JP4907146B2

JP4907146B2 - 自動培養方法及び細胞培養装置

Info

Publication number: JP4907146B2
Application number: JP2005303879A
Authority: JP
Inventors: 義広小森
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2005-10-19
Filing date: 2005-10-19
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2025-10-19
Also published as: JP2007110932A

Description

本発明は、自動培養方法及び細胞培養装置に関する。

細胞を大量に効率よく培養するには、栄養補給や老廃物の除去のため培地交換処理や、細胞の増殖に合わせて細胞を播き直す継代処理等の培養操作を行う必要がある。細胞の増殖速度は、細胞腫や個体によって大きな違いがあり、予め設定した培養スケジュールに従って細胞培養を行うとしても、細胞の増殖に合わせて随時、培養スケジュールを変更しなければならない。細胞の増殖に従って培養スケジュールを変更するには、熟練した作業者の経験が必要になる。

そこで、特許文献１に、接着細胞数、接着細胞濃度、接着細胞占有面積、接着細胞占有率、及びそれらの増加率を用いて、継代又は培地交換のタイミングを決定することが提案されている。これによれば、培養中に撮影した画像を用いて細胞の増殖を把握しているが、接着細胞数等をパターンマッチング等の画像処理により求めていることから、複雑な処理が必要で、時間がかかるという問題がある。

一方、培地交換は細胞が成長の過程で老廃物を排出する等の理由からｐＨが変化することを利用して、培地交換処理はｐＨを検出して行うことが知られている。しかし、直接、培地にｐＨ計を浸しｐＨ測定を行うと、コンタミネーションの問題が発生する。このため、培地を少量サンプリングし、ｐＨ計を用いてｐＨ検出する提案があるが、サンプリング等の処理操作が増える。

特開２００１−２７５６５９号公報

本発明は、培養器内を撮影した画像に基づいて、簡単な画像処理によって細胞を効率よく培養することができる培養スケジュールの変更等の管理を支援することを課題とする。

上記の課題は、以下に述べる手段により解決することができる。本発明の自動培養方法は、細胞を培養する培養器内を撮影した画像中の細胞を細胞の長手方向に１本の線に変換する細線化処理し、細線化された細胞を１つの細胞として見かけの細胞数を算出し、前記画像の領域を複数に分割し、見かけの細胞数が最大である領域を選択し、該領域における見かけの細胞数と設定細胞数とを比較して培養スケジュールを管理することを特徴とする。

すなわち、画像中の細胞は白又は黒の画像となるから、白又は黒の画像を抽出することにより細胞を簡単に抽出できる。また、抽出した画像中の複数の細胞を周知の細線化処理によりそれぞれ１本の線に変換するという簡単な処理により、細胞数の算出を容易にすることができる。ここで、細線化された細胞の数(見かけの細胞数)は実際の細胞数と異なるが、実際の細胞数と相関関係がある。また、培養スケジュールの変更に係る設定値には、継代処理を行う設定値と、培養終了を決定する設定値がある。

また、細胞を培養する培養器内を撮影した画像中の細胞を細線化処理し、細線化された細胞の方向を求め、該細胞の方向に基づいて細胞の密度を求め、該細胞の密度が設定値を越えたときに継代処理の実行を決定することができる。すなわち、細胞は増殖する際に様々な方向に増殖するが、隣り合う細胞との距離が短くなると同一の方向に増殖するようになる。すなわち、細胞密度が高くなると、細胞の方向がそろってくる。そこで、細胞の方向の整列度合いを求めることにより、細胞密度を把握することができる。この場合において、細胞の方向の角度と、各角度における細線化された細胞の出現回数を算出し、設定角度範囲における出現回数が設定値を超えたときに継代処理の実行を決定することができる。

ところで、撮影された画像の全体にわたって見かけの細胞数を算出すると、画像の一部に細胞密度の高いコロニーが存在しても、そのコロニーを検出できない場合がある。そこで、画像領域を複数に分割し、各領域について見かけの細胞数を算出し、見かけの細胞数が最大の領域を選択し、選択した画像領域について角度や出現回数を算出するようにすることが好ましい。

また、細胞を培養する培養器内を撮影した画像中の培地のｐＨ指示薬の変化を検出することで、培地交換処理の実行を決定することができる。

本発明によれば、培養器内を撮影した画像に基づいて、簡単な画像処理によって細胞を効率よく培養することができる培養スケジュールの変更等の管理を支援することができる。

以下、本発明の一実施形態について図１乃至図１０を参照して説明する。

図１は、本実施形態の細胞培養装置１の構成を示す図である。図示のように、細胞培養装置１は、細胞を培養する培養器２と、培養器２を収容する恒温槽３とを備え構成される。恒温槽３の内部には、培養器２内を撮影するカラーカメラ４と、カラーカメラ４を駆動させるカメラ駆動装置５と、培養器２を駆動させる培養器駆動装置６と、各々の駆動装置の駆動を制御するモータコントローラ７と、操作端末８と、コンバータ９とを備えている。

恒温槽３は、図２に示すように、培養器２が設置されており、細胞培養に最適な温度及びＣＯ２濃度に保持されている。また、培養器２は、培養器駆動装置６によりレールに沿って直線状に動くように備え付けられている。培養器２の上方に細胞を撮影するための高倍率の対物レンズを備えたカラーカメラ４が設置され、培養器２の内部を上から撮影するようになっている。カラーカメラ４は、カメラのレールに対し直角に設置されたレール上をカメラ駆動装置５によって直線状に動くように備え付けられている。カラーカメラ４と培養器２を動かすことで、オペレーターは望む撮影位置に簡単にカラーカメラ４を移動できるから、以前の撮影位置と同じ位置に正確にカラーカメラ４を移動でき、撮影時刻の異なる画像を効果的に比較することができる。

操作端末８は、細胞培養装置１の全体を制御するものであり、培養器２内部を撮影の際にモータコントローラ７に各駆動装置の駆動を制御するように指令を送り、カラーカメラ４より撮影された画像信号を、コンバータ９を介し取得する構成となっている。具体的には、図３に示すように、操作端末８は、データバス２１を介し、演算処理を行うＣＰＵ２２と、ＣＰＵ２２が一時的に記憶領域として使用する主メモリ２３と、画像データや位置情報等の与えられた情報を格納する外部記憶装置２４と、モータコントローラ７と通信する通信ポート２５と、ユーザーが情報を入力するキーボード２６やマウス２７と、ユーザーが培養情報を確認するモニタ２８とを備え構成される。また、カラーカメラ４との信号の授受を行うコンバータ９はデータバス２１に接続されている。

このように構成される本実施形態の細胞培養装置１の動作について図４乃至図１０を用いて説明する。まず、細胞培養装置１により細胞の培養を開始する際、予め培養終了時の目標細胞数を設定する。この設定は、例えば、図４に示す設定画面を用い、目標細胞数に対応する細胞培養画像を過去に撮影された画像群から検索して設定することができる。この過去に撮影された細胞培養画像は、操作端末８に予め保存されている。図４に示す目標細胞数設定ダイアログ４１は、画像表示領域４２と、画像をスクロールする画像送りボタン４３や画像戻しボタン４４と、画面を決定する決定ボタン４５と、取消をするキャンセルボタン４６と、画像を登録する画像登録ボタン４７とを備えている。画像表示領域４２には、過去に撮影された細胞培養画像が映し出され、その画像をスクロールすることにより、目標細胞数に近い画像を選択することで目標細胞数を設定する。また、過去に撮影された細胞培養画像には、後述する見かけの細胞数と細胞プロファイリングが数値として保持されている。予め撮影された細胞培養画像に基づいて目標細胞数を設定しているため、目標細胞数や細胞プロファイリング（細胞密度）を、簡便かつ直感的に、指定することができる。

画像を選択するのは、画像表示領域４２の画像を画像送りボタン４３と画像戻しボタン４４を用いスクロールして目的とする細胞状態(細胞数)を表示し、決定ボタン４５で画面を決定し、取り消す場合はキャンセルボタン４６を押す。目標細胞数設定ダイアログ４１で目標細胞数を決定して培養を開始する。

培養開始後、一定時間経過すると図５に示す処理が開始する。図５は、本発明の一実施形態の自動培養方法の手順を示すフローチャートであり、操作端末８において実行される。まず、処理が開始されると、図６のフローチャートに示す細胞画像処理が行われる。操作端末８は、図６に示すように、培養器２内を撮影したカラーカメラ４からコンバータ９を介して画像データを取り込み（Ｓ６１）、次いで細胞抽出処理を行う（Ｓ６２）。

ここで、カラーカメラ４により培養器２内を撮影して得られる画像データについて説明する。本実施形態のカラーカメラ４は、細胞部分が反転して撮影される２つのフォーカスで培養器２内を撮影する。カラーカメラ４の撮影視野は、例えば、縦１５ｍｍ、横２０ｍｍに設定される。ところで、培養器２のサイズは培養する目的でさまざまな大きさのものが用いられるが、培養開始時に培養器２内に均等に細胞が播かれるため、必ずしもカラーカメラ４で培養器２内の全域を撮影する必要はない。そこで、例えば、半径約２５ｃｍの培養器２を使用した場合、図７に示すように、半径２ｃｍの円と半径４ｃｍの円の周上に、図中に黒丸で示す各々１６箇所の計測点を設定する。そして、各計測点を中心として縦１５ｍｍ、横２０ｍｍの画像を撮影することにより、培養器２全体の細胞の増殖をほぼ確認できる。なお、計測点の数及び位置は、培養器２全体の状況が確認できれば、図７の例に限られない。

このようにして撮影された画像データは、コンバータ９を経由して操作端末８に転送される。転送された画像データは主メモリ２３に取り込まれ、同時に外部記憶装置２４にも取り込まれる。

図６のステップＳ６２における細胞抽出処理は、ＣＰＵ２２により定められた閾値以上の輝度を有する画素（反転した部分）を細胞として抽出する（Ｓ６２）。このように、細胞抽出処理は高度な処理は要求されず、細胞の特徴点を抽出できればどのようなアルゴリズムでもよい。細胞部分と細胞以外の部分が認識されると、ＣＰＵ２２と主メモリ２３を用いて細胞以外の部分の画素値を０、細胞の画素値を１とする２値化処理を行う（Ｓ６３）。

次に、抽出した細胞の細胞部分の中心を通る１本の線を描く細線化処理を行う（Ｓ６４）。この細線化処理は、図８に示すように、一つ細胞は対極方向から徐々に膨らみや厚みを削られ（図８（ａ））、最終的には一本の線に変換される（図８（ｂ））。細線化処理の詳細は、文献「Ｃ言語による画像処理入門(ＩＳＢＮ４−７８５６−３１２４−４)昭晃堂発行」に記載されている。このように画像中の細胞に対して細線化処理という簡単な画像処理を施すと、細胞数の算出を容易にすることができる。

ここで、細線化処理した画像に基づいて、画像全体の見かけの細胞の数を算出すると、細胞密度に偏りがある場合、データが平均化されてしまい、特に細胞密度が高いコロニーを検出することができなくなる。そこで、図９に示すように元の画像（図９（ａ））を複数（図示例では、４）の領域に分割（図９（ｂ））する（Ｓ６５）。この領域分割数は、培養状態に応じて、適宜設定できる。各領域について、ステップＳ６４の細線化処理により算出された連続する一本の線を１個の細胞として計算して、分割された各領域の見かけの細胞数を求める細胞計数処理を実行する（Ｓ６６）。見かけの細胞数は実際の細胞数と異なるが、実際の細胞数と相関関係がある。この細胞計数処理の際には、同時に細線化された細胞の各線の始点座標と終点座標を求めて主メモリ２３に記憶しておく。

次に、見かけの細胞数が最大の領域を選択する（Ｓ６７）。そして、見かけの細胞数が最大の領域について、細胞方向プロファイルング処理を実行する（Ｓ６８）。この細胞方向プロファイリング処理は、ステップＳ６４で細線化された細胞の方向のプロファイルを求める処理である。ここで、細胞の方向は、細胞計数処理の際に主メモリ２３に記憶した細胞の始点と終点の座標を結ぶ直線の方向で求める。また、その直線の方向は、例えば、画像の水平方向又は垂直方向を基準線とし、基準線と細胞の方向とのなす角度で表す。そして、各角度における細線化された細胞の出現回数をそれぞれ算出して、主メモリ２３に保存する。つまり、細胞は増殖する際に様々な方向に増殖するが、隣り合う細胞との距離が短くなると同一の方向に増殖するから、細胞密度が高くなると、細胞の方向がそろってくる。そこで、細胞の方向の整列度合いを求めることにより、細胞密度を把握することができる。また、角度ごとに細線化された細胞の出現回数を算出すれば、一層精度の高い細胞密度を把握することができる。また、設定された角度範囲ごとの出現回数が設定値を超えたときに継代処理の実行を決定することができる。

ここで、図１１乃至図１３を用いて、細胞の方向と密度の関係ついて説明する。図１１は、細胞の密度が小さい場合の細胞の様子を示した画像である。図１２は、細胞の密度が大きい場合の細胞の様子を示した画像である。図１３は、細胞の方向と細胞の出現回数を示したグラフである。

図１１に示すように、細胞の密度が小さいと、細胞は、不規則な方向へ増殖するのに対し、図１２に示すように、細胞の密度が大きくなると、細胞は、同一の方向へ増殖する。このため、図１３に示すように、細胞の密度が小さいと、細い線で示すように、細胞は、−９０°〜９０°の広範囲に出現し、各細胞の方向での細胞の出現回数も少ない。これに対し、細胞の密度が大きいと、太い線で示すように、細胞は、０°〜９０°の範囲にのみ出現し、各細胞の方向での細胞の出現回数も多くなっている。すなわち、細胞密度が大きいと、細胞の方向の角度が一定の範囲に収束することから、細胞の方向の範囲は狭くなる。また、各細胞の方向における細胞の出現回数が多くなることから、出現回数の平均値が大きくなる。なお、図１３の角度は、横軸に対する細胞の方向の角度である。

図６の細胞画像処理が終了すると、図５の処理に戻り、図６のステップＳ６６で求めた見かけの細胞数が、目標細胞数設定ダイアログ４１で設定した目標細胞数に達しているか否かが判定される（Ｓ５０）。この判定において、見かけの細胞数が目標細胞数に達している場合は培養を終了する。一方、見かけの目標細胞数に達していない場合は、ステップＳ５１に進み、見かけの細胞数が継代処理をすべき継代閾値（設定値）に達しているか否かを判定する。この判定において、見かけの細胞数が継代閾値以上の場合は、ステップＳ５２に進んで、継代命令が出され、これに基づいて例えば自動的に継代処理が行われる。次いで、継代閾値を高い値に更新するとともに(Ｓ５５)、細胞方向プロファイルの閾値を高い値に更新して、ステップＳ５４に進む。ここで、継代閾値と細胞方向プロファイル閾値を高い値に更新する理由は、周期的に実行する図５の処理による継代処理の頻度を少なくするためである。

一方、見かけの細胞数が継代閾値に満たない場合は、ステップＳ５３に進んで、細胞方向のプロファイルが継代処理をすべきか否かを決定するプロファイル閾値（設定値）に達しているか否かを判定する。この判定において、細胞方向のプロファイルが継代閾値に達している場合は、ステップＳ５２に進んで、継代命令が出される。

一方、細胞方向のプロファイルが継代閾値に達していない場合は、ステップＳ５４に進んで、培地交換間隔が培地交換処理をすべき交換間隔閾値（設定値）に達しているか否かの判定をする。この判定で、培地交換する時期に達した場合は、培地交換命令が出され（Ｓ５７）、次回の画像取得まで待機する命令が出される（Ｓ５８）。一方、培地交換する時期に達していない場合は、図１０に示すｐＨ指示薬が滴下された培養器内培地の画像を処理するｐＨ画像処理が実行される。

図１０に示すｐＨ画像処理開始されると、外部記憶装置２４に記憶された画像データを呼び出し（Ｓ７１）、主メモリ２３に画像データを展開する。この状態では画像はＲＧＢのカラーモデルで表現されているので、これを輝度と色相のカラーモデルに変換する（Ｓ７２）。変換された輝度と色相から色差値を求める色差算出処理を実行し(Ｓ７３)、ｐＨの変化量を求めて図５の処理に戻る。

図５のステップＳ５９において、ｐＨ変化量が変化量閾値に達しているか否かを判定する。この判定で、ｐＨ変化量が変化量閾値に達している場合は培地交換命令を出し、これにより、例えば、自動により培地交換が行われる（Ｓ５７）。そして、次回の画像取得まで待機する命令が出される（Ｓ５８）。一方、ｐＨ変化量が変化量閾値に達していない場合は、次回の画像取得まで待機する命令が出される（Ｓ５８）。

上述したように、本実施形態によれば、細線化処理を細胞に施し、細胞数や細胞プロファイル（角度と出現回数）を算出し培養スケジュールの変更を支援することに特徴がある。この特徴を生かせれば、培養装置の構成や培養スケジュールの設定は、ユーザーの実施にあわせ自由に変更することができる。例えば、カラーカメラを固定し、培養器を縦横に自由に動かす構成とすることが考えられる。

本発明の一実施形態である細胞培養装置の構成を示す図である。本発明の一実施形態である細胞培養装置の操作端末８のブロック図である。本発明の一実施形態である細胞培養装置の恒温槽の内部を示す図である。目標細胞数設定画面の図である。本発明の一実施形態である細胞培養装置で培養実験を行う際のフローチャートである。細胞の画像処理を示すフローチャートである。撮影箇所を示す図である。細線化処理を示す図である。領域分割処理を示す図である。ｐＨ画像処理を示すフローチャートである。細胞の密度が小さい場合の細胞の様子を示した画像である。細胞の密度が大きい場合の細胞の様子を示した画像である。細胞の方向と細胞の出現回数を示したグラフである。

符号の説明

１：細胞培養装置
２：培養器
３：恒温槽
４：カラーカメラ
５：カメラ駆動装置
６：培養器駆動装置
７：モータコントローラ
８：操作端末
９：コンバータ
２２：ＣＰＵ
２３：主メモリ
２４：外部記憶装置
２８：モニタ

Claims

細胞を培養する培養器内を撮影した画像中の細胞を細胞の長手方向に１本の線に変換する細線化処理し、細線化された細胞を１つの細胞として見かけの細胞数を算出し、前記画像の領域を複数に分割し、前記見かけの細胞数が最大である領域を選択し、該領域における前記見かけの細胞数と設定細胞数とを比較して培養スケジュールを管理することを特徴とする自動培養方法。
さらに、前記細胞数が最大の領域における細線化された細胞の方向を求め、該細胞の方向の整列度と細胞密度との関係に基づいて前記最大の領域の細胞密度を求め、該細胞密度が設定細胞密度を越えたとき継代処理の実行を決定することを特徴とする請求項１に記載の自動培養方法。
前記設定細胞数は、継代処理を行う設定細胞数と培養終了を決定する設定細胞数とを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の自動培養方法。
細胞を培養する培養器内を撮影した画像中の細胞を細胞の長手方向に１本の線に変換する細線化処理し、細線化された細胞の方向を求め、該細胞の方向の整列度と細胞密度の関係に基づいて前記画像の細胞密度を求め、前記画像の領域を複数に分割し、前記細胞密度が最大である領域を選択し、該領域における細胞密度と設定細胞密度とを比較して培養スケジュールを管理することを特徴とする自動培養方法。
前記細胞密度が最大である領域は、細線化された細胞を１つの細胞として見かけの細胞数を算出し、前記画像の領域を複数に分割し、前記見かけの細胞数が最大である領域でもあることを特徴とする請求項４に記載の自動培養方法。
前記細線化された細胞の方向の角度と、各角度における前記細線化された細胞の出現回数を算出し、設定角度範囲における前記出現回数に基づいて前記細胞密度を求め、該細胞密度が前記設定細胞密度を越えたとき継代処理の実行を決定することを特徴とする請求項２、４、又は５に記載の自動培養方法。
細胞を培養する培養器内にｐＨ指示薬を添加し、該培養器内を撮影した画像に基づいて前記ｐＨ指示薬の変化を検出し、該ｐＨ指示薬の変化に基づいて培地交換処理の実行を決定することを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の自動培養方法。
細胞を培養する培養器と、前記培養器内を撮影する撮影手段と、制御手段を備えた細胞培養装置において、
前記制御手段は、前記撮影手段で撮影した画像中の細胞を細胞の長手方向に１本の線に変換する細線化処理し、細線化された細胞を１つの細胞として見かけの細胞数を算出し、前記画像の領域を複数に分割し、前記見かけの細胞数が最大である領域を選択し、該領域における前記見かけの細胞数と設定細胞数とを比較して培養スケジュールを管理することを特徴とする細胞培養装置。
さらに、前記制御手段は、前記最大の領域における細線化された細胞の方向を求め、該細胞の方向の整列度と細胞密度との関係に基づいて前記最大の領域における細胞密度を求め、該細胞密度が設定細胞密度を越えたとき継代処理を実行を決定することを特徴とする請求項８に記載の細胞培養装置。
細胞を培養する培養器と、前記培養器内を撮影する撮影手段と、制御手段を備えた細胞培養装置において、
前記制御手段は、前記撮影手段で撮影した画像中の細胞を細胞の長手方向に１本の線に変換する細線化処理し、細線化された細胞の方向を求め、前記細胞の方向の整列度と細胞密度の関係に基づいて前記画像の細胞密度を求め
前記画像の領域を複数に分割し、前記細胞密度が最大である領域を選択し、該領域における前記細胞密度と設定細胞密度を比較して培養スケジュールを管理することを特徴とする細胞培養装置。