JP4937751B2 - Ｄ−アミノ酸ペプチド - Google Patents

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Description

発明の背景
発明の分野
本発明は、例えば放射免疫療法（ＲＡＩＴ）などの治療用途、および例えば放射免疫診断（ＲＡＩＤ）および磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）などの診断用途のための免疫学的試薬に関する。本願は、２００３年６月１３日出願の仮特許出願第６０／４７８，４０３号の優先権を主張するものであり、その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とする。また、米国出願第６０／０９０，１４２号および米国出願第６０／１０４，１５６号の全開示内容も引用することにより本明細書の一部とする。
関連技術
癌の治療および診断のアプローチには、抗体または抗体フラグメントを罹患組織に向けることが含まれ、この抗体または抗体フラグメントは罹患部位に診断薬または治療薬をターゲッティングすることができる。検討されてきたこの方法の１つのアプローチとして、標的罹患組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、標的低分子量ハプテンに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有するｂｓＡｂの使用が含まれる。この方法では、ｂｓＡｂを投与して標的に局在化させ、正常な組織からクリアリングする。しばらくしてから、ｂｓＡｂの第二の特異性によって認識され、元の標的にも局在する、放射性標識された低分子量のハプテンを与える。
ｂｓＡｂと組み合わせて用いる低分子量ハプテンは、多数の特定の画像化および治療用途があるものの、可能な各適用のための各ｂｓＡｂの調製は実用的ではない。さらに、このｂｓＡｂ／低分子量ハプテンの系を適用するには、他のいくつかの問題を克服しなければならない。第一に、低分子量のハプテンに結合するｂｓＡｂのアームは、ｂｓＡｂと結合した場合、低分子量のハプテンが生体系から迅速にクリアリングされるように設計されているので、高い親和性で結合されなければならない。第二に、非ｂｓＡｂ結合低分子ハプテンは、非標的組織の取り込みおよび保持を回避するために、生体系を実際にクリアリングする必要がある。第三に、検出薬および／または治療薬は、用いるｂｓＡｂプロトコールでの適用中、低分子ハプテンとの会合を維持していなければならない。
このアプローチで着目されるのは、適切な二重特異性のＡｂを用いてキレート剤および金属キレート複合体を癌へ向けるｂｓＡｂである。用いるキレート剤および金属キレート複合体は多くの場合が放射性であり、放射免疫映像法にはコバルト−５７(Goodwin et al.,米国特許第４，８６３，７１３号)、インジウム−１１１(Barbet et al.,米国特許第５，２５６，３９５号および米国特許第５，２７４，０７６号， Goodwin et al, J. Nucl. Med., 33:1366-1372 (1992)、およびKranenborg et al., Cancer Res (suppl.), 55:5864s-5867s (1995)およびCancer (suppl. ) 80:2390-2397 (1997))およびガリウム−６８(Boden et al., Bioconjugate Chem., 6:373-379, (1995)およびSchuhmacher et al., Cancer Res., 55:115-123 (1995))が用いられる。このＡｂはキレート剤および金属キレート複合体に対して惹起されたものなので、それらが本来惹起された複合体に対して顕著な特異性を有する。実際、Boden et al.のｂｓＡｂは、キレート剤および金属キレート複合体の鏡像異性体混合物のうちの１つの鏡像異性体に対して特異性を有する。この顕著な特異性は、放射免疫療法（ＲＡＩＴ）に有用なイットリウム−９０およびビスマス−２１３、ならびにＭＲＩに有用なガドリニウムなどの他の核種が別の用途で利用可能な試薬と容易に交換できないという１つの点で不利であることが分かっている。結果として非金属であるヨウ素−１３１が、第二のターゲッティング工程でＩ−１３１標識インジウム−金属キレート複合体の使用によるＲＡＩＴ用に採用されてきた。この方法のもう１つの不利な点は、診断または治療用に望ましい薬剤ごとに抗体を惹起する必要があることである。
プレターゲッティング法は癌の画像化および治療に関してかなりの注目を浴びてきた。エフェクター分子（例えば、小担体に結合された放射性核種または薬物）が直接ターゲティング剤に結合される直接ターゲッティング系とは違い、プレターゲッティング系では、エフェクター分子はターゲッティング剤の後しばらくしてから与えられる。これにより、ターゲッティング剤を腫瘍病巣に局在させ、より重要なことには身体からクリアリングする時間ができる。ほとんどのターゲッティング剤は抗体タンパク質であったことから、それらは小さなエフェクター分子（通常、分の単位）よりもはるかにゆっくり身体からクリアリングされる傾向がある（通常、日の単位）。治療用放射性核種を含む直接ターゲッティング系では、ターゲッティング剤が腫瘍においてそのピークレベルにゆっくり達し、身体からクリアリングされる間中、身体および特に極めて傷つきやすい赤色骨髄が放射線に曝される。プレターゲッティング系では、放射性核種は通常、身体から極めて迅速にクリアリングされるキレートまたはペプチドなどの小「エフェクター」分子に結合されているので、正常な組織の暴露は最小となる。小分子は腫瘍の脈管構造を効率的に横断して一次ターゲッティング剤に結合するので、放射性核種の最大腫瘍取り込みもまた極めて迅速である。その大きさが小さいこともまた、腫瘍中でのより均一な分布を促す。
プレターゲッティングではいくつかの異なる戦略が用いられてきたが、アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン認識系、または腫瘍抗原とエフェクター分子を同時に認識する二重特異性抗体を伴う場合が最も多い。アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン系は極めて用途が広く、いくつかの構成で用いられている。抗体をストレプトアビジンまたはビオチンに結合させ、これを一次ターゲッティング剤として用いる。その後にそれぞれビオチンまたはアビジン／ストレプトアビジンと結合させたエフェクター分子がくることもある。別の構成として、まず、ビオチン結合抗体を、その後、ストレプトアビジン／アビジンとの架橋をターゲッティングし、次に、ビオチン結合エフェクターを与える三工程のアプローチに頼るものがある。これらの系は、エフェクターおよびターゲッティング剤が用いる構成に応じてビオチンまたはストレプトアビジン／アビジンと結合可能である限り、種々のエフェクター物質とともに用いるために容易に変換することができる。多くのターゲッティング状況で用いるためのその用途の広さとアビジン／ストレプトアビジンとビオチンの間の高い結合親和性により、この種のプレターゲッティングは、提案されている他の系に優る著しい利点を持つ。しかし、アビジンおよびストレプトアビジンは外来タンパク質であることから免疫原性があり、臨床適用において投与できる回数は制限される。この点で、ｂｓＡｂには比較的免疫原性のないヒト化タンパク質として操作することができるという利点がある。ｂｓＡｂの結合親和性（典型的には １０−９〜１０−１０Ｍ）はストレプトアビジン／アビジン−ビオチンの極めて高い親和性（〜１０−１５Ｍ）とは比べものにならず、両プレターゲッティング系とも一次ターゲッティング剤の結合親和性に依存し、従って、ストレプトアビジン／アビジン−ビオチン系のより高い親和性はｂｓＡｂプレターゲッティング系に優る実質的な利点を提供し得ない。しかし、ほとんどのｂｓＡｂは一次標的と結合するために利用できるアームを１つしか持っておらず、一方、ストレプトアビジン／アビジン−ビオチンプレターゲッティング系は典型的には標的と結合するためのアームを２つ持つ完全なＩｇＧを用いており、これが標的結合を強化する。二価ペプチドを用いることにより、親和性の増強がなされ、これにより、一価のペプチドに比べて標的部位に対するペプチドの結合が著しく向上する。このように、両系とも、妥当な保持力を持つ優れたターゲッティング比をもたらす可能性がある。
ｂｓＡｂを用いたプレターゲッティングはまた、エフェクター分子を認識する抗体の１つのアームを必要とする。これまでに報告されているほとんどの放射性核種ターゲッティング系は、インジウム付加ＤＴＰＡに対する抗体または他のキレートに対する抗体などのキレート金属複合体に対する抗体に頼ってきた。この抗体は一般にこの特定のキレート金属複合体に対して高い選択性があることから、特定のエフェクター分子を用いて新たなｂｓＡｂを構築する必要がある。もし抗体がエフェクターに特異的でなく、その代わりに別の物質と反応性があったとすればこの必要はなくなる可能性がある。このような場合には、それらがまた抗体認識物質を含んでいる限り、種々のエフェクターが作製される得る。本発明者らは、種々のエフェクター物質が調製できる認識系としてヒスタミン誘導体であるヒスタミン−スクシニル−グリシル（ＨＳＧ）に対する抗体を用いたJanevik-Ivanovska et al.が最初に記載しているプレターゲッティング系の開発を続けてきた。放射性ヨウ素化し、かつレニウムを付加した二価のＨＳＧ含有ペプチドを用いて優れたプレターゲッティング結果が報告されている。この研究では、発明者らは、この系を、放射性標識９０Ｙ、１１１Ｉｎ、および１７７Ｌｕに好適なペプチド、ならびに別の９９ｍＴｃ結合ペプチドを含むように拡張した。
このように、罹患組織に向けることができ、かつ、次に投与されるターゲッティング可能な診断または治療複合体に特異的に結合し得る免疫剤、および二重特異性または多重特異性抗体の変更なく種々の診断薬および治療薬に適合する柔軟な系の必要が依然としてある。
本発明者らは１以上の診断薬または治療薬を有し得るターゲッティング可能な構築物に対して多重特異性Ａｂを惹起することが有利であることを見出した。この技術を用いることにより、キレート剤、金属キレート複合体、治療薬または診断薬の性質を、新規な適用ごとに新たな多重特異性Ａｂを惹起することなく種々の適用に適合するよう変えることができる。さらに、このアプローチを用いることにより、２以上の異なるキレート剤、金属キレート複合体、診断薬または治療薬を本発明の多重特異性Ａｂとともに用いることができる。
発明の概要
本発明の一つの実施態様によれば、式：
Ｘ−Ｒ１−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ａ）−Ｒ２（Ｚ）−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ｂ）−Ｒ３（Ｙ）−ＮＲ４Ｒ５；または
Ｒ１（Ｘ）−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ａ）−Ｒ２（Ｚ）−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ｂ）−Ｒ３（Ｙ）−ＮＲ４Ｒ５
［式中、
Ｘは硬酸陽イオンキレート剤、軟酸陽イオンキレート剤、酵素、治療薬、診断薬、またはＡｃ−であり；
Ｒ１は共有結合または同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり；
Ｒ２は共有結合または同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり；
Ｒ３は共有結合または同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり；
Ｙは硬酸陽イオンキレート剤、軟酸陽イオンキレート剤、酵素、治療薬、もしくは診断薬であるか、または存在せず；
Ｚは硬酸陽イオンキレート剤、軟酸陽イオンキレート剤、酵素、治療薬、もしくは診断薬であるか、または存在せず；
ＡおよびＢはハプテンまたは硬酸陽イオンキレート剤であり、これらは同じであっても異なっていてもよく；かつ、
Ｒ４およびＲ５は硬酸陽イオンキレート剤、軟酸陽イオンキレート剤、酵素、治療薬、診断薬およびＨからなる群から独立に選択される］
を含んでなる化合物が提供される。本式では、Ｄｐｒは２，３−ジアミノプロピオン酸である。これらの実施態様のいくつかのものでは、Ｒ１またはＲ３が共有結合であるとき、他方のＲ１またはＲ３は同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり得る。これらの実施態様およびその他の実施態様では、Ｒ２は同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり得る。これらの実施態様のさらに別の場合では、この化合物は式Ｘ−Ｒ１−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｒ２−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂ）−Ｒ３（Ｙ）−ＮＲ４Ｒ５を含むことができる。これらの実施態様のいくつかのものでは、Ｒ２は単一のＤ−アミノ酸である。他の実施態様では、Ｒ２は同じであっても異なっていてもよい２つのＤ−アミノ酸である。さらなる実施態様では、Ｒ３はＤ−Ｌｙｓであり、Ｙは硬酸陽イオンキレート剤または軟酸陽イオンキレート剤である。これらの実施態様のいくつかのものでは、Ｒ２はＤ−Ｌｙｓではない。なおさらなる実施態様では、ＡおよびＢはヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）、ＤＴＰＡおよびフルオレセインイソチオシアネートからなる群から独立に選択される。さらに他の実施態様では、Ｒ１は同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり、Ｒ２は同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり、Ｒ３は共有結合であり、Ｙは存在せず、かつ、ＡおよびＢはハプテンまたは硬酸陽イオンキレート剤であり、これらは同じであっても異なっていてもよい。さらなる実施態様では、ＡおよびＢはハプテンであり、これらは同じであっても異なっていてもよい。これらの実施態様およびその他の実施態様では、Ｒ１およびＲ２は単一のＤ−アミノ酸であり、これらは同じであっても異なっていてもよい。Ｒ１が１を超えるアミノ酸であるとき、そのアミノ酸の１つ、任意の個数、または総てが（Ｘ）基と結合していてもよい。同様に、Ｒ２が１を超えるアミノ酸であるとき、そのアミノ酸の１つ、任意の個数、または総てが（Ｚ）基と結合していてもよい。いくつかの実施態様では、Ｚは存在しない。いくつかの実施態様では、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ４またはＲ５の１つまたは２つだけが酵素、治療薬または診断薬である。括弧はアミノ酸側鎖の置換基を示す。これらの分子がペプチドの主鎖にある場合には、それらは括弧で囲まれない。
さらなる実施態様では、Ｒ１はＤ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、およびＤ−Ｐｈｅからなる群から選択される。さらなる実施態様では、Ｒ１はＤ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ａｒｇ、およびＤ−Ｌｙｓからなる群から選択される。これら実施態様およびその他の実施態様では、Ｒ２はＤ−Ａｓｐ、Ｄ−ＧｌｕおよびＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される。本明細書に記載の実施態様のいくつかのものでは、Ｒ４およびＲ５はともにＨである。他の実施態様では、Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの１つが硬酸陽イオンキレート剤である。これら実施態様およびその他の実施態様では、残されたＸ、Ｒ４およびＲ５のうちの１つが軟酸陽イオンキレート剤である。いくつかの実施態様では、Ｘは硬酸陽イオンキレート剤である。さらなる実施態様では、Ｒ４およびＲ５の一方が硬酸陽イオンキレート剤である。いくつかの実施態様では、硬酸陽イオンキレート剤はカルボン酸基またはアミン基を含んでなる。なおさらなる実施態様では、硬酸陽イオンキレート剤はＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、およびＴＥＴＡからなる群から選択される。さらに他の実施態様では、Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの１つが軟酸陽イオンキレート剤であり、これはチオール基を含んでいてもよい。この軟酸陽イオンキレート剤はＴｓｃｇ−ＣｙｓおよびＴｓｃａ−Ｃｙｓからなる群から選択することができる。本化合物のいくつかのものでは、Ｒ４およびＲ５の一方が軟酸陽イオンキレート剤であり、残りのＲ４またはＲ５がＨである。
ある実施態様では、ＸはＡｃ−であり、ＡおよびＢは硬酸陽イオンキレート剤であり、これらは同じであっても異なっていてもよく、Ｒ３は共有結合であり、かつ、Ｙは存在しない。いくつかの実施態様では、ＸはＡｃ−であり、ＡおよびＢはハプテンであり、これらは同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１は共有結合であり、かつ、Ｙは軟酸陽イオンキレート剤である。本化合物の具体例としては、
Figure 0004937751
 が挙げられる。
本化合物のいくつかの実施態様では、（ｉ）Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの多くとも１つだけが硬酸陽イオンキレート剤であり、かつ、（ii）Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの多くとも１つが軟酸陽イオンキレート剤である。本化合物のさらなる具体例としては、
Figure 0004937751
Figure 0004937751
が挙げられる。
これらの実施態様およびその他の実施態様では、これらの化合物は少なくとも１つの放射性核種をさらに含んでいてもよい。好適な放射性核種の例としては、２２５Ａｃ、１１１Ａｇ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、１１Ｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６６Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１９４Ｉｒ、１７７Ｌｕ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、９９Ｍｏ、１３Ｎ、１５Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、２２３Ｒａ、８２ｍＲｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、１５３Ｓｍ、７５Ｓｅ、８３Ｓｒ、８９Ｓｒ、１６１Ｔｂ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、８６Ｙ、９０Ｙ、９０Ｙ、および８９Ｚｒが挙げられる。
本化合物のいくつかのものでは、硬酸陽イオンキレート剤は、IIa族およびIIIa族の金属陽イオンからなる群から選択される陽イオンとキレート化されている。これらの実施態様およびその他の実施態様では、軟酸陽イオンキレート剤は、遷移金属、Ｂｉ、ランタニド類およびアクチニド類からなる群から選択される陽イオンとキレート化されている。好適な陽イオンとしては、Ｔｃ、Ｒｅ、およびＢｉが挙げられる。
さらにその他の実施態様では、本化合物のＲ４またはＲ５は治療薬、診断薬または酵素である。これらの実施態様では、治療薬、診断薬または酵素はリンカー部分により化合物と共有結合させることができる。いくつかの実施態様では、このリンカー部分は少なくとも１つのアミノ酸を含んでいてもよい。本発明での使用に好適な治療薬としては、薬物、プロドラッグまたは毒素が挙げられる。プロドラッグとしては、エピルビシングルクロニド、ＣＰＴ−１１、エトポシドグルクロニド、ダウノマイシングルクロニドおよびドキソルビシングルクロニドからなる群から選択することができる。毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群から選択することができる。治療薬は、ドキソルビシン、ＳＮ−３８、カンプトテシン、エトポシド、メトトレキサート、６−メルカプトプリンまたはリン酸エトポシドを含んでいてもよい。診断薬としては、光線力学療法用の１以上の薬剤、例えば、ベンゾポルフィリン一酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）、錫エチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、スルホン化アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）およびルテチウムテキサフィリン（Ｌｕｔｅｘ）などの光増感剤を含んでいてもよい。他の好適な診断薬としては、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）で用いるための１以上の画像増強剤、例えば、Ｍｎ、Ｆｅ、ＬａまたはＧｄを含んでいてもよい。診断薬としてはまた、Ｘ線またはコンピューター断層撮影法用の１以上の放射線不透過剤または造影剤、例えば、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドンまたは塩化タリウムを含んでいてもよい。診断薬はまた、１以上の超音波造影剤、例えば、リポソームまたはデキストランを含んでいてもよい。いくつかの実施態様では、リポソームはガス充填されている。いくつかの実施態様では、薬物の中間体を有毒型に変換することによって標的部位における前記薬物の毒性を高めることができる酵素を化合物に含めることができる。
本化合物のいくつかのものでは、そのアミノ酸主鎖は２〜約５０、７５、８５または１００連続アミノ酸の長さを有し得る。例えば、Ｒ１またはＲ３は約１、２、５、１０または１５アミノ酸〜約２０、２５、３０または３５アミノ酸長であり得る。ある化合物では、このアミノ酸鎖は３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸長である。ある実施態様では、Ｒ２は１、２、または３アミノ酸長である。いくつかの実施態様では、本発明はまた、本化合物のいずれかを含んでなるターゲッティング可能な構築物も提供する。本化合物のいくつかのものでは、そのアミノ酸主鎖は環状であるが、他のものでは直鎖である。
本発明の別の実施態様では、疾病または疾病に至る可能性のある症状を診断、治療、または診断および治療する方法であって、
（Ａ）疾病または症状を有する、または有する疑いのある被験体に、本化合物のいずれかを含んでなるターゲッティング可能な構築物であって、少なくとも１つの診断用もしくは治療用陽イオン、および／またはキレート化されている、もしくは化学的に結合されている１以上の治療薬、診断薬、もしくは酵素を含んでなるターゲッティング可能な構築物を投与する工程；および
（Ｂ）その被験体に、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、前記ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する多重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程
を含んでなる方法が提供される。これらの方法は、
（Ｃ）被験体に、非局在抗体または抗体フラグメントの被験体からのクリアランスを促進するクリアリング組成物を投与する工程
をさらに含んでもよい。本方法では、ターゲッティング可能な構築物と多重特異性抗体または抗体フラグメントを実質的に同時に投与することができる。
本法で用いられる治療用陽イオンの好適な例は、２０〜１０，０００ｋｅＶの粒子および／または陽電子を放射するものであってよく、例えば、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８ＡＵ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂが挙げられる。他の実施態様では、診断用陽イオンは２５〜１０，０００ｋｅＶの粒子および／または陽電子を放射し、例えば、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂおよび８３Ｓｒが挙げられる。
本方法のいくつかのものでは、診断用陽イオンまたは診断薬は、ポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）またはＳＰＥＣＴ映像法に用いられるものとされる。他の実施態様では、この診断用陽イオンまたは診断薬は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）で用いられる１以上の画像増強剤、例えば、Ｍｎ、Ｆｅ、ＬａおよびＧｄを含んでなる。他の方法では、診断薬はＸ線またはコンピューター断層撮影法用の１以上の放射線不透過剤または造影剤を含んでなり、例えば、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドンまたは塩化タリウムを含んでなる。なおさらなる方法では、診断薬は１以上の超音波造影剤、例えば、リポソームまたはデキストランを含んでなる。いくつかの方法では、このリポソームはガス充填されている。
さらなる方法では、これら１以上の診断薬は蛍光化合物、化学発光化合物、および生物発光化合物からなる群から選択される。好適な蛍光化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレサミンが挙げられる。好適な化学発光化合物としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。好適な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
本方法のいくつかの実施態様では、標的組織は腫瘍である。いくつかの実施態様では、この腫瘍は、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＡＭ−４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、Ａ３、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、Ｓ１００、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、テネイシン、葉酸受容体、ＶＥＧＦ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＭＡＧＥ、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子受容体、炭酸脱水酵素ＩＸ、およびそれらの組合せからなる群から選択される抗原を産生する、または該抗原に関連するものとされる。
他の方法では、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つの前記アームは、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のフラグメントである。なおさらなる方法では、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの前記他のアームは、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のフラグメントである。さらなる方法では、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つの前記アームは、ヒト、キメラもしくはヒト化抗体、またはヒト、キメラもしくはヒト化抗体のフラグメントである。さらなる方法では、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの前記他のアームは、ヒト、キメラもしくはヒト化抗体、またはヒト、キメラもしくはヒト化抗体のフラグメントである。本方法のいくつかのものでは、多重特異性抗体または抗体フラグメントは、治療用核種、例えば、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８ＡＵ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂからなる群から選択されるものをさらに含んでなる。
ある方法では、この多重特異性抗体はＭＡｂ Ｍｕ−９のＦｖおよびＭＡｂ ６７９のＦｖを含んでなる。これらの方法のいくつかのものでは、Ｍｕ−９および／または６７９はキメラ化またはヒト化されている。これらの方法の他のものでは、Ｍｕ−９および／または６７９はヒトＭｕ９およびヒト６７９である。さらなる方法では、この多重特異性抗体はＭｕ−９の１以上のＣＤＲを含んでなる。本方法のいくつかのものでは、この多重特異性抗体は６７９の１以上のＣＤＲを含んでなる。いくつかの方法では、この多重特異性抗体は融合タンパク質である。なおさらなる方法では、この多重特異性抗体はＭＡｂ ＭＮ−１４のＦｖおよびＭＡｂ ６７９のＦｖを含んでなる。これらの方法のいくつかのものでは、ＭＮ−１４および／または６７９はキメラ化またはヒト化されている。他の方法では、この多重特異性抗体はＭＮ−１４の１以上のＣＤＲを含んでなる。さらなる方法では、この多重特異性抗体は６７９の１以上のＣＤＲを含んでなる。なおさらなる方法では、この多重特異性抗体は融合タンパク質である。本方法のいくつかのものでは、この融合タンパク質は三価であり、ＣＳＡｐと反応性のある抗体のＦｖが組み込まれている。いくつかの方法では、この多重特異性抗体にはクラスIII抗ＣＥＡ抗体および６７９のＦｖが組み込まれている。
本明細書で開示されるさらなる方法では、ターゲッティング可能な構築物は１０Ｂ原子を含んでなるものであり、その方法は
（Ｃ）標的組織に局在した１０Ｂ原子を照射し、それにより、標的組織のホウ素中性子捕捉療法を行う工程
をさらに含む。
さらなる方法では、ターゲッティング可能な構築物は酵素を含んでなるものであり、その方法は
（Ｃ）該酵素によって有毒型に変換され、これにより標的組織での毒性を高め得る薬物を被験体に投与する工程
をさらに含む。
本方法のいくつかのものでは、この疾病または症状は、癌、感染性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患、循環器病、代謝疾患、および神経疾患からなる群から選択される。癌の例としては、白血病、リンパ腫、肉腫、黒色腫、癌腫、神経膠腫、および皮膚癌が挙げられる。癌の具体例としては、Ｂ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、または多発性骨髄腫が挙げられる。本方法を施せる癌としては、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、精巣癌、腎臓癌、副腎癌または肝臓癌が挙げられる。
本方法のいくつかのものでは、疾病または症状は病原体によって引き起こされる感染性疾患である。病原体の例としては、真菌、ウイルス、寄生虫、細菌、原生動物、またはマイコプラズマが挙げられる。いくつかの方法では、この病原体は、小胞子菌(Microsporum)、白癬菌(Trichophyton)、表皮菌(Epidermophyton)、スポロトリクス・シェンキー(Sporothrix schenckii)、シルプトコッカス・ネオフォルマンス(Cyrptococcus neoformans)、コクシジオイデス・イミチス(Coccisioides immitis)、ヒストプラズム・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、ブラストミセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)、およびカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)からなる群から選択される真菌である。他の方法では、この病原体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器多核体（ＲＳ）ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水疱−帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、乳頭腫ウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルスおよびブルータングウイルスからなる群から選択されるウイルスである。さらなる方法では、この病原体は、炭疽菌(Anthrax bacillus)、ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)、レジュネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophilia)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、大腸菌(Escherichia coli)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis
)、肺炎双球菌(Pneumococcus)、Ｂ型インフルエンザ菌(Hemophilis influenzae B)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、ライム病スピロヘータ、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、らい菌(Mycobacterium leprae)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)および破傷風菌(Clostridium tetani)からなる群から選択される細菌である。
なおさらなる方法では、病原体は、蠕虫およびマラリア原虫からなる群から選択される寄生虫である。なおその他の方法では、病原体は、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、トキソプラズマ(Toxoplasma gondii)、ランゲリ・トリパノソーマ(Trypanosoma rangeli)、クルーズ・トリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ローデシア・トリパノソーマ(Trypanosoma rhodesiensei)、ブルセイ・トリパノソーマ(Trypanosoma brucei)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、日本住血吸虫(Schistosoma japanicum)、ウシバベシア(Babesia bovis)、エルメリア・テネラ(Elmeria tenella)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、熱帯リーシュマニア(Leishmania tropica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、回旋糸状虫(Onchocerca volvulus)、タイレリア・パルバ(Theileria parva)、胞状条虫(Taenia hydatigena)、テニア・オビス(Taenia ovis)、カギナシサナダ(Taenia saginata)、単胞条虫(Echinococcus granulosus)およびメソセストイデス・コルチ(Mesocestoides corti)からなる群から選択される原生動物である。なおさらなる方法では、病原体は、マイコプラズマ・アルスリティディス(Mycoplasma arthritidis)、マイコプラズマ・ヒオリニス(Mycoplasma hyorhinis)、マイコプラズマ・オーラル(Mycoplasma orale)、マイコプラズマ・アルギニニ(Mycoplasma arginini)、アコレプラスマ・ライドラウィー(Acholeplasma laidlawii)、マイコプラズマ・サリバルム(Mycoplasma salivarum)、および肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)からなる群から選択されるマイコプラズマである。
本方法のいくつかのものでは、この疾病または症状は、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、狼瘡腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェンライン紫斑病、溶連菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、硬皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡(parnphigus vulgaris)、ウェゲナー肉芽腫、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、および繊維性肺胞炎などの炎症性疾患または自己免疫疾患である。その他の方法では、疾病または症状は心筋梗塞、虚血性心疾患、アテローム斑、血餅、および塞栓などの循環器病である。さらなる方法では、疾病または症状はアミロイド症などの代謝疾患である。またさらなる方法では、疾病または症状はアルツハイマー病などの神経疾患である。
本発明はまた、被験体において標的細胞、組織または病原体を検出、同定または処置するための方法であって、
（ａ）被験体に本発明の化合物のいずれかを含んでなるターゲッティング可能な構築物を投与する工程；および
（ｂ）その被験体に、標的細胞、組織または病原体に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含んでなる多重特異性抗体または抗体フラグメントを投与する工程
を含んでなる方法も提供する。
これらの方法のいくつかのものでは、標的は標的細胞、組織または病原体により産生される、または標的細胞、組織または病原体と関連する分子を含んでなる。ある方法では、標的組織は罹患組織である。罹患組織は術中同定、内視鏡同定、または血管内同定することができる。いくつかの方法では、標的組織は、卵巣、胸腺、副甲状腺、子宮内膜、骨髄、または脾臓などの正常組織である。さらなる方法では、病原体は真菌、ウイルス、寄生虫、細菌、原生動物、またはマイコプラズマである。真菌の例としては、小胞子菌、白癬菌、表皮菌、スポロトリクス・シェンキー、シルプトコッカス・ネオフォルマンス、コクシジオイデス・イミチス、ヒストプラズム・カプスラツム、ブラストミセス・デルマティティディス、およびカンジダ・アルビカンスが挙げられる。ウイルスの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器多核体（ＲＳ）ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水疱−帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルスおよびブルータングウイルスが挙げられる。細菌の例としては、炭疽菌、ストレプトコッカス・アガラクチエ、レジュネラ・ニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎双球菌、Ｂ型インフルエンザ菌、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、結核菌および破傷風毒素が挙げられる。寄生虫としては、蠕虫またはマラリア原虫であり得る。原生動物の例としては、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ、ランゲリ・トリパノソーマ、クルーズ・トリパノソーマ、ローデシア・トリパノソーマ、ブルセイ・トリパノソーマ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、ウシバベシア、エルメリア・テネラ、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、回旋糸状虫、タイレリア・パルバ、胞状条虫、テニア・オビス、カギナシサナダ、単胞条虫およびメソセストイデス・コルチが挙げられる。マイコプラズマの例としては、マイコプラズマ・アルスリティディス、マイコプラズマ・ヒオリニス、マイコプラズマ・オーラル、マイコプラズマ・アルギニニ、アコレプラスマ・ライドラウィー、マイコプラズマ・サリバルム、および肺炎マイコプラズマが挙げられる。
本方法のいくつかのものでは、ターゲッティング可能な構築物は、少なくとも１腫の放射性核種、治療薬、診断薬または酵素をさらに含んでなる。放射性核種の例としては、２２５Ａｃ、１１１Ａｇ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、１１Ｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６６Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１９４Ｉｒ、１７７Ｌｕ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、９９Ｍｏ、１３Ｎ、１５Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、２２３Ｒａ、８２ｍＲｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、１５３Ｓｍ、７５Ｓｅ、８３ｓｒ、８９Ｓｒ、１６１Ｔｂ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、８６Ｙ、９０Ｙ、９０Ｙ、および８９Ｚｒであり得る。
いくつかの方法では、診断薬はイメージング剤を含んでなる。開示されている方法のいくつかのものでは、その方法は、
（ｃ）被験体に、非局在抗体または抗体フラグメントの被験体からのクリアランスを促進するクリアリング組成物を投与する工程
をさらに含む。本方法は、ヒト、霊長類、ウマ類、イヌ類およびネコ類をはじめとする哺乳類を処置するために用いることができる。本方法のいくつかのものでは、治療薬は１以上の薬物、毒素、サイトカイン、ホルモン、または増殖因子を含んでなる。いくつかの方法では、診断薬は造影剤を含んでなる。さらなる方法では、イメージング剤はＰＥＴまたはＳＰＥＣＴに用いられる薬剤である。本方法のいくつかのものでは、多重特異性抗体または抗体フラグメントは二重特異性である。
本発明はまた、被験体において罹患組織を処置または同定するためのキットであって、
（ａ）１以上の本化合物を含んでなるターゲッティング可能な構築物；および
（ｂ）標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する多重特異性抗体または抗体フラグメント
を含んでなるキットも提供する。本キットは、
（ｃ）非局在抗体および抗体フラグメントのクリアランスを促進するためのクリアリング組成物
をさらに含み得る。これらのキットのいくつかのものでは、診断薬は１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂおよび８３Ｓｒからなる群から選択される。その他のキットでは、治療薬は１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂからなる群から選択される。
上記のキットのいくつかのものでは、ターゲッティング可能な構築物が酵素を含んでなる場合、キットは、その酵素によって有毒型に変換され、それにより毒性を高め得る薬物をさらに含んでなる。
本発明はまた、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する多重特異性または二重特異性の抗体または抗体フラグメントも提供することができる。
本方法では、ターゲッティング可能な構築物が酵素を含んでなる場合には、これらの方法は、患者に、
１）該酵素が標的部位においてプロドラッグを薬物に変換することができる場合には、プロドラッグ；
２）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、該患者中で解毒されて毒性の低い中間体を形成することができる薬物、
３）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、天然の過程によって該患者中で活性化され、毒性の低い中間体に変換されることによって解毒を受けるプロドラッグ、または、
４）該酵素が標的部位において該プロドラッグを薬物に変換することができる場合には、該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの他のアームによって認識され得る少なくとも１つのエピトープを含むか、またはこれを担持する担体部分と、プロドラッグとを含んでなる、第二のターゲッティング可能な構築物
を投与する工程をさらに含むことができる。
別の実施態様では、キットは、第一のターゲッティング可能な構築物が酵素を含んでなる場合には、
１）該酵素が標的部位においてプロドラッグを薬物に変換することができる場合には、プロドラッグ；
２）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、該患者中で解毒されて毒性の低い中間体を形成することができる薬物、
３）該酵素が解毒型中間体を有毒型に再変換し、その結果、標的部位において該薬物の毒性を高め得る場合には、天然の過程によって該患者中で活性化され、毒性の低い中間体に変換されることによって解毒を受けるプロドラッグ、または、
４）該酵素が標的部位において該プロドラッグを薬物に変換することができる場合には、該二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの他のアームによって認識され得る少なくとも１つのエピトープを含むか、またはこれを担持する担体部分と、プロドラッグとを含んでなる、第二のターゲッティング可能な構築物
をさらに含み得る。
本発明の別の実施態様によれば、組換え技術による抗体または抗体フラグメントの調製法が提供される。本発明のこの態様によれば、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントの調製方法が提供され、その方法は、
（Ａ）宿主細胞に上記の組換えＤＮＡ構築物を導入する工程；
（Ｂ）細胞を増殖させ、抗体または抗体フラグメントを単離する工程
を含む。
本発明の別の実施態様によれば、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性融合タンパク質の調製方法が提供され、その方法は、
（１）（Ａ）二重特異性融合タンパク質のフラグメントを宿主中で産生し得る発現カセットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物であって、５’から３’の転写方向で、宿主細胞中で機能的な転写開始調節領域、宿主細胞中で機能的な翻訳開始調節領域、軽鎖抗体フラグメントに連結したｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列、ならびに宿主細胞中で機能的な転写および翻訳終結調節領域を含み、二重特異性融合タンパク質のフラグメントがこれらの調節領域の制御下にある組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に導入すること；
（Ｂ）（Ａ）における軽鎖抗体フラグメントに相補的で、軽鎖抗体フラグメントに会合する場合、結合部位が標的組織に特異的なＦａｂフラグメントを形成するＦｄフラグメントを宿主細胞中で産生し得る発現カセットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物であって、５’から３’の転写方向で、宿主細胞中で機能的な転写開始調節領域、宿主細胞中で機能的な翻訳開始調節領域、ＦｄフラグメントをコードするＤＮＡ配列、ならびに宿主細胞中で機能的な転写および翻訳終結調節領域を含んでなり、Ｆｄフラグメントがこれらの調節領域の制御下にある組換えＤＮＡ構築物を宿主細胞に同時導入すること；
（Ｃ）細胞を増殖させ、二重特異性融合タンパク質を単離すること；あるいは
（２）（Ａ）二重特異性融合タンパク質のフラグメントを第一の宿主中で産生し得る発現カセットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物であって、５’から３’の転写方向で、第一の宿主細胞中で機能的な転写開始調節領域、第一の宿主細胞中で機能的な翻訳開始調節領域、軽鎖抗体フラグメントに連結したｓｃＦｖをコードするＤＮＡ配列、ならびに第一の宿主細胞中で機能的な転写および翻訳終結調節領域を含んでなり、二重特異性融合タンパク質のフラグメントがこれらの調節領域の制御下にある組換えＤＮＡ構築物を第一の宿主細胞に導入すること；
（Ｂ）（２）（Ａ）における軽鎖抗体フラグメントに相補的で、軽鎖抗体フラグメントに会合する場合、結合部位が標的組織に特異的なＦａｂフラグメントを形成するＦｄフラグメントを第二の宿主細胞中に産生し得る発現カセットを含んでなる組換えＤＮＡ構築物であって、５’から３’の転写方向で、第二の宿主細胞中で機能的な転写開始調節領域、第二の宿主細胞中で機能的な翻訳開始調節領域、ＦｄフラグメントをコードするＤＮＡ配列、ならびに第二の宿主細胞中で機能的な転写および翻訳終結調節領域を含んでなり、Ｆｄフラグメントがこれらの調節領域の制御下にある組換えＤＮＡ構築物を第二の宿主細胞に導入すること；
（Ｃ）第一の宿主細胞および第二の宿主細胞を増殖させること；
（Ｄ）所望により、二重特異性融合タンパク質フラグメントおよびＦｄフラグメントを単離すること；
（Ｅ）それらのフラグメントを組み合わせて二重特異性融合タンパク質を産生し、その二重特異性融合タンパク質を単離すること
を含む。
種々の宿主細胞を使用して二重特異性抗体または抗体フラグメントを調製することができ、宿主細胞には、限定されるものではないが、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、および細菌細胞が含まれる。一つの実施態様では、本方法において、哺乳類の接合体を利用し、組換えＤＮＡ構築物の導入により、二重特異性抗体または抗体フラグメントを産生し得るトランスジェニック動物を産生する。
本発明者らは１以上の診断薬または治療薬を有し得るターゲッティング可能な構築物に対してｂｓＡｂを惹起することが有利であることを見出した。この技術を用いることにより、キレート剤、金属キレート複合体、治療薬または診断薬の性質を、新規な適用ごとに新たなｂｓＡｂを惹起することなく種々の適用に適合するよう変えることができる。さらに、このアプローチを用いることにより、二以上の異なるキレート剤、金属キレート複合体または治療薬を本発明のｂｓＡｂとともに用いることができる。
本発明はさらに、ターゲッティング可能な構築物をスクリーニングする方法に関し、その方法は、
該ターゲッティング可能な構築物を、標的組織に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントと接触させて混合物を得ること（該少なくとも１つのアームは標的細胞、組織もしくは病原体上、またはそれらによって産生される、もしくはそれらに関連する分子上の相補的結合部分に結合し得る）；ならびに
所望により、該混合物をインキュベートすること；ならびに
該混合物を分析すること
を含む。
本発明のさらなる態様、特徴、および利点を以下に記載し、その一部が本明細書から自明であるか、本発明の実施によって確認されるであろう。本発明の実施態様および利点は、本明細書に特に示される手段および組み合わせによって実施および取得することができる。当業者ならば、本明細書に記載される実施態様が、記載されている他のいずれかの好適な実施態様と組み合わせて適宜使用可能なことが分かるであろう。
発明の具体的説明
特に断りのない限り、可算名詞（“ａ”または“ａｎ”）は１つ以上のものを意味する。
本発明によれば、式：
Ｘ−Ｒ１−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ａ）−Ｒ２（Ｚ）−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ｂ）−Ｒ３（Ｙ）−ＮＲ４Ｒ５；または
Ｒ１（Ｘ）−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ａ）−Ｒ２（Ｚ）−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ｂ）−Ｒ３（Ｙ）−ＮＲ４Ｒ５
［式中、
Ｘは硬酸陽イオンキレート剤、軟酸陽イオンキレート剤、酵素、治療薬、診断薬、またはＡｃ−であり；
Ｒ１は共有結合または同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり；
Ｒ２は共有結合または同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり；
Ｒ３は共有結合または同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり；
Ｙは硬酸陽イオンキレート剤、軟酸陽イオンキレート剤、酵素、治療薬、もしくは診断薬であるか、または存在せず；
Ｚは硬酸陽イオンキレート剤、軟酸陽イオンキレート剤、酵素、治療薬、もしくは診断薬であるか、または存在せず；
ＡおよびＢはハプテンまたは硬酸陽イオンキレート剤であり、これらは同じであっても異なっていてもよく；かつ、
Ｒ４およびＲ５は硬酸陽イオンキレート剤、軟酸陽イオンキレート剤、酵素、治療薬、診断薬およびＨからなる群から独立に選択される］
を含んでなる化合物が提供される。本式では、Ｄｐｒは２，３−ジアミノプロピオン酸である。これらの実施態様のいくつかのものでは、Ｒ１またはＲ３が共有結合であるとき、他方のＲ１またはＲ３は同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり得る。これらの実施形態およびその他の実施態様では、Ｒ２は同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり得る。これらの実施態様のさらに別の場合では、この化合物は式Ｘ−Ｒ１−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａ）−Ｒ２−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂ）−Ｒ３（Ｙ）−ＮＲ４Ｒ５を含むことができる。これらの実施態様のいくつかのものでは、Ｒ２は単一のＤ−アミノ酸である。他の実施態様では、Ｒ２は同じであっても異なっていてもよい２つのＤ−アミノ酸である。さらなる実施態様では、Ｒ３はＤ−Ｌｙｓであり、Ｙは硬酸陽イオンキレート剤または軟酸陽イオンキレート剤である。これらの実施態様のいくつかのものでは、Ｒ２はＤ−Ｌｙｓではない。なおさらなる実施態様では、ＡおよびＢはヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）、ＤＴＰＡおよびフルオレセインイソチオシアネートからなる群から独立に選択される。さらに他の実施態様では、Ｒ１は同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり、Ｒ２は同じであっても異なっていてもよい１以上のＤ−アミノ酸であり、Ｒ３は共有結合であり、Ｙは存在せず、かつ、ＡおよびＢはハプテンまたは硬酸陽イオンキレート剤であり、これらは同じであっても異なっていてもよい。さらなる実施態様では、ＡおよびＢはハプテンであり、これらは同じであっても異なっていてもよい。これらの実施形態およびその他の実施態様では、Ｒ１およびＲ２は単一のＤ−アミノ酸であり、これらは同じであっても異なっていてもよい。Ｒ１が１を超えるアミノ酸であるとき、そのアミノ酸の１つ、任意の個数、または総てが（Ｘ）基と結合していてもよい。同様に、Ｒ２が１を超えるアミノ酸であるとき、そのアミノ酸の１つ、任意の個数、または総てが（Ｚ）基と結合していてもよい。いくつかの実施態様では、Ｚは存在しない。いくつかの実施態様では、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ４またはＲ５の１つまたは２つだけが酵素、治療薬または診断薬である。括弧はアミノ酸側鎖の置換基を示す。これらの分子がペプチドの主鎖にある場合には、それらは括弧で囲まれない。本発明において、当業者ならば、１以上のアミノ酸とは１〜１０個のアミノ酸、有利には１〜５個のアミノ酸をさすが、必要であれば１０を超えるアミノ酸も使用できることが分かるであろう。
さらなる実施態様では、Ｒ１はＤ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、およびＤ−Ｐｈｅからなる群から選択される。さらなる実施態様では、Ｒ１はＤ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ａｒｇ、およびＤ−Ｌｙｓからなる群から選択される。これらの実施形態およびその他の実施態様では、Ｒ２はＤ−Ａｓｐ、Ｄ−ＧｌｕおよびＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される。本明細書に記載の実施態様のいくつかのものでは、Ｒ４およびＲ５はともにＨである。他の実施態様では、Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの１つが硬酸陽イオンキレート剤である。これらの実施形態およびその他の実施態様では、残されたＸ、Ｒ４およびＲ５のうちの１つが軟酸陽イオンキレート剤である。いくつかの実施態様では、Ｘは硬酸陽イオンキレート剤である。さらなる実施態様では、Ｒ４およびＲ５の一方が硬酸陽イオンキレート剤である。いくつかの実施態様では、硬酸陽イオンキレート剤はカルボン酸基またはアミン基を含んでなる。なおさらなる実施態様では、硬酸陽イオンキレート剤はＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、およびＴＥＴＡからなる群から選択される。さらに他の実施態様では、Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの１つが軟酸陽イオンキレート剤であり、これはチオール基を含んでいてもよい。この軟酸陽イオンキレート剤はＴｓｃｇ−ＣｙｓおよびＴｓｃａ−Ｃｙｓからなる群から選択することができる。本化合物のいくつかのものでは、Ｒ４およびＲ５の一方が軟酸陽イオンキレート剤であり、残りのＲ４またはＲ５がＨである。
ある実施態様では、ＸはＡｃ−であり、ＡおよびＢは硬酸陽イオンキレート剤であり、これらは同じであっても異なっていてもよく、Ｒ３は共有結合であり、かつ、Ｙは存在しない。いくつかの実施態様では、ＸはＡｃ−であり、ＡおよびＢはハプテンであり、これらは同じであっても異なっていてもよく、Ｒ１は共有結合であり、かつ、Ｙは軟酸陽イオンキレート剤である。本化合物の具体例としては、
Figure 0004937751
 が挙げられる。
本化合物のいくつかの実施態様では、（ｉ）Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの１つしか硬酸陽イオンキレート剤であることができず；かつ、（ii）Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの１つしか軟酸陽イオンキレート剤であることができない。本化合物のさらなる具体例としては、
Figure 0004937751
 が挙げられる。
これらの実施形態およびその他の実施態様では、これらの化合物は少なくとも１つの放射性核種をさらに含んでいてもよい。本化合物のいくつかのものでは、硬酸陽イオンキレート剤は、IIa族およびIIIa族の金属陽イオンからなる群から選択される陽イオンとキレート化されている。これらの実施形態およびその他の実施態様では、軟酸陽イオンキレート剤は、遷移金属、Ｂｉ、ランタニド類およびアクチニド類からなる群から選択される陽イオンとキレート化されている。
さらにその他の実施態様では、本化合物のＲ４またはＲ５は治療薬、診断薬または酵素である。
本化合物のいくつかのものでは、そのアミノ酸主鎖は２〜約５０、７５、８５または１００連続アミノ酸の長さを有し得る。例えば、Ｒ１またはＲ３は約１、２、５、１０または１５アミノ酸〜約２０、２５、３０または３５アミノ酸長であり得る。ある化合物では、このアミノ酸鎖は３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸長である。ある実施態様では、Ｒ２は１、２、または３アミノ酸長である。いくつかの実施態様では、本発明はまた、本化合物のいずれかを含んでなるターゲッティング可能な構築物も提供する。本化合物のいくつかのものでは、そのアミノ酸主鎖は環状であるが、他のものでは直鎖である。本化合物はとりわけターゲッティング可能な構築物として有用である。
望ましくは、ターゲッティング可能な構築物は、少なくとも２単位の認識可能なハプテンを有するペプチドを含む。認識可能なハプテンの例としては、限定されるものではないが、ヒスタミンスクシニルグリシン（ＨＳＧ）およびフルオレセインイソチオシアネートが挙げられる。ターゲッティング可能な構築物は罹患組織の処置または同定に有用な種々の薬剤と結合させることができる。結合される薬剤の例としては、限定されるものではないが、キレート剤、金属キレート複合体、薬物、毒素（例えば、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、シュードモナス内毒素）およびその他のエフェクター分子が挙げられる。さらに、プロドラッグの活性化または薬物の標的特異的毒性の増強に有用な酵素を、ターゲッティング可能な構築物に結合させることができる。従って、ターゲッティング可能な構築物に対して反応性のあるｂｓＡｂの使用により、適用ごとに新しいｂｓＡｂを惹起することなく種々の治療および診断適用を行うことができる。
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）プレターゲッティングは、診断および治療適用の潜在的に免疫原性のない、選択性の高い代替法である。本明細書に記載のｂｓＡｂプレターゲッティング系は、種々の異なるイメージング剤または治療薬とともに用いるために開発できる可能性があるという点で、他のプレターゲッティング系に優る、さらなる著しい利点がある。この系の柔軟性は、ヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）に対する抗体の使用とＨＳＧ残基を含むペプチドの開発に基づくものである。ＨＳＧ含有ペプチドは１１１Ｉｎ、９０Ｙ、または１７７Ｌｕのキレート化のためのＤＯＴＡ、あるいはテクネチウム／レニウムキレートを用いて合成したものである。プレターゲッティングでは、これらのペプチドは、抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）または抗結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）抗体のいずれかのＦａｂ’で化学的に安定化させた抗ＨＳＧ Ｆａｂ’を用いた二重特異性抗体と組み合わせて使用され、これにより、これらの抗原を発現する腫瘍への腫瘍ターゲッティングが可能とされる。しかしながら、他の抗原標的としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｉａ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＰＡＭ−４、ＢｒＥ３、ＴＡＧ−７２（Ｂ７２．３，ＣＣ４９）、ＥＧＰ−１（例えばＲＳ７）、ＥＧＰ−２（例えば１７−ＩＡおよびその他のＥｐ−ＣＡＭ標的）、Ｌｅ（ｙ）（例えばＢ３）、Ａ３、ＫＳ−１、Ｓ１００、ＩＬ−２、Ｔ１０１、壊死抗原、葉酸受容体、脈管形成因子（例えばＶＥＧＦ）、テネイシン、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、腫瘍関連サイトカイン、ＭＡＧＥ、および／またはそのフラグメントなどに対する当技術分野で公知の多様な腫瘍関連抗原が挙げられる。組織特異的抗体（例えば、ＣＤ３４、ＣＤ７４などのような骨髄細胞に対するもの、パラチログロブリン抗体など）、ならびに血餅のフィブリン、アテローム性動脈硬化斑のマクロファージ抗原（例えばＣＤ７４抗体）などの非悪性罹患組織に対する抗体、また、特定の病原体の抗体（例えば、細菌、ウイルスおよび寄生虫に対するもの）が当技術分野で周知である。
これらのペプチドは、精製の必要がない容易な方法により、高い特異的活性を持つように放射性標識することができる。いくつかの実施態様では、これらのペプチドは、腫瘍または正常組織における最低限の保持量を残し、身体から迅速にクリアリングされる。本明細書に記載のプレターゲッティング系は柔軟性が高く、診断イメージングおよび治療上着目される幅広い化合物アレイを用いることができ、また、優れた腫瘍の取り込み比およびターゲッティング比を達成することでこれらの適用における使用に極めて有望となる。
さらに、哺乳類において標的細胞、組織または病原体を検出および／または処置する方法が含まれ、その方法はターゲッティング可能な構築物としての１以上の本化合物の有効量を投与することを含む。この方法は、標的細胞、組織または病原体に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ターゲッティング可能な構築物に特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを含んでなる二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与することをさらに含み得る。本明細書において「病原体」とは、限定されるものではないが、真菌（例えば、小胞子菌、白癬菌、表皮菌、スポロトリクス・シェンキー、シルプトコッカス・ネオフォルマンス、コクシジオイデス・イミチス、ヒストプラズム・カプスラツム、ブラストミセス・デルマティティディス、カンジダ・アルビカンス）、ウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、シミアンウイルス４０、呼吸器多核体（ＲＳ）ウイルス、マウス乳癌ウイルス、水疱−帯状疱疹ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルスおよびブルータングウイルス）、寄生虫、細菌（例えば、炭疽菌、ストレプトコッカス・アガラクチエ、レジュネラ・ニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎双球菌、Ｂ型インフルエンザ菌、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、らい菌、ウシ流産菌、結核菌および破傷風毒素）、マイコプラズマ（例えば、マイコプラズマ・アルスリティディス、Ｍ．ヒオリニス、Ｍ．オーラル、Ｍ．アルギニニ、アコレプラスマ・ライドラウィー、Ｍ．サリバルム、および肺炎マイコプラズマ）、ならびに原生動物（例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ、ランゲリ・トリパノソーマ、クルーズ・トリパノソーマ)、ローデシア・トリパノソーマ、ブルセイ・トリパノソーマ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、ウシバベシア、エルメリア・テネラ、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、旋毛虫、回旋糸状虫、タイレリア・パルバ、胞状条虫、テニア・オビス、カギナシサナダ、単胞条虫およびメソセストイデス・コルチが挙げられる。米国特許第５，３３２，５６７号参照。
本明細書ではまた、抗体および抗体フラグメントも提供される。抗体フラグメントは、抗体の抗原結合部分であり、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂなどである。抗体フラグメントは、無傷の抗体によって認識される抗原と同一の抗原と結合する。例えば、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体フラグメントは、ＣＤ２２のエピトープと結合する。
「抗体フラグメント」には、特定の抗原との結合によって複合体を形成する抗体のように作用する任意の合成または遺伝子操作されたタンパク質も含まれる。例えば、抗体フラグメントには、重鎖および軽鎖の可変領域からなる単離フラグメントの「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓＦｖタンパク質」）によって連結されている組換え一本鎖ポリペプチド分子、および「超可変領域」を模倣するアミノ酸残基からなる最小の認識単位が含まれる。これらのいわゆる「超可変」領域または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のうち３つが軽鎖または重鎖の各可変領域に見られる。各ＣＤＲは比較的保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）によってフランキングされている。ＦＲは可変領域の構造的完全性を維持しているものと思われる。軽鎖のＣＤＲおよび対応する重鎖のＣＤＲが抗原結語部位を形成する。ＣＤＲの「超可変性」により、抗体の特異性の多様性が説明される。
本明細書において「被験体」とは、動物（すわなち、脊椎動物および無脊椎動物）をいい、限定されるものではないが、ヒトおよびその他の霊長類、齧歯類（例えば、マウス、ラットおよびモルモット）、ウサギ類（例えば、ウサギ）、ウシ類（例えば、蓄牛）、ヒツジ類（例えば、ヒツジ）、ヤギ類（例えば、ヤギ）、ブタ類（例えば、ブタ）、ウマ類（例えば、ウマ）、イヌ類（例えば、イヌ）、ネコ類（例えば、ネコ）、家禽類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、その他のキジ類など）、ならびに限定されるものではないが、有蹄類（例えば、シカ）、クマ、魚類、ウサギ類、齧歯類、鳥類などの動物をはじめとする、野生化した、または野生の動物が挙げられる。この用語は特定の齢または性に限定されるものではない。よって、雄であれ雌であれ、成体および新生被験体、ならびに胎児もこの用語に包含される。
本化合物とともに使用するための好適な抗体およびフラグメントとしては以下のものが挙げられる：”Anti-CD20 Antibodies And Fusion Proteins Thereof And Methods Of Use”と題された米国仮出願、代理人事件番号１８７３３／１０７３、米国仮出願第６０／３５６，１３２号、米国仮出願第６０／４１６，２３２号および代理人事件番号１８７３３／１１５５（その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているもののような抗ＣＤ２０抗体に由来するＦｖ；米国特許第５，８７４，５４０号（その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に開示されているもののような、クラスIII抗癌胎児性抗原抗体（抗ＣＥＡ抗体）であるｈＭＮ−１４抗体；米国特許出願第１０／１１６，１１６号（その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているもののようなＭｕ−９抗体；米国仮特許出願第６０／３６０，２５９号（その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているもののようなＬＬ１抗体；米国仮特許出願第６０／３９９，７０７号（その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているもののようなＡＦＰ抗体；"Monoclonal Antibody cPAM4”と題された米国仮出願、代理人事件番号１８７３３／１１０２（その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているもののようなＰＡＭ４抗体；米国仮出願第６０／３６０，２２９号（その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているもののようなＲＳ７抗体；米国仮特許出願第６０／４１４，３４１号に開示されているもののようなヒト化ＭＮ３抗体；ならびに米国特許第５，７８９，５５４号および同第６，１８７，２８７号、および米国特許出願第０９／７４１，８４３号および同第０９／９８８，０１３号（それらの全開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる）に開示されているもののようなＣＤ２２抗体。引用されている出願に含まれているように、造血系腫瘍および固形腫瘍の他の多くの腫瘍関連抗原が当業者に知られており、（限定されるものではないが）ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、Ｉｉ、Ｉａ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、前立腺(prostastic)酸性ホスファターゼ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＰＡＭ４、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、インスリン増殖因子受容体、Ｓ １００、ＶＥＧＦ、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、胎盤アルカリ性ホスファターゼ、壊死産物、癌遺伝子産物などが挙げられる。本化合物はまた、上記の出願に開示されている方法のいずれと併用することもできる。
II．抗体に対してターゲッティング可能な構築物
ターゲッティング可能な構築物は本明細書に記載のように多様な構造であり得る。好ましい実施態様では、これらの化合物は、免疫応答の惹起をなくすため、かつ／またはｂｓＡｂターゲッティング法の範囲内で使用する場合はin vivoで迅速にクリアリングされるように選択される。強い免疫応答の惹起には疎水性の薬剤が最良であるのに対し、迅速なin vivoクリアリングのためには親水性の薬剤が好ましく、従って、疎水性と親水性の間のバランスを確立する必要がある。これは、多くの有機部分の固有の疎水性を相殺する親水性キレート剤の使用に一部依存することにより達成される。また、反対の溶解特性を有するターゲッティング可能な構築物のサブユニット（例えば、ペプチド）を選択することができ、あるものは疎水性であり、またあるものは親水性であるアミノ酸を含む。ペプチド以外に、炭水化物を使用することができる。
本化合物においては、天然および非天然アミノ酸を含め、いずれのアミノ酸を用いてもよい。
ターゲッティング可能な構築物は２つといったわずかなアミノ酸残基（好ましくはアミノ酸残基２〜１０個）を有するペプチド主鎖を含むことができ、キレート剤などの他の部分と結合させることができる。ターゲッティング可能な構築物は、好ましくはキレート剤に結合されていてもよい任意の金属イオンを含めて５０，０００ダルトン未満、有利には約２０，０００ダルトン未満、１０，０００ダルトン未満、または５，０００ダルトン未満の分子量を有する低分子量の構築物であるべきである。例えば、公知のペプチドＤＴＰＡ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＯＨ（ここで、ＤＴＰＡはジエチレントリアミン五酢酸である）を使用して分子のインジウム−ＤＴＰＡ部分に対する抗体を作製している。しかし、非インジウム含有分子の使用および適切なスクリーニング工程により、チロシル−リジンジペプチドに対する新規のＡｂを作製することができる。より通常には、ターゲッティング可能な構築物の抗原ペプチドは、ペプチドＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ここで、ＤＯＴＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸であり、ＨＳＧは式：
Figure 0004937751
 のヒスタミンスクシニルグリシル基である）など、４以上の残基を有する。
非金属含有ペプチドを免疫原として使用し、得られたＡｂをＤ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ主鎖に対する反応性についてスクリーニングしてもよい。
ターゲッティング可能な構築物のハプテンも、例えば化学ハプテンなど、免疫認識部分を提供する。化学ハプテン、好ましくはＨＳＧハプテンを用いると、抗体に対する構築物の高い特異性が示される。これは、ＨＳＧハプテンに対して惹起された抗体は公知であり、適当なｂｓＡｂに容易に組み込むことができることに基づく。よって、このペプチド主鎖に対するハプテンの結合により、ｂｓＡｂまたはｂｓＦａｂに対して特異的なターゲッティング可能な構築物が得られる。
本発明者らは、Ｄ−アミノ酸主鎖を有するペプチドが、１個または数個のＤ−アミノ酸が主鎖に組み込まれているペプチドと比較してもin vitroおよびin vivoで安定であることを見出した。非天然アミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸の、ペプチド主鎖構造への組み込みはまた、最終的にｂｓＡｂ／構築物系とともに用いる場合、ターゲッティング可能な構築物を認識するｂｓＡｂのアームが特異的であることを保証する助けともなる。本発明はさらに、非天然アミノ酸およびペプトイドから構築されたものなどの他の主鎖構造も意図する。
このように使用されるペプチドは、固相支持体および標準的な連続的直交脱保護およびカップリング技術を用いた自動ペプチド合成装置によって便宜に合成することができる。ペプチド中の遊離のアミノ基（これは、後にキレート複合体として使用される）を、アセチル基などの標準的な保護基でブロックするのが有利である。このような保護基は当業者に公知である。Greene and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 1999 (John Wiley and Sons, N. Y.)参照。ペプチドを、その後ｂｓＡｂ系で用いるために調製する場合、in vivoにおけるカルボキシペプチダーゼ活性を阻害するために樹脂から切断して対応するＣ末端アミドを作出するのが有利である。
III．キレート部分
ターゲッティング可能な構築物における親水性のキレート部分の存在は、迅速なin vivoクリアランスを保証する助けとなる。キレート剤は親水性の他、それらの金属結合特性に関して選択され、少なくとも、そのｂｓＡｂエピトープがペプチドの一部であるか、または非キレート化学ハプテンであるターゲッティング可能な構築物に関しては金属−キレート複合体の認識がもはや問題ではないので、所望に応じて変更してもよい。
特に有用な金属−キレートの組み合わせとしては、放射イメージングおよびＲＡＩＴ用の４７Ｓｃ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、１６１Ｔｂ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２２５Ａｃとともに用いる２−ベンジル−ＤＴＰＡ、ならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。本発明のｂｓＡｂとともに用いる場合、同じキレート剤を、ＭＲＩで用いるＭｎ、ＦｅおよびＧｄなどの非放射活性金属と複合体を形成させる。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸）、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）などの大環キレート剤は種々の金属および放射性金属とともに、より詳しくはそれぞれＧａ、ＹおよびＣｕの放射性核種とともに用いられる。
ＤＴＰＡおよびＤＯＴＡ型のキレート剤は、リガンドがカルボン酸基またはアミン基などの硬塩基キレート官能基を含む場合、硬酸陽イオン、特にIIa族およびIIIa族の金属陽イオンをキレート化するのに最も有効である。このような金属−キレート複合体は、対象とする金属に環のサイズを適合させることで極めて安定にすることができる。ＲＡＩＴのための２２３Ｒａなど、安定に結合する核種としては、大環ポリエーテルなどの他の環状キレート剤が対象となる。ポルフィリンキレート剤は多くの放射性金属とともに用いることができ、ｂｓＡｂに向けられた免疫光療法のための特定の非放射性金属複合体としても有用である。また、１を超える種類のキレート剤をターゲッティング可能な構築物に結合させて複数の金属イオン、例えば非放射性イオン、診断用放射性核種および／または治療用放射性核種と結合させてもよい。
ターゲッティング可能な構築物のキレート剤と結合させることができる特に有用な診断用放射性核種としては、限定されるものではないが、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、またはその他のγ、βまたは陽電子放射剤が挙げられる。好ましくは、診断用放射性核種としては、２５〜１０，０００ｋｅＶの範囲、より好ましくは２５〜４，０００ｋｅＶの範囲、いっそうより好ましくは２０〜１，０００ｋｅＶの範囲、なおいっそうより好ましくは７０〜７００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを含む。有用な陽電子放射放射性核種の崩壊エネルギーは好ましくは＜２，０００ｋｅＶ、より好ましくは１，０００ｋｅＶ未満であり、最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。γ線検出を利用する診断薬として有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、ｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｉｎ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−１６９、Ｈｇ−１９７およびＴｌ−２０１が挙げられる。有用なγ線放出放射性核種の崩壊エネルギーは好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、および最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。
好ましくは、ターゲッティング可能な構築物のキレート剤に結合させることができる有用な治療用放射性核種としては、限定されるものではないが、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕおよび２１１Ｐｂが挙げられる。治療用放射性核種は好ましくは２５〜１０，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有する。有用なβ粒子放出核種の崩壊エネルギーは好ましくは２５〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。また、オージェ放出粒子により実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２がある。有用なβ粒子放出核種の崩壊エネルギーは好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。また、α粒子の生成によって実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。このような放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５が挙げられる。有用なα粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは好ましくは２，０００〜９，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。
米国特許第５，７５３，２０６号に開示のキレート剤（特に、チオセミカルバゾニルグリオキシルシステイン（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）およびチオセミカルバジニルアセチルシステイン（Ｔｓｃａ−Ｃｙｓ）キレート剤）を有利に使用して、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｂｉ、ならびに軟塩基リガンド（特に、硫黄またはリン含有リガンド）に強く結合する他の遷移金属、ランタニドおよびアクチニドの軟酸陽イオンを結合させる。これは、ペプチドへの１種より多い型のキレート剤、例えば、Ｉｎ（III）陽イオンにはＤＴＰＡなどの硬酸キレート剤、およびＴｃ陽イオンには軟酸キレート剤（例えば、Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓなどのチオール含有キレート剤）の結合に有用であり得る。ジＤＴＰＡハプテンに対する抗体が公知（Barbet‘395, 前掲）であり、標的抗体と容易に結合してｂｓＡｂを形成するので、プレターゲッティングプロトコールにおける放射性同位元素標的用の、非放射性ジＤＴＰＡキレート剤および放射性同位元素結合用の他のキレート剤を有するペプチドハプテンを使用することができる。このようなペプチドの一例は、Ａｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２である。このペプチドに予めＩｎ（III）を付加した後、９９−ｍ−Ｔｃ陽イオンで標識することができ、Ｉｎ（III）イオンはＤＴＰＡによって優先的にキレート化され、Ｔｃ陽イオンはチオール含有Ｔｓｃｇ−ＣｙｓＣに優先的に結合する。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡなどの他の硬酸キレート剤を、ＤＴＰＡ基と置換することができ、それらに特異的なＭａｂを、類似の技術を用いて産生することができ、これを使用して抗ジ−ＤＴＰＡ Ｍａｂを作製することができる。
２つの異なる硬酸または軟酸キレート剤を、異なるサイズの陽イオン、キレート環の幾何学、および陽イオンの好ましい複合体イオン構造によって、２つの異なる硬酸または軟酸陽イオンに優先的に結合するように、リンカーに（例えば、異なるキレート環のサイズで）組込むことができると考えられる。これにより、２つの異なる金属（その１つまたは両方が放射性であるか、ＭＲＩ増強に有用であるものでよい）を、プレターゲッティングされたｂｓＡｂによる最終的な捕捉のためのリンカーに組み込ませる。
好ましいキレート剤としてはＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴｓｃｇ、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。これらのキレート剤は以下の構築物：
Figure 0004937751
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に例示されるように、キレート剤−ペプチド複合体モチーフに組み込まれている。
上記のキレート剤−ペプチド複合体は６８Ｇａと結合することができることから、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）適用に有用である。
キレート剤は標準的な化学を用いてターゲッティング可能な構築物のペプチドに結合されるが、そのいくつかが以下の実施例で詳しく開示される。
IV．金属キレート調製の一般法
キレート剤−ペプチド複合体は、固体として長期保存することができる。これらを、金属結合反応のための単位用量に定量し、固体、液体、または半液体溶液、凍結溶液または凍結乾燥調製物のいずれかとして単位用量で保存できる。これらは周知の手順によって標識することができる。
典型的には、硬酸陽イオンを、便宜な塩の溶液として導入し、硬酸キレート剤または可能ならば軟酸キレート剤によって取り上げる。しかし、その後の軟酸陽イオンの添加によって、軟酸キレート剤によるその結合が誘導されて、キレート化することができる任意の硬酸陽イオンが置き換わる。例えば、過剰な非放射性１１１ＩｎＣｌ３の存在下でさえ、in situで塩化ズスおよびＮａ９９ｍ−ＴｃＯ４を用いて作製された９９ｍ−Ｔｃ（Ｖ）グルコヘプトネートまたはＴｃ陽イオンでの標識は、軟酸キレート剤に対して定量的に進行する。
他の軟酸陽イオン（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１３Ｂｉなど）およびＭｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｂ、Ｃｕ、Ｃｄ、Ａｕ、Ｆｅ、Ａｇ（一価）、Ｚｎ、およびＨｇの二価または三価の陽イオン（特に、６４Ｃｕおよび６７Ｃｕ）（これらのいくつかは放射免疫診断または放射免疫治療に有用である）を、類似の方法によってリンカーペプチドに付加することができる。Ｒｅ陽イオンを、過レニウム酸塩および錫イオンからin situで作製するか、予め還元したグルコヘプトン酸レニウムまたは他のトランスキレート剤を使用することができる。過レニウム酸塩の還元にはＴｃの還元に必要なものよりも多量の錫イオン（典型的には、２００μｇ／ｍＬを超える最終濃度）を必要とするので、高レベルの錫イオンがジスルフィド環化ペプチドに存在するもののような感受性ジスルフィド結合を還元させないように、十分注意が必要である。レニウムで放射性標識する際にもＴｃ−９９ｍで用いたものと同様の手順が用いられる。Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ−リガンドのＲｅＯ金属複合体の調製のための１つの方法は、ペプチドのＲｅＯＣｌ３（Ｐ（Ｐｈ３）２との反応であるが、ＲｅＯ（エチレンジアミン）２などの他の還元種の使用も可能である。
Ｖ．投与法
以下に示される考察の多くは、罹患組織を処置する場合の、本開示のターゲッティング可能な構築物の使用に着目するものであることに注意すべきである。しかしがら、本発明は、米国特許第６，１２６，９１６号、同第６，０７７，４９９号、同第６，０１０，６８０号、同第５，７７６，０９５号、同第５，７７６，０９４号、同第５，７７６，０９３号、同第５，７７２，９８１号、同第５，７５３，２０６号、同第５，７４６，９９６号、同第５，６９７，９０２号、同第５，３２８，６７９号、同第５，１２８，１１９号、同第５，１０１，８２７号、および同第４，７３５，２１０号（これらは引用することにより本明細書の一部とされる）に記載の方法を用いて、正常な組織および臓器の処置および／またはイメージングに本二重特異性抗体およびターゲッティング可能な構築物を用いることも意図する。本明細書において「組織」とは、限定されるものではないが、卵巣、胸腺、副甲状腺、骨髄または脾臓由来の組織をはじめとする組織をさす。正常組織をターゲッティングする場合に重要な使用としては、子宮内膜症など、異所性の（すなわち、正規の位置からはずれている）組織を同定および処置することである。
上記で論じたｂｓＡＢおよびターゲッティング可能な構築物の投与は、リンカー部分と結合した治療薬の投与前のいずれかの時間にｂｓＡｂを投与することにより行えばよい。試薬の用量およびタイミングは、当業者ならば容易に判断することができ、これは、使用する試薬の特定の性質によって異なる。ｂｓＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２誘導体を最初に投与する場合、ターゲッティング可能な構築物の投与前に１〜６日間待機するのが適切である。ＩｇＧ−Ｆａｂ’ｂｓＡｂ複合体が一次標的ベクターである場合、このリンカー部分の投与前の待機時間はより長く、３〜１５日間の範囲で指示すればよい。あるいは、ｂｓＡｂおよびターゲッティング可能な構築物はカクテル型または一方の後に他方を投与することのいずれかで実質的に同時に投与することもできる。
多様な診断薬および治療薬を、本ターゲッティング可能な構築物に有利に結合させることができる。一般に、診断薬および治療薬としては、同位元素、薬物、毒素、サイトカイン、サイトカイン複合体、ホルモン、増殖因子、複合体、放射性核種、造影剤、金属、細胞傷害剤および免疫調節剤が挙げられる。例えば、ガドリニウム金属は磁気共鳴イメージングに用いられ、フルオロクロムは光線力学療法と組み合わせることができる。さらに、造影剤はＭＲＩ造影剤（ガドリニウムイオン、ランタンイオン、マグネシウムイオン、鉄、クロム、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウム、ネオジウム、またはその他の匹敵する標識など）、ＣＴ造影剤、および超音波造影剤であり得る。さらなる診断薬としては、蛍光標識化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオレサミンなど）、化学発光化合物（ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルなど）、および生物発光化合物（ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンなど）が挙げられる。また、放射性核種も診断および／または治療薬として使用することができ、例えば、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、および２１１Ａｔが挙げられる。
治療薬としてはまた、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗体、Ｃｏｘ−２阻害剤、有糸分裂阻害剤、抗血管形成剤、およびアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカンなどの化学療法薬、ならびにこれらおよび他種の抗癌剤に由来するもの含まれる。免疫複合体および抗体融合タンパク質の調製に有用な他の治療薬としては、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ錯体、ホルモンなどが挙げられる。好適な治療薬は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)、およびGOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)、ならびにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。試験中の薬物など、その他の好適な治療薬は当業者に公知である。治療薬はまた、限定されるものではないが、他の薬物、プロドラッグおよび／または毒素も含み得る。「薬物」、「プロドラッグ」および「毒素」の用語は本明細書を通じて定義される。「診断薬」または「診断」とは、限定されるものではないが、検出剤、検出、または局在化を含む。
ターゲッティング可能な構築物が診断薬を含む場合、ｂｓＡｂは治療薬の投与前に投与するのが好ましい。このｂｓＡｂが罹患組織をターゲッティングするのに十分な時間が経った後、診断薬を、ターゲッティング可能な構築物の手段により投与すれば、結果として画像化が達成できる。適当な波長の光を当てた後にそれを回収して種々の構造を直接的または間接的に可視化する手段により、または放射性プローブもしくは経口検出器などのような特殊な検出器によっても、体腔中の腫瘍を検出することができる。非電離放射線を当ててこれらの構造から再捕捉することができる限り、いずれの身体部位の病変も可視化することができる。例えば、高分解能で非侵襲性の画像化技術であるＰＥＴを、ヒト疾患の可視化のための本発明の抗体およびターゲッティング可能な構築物とともに使用することができる。ＰＥＴでは、陽電子消滅崩壊の際に生じた５１１ｋｅＶのγ光子が検出される。Ｘ線、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、ＭＲＩおよびγイメージング（例えば、単光子放出コンピューター断層撮影法Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT)）もまた、これらの理学療法とともに機能する診断薬の使用を通して用いることができる。
先に考察したように、ターゲッティング可能な構築物は２５〜１０，０００ｋｅＶのγ、β、αおよびオージェ粒子および／または陽電子を放射する放射性診断薬を含み得る。このような薬剤の例としては、限定されるものではないが、１８Ｓ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄおよび１７５Ｌｕが挙げられる。
本ｂｓＡｂまたはｂｓＦａｂは、米国特許第６，０９６，２８９号、同第４，３３１，６４７号、同第４，８１８，７０９号、同第４，３４８，３７６号、同第４，３６１，５４４号、同第４，４４４，７４４号、同第５，８５１，５２７号に記載のように、光線力学療法（ＰＴＤ）の方法において使用することができる。ＰＤＴでは、光増感剤、（例えば、ジヘマトポルフィリンエーテルなどのヘマトポルフィリン誘導体）を被験体に投与する。例えば６３０ｎｍの光を用いて抗腫瘍活性を誘導する。皮膚の太陽光線による光増感が不十分である場合、別の光増感剤（より長い波長で有用な物質を含む）を使用することができる。このような光増感剤の例としては、限定されるものではないが、ベンゾポルフィリン一酸環Ａ（ＢＰＤ−ＭＡ）、錫エチオプルプリン（ＳｎＥＴ２）、スルホン化アルミニウムフタロシアニン（ＡｌＳＰｃ）、およびルテチウムテキサフィリン（Ｌｕｔｅｘ）が挙げられる。
さらに、ＰＤＴでは、診断薬を、例えば全身注射し、レーザー誘起蛍光法を使用して光活性剤が結合した癌部位を内視鏡（ワイヤレスのカプセルサイズの内視鏡またはカメラを含む）によって検出することができる。例えば、これは初期肺腫瘍の蛍光気管支鏡検査に適用されている。Doiron et al, Chest 76:32(1979)。別の例では、これらの抗体および抗体フラグメントを、単光子放出に使用することができる。例えば、本発明の抗体または抗体フラグメントの投与後に、被験体へＴｃ−９９ｍ標識診断薬を投与することができる。次いで、被験体をγ線カメラでスキャンして単光子放出コンピューター断層撮影画像を得て病変または腫瘍部位を決定する。
治療上有用な免疫複合体は光活性剤または色素を抗体コンポジットにコンジュゲートさせることにより得られる。蛍光およびその他の色素源または色素（可視光に感受性のあるポルフィリンなど）は、病変部に適当な光を照射することにより病変部を検出および処置するのに使用されてきた。療法では、これは光照射、光線療法または光線力学療法と呼ばれている(Jori et al (eds.), Photodynamic Therapy of Tumors and Other Diseases (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430(1986))。さらに、光線療法を達成するため、モノクローナル抗体が光活性化色素に結合されてきた。Mew et al., J. Immunol. 130:1473 (1983);同上, Cancer Res. 45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc.. Natl. Acad, Sci. USA 83:8744 (1986); 同上, Photoehem. Photobiol. 46:83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 283:471(1989); Tatsuta et al, Lasers Surg. Med. 9:422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529 (1991)。しかしながら、これらの初期の研究では内視鏡による治療適用（特に、抗体フラグメントまたはサブフラグメントを併用する場合）の使用は含まれていなかった。従って、本発明は、光活性剤または色素を含んでなる免疫複合体の治療的使用を意図する。
Ｘ線およびコンピューター断層撮影を増強するためには放射線不透過剤および造影剤が用いられるが、これらにはヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム化合物などが含まれる。特定の化合物としては、バリウム、ジアトリゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドンおよび塩化タリウムが含まれる。また、デキストランおよびリポソーム、特にガス充填リポソームをはじめとする超音波造影剤も使用できる。一つの実施態様では、サイトカインなどの免疫調節剤を治療構築物に結合させてもよい。本明細書において「免疫調節剤」とは、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン（腫瘍壊死（ＴＮＦ）など）、および造血因子（インターロイキン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８）など）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、およびトロンボポエチンが挙げられる。好適な免疫調節剤部分の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αなどが挙げられる。
ターゲッティング可能な構築物はまた、標的部位で薬物／プロドラッグを活性化することができるか、身体の解毒経路の調節によって通常の治療薬を改良することができる酵素に結合させることもできる。ｂｓＡｂの投与後、低分子量ハプテンを有するターゲッティング可能な構築物に結合させた酵素を投与する。酵素を、ｂｓＡｂ：ターゲッティング可能な構築物の結合によって標的部位にプレターゲッティングした後、標的部位で作用することが知られている細胞傷害剤を注射する。この薬物は哺乳類の通常の解毒処理によって解毒されて毒性の低い中間体を形成するものであってもよい。例えば、薬物は、肝臓において潜在的に毒性の低いグルクロニドへと変換するものであってもよい。解毒中間体は次に、標的部位でプレターゲッティング酵素によってより有毒な形態に再変換することができ、これにより標的部位での毒性が増強する。
あるいは、投与したプロドラッグは、プレターゲッティング酵素によって有効薬へと変換させることもできる。プレターゲッティング酵素は、解毒薬物の再循環によって治療の効率を改良する。このアプローチは、どんな酵素−薬物対との併用にも適用することができる。あるいは、ターゲッティング可能な構築物を酵素とともに、患者に投与する前にターゲッティングｂｓＡｂと混合することもできる。ｂｓＡｂ：ターゲッティング可能な構築物の複合体が標的部位に局在し、結合していないターゲッティング可能な構築物が循環からクリアリングされるのに十分な時間が経過した後、プロドラッグを投与する。上述のように、このプロドラッグは次に、プレターゲッティング酵素によりin situで薬物に変換される。
抗癌治療に有用な特定の細胞傷害剤は血清に比較的不溶である。非結合形態では極めて有毒なものもあり、その毒性はプロドラッグへの変換によってかなり減少する。難溶性薬物のより溶解性の高い複合体（例えば、グルクロニド、親水性の酸のエステルまたは親水性アミンのアミド）への変換により、血清の水相でのその溶解性および静脈、動脈、または毛細血管の細胞壁を通り抜け、腫瘍が浸かっている間質液への到達能が向上する。標的部位にてプロドラッグが切断され、溶解性の低い薬物が蓄積する。このようなプロドラッグから薬物への変換についての多くの例が、Hansenの米国特許第５，８５１，５２７号に開示されている。
芳香族または脂環式アルコール、チオール、フェノールおよびアミンなどの特定の毒性物質の肝臓内でのグルクロニドへの変換は、毒性物質を解毒し、尿中に排泄しやすくする身体の方法である。このような物質に変換することができる抗腫瘍薬の一種が、アントラサイクリングリコシドであり、ヒトβ−Ｄ−グルクロニダーゼの基質であることが示されている、ドキソルビシン（アドリアマイシン）の４−エピマー、エピルビシンである。例えば、Arcamone Cancer Res. 45: 5995 (1985)参照。極性基の少ない他の類似体はより親油性が高いと考えられ、このようなアプローチにより有望であると考えられる。芳香族または脂環式アルコール、チオールまたはアミン基を有する他の薬物または毒素は、このような複合体形成の候補である。これらの薬物またはその他のプロドラッグ形態は、本発明の部位特異的増強法の好適な候補である。
プロドラッグＣＰＴ−１１（イリノテカン）は、in vivoにてカルボキシルエステラーゼによって活性な代謝産物ＳＮ−３８に変換される。従って、本発明の１つの適用では、腫瘍およびハプテン（例えば、ジ−ＤＴＰＡ）をターゲッティングするｂｓＡｂを用い、その後、ジ−ＤＴＰＡ−カルボキシルエステラーゼ複合体の注射を行う。一度、適切な腫瘍対バックグラウンド局在化比が達成されると、ＣＰＴ−１１を与え、腫瘍に局在しているカルボキシルエステラーゼは、腫瘍においてＣＰＴ−１１をＳＮ−３８へと変換する働きをする。活性なＳＮ−３８は難溶性であるために腫瘍周辺に残存し、結果的にターゲッティングされている抗原に関して陰性である隣接腫瘍細胞に対して効果を発揮する。このことが本方法のさらなる利点である。改変型カルボキシルエステラーゼについては文献に記載されており、これも本発明の範囲内である。例えば、Potter et al., Cancer Res. 58 : 2646-2651 (1998)およびPotter et al., Cancer Res. 58: 3627-3632 (1998)参照。
エトポシドは、そのグルクロニドの形成によって大幅に解毒される、広く使用されている制癌剤であり、これは本発明の範囲内である。例えば、Hande et al. Cancer Res. 48: 1829-1834 (1988)参照。グルクロニド複合体は細胞傷害剤から調製でき、ｍＡｂ−グルクロニダーゼ複合体でプレターゲッティングした腫瘍の治療薬として注射することができる。例えば、Wang et al. Cancer Res. 52: 4484-4491 (1992)参照。従って、このような複合体を本明細書に記載のプレターゲッティングアプローチと併用することもできる。同様に、ダウノマイシンおよびドキソルビシンの誘導体に基づいて設計されたプロドラッグについては、カルボキシルエステラーゼおよびグルクロニダーゼとの併用について記載されている。例えば、Bakina et al. J. Med Chem. 40: 4013-4018 (1997)参照。本発明の範囲内で使用することができるプロドラッグ／酵素対の他の例としては、限定されるものではないが、フェノールマスタードのヒドロキシ誘導体のグルクロニドプロドラッグとβ−グルクロニダーゼ；フェノールマスタードまたはＣＰＴ−１１とカルボキシペプチダーゼ；メトトレキサート置換α−アミノ酸とカルボキシペプチダーゼＡ；６−メルカプトプリンおよびドキソルビシンなどの薬物のペニシリンまたはセファロスポリン複合体とβ−ラクタマーゼ；およびリン酸エトポシドとアルカリ性ホスファターゼが挙げられる。
あるいは、標的部位にてプロドラッグを活性化することができるか、または身体の解毒経路を制御することによって通常の治療薬の効果を向上させることができる酵素をハプテンと結合させてもよい。酵素−ハプテン複合体を、プレターゲッティングｂｓＡｂの投与後に被験体に投与し、標的部位に向かわせる。酵素を標的部位に局在させた後、標的部位において作用することが知られている細胞傷害剤またはプレターゲッティング酵素によってin situで薬物に変換されるそのプロドラッグ形態を注射する。上記のように、薬物は、哺乳動物の通常の解毒プロセスを用いて解毒されて毒性の低い中間体、最も一般的にはグルクロニドを形成するものである。解毒された中間体、例えば、グルクロニドはプレターゲッティング酵素によってそのより毒性のある形態に再変換されることにより、標的部位での細胞傷害性が増大する。これにより薬物が再循環する。同様に、投与されたプロドラッグを通常の生物学的プロセスによって活性な薬物に変換することもできる。プレターゲッティング酵素は、解毒された薬物の再循環によって治療効果を向上させる。このアプローチは、どんな酵素−薬物対との併用にも適用することができる。
別の実施態様では、酵素−ハプテン複合体を、患者への投与前にターゲッティングｂｓＡｂと混合することができる。酵素−ハプテン−ｂｓＡｂ複合体が標的部位に局在化し、結合していない複合体が循環からクリアリングされるのに十分な時間が経過した後に、プロドラッグを投与する。上述のように、このプロドラッグは次に、プレターゲッティング酵素によりin situで薬物に変換される。
本発明はさらに、本発明のｂｓＡｂおよび診断薬のホウ素中性子捕獲療法（Boron Neutron Capture Therapy（ＢＮＣＴ）プロトコールにおける使用を意図する。ＢＮＣＴは、腫瘍に局在している１０Ｂ原子の中性子照射によって腫瘍細胞に電離放射線を送達させるように設計された二成分系である。ＢＮＣＴは、安定な同位元素（同位元素が富化された１０Ｂ（１９．８％の天然存在度で存在））を熱中性子照射してα粒子および７Ｌｉ原子核を生成する場合に生じる核反応に基づく。これらの粒子は、約１細胞の直径の路程を有し、それにより高い線形エネルギー移動が得られる。この核反応で生成したごく少数の短距離の１．７ＭｅＶのα粒子で、細胞核をターゲッティングし、それを破壊するのに十分である。癌でＢＮＣＴを成功させるには、腫瘍部位に高濃度の１０Ｂを局所化させつつ、非標的器官を本質的にホウ素の無い状態にしておく必要がある。ＢＮＣＴに向けたプレターゲッティングｂｓＡｂを用いて被験体の腫瘍を処置する組成物および方法については、米国特許第６，２２８，３６２号に記載されており、これは本発明の目的に向けて容易に改変することができる。
本発明の別の実施態様では、ターゲッティング可能な構築物のペプチド主鎖をプロドラッグと結合させる。プレターゲッティングｂｓＡｂを患者に投与し、標的に局在させ、循環を実質的にクリアリングする。適当な時間の後、プロドラッグを含むターゲッティング可能な構築物（例えば、ポリグルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）１０）を与え、それによって薬物を腫瘍標的に特異的に局在させる。腫瘍は、腫瘍内および腫瘍周囲の細胞の高速溶解によって、細胞内供給源から放出される酵素の量を増加させることが分かっている。実施者は、これらの酵素によって活性化することができるプロドラッグを適切に選択することによってこの事実を十分に利用することができる。例えば、カルボキシルエステラーゼは、ポリグルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）１０のエステル結合を切断することによってプロドラッグポリグルタミン酸（ＳＮ−３８−エステル）１０を活性化し、腫瘍において遊離型のＳＮ−３８の濃縮物を大量に放出する。あるいは、好適な酵素を腫瘍部位にターゲッティングすることもできる。
ターゲッティング可能な構築物からの切断後、薬物は腫瘍細胞によってインターナライズされる。あるいは、標的での架橋によって無傷の複合体の一部として薬物をインターナライズすることができる。ターゲッティング可能な構築物は、腫瘍結合ｂｓＡｂのインターナリゼーションを誘導し、それによってインターナライズされるべき薬物のレベルが高まることで治療効果を向上させることができる。
種々のペプチド担体がプロドラッグとの結合に十分に適しており、その担体としては、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン、ポリグルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）（そのＤ−アミノ酸類似体を含む））、コポリマー（例えば、ポリ（Ｌｙｓ−Ｇｌｕ）｛ポリ［ＫＥ］｝）が挙げられ、その比は１：１０〜１０：１が有利である。アミノ酸混合物に基づくコポリマー（例えば、ポリ（Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）（ＫＡＥＹ；５：６：２：１））も使用することができる。規定の分子量のより小さな高分子担体は固相ペプチド合成技術によって作製することができ、２〜５０残基の鎖長のポリペプチドが容易に作製することができる。この種の試薬の第２の利点は、正確な構造定義のほか、鎖内の一定のポイントに１つまたは所望の数の化学結合手を配置することができるということである。これは後に、各部分の選択されたレベルでの認識および治療ハプテンの結合に使用することができる。
ポリ（エチレン）グリコール［ＰＥＧ］は、二重特異性抗体プロドラッグアプローチに望ましいin vivoでの性質を有する。ＳＮ−３８のヒドロキシル基と標準的なジヒドロキシルＰＥＧの両端とのエステル結合を、ＳＮ−３８とＰＥＧのヒドロキシル基との間への二価酸（例えば、コハク酸）の挿入によって導入してＳＮ−３８−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｏ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−ＯＳＮ−３８などの種を合成する。合成されたジ−ＳＮ−３８−ＰＥＧはＳＮ−３８−ポリマープロドラッグのクラスの最も短いメンバーと考えることができる。ＰＥＧ誘導体の所望のin vivoでの性質およびその二量体の機能性のための限られた負荷能力により、Poiani et al.により記載されものような、より高いハプテン保持能を有するＰＥＧコポリマーを作製するに至った。例えば、Poiani et al. Bioconjugate Chem., 5: 621-630,1994参照。ＰＥＧ誘導体を、そのビス（スクシンイミジル）カーボネート誘導体として両端で活性化させ、リジンなどの多官能ジアミンと共重合させる。リシルカルボキシル基が重合プロセスに関与しない（−Ｌｙｓ（ＣＯＯＨ）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＣＯＯＨ）−ＰＥＧ−）ｎ反復単位を含むこのような共重合産物をＳＮ−３８残基の結合に使用することができる。ＳＮ−３８残基を遊離カルボキシル基と反応させ、（−Ｌｙｓ−（ＣＯＯＨ）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ＣＯＯＨ）−ＰＥＧ−）ｎ鎖のＳＮ−３８エステルを生成させる。
認識ハプテンおよびプロドラッグの保持に使用することができる他の合成ポリマーとしては、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＭＰＡ）コポリマー、ポリ（スチレン−コ−マレイン酸／無水物）（ＳＭＡ）、ポリ（ジビニルエーテルマレイン酸無水物）（ＤＩＶＥＭＡ）、ポリエチレンイミン、エトシキ化ポリエチレン−イミン、スターバーストデンドリマーおよびポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）が挙げられる。例として、複数の無水物単位からなるＤＩＶＥＭＡポリマーを限定量のＳＮ−３８と反応させ、ポリマー主鎖に所望の薬物置換率を生じさせる。残存した無水物基を水性条件下で切断して遊離カルボン酸基を生成させる。限定数の遊離カルボン酸基を標準的な水溶性ペプチドカップリング剤（例えば、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いて活性化し、遊離アミノ基を有する認識部分とカップリングさせる。後者の例はヒスタミンであり、これに対する抗体は過去に惹起されている。
種々のプロドラッグをターゲッティング可能な構築物と結合させることができる。ポリマー用途の上記の例は、プロドラッグＣＰＴ−１１（イリノテカン）の活性代謝物ＳＮ−３８と関係する。ＳＮ−３８は、エステラーゼ型酵素に感受性を有するアリールエステルを作製する以上での記述で使用された芳香族ヒドロキシル基を有する。同様に、化学療法で広く使用されるカンプトセシン類似体のトポテカンは、ＳＮ−３８に関して記載されるものと類似の様式で使用してエステラーゼ感受性ポリマー−プロドラッグを生成し得る利用可能な芳香族ヒドロキシル残基を有している。
ドキソルビシンはまた、カンプトセシンファミリーに関して記載されるものと類似の酸触媒反応を用いてカルボン酸含有高分子担体とカップリングすることができる芳香族ヒドロキシル基を含む。同様に、ダウノマイシン、エピルビシンおよびイダルビシンのようなドキソルビシン類似体を、同じ様式でカップリングすることができる。高分子担体との化学的カップリングに十分に活性なアミノ「化学結合手」を有するドキソルビシンおよび他の薬物を、多数の方法においてこれらの遊離アミノ基を介して担体分子と効率的にカップリングすることができる。遊離カルボン酸基を有するポリマーをin situにて活性化し（ＥＤＣ）、活性化したポリマーをドキソルビシンと混合して、薬物をアミド結合を介してポリマーの側鎖と直接結合することができる。ビス（スクシンイミジル）エステル基との反応後に２つのアミドとして２つのアミンを架橋するために、アミノ含有薬物を、市販の切断可能な架橋剤（例えば、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）(EGS, Pierce Chemical Co,, Rockford, IL)またはビス−［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン(BSOCOES, Molecular Biosciences, Huntsville, AL)）を混合することによってアミノペンダントポリマーとカップリングすることもできる。これはこれらの基が依然として酵素による切断に感受性を有しているために有利である。例えば、（ドキソルビシン−ＥＧＳ）ｎ−ポリリジンは、依然として、エステラーゼなどの酵素によるＥＧＳ結合鎖内のジエステル基の酵素切断に感受性を有している。ドキソルビシンはまた、確立された手順（ＨｙＢｎ＝ｐ−Ｈ２ＮＮＨＣ６Ｈ４ＣＯ２Ｈ）を用いて種々のペプチド（例えば、ＨｙＢｎＫ（ＤＴＰＡ）ＹＫ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２）と結合することができる。Kaneko et al., J Biocoyugate Chem., 2: 133-141,1991参照。
１つの好ましい実施態様では、治療複合体はアミン残基を含む担体およびキレート剤（例えば、ＤＴＰＡ）とカップリングしたドキソルビシンを含有してＤＴＰＡ−ペプチド−ドキソルビシン複合体を形成し、ここでは、ＤＴＰＡがプレターゲッティングｂｓＡｂの認識部分となる。いくつかの実施態様では、担体はチロシル−リジンジペプチド、例えば、Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２を含み、Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−ＮＨ２を含むこともできる。治療複合体においては、ビス−ＤＰＴＡ含有ペプチドとのドキソルビシンフェニルヒドラゾン複合体が特に望ましい。
メトトレキセートはまた、ドキソルビシンに関して記載されるものと類似の様式で活性化カルボン酸含有ポリマーとカップリングするのに利用可能なアミノ基を有する。これはアミノ基含有ポリマーとカップリングするために活性化され得る２つのグルタミルカルボキシル基（αおよびγ）も有する。メトトレキセートの遊離カルボン酸基をin situにて活性化し（ＥＤＣ）、活性化した薬物をアミノ含有ポリマーと混合して、薬物を、アミド結合を介してポリマーの側鎖と直接結合することができる。過剰な未反応または交差反応薬物は、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーを用いてポリマー−薬物複合体から容易に分離される。
メイタンシノイドおよびカリケアミシン（例えば、エスペラマイシン）は、切断されて化学操作に有用な単一のチオールを有する種を生成することができる混合ジおよびトリスルフィド結合を含む。チオメイタンシノイドまたはチオエスペラマイシンをまず、ペプチダーゼによる切断に感受性を有するマレイミド−ペプチドなどの架橋剤と反応させる。次いで、ペプチドのＣ末端を活性化し、ポリリジンなどのアミノ含有ポリマーとカップリングする。
さらに別の実施態様では、in vivoでの標的への治療薬またはプロドラッグポリマーの二重特異性抗体により指定される送達を放射性核種の二重特異性抗体送達と組み合わせて、化学療法と放射免疫治療の組合せを達成することができる。各治療薬をターゲッティング可能な構築物と結合させ、同時投与してもよいし、または核種を第１のターゲッティング可能な構築物の一部として与え、薬物を第２のターゲッティング可能な構築物の一部として後のステップで与えてもよい。１つの簡単な実施態様では、単一のプロドラッグと単一の核種を含むペプチドを構築する。例えば、トリペプチドＡｃ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ−ＮＨ２はターゲッティング可能な構築物の担体部分として使用し、それにより、ＳＮ−３８をアリールエステルとしてγグルタミルカルボキシル基と結合させることができる一方、キレートＤＯＴＡをアミドとしてε−アミノ基と結合させて、複合体Ａｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＳＮ−３８）−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＤＯＴＡ）−ＮＨ２を生成することができる。次いで、ＤＯＴＡキレートを画像化および治療目的で種々の金属（Ｉｎ−１１１、Ｙ−９０、Ｓｍ−１５３、Ｌｕ−１７７およびＺｒ−８９を含む）により放射性標識することができる。金属−ＤＯＴＡ複合体はターゲッティング可能な構築物で認識可能なハプテンを提示し得るため、ＤＯＴＡ複合体の一部として使用する金属の唯一の要件は、そのうえ使用する第２の認識抗体が十分に高い親和性で特定の金属−ＤＯＴＡ複合体を認識することである。一般に、この親和性（ｌｏｇＫａ）は６〜１１である。ポリ［Ｄ−Ｇｌｕ（ＳＮ−３８）１０−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｙ−９０−ＤＯＴＡ）２］などの高分子ペプチドは、より化学的に定義された上記の低ＭＷ試薬と同じくらい容易に与えることができ、それらがまさに好ましい。また、認識薬剤が放射免疫治療薬と無関係であるように三置換されたポリマー（例えば、ポリ［Ｄ−Ｇｌｕ（Ｓｎ−３８）１０−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｙ−９０−ＤＯＴＡ）ｎ（ヒスタミン−スクシネート）ｍ］（ここで、ｎおよびｍは整数である））を使用することができる。プロドラッグは、腫瘍部位に存在するカルボキシエステラーゼまたは第２のターゲッティング可能な構築物を使用してその部位を標的化したカルボキシルエステラーゼにより活性化される。
あるいは、別々のステップで化学療法薬および放射免疫治療薬を投与することによって併用療法を行うことができる。例えば、ＣＥＡ−腫瘍を発現している患者にまず、ＣＥＡと特異的に結合する少なくとも１つのアームと、ハプテンがイットリウム−ＤＯＴＡの複合体であるターゲッティング可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１つの別のアームとを有するｂｓＡｂを投与する。その後、患者をイットリウム−ＤＯＴＡ−β−グルクロニダーゼの複合体を含むターゲッティング可能な構築物を用いて処置する。ｂｓＡｂおよび酵素の局在化およびクリアリングに十分な時間の経過後、Ａｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＳＮ−３８）−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｙ−９０−ＤＯＴＡ）−ＮＨ２を含む第２のターゲッティング可能な構築物を与える。第２のターゲッティング可能な構築物は、第１のターゲッティング可能な構築物とまだ結合していない腫瘍のｂｓＡｂによって、腫瘍に局在する。標的部位に局在した第１のターゲッティング可能な構築物は、Ａｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＳＮ−３８）−Ｄ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｙ−９０−ＤＯＴＡ）−ＮＨ２にて作用して遊離したＳＮ−３８薬物を放出する。プロドラッグとその個々の酵素双方の標的部位における局在は、酵素を限定されない基質とすることを保証することによって、活性薬物の生成を促す。この実施態様は、当技術分野で現在実施されている現行のプロドラッグ方法論を著しく改良したものである。
核種を先に与えるターゲッティング可能な構築物の一部として送達させた後、後のステップでプロドラッグ−ポリマーを投与する別の利点は、照射と薬物治療との相乗効果を操作し、それゆえ、その効果を最大にすることができることである。ＰＡＩＴ後の照射損傷により腫瘍がより「漏出性」になると推定される。こうして、ポリマー−プロドラッグを腫瘍により完全でかつ深く侵入させることができる。これにより化学治療が向上する。
あるいは、ＲＡＩＴ治療薬を、ターゲッティング可能な構築物ではなく、ｂｓＡｂと結合させてもよい。例えば、Ｙ−９０−ＤＯＴＡと結合した抗ＣＥＡ×抗ＤＴＰＡをまず、ＣＥＡ発現腫瘍患者に投与する。この例では、抗インジウム−ＤＴＰＡ抗体がイットリウム−ＤＯＴＡキレートと結合しないという点で、特定の抗キレートｍａｂの選択性を利用する。Ｙ−９０−ＤＯＴＡ−抗ＣＥＡ×抗インジウム−ＤＴＰＡを腫瘍にて最大にし、非標的組織を実質的にクリアリングした後に、インジウム−ＤＴＰＡ−グルクロニダーゼの複合体を注射してＣＥＡ腫瘍部位に特異的に局在させる。次いで、患者にポリ（Ｇｌｕ）（ＳＮ−３８）１０などのポリマー−プロドラッグを注射する。腫瘍において後者を活性な単量体ＳＮ−３８へと選択的に切断し、化学治療と先に投与したＲＡＩＴが上手く組み合わされる。
標的部位の抗原に特異的な少なくとも１つの結合部位と、抗体−酵素複合体の酵素成分に特異的な少なくとも１つの別の結合部位とを有する二重特異性抗体または抗体フラグメントを、本方法で使用することができることにもまた注目すべきである。このような抗体は、注射前に酵素と結合することにより、酵素と抗体とが共有結合する必要性を未然に回避することができるし、または、それを注射し、標的部位に局在させることができ、非標的抗体が哺乳類の循環系から実質的にクリアリングされた後に、酵素を、十分な量の酵素が局在する抗体または抗体フラグメントに到達し、それと結合して、in situにて抗体−酵素複合体を形成することができる量および経路で注射することができる。
本発明はまた、特許出願第６０／２２０，７８２号に記載されるような、少なくとも３つの異なる標的結合部位を有する多価標的結合タンパク質の使用も意図することにもまた注目すべきである。多価標的結合タンパク質は、いくつかのＦａｂ様フラグメントを化学的リンカーを介して架橋することによって作製されている。米国特許第５，２６２，５２４号；同第５，０９１，５４２号およびLandsdorp et al., Euro. J. Immunol. 16: 679-83 (1986)参照。また、多価標的結合タンパク質は、いくつかの単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を共有結合して単一ポリペプチドを形成することによっても作製されている。米国特許第５，８９２，０２０号参照。基本的にはｓｃＦｖ分子の凝集物である多価標的結合タンパク質については、米国特許第６，０２５，１６５号および第５，８３７，２４２号で開示されている。３つのｓｃＦｖ分子を含む３価の標的結合タンパク質については、Krott et al., Proten Engineering 10 (4): 423-433 (1997)で記載されている。
ｂｓＡｂの投与とターゲッティング可能な構築物の投与との間に与えられるクリアリング剤を使用することができる。本発明者らは、新規の力学的作用を有するクリアリング剤（すなわち、ｂｓＡｂの疾病標的アームに対して向けられるグリコシル化抗イディオタイプＦａｂ’フラグメント）を本発明で使用することができることを発見した。抗ＣＥＡ（ＭＮ−１４Ａｂ）×抗ペプチドｂｓＡｂを与え、疾病標的中で最大限の範囲まで付着させることができる。残るｂｓＡｂをクリアリングするために、ＷＩ２と呼ばれるＭＮ−１４に対する抗イディオタイプＡｂを、好ましくは、グリコシル化Ｆａｂ’フラグメントとして与える。クリアリング剤が一価でｂｓＡｂと結合する一方で、その付加グリコシル残基が全ての複合体を肝臓に向け、そこで迅速な代謝が行われる。次いで、ターゲッティング可能な構築物と結合した治療薬または診断薬を被験体に与える。ｂｓＡｂのＭＮ−１４アームに対するＷＩ２ Ａｂは、ＷＩ２−Ｆａｂ’が一価部分であることから、架橋に関与しないために、高い親和性を有し、クリアリング機構は他の開示された機構（Goodwin et al., 前記参照）とは異なっている。
本発明のさらに別の態様によれば、本発明は、患者の罹患組織の治療または同定に好適なキットであって、標的組織と特異的に結合する少なくとも１つのアームとターゲッティング可能な構築物と特異的に結合する少なくとも１つの別のアームを有する二重特異性抗体または抗体フラグメント、二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの別のアームによって認識可能な少なくとも１つのエピトープを含むか有する担体部分を含む第１のターゲッティング可能な構築物、１以上の複合した治療薬もしくは診断薬、または酵素、ならびに、所望により、非局在化抗体および抗体フラグメントをクリアリングするのに有用なクリアリング組成物を含むキットを提供する。第１のターゲッティング可能な構築物が、標的部位にてプロドラッグを薬物へと変換することができる酵素、薬物の解毒された中間体を有毒形態に再変換し、その結果、標的部位にて薬物の毒性を増強し得る酵素、または自然プロセスを通じて患者中で活性化され、毒性の低い中間体への変換による解毒を受けるプロドラッグを、解毒された中間体から毒性ある形態へと再変換し、その結果、標的部位にて薬物の毒性を増強し得る酵素を含む場合、キットは、所望により、プロドラッグを含んでいてもよい。また、二重特異性抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの別のアームによって認識可能な少なくとも１つのエピトープを含むか有する担体部分、酵素が標的部位にてプロドラッグを薬物へと変換することができる場合には、プロドラッグを含む第２のターゲッティング可能な構築物も使用し得る。罹患組織の同定または治療を容易にする手段もキットに含めることができる。例として、限定されるものではないが、シリンジなどの適用装置が挙げられる。罹患組織の同定または治療用に開示された本発明の利用に必要な溶液もキットに含めることができる。
ターゲッティング可能な構築物または抗体フラグメントは、静脈内、動脈内、術中、内視鏡的、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内投与、局所カテーテルによる潅流、または直接病変内局注により、持続注入または単一もしくは複数のボーラスにより、あるいは罹患組織の診断（検出）および治療に向けた当業者には公知のその他の方法によっても投与可能である。さらに、ターゲッティング可能な構築物は、罹患組織の検出および治療のための他の方法に向けた薬剤を含んでもよい（限定されるものではないが、これまでに記載されたような、超音波検査で使用するデキストランまたはリポソーム製剤のターゲッティング可能な構築物との複合体、またはＸ線、ＣＴ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴおよび超音波検査などの他の画像診断技術で使用する他の造影剤など）。
VI．抗体産生方法
ペプチド主鎖および／またはハプテンに対するＡｂは、Ａｂ産生に関する周知の方法によって作製される。例えば、正常な免疫能を有する動物にフロイントの完全アジュバント中の免疫原、例えば、（ペプチド）ｎ−ＫＬＨ（ここで、ＫＬＨはキーホールリンペットヘモシアニンであり、かつｎ＝１〜３０）を注射し、続いて、フロイントの不完全アジュバント中に懸濁した同じ免疫原を２回注射し、抗原のｉ．ｖ．追加免疫の３日後に脾臓細胞を回収した。次いで、回収した脾臓細胞を、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合し、得られたクローンの培養物上清を、直接結合ＥＬＩＳＡにより抗ペプチド反応性について解析する。産生したＡｂの詳細な特異性は、最初の免疫原のペプチド断片を用いて解析することができる。これらの断片は、自動ペプチド合成装置によって容易に作製することができる。Ａｂ産生では、酵素欠損ハイブリドーマを単離して融合細胞株を選択することができる。この技術を使用してリンカー（例えば、Ｉｎ（III）−ＤＴＰＡキレート）を含む１以上のキレートに対する抗体を惹起することもできる。Ｉｎ（III）−ジ−ＤＴＰＡに対するマウスモノクローナル抗体が公知である（Barbet'395、前掲）。
本発明において使用する抗体は、マーカー物質として種々の細胞表面または細胞内腫瘍関連抗原に特異的である。これらのマーカーは、腫瘍によって生じる物質であってもよいし、腫瘍部位に、腫瘍細胞表面上に、または腫瘍細胞（細胞質、核または種々の細胞小器官もしくは細胞以下の構造を問わない）内に蓄積する物質であってもよい。このような腫瘍関連マーカーのうち、Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", in Fleisher ed., "The Clinical Biochemistry of Cancer", page 347(American Association of Clinical Chemists, 1979)により、ならびに米国特許第４，１５０，１４９号；同第４，３６１，５４４号；および第同４，４４４，７４４号に開示されるものである。Thorpe et al.の米国特許第５，９６５，１３２号、Thorpe et al.の米国特許第６，００４，５５４号、Epstein et al.の米国特許第６，０７１，４９１号、Epstein et al.の米国特許第６，０１７，５１４号、Epstein et al.の米国特許第５，８８２，６２６号、Epstein et al.の米国特許第５，０１９，３６８号、および Thorpe et al.の米国特許第６，３４２，２２１号も参照。これらは全て、引用することにより本明細書の一部とされる。
腫瘍関連マーカーは、Herberman, 前掲によって、癌胎児性抗原、胎盤抗原、発癌または腫瘍ウイルス関連抗原、組織関連抗原、器官関連抗原、異所性ホルモンおよび正常抗原もしくはその変異体をはじめとする数多くのカテゴリーに分類されている。腫瘍関連マーカーのサブユニットを使用して腫瘍特異性（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のβ−サブユニットまたは癌胎児性抗原（ＣＥＡの）γ領域）の高い抗体を惹起することが時に有利であり、米国特許第４，３６１，６４４号および同第４，４４４，７４４号で開示されるように、非腫瘍物質との交差反応性が極めて低い抗体の産生が刺激される。また、腫瘍血管構造（例えば、ＶＥＧＦ）マーカー、腫瘍壊死（エプステインの特許）マーカー、膜受容体（例えば、葉酸受容体、ＥＧＦＲ）マーカー、トランスメンブラン抗原（例えば、ＰＳＭＡ）マーカー、および癌遺伝子産物マーカーは、抗体または抗体フラグメントの好適な腫瘍関連標的としての役割も果たし得る。腫瘍細胞で豊富に発現されるＢ細胞複合抗原などの正常細胞構成要素のマーカー（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、およびＢ細胞悪性腫瘍のＨＬＡ−ＤＲ）、ならびに特定の腫瘍細胞で発現されるサイトカイン（例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍のＩＬ−２受容体）もまた、本発明の抗体および抗体フラグメントの好適な標的である。本発明の抗体および抗体フラグメントによって標的化することができる他の周知の腫瘍関連抗原としては、限定されるものではないが、ＣＥＡ、ＣＳＡｐ、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＢｒＥ３、ＰＡＭ−４、ＫＣ−４、Ａ３、ＫＳ−１、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、テネイシン、Ｔ１０１、Ｓ１００、ＭＡＧＥ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、およびＣＤ７４が挙げられる。
対象となる別のマーカーとして、トランスメンブランアクチベーターおよびＣＡＭＬ−インタラクター（ＴＡＣＩ）がある。Yu et al. Nat Immunol. 1: 252-256 (2000)参照。簡潔には、ＴＡＣＩはＢ細胞悪性腫瘍（例えば、リンパ腫）のマーカーである。さらに、ＴＡＣＩおよびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）が腫瘍壊死因子相同体、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）と結合することは公知である。ＡＰＲＩＬは、一次ＢおよびＴ細胞のin vitro増殖を刺激し、in vivoでのＢ細胞の蓄積により脾臓重量が増加する。また、ＡＰＲＩＬは受容体結合に関してＴＡＬＬ−１（ＢＬｙＳまたはＢＡＦＦとも呼ばれる）と競合する。可溶性ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩはＡＰＲＩＬの結合を特異的に妨げ、ＡＰＲＩＬにより刺激される一次Ｂ細胞の増殖を遮断する。ＢＣＭＡ−Ｆｃは、マウスにおいてキーホールリンペットヘモシアニンおよびニューモバックスに対する抗体の産生も阻害し、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを介するＡＰＲＩＬおよび／またはＴＡＬＬ−１シグナル伝達が体液性免疫の生起に必要であることがわかる。このように、ＡＰＲＩＬ−ＴＡＬＬ−１およびＢＣＭＡ−ＴＡＣＩがＢおよびＴ細胞機能の刺激に関係する２リガンド−２受容体経路を構成している。
免疫原に対する抗体の最初の惹起後、抗体を配列決定し、その後、組換え技術によって製造することができる。ネズミ抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は当業者に周知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域由来のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに導入し、次いで、ネズミ対応物のフレームワーク領域内でヒト残基と置換することによって作製される。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分を使用することで、ネズミ定常部の免疫原性に関する潜在的な問題が排除される。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローニングする一般的方法は、例えば、各々引用することにより本明細書の一部とされるOrlandi et al.の刊行物、Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989)に記載されている。ヒト化Ｍａｂの作製技術は、例えば、Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992)、およびSinger et al., J. Immun. 150: 2844 (1993)に記載されており、その各々が引用することにより本明細書の一部とされる。
あるいは、完全なヒトの抗体を、トランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。例えば、Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997)；米国特許第５，６３３，４２５号参照。例えば、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収することができる。マウス体液性免疫系を、内在性免疫グロブリン遺伝子を不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによってヒト化する。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、非常に複雑で、ヒトゲノムのほぼ０．２％を占める多数の不連続なセグメントを含む。トランスジェニックマウスにより確実に抗体の十分なレパートリーを作製し得るように、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座の大部分をマウスゲノムに導入しなければならない。これは段階的プロセスによって達成され、生殖細胞系配置中にヒト重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成によって開始される。各挿入断片の大きさが約１Ｍｂであるため、ＹＡＣ構築には免疫グロブリン遺伝子座の重複断片の相同組換えが必要である。２つのＹＡＣ（一方は重鎖遺伝子座を含み、他方は軽鎖遺伝子座を含む）を、ＹＡＣ含有酵母スフェロブラストとマウス胚幹細胞との融合を介してマウスに個別に導入する。次いで、胚幹細胞クローンをマウス胚盤胞にマイクロインジェクションする。得られた雄キメラを、その生殖細胞系によってＹＡＣを伝達する能力についてスクリーニングし、ネズミ抗体産生不全マウスと交配させる。２つのトランスジェニック系統（一方はヒト重鎖遺伝子座を含み、他方はヒト軽鎖遺伝子座を含む）の交配により、免疫化に応答するヒト抗体を産生する子孫を作製する。
非再配列ヒト免疫グロブリン遺伝子を、微小細胞媒介性染色体導入（ＭＭＣＴ）を介してマウス胚幹細胞に導入することもできる。例えば、Tomizuka et al., Nature Genetics, 16: 133 (1997)参照。この方法では、ヒト染色体を含む微小細胞をマウス胚幹細胞と融合する。導入された染色体は安定に維持され、成体キメラは好適な組織特異的発現を示す。
あるいは、本発明の抗体または抗体フラグメントを、コンビナトリアル免疫グロブリンライブリーから単離されたヒト抗体フラグメントから誘導してもよい。例えば、引用することにより本明細書の一部とされる、Barbas et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119 (1991)、およびWinter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433 (1994)参照。Ｂ細胞の不死化によるモノクローナル抗体の作製に関連する多くの問題は、ファージディスプレーを用いて大腸菌(E.coli)中の抗体フラグメントを操作し、発現させることによって克服することができる。高親和性モノクローナル抗体を確実に回収するために、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーは幅広いレパートリーサイズであるべきである。典型的な戦略は、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成するために免疫化マウスのリンパ球または脾臓細胞から得たｍＲＮＡを利用する。重鎖および軽鎖遺伝子をＰＣＲで個別に増幅し、ファージクローニングベクターに連結する。２つの異なるライブラリー（一方は重鎖遺伝子を含み、他方は軽鎖遺伝子を含む）を作製する。ファージＤＮＡを各ライブラリーから単離し、重鎖および軽鎖配列をともに連結し、パッケージングしてコンビナトリアルライブラリーを作製する。各ファージは重鎖ｃＤＮＡと軽鎖ｃＤＮＡとの無作為な対を含み、大腸菌の感染の際に感染細胞での抗体鎖の発現を指示する。目的の抗原を認識する抗体を同定するために、ファージライブラリーをプレーティングし、プラーク中に存在する抗体分子をフィルターへ移す。フィルターを放射性標識抗原とともにインキュベートした後、洗浄して過剰の結合していないリガンドを除去する。オートラジオグラムによる放射性スポットにより、抗原と結合している抗体を含むプラークを同定する。ヒト免疫グロブリンファージライブラリーの作製に有用なクローニングベクターおよび発現ベクターを、例えば、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥクローニングシステム(La Jolla, CA)から得ることができる。
類似の戦略を用いて高親和性のｓｃＦｖを得ることができる。例えば、Vaughn et al., Nat. Biotechnol., 14: 309-314 (1996)参照。幅広いレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリーを、全ての公知のＶＨ、ＶκおよびＶλ遺伝子ファミリーに相当するＰＣＲプライマーを用いて非免疫化ヒト供与体由来のＶ遺伝子を単離することによって構築することができる。増幅後、ＶκおよびＶλプールを合わせて１つのプールとする。これらのフラグメントをファージミドベクターに連結する。次いで、ｓｃＦｖリンカー（Ｇｌｙ４、Ｓｅｒ）３をＶＬフラグメントの上流のファージミドに連結する。ＶＨおよびリンカー−ＶＬフラグメントを増幅し、ＪＨ領域で構成する。得られたＶＨ−リンカー−ＶＬフラグメントをファージミドベクターに連結する。ファージミドライブラリーを上記のようにフィルターを用いるか、免疫チューブ(Nunc; Maxisorp)を用いてパンニングする。免疫化ウサギのリンパ球または脾臓細胞由来のコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを構築することによって、また、P.pastorisでｓｃＦｖ構築物を発現させることによって類似の結果を達成することができる。例えば、Ridder et al., Biotechnology, 13: 255-260 (1995)参照。さらに、好適なｓｃＦｖの単離後、結合親和性が高く、解離速度が遅い抗体フラグメントをＣＤＲ３突然変異誘発および鎖のシャッフリングなどの親和性成熟プロセスによって得ることができる。例えば、Jackson et al., Br. J. Cancer, 78: 181-188 (1998); Osbourn et al., Immunotechnolog, 2: 181-196 (1996)参照。
抗体フラグメントの別の形態が単一のＣＤＲをコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡ由来の可変領域を合成することによって作製される。例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995);およびWard et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES; PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995)参照。
ｂｓＡｂを当技術分野で公知の技術によって調製することができる。例えば、抗ＣＥＡ腫瘍Ａｂおよび抗ペプチドＡｂを個別にペプシンで消化してそれぞれＦ（ａｂ’）２を得る。抗ＣＥＡ−Ａｂ−Ｆ（ａｂ’）２をシステインで還元してＦａｂ’単量体単位を作製し、これを架橋剤ビス（マレイミド）ヘキサンとさらに反応させてＦａｂ’−マレイミド部分を作製する。抗ペプチドＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２をシステインで還元し、精製し、回収した抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨを抗ＣＥＡ−Ｆａｂ’−マレイミドと反応させてＦａｂ’×Ｆａｂ’二重特異性Ａｂを作製する。あるいは、抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨフラグメントを抗ＣＥＡ Ｆ（ａｂ’）２とカップリングしてＦ（ａｂ’）２×Ｆａｂ’構築物を作製するか、抗ＣＥＡ ＩｇＧとカップリングしてＩｇＧ×Ｆａｂ’二重特異性構築物を作製する。１つの実施態様では、ＩｇＧ×Ｆａｂ’構築物を、過ヨウ素酸塩で酸化し、続いて、市販のヒドラジン−マレイミド架橋剤との反応によって活性化した抗ＣＥＡ ＩｇＧ重鎖炭水化物への抗ペプチドＦａｂ’チオール基の付着により部位特異的に調製することができる。使用した成分Ａｂを公知の技術によってキメラ化またはヒト化することができる。キメラ抗体は齧歯動物由来の可変ドメインおよび相補性決定領域領域を含む組換えタンパク質であり、抗体分子の残りの部分はヒト抗体由来である。ヒト化抗体はモノクローナル抗体のネズミ相補性決定領域がネズミ免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域からヒト可変ドメインに導入された組換えタンパク質である。
種々の組換え法を使用して二重特異性抗体および抗体フラグメントを作製することができる。例えば、二重特異性抗体および抗体フラグメントをトランスジェニック家畜の乳汁中で作製することができる。例えば、Colman, A., Biochem. Soc. Symp., 63: 141-147, 1998; 米国特許第５，８２７，６９０号参照。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖対をコードするＤＮＡセグメントをそれぞれ含む２つのＤＮＡ構築物を調製する。フラグメントを、哺乳類上皮細胞において優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクターにクローニングする。例としては、限定されるものではないが、ウサギ、ウシおよびヒツジカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、ならびにマウスホエイ酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。好ましくは、挿入したフラグメントは、哺乳類特異的遺伝子由来の同起源のゲノム配列のその３’側にフランキングしている。これにより、ポリアデニル化部位および転写安定配列が提供される。発現カセットを受精した哺乳類の卵子の前核に同時注入し、これを、その後、受容体である雌の子宮に移植し、懐胎させる。出産後、その子孫をサザン解析により両トランスジーンの存在についてスクリーニングする。抗体が存在するためには、重鎖および軽鎖遺伝子いずれもが同一細胞で同時に発現されなければならない。当技術分野では公知の標準的な免疫学的方法を使用し、トランスジェニック雌由来の乳汁を抗体または抗体フラグメントの存在および機能性について解析する。抗体は当技術分野で公知の標準的な方法により乳汁から精製することができる。
キメラＡｂは、マウス軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡ断片の、ヒト抗体由来のＣドメインをコードする断片への連結によって構築される。Ｃドメインは抗原結合に寄与しないため、キメラ抗体は起源のマウスＡｂと同一の抗原特異性を維持するが、配列はヒト抗体により近い。キメラＡｂは、いくつかのマウス配列を依然含んでいるが、なお免疫原性である。ヒト化Ａｂは、抗原を認識するのに必要なマウスアミノ酸のみを含む。この産物は、ヒト抗体フレームワークにマウス相補性決定領域由来のアミノ酸を確立することによって構築する。
他のｂｓＡｂ作製方法としては、より一般的な免疫グロブリンイソタイプよりも強く架橋するように、さらなるシステイン残基を有する人工組換えＡｂが挙げられる。例えば、FitzGerald et al., Protein Eng. 10 (10): 1221-1225, 1997参照。別のアプローチは、必要な二重特異性を有する２以上の異なる単鎖抗体または抗体フラグメントと連結した組換え融合タンパク質を操作することである。例えば、Coloma et al., Nature Biotech. 15: 159-163, 1997参照。分子操作を用いて種々の二重特異性融合タンパク質を作製することができる。一形態では、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば、１つの抗原に対して１つの結合部位を有するｓｃＦｖと第２の抗原に対して１つの結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。別の形態では、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、１つの抗原に対して２つの結合部位を有するＩｇＧと第２の抗原に対して２つの結合部位を有するｓｃＦｖからなる。
ダイアボディーとも呼ばれる機能的二重特異性単鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）を、組換え法を用いて哺乳類細胞で作製することができる。例えば、Mack et al., Proc. Natl, Acad. Sci., 92: 7021-7025, 1995参照。例えば、組換え法を用いたグリシン−セリンリンカーを介する２つの単鎖Ｆｖフラグメントの連結によってｂｓｃＡｂを作製する。目的の２つの抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）およびＶ重鎖（ＶＨ）ドメインを標準的なＰＣＲ法を用いて単離する。次いで、各ハイブリドーマから得たＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを連結して２ステップ融合ＰＣＲにて単鎖フラグメントを形成する。第１のＰＣＲステップにより、（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ１）３リンカーを導入し、第２のステップにより、ＶＬおよびＶＨアンプリコンを連結する。次いで、各単鎖分子を細菌発現ベクターにクローニングする。増幅後、単鎖分子の１つを切り出し、目的の第２の単鎖分子を含む他のベクターにサブクローニングする。得られたｂｓｃＡｂフラグメントを真核生物発現ベクターにサブクローニングする。機能タンパク質発現は、ベクターをチャイニーズハムスター卵巣細胞にトランスフェクトすることにより得ることができる。二重特異性融合タンパク質は同様に調製される。二重特異性単鎖抗体および二重特異性融合タンパク質は本発明の範囲内に含まれる。
２以上の異なる単鎖抗体または抗体フラグメントを結合した二重特異性融合タンパク質を同様に作製する。
組換え法を用いて種々の融合タンパク質を作製することができる。例えば、ヒト化モノクローナル抗ＣＥＡ抗体由来のＦａｂフラグメントとネズミ抗ジＤＴＰＡ由来のｓｃＦｖを含む融合タンパク質を作製することができる。フレキシブルリンカー（例えば、ＧＧＧＳ）によりｓｃＦｖを抗ＣＥＡ抗体の重鎖の定常部に連結する。あるいは、ｓｃＦｖをｈＭＮ−１４の軽鎖の定常部に連結することができる。ｓｃＦｖへの重鎖Ｆｄのインフレームでの連結に必要な好適なリンカー配列をＰＣＲ反応を通じてＶＬおよびＶＫドメインに導入する。次いで、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡ断片を、ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含むステージングベクターに連結する。得られたｓｃＦｖ−ＣＨ１構築物を切り出し、抗ＣＥＡ抗体のＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列を含むベクターに連結する。得られたベクターを使用して二重特異性タンパク質発現用の哺乳類細胞にトランスフェクトすることができる。
大腸菌発現系を用いて大量のｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質を作製することができる。例えば、Zhenping et al., Biotechnology, 14 :192-196, 1996参照。機能的なｂｓｃＡｂを、２つのフラグメントのＶＬおよびＶＨドメインが異なるポリペプチド鎖に存在する２つの「交差」ｓｃＦｖフラグメントの大腸菌における同時発現によって作製することができる。目的の２つの抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）およびＶ重鎖（ＶＨ）ドメインを標準的なＰＣＲ法を用いて単離する。次いで、ｃＤＮＡを、目的の第１の抗体のＶＬドメインのＣ末端をリンカーを介して第２の抗体のＶＨドメインのＮ末端に連結するように細菌発現ベクターに連結する。同様に、目的の第２の抗体のＶＬドメインのＣ末端をリンカーを介して第１の抗体のＶＨドメインのＮ末端に連結する。得られた二シストン型んのオペロンを、強力なプロモーター（例えば、リン酸塩欠乏によって誘導される大腸菌アルカリ性ホスファターゼプロモーター）の転写制御下に置く。あるいは、単鎖融合構築物を、ｌａｃプロモーターおよび２％グリシンおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００からなる培地を用いて大腸菌で首尾よく発現させた。例えば、Yang et al.,Appl. Environ. Microbiol., 64: 2869-2874, 1998参照。大腸菌の熱安定性エンテロトキシンIIシグナル配列を使用してペプチドを周縁質空間に向ける。分泌後、２つのペプチド鎖は会合して両方の抗原結合特異性を有する非共有結合ヘテロダイマーを形成する。ｂｓｃＡｂは当技術分野で公知の標準的手順（例えば、ブドウ球菌プロテインＡクロマトグラフィー）を用いて精製する。
機能的ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質をトランスジェニック家畜の乳汁中で作製することもできる。例えば、Colman, A., Biochem. Soc. Symp., 63: 141-147, 1998; 米国特許第５，８２７，６９０号参照。上記のように得たｂｓｃＡｂフラグメントを、哺乳類上皮細胞において優先的に発現するプロモーター配列を含む発現ベクターにクローニングする。例として、限定されるものではないが、ウサギ、ウシおよびヒツジカゼイン遺伝子、ウシα−ラクトグロブリン遺伝子、ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子、ならびにマウスホエイ酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。好ましくは、挿入したｂｓｃＡｂは、哺乳類特異的遺伝子由来の同起源のゲノム配列のその３’側にフランキングしている。これにより、ポリアデニル化部位および転写安定配列が提供される。次いで、発現カセットを受精した哺乳類の卵子の前核に注入し、これを、その後、受容体である雌の子宮に移植し、懐胎させる。出産後、その子孫をサザン解析により導入したＤＮＡの存在についてスクリーニングする。当技術分野では公知の標準的な免疫学的方法を使用し、トランスジェニック雌由来の乳汁をｂｓｃＡｂの存在および機能性について解析する。ｂｓｃＡｂは当技術分野では公知の標準的な方法により乳汁から精製することができる。乳汁中でｂｓｃＡｂのトランスジェニック産生により、大量のｂｓｃＡｂの効率的な取得法が提供される。
機能的ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質をトランスジェニック植物で作製することもできる。例えば、Fiedler et al., Biotech., 13: 1090-1093, 1995; Fiedler et al., Immunotechnology, 3: 205-216, 1997参照。このように作製することにより、いくつかの利点（低価格、大量生産および安定した長期保存など）が付与される。タンパク質を小胞体に向けるために、上記のように得たｂｓｃＡｂフラグメントを、プロモーター配列を含み、シグナルペプチド配列をコードする発現ベクターにクローニングする。種々のプロモーターを利用して、発現産物を植物内の特定の位置に向けることができる。例えば、タバコ植物における遍在的な発現は、強力なカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを用いて達成することができ、器官特異的発現は種子特異的レグミンＢ４プロモーターを介して達成される。発現カセットを当技術分野で公知の標準的な方法によって形質転換する。形質転換をサザン解析によって評価する。当技術分野で公知の標準的な免疫学的方法を使用し、トランスジェニック植物をｂｓｃＡｂの存在および機能性について解析する。ｂｓｃＡｂは当技術分野で公知の標準的な方法を用いて植物組織から精製することができる。
さらに、トランスジェニック植物は、ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質の長期保存を容易にする。機能的に活性なｓｃＦｖタンパク質を、室温で１週間保存後にタバコの葉から抽出した。同様に、室温で１年間保存したトランスジェニックタバコ種子には、ｓｃＦｖタンパク質またはその抗原結合活性の喪失は認められない。
機能的ｂｓｃＡｂおよび融合タンパク質を昆虫細胞で作製することもできる。例えば、Mahiouz et al., J. Immunol. Methods, 212: 149-160 (1998)参照。昆虫に基づく発現系により、大量の均質で適切に折りたたまれたｂｓｃＡｂの作製産生手段が提供される。バキュロウイルスは広く使用されている昆虫細胞の発現ベクターであり、組換え抗体分子に首尾よく適用されてきた。例えば、Miller, L. K., Ann. Rev. Microbiol., 42: 177 (1988) ;Bei et al., J. Immunol. Methods, 186: 245 (1995)参照。あるいは、誘導プロモーターの転写制御下でのｂｓｃＡｂ構築物を含む安定な昆虫細胞株を作製することにより誘導発現系を利用することができる。例えば、Mahiouz et al., J. Immunol. Methods, 212: 149-160 (1998)参照。上記のように得たｂｓｃＡｂフラグメントをキイロショウジョウバエ(Drosophila)メタトチオネインプロモーターおよびヒトＨＬＡ−Ａ２リーダー配列を含む発現ベクターにクローニングする。次いで、構築物をキイロショウジョウバエ(D. melanogaster) ＳＣ−２細胞にトランスフェクトする。細胞を多量の銅、亜鉛、またはカドミウムに暴露することによって発現を誘導する。当技術分野で公知の標準的な免疫学的方法を使用して、ｂｓｃＡｂの存在および機能性を判定する。精製ｂｓｃＡｂは当技術分野で公知の標準的な方法を用いて得られる。
本発明の好ましい二重特異性抗体は、ＭＡｂ Ｍｕ−９のＦｖとＭＡｂ ６７９のＦｖまたはＭＡｂ ＭＮ−１４のＦｖとＭＡｂ ６７９のＦｖ、ならびにそれらのヒトキメラ化またはヒト化対応物を組み込んだものである。ＭＮ−１４、ならびにそのキメラ化およびヒト化対応物については、米国特許第５，８７４，５４０号で開示されている。また、Ｍｕ−９または６７９の１以上のＣＤＲを組み込んだ二重特異性抗体も好ましい。また、抗体は融合タンパク質であり得るし、またはクラス−III 抗ＣＥＡ抗体および６７９のＦｖを組み込んだ二重特異性抗体であり得る。クラス−III 抗ＣＥＡをはじめとするクラス−III 抗体については、米国特許第４，８１８，７０９号で詳細に記載されている。６７９はＵＳ２００３０１１３３３３ＡおよびＵＳ２００２０００６３７９で開示されている。
VII．他の応用
本発明は、米国特許第６，０９６，２８９号で記載されているような、上記のターゲッティング可能な構築物と結合するｂｓＡｂおよび治療薬または診断薬の術中、血管内、内視鏡における腫瘍および病巣の検出、生検ならびに治療における使用を包含する。
本発明の抗体および抗体フラグメントは、治療および画像化の目的だけでなく、in vitro研究の実施における補助手段として使用することができる。例えば、本発明のｂｓＡｂをin vitroにて使用して、ターゲッティング可能な構築物が１以上のｂｓＡｂと安定した複合体を形成することができるかどうかを確かめることができる。このようなアッセイは、ｂｓＡｂと安定した複合体を形成するターゲッティング可能な構築物の同定において当業者の手助けとなる。これにより、当業者は治療薬および／または造影剤として優れていると考えられるターゲッティング可能な構築物の同定が可能になる。
アッセイは問題のターゲッティング可能な構築物を少なくとも２モル等量のｂｓＡｂと合わせることによって実施することが有利である。インキュベーション後、混合物をサイズ排除ＨＰＬＣにより分析して構築物がｂｓＡｂと結合しているかどうかを判定する。あるいは、アッセイを標準的なコンビナトリアル法を使用して実施する（ここで、 種々のｂｓＡｂ溶液を標準９６ウェルプレートに入れる）。各ウェルに、ターゲッティング可能な構築物の溶液を添加する。インキュベートし、分析した後、構築物がどのｂｓＡｂと最良の結合をするかが容易に判定できる。
当然のことではあるが、ｂｓＡｂのターゲッティング可能な構築物への添加順序は重要でない、すなわち、ｂｓＡｂを構築物に添加してもよいし、逆の場合も同じである。また、ｂｓＡｂも構築物も溶解状態である必要はない、すなわち、それらは、溶解状態またはストレートのいずれか都合のよい方法で添加してよい。最後に、結合が確立されさえすれば、結合についての解析方法は重要でない。よって、限定されるものではないが、サイズ排除ＨＰＬＣと合わせた、もしくはその代わりの、ＦＡＢＭＳ、高電界型ＮＭＲ、または他の好適な方法をはじめとする標準的な解析方法を使用して結合について解析し得る。
以下、本発明を実施例により説明するが、これらは何ら限定されるものではない。
ＩＭＰ２８１の標識
以下のペプチド：（ＭＨ＋：１３６１）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２を１１１Ｉｎで標識した。
さらに、このペプチドを、標識後、３７℃で２０時間にわたるヒト血清（それまでは冷凍）中での安定性に関して試験した。この試験により、ペプチドは安定なままであることが示された。また、ＩＭＰ２８１を、ヒト化抗体ｍ６７９×ｈＭＮ１４との結合に関して試験した。Ｉｎ−１１１標識ペプチドを逆相ＨＰＬＣ系とサイズ排除ＨＰＬＣ系の双方で分析した。
ＩＭＰ２８１の合成
このペプチドを、標準的なＦｍｏｃ合成法を用い、リンクアミド樹脂（２．０１５９ｇ，０．７ｍｍｏｌ／ｇ）上での固相ペプチド合成により合成した（ＮＢ Ｒｅｆ．ＣＮ２−３４）。以下のアミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨおよびＤＯＴＡ−トリス（ｔ−ブチル）エステル（１回の結合につき６当量）を示された順序で加えた。各アミノ酸を、活性化剤としてまずジイソプロピルカルボジイミドを用いた２時間のカップリング、次にＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）を用いたカップリングで二重にカップリングした。次に、通常の方法でＰｄ触媒を用いてＡｌｏｃ側鎖を除去し、そのトリチル−ＨＳＧ−ＯＨをリシン側鎖と二重にカップリングした。ＴＦＡを用いて樹脂からペプチドを切断し、エーテル中で沈殿させ、ＨＰＬＣにより精製し、目的のペプチドを得た。合成の成功はＥＳＭＳ分析、ＭＨ＋：１３６１により確認した。目的生成物の全収量は６画分で２９８．８ｍｇであった。これら６画分のうち４画分は、２０１．３ｍｇ量の純粋なペプチドを含んでいるが、残りの２画分は若干の不純物を含み、総量９７．５ｍｇである。
ＩＭＰ２８１溶液
ペプチド（３．５ｍｇ）を１１６９μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃバッファー（ｐＨ３．９８，Ｒｅｆ．ＢＭ１０−９１）と合わせ、終濃度２．２×１０−３Ｍとした。
ＩＭＰ２８１の標識（図１および２）
ねじ蓋付きプラスチックバイアル中、２．５μＬのＩＭＰ２８１溶液および１５０μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃバッファー（ｐＨ３．９８，Ｒｅｆ．ＢＭ１０−９１）に１１１ＩｎＣｌ３（６．３μＬ）を加えた。このバイアルを鉛の容器に入れ、１５分間沸騰水浴中に浸漬した。プラスチックバイアルを取り出し、室温に戻した。次に、この標識ペプチドを逆相ＨＰＬＣおよびサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。クロマトグラム（図１および２）は、ペプチドが十分標識されていることを示した。この溶液のペプチド濃度は３．４６３×１０−４Ｍであった。
ヒト血清中の１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８１（図３）
標識ペプチドとヒト血清（それまでは冷凍）の（１：９）混合物を作製し、３７℃でインキュベートした。１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８１溶液（７０μＬ）および６３０μＬのヒト血清を合わせ、ボルテックスにかけた。これを一定温度で２０時間維持し、ｔ０＝０時間、ｔ１＝１．３時間、ｔ２＝２．５時間およびｔ３＝２０時間に逆相ＨＰＬＣに注入した。この標識ペプチドは、ヒト血清中で混合しても何ら変化を受けなかったことが明らかである。この混合物のペプチド濃度は３．４６３×１０−５Ｍであった。
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８１と抗体の結合（図４）
標識ペプチド（０．５μＬ）混合物を４．３３μＬのｍ６７９×ｈＭＮ１４抗体（抗体／ペプチド比１０：１）および９９５μＬの０．９％生理食塩水と合わせた。この溶液をボルテックスにかけ、サイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。クロマトグラムは、いくらかの一抗体がペプチドと結合していたものの、ほとんど二抗体が結合していたことを示す。
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８１ｗ／抗体とヒト血清（図５および６）
ヒト血清（５．０μＬ）中、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８１を、４．３３μＬのｍ６７９×ｈＭＮ１４抗体（抗体／ペプチド比１０：１）および９９０μＬの０．９％生理食塩水に加えた。この混合物をボルテックスにかけ、２時点（１時間と２０時間）でサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。これらの結果は、抗体単独を用いたペプチドの場合と同等であると思われた。
ＩＭＰ２８４の標識
以下のペプチド：（ＭＨ＋：１４７１）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２を１１１Ｉｎで標識した。
さらに、このペプチドを、標識後、ヒト血清中で２１時間、また、マウス血清中で１９時間にわたる安定性に関して試験した。この試験により、ペプチドは安定なままであることが示された。また、ＩＭＰ２８４を、ヒト化抗体ｍ６７９×ｈＭＮ１４との結合に関して試験した。この検討には逆相ＨＰＬＣ系とサイズ排除ＨＰＬＣ系を用い、標識、抗体結合、および血清安定性を分析した。
ＩＭＰ２８４の合成
このペプチドを、標準的なＦｍｏｃ合成法を用い、リンクアミド樹脂（１．０ｇ，０．６ｍｍｏｌ／ｇ）上での固相ペプチド合成により合成した。以下のアミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｄ− Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨおよびＤＯＴＡ−トリス（ｔ−ブチル）エステル（結合１回につき６当量）を 示された順序で加えた。活性化剤としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を用い、各アミノ酸を一晩カップリングした。次に、通常の方法でＰｄ触媒を用いてＡｌｏｃ側鎖を除去し、そのトリチル−ＨＳＧ−ＯＨ（７当量）を、ＤＩＥＡ（１４当量）の存在下、ＤＩＣ（７当量）を用いてリシン側鎖とカップリングさせた。ＴＦＡを用いて樹脂からペプチドを切断し、エーテル中で沈殿させ、ＨＰＬＣにより精製し、目的のペプチドを得た。合成の成功はＥＳＭＳ分析、ＭＨ＋：１４７１により確認した。目的生成物の全収量は３画分で２４８．１ｍｇであった。
ＩＭＰ２８４溶液
ペプチド（３．７ｍｇ）を１１４３μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃバッファー（ｐＨ３．９８，Ｒｅｆ．ＢＭ１０−９１）と合わせ、終濃度２．２×１０−３Ｍとした。
ＩＭＰ２８４の標識（図７および８）
「ねじ蓋付き」プラスチックバイアル中、２．５μＬのＩＭＰ２８４溶液および１５０μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃバッファー（ｐＨ３．９８，Ｒｅｆ．ＢＭ１０−９１）に１１１ＩｎＣｌ３（７．９μＬ）を加えた。このバイアルを鉛の容器に入れ、それ自体を１５分間沸騰水浴中に浸漬した。プラスチックバイアルを取り出し、室温に戻した後、逆相ＨＰＬＣにより分析した。クロマトグラムは、ペプチドが十分標識されていることを示した。この溶液のペプチド濃度は３．４２９×１０−５Ｍであった。
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８４と抗体の結合（図９）
標識ペプチド（０．５μＬ）混合物を３．１μＬのｍ６７９×ｈＭＮ１４抗体（抗体／ペプチド比１９．７：１）および１０００μＬの０．９％生理食塩水と合わせた。この溶液をボルテックスにかけ、ＨＰＬＣにより分析した。クロマトグラムは、ほとんどが二結合で少量が一結合のペプチドであったことを示す。
ヒト血清中の１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８４（図１０）
標識ペプチドとヒト血清の混合物を作製し、３７℃で１９．５時間インキュベートした。ヒト血清を新たに抜き取り、遠心分離し、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＶ ０．２２μｍフィルターユニットで濾過した。インジウム標識ペプチド溶液（５０μＬ）および４５０μＬのヒト血清を合わせ、ボルテックスにかけた。インキュベーションしながら、ｔ０＝０時間、ｔ１＝２．０時間、およびｔ２＝１９．５時間に逆相ＨＰＬＣに注入を行った。この標識ペプチドは、ヒト血清中で混合しても何ら変化を受けなかったことが明らかである。ヒト血清中で希釈した後のこの混合物のペプチド濃度は３．４２９×１０−６Ｍであった。
マウス血清中の１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８４（図１３）
標識ペプチドとマウス血清の混合物を作製し、３７℃でインキュベートした。マウス血清は同日ＧＳＣＣから得た新鮮なヌードマウス血清であった。インジウム標識ペプチド 溶液（５０μＬ）および４５０μＬのマウス血清を合わせ、ボルテックスにかけた。これを３７℃で１８時間インキュベートした。ｔ０＝０時間およびｔ１＝１８．０時間に逆相ＨＰＬＣに注入した。この標識ペプチドは、マウス血清中で混合しても何ら変化を受けなかったことが明らかである。マウス血清中で希釈した後のこの混合物のペプチド濃度は３．４２９×１０−６Ｍであった。
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８４ｗ／抗体とヒト血清（図１１および１２）
ヒト血清中の１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８４（１．０μＬ）を０．７μＬのｍ６７９×ｈＭＮ１４抗体（抗体／ペプチド比２２．３：１）および６０μＬの０．９％生理食塩水に加えた。この混合物をボルテックスにかけ、サイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。同じ手順を１８時間後に繰り返した。両放射線測定クロマトグラムの結果は、抗体単独を用いたペプチドの場合と同等であると思われた。
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８４ｗ／抗体とヒト血清（図１４および１５）
ヒト血清中１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８４（１．０μＬ）を０．７μＬのｍ６７９×ｈＭＮ１４抗体（抗体／ペプチド比２２．３：１）および６０μＬの０．９％生理食塩水に加えた。この混合物をボルテックスにかけ、サイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。同じ手順を１６時間後に繰り返した。両放射線測定クロマトグラムの結果は、抗体単独を用いたペプチドの場合と同等であると思われた。
ペプチドの標識
以下のペプチド：
ＩＭＰ２８１：
ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＭＨ＋：１３６１）
ＩＭＰ２８４：
ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＭＨ＋：１４７１）
を１１１Ｉｎで標識した。
さらに、これらのペプチドを、標識後、２１時間にわたるヒト血清中での安定性に関して試験した。この試験により、両ペプチドとも安定なままであることが示された。また、ＩＭＰ２８１およびＩＭＰ２８４を、ヒト化抗体ｍ６７９×ｈＭＮ１４（１００，０００ｇｍｏｌ−１、１０．９ｍｇ ｍＬ−１）との結合に関して試験した。逆相ＨＰＬＣ系とサイズ排除ＨＰＬＣ系の双方で分析を行った。
ＩＭＰ２８１
このペプチドを従前に合成したところ、最初の精製後に不純物が見られたので、異なる移動相、カラム、流速および勾配を用いてさらに２回再精製した。本報告に記載した標識研究に用いた材料は約９７％純度（ＨＰＬＣ）であった。
ＩＭＰ２８４
このペプチドを従前に合成したところ、最初の精製後に不純物が見られたので、異なる移動相、カラム、流速および勾配を用いてさらに２回再精製した。本報告に記載した標識研究に用いた材料は約９７％純度（ＨＰＬＣ）であった。
ＩＭＰ２８１保存溶液
ペプチド（３．９ｍｇ）を１３０３μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃバッファー（ｐＨ３．９８）と合わせ、濃度２．２×１０−３Ｍとした。
ＩＭＰ２８４保存溶液
ペプチド（１．５ｍｇ）を４６４μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃバッファー（ｐＨ３． ９８）と合わせ、濃度２．２×１０−３Ｍとした。
ＩＭＰ２８１の標識（図１６および１７）
ねじ蓋付きプラスチックバイアル中、２．５μＬのＩＭＰ２８１保存溶液および１５０μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃバッファー（ｐＨ３．９８）に１１１ＩｎＣｌ３（６．２μＬ）を加えた。このバイアルを鉛の容器に入れ、３２分間、沸騰水浴中に浸漬した。プラスチックバイアルを取り出し、室温に戻した後、逆相ＨＰＬＣにより分析した。逆相ＨＰＬＣは、ペプチドが十分標識され、結合していないインジウムは微量しかないことを示した。この溶液のペプチド濃度は３．４６６×１０−５Ｍであった。
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８１と抗体の結合（図１８）
標識ペプチド（１．０μＬ）混合物を３．２μＬのｍ６７９×ｈＭＮ１４抗体（抗体／ペプチド比１０：１）および２００μＬの０．９％生理食塩水と合わせた。この溶液をボルテックスにかけ、ＨＰＬＣにより分析した。クロマトグラムは、同様に、一結合ペプチドがいくらかあったものの、ほとんどが二結合であることを示す。
ＩＭＰ２８４の標識（図１９および２０）
ねじ蓋付きプラスチックバイアル中、２．５μＬのＩＭＰ２８４保存溶液および１５０μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃバッファー（ｐＨ３．９８）に１１１ＩｎＣｌ３（６．２μＬ）を加えた。このバイアルを鉛の容器に入れ、３２分間、沸騰水浴中に浸漬した。プラスチックバイアルを取り出し、室温に戻した後、逆相ＨＰＬＣにより分析した。逆相ＨＰＬＣは、ペプチドが十分標識され、結合していないインジウムは微量しかないことを示した。この溶液のペプチド濃度は３．４６６×１０−５Ｍであった。
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８４と抗体の結合（図２１）
標識ペプチド（１．０μＬ）混合物を３．２μＬのｍ６７９×ｈＭＮ１４抗体（抗体／ペプチド比１０：１）および２００μＬの０．９％生理食塩水と合わせた。この溶液をボルテックスにかけ、ＨＰＬＣにより分析した。クロマトグラムは、同様に、一結合ペプチドがいくらかあったものの、ほとんどが二結合であることを示す。
ヒト血清中の１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８１（図２２）
標識ペプチドと新しく抜き取って濾過したヒト血清の混合物を作製し、３７℃でインキュベートした。インジウム−１１１標識ペプチド（５０μＬ）と４５０μＬのヒト血清を合わせ、ボルテックスにかけた。これを一定温度で２１時間維持し、ｔ０＝２．２５時間、ｔ１＝３．２５時間、およびｔ２＝２０．２５時間に逆相ＨＰＬＣに注入した。この標識ペプチドは、ヒト血清中で混合しても何ら変化を受けなかったことが明らかである。この混合物のペプチド濃度は３．４６６×１０−６Ｍであった。
ヒト血清中の１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８４（図２３）
標識ペプチドと新しく抜き取って濾過したヒト血清の混合物を作製し、３７℃でインキュベートした。インジウム−１１１標識ペプチド（５０μＬ）と４５０μＬのヒト血清を合わせ、ボルテックスにかけた。これを一定温度で２１時間維持し、ｔ０＝２．５時間およびｔ１＝２０．５時間に逆相ＨＰＬＣに注入した。この標識ペプチドは、ヒト血清中で混合しても何ら変化を受けなかったことが明らかである。この混合物のペプチド濃度は３．４６６×１０−６Ｍであった。
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８１ｗ／抗体とヒト血清（図２４）
ヒト血清中１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８１（１．０μＬ）を０．６４μＬのｍ６７９×ｈＭＮ１４抗体（抗体／ペプチド比２０：１）および２００μＬの０．９％生理食塩水に加えた。この混合物をボルテックスにかけ、サイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。これらの結果は、抗体単独を用いたペプチドの場合と同等であると思われた。
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２８４ｗ／抗体とヒト血清（図２５）
ヒト血清中１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８４（１．０μＬ）を０．６４μＬのｍ６７９×ｈＭＮ１４抗体（抗体／ペプチド比２０：１）および２００μＬの０．９％生理食塩水に加えた。この混合物をボルテックスにかけ、サイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。これらの結果は、抗体単独を用いたペプチドの場合と同等であると思われた。
以下のペプチド：（ＩＭＰ２７７ ＭＨ＋１４１９）ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２を合成し、１１１Ｉｎで標識した。
血清中でのペプチドの安定性を向上させるため、全Ｄ−アミノ酸を用いた。
合成：
ペプチドを、Ｆｍｏｃ法を用い、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂上での固相ペプチド合成により合成した。以下のアミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、ＤＯＴＡ−トリス（ｔＢｕ）エステルを示された順序で加えた。各アミノ酸を、活性化剤としてまずジイソプロピルカルボジイミドを用いた２時間のカップリング、次にＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）を用いたカップリングで二重にカップリングした。次に、通常の方法でＰｄ触媒を用いてＡｌｏｃ側鎖を除去し、そのトリチル−ＨＳＧ−ＯＨをリシン側鎖と二重にカップリングした。ＴＦＡを用いて樹脂からペプチドを切断し、エーテル中で沈殿させ、ＨＰＬＣにより精製し、目的のペプチドを得た。
標識溶液：
ペプチド０．００１５ｇ（１．０６×１０−６ｍｏｌ）を標識のため、４８０μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ ｐＨ３．９８に溶解した。
放射性標識：
ペプチド２．５μＬを２０μＬのＩｎ−１１１（２．７８ｍＣｉ）および６０μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ ｐＨ３．９８と混合した。この溶液を沸騰水浴中で１５分間加熱した。
別に、異なるバッファーとして３０μＬの０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ ｐＨ５．５バッファーを使用したこと以外は同じ条件を用い、標識を行った。
血清安定性：
ヒト血清：
Ｉｎ−１１１ ＩＭＰ２７７（３０μＬ）を５４０μＬの新鮮なヒト血清で希釈し、３７℃のインキュベーターに入れた。種々の時点でアリコートを採取し、逆相ＨＰＬＣおよびサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。
マウス血清：
Ｉｎ−１１１ ＩＭＰ２７７（１５μＬ）を１５０μＬの新鮮なマウス血清で希釈し、３７℃のインキュベーターに入れた。種々の時点でアリコートを採取し、逆相ＨＰＬＣおよびサイズ排除ＨＰＬＣにより分析した。
結果：
ペプチドはＩｎ−１１１で十分標識されるが、逆相ＨＰＬＣは、用いた標識条件によって様々な量で不純物を含むことを示す。抗体結合試験は、ペプチドが２つのｈＭＮ−１４ ×６７９二重特異性抗体と結合するが、ｈＭＮ−１４×７３４とは結合しないことを示す。このペプチドはヒト血清中で極めて安定であり、マウス血清中での安定性と同様であると思われる。このマウス血清抗体結合ＳＥＣ ＨＰＬＣ実験は、存在するはずのない抗体領域にいくつかのピークが見られるが、これはおそらく前の注入のインジェクターまたはシリンジ中にその抗体が残っていたためであると思われる。
結論：
ペプチドは十分標識され、マウス血清およびヒト血清中で安定である。
二重特異性抗体腫瘍プレターゲッティングによる腫瘍への治療用／画像用放射性同位元素の運搬のためのペプチド例：ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ２３７）を合成し、二重特異性抗体腫瘍プレターゲッティングにより、９０Ｙまたは１７７Ｌｕなどの治療用放射性同位元素を腫瘍へ送達した。この二重特異性抗体は、腫瘍上の抗原に結合する１つの部分と、ＨＳＧペプチドに結合する別の部分からなる。ＨＳＧペプチドに結合する抗体は６７９である。この系はまた、１１１Ｉｎ−１１１などの画像用同位元素を送達するためにも使用できる。
ＩＭＰ２３７合成
以下の保護アミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（Advanced Chemtechからの試薬）トリ−ｔ−ブチルＤＯＴＡ(Macrocyclics)をこの順序で含むペプチド主鎖を構築すべく、標準的なＦｍｏｃに基づく固相ペプチド合成を用い、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂(Nova-Biochem)上でＩＭＰ２３７を合成した。次に、Dangles et. al. J. Org. Chem. 52:4984-4993 (1987)の方法により、Ｐｄ［Ｐ（Ｐｈ）３］４を用いてリシン側鎖を脱保護した。次に、アミノ酸の付加に用いるＢＯＰ／ＨＢＴＵ二重カップリング法を用い、ＨＳＧリガンドをトリチルＨＳＧとして付加した（下記の合成）。このペプチドを樹脂から切断し、ＴＦＡ処理により保護基を除去した。ＨＰＬＣによりペプチドを精製し、１．８２３ｇのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＮＨ−Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂から０．６０７９ｇのペプチドを得た。
Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ＯＨの合成
グリシンｔ−ブチルエステル塩酸塩（１５．２６３ｇ，９．１×１０−２ｍｏｌ）と１９．７６０ｇのＮａ２ＣＯ３を混合した後、５０ｍＬのＨ２Ｏに懸濁させ、氷浴で冷却した。この反応溶液に無水コハク酸（９．１４２ｇ，９．１４×１０−２ｍｏｌ）を加え、ゆっくり室温まで温め、１８時間攪拌した。クエン酸（３９．９１１ｇ）を５０ｍＬのＨ２Ｏに溶解し、反応溶液にゆっくり加えた後、２×１５０ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過および濃縮し、２５．７０９ｇの白色固体を得た。
粗生成物（２５．７０９ｇ）を１２５ｍＬのジオキサンに溶解し、室温の水浴中で冷却し、１１．２４４ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと混合した。この反応溶液にジイソプロピルカルボジイミド１５．０ｍＬを加え、１時間攪拌した。次に、二塩酸ヒスタミン（１８．４０２ｇ，１．００×１０−１ｍｏｌ）を１００ｍＬのＤＭＦおよび３５ｍＬのジイソプロピルエチルアミンに溶解した。このヒスタミン混合物を反応溶液に加え、室温で２１時間攪拌した。反応物を１００ｍＬの水で急冷し、濾過して沈殿を除去した。溶媒をロータリーエバポレーターにて真空下で除去した。粗生成物を３００ｍＬのジクロロメタンに溶解し、１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、３４．１９ｇの粗生成物を黄色の油状物として得た。
粗生成物（３４．１９ｇ）を５０ｍＬのクロロホルムに溶解し、３１ｍＬのジイソプロピルエチルアミンと混合した。塩化トリフェニルメチル（２５．４１５ｇ）を５０ｍｌのクロロホルムに溶解し、攪拌した反応溶液に滴下し、氷浴で冷却した。反応物を４５分間攪拌した後、１００ｍＬのＨ２Ｏで急冷した。層を分離し、有機溶液をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮すると緑色のガム質が生じた。このガム質を１００ｍＬのＥｔ２Ｏでトリチュレートすると黄色の沈殿が得られ、これを３×５０ｍＬ部のＥｔ２Ｏで洗浄した。固体を真空乾燥させて３０．６４１ｇ（全体の収率５９．５％）のＮ−トリチル−ＨＳＧ−ｔ−ブチルエステルを得た。
Ｎ−トリチル−ＨＳＧ−ｔ−ブチルエステル（２０．６２０ｇ，３．６４×１０−２ｍｏｌ）を、３０ｍＬのクロロホルムおよび３５ｍＬの氷酢酸の溶液に溶解した。反応物を氷浴で冷却し、この反応溶液に１５ｍＬのＢＦ３・Ｅｔ２Ｏをゆっくり加えた。この反応物を室温までゆっくり温め、５時間混合した。この反応物を２００ｍＬの１Ｍ ＮａＯＨ中に注ぐことにより急冷し、生成物を２００ｍＬのクロロホルムで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して粗ガム質えを得、これを１００ｍＬのＥｔ２Ｏでトリチュレートすると沈殿が生じた。この粗沈殿４００ｍＬの０．５Ｍ ｐＨ７．５のリン酸バッファーに注ぎ、２×２００ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。水層を１Ｍ ＨＣｌでｐＨ３．５に酸性化し、２×２００ｍＬのクロロホルムで抽出した。沈殿が生じ、濾過により回収した（８．５８ｇ）。この沈殿は、従前のサンプル（ＥＳＭＳ ＭＨ＋５１１）とのＨＰＬＣ比較によれば、目的生成物であった。
放射性標識
１１１Ｉｎでの標識
１１１Ｉｎ（約３００μＣｉ／キット）を脱イオン水で０．５ｍＬに希釈し、凍結乾燥キットに加えた。これらのキットを沸騰水浴中で１５分間加熱し、それらのバイアルを冷却し、０．５Ｍ酢酸バッファー中２．５６×１０−５ＭのＩｎ０．５ｍＬを加え、これらのキットを再び沸騰水浴中で１５分間加熱した。これら標識ペプチドのバイアルを室温まで冷却し、逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ条件：Ｗａｔｅｒｓ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ Ｃ−１８，８×１００ｍｍ ＲＣＭカラム、１００％（Ｈ２Ｏ中０．１％ＴＦＡ）〜１００％（９０％ＣＨ３ＣＮ、０．１％ＴＦＡ、１０％Ｈ２Ｏ）の直線勾配を用い３ｍＬ／分で溶出）によって評価した。このＨＰＬＣ分析により、この組成を用いた場合に標識に必要な最低ペプチド濃度（非結合Ｉｎは４．７％）は３５μｇ／ｍＬであった。逆相ＨＰＬＣトレースは、鋭い１１１Ｉｎ標識ペプチドピークを示した。この標識ペプチドは、過剰量の６７９ＩｇＧと混合した場合、サイズ排除ＨＰＬＣＭによれば、完全に結合した。
in vivo研究
ＧＷ−３９ヒト結腸異種移殖片腫瘍（１００〜５００ｍｇ）を担持するヌードマウスをに二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×ｍ６７９（１．５×１０−１０ｍｏｌ）を注射した。この 抗体を２４時間クリアリングさせた後、１１１Ｉｎ標識ペプチド（８．８μＣｉ，１．５×１０−１１ｍｏｌ）を注射した。注射後３時間、２４時間、４８時間で動物を犠牲にした。
ｈＭＮ−１４×ｍ６７９でプレターゲッティングしたマウスにおけるペプチドの生体分布研究の結果を表１に示す。このプレターゲッティング研究におけるペプチドの腫瘍／非腫瘍比を表２に示す。
Figure 0004937751
Figure 0004937751
 ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ２３７）およびＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ２４１）の血清安定性
ペプチドの標識とＨＰＬＣ分析
ペプチドＩＭＰ２３７およびＩＭＰ２４１を、Karacay et. al. Bioconjugate Chem. 11: 842-854 (2000)が記載している手順に従って標識した。ペプチドＩＭＰ２４１（０．００１９ｇ）を５８７μｌの０．５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ，ｐＨ５．５に溶解した。このペプチド溶液の１．７μＬアリコートを１６５μｌの０．５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ，ｐＨ５．５で希釈した。このペプチド溶液に１０μＬ中１１１Ｉｎ（１．８ｍＣｉ）を加え、この混合物を沸騰水浴中で３０分間加熱した。
標識ペプチドを、Ｗａｔｅｒｓ ８×１００ｍｍ ｒａｄｉａｌ−ｐａｋ，ｎｏｖａ−ｐａｋ Ｃ−１８ ＲＣＭカートリッジカラムを用い、ＨＰＬＣにより分析した。カラムを、水中０．１％のＴＦＡ１００％で始まり、１０分間で、９０％アセトニトリルおよび１０％水中０．１％のＴＦＡ１００％に向かう直線勾配を用い、３ｍＬ／分で溶出した。この標識法では約６％の非結合１１１Ｉｎが存在し、これはカラムのボイド容量（１．６分）に溶出した。また、５分および６．６〜８分にいくらかの１１１Ｉｎ標識ピークがあった。１１１Ｉｎ標識ペプチドは８．８分に単一のピークとして溶出した。１１１Ｉｎ ＩＭＰ２３７のＨＰＬＣプロフィールは１１１Ｉｎ ＩＭＰ２４１とほぼ等しかった。
血清安定性
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２４１のアリコート（３０μＬ）を３００μＬの新鮮なマウス血清に入れ、３７℃のインキュベーターに入れた。ペプチドを上記のようにしてＨＰＬＣによりモニタリングした。
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２３７のアリコート（２４μＬ）を２３０μＬの新鮮なマウス血清に入れ、３７℃のインキュベーターに入れた。ペプチドを上記のようにしてＨＰＬＣによりモニタリングした。
この分析で、１１１Ｉｎ ＩＭＰ２４１は３７℃のマウス血清中で２２時間後にわずかに（約５％）分解したことが示された。１１１Ｉｎ ＩＭＰ２３７は、３７℃で２２時間のインキュベーション後に約７０％がより短い保持時間のピークに変化した。
結論
ＩＭＰ２４１ペプチド中のＤ−チロシンは、ＩＭＰ２３７の場合に比べてマウス血清中でのペプチドの分解を遅くする。
ＩＭＰ２３７とＩＭＰ２４１のin vivo安定性の比較
１１１Ｉｎ ＩＭＰ２３７と１１１Ｉｎ ＩＭＰ２４１のin vivo安定性を、３０分および６０分の時点のマウスからの尿サンプルを調べることにより（ＨＰＬＣによる）比較した。ペプチドＩＭＰ２４１およびＩＭＰ２３７は１上記のように１１１Ｉｎ−１１１で標識した。
これらの標識ペプチドをＢａｌｂ／ｃマウスに注射し、ペプチドの注射後３０分と６０分に、１時点につき１個体を用い、犠牲にした。ＨＰＬＣトレースは、１１１Ｉｎ ＩＭＰ２４１は完全な形で溶出したが、１１１Ｉｎ ＩＭＰ２３７はほぼ完全に新たな１１１Ｉｎ標識ペプチドに代謝されていたことを示した。
結論
ペプチド主鎖におけるＴｙｒのＤ−Ｔｙｒでの置換は、in vivoにおいてこのペプチドの代謝を軽減する。
ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ２７１）の合成
以下の保護アミノ酸：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（Ｂｕｔ）−ＯＨ（Advanced Chemtechからの試薬）をこの順序で含むペプチド主鎖を構築すべく、標準的なＦｍｏｃに基づく固相ペプチド合成を用い、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂(Nova-Biochem)上でＩＭＰ２３７を合成した。直鎖ペプチドを構築し、ＤＯＴＡ−トリス（ｔＢｕ）エステル(Macrocyclics)をそのＮ末端に付加した。次に、Dangles et. al. J. Org. Chem. 52:4984-4993 (1987)の方法により、Ｐｄ［Ｐ（Ｐｈ）３］４を用いてＤ−リシン上のＡｌｏｃ側鎖を除去した。次に、アミノ酸の付加に用いるＢＯＰ／ＨＢＴＵ二重カップリング法を用い、ＨＳＧリガンドをトリチルＨＳＧとして付加した（下記の合成）。このペプチドを樹脂から切断し、ＴＦＡ処理により保護基を除去した。ＨＰＬＣによりペプチドを精製した。
プレターゲッティングおよび単独注射時における新規ペプチド１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８１およびＩＭＰ２８４とＩＭＰ２４１との生体分布の比較
目的：本実施例ではＩＭＰ２８１の腫瘍ターゲッティングを調べた。
試薬：ｈＭＮ−１４×ｍ６７９ Ｆａｂ’×Ｆａｂ’：ＧＮ，ＬＮ ０７３１０２，１０．９ｍｇ／ｍＬ
ＮＣｒヌード：（ＮＣＩ）Taconicから、４週齢
ＧＷ３９：生成＃８；ＳＣ１０％を３００μＬ
ＩＭＰ２４１：ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２
ＩＭＰ２８１：ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；ＭＨ＋１３６１
ＩＭＰ２８４：ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；ＭＨ＋１４７１
Ｉ群 ＩＭＰ２４１
Ａ．プレターゲッティング
Ｉ−１２５標識ｂｓＭａｂ（１５μｇ）を１０ＧＷ異種移殖片担持マウス（腫瘍重≧０．２ｇ）に注射する。局在化と血液からのクリアランスのための時間をおいた後、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１を注射する。上記に示した時点で、１時点につき５個体のマウスを剖検する。組織（腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、大腸および小腸）を単離し、秤量し、適当な枠で計数する。
Ｂ．ペプチド単独
１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２４１（８．８μＣｉ，１．５×１０−１１ｍｏｌ）を１０個体の担癌マウスに注射する。注射後３時間および２４時間で、１時点につき５個体のマウスを剖検する。組織（腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、大腸および小腸）を単離し、秤量し、適当な枠で計数する。
II群 ＩＭＰ２８１
Ａ．プレターゲッティング
Ｉ−１２５標識ｂｓＭａｂ（１５μｇ）を１０ＧＷ異種移殖片担持マウス（腫瘍重≧０．２ｇ）に注射する。局在化と血液からのクリアランスのための時間をおいた後、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８１を注射する。上記に示した時点で、１時点につき５個体のマウスを剖検する。組織（腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、大腸および小腸）を単離し、秤量し、適当な枠で計数する。
Ｂ．ペプチド単独
１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８１（８．８μＣｉ，１．５×１０−１１ｍｏｌ）を１２個体の担癌マウスに注射する。注射後３時間および２４時間で、１時点につき５個体のマウスを剖検し、３０分で２個体のマウスを剖検する。組織（腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、大腸および小腸）を単離し、秤量し、適当な枠で計数する。
III群 ＩＭＰ２８４
Ａ．プレターゲッティング
Ｉ−１２５標識ｂｓＭａｂ（１５μｇ）を１０ＧＷ異種移殖片担持マウス（腫瘍重≧０．２ｇ）に注射する。局在化と血液からのクリアランスのための時間をおいた後、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８１を注射する。上記に示した時点で、１時点につき５個体のマウスを剖検する。組織（腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、大腸および小腸）を単離し、秤量し、適当な枠で計数する。
Ｂ．ペプチド単独
１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８４（８．８μＣｉ，１．５×１０−１１ｍｏｌ）を１３個体の担癌マウスに注射する。注射後３時間および２４時間で、１時点につき５個体のマウスを剖検し、３０分で３個体のマウスを剖検する。組織（腫瘍、肝臓、脾臓、腎臓、肺、血液、胃、大腸および小腸）を単離し、秤量し、適当な枠で計数する。
放射性標識：
以下のプロトコールに従い、ＩＭＰ−２４１ペプチドをＩｎ−１１１で標識する。
１１１ＩｎＣｌ３（３ｍＣｉ）。
０．５Ｍ酢酸アンモニウム，ｐＨ５．５（Ｉｎ−１１１の３倍量）。
ペプチドは０．５Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．５中２．２×１０−３Ｍを２．３２μＬ。
遠心分離。
沸騰水浴中で３０分間加熱。
氷浴上で５分間冷却。
遠心分離。
ＤＴＰＡ（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ，ｐＨ６．５０中１Ｍ）を加えて最終ＤＴＰＡ濃度を３ｍＭとする。
室温で１５分間置く。
０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６．５を加えて１ｍＬとする。
ＩＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析。ＩＴＬＣストリップは飽和塩化ナトリウムおよび水：エタノール：アンモニア（５：２：１）で展開する。
放射性標識：
以下のプロトコールに従い、ＩＭＰ−２８１ペプチドをＩｎ−１１１で標識する。
１１１ＩｎＣｌ３（３ｍＣｉ）。
０．５Ｍ酢酸アンモニウム，ｐＨ５．５（Ｉｎ−１１１の３倍量）。
ペプチドは０．５Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．５中２．２×１０−３Ｍを２．３２μＬ。
遠心分離。
沸騰水浴中で３０分間加熱。
氷浴上で５分間冷却。
遠心分離。
ＤＴＰＡ（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ，ｐＨ６．５０中１Ｍ）を加えて最終ＤＴＰＡ濃度を３ｍＭとする。
室温で１５分間置く。
０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６．５を加えて１ｍＬとする。
ＩＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析。ＩＴＬＣストリップは飽和塩化ナトリウムおよび水：エタノール：アンモニア（５：２：１）で展開する。
放射性標識：
以下のプロトコールに従い、ＩＭＰ−２８４ペプチドをＩｎ−１１１で標識する。
１１１ＩｎＣｌ３（３ｍＣｉ）。
０．５Ｍ酢酸アンモニウム，ｐＨ５．５（Ｉｎ−１１１の３倍量）。
ペプチドは０．５Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．５中２．２×１０−３Ｍを２．３２μＬ。
遠心分離。
沸騰水浴中で３０分間加熱。
氷浴上で５分間冷却。
遠心分離。
ＤＴＰＡ（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ，ｐＨ６．５０中１Ｍ）を加えて最終ＤＴＰＡ濃度を３ｍＭとする。
室温で１５分間置く。
０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６．５を加えて１ｍＬとする。
ＩＴＬＣおよびＨＰＬＣにより分析。ＩＴＬＣストリップは飽和塩化ナトリウムおよび水：エタノール：アンモニア（５：２：１）で展開する。
結果：ペプチド１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２４１、２８１および２８４単独とｈＭＮ１４×ｍ６７９ Ｆａｂ’×Ｆａｂ’を用いたプレターゲッティングの比較
本実施例では、ＩＭＰ２４１を、単独およびプレターゲッティングの場合で、上記実施例に記載の２つ総てのＤ−アミノ酸主鎖ペプチドと比較した。プロトコールおよび生体分布データを添付する。
これらのペプチドの放射性標識データ：
Figure 0004937751
Figure 0004937751
Figure 0004937751
生体分布：
生体分布データを以下に示す。３つのペプチドを比較すると、腫瘍のペプチド取り込みは、注射後３時間および２４時間で、プレターゲッティングの場合、３つ総てのペプチドで同等であった（図２７）。ＩＭＰ２８１は、プレターゲッティングの場合でも単独を与えた場合でも、ＩＭＰ２４１および２８４よりも低い腎臓取り込みを示した（図２８および２９）。
結論：ｂｓＡｂおよびペプチド腫瘍取り込みは、種々のペプチドを用いた３つのプレターゲッティング群で同じであった。ＩＭＰ２８１はプレターゲッティングにおいてＩＭＰ２４１および２８４よりもわずかに低い腎臓取り込みを示した。ＩＭＰ２８１の腎臓取り込みの低減は、ペプチド単独を注射した場合により明らかであった。
Figure 0004937751
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当業者が理解しているように、特に表記するという点で、いずれか、また総ての目的で、本明細書に開示されている範囲は総て、いずれか、また総ての可能性のある部分範囲、およびその部分範囲の組合せも包含する。挙げられている範囲はいずれも、同じ範囲が少なくとも二等分、三分の一、四分の一、五分の一、十分の一などに細分されることを十分述べ、それが可能であることが容易に認識できよう。非限定的な例として、本明細書に開示されている各範囲は下三分の一、中三分の一、上三分の一などに容易に細分できる。当業者が理解しているように、「〜まで」、「少なくとも〜」、「〜より大きい」、「〜より小さい」、「〜を超える」などの言葉は示されている数値を含み、上述のようにさらに部分範囲に細分できる範囲を表す。同様に、本明細書に開示されている比は総て、より広い比内にある総ての部分比を含む。
また、当業者ならば、各メンバーがＭａｒｋｕｓｈ方式などの一般的な様式で分類されている場合、本発明は全体像として挙げられている完全な群だけでなく、個々にその群の各メンバーおよび主要な群の可能性のある総ての亜群も包含する。従って、あらゆる目的で、本発明は、主要な群だけではなく１以上の群メンバーが存在しない主要な群も包含する。本発明はまた、請求の発明における群メンバーのいずれか１以上の明確な排除も意図する。
当業者ならば、本発明の組成物および方法に対して種々の変形や変更が可能であることが明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内にある限り、このような変形や変更も含むものとする。
本明細書に開示されている総ての刊行物の開示内容は明らかに引用することにより、各々が個々に引用することにより本明細書の一部とされる場合と同じく、そのまま本明細書の一部とされる。
注目されるさらなる参照文献としては次のものがある。
Figure 0004937751
Figure 0004937751
Figure 0004937751
本明細書に挙げられている総ての参照文献は、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
標識ＩＭＰ２８１の逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）トレースを示す。 標識ＩＭＰ２８１のサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）トレースを示す。 ヒト血清中でのＩＭＰ２８１の安定性を示すＲＰ−ＨＰＬＣトレースを示す。 ｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合するＩＭＰ２８１のＳＥ−ＨＰＬＣを示す。 ヒト血清中でのインキュベーション後にｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合したＩＭＰ２８１のＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 ヒト血清中でのインキュベーション後にｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合したＩＭＰ２８１のＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 標識ＩＭＰ２８４のＲＰ−およびＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 標識ＩＭＰ２８４のＲＰ−およびＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 ｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合するＩＭＰ２８４のＳＥ−ＨＰＬＣを示す。 ヒト血清中でのＩＭＰ２８４の安定性を示すＲＰ−ＨＰＬＣトレースを示す。 ヒト血清中でのインキュベーション後にｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合したＩＭＰ２８４のＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 ヒト血清中でのインキュベーション後にｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合したＩＭＰ２８４のＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 マウス血清中での標識ＩＭＰ２８４の安定性を示す。 ヒト血清中での、ｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合した標識ＩＭＰ２８４の安定性を示す。 ヒト血清中での、ｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合した標識ＩＭＰ２８４の安定性を示す。 標識ＩＭＰ２８１のＲＰ−およびＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 標識ＩＭＰ２８１のＲＰ−およびＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 ｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合した標識ＩＭＰ２８１のＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 標識ＩＭＰ２８４のＲＰ−およびＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 標識ＩＭＰ２８４のＲＰ−およびＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 ｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合したＩＭＰ２８４のＳＥ−ＨＰＬＣトレースを示す。 ヒト血清中での標識ＩＭＰ２８１の安定性を示す。 ヒト血清中での標識ＩＭＰ２８４の安定性を示す。 ヒト血清中での、ｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合した標識ＩＭＰ２８１の安定性を示す。 ヒト血清中での、ｍ６７９×ｈＭＮ１４と結合した標識ＩＭＰ２８４の安定性を示す。 ペプチド注射後３時間および２４時間でのプレターゲッティングにおける１２５ＩｈＭＮ１４×ｍ６７９ Ｆａｂ’×Ｆａｂ’の組織取り込みを示す。 ペプチド注射後３時間（上）および２４時間（下）でのプレターゲッティングにおけるペプチドＩＭＰ２４１、２８１および２８４の組織取り込みの比較を示す。 ペプチド注射後３時間および２４時間でのプレターゲッティングにおけるペプチドの腎臓取り込みの比較を示す。 ペプチド注射後３時間および２４時間でのＩＭＰ２４１、２８１および２８４ペプチドの組織取り込みを示す。

Claims (39)

  1. 下記の式で表される化合物：
    Ｘ−Ｒ１−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ａ）−Ｒ２（Ｚ）−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ｂ）−Ｒ３（Ｙ）−ＮＲ４Ｒ５；または
    Ｒ１（Ｘ）−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ａ）−Ｒ２（Ｚ）−Ｄ−［Ｄｐｒ、ＯｒｎまたはＬｙｓ］（Ｂ）−Ｒ３（Ｙ）−ＮＲ４Ｒ５
    ［式中、
    Ｘは硬酸陽イオンキレート剤、軟酸陽イオンキレート剤、またはＡｃ−であり、
    Ｒ１はＤ−Ａｌａ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−ＡｓｐおよびＤ−Ｔｙｒから選択される１のＤ−アミノ酸であり、
    Ｒ２はＤ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−ＡｓｐおよびＤ−Ａｌａから選択される１のＤ−アミノ酸であり、
    Ｒ３は共有結合またはＤ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−ＣｙｓおよびＤ−Ｌｙｓから選択される１のＤ−アミノ酸であり、
    Ｙは硬酸陽イオンキレート剤もしくは軟酸陽イオンキレート剤であるか、または存在せず、
    Ｚは硬酸陽イオンキレート剤もしくは軟酸陽イオンキレート剤であるか、または存在せず、
    ＡおよびＢは独立にハプテンまたは硬酸陽イオンキレート剤であり、これらは同じであっても異なっていてもよく、かつ、
    Ｒ４およびＲ５は硬酸陽イオンキレート剤、軟酸陽イオンキレート剤、酵素、治療薬、診断薬およびＨからなる群から独立に選択される］。
  2. 式：Ｘ−Ｒ１−Ｄ−Ｌｙｓ(Ａ)−Ｒ２−Ｄ−Ｌｙｓ(Ｂ)−Ｒ３(Ｙ)−ＮＲ４Ｒ５で表される、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ３がＤ−Ｌｙｓであり、Ｙが硬酸陽イオンキレート剤または軟酸陽イオンキレート剤である、請求項１に記載の化合物。
  4. ＡおよびＢがヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）、ＤＴＰＡ、および検出可能な標識からなる群から独立に選択される、請求項１に記載の化合物。
  5. Ｒ３が共有結合であり、
    Ｙが存在せず、かつ、
    ＡおよびＢがハプテンまたは硬酸陽イオンキレート剤であり、これらが同じであっても異なっていてもよい、請求項１に記載の化合物。
  6. ＡおよびＢがハプテンであり、これらが同じであっても異なっていてもよい、請求項５に記載の化合物。
  7. Ｒ２がＤ−Ａｓｐ、Ｄ−ＧｌｕおよびＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される、請求項５に記載の化合物。
  8. Ｒ４およびＲ５がともにＨである、請求項５に記載の化合物。
  9. Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの１つが硬酸陽イオンキレート剤である、請求項５に記載の化合物。
  10. 残されたＸ、Ｒ４およびＲ５のうちの１つが軟酸陽イオンキレート剤である、請求項５に記載の化合物。
  11. Ｘが硬酸陽イオンキレート剤である、請求項５に記載の化合物。
  12. Ｒ４およびＲ５の一方が硬酸陽イオンキレート剤である、請求項１１に記載の化合物。
  13. 硬酸陽イオンキレート剤がカルボン酸基またはアミン基を含んでなる、請求項９に記載の化合物。
  14. 硬酸陽イオンキレート剤がＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、およびＴＥＴＡからなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
  15. 軟酸陽イオンキレート剤がチオール基を含んでなる、請求項１に記載の化合物。
  16. 軟酸陽イオンキレート剤がＴｓｃｇ−ＣｙｓおよびＴｓｃａ−Ｃｙｓからなる群から選択される、請求項１５に記載の化合物。
  17. Ｒ４およびＲ５の一方が軟酸陽イオンキレート剤であり、残りのＲ４またはＲ５がＨである、請求項１に記載の化合物。
  18. ＸがＡｃ−であり、
    ＡおよびＢが硬酸陽イオンキレート剤であり、これらは同じであっても異なっていてもよく、
    Ｒ３が共有結合であり、かつ、
    Ｙが存在しない、請求項１に記載の化合物。
  19. Figure 0004937751
    からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
  20. （ｉ）Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの多くとも１つが硬酸陽イオンキレート剤であり、かつ
    （ii）Ｘ、Ｒ４およびＲ５のうちの多くとも１つが軟酸陽イオンキレート剤である、請求項１に記載の化合物。
  21. Figure 0004937751
    からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
  22. 少なくとも１つの放射性核種をさらに含んでなる、請求項１に記載の化合物。
  23. 放射性核種が２２５Ａｃ、１１１Ａｇ、７２Ａｓ、７７Ａｓ、２１１Ａｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、１１Ｃ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１６６Ｄｙ、１６９Ｅｒ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１５４Ｇｄ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５７Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１９４Ｉｒ、１７７Ｌｕ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、９９Ｍｏ、１３Ｎ、１５Ｏ、３２Ｐ、３３Ｐ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、１０９Ｐｄ、１４９Ｐｍ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、２２３Ｒａ、８２ｍＲｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１０５Ｒｈ、４７Ｓｃ、１５３Ｓｍ、７５Ｓｅ、８３Ｓｒ、８９Ｓｒ、１６１Ｔｂ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、８６Ｙ、９０Ｙ、９０Ｙ、および８９Ｚｒからなる群から選択される、請求項２２に記載の化合物。
  24. 硬酸陽イオンキレート剤が、IIa族およびIIIa族の金属陽イオンからなる群から選択される陽イオンとキレート化されている、請求項１に記載の化合物。
  25. 軟酸陽イオンキレート剤が、遷移金属、Ｂｉ、ランタニド類およびアクチニド類からなる群から選択される陽イオンとキレート化されている、請求項１に記載の化合物。
  26. 陽イオンがＴｃ、Ｒｅ、およびＢｉからなる群から選択される、請求項２５に記載の化合物。
  27. Ｒ４またはＲ５が治療薬、診断薬または酵素である、請求項１に記載の化合物。
  28. 治療薬、診断薬または酵素がリンカー部分により共有結合されている、請求項２７に記載の化合物。
  29. リンカー部分が少なくとも１つのアミノ酸を含んでなる、請求項２８に記載の化合物。
  30. 治療薬が薬物、プロドラッグまたは毒素を含んでなる、請求項２７に記載の化合物。
  31. プロドラッグがエピルビシングルクロニド、ＣＰＴ−１１、エトポシドグルクロニド、ダウノマイシングルクロニドおよびドキソルビシングルクロニドからなる群から選択される、請求項３０に記載の化合物。
  32. 毒素がリシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群から選択される、請求項３０に記載の化合物。
  33. 治療薬がドキソルビシン、ＳＮ−３８、カンプトテシン、エトポシド、メトトレキサート、６−メルカプトプリンまたはリン酸エトポシドを含んでなる、請求項２７に記載の化合物。
  34. 診断薬が光線力学療法用の１以上の薬剤を含んでなる、請求項２７に記載の化合物。
  35. 光線力学療法用の薬剤が光増感剤である、請求項３４に記載の化合物。
  36. 診断薬が磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）で用いるための１以上の画像増強剤を含んでなる、請求項２７に記載の化合物。
  37. 診断薬がＸ線またはコンピューター断層撮影法用の１以上の放射線不透過剤または造影剤を含んでなる、請求項２７に記載の化合物。
  38. 診断薬が１以上の超音波造影剤を含んでなる、請求項２７に記載の化合物。
  39. 酵素が、薬物の中間体を有毒型に変換することによって標的部位における前記薬物の毒性を高めることができるものである、請求項２７に記載の化合物。
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