍細胞におけるビトロネクチン依存性細胞遊走阻止用医薬組成物。
4. シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−［Ｎ−Ｍｅ］−Ｖａｌ）であるα _ｖ インテグリンアンタゴニストを有効成分とする脳内腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導用医薬組成物。

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