PT2857516T - Anticorpos multivalentes e utilizações dos mesmos - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
ANTICORPOS MULTIVALENTES Ξ UTILIZAÇÕES DOS MESMOS ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da invenção A presente invenção refere-se a anticorpos manipulados, com quatro ou mais sítios de ligação a antigénio funcionais, e a utilizações, como utilizações terapêuticas, para tais anticorpo manipulados.
Descrição da técnica relacionada
Estrutura de anticorpos de ocorrência natural
Os anticorpos de ocorrência natural (imunoglobulinas) compreendem duas cadeias pesadas ligadas entre si por ligações dissulfureto e duas cadeias leves, uma cadeia leve estando ligada a cada das cadeias pesadas por ligações dissulfureto. Cada cadeia pesada tem numa extremidade um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes (três ou quatro domínios constantes, CHI, CH2, CH3 e CH4, dependendo da classe de anticorpo). Cada cadeia leve tem um domínio variável (VL) numa extremidade e um domínio constante (CL) na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Veja-se a Fig. 1 no presente documento. Acredita-se que resíduos particulares de aminoácidos formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada, veja-se por exemplo, Chothia et al. , J. Mol. Biol. 186:651-663 (1985); e Novotny e Haber, Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 82:4592-4596 (1985).
Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação do anticorpo a um antigénio, mas estão envolvidos em várias funções efetoras, como participação do anticorpo na citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Os domínios variáveis de cada par de cadeias leves e pesadas estão envolvidos diretamente na ligação do anticorpo ao antigénio. Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas de ocorrência natural têm a mesma estrutura geral; cada compreendendo quatro regiões estruturais (FRs), cujas sequências são algo conservadas, conectadas por três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) (veja-se Rabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)). As quatro FRs adotam grandemente uma conformação de folha beta e as CDRs formam ansas que conectam, e em alguns casos fazem parte da estrutura de folha beta. As CDRs em cada cadeia são mantidas em estreita proximidade pelas FRs e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antigénio.
As Figs. 2A-E no presente documento ilustram as estruturas dos cinco isotipos de imunoglobulina principais que ocorrem naturalmente. As imunoglobulinas IgG, IgD e IgE possuem apenas dois sítios de ligação a antigénio. IgA e IgM, por outro lado, são capazes de formar estruturas poliméricas com valências mais elevadas. A IgM é secretada pelas células como um pentâmero no qual cinco unidades monoméricas são mantidas unidas por ligações dissulfureto, que ligam os seus domínios do terminal carboxilo (Cp4/Cp4) e os domínios Cp3/Cp3. As cinco subunidades monoméricas estão dispostas com as suas regiões Fc no centro do pentâmero e os 10 sítios de ligação a antigénio na periferia da molécula. Cada pentâmero contém um polipéptido ligado a Fc adicional denominado a cadeia J (junção), que está ligada por dissulfureto ao resíduo de cisteína do terminal carboxilo de 2 das cadeias 10 μ. A cadeia J parece ser necessária para a polimerização dos monómeros para formar IgM pentamérica; é adicionada imediatamente antes da secreção do pentâmero. Uma molécula de IgM pode ligar-se a 10 moléculas pequenas de hapteno; contudo, devido ao impedimento estérico, apenas 5 moléculas de antigénios maiores podem ligar-se simultaneamente. A valência aumentada da IgM pentamérica aumenta a sua capacidade de ligação a tais antigénios multidimensionais, como partículas virais e glóbulos vermelhos (RBCs). A IgA existe primariamente como um monómero, embora formas poliméricas como dímeros, trímeros e mesmo tetrâmeros sejam por vezes observadas. A IgA das secreções externas consiste num dímero ou tetrâmero, um polipéptido de cadeia J e uma cadeia polipeptídica designada componente secretor.
Anticorpos para utilizações clínicas
Tem sido feita uma utilização generalizada dos anticorpos monoclonais, particularmente aqueles derivados a partir de roedores incluindo ratinhos, contudo eles são frequentemente antigénicos na utilização clínica em seres humanos. Por exemplo, uma limitação principal na utilização clínica dos anticorpos monoclonais de roedores é uma resposta anti-globulina durante a terapêutica (Miller et al. , Blood 62:988-995 (1983); e Schroff, R. W. et al. , Cancer Res. 45:879-885 (1985)). A técnica tentou superar este problema construindo anticorpos pquiméricosp nos quais um domínio variável de ligação a antigénio animal é acoplado a um domínio constante humano (Cabilly et al., documento de patente U.S. 4.816.567; Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al. , Nature 312:643-646 (1984); e Neuberger et ai., Nature 314:268-270 (1985)). 0 isotipo do domínio constante humano pode ser selecionado para adaptar o anticorpo quimérico para a participação em ADCC e CDC (veja-se, por exemplo, Brúggemann et ai., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987); Riechmann et ai., Nature 332:323-327 (1988); Love et ai., Methods in Enzymology 178:515-527 (1989); e Bindon et al. , J. Exp. Med. 168:127-142 (1988)). Na forma de realização típica, tais anticorpos quiméricos contêm cerca de um terço de sequência de roedor (ou outra espécie não humana) e, portanto, são capazes de desencadear uma resposta anti-globulinas significativa em seres humanos. Por exemplo, no caso do anticorpo anti-CD3 murino, 0KT3, grande parte da resposta anti-globulina resultante é direcionada contra a região variável em vez da região constante (Jaffers et al., Transplantation 41:572-578 (1986)) .
Num esforço adicional para determinar as funções de ligação a antigénio dos anticorpos e para minimizar a utilização de sequências heterõlogas nos anticorpos humanos, Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); e Verhoeyen et al. , Science 239:1534-1536 (1988)) substituíram os segmentos correspondentes de um anticorpo humano pelas CDRs ou sequências de CDR de roedor. A promessa terapêutica desta abordagem é suportada pela eficácia clínica de um anticorpo humanizado específico para o antigénio CAMPATH-1 com dois pacientes com linfoma não Hodgkin, um dos quais tinha anteriormente desenvolvido uma resposta anti-globulina frente ao anticorpo de rato parental (Riechmann et al. , Nature 332:323-327 (1988); e Hale et al., Lancet i: 1394-1399 (1988)).
Em alguns casos, substituir CDRs humanas por CDRs a partir de anticorpos de roedor nas regiões estruturais humanas é suficiente para transferir uma afinidade de ligação a antigénio elevada (Jones et al. , Nature 321:522-525 (1986); Verhoeyen et al. , Science 239:1534-1536 (1988)), enquanto noutros casos foi necessário adicionalmente substituir um (Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988)) ou vários (Queen et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1989)) resíduos estruturais. Veja-se também Co et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2869-2873 (1991); documento de patente U.S. N.° 5.821.337 (Carter et al.) e documento de patente U.S. N. 0 5.530.101 (Queen et al.). Referências adicionais relacionadas com a humanização de anticorpo incluem Gorman et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:4181-4185 (1991); Daugherty et al., Nucleic Acids Research 19(9):2471-2476 (1991); Brown et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2663-2667 (1991); e Junghans et al. , Cancer Research 50:14 95-1502 (1990).
Em vez de um anticorpo quimérico/humanizado, é possível tratar um paciente com um anticorpo humano de modo a evitar anticorpos humanos produzidos contra um anticorpo murino (conhecida como a resposta "HAMA"). Estão disponíveis várias tecnologias para gerar anticorpos humanos.
Os anticorpos humanos podem ser selecionados utilizando tecnologia de apresentação em fagos. A apresentação em fagos foi adaptada para selecionar anticorpos humanos a partir de um dador não imunizado (Marks et al. J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)). De acordo com esta abordagem, a PCR é utilizada para amplificar genes de domínio variável a partir de ARNm preparado a partir de linfócitos do sangue periférico humano (PBLs). São utilizados iniciadores de tal forma que o ADN de cadeias pesadas de ambas IgG e IgM e ambas cadeias κ e λ é amplificado. Estes genes são depois combinados de forma aleatória e expressos como um Fv de cadeia simples (scFv) fusionado à proteína de revestimento do gene III do fago M13. Anticorpos humanos contra um antigénio de interesse podem depois ser identificados por ciclos de crescimento e seleção através de ligação a esse antigénio (por exemplo, ao antigénio imobilizado). Veja-se Griffiths et al. EMBO J. 12 : 725-734 (1993) .
Repertórios de fagos-anticorpos "sintéticos" também foram construídos a partir de segmentos de gene VH humanos.
Um repertório (2 X 1G7 clones) foi primeiramente construído utilizando uma ansa H3 curta de cinco ou oito resíduos aleatórios cada um com 4 9 segmentos, e combinados com uma cadeia leve fixa (Hoogenboom et al. J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992)). Ao adicionar uma gama de ansas H3 de diferentes comprimentos, de até 12 resíduos, foi criada uma biblioteca única a partir da qual uma gama de mais de 20 especificidades de ligação pode ser selecionada (Winter et al. Ann. Rev. Immune. 12:433-55 (1994)). Outras bibliotecas sintéticas foram construídas a partir da região estrutural de um anticorpo único através da randomização de CDRs do anticorpo humano (Garrard e Henner Gene 128:103-109 (1993)). Os anticorpos derivados a partir de tais repertórios de fagos-anticorpos sintéticos também são considerados como sendo anticorpos "humanos" no presente documento. A afinidade de fagos-anticorpos "primários" de baixa afinidade pode ser melhorada utilizando tecnologia de apresentação em fagos. Uma abordagem consiste em utilizar uma estratégia de redistribuição de cadeias (chain-shuffling) na qual o domínio VH é mantido constante e depois recombinado com a biblioteca original de genes VL e agentes de união mais fortes selecionados através da ligação a antigénio imobilizado. Este ciclo é repetido fixando o novo domínio VL e recombinando com a biblioteca de VH original (Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)). Alternativamente, mutações pontuais no anticorpo primário podem ser introduzidas utilizando PCR propensa a erros e agentes de união de afinidade mais elevada selecionados utilizando apresentação em fagos. Gram et al. PNAS (USA) 89: 3576-3580 (1992).
Também é possível produzir anticorpos humanos imunizando ratinhos que foram geneticamente manipulados para expressar anticorpos humanos. Ratinhos com imunodeficiência grave combinada (SCID) carecem da capacidade de produzir as suas próprias imunoglobulinas devido a um defeito no gene da recombinase. Vários grupos reconstituíram um sistema imunitário humoral funcional nestes ratinhos através da transferência de linfõcitos do sangue periférico humano (PBLs). Estes ratinhos hu-PBL-SCID podem ser utilizados para produzir anticorpos humanos depois da imunização com antigénio. Duchosal et al. Nature 355:258-262 (1992) . Utilizando outra abordagem, os genes de cadeia pesada e leve nos ratinhos são desativados e posteriormente cromossomas artificiais de levedura (YACs) manipulados com grandes sequências de ADN contendo genes de cadeia pesada e leve humana são introduzidos nos ratinhos. Tais pXenoRatinhosp são capazes de produzir anticorpos humanos depois da imunização com um antigénio de interesse. Veja-se o documento de patente U.S. N.° 5.434.340; documento de patente U.S. N.° 5.591.699; documento de patente U.S. N.° 5.569.825; documento de patente U.S. N.° 5.545.806 e documento de patente U.S. M.° 5.545.807.
Os anticorpos monoclonais humanos também podem ser gerados imortalizando um linfócito B humano que produz um anticorpo de interesse. Os problemas éticos que rodeiam a imunização de humanos de modo a gerar linfócitos B humanos ativados podem ser evitados imunizando linfócitos humanos in vitro. Tanto os PBLs humanos (Borrebaeck et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:3995-4000 (1988)) como os esplenocitos humanos (Boerner et al. J. Immunol. 147, 86-95 (1991)) foram imunizados in vitro com sucesso. Foram alcançadas melhorias na tecnologia de hibridomas humanos através da utilização de um heterohíbrido de ratinho-humano como o parceiro de fusão (Boerner et al.).
Variantes de anticorpos
Os anticorpos foram modificados de modo a aumentar a sua valência de ligação a antigénios. Por exemplo, Ghetie et al. homodimerizaram anticorpos monoclonais reativos com tumores (anticorpos anti-CD19, anti-CD20, anti-CD21, anti- CD22 e anti-HER2) através da introdução química de uma ligação tioéter entre um par de IgGs utilizando dois reticuladores heterobifuncionais. Ghetie et al. PNAS (USA) 94:7509-7514 (1997); e documento WO 99/02567. Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993) também ligaram quimicamente um anticorpo monoclonal de IgG (CHÍBR96) utilizando reticuladores heterobifuncionais para gerar um homodímero de anticorpo monoclonal com atividade antitumoral potenciada em ratinhos nus.
Shopes et al. substituíram um resíduo de serina próximo do terminal carboxilo de uma cadeia pesada de IgGl (Ser444) por uma cisteína. As ligações dissulfureto intermoleculares introduzidas entre os resíduos Cys444 ligaram pares de imunoglobulinas "cauda com cauda" para formar dímeros covalentes (H2L2)2. Diz-se que os dímeros anti-dansilo são mais eficazes que a IgGl humana monomérica na citólise mediada por complemento dependente de anticorpos de eritrócitos que carregam haptenos. Shopes, B. J. Immunol. 148(9) : 2918-2922 (1992); e documento WO 91/19515. Esta abordagem, envolvendo a introdução de resíduos de cisteína, também foi utilizada para gerar uma forma homodimérica do anticorpo CAMPATH-1 H. 0 anticorpo homodimérico CAMPATH-1 H exibiu uma lise melhorada utilizando células alvo que expressam antigénio a baixa densidade, mas não foi observada qualquer melhoria utilizando células que expressam antigénio a alta densidade. Greenwood et al. Ther, Immunol. 1:247-255 (1994). Veja-se, também, Caron et al. J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992), referindo-se a um anticorpo anti-CD33 manipulado com uma substituição de serina por cisteína na posição 444 da cadeia pesada permitindo a formação de ligação dissulfureto intercadeia no terminal COOH da IgG. Diz-se que a IgG homodimérica tem uma avidez semelhante à da IgG parental, mas aparentemente demonstrou uma capacidade melhorada para internalizar e reter radioisótopo em células alvo de leucemia, e foi mais potente na morte de células de leucemia mediada pelo complemento e citotoxicidade celular dependente de anticorpos utilizando efetores humanos.
Coloma e Morrison Mature Biotech. 15:159-163 (1997) descrevem um anticorpo biespecífico tetravalente que foi manipulado fusionado ADN que codifica um Fv de anticorpo anti-dansilo de cadeia simples (scFv) depois do terminal C (CH3-scFv) ou depois da dobradiça (Dobradiça-scFv) de um anticorpo anti-dansilo de IgG3. Veja-se, (também, o documento WO95/09917. Smith e Morrison manipularam três versões de IgG3 semelhantes a mu através de manipulação de (1) Cys414 de uma cadeia pesada de IgM ou (2) Cys575 de uma cadeia pesada de IgM, ou ambas (1) e (2) , para dentro do gene de cadeia pesada de IgG3. Todas as três construções mutantes foram expressas por células Sp2/0 e montadas em polímeros contendo até seis subunidades H2L2. Os polímeros psemelhantes a IgMp assim produzidos de IgG foram considerados como possuindo tanto as propriedades de ligação ao recetor Fc gama da IgG como a atividade de complemento mais potente da IgM. Veja-se, Smith e Morrison Bio/Technology 12:683-688 (1994).
Shuford e colaboradores isolaram um oligómero de anticorpo anti-estreptococos do grupo B de IgGl humana a partir de uma linha celular de mieloma transfetada. Shuford et al. Science 252:724-727 (1991). A análise imunoquímica e sequenciação de ADN indicaram que a linha celular produziu ambas uma cadeia leve capa normal e uma cadeia leve variantes V-V-C de 37 kD (L37). A cotransfeção de vetores que codificam a cadeia pesada e L37 resultaram na produção de IgG oligomérica. 0 documento de patente U.S. N.° 5.641.870 (Rinderknecht et al.) descreve um fragmento F(ab')2 linear, bivalente que compreende repetições em tandem de um fragmento de cadeia pesada (VH-CH1-VH-CH1) cosecretado com uma cadeia leve. 0 terminal C de CHI foi unido direcionado para o terminal N de VH sem quaisquer sequências proteicas de ligação estranhas.
Alt e colaboradores descrevem moléculas semelhantes a IgG de diacorpo (diabody) de cadeia simples (scDb) dimérico que, num polipéptido simples, incluem dois domínios VH, dois domínios VL, um domínio CH2 opcional e um domínio CH3 na ordem de VHA-VLB-VHB- VLA-(CH2)-CH3 . Alt et ai. , FEBS Letters, 454:90-94 (1990). Afirma-se que a fusão de scDbs a uma região Fc ou região CH3 resulta na expressão de moléculas semelhantes a IgG diméricas funcionalmente ativas (Resumo).
Outras publicações sobre variantes de anticorpos incluem o documento WO 00/06605; documento de patente U.S. N.° 5.591.828; documento de patente U.S. N.° 5.959.083; documento de patente U.S. N.° 6.027.725; documento W098/58965; documento WO94/13804; Tutt et al. J. Immunol. 147:60-69 (1991); documento W099/37791; documento de patente U.S. N.° 5.989.830; documentos W094/15642; EP 628.Q78B1; W097/14719; Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).
Pluckthun et al. , Immunotechnology, Volume 3, n.° 2, páginas 83-105, 1997 resume abordagens de manipulação de proteínas para fragmentos de anticorpos multivalentes e biespecíficos. 0 documento EP0.517.024 descreve a preparação e utilização de recetores biespecíficos tetravalentes.
Tirosina quinases recetoras ErhB
As tirosinas quinases recetoras ErbB são mediadores importantes do crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. A família de recetores inclui pelo menos quatro membros distintos incluindo o Recetor de Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR ou ErbBl). HER2 (ErbB2 ou pl8Sneu) , HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tyro2) . 0 EGFR, codificado pelo gene erbBl, tem sido casualmente implicado nas neoplasias malignas humanas. Em particular, uma expressão aumentada de EGFR tem sido observada no cancro da mama, bexiga, pulmão, cabeça, pescoço e estômago, bem como nos glioblastomas. A expressão do recetor EGFR está frequentemente associada com a produção aumentada do ligando de EGFR, Fator de Crescimento Transformante alfa (TGF-alfa), através das mesmas células tumorais resultando na ativação de recetores por uma via estimuladora autócrina. Baselga e Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994). Anticorpos monoclonais direcionados contra o EGFR ou os seus ligandos, TGF-alfa e EGF, foram avaliados como agentes terapêuticos no tratamento de tais neoplasias malignas. Veja-se, por exemplo, Baselga e Mendelsohn., supra; Masui et al. Cancer Research 44:1002-1007 (1984); e Wu et al. J. Clin. Invest. 95:1897-1905 (1995) . 0 segundo membro da família ErbB, pl85rieu, foi originalmente identificado como o produto do gene de transformação a partir de neuroblastomas de ratos tratados quimicamente. A forma ativada do proto-oncogene neu resulta a partir de uma mutação pontual (valina para ácido glutâmico) na região transmembrana da proteína codificada. A amplificação do homólogo humano de neu é observada nos cancros de mama e ovário e correlaciona-se com um mau prognóstico (Slamon et al. , Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al. , Science, 244:707-712 (1989); e documento de patente U.S. N.° 4.968.603). Até à data, nenhuma mutação pontual análoga à presente no proto-oncogene neu foi relatada para os tumores humanos. A superexpressão de HER2 (frequentemente mas não uniformemente devido à amplificação génica) também foi observada noutros carcinomas incluindo carcinomas no estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tiroide, pâncreas e bexiga.
Foram descritos anticorpos direcionados contra os produtos proteicos pl85neu de rato e HER2 de ser humano.
Drebin e colaboradores produziram anticorpos contra o produto génico neu de rato, pl85Iieu. Veja-se, por exemplo, Drebin et al. , Cell 41:695-706 (1985); Myers et ai., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991); e o documento W094/22478. Drebin et al. Oncogene 2:273-277 (1988) relatam que misturas de anticorpos reativos com duas regiões distintas de ρΐ85Ώε“ resultam em efeitos antitumorais sinérgicos sobre células NÍH-3T3 transformadas com neu, implantadas em ratinhos nus. Veja-se também o documento de patente U.S. N.° 5.824.311 emitida a 20 de outubro, 1998.
Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172 (1989) descrevem a geração de um painel de anticorpos anti-HER2 que foram caracterizados utilizando a linha celular de tumor da mama humano SKBR3. A proliferação celular relativa das células SKBR3 depois da exposição aos anticorpos foi determinada por coloração com cristal violeta das monocamadas depois de 72 horas. Utilizando este ensaio, foi obtida uma inibição máxima com o anticorpo denominado 4D5 que inibiu a proliferação celular em 56 ê. Outros anticorpos no painel reduziram a proliferação celular numa menor extensão neste ensaio. Verificou-se ainda que o anticorpo 4D5 sensibiliza as linhas celulares de tumor de mama que superexpressam HER2 frente aos efeitos de TNF-alfa. Veja-se, também, o documento de patente U.S. N.° 5.677.171, emitido a 14 de outubro de 1997. Os anticorpos anti-HER2 discutidos em Hudziak et al. , foram adicionalmente caracterizados em Fendly et al. Cancer Research 50:1550-1558 (1990); Kotts et al. In Vitro 26(3) :59A (1990); Sarup et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11 (3) : 117-127 (1991); Kumar et al. Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al. J.
Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996); e Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997) .
Uma versão de IgGl humanizada recombinante do anticorpo 4D5 anti-HER2 murino (rhuMAb HER2 ou HERCEPTIN®; comercialmente disponível a partir de Genentech, Inc., South San Francisco) é clinicamente ativo nos pacientes com cancros de mama metastãticos com superexpressão de HER2 que receberam uma terapêutica contra o cancro extensiva anterior (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:737-744 (1996)) . HERCEPTIN® recebeu aprovação de comercialização da Food and Drug Administration a 25 de setembro de 1998 para o tratamento de pacientes com cancro da mama metastático cujos tumores superexpressavam a proteína HER2.
Outros anticorpos anti-HER2 com várias propriedades foram descritos em Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543-548 (1989); Maier et al. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); documento W094/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver et al. Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994); Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); documento de patente U.S. N.° 5.783.186; Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997); documento WO 98/77797 e documento de patente U.S. N.° 5.783.186. 0 rastreio de homologia resultou na identificação de dois outros membros da família de recetores ErbB; HER3 (documento de patente N.°s 5.183.884 e 5.480.968 bem como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) e HER4 (pedido de patente EP N.° 599.274; Plowman et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); e Plowman et al,, Nature, 366:473-475 (1993)). Ambos estes recetores apresentam uma expressão aumentada em pelo menos algumas linhas celulares de cancro da mama.
Os recetores ErbB são geralmente encontrados em várias combinações nas células e a acredita-se que a heterodimerização aumenta a diversidade de respostas celulares frente a uma variedade de ligandos de ErbB (Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132 (1995)). o EGFR é ligado por seis ligandos diferentes; Fator de Crescimento Epidérmico (EGF), Fator de Crescimento Transformante alfa (TGF-alfa), anfirregulina, Fator de Crescimento Epidérmico de Ligação de Heparina (HB-EGF), betacelulina e epirregulina (Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994)). Uma família de proteínas de herregulina que resulta do splicing alternativo de um gene único são ligandos para HER3 e HER4. A família de herregulina inclui herregulinas alfa, beta e gama (Holmes et al. , Science, 256:1205-1210 (1992); documento de patente U.S. N. 0 5.641.869; e Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)); fatores de diferenciação de neu (NDFs), fatores de crescimento glial (GGFs) ,* atividade indutora de recetor de acetilcolina (ARIA); e fator derivado de neurónios sensoriais e motores (SMDF). Para uma revisão, veja-se Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996) e Lee et al. Pharm. Rev, 47:51-85 (1995). Recentemente, dois ligandos adicionais de ErbB foram identificados; neurregulina-2 (NRG-2) que está relatada como ligando-se tanto a HER3 como HER4 (Chang et al. Nature 387 509-512 (1997); a Carraway et al Nature 387:512-516 (1997)) e neurregulina-3 que se liga a HER4 (Zhang et al. PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)). HB-EGF, betacelulina e epirregulina também se ligam a HER4.
Embora EGF e TGF-alfa não se liguem a HER2, o EGF estimula o EGFR e HER2 a formar um heterodímero, que ativa o EGFR e resulta na transfosforilação de HER2 no heterodímero. A dimerização e/ou transfosforilação parece ativar a tirosina quinase HER2. Veja-se Earp et al., supra. Igualmente, quando HER3 é coexpressa com HER2, é formado um complexo de sinalização ativo e os anticorpos direcionados contra HER2 são capazes de alterar este complexo (Sliwkowski et al. , J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994) ). Adicionalmente, a afinidade de HER3 para a herregulina (HRG) é aumentada até um estado de afinidade mais elevado quando coexpressa com HER2. Veja-se também, Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 1431-1435 (1995) ; e Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996) em relação ao complexo proteico de HER2-HER3. A HER4, como a HER3, forma um complexo de sinalização ativo com HER2 (Carraway e Cantley, Cell 78:5-8 (1994)).
Superfamília de recetores de TNF Várias moléculas, como o Fator de Necrose Tumoral-alfa ("TNF-alfa"), Fator de Necrose Tumoral-beta ("TNF-beta"), Linfotoxina-alfa (!,LT-alfa'!) , ligando de CD3Q, ligando de CD27, ligando de CD4 0, ligando de OX-4 0, ligando de 4-1BB, ligando de Apo-1 (também referido como ligando de Fas ou ligando de CD95), ligando de Apo-2 (também referido como TRAIL), ligando de Apo-3 (também referido como TWEAK), osteoprotegerina (OPG), APRIL, ligando de RANK (também referido como TRANCE) e TALL-1 (também referido como BlyS, BAFF ou THANK) foram identificados como membros da família de citocinas do Fator de Necrose Tumoral ("TNF") (veja-se, por exemplo, Gruss e Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995); Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996); Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995); Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993); Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992); Documento WO 97/01633 publicado a 16 de janeiro de 1997; documento WO 97/25428 publicado a 17 de julho de 1997; Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998);
Simonet et al. , Cell, 89:309-319 (1997); Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997); Hahne et al., J.
Exp. Med., 188:1185-1190 (1998); documento W098/28426 publicado a 2 de julho de 1998; documento W098/46751 publicado a 22 de outubro de 1998; documento WO/98/18921 publicado a 7 de maio de 1998; Moore et al., Science, 285:260-263 (1999); Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999); Schneider et al. , J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); e Mukhopadhyay et al. , J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)). Entre estas moléculas, o TNF-alfa, TNF-beta, ligando de CD30, ligando de 4-1BB, ligando de Apo-1, ligando de Apo-2 (Apo2L/TRAIL) e ligando de Apo-3 (TWEAK) foram relatados como estando envolvidos na morte celular apoptótica. Ambos o TNF-alfa e TNF-beta foram relatados como induzindo a morte apoptótica em células tumorais suscetíveis (Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 83:1881 (1986); Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)). Várias moléculas na família de TNF também têm um ou mais papéis significativos na função ou desenvolvimento do sistema imunitário (Gruss et al., Blood, 85:3378 (1995)).
Zheng et al. relataram que o TNF-alfa está envolvido na apoptose pós-estimulação de células T CD8 positivas (Zheng et al., Nature, 377:348-351 (1995)). Outros investigadores relataram que o ligando CD30 pode estar envolvido na deleção de células T autorreativas no timo (Amakawa et al., Cold Spring Harbor Laboratory Symposium on Programmed Cell Death, Abstr. N.° 10, (1995)). 0 ligando CD40 ativa muitas
funções das células B, incluindo a proliferação, secreção de imunoglobulinas e sobrevivência (Renshaw et al., J. Exp. Med., 180:1889 (1994)). Outra citocina da família de TNF recentemente identificada, TALL-1 (BlyS), foi relatada, sob determinadas condições, como induzindo a proliferação de células B e secreção de imunoglobulinas. (Moore et al., supra; Schneider et al. , supra; Mackay et al. , J. Exp. Med., 190:1697 (1999)).
As mutações nos genes de recetores ou ligandos de Fas/Apo-1 de ratinho (denominados Ipr e gld, respetivamente) foram associados com alguns distúrbios autoimunes, indicando que o ligando Apo-1 pode desempenhar um papel na regulação da deleção clonal de linfócitos autorreativos na periferia (Krammer et al. , Curr. Op. Immunol., 6:279-289 (1994); Nagata et al. , Science, 267:1449-1456 (1995)). Também foi relatado que o ligando Apo-1 induz a apoptose pós-estimulação em linfócitos T e em linfócitos B CD4 positivos, e pode estar envolvido na eliminação de linfócitos ativados quando a sua função jã não é necessária (Krammer et al. , supra; Nagata et al., supra). Foi relatado que anticorpos monoclonais de ratinho agonistas que se ligam especificamente ao recetor de Apo-1 exibem uma atividade de morte celular que é comparável, ou semelhante à do TNF-alfa (Yonehara et al. , J. Exp. Med., 169 :1747-1756 (1989)) .
Acredita-se que a indução de várias respostas celulares mediadas por tais citocinas da família do TNF é iniciada pela sua ligação a recetores celulares específicos. Previamente, foram identificados dois recetores de TNF de aproximadamente 55 kDa (TNFR1) e 75 kDa (TNFR2) (Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989); Brockhaus et al. , Proc. Natl. Acad. Sei., 87:3127-3131 (1990); documento EP 417.563, publicado a 20 de março de 1991; Loetscher et al. , Cell, 61:351 (1990); Schall et al., Cell, 61:361 (1990); Smith et al. , Science, 248:1019-1023 (1990); Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 88:2830-2834 (1991); Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991) ) . Verificou-se que aqueles TNFRs partilhavam a estrutura típica dos recetores de superfície celular incluindo regiões extracelulares, de transmembrana e intracelulares. As porções extracelulares de ambos os recetores foram descobertas de maneira natural também como proteínas de ligação a TNF solúveis (Nophar et al., EMBO J., 5:3269 (1990); e Kohno et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331 (1990); Hale et al. , J. Cell. Biochem.
Supplement 15F, 1991, p. 113 (P424)). A porção extracelular dos TNFRs de tipo 1 e tipo 2 (TNFR1 e TNFR2) contem um padrão de sequência de aminoãcidos repetitivo de quatro domínios ricos em cisteína (CRDs) designados 1 a 4, começando desde o terminal NH2. (Schall et al. , supra; Loetscher et al. , supra; Smith et al., supra; Nophar et al., supra; Kohno et al., supra; Banner et al., Cell, 73:431-435 (1993)). Um padrão repetitivo semelhante de CRDs existe em muitas outras proteínas da superfície celular, incluindo o recetor do fator de crescimento nervoso p75 (NGFR) (Johnson et al. , Cell, 47:545 (1986); Radeke et al., Nature, 325:593 (1987)), o antigénio de células B CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403 (1989)), o antigénio de células T 0X40 (Mallet et al. , EMBO J., 9:1063 (1990)) e o antigénio Fas (Yonehara et al. , supra e Itoh et al. , Cell, 66:233-243 (1991) ) . As CRDs também são encontradas nas proteínas T2 semelhantes a TNFR solúvel (sTNFR) dos poxvirus de Shope e mixoma (Upton et al., Virology, 160:20-29 (1987); Smith et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335 (1991); Upton et al. , Virology, 184:370 (1991)). 0 alinhamento ótimo destas sequências indica que as posições dos resíduos de cisteína estão bem conservadas. Estes recetores são, por vezes, coletivamente referidos como membros da superfamília de recetores de TNF/NGF.
Os ligandos da família do TNF identificados até à data, com a exceção de Linfotoxina-alfa, são proteínas transmembranares de tipo II, cujo terminal C é extracelular. Em contraste, a maioria dos recetores na família do recetor de TNF (TNFR) identificados até à data são proteínas transmembranares de tipo I. Em ambas as famílias de recetores e ligandos de TNF, contudo, a homologia identificada entre os membros da família foi verificada principalmente no domínio extracelular (pECDp). Várias das citocinas da família de TNF, incluindo TNF-alfa, ligando Apo-1 e ligando CD40, são clivados proteoliticamente na superfície celular; a proteína resultante em cada caso forma tipicamente uma molécula homotrimérica que funciona como uma citocina solúvel. As proteínas da família dos recetores de TNF são também, normalmente, clivadas proteoliticamente para libertar ECDs de recetores solúveis que podem funcionar como inibidores das citocinas cognatas.
Mais recentemente, foram identificados outros membros da família de TNFR. Em von Bulow et al., Science, 278:138-141 (1997), os investigadores descrevem um recetor de membrana plasmática referido como Ativador Transmembrana e interatuador de CAML ou μΤΑΟΙμ (Transmembrane Activator and CAML-Interact or) . É relatado que o recetor de TACI contém um motivo rico em cisterna característico da família de TNFR. Num ensaio in vitro, a reticulação de TACI na superfície de células Jurkat transfetadas com anticorpos específicos para TACI conduziu à ativação de NF-KB (veja-se também, documento WO 98/39361 publicado a 18 de setembro de 1998) .
Laabi et al., EMBO J., 11:3897-3904 (1992) relataram a identificação de um novo gene designado pBCMp cuja expressão foi verificada como coincidindo com a maturação terminal de células B. A grelha de leitura aberta do ADNc normal de BCM previu um polipéptido com 184 aminoácidos de comprimento com um domínio transmembrana único. Posteriormente, estes investigadores denominaram este gene como pBCMAp. (Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22:1147-1154 (1994)) . A expressão de ARNm de BCMA foi relatada como estando ausente nas linhas de células B malignas humanas que representam o estádio de linfdeito pró-B, e portanto, acredita-se que esteja ligada ao estádio de diferenciação dos linfócitos (Gras et al. , Int. Immunology, 7:1093-1106 (1995)). Em Madry et al., Int. Immunology, 10:1693-1702 (1998), foi descrita a clonagem de ADNc de BCMA murino. É relatado que o ADNc de BCMA codifica um polipéptido com 185 aminoácidos de comprimento tendo 62 ê de identidade com ο polipéptido BCMA humano. 0 alinhamento das sequências proteicas de BCMA humano e murino revelou um motivo conservado de seis cisteínas na região N-terminal, sugerindo que a proteína BCMA pertence à superfamília de TNFR (Madry et al., supra).
Em Marsters et al. , Curr. Biol., 6:750 (1996), os investigadores descrevem um polipéptido humano de sequência nativa de comprimento completo, denominado Apo-3, que exibe uma semelhança com a família de TNFR quanto às suas repetições ricas em cisteína e se assemelha a TNFR1 e CD95 no sentido em que contém uma sequência de domínio de morte citoplasmático (veja-se também Marsters et al., Curr. Biol., 6:1669 (1996)). Apo-3 também foi referido por outros investigadores como DR3, wsl-1, TRAMP e LARD (Chinnaiyan et al., Science, 274:990 (1996); Kitson et ai., Nature, 384:372 (1996); Bodmer et ai., Immunity, 6:79 (1997); Screaton et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., 94:4615-4619 (1997)) .
Pan et ai. divulgaram outro membro da família de recetores de TNF referido como "DR4" (Pan et ai., Science, 276:111-113 (1997); veja-se também o documento W098/32856 publicado a 30 de julho de 1998) . Foi relatado que o DR4 contém um domínio de morte citoplasmático capaz de ativar o aparelho de suicídio celular. Pan et al. divulgam que se acredita que DR4 é um recetor para o ligando conhecido como Apo2LITRAIL.
Em Sheridan et ai., Science, 277:818-821 (1997) e Pan et al. , Science, 277:815-818 (1997), é descrita outra molécula que se acredita ser um recetor para Apo2L/'TRAIL (veja-se também o documento W098/51793 publicado a 19 de novembro de 1998; e o documento WO 98/41629 publicado a 24 de setembro de 1998). Aquela molécula é referida como DR5 (também foi alternativamente referida como Apo-2; TRAIL-R, TR6, Tango-63, Ι1ΆΡΟ8, TRICK2 ou KILLER (Screaton et al. , Curr. Biol. , 7:693-696 (1997); Walczak et al. , EMBO J., 16:5386-5387 (1997); Wu et al., Nature Genetics, 17:141-143 (1997); documento W098/35986 publicado a 20 de agosto de 1998; documento EP870.827 publicado a 14 de outubro de 1998; documento W098/46643 publicado a 22 de outubro de 1998; documento WO99/02653 publicado a 21 de janeiro de 1999; documento WO99/09165 publicado a 25 de fevereiro de 1999 e documento W099/11791 publicado a 11 de março de 1999) . Tal como DR4, é relatado que DR5 contém um domínio de morte citoplasmãtico e é capaz de sinalizar a apoptose. A estrutura cristalina do complexo formado entre Apo2L/TRAIL e DR5 é descrita em Hymowitz et al., Molecular Cell, 4 : 563-571 (1999) .
Ainda outro recetor contendo domínio de morte, DR6, foi recentemente identificado (Pan et al. , FEBS Letters, 431:351-356 (1998)) . Além de conter quatro domínios ricos em cisteína extracelulares putativos e um domínio de morte citoplasmãtico, acredita-se que DR6 contém uma sequência de fecho de leucina putativa que se sobrepõem com um motivo rico em prolina na região citoplasmática. O motivo rico em prolina assemelha-se a sequências que se ligam a domínios 3 de homologia de src, que são encontrados em muitas moléculas transdutoras de sinal intracelular.
Um grupo adicional de recetores recentemente identificados é referido como "recetores chamariz" que se acredita que funcionam como inibidores, em vez de transdutores de sinalização. Este grupo inclui DcRl (também referido como TRID, LIT ou TRAIL-R3) (Pan et al. , Science, 276:111-113 (1997); Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997); McFarlane et al., J. Biol. Chem., 272:25417-25420 (1997); Schneider et al. , FEBS Letters, 416:329-334 (1997); Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997); e
Mongkolsapaya et al., J. Immunol., 160:3-6 (1998)) e DcR2 (também designado TRIJNDD ou TRAIL-R4) (Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997); Pan et al., FEBS Letters, 424:41-45 (1998); Degli-Esposti et al., Immunity, 7:813-820 (1997)), ambas moléculas de superfície celular, bem como OPG (Simonet et al., supra; Emery et al., infra) e DcR3 (Pitti et al. , Nature, 396:699-703 (1998)), ambas as quais são proteínas solúveis secretadas.
Membros adicionais recém-identificados da família de TNFR incluem CARI, HVEM, GITR, ZTNFR-5, NTR-1 e TNFL1 (Brojatsch et al. , Cell, 87:845-855 (1996); Montgomery et al. , Cell, 87:427-436 (1996); Marsters et al. , J. Biol. Chem., 272:14029-14032 (1997); Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:6216-6221 (1997); Emery et al., J. Biol. Chem., 273:14363-14367 (1998); documento W099/04001 publicado a 28 de janeiro de 1999; documento WO99/07738 publicado a 18 de fevereiro de 1999; documento WO99/33980 publicado a 8 de julho de 1999).
Como revisto recentemente por Tewari et al., o TNFR1, TNFR2 e CD4 0 modulam a expressão de citocinas proinflamatórias e coestimuladoras, recetores de citocinas e moléculas de adesão celular através da ativação do fator de transcrição, NF-κΒ (Tewari et al., Curr. Op. Genet. Develop., 6:39-44 (1996)). NF-κΒ é o protótipo de uma família de fatores de transcrição diméricos cujas subunidades contêm regiões Rei conservadas (Verma et al., Genes Develop., 9:2723-2735 (1996); Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14:649-681 (1996)). Na sua forma latente, NF-κΒ forma complexos com membros da família de inibidores I-kB; depois da inativação de I-κΒ em resposta a determinados estímulos, ο NF-κΒ libertado transloca-se para o núcleo onde se liga a sequências de ADN específicas e ativa a transcrição génica. Como descrito acima, os membros de TNFR identificados até à data incluem ou carecem de uma região de domínio de morte intracelular. Algumas moléculas de TNFR que carecem de um domínio de morte, como TNFR2, CD40, HVEM e GITR, são capazes de modular a atividade de NF-κΒ. (veja-se, por exemplo, Lotz et al., J. Leukocyte Biol., 60:1-7 (1996) ) .
Para uma revisão sobre a família TNF de citocinas e os seus recetores, veja-se Ashkenazi e Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998); Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) ; Gruss e Dower, supra, e Nagata, Cell, 88:355-365 (1997) .
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Os linfócitos são um dos muitos tipos de glóbulos brancos produzidos na medula óssea durante o processo de hematopoiese. Existem duas populações principais de linfócitos: linfócitos B (células B) e linfócitos T (células T) . Os linfócitos de particular interesse no presente documento são as células B.
As células B amadurecem dentro da medula óssea e abandonam a medula expressando um anticorpo de ligação a antigénio na sua superfície celular. Quando uma célula B naive se encontra pela primeira vez com o antigénio para o qual o seu anticorpo ligado à membrana é específico, a célula começa a dividir-se rapidamente e a sua descendência diferencia-se em células B de memória e células efetoras denominadas "células plasmãticas". As células B de memória têm uma esperança de vida mais longa e continuam a expressar um anticorpo ligado à membrana com a mesma especificidade que a célula parental original. As células plasmãticas não produzem anticorpo ligado à membrana mas, em vez disso, produzem o anticorpo numa forma que pode ser secretada. Os anticorpos secretados são as moléculas efetoras principais da imunidade humoral. 0 antigénio CD20 (também denominado antigénio de diferenciação restrita a linfócitos B humanos, Bp35) é uma proteína de transmembrana hidrofõbica com uma massa molecular de aproximadamente 35 kD localizada em linfócitos pré-B e B maduros (Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19) : 11282-11287 (1989) ; e Einfeld et ai. ΞΜΒΟ J. 7(3) :711-717 (1988)) . O antigénio também é expresso em mais de 90 ê de linfomas não Hodgkin (NHL) de células B (Anderson et ai. Blood 63(6):1424-1433 (1984)), mas não se encontra em células estaminais hematopoiéticas, células pré-B, células plasmáticas normais ou outros tecidos normais (Tedder et al. J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)). 0 CD20 regula uma ou mais etapas precoces no processo de ativação para a iniciação do ciclo celular e diferenciação celular (Tedder et ai., supra) e possivelmente funciona como um canal de iões cálcio (Tedder et al. J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)).
Dada a expressão de CD20 nos linfomas de células B, este antigénio pode servir como um candidato para o "direcionamento" de tais linfomas. Essencialmente, tal direcionamento pode ser generalizado como se segue: anticorpos específicos para o antigénio de superfície CD20 das células B são administrados a um paciente. Estes anticorpos anti-CD20 ligam-se especificamente ao antigénio CD20 de (aparentemente) células B normais e malignas; o anticorpo ligado ao antigénio de superfície CD20 pode conduzir à destruição e depleção de células B neoplãsicas. Adicionalmente, agentes químicos ou marcadores radioativos tendo o potencial para destruir o tumor podem ser conjugados com o anticorpo anti-CD20 de modo que o agente é especificamente "administrado" às células B neoplãsicas. Independentemente da abordagem, um objetivo principal consiste em destruir o tumor; a abordagem específica pode ser determinada pelo anticorpo anti-CD20 particular que é utilizado e, portanto, as abordagens disponíveis para direcionar o antigénio CD20 podem variar consideravelmente. GDI 9 é outro antigénio que é expresso sobre a superfície de células da linhagem B. Tal como o CD20, CD19 é encontrado em células ao longo da diferenciação da linhagem a partir do estádio de célula estaminal até um ponto imediatamente antes da diferenciação terminal em células plasmáticas (Nadler, L. Lymphocyte Typing II 2: 3-37 e Apêndice, Renling et al. eds. (1986) por Springer Verlag). Contudo, ao contrário de CD20, a ligação de anticorpo a GDI 9 provoca a internalização do antigénio GDI9. 0 antigénio CD19 é identificado pelo anticorpo HD237-CD19 (também denominado o anticorpo μΒ4μ) (Kiesel et al. Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)), entre outros. 0 antigénio CD19 está presente em 4-8 ê das células mononucleares do sangue periférico e em mais de 90 ê das células B isoladas a partir do sangue periférico, baço, gânglios linfáticos ou amígdalas. CD19 não é detetado nas células T do sangue periférico, monócitos ou granulócitos. Virtualmente todas as leucemias linfoblásticas agudas (ALL) de células não T, leucemias linfõciticas crónicas (CLL) de células B e linfomas de células B expressam CD19 detetável pelo anticorpo B4 (Nadler et al. J. Immunol. 131:244 (1983); e Nadler et al. em Progress in Hematology Vol. XII pp. 187-206. Brown, E. ed. (1981) por Grune e Stratton, Inc) .
Foram identificados anticorpos adicionais que reconhecem antigénios específicos do estádio de diferenciação expressos pelas células da linhagem de células B. Entre estes estão o anticorpo B2 direcionado contra o antigénio CD21; anticorpo B3 direcionado contra o antigénio CD22 e o anticorpo J5 direcionado contra o antigénio CD10 (também denominado CALLA). Veja-se o documento de patente U.S. N.° 5.595.721 publicado a 21 de janeiro de 1997 (Kaminski et al.) . 0 anticorpo rituximab (RITUXAN®) é um anticorpo monoclonal murino/humano quimérico manipulado geneticamente direcionado contra o antigénio CD20. 0 rituximab é o anticorpo denominado μ02Β8μ no documento de patente U.S. N. 0 5.736.137 publicado a 7 de abril de 1998 (Anderson et al.) . 0 RITUXAN® está indicado para o tratamento de pacientes com linfoma não Hodgkin de células B, CD20 positivo, reincidente ou refratário de baixo grau ou folicular. Estudos sobre o mecanismo de ação in vitro demonstraram que o RITUXAN® se liga ao complemento humano e lisa linhas de células B linfoides através de CDC (Reff et al, Blood 83(2):435-445 (1994)). Adicionalmente, tem atividade significativa em ensaios para ADCC. Mais recentemente, o RITUXAN® mostrou ter efeitos antiproliferativos em ensaios de incorporação de timidina tritiada e induzir a apoptose diretamente, enquanto outros anticorpos anti-CD19 e CD20 não o fazem (Maloney et al. Blood 88(10):637a (1996)). A sinergia entre RITUXAN® e quimioterapias e toxinas também foi observada experimentalmente. Em particular, o RITUXAN® sensibiliza linhas de células de linfoma de células B humanas aos efeitos citotóxicos da doxorrubicina, CDDP, VP-16, toxina da difteria e ricina (Demidem et al. Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177-186 (1997)). Estudos pré- clínicos in vivo mostraram que o RITUXAN esgota as células B do sangue periférico, gânglios linfáticos e medula óssea de macacos cinomolgos, supostamente por meio de processos mediados por células e complemento (Reff et al. Blood 83(2) :435-445 (1994) ) .
SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona anticorpos multivalentes (por exemplo, anticorpos tetravalentes) com quatro ou mais sítios de ligação a antigénio, como definido na reivindicação 1. Numa forma de realização, o anticorpo multivalente compreende cinco ou mais (por exemplo, até cerca de oito) sítios de ligação a antigénio. 0 antigénio multivalente do presente documento é preferentemente não uma IgA ou IgM de sequência nativa e pode ter apenas uma região Fc.
Os anticorpos multivalente do presente documento têm propriedades que são desejáveis, entre outras coisas, desde um ponto de vista terapêutico. Por exemplo, o anticorpo multivalente pode (1) ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rapidamente que um anticorpo bivalente por uma célula expressando um antigénio ao qual os anticorpos se ligam; (2) ser um anticorpo agonista; e/ou (3) induzir a morte celular e/ou apoptose de uma célula que expressa um antigénio ao qual o anticorpo multivalente é capaz de se ligar. 0 panticorpo parentalp que proporciona pelo menos uma especificidade de ligação de antigénio pode ser um que é internalizado (e/ou catabolizado) por uma célula que expressa um antigénio ao qual o anticorpo se liga; e/ou pode ser um anticorpo agonista, indutor da morte celular e/ou indutor da apoptose, e a forma multivalente do anticorpo como descrito no presente documento pode apresentar uma ou mais melhorias numa ou mais destas propriedades. Além disso, o anticorpo parental pode carecer de uma ou mais destas propriedades, mas pode ser dotado com elas quando construído como um anticorpo multivalente como descrito no presente documento.
Os quatro ou mais srtios de ligaçao a antigénio dos anticorpos multivalentes do presente documento podem todos ligar-se ao mesmo antigénio; ou podem ligar-se a dois ou mais (por exemplo, desde dois a cerca de três) antigénios diferentes. 0 anticorpo multivalente pode ligar-se a (1) uma proteína da superfície celular expressa (ou superexpressa) por células tumorais, por exemplo, ao Recetor de Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), recetor HER2, recetor HER3, recetor HER4, ou DcR3; (2) um recetor na superfamília do recetor de Fator de Necrose Tumoral (TNF) (por exemplo, um recetor de Apo2L, como DR4, DR5, DcRl ou DcR2); e/ou (3) um antigénio de superfície de células B (como CD19, CD20, CD22 ou CD4 0) . Na forma de realização preferida da invenção, todos os sítios de ligação a antigénio funcionais do anticorpo multivalente se ligam ao mesmo antigénio como listado acima (por exemplo, todos os quatro sítios de ligação a antigénio de um anticorpo tetravalente se ligam a (1) , (2) ou (3) ) . A invenção também proporciona imunoconjugados que compreendem o anticorpo multivalente conjugado com um agente citotóxico. 0 agente citotóxico aqui pode ser um que é ativo na morte das células uma vez internalizado. É divulgado no presente documento uma cadeia polipeptídica que compreende VD1-(XI) n-VD2 (X2) n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, XI e X2 representam um aminoácido ou polipéptido e n é 0 ou 1. Por exemplo, a cadeia polipeptídica pode compreender uma cadeia VH-CHl-ligante flexível-VH-CHI-região Fc; cadeia VH-CHl-VH-CHl-região Fc; cadeia VL-CL-ligante flexível-VL-CL-região Fc ou cadeia VL-CL-VL-CL-região Fc. A cadeia polipeptídica pode compreender VH-CHI-ligante flexível-VH-CHI-domínio de dimerização; VH-CHI-VH-CH1-domínio de dimerização; VL-CL-ligante flexível-VL-CL-domínio de dimerização ou VL-CL-VL-CL-domínio de dimerização. Por exemplo, a cadeia polipeptídica pode compreender uma cadeia VH-CHl-ligante flexíve-VH-CHl-região de dobradiça; VH-CHl-VH-CHl-região de dobradiça. É divulgado no presente documento um anticorpo que compreende uma ou mais (preferentemente duas) de tais cadeias polipeptídicas. 0 anticorpo preferentemente compreende pelo menos dois (e preferentemente quatro) polipéptidos de domínio variável de cadeia leve ou cadeia pesada, por exemplo, onde os polipéptidos de domínio variável de cadeia leve compreendem VL-CL e os polipéptidos de domínio variável de cadeia pesada compreendem VH-CHI. É divulgado no presente documento uma cadeia polipeptídica que compreende três ou mais domínios variáveis de cadeia pesada ou cadeia leve, em que cada dos domínios variáveis é capaz de se combinar com três ou mais polipéptidos de domínio variável de cadeia leve ou cadeia pesada para formar três ou mais sítios de ligação a antigénio, cada um direcionado contra o mesmo antigénio. É divulgado no presente documento um anticorpo isolado que compreende a cadeia polipeptídica. Quando a cadeia polipeptídica compreende três ou mais domínios variáveis de cadeia pesada, o anticorpo pode compreende adicionalmente três ou mais polipéptidos de domínio variável de cadeia leve que se podem combinar com os domínios variáveis de cadeia pesada para formar três ou mais sítios de ligação a antigénio. Exemplos de tais anticorpos são mostrados na Fig. 23D (com três sítios de ligação a antigénio) e na Fig. 23E (com quatro sítios de ligação a antigénio). É divulgada no presente documento uma cadeia polipeptídica que compreende a fórmula: (a) VL-CL-ligante flexível-VL-CL-ligante flexível-VL-CL; (b) VH-CHl-ligante flexível-VH-CH1-ligante flexível-VH-CH1; (c) (VL-CL) n, em que n é três ou mais; ou (d) (VH-CHl)n, em que n é três ou mais. A invenção proporciona adicionalmente: um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo multivalente; um vetor que compreende o ácido nucleico que codifica o anticorpo multimérico, opcionalmente, operativamente ligado a sequências de controlo reconhecidas por uma célula hospedeira transformada com o vetor; uma célula hospedeira que compreende (por exemplo, transformada com) o ácido nucleico que codifica o anticorpo multimérico ou cadeia polipeptídica; um método para a produção do anticorpo multivalente que compreende cultivar a célula hospedeira de modo que o ácido nucleico é expresso e, opcionalmente, recuperar o anticorpo multivalente ou cadeia polipeptídica a partir da cultura de células hospedeiras (por exemplo, a partir do meio de cultura das células hospedeiras) . Os ácidos nucleicos que codificam (1) os domínios variáveis de cadeia pesada e (2) os domínios variáveis de cadeia leve do anticorpo multivalente são preferentemente coexpressos por uma célula hospedeira transformada com ambos (1) e (2) . Os ácidos nucleicos (1) e (2) podem estar presentes no mesmo vetor, ou em vetores diferentes. São contempladas aplicações diagnósticas e terapêuticas para os anticorpos multivalentes divulgados no presente documento. Ê divulgado no presente documento um método para determinar a presença de um antigénio de interesse que compreende a exposição de uma amostra suspeita de conter o antigénio para o anticorpo multivalente e determinar a ligação do anticorpo multivalente à amostra. Ambos métodos de diagnóstico in vitro e in vivo são divulgados no presente documento. É divulgado no presente documento um método para o tratamento de um mamífero que padece de, ou é predisposto a, uma doença ou distúrbio, que compreende administrar ao mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo multivalente como divulgado no presente documento, ou de uma composição que compreende o anticorpo multivalente e um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 distúrbio a ser tratado no presente documento pode ser cancro, em cujo caso o método pode compreender adicionalmente a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente citotõxico ao mamífero. É divulgado no presente documento um método para induzir a apoptose de uma célula cancerosa que compreende a exposição da célula a um anticorpo multivalente como descrito no presente documento, em que o anticorpo multivalente se liga a um recetor na superfamília de recetores do Fator de Necrose Tumoral (TNF). 0 método pode envolver a morte de uma célula B através da exposição da célula B a um anticorpo multivalente que se liga a um antigénio de superfície das células B. Além disso, o método pode referir-se à morte de uma célula que expressa (ou superexpressa) um recetor ErbB que compreende a exposição da célula a um anticorpo que se liga ao recetor ErbB.
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EjX 6 V u M>U w in iJu γβ>ν sJlvJ* m vie! m £9 A Figura 1 é uma representação esquemática de uma IgG nativa e da digestão da mesma com (1) papaína para gerar dois fragmentos Fab e uma região Fc ou (2) pepsina para gerar um fragmento F(ab')2 © múltiplos fragmentos pequenos. As pontes de dissulfureto são representadas por linhas entre os domínios CHI e CL e os dois domínios CH2. V é domínio variável; C é domínio constante; L significa cadeia leve e H significa cadeia pesada.
As Figuras 2A-E ilustram as estruturas dos cinco isotipos de imunoglobulina principais que ocorrem naturalmente; IgG (Fig, 2A) , IgD (Fig. 2B) , IgE (Fig. 2C) , dímero de IgA (Fig. 2D) e pentâmero de IgM (Fig. 2E) . A Figura 3 ilustra os alinhamentos das regiões Fc de IgG de sequência nativa. Sequências de região Fc de IgG humana de sequência nativa, humlgGl (alotipos não A e A) (SEQ ID NOs: 1 e 2, respetivamente), humIgG2 (SEQ ID N0:3), humIgG3 (SEQ ID NO:4) e humIgG4 (SEQ ID NO:5), são mostrados. A sequência de IgGl humana é o alotipo não A, e diferenças entre esta sequência a o alotipo A (nas posições 356 e 358; sistema de numeração EU) são mostradas abaixo da sequência de IgGl humana. Sequências de região Fc de IgG murina de sequência nativa, murlgGl (SEQ ID N0:6), murIgG2A (SEQ ID N0:7), murIgG2B (SEQ ID N0:8) e murlgG3 (SEQ ID NO:9), também são mostradas.
As Figuras 4A-B ilustram esquematicamente anticorpos tetravalent.es de acordo com a presente invenção. Na Fig. 4A, os quatro Fabs de ligação a antigénio são numerados (1 e 2 para cada braço do anticorpo tetravalente) e X representa um domínio de dimerização. Na Fig. 4B, o domínio de dimerização do anticorpo tetravalente é uma região Fc. A Figura 5 mostra a construção usada para expressão de um anticorpo anti-HER2 tetravalente (0ctHER2) no Exemplo 1.
As Figuras 6A-C ilustram a ligação de 0ctHER2 (Fig. 6A); rhuMAb de IgGl bivalente 4D5-8 expresso por células 293 (Fig. 6B); e HERCEPTIN® em frascos (expresso por células de ovário de hamster chinês (CEO)) (Fig. 6C) para o domínio extracelular (ECD) de HER2 como determinado utilizando um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). A Figura 7 ilustra uma análise de ultracentrifugação da ligação de 0ctHER2 ao ECD de HER2. São mostradas as massas moleculares médias (teóricas ou determinadas experimentalmente) frente à razão molar de 0ctHER2 para o ECD de HER2. As massas moleculares médias calculadas teóricas assumindo que o anticorpo tetravalente tem quatro sítios de ligação completamente funcionais são mostradas em círculos; as massas moleculares médias calculadas teóricas assumindo que o anticorpo tetravalente tem três sítios de ligação completamente funcionais são mostradas em quadrados; e os triângulos representam massas moleculares determinada experimentalmente.
As Figuras 8A-D ilustram a atividade inibitória do crescimento de HERCEPTIN® em comparação com 0ctHER2 utilizando linhas celulares SKBR3 (que superexpressa HER2 3 + ) (Fig. 8A) , MDA 361 (que superexpressa HER2 2+) (Fig. 8B), BT474 (que superexpressa HER2 3+) (Fig. 8C) e MCF7 (que superexpressa HER2 0+) (Fig. 8D). A Figura 9 ilustra o efeito de ligantes flexíveis sobre a atividade inibidora do crescimento dos anticorpos anti-HER2 tetravalentes em relação a células MDA 231 (superexpressa HER2 1+) ou células SKBR3 (superexpressa HER2 3 + ) .
As Figuras 10A-B comparam a taxa de internalização/catabolismo de 0ctHER2 (Fig. 10A) com a de HERCEPTIN® (Fig. 10B), em relação a ambas as linhas celulares MDA 453 (superexpressa HER2 2 + ) e SKBR3 (superexpressa HER2 3 + ) . As Figuras 11A-I são fotografias de microscopia eletrónica que mostram a internalização de 0ctHER2. As Figuras 11A-F mostram a localização subcelular de 12bI-OctHER2 em células SKBR3. Foram observados grãos de prata autorradiográficos associados com as vilosidades da membrana celular apical (Fig. 11A), em estreita proximidade com uma reentrância revestida em formação (Fig. 11B, seta), com vesículas citosólicas lisas (Figs. 11C e D) e endossomas (Figs. 11 E e F) . Barras = 0,25 μΜ. As Figs. 11G-I mostram a internalização no tempo 0 horas (Fig. 11G) e 5 horas (Figs. 11H e 111). As Figuras 12A-E ilustram a apoptose induzida por um anticorpo tetravalente anti-DR5 (Octopus 16E2), um anticorpo IgG bivalente anti-DR5 (IgG 16E2), e
Apo2L,/TRAIL (Apo2L) sobre linhas celulares de cancro: COLO 205 (Fig. 12A), SK-MES-1 (Fig. 12B), HCT116 (Fig. 12C), e HOP 92 (Fig. 12D), em comparação com uma linha celular de controlo não cancerosa, HUMEC (Fig. 12E) . As Figuras 13A-D são lâminas histológicas coradas para detetar células apoptõticas. Tecidos tumorais a partir de ratinhos tratados com Octopus 16E2 ou Apo2L/TRAIL foram fixos em formalina a 10 ê e depois incorporados em parafilme e seccionados sobre lâminas que foram depois coradas com hematoxilina e eosina e visualizadas sob uma ampliação de 40QX. 0 efeito de
Octopus 16E2 a 6 e 24 horas é mostrado nas Figs. 13A e B, respetivamente; as células tratadas com controlo são mostradas na Fig. 13C; e células tratadas com Apo2/TRAIL são mostradas na Fig. 13D. A Figura 14 representa a atividade in vivo de
Apo2L/TRAIL (60 mg/kg, 5x/semana), IgG bivalente 3H3 (5 mg/kg dado nos dias 0, 3, 5 e 9) , IgG bivalente 16E2 (16E2) (5 mg/kg dado nos dias 0, 3, 5 e 9) , e Octopus 16E2 (5 mg/kg dado nos dias 0, 3, 5 e 9) em relação a tumores COLO 205 em ratinhos nus atímicos. A Figura 15 representa um ensaio in vitro a1amarBlue que confirma a atividade apoptótica do material utilizado nos estudos de ratinhos (Apo2L/'TRAIL e Octopus 16E3) em comparação com o controlo positivo padrão de Apo2L. Confirmou-se que o anticorpo anti-IgE (E25) utilizado como controlo negativo nos estudos de ratinho não tinha qualquer atividade apoptótica. A Figura 16 representa os resultados de um ensaio de apoptose de cristal violeta comparando Octopus 3H3 anti-DR5 com vários lotes do Octopus 16E2 anti-DR5,
As Figuras 17A-B revelam os resultados do ensaio de apoptose alamarBlue em relação a Apo2L/TRAIL (documento W097/25428), anticorpo Octopus 3H3 anti-DR5, anticorpo Octopus 16E2 anti-DR5, e Apo2L/TRAIL com uma etiqueta de epítopo FLAG reticulada por um anticorpo anti-FLAG (documento W097/25428), em relação a células SK-MES-1 (Fig. 17A) e Jurkat (Fig. 17B) na presença de soro fetal bovino a 5 ê (FBS).
As Figuras 18A-C ilustram curvas de resposta à dose que mostram o efeito do Octopus 16E2 anti-DR5 (gráficos superiores) em comparação com Apo2L/TRAIL (gráficos inferiores) sobre o crescimento de linhas celulares tumorais humanas de leucemia, cancro pulmonar de células não pequenas, cancro do cólon, cancro do sistema nervoso central (SNC), melanoma, cancro ovãrico, cancro renal, cancro de próstata e cancro de mama aos 2 dias. Os resultados são a partir do National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program. Todas as amostras foram testadas a 5 concentrações, começando a 1 ê da solução-mãe (solução-mãe de Octopus 16E2 a 0,2 mg/ml) e 4 x 0,5 diluições log.
As Figuras 19A-C ilustram curvas de resposta à dose que mostram o efeito do Octopus 16E2 anti-DR5 (gráficos superiores) em comparação com Apo2L/TRAIL (gráficos inferiores) sobre o crescimento de linhas celulares tumorais humanas de leucemia, cancro pulmonar de células não pequenas, cancro do cólon, cancro do sistema nervoso central (SNC), melanoma, cancro ovãrico, cancro renal, cancro de próstata e cancro de mama aos 6 dias. Os resultados são a partir do National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program. Todas as amostras foram testadas a 5 concentrações, começando a 1 ê da solução-mãe (solução-mãe de Octopus 16E2 a 0,2 mg/ml) e 4 x 0,5 diluições log.
As Figuras 20A-B apresentam um resumo quantitativo dos resultados in vitro aos 2 dias do National Cancer
Institute Developmental Therapeutics Program comparando o Octopus 16E2 anti-DR5 (Fig. 20A) com
Apo2 L/TRAIL (Fig. 20B) analisando a inibição do crescimento (GI50), estase (TGI) e toxicidade (CL50). As Figuras 21A-B apresentam um resumo quantitativo dos resultados in vitro aos 6 dias do National Cancer
Institute Developmental Therapeutics Program comparando o Octopus 16E2 anti-DR5 (Fig. 21A) com
Apo2 L/TRAIL (Fig. 21B) analisando a inibição do crescimento (GI50), estase (TGI) e toxicidade (CL50). A Figura 22 ilustra a apoptose de células Wil-2 pelo anticorpo RITUXAN® anti-CD20, RITUXAN® reticulado com um anticorpo anti-IgG humana (RITUXAN®-IgG) e urn anticorpo anti-CD20 tetravalente (OctCD20).
As Figuras 23A-E são representações ilustrando ο anticorpo Octopus/tetravalente de comprimento completo (Fig. 23B) , o F(ab)'2 de Octopus (Fig. 23C) , Fab de POPoct-3 (Fig. 23D) e Fab de POPoct-4 (Fig. 23Ξ) em comparação com a IgG nativa (Fig. 23A) . Urn gel de Tris-Glicina corado com coomassie representativo de proteínas de Octopus anti-CD20 (C2B8) compara os tamanhos dos anticorpos intactos em condições não redutoras (Fig. 23F), e das cadeias pesadas em condições redutoras, sob as quais as ligações dissulfureto são interrompidas resultando na separação das cadeias pesada e leve (Fig. 23G). A Figura 24 ilustra a construção da cadeia principal de F(ab')2 de Octopus. Qualquer região VH/CH1 pode ser substituída na cadeia principal de F(ab')2 através dos sítios de enzimas de restrição BamHI, Nhel e BspEI. A Figura 25 ilustra a construção da cadeia pesada de POPoct-3 . A Figura 26 ilustra a construção da cadeia pesada de POPoct-4 . A Figura 27 ilustra a atividade de anticorpos anti-HER2 multivalentes em ensaios de citoestase utilizando células BT474.
As Figuras 28A-B ilustram a atividade de anticorpos anti-HER2 multivalentes em ensaios de citoestase utilizando células SKBR3. As figuras são traçados representativos de ensaios de citoestase n=4.
As Figuras 29A-B mostram a capacidade de internalização de anticorpos anti-HER2 multivalentes em células SKBR3 (Fig. 29A) e células BT474 (Fig. 29B) .
As Figuras 30A-B revelam a apoptose de células COLO205 por anticorpos anti-DR5 multivalentes.
As Figuras 31A-B demonstram a sinalização de anticorpos anti-DR5 multivalentes através da via da caspase. A Figura 32 compara a apoptose induzida por RITUXAN® reticulado com IgG (RITUXAN-IgG) e Oct.CD20 reticulado com IgG (0ctCD2Q-IgG). A Figura 33 mostra a apoptose de células WIL2 por anticorpos anti-CD20 multivalentes, o anticorpo anti-CD20 IF5 (Clark et al. PNAS (USA) 82:1766-1770 (1985)) e anticorpo IF5 reticulado com IgG (IF5 + IgG-X). A Figura 34 ilustra a adesão de células homotípicas em células WIL2S induzida pelo anticorpo anti-CD20 IF5, anticorpo IF5 reticulado com IgG e POPoct-3 CD20, A Figura 35 reflete a internalização/catabolismo de RITUXAN® ou 0ctCD20 em linhas celulares DB, WIL2 e de linfoma de células B Ramos.
Descrição detalhada das formas de realização preferidas I. Definições
Ao longo da presente memória descritiva e reivindicações, a numeração dos resíduos numa cadeia pesada de imunoglobulina é aquela do índice EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . 0 "índice EU como em Kabat" refere-se à numeração de resíduos do anticorpo EU IgGl humano.
Um "recetor ErbB" é uma proteína tirosina quinase recetora que pertence à família de recetores de ErbB e inclui os recetores EGFR, HER2, ErbB3 e ErbB4 bem como TEGFR (documento de patente U.S. 5.708.156) e outros membros desta família a ser identificados no futuro. 0 recetor ErbB irá compreender, no geral, um domínio extracelular, que se pode ligar a um ligando de ErbB; um domínio de transmembrana lipofílico; um domínio de tirosina quinase intracelular conservado; e um domínio de sinalização no terminal carboxilo que alberga vários resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. 0 recetor ErbB pode ser um recetor ErbB de sequência nativa ou uma variante de sequência de aminoácidos do mesmo. Preferentemente o recetor ErbB é o recetor ErbB humano de sequência nativa.
Por pligando de ΕΛΒμ entende-se um polipéptido que se liga a e/ou ativa um recetor ErbB. 0 ligando de ErbB de particular interesse no presente documento é um ligando de ErbB humano de sequência nativa como o Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) (Savage et al. , J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); o Fator de Crescimento Transformante alfa (TGF-alfa) (Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)); anfirregulina também conhecida como schwanoma ou fator de crescimento autócrino de queratinócitos (Shoyab et al. Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348:257-260 (1990); e Cook et al. Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557 (1991)); betacelulina (Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); e Sasada et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB-EGF)(Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)); epirregulina (Toyoda et al, J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); e Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)), uma herregulina (veja-se abaixo); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 94:9562-9567 (1997)); ou cripto (CR-1) (Kannan et al. J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). Os ligandos de ErbB que se ligam a EGFR incluem EGF, TGF-alfa, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF e epirregulina. Os ligandos de ErbB que se ligam a HER3 incluem herregulinas. Os ligandos de ErbB capazes de se ligar a HER4 incluem betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3 e herregulinas. pHerregulinap (HRG) quando utilizado no presente documento refere-se a um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos codificada pelo produto génico de herregulina como divulgado no documento de patente U.S. N.° 5.641.869 ou Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993), e variantes biologicamente ativas de tais polipéptidos. Exemplos de herregulinas incluem herregulina-alfa, herregulina-betal, herregulina-beta2 e herregulina-beta3 (Holmes et al. , Science, 256:1205-1210 (1992); e documento de patente U.S. N.° 5.641.869); fator de diferenciação de neu (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)); atividade indutora de recetor de acetilcolina (ARIA) (Falls et al. Cell 72:801-815 (1993)); fatores de crescimento glial (GGFs)(Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); fator derivado de neurónios sensoriais e motores (SMDF) (Ho et al. J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)); gama-herregulina (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Um exemplo de um fragmento biologicamente ativo/variante de sequência de aminoácidos de um polipéptido HRG de sequência nativa, é um fragmento de domínio semelhante a EGF (por exemplo, HRGbetal:L77-244) -
Um "hetero-oligómero de ErbB" no presente documento é um oligómero associado de forma não covalente que compreende pelo menos dois recetores ErbB diferentes. Tais complexos podem formar-se quando uma célula que expressa dois ou mais recetores ErbB é exposta a um ligando de ErbB e podem ser isolados por imunoprecipitação e analisados por SDS - PAGE como descrito em Sliwkowski et al. , J. Biol. Chem., 269(20) :14 661-14 665 (19 94), por exemplo. Exemplos de tais hetero-oligómeros de ErbB incluem complexos de EGFR-HER2, HER2-HER3 e HER3-HER4. Além disso, o hetero-oligómero de ErbB pode compreender dois ou mais recetores HER2 combinados com um recetor ErbB diferente, como HER3, HER4 ou EGFR. Outras proteínas, como uma subunidade de recetor de citocina (por exemplo, gpl30), podem ser incluídas no hetero-oligómero.
Os termos !!ErbBl", "recetor de fator de crescimento epidérmico" e "EGFR" são utilizados indistintamente no presente documento e referem-se ao EGFR de sequência nativa como divulgado, por exemplo, em Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), incluindo variantes do mesmo (por exemplo, um mutante de deleção de RGFR como em
Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). erbBl refere-se ao gene que codifica o produto proteico de EGFR. Exemplos de anticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506) , MAb 455 (ATCC CRL HB8507) , MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (veja-se, documento de patente U.S. N.° 4.943.533, Mendelsohn et al.) e variantes dos mesmos, como 225 quimerizado (C225) e 225 humano remodelado (H225) (veja-se, o documento WO 96/40210, Imclone Systems Inc.).
As expressões μΕι±>Β2μ e μHER2μ sâo utilizadas indistintamente no presente documento e referem-se à proteína HER2 humana de sequência nativa descrita, por exemplo, em Semba et al. , PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) e Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (número de acesso do Genebank X03363), e variantes da mesma. O termo erbB2 refere-se ao gene que codifica HER2 humano e neu refere-se ao gene que codifica ρ185Ώβ1! de rato. 0 HER2 preferido é HER2 humano de sequência nativa. Exemplos de anticorpos que se ligam a HER2 incluem os MAbs 4D5 (ATCC CRL 10463), 2C4 (ATCC HB-12697), 7F3 (ATCC HB-12216) e 7C2 (ATCC HB 12215) (veja-se, documento de patente U.S. N.° 5.772.997; documento W098/77797 e documento de patente U.S. N.0 5.840.525). Gs anticorpos anti-HER2 humanizados incluem huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN®) como descrito no Quadro 3 do documento de patente U.S. 5.821.337; 520C9 humanizado (W093/21319). Os anticorpos anti-HER2 humanos são descritos no documento de patente U.S. N.° 5.772.997 publicado a 3 0 de junho de 19 98 e documento WO 97/00271 publicado a 3 de janeiro de 1997. pErbB3p e pHER3p referem-se ao polipéptido recetor como divulgado, por exemplo, nos documentos de patente U.S. N.°s 5.183.884 e 5.480.968 bem como Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989), incluindo variantes do mesmo. Exemplos de anticorpos que se ligam a HER3 são descritos no documento de patente U.S. N.° 5.968.511 (Akita e Sliwkowski), por exemplo, o anticorpo 8B8 (ATCC HB 12070) ou uma variante humanizada do mesmo.
Os termos μΕιόοΒ4μ e pHER4p no presente documento referem-se ao polipéptido recetor como divulgado, por exemplo, no pedido de patente EP N.° 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:1746-1750 (1993); e Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), incluindo variantes do mesmo como as isoformas de HER4 divulgadas no documento WO 99/19488.
Um pmarcador de superfície de células Βμ no presente documento é um antigénio expresso sobre a superfície de uma célula B que pode ser alvejado com um anticorpo que se liga ao mesmo. Marcadores de superfície de células B exemplificativos incluem os marcadores de superfície leucocitários CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw^8, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 e CD86. 0 marcador de superfície de células B de interesse particular é preferentemente expresso em células B em comparação com outros tecidos de células não B de um mamífero e pode ser expresso em células B precursoras e células B maduras. Numa forma de realização, o marcador é um, como CD20 ou CD19, que é encontrado nas células B ao longo da diferenciação da linhagem a partir do estádio de célula estaminal até um ponto imediatamente antes da diferenciação terminal em células plasmáticas. Os marcadores de superfície das células B preferidos no presente documento são CD19, CD20, CD22 e CD40.
0 antigénio μ0ϋ20μ é uma fosfoproteína não glicosilada de cerca de 35 kDa encontrada na superfície de mais de 90 % das células B do sangue periférico ou dos órgãos linfoides. 0 CD20 é expresso durante o desenvolvimento precoce das células pré-B e permanece até à diferenciação em células plasmáticas. 0 CD20 está presente em ambas células B normais bem como células B malignas. Outros nomes para CD20 na bibliografia incluem pantigénio restrito a linfócitos Βμ e μΒρ35μ. 0 antigénio CD20 é descrito em Clark et al. PNAS (USA) 82:1766 (1985), por exemplo. Exemplos de anticorpos que se ligam ao antigénio CD20 incluem: pC2B8p que é agora denominado prituximabp (pRITUXAN®p) (documento de patente U.S. N,° 5.736.137); o anticorpo murino 2B8 marcado com ítrio-[90] designado μΥ2Β8μ (documento de patente U.S. N.° 5.736.137); IgG2a μΒΙμ murino opcionalmente marcado com *3*I para gerar o anticorpo μ131Ι--Β1μ (BEXXAR™) (documento de patente U.S. N.° 5.595.721); anticorpo monoclonal murino plF5p (Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987)); anticorpo μ2Η7 quiméricop (documento de patente U.S. N.° 5.677.180 e anticorpos monoclonais L27, G28-2, 93-1B3, B-Cl ou NU-B2 disponível a partir do International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., Em: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)). O antigénio pCD19p refere-se ao antigénio de cerca de 90 kDa identificado, por exemplo, pelo anticorpo HD237-CD19 ou B4 (Kiesel et al. Leukemia Research II, 12: 1119 (1987)) . Tal como o CD20, CD19 é encontrado em células ao longo da diferenciação da linhagem a partir do estádio de célula estaminal até um ponto imediatamente antes da diferenciação terminal em células plasmãticas. A ligação de um anticorpo a CD19 pode provocar a internaiização do antigénio CD19. Exemplos de anticorpos que se ligam ao antigénio CD19 incluem os anticorpos anti-CD19 em Hekman et al. Cancer Immunol. Immunother. 32:364-372 (1991) e Vlasveld et al. Cancer Immunol. Immunother. 40:37-47 (1995); e o anticorpo B4 em Kiesel et al. Leukemia Research II, 12: 1119 (1987) . 0 antigénio pCD22p tem uma massa molecular de cerca de 140.000 kD. CD22 é expresso no citoplasma das células pré-B precoces e células progenitoras, aparece na superfície apenas de células B maduras e na maioria das células de linfoma não Hodgkin (NHL), e é depois perdido durante a diferenciação terminal antes do estádio de célula plasmãtica a partir tanto da superfície como do citoplasma. Um exemplo de um anticorpo anti-CD22 é o anticorpo LL2 descrito em Juweid et ai. Cancer Research 55:5899-5907 (1995), incluindo variantes quiméricas/humanizadas do mesmo. 0 antigénio pCD40p é uma glicoproteína fosforilada de superfície celular que é expressa numa variedade de tipos celulares, incluindo células B, neoplasias malignas de células B, células dendríticas foliculares, células epiteliais basais e carcinomas. 0 CD40 liga-se ao ligando de CD40 (CD40L) . Além de ser um antigénio de superfície de células B, o CD40 também é um membro da superfamília de recetores de TNF. Exemplos de anticorpos que se ligam a CD4 0 incluem aqueles que (1) bloqueia a interação de CD40/CD40L e têm propriedades antineoplásicas (Armitage et ai., documento de patente U.S. N.° 5.674.492); (2) antagonizam a sinalização através de CD40 (deBoer et ai., documento de patente U.S. N.° 5.677.165); (3) distribuem um sinal estimulador através de CD40 mas não aumentam a interação entre CD4 0 e CD4 0L, por exemplo, G28-5 (Ledbetter et ai., documento de patente U.S. N.° 5.182.368); (4) aumentam a interação entre CD40 e CD40L, por exemplo, CD40.4 (5C3) (PharMingen, San Diego, Califórnia) e S2C6 (depositado com a Coleção Americana de Culturas Tipo (American Type Culture Collection, ATCC), Manassass, Virginia a 25 de maio de 1999 sob o número de acesso PTA-110) .
A psuperfamilia do recetor do fator de necrose tumoralp ou psuperfamilia do recetor de ΤΝΕμ refere-se a polipéptidos recetores ligados por citocinas na família de TNF. Geralmente, estes recetores são recetores de transmembrana de tipo I com uma ou mais sequências de repetições ricas em cisteína no seu domínio extracelular. A superfamília de recetores de TNF pode ser adicionalmente subdividida em (1) recetores de morte; (2) recetores chamariz e (3) recetores de sinalização que carecem de domínios de morte. Os precetores de mortep contêm na sua região citoplasmática ou intracelular um pdomínio de mortep, ou seja, uma região ou sequência que atua para transduzir sinais na célula que podem resultar na apoptose ou na indução de determinados genes. Os precetores chamarizp carecem de um domínio de morte funcional e são incapazes de transduzir sinais que resultam em apoptose. Exemplos de citocinas na família de genes de TNF incluem o Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-alfa), Fator de Necrose Tumoral-beta (TNF-beta ou linfotoxina), ligando de CD3Q, ligando de CD2 7, ligando de CD40, ligando de OX-40, ligando de 4-1BB, ligando de Apo-1 (também referido como ligando de Fas ou ligando de CD95), ligando de Apo-2 (também referido como TRAIL), ligando de Apo-3 (também referido como TWEAK), osteoprotegerina (OPG), APRIL, ligando de RANK (também referido como TRANCE) e TALL-1 (também referido como BlyS, BAFF ou THANK) . Exemplos de recetores na superfamília de recetores de TNF incluem: Recetor do Fator de Necrose Tumoral de tipo 1 (TNFR1), Recetor de Fator de Necrose Tumoral de tipo 2 (TNFR2), recetor de Fator de Crescimento Nervoso p75 (NGFR), o antigénio de superfície de células B CD40, o antigénio de células T OX-40, o recetor Apo-1 (também designado Fas ou CD95), o recetor Apo-3 (também designado DR3, swl-1, TRAMP e LARD), o recetor designado pAtivador Transmembrana e interatuador de CAMLp ou pTACIp, proteína BCMA, DR4, DR5 (alternativamente referido como Apo-2; TRAIL-R2, TR6, Tango-63, hAP08, TRICK2 ou KILLER), DR6, DcRl (também referido como TRID, LIT ou TRAIL-R3) , DcR2 (também denominado TRAIL-R4 ou TRIJNDD) , OPG, DcR3 (também denominado TR6 ou M68), CARI, HVEM (também denominado ATAR ou TR2), GITR, ZTNFR-5, NTR-1, TNFL1, CD30, recetor de linfotoxina beta (LTBr), recetor 4-1BB e TR9 (EP988, 371A1).
Os termos pligando de Αρο-2μ ou pApo2Lp referem-se aos polipéptidos de Apo2L divulgados no documento W097/25428, publicado a 17 de julho de 1997. Para propósitos do presente pedido, estes termos também se referem aos polipéptidos referidos como TRAIL divulgados no documento WO97/01633, publicado a 16 de janeiro de 1997 e documento de patente U.S. N.° 5.763.223, emitido em 9 de junho de 1998 .
Um precetor de Apo2Lp é um polipéptido ao qual o Apo2L se pode ligar especificamente. 0 termo precetor de Apo2Lp quando utilizado no presente documento engloba recetores de Apo2L de sequência nativa e variantes dos mesmos. Estes termos englobam o recetor de Apo2L a partir de uma variedade de mamíferos, incluindo seres humanos. 0 recetor de Apo2L pode ser isolado a partir de uma variedade de fontes, como a partir de tipos de tecidos humanos ou a partir de outra fonte, ou preparados através de métodos recombinantes ou sintéticos. Exemplos de recetores de Apo2L de psequência nativap incluem o polipéptido Apo-2 ou DR5 (documento W098/51793), DR4 de sequência nativa como descrito em Pan et al. Science 276:111-113 (1997); recetor chamariz 1 de sequência nativa ou DcRl como em Sheridan et al. , Science 277:818-821 (1997); e recetor chamariz 2 de sequência nativa ou DcR2 como em Marsters et al. Curr. Biol. 7:1003-1006 (1997); osteoprotegerina de sequência nativa (veja-se Simonet et al. Cell 89:309-319 (1997) e
Emery et al. J. Interferon and Cytokine Research 18(5) : A47 Abstract 2.17 (1998)). Exemplos de anticorpos anti-DR5 incluem 3F11.39.7 (ATCC HB- 12456), 3H3.14.5 (ATCC HB-12534), 3D5.1.10 (HB-12536) e 3H1.18.10 (HB-12535), 16E2 e 20E6 (veja-se o documento WO 98/51793 ). Exemplos de anticorpos anti-DR4 incluem 4E7.24.3 (ATCC HB-12454) e 4H6.17.8 (ATCC HB-12455) (veja-se, o documento WO 99/37684) . pDcR3p de sequência nativa é descrito no documento WO99/14330. Esta publicação de patente descreve os seguintes mAbs dirigidos contra DcR3: 4C4.1.4 (ATCC HB-12573); 5C4.14.7 (ATCC HB-12574); 11C5.2.8 (ATCC HB-12572); 8D3.1.5 (ATCC HB-12571) e 4B7.1,1 (ATCC HB-12575).
Um polipéptido de psequência nativap compreende um polipéptido que tem a mesma sequência de aminoãcidos que um polipéptido derivado a partir da natureza. Assim, um polipéptido de sequência nativa pode ter a sequência de aminoãcidos de um polipéptido de ocorrência natural a partir de qualquer mamífero. Tal polipéptido de sequência nativa pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido através de meios recombinantes e/ou sintéticos. 0 termo polipéptido de psequência nativap engloba especificamente formas truncadas ou secretadas de ocorrência natural do polipéptido (por exemplo, uma sequência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas alternativamente submetidas a splicing) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipéptido.
Uma pvariantep polipeptídica significa um polipéptido biologicamente ativo tendo pelo menos cerca de 80 ê de identidade de sequência de aminoãcidos com o polipéptido de sequência nativa. Tais variantes incluem, por exemplo, polipéptidos em que um ou mais resíduos de aminoãcidos são adicionados, ou eliminados, no terminal N ou C do polipéptido. Vulgarmente, uma variante de terá pelo menos cerca de 80 é de identidade de sequência de aminoãcidos, mais preferentemente pelo menos cerca de 90 ê de identidade de sequência de aminoãcidos, e ainda mais preferentemente pelo menos cerca de 95 ê de identidade de sequência de aminoãcidos com o polipéptido de sequência nativa. pApoptosep refere-se à morte celular programada. Eventos fisiológicos normalmente indicativos da ocorrência de apoptose incluem: fragmentação de ADN, retração celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular, e/ou formação de vesículas de membrana (chamadas corpos apoptõticos). Estão disponíveis vários métodos para avaliar os eventos celulares associados com a apoptose. Por exemplo, a translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida através da ligação de anexina V; a fragmentação de ADN pode avaliada através do escalonamento de ADN ou coloração com iodeto de propídio; e a condensação nuclear/da cromatina em conjunto com a fragmentação do ADN pode ser avaliada através do aumento de quaisquer células hipodiploides. 0 termo panticorpop é utilizado no sentido mais lato e inclui anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonals intactos ou de comprimento completo), anticorpos monoclonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos (veja-se abaixo) desde que exibam a atividade biológica desejada, A menos que indicado o contrário, a expressão panticorpo multivalentep é utilizada ao longo desta memória descritiva para indicar um anticorpo que compreende três ou mais sítios de ligação a antigénio, 0 anticorpo multivalente é preferentemente manipulado para ter três ou mais sítios de ligação a antigénio e, geralmente, não é um anticorpo IgM ou IgA de sequência nativa. pFragmentos de anticorpop compreendem apenas uma porção de um anticorpo intacto, geralmente incluindo um sítio de ligação a antigénio do anticorpo intacto e, portanto, retendo a capacidade de se ligar a antigénio. Exemplos de fragmentos de anticorpo englobados pela presente definição incluem: (i) o fragmento Fab, tendo domínios VL, CL, VH e CHI; (ii) o fragmento Fab', que é um fragmento Fab que tem um ou mais resíduos de cisteína no terminal C do domínio CHI; (iii) o fragmento Fd tendo domínios VH e CHI; (iv) o fragmento Fd' tendo domínios VH e CHI e um ou mais resíduos de cisteína no terminal C do domínio CHI; (v) o fragmento Fv tendo os domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo; (vi) o fragmento dAb (Ward et al. , Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste num domínio VH; (vii) regiões CDR isoladas; (viii) fragmentos F(ab')2, um fragmento bivalente incluindo dois fragmentos Fab' ligados por uma ponte de dissulfureto na região de dobradiça; (ix) moléculas de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, Fv de cadeia simples; scFv) (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); e Huston et al., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diacorpos" com dois sítios de ligação a antigénio, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (veja-se, por exemplo, o documento EP 404.097; documento WO 93/11161 e Hollinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "anticorpos lineares" compreendendo um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, juntamente com polipéptidos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação a antigénio (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995); e documento de patente U.S. N.° 5.641.870). 0 termo "anticorpo monoclonal" como utilizado no presente documento refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades mínimas. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, estando direcionados contra um antigénio único. Adicionalmente, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal está direcionado contra um único determinante no antigénio. 0 modificador "monoclonal" não deve ser interpretado como necessitando a produção do anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma, primeiramente descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser feitos por métodos recombinantes de ADN (veja-se, por exemplo, documento de patente U.S. N.° 4.816.567). Os panticorpos monoclonaisp também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al. , Nature 352:624-628 (1991) ou Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por exemplo.
Os anticorpos monoclonais no presente documento, incluem especificamente anticorpos pquiméricosp nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados a partir de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos dos tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (documento de patente U.S. N.° 4.816.567; e Morrison et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)).
Formas phumanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Maioritariamente, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) nas quais resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Nalguns casos, resíduos de região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Adicionalmente, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recetor ou no anticorpo dador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas das ansas hipervariãveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas das FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado, opcionalmente, também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) de uma imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, veja-se Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Um panticorpo humanop é um que possui uma sequência de aminoácidos a qual corresponde à de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que tenha sido produzido usando qualquer das técnicas para produzir anticorpos humanos como divulgado no presente documento. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antigénio não humanos. Os anticorpos humanos podem ser diretamente produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica. Numa forma de realização, o anticorpo humano é selecionado a partir de uma biblioteca de fagos, onde essa biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan et al, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al, , J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Os anticorpos humanos também podem ser feitos através da introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgénicos, por exemplo, ratinhos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram parcial ou completamente inativados. Depois do desafio, é observada a produção de anticorpos humanos, que se assemelha bastante à vista em seres humanos em todos os aspetos, incluindo rearranjo génico, montagem, e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, nos documentos de patente U.S. N. °s 5.545.807; 5.545.806; 5,569,825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, e nas seguintes publicações científicas: Marks et ai., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995), Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado através da imortalização de linfócitos B humanos que produzem um anticorpo direcionado contra um antigénio alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados a partir de um indivíduo ou podem ter sido imunizados in vitro) . Veja-se, por exemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al. , J. Immunol., 147 (1) :86-95 (1991); e o documento de patente U.S. 5.750.373. 0 termo pvariávelp refere-se ao facto de que determinadas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente quanto à sequência entre anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu antigénio particular. Contudo, a variabilidade não está uniformemente distribuída ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariãveis nos domínios variáveis tanto de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são denominadas regiões estruturais (FRs). Os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem, cada um, quatro FRs, adotando grandemente uma configuração de folha beta, conectada por três regiões hipervariáveis, que formam ansas que conectam, e em alguns casos fazem parte, da estrutura de folha beta. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas em conjunto em estreita proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis a partir da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação a antigénio dos anticorpos (veja-se Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)) . Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efetoras, como participação do anticorpo na citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC). 0 termo pregião hipervariãvelp quando utilizado no presente documento refere-se aos resíduos de aminoãcidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação a antigénio. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminácidos a partir de uma pregião de determinação de complementaridadep ou pCDR" (por exemplo resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos a partir de uma pansa hipervariávelp (por exemplo, resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Resíduos pde região estruturalp ou de pFRp são aqueles resíduos de domínio variável que não os resíduos da região hipervariável como definido no presente documento.
Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser atribuídos a diferentes pclassesp. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem ser adicionalmente divididas em psubclassesp (isotipos), por exemplo, IgGl (incluindo alotipos A e não A), IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2, Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos denominam-se α, δ, ε, γ e E , respetivamente. As estruturas da subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
As cadeias leves dos anticorpos a partir de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa (k) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes. 0 termo pregião Fcp é utilizado para definir a região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que pode ser gerada por digestão por papaína de um anticorpo intacto. A região Fc pode ser uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é normalmente definida como estendendo-se desde um resíduo de aminoácido aproximadamente na posição Cys226, ou desde aproximadamente a posição Pro230, até ao terminal carboxilo da região Fc. A região Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, um domínio CH2 e um domínio CH3 e opcionalmente compreende um domínio CH4.
Por pcadeia de região Fcp no presente documento entende-se uma de duas cadeias polipeptídicas de uma região Fc. 0 pdomínio CHp de uma região Fc de IgG humana (também referido como domínio pCv2p) estende-se normalmente desde um resíduo de aminoácido aproximadamente na posição 231 até um resíduo de aminoácido aproximadamente na posição 340. 0 domínio CH2 é único no sentido em que não está estreitamente emparelhado com outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de hidratos de carbono ramificadas ligadas em N estão interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula IgG nativa Intacta. Foi especulado que o hidrato de carbono pode proporcionar um substituto para o emparelhamento domínio-domínio e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985). 0 domínio CH2 no presente documento pode ser um domínio CH2 de sequência nativa ou domínio CH2 variante. 0 pdomínio 0Ή3μ compreende uma extensão de resíduos C-terminal a um domínio CH2 numa região Fc (ou seja, desde um resíduo de aminoácido aproximadamente na posição 341 até um resíduo de aminoácidos aproximadamente na posição 447 de uma IgG) . A região CH3 no presente documento pode ser um domínio CH3 de sequência nativa ou um domínio CH3 variante (por exemplo, um domínio CH3 com uma pprotuberânciap introduzida numa cadeia do mesmo e uma pcavidadep introduzida correspondente na outra cadeia do mesmo; veja-se o documento de patente U.S. N.° 5.821.333). Tais domínios CH3 variantes podem ser utilizados para produzir anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) como descritos no presente documento. pRegiâo de dobradiçap é geralmente definida como estendendo-se desde aproximadamente Glu216, ou aproximadamente Cys226, até aproximadamente Pro230 da IgGl humana (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). As regiões de dobradiça de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a sequência de IgGl colocando os primeiro e último resíduos de cisteína que formam as ligações S-S inter-cadeia pesada nas mesmas posições. A região de dobradiça do presente documento pode ser uma região de dobradiça de sequência nativa ou uma região de dobradiça variante. As duas cadeias polipeptídicas de uma região de dobradiça variante retêm pelo menos um resíduo de cisterna por cadeia polipeptídica, de modo que duas cadeias polipeptídicas da região de dobradiça variante podem formar uma ligações dissulfureto entre as duas cadeias. A região de dobradiça preferida no presente documento é uma região de dobradiça humana de sequência nativa, por exemplo, uma região de dobradiça de IgGl humana de sequência nativa.
Uma pregião Fc funcionalp possui pelo menos uma pfunção efetorap de uma região Fc de sequência nativa. pFunções efetorasp exemplificativas incluem ligação de Clq; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação a recetor Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa dos recetores de superfície celular (por exemplo, recetor de células B; BCR), etc. Tais funções efetoras requerem geralmente que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e pode ser avaliada utilizando vários ensaios conhecidos na técnica para a avaliação de tais funções efetoras de anticorpos.
Uma pregião Fc de sequência nativap compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada 11a natureza. A Fig. 3 proporciona sequências de aminoácidos de regiões Fc de IgG murinas e humanas de sequência nativa.
Uma pregião Fc variantep compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em relação a pelo menos uma modificação de aminoácidos. Preferentemente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipéptido parental, por exemplo, desde cerca de uma até cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferentemente desde cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoãcidos numa região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipéptido parental. A região Fc variante do presente documento possuirá preferentemente pelo menos cerca de 80 ê de identidade de sequência com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipéptido parental, e mais preferentemente pelo menos cerca de 90 é de identidade de sequência com a mesma, mais preferentemente pelo menos cerca de 95 ê de identidade de sequência com a mesma. pCitotoxicidade mediada por células dependente de anticorposp e pADCCp referem-se a uma reação mediada por células na qual células citotõxicas não específicas que expressam recetores de Fc (FcRs) (por exemplo, células natural killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado numa célula alvo e subsequentemente provocam a lise da célula alvo. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam somente FcyRIII, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas encontra-se resumida no Quadro 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) . Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, pode ser realizado como o descrito no documento de patente U.S. N.° 5.500.362 ou 5.821.337. As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK) . Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, num modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). pCélulas efetoras humanasp são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferentemente, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam a função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células natural killer (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrõfilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa das mesmas, por exemplo, a partir do sangue ou PBMCs como descrito no presente documento.
Os termos precetor de Fcp e pFcRp são utilizados para descrever um recetor que se liga à região Fc de um anticorpo. 0 FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um recetor gama) e incluir recetores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcvRIII, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente submetidas a splicing destes recetores. Os recetores FcyRII incluem FcvRIIA (um precetor de ativaçãop) e FcyRIIB (um precetor de inibiçãop), que têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem primariamente nos domínios citoplasmãticos dos mesmos. 0 recetor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação do imunorrecetor baseado em tirosina (ITAM) no seu domínio citoplasmático. 0 recetor de ativação FcyRIIB contém um motivo de inibição do imunorrecetor baseado em tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático (revisto em Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcRs são revistos em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et al. , Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo pFcRp no presente documento. 0 termo também inclui o recetor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976); e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). pCitotoxicidade dependente do complementop ou pCDCp referem-se à lise de um alvo na presença de complemento. A via de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (Clq) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexado com um antigénio cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado.
Um anticorpo de pafinidade maturadap é um com uma ou mais alterações numa ou mais CDRs do mesmo, que resultam numa melhoria na afinidade do anticorpo para o antigénio, em comparação com um anticorpo parental que não possui aquela(s) alteração(ões). Os anticorpos de afinidade maturada preferidos terão afinidades nanomolares ou mesmo picomolares para o antigénio alvo. Os anticorpos de afinidade maturada são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descreve a maturação da afinidade por rearranjo dos domínios VH e VL. A mutagénese aleatória de uma CDR e/ou resíduos estruturais é descrita por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al. , J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992) . pPercentagem (è) de identidade da sequência de aminoácidosp é definida no presente documento como a percentagem de resíduos de aminoácidos numa sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos numa sequência selecionada, após alinhamento das sequências e introdução de intervalos, se necessário, para alcançar a máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. 0 alinhamento para propósitos de determinação da percentagem de identidade da sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias formas que estão dentro da experiência da técnica, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis publicamente, como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar parâmetros apropriados para medição do alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo sob o comprimento total das sequências a serem comparadas. Para os propósitos do presente documento, contudo, são obtidos valores de ê de identidade de sequência de aminoãcidos como é descrito posteriormente utilizando o programa informático de comparação de sequências ALIGN-2. 0 programa informático de comparação de sequências ALIGN-2 foi criado por Genentech, Inc., foi depositado com documentação de utilizador no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde se encontra registado sob o N.° de Registo de Direitos de Autor U.S. TXU510Q87, e está publicamente disponível através de Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia. 0 programa ALIGN-2 deverá ser compilado para utilização num sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
Para os propósitos do presente documento, a ê de identidade de sequência de aminoãcidos de uma dada sequência de aminoãcidos A a, com, ou frente a uma dada sequência de aminoãcidos B (que pode alternativamente ser mencionado como dada sequência de aminoãcidos A que tem ou compreende uma determinada ê de identidade de sequência de aminoãcidos a, com, ou frente a uma dada sequência de aminoãcidos B) é calculada conforme se segue:
100 vezes a fração X/Y onde X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento desse programa de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que quando o comprimento da sequência de aminoãcidos A não seja igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a ê de identidade de sequência de aminoãcidos de A com B não será igual à ê de identidade de sequência de aminoãcidos de B com A.
Uma pcadeia de polipéptidosp é um polipéptido em que cada dos domínios do mesmo está unido a outro(s) domínio(s) por uma ou mais ligações peptídicas, em oposição a interações não covalentes ou ligações dissulfureto,
Um qligante flexívelp no presente documento refere-se a um péptido que compreende dois ou mais resíduos de aminoácidos unidos por uma ou mais ligações peptídicas, e proporciona maior liberdade rotacional a dois polipéptidos (como duas regiões Fd) ligadas desta forma. Tal liberdade rotacional permite que dois ou mais sítios de ligação a antigénio unidos pelo ligante flexível acedam ao(s) antigénio(s) alvo de forma mais eficaz. Exemplos de sequências peptídicas de ligante flexível incluem gly-ser, gly-ser-gly-ser (SEQ ID NO:10), ala-ser e gly-gly-gly-ser (SEQ ID NO:11). Preferentemente, o ligante flexível compreende 2 até cerca de 10 resíduos de aminoãcidos, e mais preferentemente quatro ou menos resíduos.
Um pdomínio de dimerizaçãop é formado pela associação de pelo menos dois resíduos de aminoácidos (geralmente resíduos de cisteína) ou de pelo menos dois péptidos ou polipéptidos (que podem ter as mesmas, ou diferentes, sequências de aminoácidos). Os péptidos ou polipéptidos podem interagir uns com os outros através de uma ou mais associações covalentes e/ou não covalentes. Exemplos de domínios de dimerização no presente documento incluem uma região Fc; uma região de dobradiça; um domínio CH3; um domínio CH4; um par CH1-CL; uma pinterfacep com uma psaliênciap e/ou pprotuberânciap como descrito no documento de patente U.S. N.° 5.821.333; um fecho de leucina (por exemplo, fecho de leucina jun/fos, veja-se Kostelney et ai. , J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992); ou um fecho de leucina GCN4 de levedura) ; um fecho de isoleucina; um par dímero-recetor (por exemplo, recetor de interleucina-8 (IL-8R) ; e heterodímeros de integrina como LFA-1 e GPIIIb/IIIa) , ou a uma ou mais regiões de dimerização dos mesmos; polipéptidos de ligandos diméricos (por exemplo, fator de crescimento nervoso (NGF), neurotrofina-3 (NT-3), interleucina-8 (IL-8), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); veja-se Arakawa et ai. J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994) e Radziejewski et al. Biochem. 32(48): 1350 (1993)), ou a uma ou mais regiões de dimerização dos mesmos; um par de resíduos de cisterna capazes de formar uma ligação dissulfureto; um par de péptidos ou polipéptidos, cada compreendendo pelo menos um resíduo de cisterna (por exemplo, desde cerca de um, dois ou três até cerca de dez resíduos de cisterna) de modo que a uma ou mais ligações dissulfureto podem formar-se entre os péptidos ou polipéptidos (doravante "uma dobradiça sintética"); e domínios variáveis de anticorpo. 0 domínio de dimerização mais preferido no presente documento é uma região Fc ou uma região de dobradiça. "Resíduos de aminoácidos de ocorrência natural" (ou seja, resíduos de aminoácidos codificados pelo código genético) podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) ; cisterna (Cys) ; glutamina (Gin) ; ácido glutâmico (Glu) ; glicina (Gly) ; histidina (His); isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser) ; treonina (Thr) ; triptofano (Trp) ; tirosina (Tyr) e valina (Vai). Um "resíduo de aminoácido não de ocorrência natural" refere-se a um resíduo, diferente daqueles resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente, listados acima, que é capaz de se ligar de forma covalente a um ou mais resíduos de aminoácidos adjacentes numa cadeia polipeptídica. Exemplos de resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural incluem norleucina, ornitina, norvalina, homoserina e outros análogos de resíduos de aminoácidos como aqueles descritos em Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991) . Para gerar tais resíduos de aminoácidos não de ocorrência natural, os procedimentos de Noren et al. Science 244:182 (1989) e Ellman et al. , supra, podem ser utilizados. Resumidamente, estes procedimentos envolvem ativar quimicamente um ARNt supressor com um resíduo de aminoácido não de ocorrência natural seguido por transcrição e tradução in vitro do ARN.
Um polipéptido "isolado" é um que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir com utilizações diagnósticas ou terapêuticas para o polipéptido, e podem incluir enzimas, hormonas, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em formas de realização preferidas, o polipéptido será purificado (1) até mais do que 95 % em peso de polipéptido conforme determinado pelo método de Lowry, e mais preferentemente mais do que 99 % em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácidos interna ou N-terminal através da utilização de um sequenciador de copo rotatório, ou (3) até à homogeneidade por SDS- PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou, preferentemente, coloração de prata. 0 polipéptido isolado inclui o polipéptido in situ dentro de células recombinantes uma vez que, pelo menos, um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Vulgarmente, contudo, o polipéptido isolado será preparado por, pelo menos, uma etapa de purificação.
Um "sítio de ligação a antigénio funcional" de um anticorpo é um que é capaz de se ligar a um antigénio alvo. A afinidade de ligação a antigénio do sítio de ligação a antigénio não é necessariamente tão forte como a do anticorpo parental a partir do qual o sítio de ligação a antigénio é derivado, mas a capacidade de se ligar ao antigénio deve ser medida utilizando qualquer de uma variedade de métodos conhecidos para a avaliação da ligação de um anticorpo a um antigénio. Além disso, a afinidade de ligação a antigénio de cada um dos sítios de ligação a antigénio de um anticorpo multivalente no presente documento não tem de ser quantitativamente a mesma. Para os anticorpos multiméricos do presente documento, o número de sítios de ligação a antigénio funcionais podem ser avaliados utilizando análise por ultracentrifugação como descrito no Exemplo 2 abaixo. De acordo com este método de análise, diferentes razões de antigénio alvo para anticorpo multimérico são combinadas e a massa molecular média dos complexos é calculada assumindo números diferentes de sítios de ligação funcionais. Estes valores teóricos são comparados com os valores experimentais reais obtidos de modo a avaliar o número de sítios de ligação a antigénio funcionais.
Por pativação de um recetor por ligandop entende-se a transdução de sinal (por exemplo, para uma tirosina quinase recetora, provocada por um domínio de quinase intracelular de uma tirosina quinase recetora que fosforila resíduos de tirosina no recetor ou um polipéptido substrato) mediada por ligação de ligando ao recetor (ou a um complexo recetor que compreende o recetor de interesse) . No caso de um recetor ErbB, geralmente, isto envolverá a ligação de um ligando de ErbB a um hetero-oligómero de ErbB que ativa um domínio de quinase de um ou mais dos recetores ErbB no hetero-oligómero e resulta, desta forma, na fosforilação de resíduos de tirosina num ou mais dos recetores ErbB e/ou fosforilação de resíduos de tirosina num ou mais polipéptidos substrato adicionais.
Um anticorpo que pbloqueiap a ativação de um recetor por um ligando é um que reduz ou previne tal ativação como definido acima no presente documento. Tal bloqueio pode ocorrer por qualquer meio, por exemplo, interferindo com: a ligação do ligando ao recetor, a formação de complexos recetores, a atividade de tirosina quinase de uma tirosina quinase recetora num complexo recetor e/ou a fosforilação de um ou mais resíduos de tirosina quinase no, ou pelo recetor. Exemplos de anticorpos que bloqueiam a ativação de um recetor ErbB por um ligando incluem os anticorpos monoclonais 2C4 e 7F3 (que bloqueiam a ativação de HRG de hetero-oligómeros de HER2/HER3 e HER2/HER4; e a ativação de EGF, TGF-beta ou anfirregulina de um hetero-oligómero de EGFR/HER2); e os anticorpos L26, L96 e L288 (Klapper et al. Oncogene 14:2099-2109 (1997)), que bloqueiam a ligação de EGF e NDF a células T47D que expressam EGFR, HER2, HER3 e HER4 .
Um anticorpo que tem uma pcaracterística biológicap de um anticorpo designado é um que possui uma ou mais das características biológicas desse anticorpo que o distinguem de outros anticorpos que se ligam ao mesmo antigénio.
Um pagente de inibição do crescimentop quando utilizado no presente documento refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula in vitro e/ou in vivo. Assim, o agente de inibição do crescimento pode ser um que reduza significativamente a percentagem de células em fase S. Exemplos de agentes de inibição do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (num local diferente da fase S), como agentes que induzem a interrupção de G1 e a interrupção da fase M. Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), TAXOL®, inibidores de topo II como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etopõsido e bleomicina. Aqueles agentes que interrompem G1 também atuarão sobre a interrupção da fase S, por exemplo, agentes de alquilação de ADN como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., capítulo 1, intitulado pCell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugsp por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13.
Exemplos de anticorpos anti-HER2 pinibidores do crescimentop são aqueles que se ligam a HER2 e inibem o crescimento de células cancerosas que superexpressam HER2. Anticorpos anti-HER2 inibidores do crescimento preferidos inibem o crescimento de células tumorais de mama SKBR3 em cultura em mais de 20 ê, e preferentemente superior a 50 ê (por exemplo, desde cerca de 50 é até cerca de 100 é) a uma concentração de anticorpo de cerca de 0,5 a 30 8 g/fli, onde o inibidor de crescimento é determinado seis dias depois da exposição das células SKBR2 ao anticorpo (veja-se o documento de patente U.S. N.° 5.677.171 emitido a 14 de outubro de 1997).
Um anticorpo que pinduz a morte celularp é um que faz com que uma célula viável se torne não viável. A célula é geralmente uma que expressa o antigénio ao qual o anticorpo se liga, especialmente quando a célula superexpressa o antigénio. Preferentemente, a célula é uma célula cancerosa, por exemplo, uma célula de mama, ovário, estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tiroide, pancreática ou de bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SKBR3, BT474, Caiu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SK0V3. A morte celular in vitro pode ser determinada na ausência de complemento e células imunitárias efetoras para distinguir a morte celular induzida por citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Assim, o ensaio para a morte celular pode ser realizado utilizando soro inativado por calor (ou seja, na ausência de complemento) e na ausência de células imunitárias efetoras. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir a morte celular, a perda da integridade da membrana como avaliada pela absorção de iodeto de propídio (PI), azul de tripano (veja-se, Moore et ai. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) ou 7AAD pode ser avaliada em relação a células não tratadas.
Um anticorpo que pinduz a apoptosep é um que induz a morte celular programada como determinado pela ligação de anexina V, fragmentação de ADN, retração celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular, e/ou formação de vesículas de membrana (chamadas corpos apoptóticos) . A célula é uma que expressa o antigénio ao qual o anticorpo se liga e pode ser uma que superexpressa o antigénio. A célula pode ser uma célula tumoral, por exemplo, uma célula de mama, ovário, estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tiroide, pancreática ou de bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SKBR3, BT474, Caiu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SK0V3. Estão disponíveis vários métodos para avaliar os eventos celulares associados com a apoptose. Por exemplo, a translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida através da ligação de anexina; a fragmentação de ADN pode ser avaliada através do escalonamento de ADN como divulgado no exemplo do presente documento; e a condensação nuclear/da cromatina em conjunto com a fragmentação do ADN pode ser avaliada através do aumento de quaisquer células hipodiploides. Preferentemente, o anticorpo que induz a apoptose é um que resulta em cerca de 2 a 50 vezes, preferentemente cerca de 5 a 50 vezes e mais preferentemente cerca de 10 a 50 vezes, a indução da ligação de anexina em relação a uma célula não tratada num ensaio de ligação a anexina utilizando células que expressam o antigénio ao qual o anticorpo se liga.
Exemplos de anticorpos que induzem a apoptose incluem os anticorpos monoclonais anti-HER2 7F3 (ATCC HB- 12216), e 7C2 (ATCC HB 12215), incluindo variantes de afinidade maturada e/ou humanizadas dos mesmos; os anticorpos anti-DR5 3F11.39.7 (ATCC HB-12456); 3H3.14,5 (ATCC HB-12534); 3D5.1.10 (ATCC HB-12536) e 3H3.14.5 (ATCC HB - 12534), incluindo variantes de afinidade maturada e/ou humanizadas dos mesmos; os anticorpos anti-recetor de DR5 humano 16E2 e 20E6, incluindo variantes de afinidade maturada e/ou humanizadas dos mesmos (documento W098/51793); os anticorpos anti-DR4 4E7.24.3 (ATCC HB- 12454); 4H6.17.8 (ATCC HB-12455); 1H5.25.9 (ATCC HB-12695); 4G7.18.8 (ATCC PTA-99 e 5G11.17.1 (ATCC HB-12694), incluindo variantes de afinidade maturada e/ou humanizadas dos mesmos.
De modo a rastrear para anticorpos que se ligam a um epítopo num antigénio ligado por um anticorpo de interesse, um ensaio de bloqueio cruzado de rotina tal como aquele descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser realizado.
Um panticorpo agonistap é um anticorpo que se liga a, ou ativa, um recetor. Geralmente, a capacidade de ativação dos recetores do anticorpo agonista será pelo menos quantitativamente semelhante (e pode ser essencialmente quantitativamente semelhante) a um ligando agonista nativo do recetor. Um exemplo de um anticorpo agonista é um que se liga a um recetor na superfamília de recetores de TNF e induz a apoptose de células que expressam o recetor de TNF. Ensaios para determinar a indução da apoptose são descritos nos documentos W098/51793 e W099/37684.
Um pdistúrbiop é qualquer condição que beneficiaria do tratamento com o anticorpo. Isto inclui distúrbios ou doenças crónicos e agudos incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Exemplos não limitantes de distúrbios a serem tratados no presente documento incluem tumores malignos e benignos; leucemias e neoplasias malignas linfoides; distúrbios neuronais, gliais, astrocíticos, hipotalâmicos e outros distúrbios glandulares, macrofágicos, epiteliais, estromais e blastocíticos; e distúrbios inflamatórios, angiogénicos e imunológicos. 0 termo pquantidade terapeuticamente eficazp refere-se a uma quantidade de um fármaco eficaz para tratar uma doença ou distúrbio num mamífero. No caso do cancro, a quantidade terapeuticamente eficaz do fármaco pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, desacelerar em algum grau e preferentemente deter) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, desacelerar em algum grau e preferentemente deter) as metãstases tumorais; inibir, em algum grau, o crescimento tumoral; e/ou aliviar em certa medida um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. Na medida em que o fármaco pode prevenir o crescimento e/ou destruir as células cancerosas existentes, pode ser citostático e/ou citotóxico. Para a terapêutica do cancro, a eficácia in vivo pode, por exemplo, ser medida avaliando o tempo até à progressão da doença (TTP) e/ou determinar as taxas de resposta (RR). pTratamentop refere-se tanto ao tratamento terapêutico e profilático ou a medidas preventivas. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio bem como aqueles nos quais o distúrbio deve ser prevenido.
Os termos pcancrop e pcancerosop referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular não regulado. Exemplos de cancros incluem mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais particulares de tais cancros incluem cancro de células escamosas, cancro pulmonar de células pequenas, cancro pulmonar de células não pequenas, adenocarcinoma pulmonar, carcinoma de células pequenas do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro do colo do útero, cancro ovãrico, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro de cólon, cancro colorretal, carcinoma do endométrio ou do útero, carcinoma das glândulas salivares, cancro renal, cancro do fígado, cancro de próstata, cancro da vulva, cancro da tiroide, carcinoma hepático e vários tipos de cancro da cabeça e pescoço.
Uma "doença autoimune" no presente documento é uma doença ou distúrbio não maligno que surge e está dirigido contra os próprios tecidos do indivíduo. Exemplo de distúrbios ou doenças autoimunes incluem, mas não são limitados a, respostas inflamatórias tais como doenças inflamatórias da pele incluindo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); esclerodermia sistémica e esclerose; respostas associadas à doença intestinal inflamatória (tal como doença de Crohn e colite ulcerativa); síndrome do desconforto respiratório (incluindo síndrome do desconforto respiratório em adultos; SDRA); dermatite; meningite; encefalite; uveíte; colite; glomerulonefrite; condições alérgicas tais como eczema e asma e outras condições patológicas envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas; aterosclerose; deficiência de adesão de leucócitos; artrite reumatoide; lúpus eritematoso sistémico (LES); diabetes mellitus (por exemplo, diabetes mellitus do tipo I ou diabetes mellitus dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tiroidite autoimune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sjogren; diabetes de aparição juvenil; e respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T tipicamente encontrados em tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças que envolvem a diapedese leucocitãria; distúrbio inflamatório do sistema nervoso central (SNC); síndrome de lesão de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, mas não limitada a crioglobinemia ou anemia positiva de Coombs); miastenia gravis; doenças mediadas por complexos antigénio-anticorpo; doença de membrana basal anti-glomerular; síndrome antifosfolipídica; neurite alérgica; doença de Graves; síndrome miasténica de Lambert-Eaton; penfigoide bulhoso; pênfigo; poliendocrinopatias autoimunes; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doença de Behcet; arterite de células gigantes; nefrite por complexos imunes; nefropatia por IgA; polineuropatias por IgM; púrpura trombocitopénica imune (ITP) ou trombocitopenia autoimune, etc.
Por pantigénio exõgenop entende-se uma molécula ou moléculas que não é/são endógenas ou nativas de um mamífero que é exposto a elas. 0 antigénio exógeno pode desencadear uma resposta imunitária, por exemplo, uma resposta mediada por células T e/ou humoral no mamífero. Geralmente, o antigénio exógeno provocará a produção de anticorpos contra ele. Exemplos de antigénios exógenos contemplados no presente documento incluem agentes terapêuticos imunogénicos, por exemplo, proteínas como anticorpos, particularmente anticorpos que compreendem resíduos de aminoácidos não humanos (por exemplo, anticorpos de roedor, quiméricos/humanizados e anticorpos primatizados); toxinas (opcionalmente conjugadas com uma molécula de direcionamento como um anticorpo, em que a molécula de direcionamento também pode ser imunogénica); vetores virais de terapêutica génica, como retrovirus e adenovirus; enxertos; agentes infeciosos (por exemplo, bactérias e vírus); aloantigénios (ou seja, um antigénio que ocorre em alguns, mas não todos os membros da mesma espécie) como diferenças nos tipos sanguíneos, antigénios linfocitarios humanos (HLA), antigénios de plaquetas, antigénios expressos em órgãos transplantados, componentes sanguíneos, fatores de gravidez (Rh) e hemofílicos (por exemplo, Fator VIII e Fator IX).
Por pbloquear uma resposta imunitãriap contra um antigénio exógeno entende-se reduzir ou prevenir pelo menos uma resposta imunomediada que resulta da exposição a um antigénio exógeno. Por exemplo, é possível diminuir a resposta humoral contra o antigénio exógeno, ou seja, prevenindo ou reduzindo a produção dos anticorpos dirigidos contra o antigénio no mamífero. Alternativamente, ou adicionalmente, é possível suprimir o idiotipo; ppacificarp a remoção de células revestidas com aloanticorpo,* e/ou afetar a apresentação do aloantigénio através do esgotamento de células apresentadoras de antigénio. 0 termo penxertop conforme é utilizada no presente documento refere-se a materiais biológicos derivados de um dador pra transplante num recipiente. Os enxertos incluem tais materiais diversos como, por exemplo, células isoladas tais como células de ilhota; tecido tal como membrana amniótica de um recém-nascido, medula óssea, células precursoras hematopoiéticas, e tecido ocular, tal como tecido da córnea; e órgãos tais como a pele, coração, fígado, baço, pâncreas, lóbulo tiroide, pulmão, rim, órgãos tubulares (por exemplo, intestino, vasos sanguíneos, ou esófago), etc. Os órgãos tubulares podem ser utilizados para substituir porções danificadas do esófago, vasos sanguíneos, ou duto biliar. Os enxertos de pele podem ser utilizados não só para queimaduras, mas também como um penso para intestino danificado ou para fechar certos defeitos como a hérnia diafragmãtica. 0 enxerto é derivado de qualquer fonte de mamífero, incluindo de ser humano, quer de cadáveres ou dadores vivos. Preferentemente o enxerto é medula óssea ou um órgão tal como o coração e o dador do enxerto e o hospedeiro são correspondentes para antigénios HLA de classe II. 0 termo phospedeiro mamíferop como utilizado no presente documento refere-se a qualquer recipiente de transplante compatível. Por pcompatívelp entende-se um hospedeiro mamífero que aceitará o enxerto doado. Preferentemente, o hospedeiro é humano. Se ambos o dados do enxerto e o hospedeiro são humanos, estes são preferentemente correspondentes quanto aos antigénios de HLA de classe II de modo a melhorar a histocompatibilidade. 0 termo pdadorp como utilizado no presente documento refere-se às espécies mamíferas, mortas ou vivas, a partir das quais o enxerto é derivado. Preferentemente, o dador é humano. Os dadores humanos são preferentemente dadores voluntários com grupo sanguíneo relacionado que no exame físico são considerados normais e do mesmo grupo sanguíneo ABO principal, uma vez que cruzar barreiras de grupos sanguíneos principais possivelmente prejudica a sobrevivência do aloenxerto. É, contudo, possível transplantar, por exemplo, um rim de um dador do tipo 0 num recetor do tipo A, B ou AB. 0 termo ptransplantep e variações dos mesmos referem-se à inserção de um enxerto num hospedeiro, quer o transplante seja sinérgico (onde o dador e o recetor são geneticamente idênticos), alogeneico (onde o dador e recetor são de origens genéticas diferentes mas da mesma espécie), ou xenogeneico (onde o dador e recetor são de diferentes espécies). Assim, num cenário típico, o hospedeiro é humano e o enxerto é um isoenxerto, derivado a partir de um ser humano da mesma ou diferente origem genética. Noutro cenário, o enxerto é derivado a partir de uma espécie diferente daquela na qual é transplantado, como um coração de babuíno transplantado num hospedeiro recetor humano, e incluindo animais de espécies amplamente separadas desde o ponto de vista filogenético, por exemplo, uma válvula cardíaca de porco, ou células de ilhotas beta animais ou células neuronais transplantadas num hospedeiro humano. A expressão pdessensibilizar um mamífero a aguardar transplantep refere-se a reduzir ou abolir a sensibilidade ou reatividade alérgica a um transplante, antes da administração do transplante ao mamífero. Isto pode ser alcançado por qualquer mecanismo, como uma redução nos anticorpos antidador no mamífero dessensibilizado, por exemplo, onde tais anticorpos antidador são direcionados contra antigénios linfocitãrios humanos (HLA). 0 termo pagente citotóxicop como aqui utilizado refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou provoca a destruição de células. 0 termo destina-se a incluir isótopos radioativos (por exemplo, 7y 2 1.-L t 1.31. t 1.2 5 τ j90 t·, „ .L 8 b t·, „ .L 8 S o.L53 t-\ ° 2 1.2 τ',3p
At , I / I , Y / Re ! Re ! 8m , Bi , P e isotopos radioativos de Lu) , agentes quimioterapêuticos, e toxinas como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos.
Um pagente quimioterapêuticop é um composto químico útil no tratamento de cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN™); alquil sulfonatos como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosfaoramida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo a sua adozelesina, análogos sintéticos de carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pane rat i st at i na.; uma sarcodictima; espongistatina; mostardas de azoto tais como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosoureias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como os antibióticos de enediína (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina Yi1 e caliqueamicina, Θ1!, veja-se, por exemplo, Agnew Chem Inti. Ed. Engl. 33:183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; bem como cromõforo neocarzinostatina e cromõforos de antibiótico de cromoproteína enediína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicina, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozoeina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato ,* análogos de purina como fluradabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgénios como calusterona, propionato de dromostalonona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglúcido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lent inano,· lonidamina,· maitansinoides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2' , 2p-triclorot.riet.ilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (pAra-Cp); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e doxetaxel (TAXOTERE®, Rhõne-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucilo; gencitabina; 6-tioguanina,* mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; capeeitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos citados acima. Também são incluídos nesta definição agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação de hormonas sobre tumores tais como anti-estrogénios incluindo por exemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazois inibidores da aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e antiandrogénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer dos citados acima. 0 termo pcitocinap é um termo genérico para proteínas libertadas por uma população celular que atuam sobre outra célula como mediadores intracelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas e hormonas polipépticas tradicionais. Incluídas entre as citocinas estão hormonas de crescimento tais como hormona de crescimento humana, N-metionil-hormona de crescimento humana e hormona do crescimento bovina; hormona da paratiroide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoproteícas tais como a hormona folículo-estimulante (FSH), hormona estimulante da tiroide (TSH) e hormona luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogénio placentário; fator de necrose tumoral alfa e beta; sustância inibidora mulleriana; péptido associado a gonadotropina de ratinho; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento nervoso tal como NGF-alfa; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento transformante (TGFs) tais como TGF-alfa e TGF-beta; fator de crescimento I e II semelhante a insulina; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivos; interferões tais como interferão-alfa, beta e gama, fatores de estimulação de colónias (CSFs) como CSF de macrófagos (M-CSF) ; CSF de granulócitos macrófagos (GM-CSF) e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (ILs) como IL-1, IL-lalfa, IL-2, IL-3, IL-4 , IL — 5 , IL- 6 , IL — "7 , IL — S , IL — 9 , IL —10, IL — 11, IL — 12; um fator de necrose tumoral como TNF-alfa ou TNF-beta; e outros fatores polipeptídicos incluindo LIF e ligando kit (KL) . Como utilizado no presente documento, o termo citocina inclui proteínas a partir de fontes naturais ou a partir de culturas celulares recombinantes e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequência nativa. 0 termo pprofãrmacop como utilizado neste pedido refere-se a uma forma de precursor ou derivado de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica para as células tumorais em comparação com o fãrmaco parental e é capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida na forma parental mais ativa. Veja-se, por exemplo, Wilman, pProdrugs in Cancer Chemotherapyp Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) e Stella et al. , pProdrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,μ Directed Drug Delivery, Borchardt et al. , (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Os profãrmacos desta invenção incluem, mas não estão limitados a, profãrmacos que contêm fosfato, profãrmacos que contêm tiofosfato, profãrmacos que contêm sulfato, profãrmacos que contêm péptidos, profãrmacos modificados com D-aminoácidos, profãrmacos glicosilados, profãrmacos que contêm beta-lactama, profãrmacos contendo fenoxiacetamina opcionalmente substituídos ou profãrmacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituídos, profãrmacos de 5-fluorocitosina e outros de 5-fluorouridina que podem ser convertidos no fãrmaco livre citotóxico mais ativo. Os exemplos de fármacos citotõxicos que podem ser derivados numa forma de profármaco para utilização nesta invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles agentes quimioterapêuticos descritos acima.
Um pfator angiogénicop é um fator de crescimento que estimula o desenvolvimento de vasos sanguíneos. 0 fator angiogénico preferido no presente documento é o Fator de Crescimento Endotelial vascular (VEGF). A palavra pmarcadorp quando utilizada no presente documento refere-se a um composto ou composição detetável que é conjugada direta ou indiretamente com o polipéptido. 0 marcador pode ser ele próprio detetável (por exemplo, marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimãtico, podem catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detetável.
Uma molécula de ácido nucleico pisoladap é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada a partir de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está vulgarmente associada na fonte natural do ácido nucleico do polipéptido. Uma molécula de ácido nucleico isolada é outra que não na forma ou configuração na qual é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucleico isoladas distinguem-se portanto da molécula de ácido nucleico tal como existe em células naturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que vulgarmente expressam o polipéptido onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está, numa localização cromossõmica, diferente daquela das células naturais. A expressão psequências de controlop refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num organismo hospedeiro particular. As sequências de controlo que são adequadas para procarióticas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação a ribossomas. As células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores.
Um ácido nucleico está poperativamente ligadop quando é colocado numa relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, o ADN para uma pré-sequência ou líder de secreção está operativamente ligado ao ADN para um polipéptido se for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou potenciador está operativamente ligado a uma sequência codificadora se afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação a ribossomas está operativamente ligado a uma sequência de codificação se está posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, poperativamente ligadop significa que as sequências de ADN a serem ligadas são contíguas, e, no caso de um líder de secreção, contíguas e na fase de leitura. Contudo, os potenciadores não têm de ser contíguos. A ligação é alcançada através da ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleótidos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional.
Como utilizado no presente documento, as expressões pcélulap, plinha celularp e pcultura celularp são utilizadas indistintamente e todas tais designações incluem a descendência. Assim, as palavras ptransformantesp e pcélulas transformadasp incluem a célula em causa primária e culturas derivadas da mesma sem ter em conta o número de transferências. Também se entende que toda a descendência pode não ser precisamente idêntica quanto ao conteúdo de ADN, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A descendência mutante que tem a mesma função ou atividade biológica conforme rastreada na célula originalmente transformada está incluída. Quando se pretendam designações distintas, tal será evidente a partir do contexto. II. Modos para levar a cabo a invenção Ά. Anticorpos muitivalentes A invenção do presente documento refere-se a um método para fabricar um anticorpo multivalente. Várias técnicas para gerar o anticorpo pparentalp ou pde partidap a partir do qual o um ou vários domínio variáveis do anticorpo multivalente podem ser derivados serão descritos posteriormente no presente pedido. 0 anticorpo multivalente de particular interesse no presente documento é um que compreende quatro ou mais sítios de ligação a antigénio. Geralmente, todos os sítios de ligação a antigénio são pfuncionaisp como definido acima no presente documento. Preferentemente, o anticorpo multivalente não existe na natureza e não é um anticorpo IgM ou IgA de sequência nativa. 0 anticorpo multivalente do presente documento é preferentemente não produzido in vitro por reticulação química de um par de anticorpos (por exemplo, como em Ghetie et al. (1997), supra ou Wolff et al. (1993), supra). 0 presente pedido também proporciona anticorpos multivalentes que não requerem um ou mais resíduos de cisteína introduzidos num anticorpo parental de modo a produzir o anticorpo multivalente através de uma ou mais pontes dissulfureto entre um par de regiões Fc (por exemplo, como em Shopes et al. (1992), supra ou Caron et al. (1992), supra). A primeira cadeia polipeptídica compreende dois domínios variáveis de cadeia pesada e a segunda cadeia polipeptídica também compreende dois domínios variáveis de cadeia pesada, que podem ser combinados com domínios variáveis de cadeia leve correspondentes (pelo menos dois por cada cadeia polipeptídica) para gerar quatro ou mais sítios de ligação a antigénio. 0 anticorpo multivalente compreende uma região Fc (por exemplo, uma sequência nativa ou região Fc variante). A região Fc é preferentemente "funcional" como definido acima no presente documento e, portanto, é capaz de realizar uma ou mais funções efetoras de anticorpo, como ADCC ou CDC. Preferentemente, o anticorpo multivalente tem apenas uma região Fc.
Os quatro ou mais sítios de ligação a antigénio são proporcionados no sentido do terminal amino em relação à região Fc (em vez de no terminal carboxi da região Fc como em Coloma e Morrison, (1997) supra). Isto pode ser alcançado proporcionando uma primeira cadeia polipeptídica representada pela fórmula VD1-X1-VD2-X2-FC, em que (1) VD1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada ou leve (preferentemente um domínio variável de cadeia pesada), (2) VD2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada ou leve (preferentemente um domínio variável de cadeia pesada), (3) Fc compreende uma cadeia de uma região Fc e (4) XI e X2 representam um aminoácido ou polipéptido interveniente opcional. 0 ligante flexível pode compreender um péptido como gly-ser, gly-ser-gly-ser (SEQ ID NO:10), ala-ser ou gly-gly-gly-ser (SEQ ID N0:11). 0 anticorpo multivalente compreende quatro ou mais polipéptidos Fab, cada um capaz de se ligar a antigénios. Os fragmentos Fab são proporcionados na direção amino terminal em relação à região Fc (onde o anticorpo multivalente tem uma região Fc). Por exemplo, dois ou mais fragmentos Fd podem ser fusionados com o terminal amino de uma cadeia de uma região Fc. A cadeia polipeptídica assim manipulada pode ser combinada com (1) outra cadeia polipeptídica formada por dois ou mais fragmentos Fd fusionados com o terminal amino da outra cadeia da região Fc, bem como (2) domínios VL complementares (por exemplo, quatro ou mais domínios VL cada um dos quais, opcionalmente, está fusionado a um domínio CL). Opcionalmente, o anticorpo compreende um ligante flexível entre os dois ou mais fragmentos Fd.
Os quatro ou mais sítios de ligação a antigénio funcionais do anticorpo multivalente no presente documento são cada, preferentemente, formados por um domínio variável de cadeia pesada e leve. Assim, quando dois ou mais domínios variáveis de cadeia pesada estão fusionados (opcionalmente com um ou mais resíduos de aminoãcidos intervenientes como indicado acima), dois ou mais polipéptidos contendo domínios variáveis de cadeia leve complementares são combinados com os domínios variáveis de cadeia pesada (por exemplo, através da coexpressão da proteína de fusão e do um ou mais polipéptidos de domínio variável de cadeia leve na mesma células hospedeira). 0 anticorpo compreende quatro, ou cinco, ou mais (por exemplo, até cerca de 8) polipéptidos de domínio variável de cadeia leve, cada um dos quais, opcionalmente, compreendem um domínio CL.
Numa forma de realização do presente documento, o anticorpo com quatro ou mais sítios de ligação a antigénio pode compreender uma cadeia polipeptídica que compreende quatro ou mais domínios variáveis de cadeia pesada ou leve, em que cada dos domínios variáveis está combinado com, ou associado com, quatro ou mais polipéptidos de domínio variável de cadeia leve ou cadeia pesada de tal modo para formar os sítios de ligação a antigénio. Assim, quando a cadeia polipeptídica compreende quatro ou mais domínios variáveis de cadeia pesada, está combinada com, ou associada com quatro ou mais polipéptidos de domínio variável de cadeia leve (por exemplo, com polipéptidos VL-CL) . Alternativamente, quando a cadeia polipeptídica compreende quatro ou mais domínios variáveis de cadeia leve, está combinada com, ou associada com quatro ou mais polipéptidos de domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, com polipéptidos VH-CH1). Preferentemente cada dos quatro ou mais sítios de ligação a antigénio está direcionado contra o mesmo antigénio. Exemplos de antigénios ligados por tais anticorpos incluem (1) um recetor na superfamília de recetores de Tumor de Necrose Tumoral (TNF) como DR4 e DR5; (2) um antigénio de
superfície de células B como CD20; (3) um recetor ErbB exemplificado pelo recetor HER2 ou (4) uma proteína de superfície celular expressa pelas células tumorais. Por exemplo, a cadeia polipeptídica pode compreende quatro domínios variáveis de cadeia pesada que são capazes de se combinar com quatro polipéptidos de domínio variável de cadeia leve (preferentemente polipéptidos VL-CL) para gerar quatro sítios de ligação a antigénio direcionados contra o mesmo antigénio. Tais anticorpos são exemplificados pelos ilustrados na Fig. 23D (com quatro sítios de ligação a antigénio) e Fig. 23E (com quatro sítios de ligação a antigénio).
Os anticorpos multivalentes do presente documento têm propriedades desejáveis particularmente para terapêutica e diagnóstico in vivo. Por exemplo, o anticorpo multivalente pode ser internaiizado e catabolizado por uma célula que expressa um antigénio, ao qual o anticorpo se liga, mais rapidamente do que um anticorpo bivalente. Assim, a invenção proporciona um imunoconjugado que compreende o anticorpo multivalente conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um que é ativo na morte das células uma vez internalizado). Vários agentes citotóxicos para gerar um imunoconjugado são descritos no presente documento, mas o agente citotóxico preferido é um isótopo radioativo, um maitansinoide ou uma caliqueamicina. 0 anticorpo multivalente, e/ou um anticorpo parental a partir do qual pelo menos uma das especificidades de ligação a antigénio do anticorpo multivalente é derivada, podem ter determinadas propriedades. Por exemplo, o anticorpo multivalente e/ou o anticorpo parental pode (1) ser um anticorpo agonista (por exemplo, onde um antigénio ligado pelo anticorpo é um recetor na família de recetores de TNF ou um antigénio de superfície de células B) ; (2) induzir a apoptose (por exemplo, onde um antigénio ligado pelo anticorpo é um recetor ErbB ou um recetor na superfamília de recetores de TNF); (3) ligar uma proteína da superfície celular (como um antigénio de superfície de células B ou um recetor ErbB) expressa nas células tumorais; (4) ligar uma proteína de superfície celular (por exemplo, Recetor de Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), recetor HER2, recetor ErbB3, recetor ErbB4, ou recetor DcR3) superexpresso pelas células tumorais; e/ou (5) ser um anticorpo inibidor do crescimento. 0 anticorpo multivalente do presente documento pode ter especificidade para apenas um antigénio, ou mais do que um antigénio (por exemplo, desde dois até cerca de três antigénios) . Numa forma de realização, os três ou mais sítios de ligação a antigénio funcionais do anticorpo multivalente podem todos ligar-se ao mesmo antigénio (preferentemente ao epítopo sobre aquele antigénio, em cujo caso o anticorpo multivalente poderia ser considerado como sendo "monoespecífico") . Este pedido também proporciona anticorpos "multiespecíficos". Assim, os três ou mais sítios de ligação a antigénio funcionais podem ligar-se a dois ou mais (por exemplo, desde dois até cerca de três) antigénios ou epítopos diferentes. 0 presente pedido mostra que um anticorpo multivalente direcionado contra um antigénio recetor pode ser manipulado, o qual, surpreendentemente, tem capacidade agonística e/ou de indução da apoptose que é quantitativamente semelhante à do ligando nativo. Por "quantitativamente semelhante" aqui entende-se que o anticorpo multivalente tem uma atividade num ensaio que determina a atividade agonística e/ou de indução da apoptose, dentro de cerca de dez vezes, e preferentemente dentro de cerca de cinco vezes da atividade agonística e/ou de indução da apoptose do ligando nativo. Nesta forma de realização, o anticorpo com atividade agonística e/ou de indução da apoptose pode ser um com especificidade para um recetor na superfamília de recetores de TNF, por exemplo, um recetor Apo2L, como DR4, DR5, DcRl e DcR2 (preferentemente DR4 ou DR5) , em cujo caso a atividade do anticorpo num ensaio de apoptose como aqueles descritos no Exemplo 3 abaixo está dentro de cerca de dez vezes, por exemplo, dentro de cerca de cinco vezes, da atividade de Apo2L nesse ensaio. 0 anticorpo multivalente do presente documento pode, numa forma de realização da invenção, ligar-se a um antigénio de superfície de células B. Antigénios de superfície de células B preferidos incluem CD19, CD20, CD22 e CD40, e mais preferentemente CD20. Várias aplicações para os anticorpos multivalente do presente documento são contempladas e descritas em maior detalhe abaixo. Quando o anticorpo multivalente possui uma ou mais regiões Fc funcionais, antecipa-se que tem a capacidade de mediar funções efetoras (como ADCC e CDC) e tem uma semivida mais longa do que anticorpos multivalentes que carecem de uma região Fc. Tais anticorpos multivalentes podem ser utilizados onde a morte de células, como de células cancerosas ou tumorais, é desejada. Outras formas dos anticorpos multivalentes do presente documento que carecem uma região Fc podem ser desejáveis quando é desejada uma semivida mais curta (por exemplo, para o tratamento de doenças ou distúrbios cardiovasculares ou inflamatórios, ou quando o anticorpo é conjugado com um agente citotóxico); quando a internalização do anticorpo é desejada (por exemplo, para terapêutica com um imunoconjugado que compreende o anticorpo e um agente citotóxico); para penetração melhorada de um tumor sólido; quando a expressão do anticorpo multivalente numa célula hospedeira não mamífera (por exemplo, uma célula hospedeira procariótica como uma células hospedeira de E. coli) é desejada; para terapêutica de doenças ou distúrbios não oncológicos; e/ou para evitar o "efeito de primeira dose" observado depois da administração aos pacientes de determinados anticorpos que possuem uma ou mais funções efetoras. Tais formas do anticorpo podem compreender um anticorpo multivalente incluindo um domínio de dimerização, em que o domínio de dimerização compreende uma região de dobradiça de anticorpo fusionada a um domínio de fecho de leucina (o domínio de fecho de leucina facilita a associação dos polipéptidos que formam o domínio de dimerização, mas podem ser subsequentemente removidos proteoliticamente antes da administração a um paciente) (veja-se a Fig. 23C) ; um anticorpo multivalente com três sítios de ligação a antigénio como aquela mostrada na Fig. 23D; ou um anticorpo multivalente com quatro sítios de ligação a antigénio como aquele ilustrado na Fig. 23E.
Βτρ M Mh Μ Μ M Jv J AM M mS ^3j A /3 Μ 1 Μ Μ «M* AM M dHA (1% |M ijn M AMO* AM MM H JM • &SpsClIlClGaG6 G@ ll^aÇaO cl αΠ^Ι^ΘΏΙΟ 0 anticorpo multivalente do presente documento é direcionado contra, ou liga-se especificamente a, um ou mais antigénios alvo. Preferentemente, pelo menos um dos antigénios ligados pelo anticorpo multivalente é um polipéptido biologicamente importante e a administração do anticorpo a um mamífero que sofre de uma doença ou distúrbio pode resultar num benefício terapêutico nesse mamífero. Contudo, os anticorpos direcionados contra antigénios não polipeptídicos (como antigénios glicolipídicos associados a tumores; veja-se o documento de patente 5.091.178) são também contemplados.
Quando o antigénio é um polipéptido, pode ser uma molécula transmembranar (por exemplo, um recetor) ou ligando como um fator de crescimento. Antigénios exemplificativos incluem moléculas como renina; uma hormona do crescimento, incluindo hormona de crescimento humana e hormona de crescimento bovina; fator de libertação de hormona do crescimento; hormona da paratiroide; hormona estimulante da tiroide; lipoproteínas; alfa-l-antitripsina; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagão; fatores de coagulação como fator VIIIC, fator IX, fator tecidual (TF) e fator de von Willebrands; fatores anticoagulação como Proteína C; fator natriurético atrial; tensioativo pulmonar; um ativador de plasminogénio, como uma uroquinase ou ativador de plasminogénio de tipo de tecido ou urina humana (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hematopoiético; fator de necrose tumoral alfa e beta; encefalinase,* RANTES (regulada na ativação, normalmente expressa e secretada por células T); proteína inflamatória de macrófagos humana (MIP-1-alfa); uma albumina sérica tal como albumina sérica humana; sustancia inibidora Muelleriana; cadeia A da relaxina,* cadeia B da relaxina; prorrelaxina; péptido associado a gonadotropina de ratinho; uma proteína microbiana, como beta-lactamase; ADNase; IgE; um antigénio associado a linfócitos T citotóxicos (CTLA), como CTLA-4; inibina; ativina,· fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); recetores de hormonas ou fatores de crescimento; proteína A ou D; fatores reumatoides; um fator neurotrófico tal como fator neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento nervoso como NGF-β; fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento fibroblãstico tal como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento transformante (TGF) tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-βΙ, TGF-β2, Τ0Ρ-β3, TGF^4 ou TGF-βδ; fator de crescimento semelhante a insulina I e II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação a fator de crescimento semelhante a insulina; proteínas CD como CD3, CD4, CDS, CD19, CD2 0 e CD25 (subunidade Tac do recetor de IL-2); eritropoietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; uma proteína morfogenética óssea (BMP); um interferão como interferão-alfa, -beta, e -gama; fatores estimulantes de colónias (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1 a IL-10; superõxido dismutase; recetores de células T; proteínas de membrana de superfície; fator acelerador do decaimento; antigénio virai como, por exemplo, uma porção do envelope de SIDA; proteínas de transporte; recetores de migração dirigida; adressinas; proteínas reguladoras; integrinas como CDlla, CDllb, CDllc, CD18, e ICAM, VLA-4 ou VCAM; um antigénio associado a tumor como recetor HER2, HER3 ou HER4; e fragmentos de qualquer dos polipéptidos listados acima.
Alvos moleculares preferidos para os anticorpos englobados pela presente invenção incluem marcadores da superfície leucocitãria ou proteínas CD como CDla-c, CD2, CD2R, CD3, CD4, CDS, CD6, CD7, CDS, CD9, CD10, GDIla, CDllb, CDllc, CDwl2, CD13, CD14, CD15, CD15S, CD16, CD16b, CDwl7, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD2 6, CD2 7, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD3 6, CD3 7, CD38, CD39, CD40, C41, CD42a-d, CD43, CD44, CD44R, CD4 5, CD45A, CD45B, CD450, CD46-CD48, CD49a-f, CD50, CD51, CD52, CD53- CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CDw65, CD66a-e, CD68-CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a-b, CD80-CD83, CDw84, CD85-CD89, CDw90, CD91, CDw92, CD93-CD98, CD99, CD99R, CD100, CDwlOl, CD102-CD106, CDlQ7a-b, CDwlOS, CDwl09, CD115, CDwll6, CD117, CD119, CD120a-b, CD121a-b, CD122, CDwl24, CD126-CD129 e CD130; membros da família do recetor ErbB como o recetor de EGF, recetor HER2, recetor HER3 ou recetor HER4; antigénio(s) específico(s) da próstata; moléculas de adesão celular como Ilb/IIIa, LFA- 1, Mad, pl50.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, integrina α4/β7 e integrina αν/β3 incluindo subunidades o; ou β das mesmas (por exemplo, anticorpos anti-CDlla, anti-CD18 ou anti-CDllb) ; fatores de crescimento como VEGF; fator tecidual (TF) ; interferão alfa (IFN a) ; uma interleucina, como IL-8; IgE; antigénios de grupo sanguíneo; recetor flk2/flt3; recetor de obesidade (OB) ; recetor c-mpl; CTLA-4; proteína C, etc.
Antigénios solúveis ou fragmentos dos mesmos, opcionalmente conjugados com outras moléculas, podem ser utilizados como imunogénios para a geração de anticorpos. Para moléculas transmembranares, como recetores, fragmentos dos mesmos (por exemplo, o domínio extracelular de um recetor) podem ser utilizados como o imunogénio. Alternativamente, as células que expressam a molécula transmembranar podem ser utilizadas como o imunogénio. Tais células podem ser derivadas a partir de uma fonte natural (por exemplo, linhas celulares de cancro) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembranar. Outros antigénios e formas dos mesmos úteis para a preparação dos anticorpos serão aparentes para os peritos 11a especialidade.
Antigénios alvo preferidos para os anticorpos multivalentes do presente documento incluem (1) recetores ErbB, incluindo EGFR, HER2, HER3 e HER4; (2) recetores na superfamília de recetores de TNF, por exemplo, recetores Apo2L, como DR4, DR5, DcRl e DcR2; (3) antigénios de superfície de células B, especialmente CD19, CD20, CD22 e CD40; (4) antigénios expressos por células tumorais; (5) antigénios superexpressos por células tumorais (por exemplo, recetores ErbB; DcR3); (6) recetores ativados por ligandos multiméricos (por exemplo, diméricos ou triméricos) (por exemplo, recetores 11a superf amí lia dos recetores de TNF; recetores VEGF, etc.) . Numa forma de realização, três ou mais (por exemplo, quatro a cerca de oito) dos sítios de ligação a antigénio do anticorpo multivalente podem ser todos direcionados contra o mesmo determinante antigénico ou epítopo num dos antigénios anteriores. 0 presente pedido também proporciona anticorpos multiespecíficos, ou seja, anticorpos que têm especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes ou determinantes antigénicos. Anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos; BsAbs) têm potencial significativo numa ampla gama de aplicações clínicas como agentes de direcionamento para imunodiagnóstico e terapêutica in vitro e in vivo, e para imunoensaios de diagnóstico.
Os anticorpos biespecíficos têm sido muito úteis na sondagem de propriedades funcionais das moléculas de superfície celular e na definição da capacidade dos diferentes recetores Fc para mediar a citotoxicidade (Fanger et al. , Grit. Rev. Immunol. 12:101-124 (1992)).
Nolan et al., Biochem. Biophys. Acta. 1040:1-11 (19S0) descrevem outras aplicações de diagnóstico para os BsAbs. Em particular, os BsAbs podem ser construídos para imobilizar enzimas para utilização em imunoensaios enzimáticos. Para alcançar isto, um braço do BsAb pode ser desenhado para se ligar a um epítopo específico na enzima de modo que a ligação não causa a inibição enzimática, o outro braço do BsAb liga-se à matriz de imobilização assegurando uma elevada densidade enzimática no local desejado. Exemplos de tais BsAbs de diagnóstico incluem o BsAb de coelho anti-IgG/anti-ferritina descrito por Hammer ling et al. , J. Exp. Med. 128:1461-1473 (1968) que foi utilizado para localizar antigénios de superfície. Os BsAbs que têm especificidades de ligação para a peroxidase de rábano (HRP) bem como uma hormona também foram desenvolvidos. Outra potencial aplicação imunoquímica para os BsAbs envolve a sua utilização em imunoensaios de dois sítios. Por exemplo, dois BsAbs são produzidos ligando-se a dois epítopos separados na proteína analito: um BsAb liga o complexo a uma matriz insolúvel, o outro liga uma enzima indicadora (veja-se Nolan et al., supra).
Anticorpos multiespecíficos também podem ser utilizados para imunodiagnóstico in vitro ou in vivo de várias doenças como o cancro (Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol. 79:315 (1990)) . Para facilitar esta utilização de diagnóstico do BsAb, um braço do BsAb pode ligar-se a um antigénio associado a tumor e o outro braço pode ligar-se a um marcador detetável como um quelante que se liga fortemente a um radionuclídeo. Utilizando esta abordagem, Le Doussal et al., produziram um BsAb útil para radioimunodeteção de carcinomas colorretais e de tiroide que tinham um braço que se ligava a um antigénio carcinoembriónico (CEA) e outro braço que se ligava a ácido dietilenotriaminopentacético (DPTA). Veja-se Le Doussal et al. , Int. J. Cancer Suppl. 7:58-62 (1992) e Le Doussal et al., J. Nucl, Med. 34:1662-1671 (1S93). Stickney et al. descrevem, de forma semelhante, uma estratégia para detetar cancros colorretais que expressam CEA utilizando radioimunodeteção. Estes investigadores descrevem um BsAb que se liga a CEA bem como a hidroxietiltioureia-benzil-EDTA (EOTUBE) . Veja-se Stickney et al., Cancer Res. 51 :6650-6655 (1991) .
Os anticorpos multiespecíficos também podem ser utilizados para terapêutica humana na citotoxicidade redirecionada proporcionando um braço que se liga a um alvo (por exemplo, agente patogénico ou célula tumoral) e outro braço que se liga a uma molécula desencadeadora citotõxica, como o recetor de células T ou um recetor de Fc gama. Consequentemente, os anticorpos multiespecíficos podem ser utilizados para direcionar os mecanismos de defesa imunitária do paciente especificamente para a célula tumoral ou agente infecioso. Utilizando esta estratégia, foi demonstrado que os anticorpos biespecíficos que se ligam ao Fc gama RIII (ou seja, CD16) podem mediar a morte das células tumorais por células natural killer (NK)/linfócitos granulares grandes (LGK) in vitro e são eficazes na prevenção do crescimento tumoral in vivo. Segal et al. , Chem. Immunol. 47:179 (1989) e Segal et al. , Biologic Therapy of Cancer 2(4) DeVita et al. eds. J.B. Lippincott, Philadelphia (1992) p. 1. De forma semelhante, foi desenvolvido um anticorpo biespecífico tendo um braço que se liga a Fc gama RIII e outro que se liga ao recetor HER2 para terapêutica de tumores ováricos e de mama que superexpressam o antigénio HER2. (Hseih-Ma et al. Cancer Research 52:6832-6839 (1992) e Weiner et al. Cancer Research 53:94-100 (1993)). Os anticorpos biespecíficos também medeiam a morte por células T. Normalmente, os anticorpos biespecíficos ligam o complexo de CD3 nas células T a um antigénio associado a um tumor. Um BsAb F(ab')2 completamente humanizado que consiste em anti-CD3 ligado a anti-pl85 foi utilizado paira direcionar células T para matar células tumorais que superexpressam o recetor HER2. Shalaby et al. , J. Exp. Med. 175(1):217 (1992). Os anticorpos biespecíficos foram testados em vários ensaios clínicos de fase precoce com resultados encorajadores. Num ensaio, 12 pacientes com cancro pulmonar, ovãrico ou de mama foram tratados com infusões de linfócitos T direcionados com um anticorpo biespecífico anti-CD3/antitumoral (M0C31). deLeij et al. Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne, Fanger e Segal Eds., Lienhart (1991) p. 249. As células alvejadas induziram uma lise local considerável das células tumorais, uma reação inflamatória leve, mas nenhuns efeitos secundários tóxicos ou respostas de anticorpo anti-ratinho. Num ensaio muito preliminar de um anticorpo biespecífico anti-CD3/anti-CD19 num paciente com neoplasia maligna de células B, foi também alcançada uma redução significativa das contagens de células tumorais periféricas. Clark et al. Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne, Fanger e Segal Eds., Lienhart (1991) p. 243. Veja-se também Kroesen et al. , Cancer Immunol. Immunother. 37:400-407 (1993), Kroesen et al., Br. J. Cancer 70:652-661 (1994) e Weiner et al. , J. Immunol. 152:2385 (1994) em relação a aplicações terapêuticas para anticorpos multiespecíficos.
Os anticorpos multiespecíficos também podem ser utilizados como agentes fibrinolíticos ou adjuvantes de vacinas. Adicionalmente, estes anticorpos podem ser utilizados no tratamento de doenças infeciosas (por exemplo, para direcionar células efetoras para células infetadas com vírus como VIH ou vírus da gripe ou protozoários como Toxoplasma gondii) , utilizados para administrar imunotoxinas a células tumorais, ou direcionar complexos imunes a recetores da superfície celular (veja-se Fanger et al., supra). Vários anticorpos multiespecíficos são contemplados no presente documento. Por exemplo, o anticorpo multiespecífico pode ligar-se a dois ou mais epítopos diferentes de um antigénio de interesse. Alternativamente, o anticorpo multiespecífico pode ter especificidade para (1) um antigénio expresso por uma célula alvo (por exemplo, onde a célula alvo é uma célula tumoral) e (2) uma molécula desencadeadora num leucócito, como uma molécula recetora de células T (por exemplo, CD2 ou CD3) , ou recetores Fc para IgG (Fc gama R), como Fc gama RI (CD64), Fc gama RII (CD32) e Fc gama RI II (GDI 6) de modo a focar os mecanismos de defesa celular na célula que expressa o antigénio. Os anticorpos multiespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos em células que expressam o antigénio alvo. Estes anticorpos possuem um braço de ligação a antigénio alvo e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, interferão alfa, alcaloide da vinca, cadeia A de ricina, metotrexato ou hapteno de isótopos radioativos). 0 documento WO 96/16673 descreve um anticorpo biespecífico anti-HER2/anti-Fc gama RIII e o documento de patente U.S. N.° 5.837.234 divulga um anticorpo biespecífico anti-HER2/anti-Fc gamma RI. Um anticorpo biespecífico anti-HER2/Fc alfa é mostrado no documento WO98/02463. 0 documento de patente U.S. N.° 5.821.337 ensina um anticorpo biespecífico anti-HER2,/anti-CD3 . C. Preparação do anticorpo parental
De modo a gerar o anticorpo multivalente, um anticorpo pparentalp ou pde partidap com domínios variáveis direcionado contra um antigénio pode ser preparado utilizando várias metodologias para produzir anticorpos, como aquelas descritas abaixo no presente documento. As sequências dos domínios variáveis do anticorpo de partida ou parental podem ser utilizadas no conceção do anticorpo multivalente do presente documento. (i) Anticorpos policlonais
Os anticorpos policlonais são produzidos preferentemente em animais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antigénio relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antigénio relevante com uma proteína que seja imunogénica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina de lapa californiana, albumina serica, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja utilizando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugação por meio de resíduos de cisterna), N-hidroxisuccinimida (por meio de resíduos de lisina), gluteraldeído, anidrido succínico, S0C12, ou R1N=C=NR, em que R e R1 são grupos alquilo diferentes.
Os animais são imunizados contra o antigénio, conjugados imunogénicos, ou derivados combinando, por exemplo, 100 pg ou 5 pg da proteína ou conjugado (para coelhos ou ratinhos, respetivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução por via intradérmica em múltiplos locais. Um mês depois os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de péptido ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos locais. De sete a 14 dias mais tarde são recolhidas amostras sanguíneas dos animais e o soro é analisado quanto ao título de anticorpos. Os animais são reforçados até estabilizar o título. Preferentemente, o animal é reforçado com o conjugado do mesmo antigénio, mas conjugado a uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Os conjugados também podem ser feitos em culturas celulares como proteínas de fusão. Igualmente, são utilizados convenientemente agentes de agregação tais como alúmen para potenciar a resposta imunitária. (ii) Anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais são obtidos de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades mínimas. Assim, o modificador "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos diferenciados.
Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por meio de métodos de ADN recombinante (documento de patente U.S. N.° 4.816.567).
No método de hibridoma, um ratinho ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hãmster, é imunizado como foi descrito anteriormente no presente documento para induzir linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se liguem especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são fusionados depois com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, tais como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)) .
As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e crescidas num meio de cultura adequado que contém preferentemente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma originais, não fusionadas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não possuem a enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT.
As células de mieloma preferidas são aquelas que são fusionadas eficazmente, suportam a produção a alto nível estável de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas, são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Entre estes, as linhas celulares de mieloma preferidas são linhas de mieloma murino, como as derivadas de tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-ll disponíveis do Centro de Distribuição de Células do Instituto Salk, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e as células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis da Coleção Americana de Culturas Tipo, Rockville, Maryland, Estados Unidos. Também foram descritas linhas celulares de mieloma humano e heteromieloma de ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)). 0 meio de cultura no qual as células de hibridoma crescem é analisado para a produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antigénio. Preferentemente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Depois de serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por meio de procedimentos de diluição limitativa e cultivados por meio de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).
Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores ascíticos num animal.
Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones também sâo separados convenientemente do meio de cultura, fluido ascítico ou soro por meio de procedimentos de purificação de anticorpos convencionais tais como, por exemplo, proteína Ά-Sepharose, cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese em gel, diãlise ou cromatografia de afinidade. 0 ADN que codifica os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que são capazes de se ligar especificamente a ADNs que codificam as cadeias pesadas e leves dos anticorpo murinos). As células de hibridoma agem como uma fonte preferida do dito ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vetores de expressão, que, quando são transfetados em células hospedeiras, tais como E. coli, células COS símias, células de ovário de hãmster chinês (CHO), ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de ADN que codifica o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992). A expressão recombinante de anticorpos será descrita em maior detalhe abaixo.
Numa forma de realização adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al. , Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al. , J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos humanos e murinos, respetivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de afinidade elevada (intervalo nM) através de redistribuição de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992) ), bem como infeção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionais para isolamento de anticorpos monoclonais. 0 ADN pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos em lugar das sequências de ratinho homólogas (documento de patente U.S. N.° 4.816.567; e Morrison, et al., Proc. Nat/ Acad. Sei. USA, 81:6851 (1984)), ou juntando covalentemente à sequência de codificação da imunoglobulina toda ou parte da sequência de codificação para um polipéptido não imunoglobulínico.
Tipicamente os ditos polipéptidos não imunoglobulínicos substituem os domínios constantes de um anticorpo, ou substituem os domínios variáveis de um local de combinação de antigénio de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um local de combinação de antigénio que tem especificidade por um antigénio e outro local de combinação de antigénio que tem especificidade por um antigénio diferente. (iii) Anticorpos humanos
Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos através de uma adaptação do método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler e Milstein utilizando linfõcitos B humanos como o parceiro de fusão. Os linfócitos B humanos que produzem um anticorpo de interesse podem, por exemplo, ser isolados a partir de um indivíduo humano, depois de se obter o consentimento informado. Por exemplo, o indivíduo pode estar a produzir anticorpos contra um autoantigénio como ocorre com determinados distúrbios como lúpus e r i t emato so sistémico (Shoenf eld 6l al. J. Clin. 1nve s t. 70:205 (1982)), púrpura trombocitopénica imunomediada (ITP) (Nugent et al. Blood 70(1):16-22 (1987)), ou cancro. Alternativamente, ou adicionalmente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Por exemplo, podem expor-se linfócitos de sangue periférico humanos isolados in vitro a um agente lisomotrófico (por exemplo, éster L-leucina-O-metílico, éster dimetílico do ácido L-glutâmico ou éster L-leucil-L-leucina-O-metílico) (documento de patente U.S. N.° 5.567.610, Borrebaeck et al.); e/ou linfócitos do sangue periférico humano esgotados de células T in vitro com adjuvantes como 8-mercaptoguanosina e citocinas (documento de patente U.S. N.° 5.229.275, Goroff et al.).
Os linfócitos B recuperados a partir do indivíduo ou imunizados in vitro, são depois, no geral, imortalizados de modo a gerar um anticorpo monoclonal humano. Técnicas para imortalizar os linfócitos B incluem, mas não estão limitadas a: (a) fusão do linfócito B humano com células de mielomas humanos, de ratinho ou heteromieloma de ratinho-humano; (b) transformação virai (por exemplo, com um vírus Epstein-Barr; veja-se Nugent et al. , supra, por exemplo); (c) fusão com uma linha celular linfoblastoide ou (d) fusão com células de linfoma.
Os linfócitos podem ser fusionados depois com células de mieloma utilizando um agente de fusão adequado, como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e crescidas num meio de cultura adequado que contém preferentemente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma originais, não fusionadas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não possuem a enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), cujas substâncias previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT. Linhas celulares de mieloma humano e heteromieloma de ratinho-humano adequadas foram descritas (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987)) . O meio de cultura no qual as células de hibridoma crescem é analisado quanto à produção de anticorpos monoclonais direcionados contra o antigénio. Preferentemente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA).
Depois de serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por meio de procedimentos de diluição limitativa e cultivados por meio de métodos padrão (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones também são separados convenientemente do meio de cultura, fluido ascítico ou soro por meio de procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tais como, por exemplo, cromatografia de proteína A, eletroforese em gel, diãlise ou cromatografia de afinidade.
Os anticorpos humanos também podem ser gerados utilizando um hospedeiro não humano, tal como um ratinho, que é capaz de produzir anticorpos humanos. Conforme indicado acima, estão agora disponíveis ratinhos transgénicos que são capazes, após a sua imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção (JH) da cadeia pesada de um anticorpo em ratinhos mutantes quiméricos e de linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógena. A transferência da coleção de genes de imunoglobulinas germinais humanos em tais ratinhos mutantes germinais resultará na produção de anticorpos humanos após desafio antigénico. Veja-se, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al. , Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immune., 7:33 (1993); documento de patente U.S. N. 0 5.591.669; documento de patente U.S. N.° 5.589.369 e documento de patente U.S. M.° 5.545.807. Os anticorpos humanos também podem ser preparados utilizando ratinhos SCI-hu (Duchosal et al. Nature 355:258-262 (1992)).
Noutra forma de realização, o anticorpo humano pode ser selecionado a partir de uma biblioteca de apresentação em fagos de anticorpos humanos. A preparação de bibliotecas de anticorpos ou fragmentos dos mesmos é bem conhecida na técnica e qualquer dos métodos conhecidos pode ser utilizado para construir uma família de vetores de transformação que podem ser introduzidos nas células hospedeiras. Bibliotecas de cadeias leves e pesada de anticorpos em fagos (Huse et al., Science, 246:1275 (1989)) ou de proteínas de fusão em fagos ou fagemídeos podem ser preparadas de acordo com procedimentos conhecidos. Veja-se, por exemplo, Vaughan et al. , Nature Biotechnology 14:309-314 (1996); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 88:7978-7982 (1991); Marks et al. , J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:4457-4461 (1992); Griffiths et al. , EMBO Journal, 13:3245-3260 (1994); de Kruif et al., J. Mol. Biol., 248:97-105 (1995); documento WO 98/05344; documento WO 98/15833; documento WO 97/47314; documento WO 97/44491; documento WO 97/35196; documento WO 95/34648; documento de patente U.S. N.° 5.712.089; documento de patente U.S. N.° 5.702.892; documento de patente U.S. M.° 5.427.908; documento de patente U.S. N.° 5.403.484; documento de patente U.S. N.° 5.432.018; documento de patente U.S. N.° 5.270.170; documento WO 92/06176; documento WO 99/06587; documento de patente U.S. N.° 5.514.548; documento WO 97/08320 e documento de patente U.S. N.° 5.702.892. 0 antigénio de interesse ê detetado frente à biblioteca de fagos utilizando procedimentos conhecidos no campo para selecionar fagos-anticorpos que se ligam ao antigénio alvo. (iv) Anticorpos humanizados
Foram descritos na técnica métodos para humanizar anticorpos não humanos. Preferentemente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos nele de uma fonte que nao é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são denominados com frequência resíduos "importados", que são recolhidos tipicamente de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. , Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al. , Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. , Science, 239:1534-1536 (1988)), substituindo as sequências das regiões hipervariáveis pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (documento de patente U.S. N. 0 4.816.567) em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados sao tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos das regiões hipervariãveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. A escolha de domínios variáveis humanos, anto leves como pesados, a ser utilizado na preparação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o método denominado de "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra toda a biblioteca de sequências de domínios variáveis humanas conhecidas. A sequência humana que está mais próxima daquela do roedor é então aceite como a estrutura humana para o anticorpo humanizado (Sims et al. , J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al. , J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma estrutura particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992); Presta et al. , J. Immunol., 151:2623 (1993) ) . É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências de origem e vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências de origem e humanizadas. Os modelos de imunoglobulinas tridimensionais estão comummente disponíveis e são familiares àqueles peritos na especialidade. Estão disponíveis programas informáticos os quais ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulinas candidatas selecionadas. A inspeção destas apresentações permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, ou sejaf a análise de resíduos que influem na capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar a seu antigénio. Desta maneira, podem ser selecionados e ser combinados do recipiente e importados sequências de modo que se consiga a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada pelo antigénio ou os antigénios alvo, e conseguida. Geralmente, os resíduos das regiões hipervariáveis estão diretamente e muito substancialmente envolvidos na influência da ligação ao antigénio. (v) Fragmentos de anticorpos Várias técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja-se, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al. , Science, 229:81 (1985)). Contudo, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas em fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, podem ser recuperados diretamente fragmentos Fab'-SH de E. coli e ser acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 podem ser diretamente isolados a partir de cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para o perito. Noutras formas de realização, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Veja-se o documento WO 93/16185.; documento de patente U.S. N.° 5.571.894 e documento de patente U.S. N.° 5.587.458. 0 fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito no documento de patente U.S. N.° 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpos podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. (vi) Sequências variantes de anticorpo São contempladas uma ou mais modificações dos anticorpos descritos no presente documento. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da sequência de aminoãcidos do anticorpo são preparadas pela introdução de alterações nucleotídicas apropriadas no ácido nucleico do anticorpo, ou através de síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, eliminações a partir de, e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição é realizada para alcançar a construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácidos também podem alterar processos pós-traducionais do anticorpo, como alterar o número ou posição dos sítios de glicosilação. Tais alterações podem ser feitas ao anticorpo parental e/ou anticorpo multivalente e/ou podem ser introduzidas na sequência de aminoãcidos do anticorpo multivalente no momento em que a sequência é feita.
Um método útil para a identificação de determinados resíduos ou regiões do anticorpo que são localizações preferidas para mutagénese é chamado "mutagénese dirigida com alanina" como descrito por Cunningham e Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, é identificado um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos com carga tais como arg, asp, his, lys, e são substituídos por um aminoácido neutro ou com carga negativa (mais preferentemente alanina ou polialanina) para afetar à interação dos aminoãcidos com antigénio. Aquelas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são, então, refinadas por introdução de mais ou outras variantes nos, ou para os, sítios de substituição. Assim, enquanto o sítio para introdução da variação na sequência de aminoácidos é predeterminado, a natureza da mutação per se não tem de ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o rendimento de uma mutação num local dado, realiza-se mutagénese dirigida com ala ou aleatória no codão ou região alvo e os anticorpos multivalentes expressos são rastreadas quanto à atividade desejada.
As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carboxilo terminais variando em comprimento de um resíduo a polipéptidos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de resíduos de aminoácidos individuais ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionilo N-terminal ou o anticorpo fusionado a um polipéptido citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo de uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipéptido que aumenta a semivida sérica do anticorpo.
Um outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagénese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. As substituições conservatives são mostradas no Quadro 1 sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultam numa alteração na atividade biológica, então, as substituições mais substanciais, denominadas "substituições exemplificativas" no Quadro 1, ou como adicionalmente descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos rastreados. __Quadro 1_
São conseguidas modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo selecionando substituições que diferem significativamente no seu efeito na manutenção de (a) a estrutura da cadeia principal polipeptídica na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de origem natural são divididos em grupos baseados em propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
As substituições não conservatives implicarão a troca de um membro de uma destas classes para uma outra classe.
Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a reticulação aberrante. De modo inverso, uma ou mais ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade.
Um tipo de variante de substituição particularmente preferido envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para posterior desenvolvimento terão propriedades biológicas melhoradas relativamente ao anticorpo parental a partir do qual são geradas. Uma forma conveniente de gerar tais variantes de substituição envolve a maturação da afinidade utilizando apresentação em fagos. Resumidamente, diversos sítios da região hipervariável (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cada sítio. Os anticorpos muitivalentes assim gerados são apresentados de uma forma monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões ao produto do gene III de Ml3 compactado dentro de cada partícula. As variantes expressas em fagos são então rastreadas quanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação), como divulgado no presente documento. Com a finalidade de identificar locais de região hipervariãvel candidatos para modificação, pode ser realizada mutagénese de rastreio de alanina para identificar resíduos de região hipervariãvel que contribuem significativamente à ligação de antigénio. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antigénio-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e o antigénio. Tais resíduos de contacto e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas aqui elaboradas. Uma vez que tais variantes são geradas, o painel de variantes é submetido a rastreio como descrito no presente documento e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para posterior desenvolvimento.
Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Alterar significa eliminar uma ou mais frações de hidratos de carbono encontrados no anticorpo, e/ou adicionando um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação de anticorpos é tipicamente ou N-ligada ou 0-ligada. N-ligada refere-se à ligação da fração de hidrato de carbono à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas de asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é um aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimãtica da fração de hidrato de carbono à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma destas sequências tripeptídicas num polipéptido cria um potencial sítio de glicosilação. A glicosilação 0-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido de hidroxamino, mais frequentemente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser utilizadas. A adição de sítios de glicosilaçâo ao anticorpo é convenientemente conseguida alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que contenha uma ou mais das sequências tripeptídicas acima descritas (para sítios de glicosilaçâo N-ligados). A alteração também pode ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilaçâo O-ligados).
As moléculas de ácido nucleico codificando variantes da sequência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados a, isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de variantes de sequência de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação através de mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou sítio-dirigida), mutagénese por PCR, e mutagénese por cassete de uma versão variante ou não variante previamente preparada do anticorpo.
Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção em relação à função efetora, por exemplo, de modo a potenciar a citotoxicidade mediada por células dependente de antigénio (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser conseguido introduzindo uma ou mais modificações de aminoácidos numa região Fc do anticorpo, gerando assim uma região Fc variante. A variante de região Fc pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma substituição) numa ou mais posições de aminoácidos.
Numa forma de realização, a região Fc variante pode mediar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) na presença de células efetoras humanas de forma mais eficaz, ou ligar-se a um recetor Fc gama (FcvR) com melhor afinidade, do que uma região Fc de sequência nativa. Tais variantes de região Fc podem compreender uma modificação de aminoácidos numa ou mais das posições 256, 290, 298, 312, 326, 330, 333, 334, 360, 378 ou 430 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Rabat. A variante de região Fc com ligação reduzida a um FcyR pode compreender uma modificação de aminoácidos numa ou mais das posições de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 272, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 ou 43 9 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Rabat.
Por exemplo, a variante de região Fc pode apresentar uma ligação reduzida a um FcyRI e compreender uma modificação de aminoácidos numa ou mais das posições de aminoácidos 238, 265, 269, 270, 327 ou 329 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Rabat. A variante de região Fc pode apresentar uma ligação reduzida a um FcyRII e compreender uma modificação de aminoácidos numa ou mais das posições de aminoácidos 238, 265, 269, 270, 292, 294, 295, 298, 303, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 373, 376, 414, 416, 419, 435, 438 ou 4 3 9 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Rabat. A variante de região Fc de interesse pode apresentar uma ligação reduzida a um FcyRIII e compreender uma modificação de aminoácidos numa ou mais das posições de aminoácidos 238, 239, 248, 249, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 2 72, 278, 28S, 293, 294, 295, 296, 301, 303, 322, 327, 329, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 416, 434, 435 ου 437 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.
Noutra forma de realização, a variante de região Fc apresenta uma ligação melhorada ao FcyR e compreende uma modificação de aminoácidos numa ou mais das posições de aminoácidos 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 298, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 326, 330, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 ou 430 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.
Por exemplo, a variante de região Fc pode apresentar uma ligação aumentada a um FcyRIII e, opcionalmente, pode adicionalmente apresentar uma ligação diminuída a um FcyRII. Uma tal variante exemplificativa compreende uma ou mais modificações de aminoácidos na(s) posição(ões) 298 e/ou 333 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. A variante de região Fc pode apresentar uma ligação aumentada a um FcyRII e compreender uma modificação de aminoácidos numa ou mais das posições de aminoácidos 255, 256, 258, 267, 268, 272, 276, 280, 283, 285, 286, 290, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 326, 330, 331, 337, 340, 3 78, 3 98 ou 430 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Tais variantes de região Fc com ligação aumentada a um FcyRII podem opcionalmente apresentar ainda uma ligação diminuída a um FcyRIII e podem, por exemplo, compreender uma modificação de aminoácidos em qualquer uma ou mais das posições de aminoácidos 268, 272, 298, 301, 322 ou 340 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. A região Fc variante pode alternativa ou adicionalmente ter afinidade de ligação ao recetor Fc neonatal (FcRn) alterada. Tais regiões Fc variantes podem compreende uma modificação de aminoãcidos numa ou mais das posições 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 ou 447 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. As variantes de região Fc com ligação reduzida a um FcRn podem compreender uma modificação de aminoãcidos numa ou mais das posições de aminoãcidos 252, 253, 254, 255, 288, 309, 386, 388, 400, 415, 433, 435, 436, 439 ou 44 7 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. As variantes de região Fc mencionadas anteriormente podem, alternativamente, apresentar uma ligação aumentada a um FcRn e compreender uma modificação de aminoãcidos numa ou mais das posições de aminoãcidos 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 4 34 da região Fc, em que a numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice EU como em Kabat.
Variantes de região Fc com ligação a Clq e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC) alterada (ou seja, melhorada ou diminuída) são descritas no documento W099/51642. Tais variantes podem compreender uma substituição de aminoãcidos numa ou mais das posições 270, 322, 326, 327, 329, 331, 333 ou 334 da região Fc. Veja-se, também, Duncan e Winter Nature 322:738-40 (1988); documento de patente U.S. N.° 5.648.260; documento de patente U.S. N.° 5.624.821 e documento W094/29351 relacionados com as variantes de região Fc.
Para aumentar a semivida em soro do anticorpo, pode ser incorporado um epítopo de ligação a recetor de recuperação no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) como é descrito no documento de patente U.S. 5.739.277, por exemplo. Como utilizado no presente documento, a expressão "epítopo de ligação a recetor de recuperação" refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável por aumentar a semivida sérica in vivo da molécula de IgG. (vii) Imunoconjugados A invenção também se refere a imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado com um agente citotóxico como um agente quimioterapêutico, toxina (por exemplo, uma toxina de molécula pequena ou uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes das mesmas), ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado).
Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima.
Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, como caliqueamicina, uma maitansina (documento de patente U.S. N.° 5.208.020), um tricoteno, e CC1065 são também contemplados no presente documento.
Numa forma de realização preferida da invenção, o anticorpo é conjugado com uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 a cerca de 10 moléculas de maitansina por molécula de anticorpo). A maitansina pode, por exemplo, ser convertida em May-SS-Me que pode ser reduzida a May-SH3 e submetida a reação com um anticorpo modificado (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) para gerar um imunoconjugado de maitansinoide-anticorpo.
Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo conjugado com uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos de caliqueamicina é capaz de produzir quebras no ADN de cadeia dupla em concentrações subpicomolares. Análogos estruturais da caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados a, γι1, ay1, ay1, N-acetil-γι1, PSAG e Θ1! (Hinman et al, Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) e Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)). Vejam-se, também, os documentos de patente U.S. N.°s 5.714.586; 5.712.374; 5.264.586 e 5.773.001.
Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas que podem ser utilizados incluem a cadeia A de difteria, fragmentos ativos de não ligação da toxina da difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Mormodica charantia, curcina, crotina, inibidor da Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restritocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Veja-se, por exemplo, o documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. A presente invenção contempla ainda um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma ADN endonuclease, como uma desoxirribonuclease; ADNase).
Uma variedade de isótopos radioativos estão disponíveis para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, , Ii25, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu.
Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser produzidos utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP) , ciclohexano-1-carboxilato de sucinimidil-4-(N-maleimidometilo), iminotiolano (IT), derivados funcionais de imidoésteres (como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres ativos (como suberato de disuccinimidilo), aldeídos (como gluteraldeído), compostos de bis-azido (coo bis (p-azidobenzoílo) hexanodiamina), derivados de bis-diazónio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolieno), e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987) . Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentacético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 é um agente quelante exemplificativo para a conjugação de radionucleótidos com o anticorpo. Veja-se o documento WO 94/11026. 0 ligante pode ser um "ligante clivável" que facilita a libertação do fãrmaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante ãcido-lábil, ligante sensível à peptidase, ligante de dimetilo ou ligante contendo dissulfureto (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) podem ser utilizados.
Alternativamente, pode ser produzida uma proteína de fusão que compreende o anticorpo e agente citotóxico, por exemplo, através de técnicas recombinantes ou síntese peptídica.
Ainda noutra forma de realização, o anticorpo pode ser conjugado com um "recetor" (como estreptavidina) para utilização no pré-direcionamento tumoral em que o conjugado de anticorpo-recetor é administrado ao paciente, seguido pela remoção de conjugado não ligado a partir da circulação utilizando um agente de eliminação e depois administração de um "ligando" (por exemplo, avidina) que é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleótido). (viii) Terapêutica com profármacos mediada por enzimas dependente de anticorpos (Antibody Dependent Enzyme Mediated Prodrug Therapy, ADEPT)
Os anticorpos da presente invenção podem ser também utilizados em ADEPT através da conjugação do anticorpo com uma enzima ativadora de profármaco que converte um profãrmaco (por exemplo, um agente quimioterapêutico de peptidilo, veja-se o documento WO 94/01145) num fãrmaco anticanceroso ativo. Veja-se, por exemplo, o documento WO 88/07378 e o documento de patente U.S. N.° 4.975.278. O componente enzimático do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de atuar sobre um profármaco de tal modo a convertê-lo na sua forma citotóxica mais ativa.
Enzimas que são úteis no método desta invenção incluem, mas não estão limitadas a, fosfatase alcalina útil para converter profármacos que contêm fosfato em fãrmacos livres; arilssulfatase útil para converter profármacos que contêm sulfato em fãrmacos livres; citosina desaminase útil para converter 5-fluorocitosina não tóxica no fármaco anticanceroso, 5-fluorouracilo; protéases, como protéase de serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (como catepsinas B e L) , que são úteis para converter profármacos que contêm péptidos em fãrmacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, úteis para converter profármacos que contêm substituintes de D aminoácidos; enzimas que clivam hidratos de carbono como beta-galactosidade e neuraminidase úteis para converter profármacos glicosilados em fármacos livres; beta-lactamase útil para converter fármacos derivatizados com beta-lactamas em fãrmacos livres; e amidases de penicilina, como amidase de penicilina V ou amidase de penicilina G, úteis para converter fármacos derivatizados nos seus azotos amina com grupos fenoxiacetilo ou fenilacetilo, respetivamente, em fãrmacos livres. Alternativamente, os anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como pabzimasp, podem ser utilizados para converter os profármacos da invenção em fármacos ativos livres (veja-se, por exemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Os conjugados de anticorpo-abzima podem ser preparados como descrito no presente documento para administração da abzima a uma população de células tumorais.
As enzimas desta invenção podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos através de técnicas bem conhecidas na técnica como a utilização dos reagentes de reticulação heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, proteínas de fusão que compreendem pelo menos a região de ligação a antigénio de um anticorpo da invenção ligada a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma enzima da invenção podem ser construídas utilizando técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na técnica (veja-se, por exemplo, Neuberger et al. , Nature, 312 : 604-608 (1984) . (ix) Outras modificações de anticorpos
Outras modificações do anticorpo são contempladas no presente documento. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado a um de uma variedade de polímeros não proteicos, por exemplo, polietilenoglicol, propilenoglicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol. 0 anticorpo também pode ser aprisionado em microcãpsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, microcãpsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcãpsulas de poli(metilmetacrilato), respetivamente), em sistemas de administração de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., Ed., (1980).
Os anticorpos divulgados no presente documento também podem ser formulados como imunolipossomas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, como descrito em Epstein et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); documentos de patente U.S. N.°s 4.485.045 e 4.544.545 e documento W097/38731 publicado a 23 de outubro de 1997. Lipossomas com tempo de circulação potenciado são divulgados no documento de patente U.S. N.° 5.013.556.
Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação de fase reversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudidos através de filtros de tamanho de poro definido para proporcionar lipossomas com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados com os lipossomas como descrito em Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reação de intercâmbio de dissulfureto. Um agente quimioterapêutico é opcionalmente contido dentro do lipossoma. Veja-se Gabizon et al. J. National Cancer Inst.81(19)1484 (1989). D. Vetores, células hospedeiras e métodos recombinantes A invenção também proporciona ácidos nucleicos isolados que codificam um anticorpo como divulgado no presente documento, vetores e células hospedeira que compreendem o ácido nucleico, e técnicas recombinantes para a produção do anticorpo.
Para a produção recombinante do anticorpo, o ácido nucleico codificante é isolado e inserido num vetor replicável para clonagem adicional (amplificação do ADN) ou para expressão. 0 ADN que codifica o anticorpo é prontamente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam o anticorpo). Estão disponíveis muitos vetores. Os componentes do vetor normalmente incluem, mas não são limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor, uma sequência de terminação da transcrição. (i) Componente da sequência sinal 0 anticorpo muitivalente pode ser produzido de forma recombinante, não apenas diretamente, mas também como um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que é preferentemente uma sequência sinal ou outro polipéptido com um sítio de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipéptido maduro. A sequência sinal heteróloga selecionada, é preferentemente, uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariotas que não reconhecem nem processam a sequência sinal do anticorpo multivalente nativo, a sequencia sinal e substituída por uma sequência sinal procariota selecionada, por exemplo, a partir do grupo de líderes da fosfatase alcalina, penicilase, Ipp, ou de enterotoxina termoestãvel II. Para a secreção de leveduras a sequência sinal nativa pode ser substituída por, por exemplo, pelo líder de invertase de levedura, líder do fator a. (incluindo os líderes dos fatores c* de Saccharomyces e Kluyveromyces), ou líder da fosfatase ácida, o líder da glucosamilase de C. albicans, ou o sinal descrito no documento WO 90/13646. Na expressão de células de mamífero, as sequências sinal de mamífero, bem como os líderes de secreção virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis. 0 ADN para tal região precursora é ligado num quadro de leitura ao ADN que codifica o anticorpo multivalente. (íí) Componente de origem de replicação
Tanto os vetores de expressão como de clonagem contêm uma sequência de ácidos nucleicos que permite que o vetor se replique numa ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, nos vetores de clonagem esta sequência é uma que permite que o vetor se replique independentemente do ADN cromossómico do hospedeiro, e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autónoma. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para leveduras, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovirus, VSV ou BPV) são úteis para a clonagem de vetores em células de mamíferos. Mo geral, o componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamífero (a origem de SV40 pode tipicamente ser utilizada apenas porque contém o promotor precoce). (iii) Componente do gene de seleção
Os vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também designado marcador selecionável. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos e outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica a D-alanina racemase para Bacillus.
Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para deter o crescimento de uma célula hospedeira. Aquelas células que são transformadas com sucesso com um gene heterõlogo produzem uma proteína que confere resistência a fármacos e assim sobrevivem ao regime de seleção. Os exemplos de tal seleção dominante utilizam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
Outro exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para incorporar o ácido nucleico do anticorpo multivalente, tais como DHFR, timidina quinase, metalotioneína-I e -II, preferentemente genes de metalotioneína de primata, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase, etc.
Por exemplo, as células transformadas com o gene de seleção DHFR são, primeiro, identificadas por cultura de todos os transf ormantes num meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada aquando da utilização de DHFR de tipo selvagem é a linha de células de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR.
Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiras de tipo selvagem que contêm DHFR endógena) transformadas ou cotransformadas com sequências de ADN que codificam um anticorpo multivalente, proteína DHFR do tipo selvagem, e um outro marcador selecionãvel, tal como aminoglicosídeo 3'-fosfotransferase (ΑΡΗ), podem ser selecionadas por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionãvel, tal como um antibiótico aminoglicosídeo, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418. Veja-se o documento de patente U.S. N.° 4.965.199.
Um gene de seleção adequado para utilização em leveduras é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al. , Mature, 282:39 (1979)) . 0 gene trpl proporciona um marcador de seleção para uma estirpe mutante de levedura que carece da atividade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC N. 0 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). A presença da lesão trpl no genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para a deteção de transformação através do crescimento na ausência de triptofano. De forma semelhante, as estirpes de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 or 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que carregam o gene Leu2.
Adicionalmente, vetores derivados a partir do plasmídeo circular pKDl de 1,6 Sm podem ser utilizdos para a transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para produção a larga escala de quimosina de bezerro recombinante foi relatado para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990) . Vetores de expressão multicópias estáveis para a secreção de albumina sérica humana madura através de estirpes industriais de Kluyveromyces também foram divulgados. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991). (iv) Componente promotor
Os vetores de expressão e clonagem contêm normalmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operativamente ligado ao ácido nucleico do anticorpo multivalente. Promotores adequados para utilização com hospedeiros procariotas incluem o promotor phoA, os sistemas promotores de β-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, um sistema de promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos tais como o promotor tac. Contudo, outros promotores bacterianos conhecidos são adequados. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente ligada ao ADN que codifica o anticorpo multivalente.
Sequências de promotores são conhecidas para eucariotas. Virtualmente, todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Uma outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleótido. Na extremidade 3! da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência ΑΑΤΆΆΑ que pode ser o sinal para a adição da cauda poli-A à extremidade 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são adequadamente inseridas em vetores de expressão eucarióticos.
Exemplos de sequências promotoras adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glucoquinase.
Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveis tendo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para a álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas com o metabolismo do azoto, metalotioneína, giiceraldeído-3-fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis para utilização de maltose e galactose. Os vetores e promotores adequados para utilização na expressão de leveduras são descritos adicionalmente em EP 73.657. Os potenciadores de levedura são vantajosamente utilizados com promotores de levedura. A transcrição do anticorpo multivalente a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomas de vírus como poliomavírus, vírus da varíola aviária, adenovirus (tal como Adenovirus 2), papilomavírus bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovirus, vírus da hepatite B e mais preferentemente o Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores de mamífero heterõlogos, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.
Os promotores precoce e tardio do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV4 0 que também contém a origem de replicação virai de SV4G, 0 promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E. Um sistema para expressar ADN em hospedeiros mamíferos utilizando o papilomavírus bovino como um vetor é divulgado no documento de patente U.S. N.° 4.419.446. Uma modificação deste sistema é descrita no documento de patente U.S. N.° 4.601.978. Veja-se também Reyes et al. ,
Nature 297:598-601 (1982) sobre a expressão do ADNc de β- interferão humano em células de ratinho sob o controlo de um promotor de timidina quinase a partir do vírus de herpes simplex. Alternativamente, a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous pode ser utilizada como o promotor. (v) Componente de elemento potenciador A transcrição do ADN que codifica o anticorpo multivalente desta invenção por eucariotas superiores é frequentemente aumentada inserindo uma sequência potencializadora no vetor. Muitas sequências potenciadoras são agora conhecidas de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, cx-fetoprotema e insulina) . Tipicamente, contudo, utilizar-se-ã um potenciador de um vírus de células eucariõticas. Exemplos incluem o potenciador do SV40 na última parte da origem de replicação (100-270 pb) , o potenciador do promotor inicial de citomegalovírus, o potenciador de polioma na última parte da origem de replicação e potenciadores de adenovirus. Veja-se também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos potenciadores para ativação de promotores eucarióticos. 0 potencializador pode ser unido por splicing no vetor numa posição 5' ou 3' em relação à sequência de codificação do anticorpo multivalente, mas é preferentemente localizado num sítio a 5' do promotor. (vi) Componente de terminação da transcrição
Os vetores de expressão utilizados nas células hospedeiras eucariõticas (de leveduras, fúngicas, de inseto, vegetais, animais, de ser humano, ou células nucleadas a partir de outros organismos multicelulares) irão também conter sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do ARNm. Tais sequências estão normalmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente, 3', de ADN ou ADNc eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica o anticorpo multivalente. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilaçâo da hormona de crescimento bovina. Veja-se o documento WO 94/11026 e o vetor de expressão divulgado neste. (vii) Seleção e transformação de células hospedeiras Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vetores do presente documento são as células procariotas, leveduras ou células eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequados para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos e Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, por exemplo, E. colí, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacillus tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheníformis 41 P divulgado em DD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 2 94 (ATCC 31.446), embora outras estirpes como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam adequadas. Estes exemplos são ilustrativos, em vez de limitantes.
Adicionalmente aos procariotas, os micróbios eucariotas tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de expressão ou clonagem adequados para os vetores que codificam o anticorpo multivalente. Saccharomyces cerevisiae, ou a levedura de padeiro comum, é o mais comumente utilizado entre os microrganismos hospedeiros eucariotas inferiores. Contudo, uma série de outros géneros, espécies, e estirpes estão comummente disponíveis e são úteis no presente documento, como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltíi (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans e K. marxíanus/yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros de Aspergillus como A. nidulans e A. niger.
As células hospedeiras adequadas para a expressão do anticorpo multivalente glicosilado são derivadas a partir de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrado incluem células vegetais e de insetos. Numerosas estirpes e variantes de baculovírus e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta), e Bombyxmori foram identificadas. Uma variedade de estirpes virais para a transfeção estão publicamente disponíveis, por exemplo, a variante L-l de NPV de Autographa californica e a estirpe Bm-5 de NPV de Bombyx mori, e tais vírus podem ser utilizados como os vírus do presente documento de acordo com a presente invenção, particularmente para transfeção de células de Spodoptera frugiperda.
Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiros.
Contudo, o interesse tem sido maior para células de vertebrados, e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhas celulares de hospedeiros mamíferos úteis são a linha CV1 de rim de macaco transformada por SV4G (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embriónico humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al. , J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70) ; células de rim de macaco-verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma do colo do útero humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de ratazana búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; uma linha de hepatoma humano (Hep G2) e células de mieloma ou linfoma (por exemplo, células Y0, J558L, P3 e NS0) (veja-se o documento de patente U.S. N.° 5.807.715).
As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem para a produção dos anticorpos multivalentes descritos acima, e cultivadas em meios nutritivos convencionais modificados como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes, ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas. (viii) Cultura das células hospedeiras
As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo multivalente desta invenção podem ser cultivadas numa variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e meio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para a cultura das células hospedeiras. Adicionalmente, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al, , Anal. Biochem.102:255 (1980), documentos de patente U.S. N.°s 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 OU 5.122.469; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195 ou documento de patente U.S. Re. 30.985 podem ser utilizados como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios podem ser suplementados conforme necessário com hormonas e/ou outros fatores de crescimento (como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (como HEPES), nucleótidos (como adenosina e timidina), antibióticos (como fãrmaco GENTAMY CIN™), oligoelementos (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais no intervalo micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas pelos peritos na especialidade. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e semelhantes, são aquelas previamente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão aparentes para o perito na especialidade. (ix) Purificação
Ao utilizar técnicas recombinantes, o anticorpo multivalente pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplásmico, ou ser diretamente secretado para o meio. Se o anticorpo multivalente for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os detritos particulados, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultrafiltraçâo. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolamento de anticorpos que são secretados para o espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante cerca de 30 min„ Os detritos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo multivalente é secretado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados utilizando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon, Um inibidor de protéases, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer das etapas anteriores para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. A composição do anticorpo multivalente preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatite, eletroforese em gel, diãlise e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequabilidade da proteína A como um ligando de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer região Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo multivalente. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que estão baseados nas cadeias pesadas γΐ, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de ratinho e para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)) . A matriz à qual o ligando de afinidade está ligado é, muito frequentemente, agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de porosidade controlada ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos que os que podem ser alcançados com agarose. Quando o anticorpo multivalente compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação proteica tais como fracionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina-SEPHAROSE™, cromatografia numa resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico) , cromatofocagem, SDS-PAGE, e precipitação com sulfato de amónio, estão também disponíveis dependendo do anticorpo multivalente a ser recuperado. E. Formulações farmacêuticas
Formulações terapêuticas do anticorpo multivalente são preparadas para armazenamento através de mistura do anticorpo multivalente que têm o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes opcionais farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de soluções aquosas, formulações liofilizadas ou outras secas. Veículos, excipientes, ou estabilizantes aceitáveis são não tóxicos para os recetores nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos,· antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcõnio, cloreto de benzetónio; fenol, butilo ou álcool benzílico; parabenos de alquilo tais como parabeno de metilo ou propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixa massa molecular (menos do que 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacãridos, dissacãridos, e outros hidratas de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de
Zn-proteina) } e/ou tensioativos nao ionicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). A formulação no presente documento também pode conter mais de um composto ativo conforme for necessário para a indicação particular a ser tratada, preferentemente aqueles que têm atividades complementares que não se afetam de forma adversa entre si. Exemplos de combinações de compostos ativos são proporcionados na Secção G abaixo intitulada pUtilizações in vivo para o anticorpo multivalentep. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respetivamente, em sistemas de administração de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microsferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente conseguido por filtração através de membranas de filtração estéreis.
Podem ser preparadas preparações de libertação sustentada. Exemplos adequados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo multivalente, cujas matrizes estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilácticos (documento de patente N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, vinilacetato de etileno não degradável, copolímeros degradáveis de ácido glicólico-ácido láctico tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno vinilo acetato e ácido láctico-ácido glicólico possibilitam a libertação de moléculas durante mais de 100 dias, determinados hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Quando os anticorpos encapsulados permanecem no corpo durante um período de tempo longo, elas podem desnaturar-se ou agregar-se como um resultado da exposição à humidade a 37 °C, resultando numa perda de atividade biológica e possíveis alterações na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser concebidas para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se se descobre que o mecanismo de agregação consiste na formação de ligações S-S intermoleculares através do intercâmbio de tio-dissulfureto, a estabilização pode ser alcançada através da modificação dos resíduos de sulfidrilo, liofilização de soluções ácidas, controlo do teor de humidade, utilização de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz polimérica específicas. F. Utilizações não terapêuticas para o anticorpo muitivaiente 0 anticorpo multivalente da invenção pode ser utilizado como um agente de purificação de afinidade. Neste processo, o anticorpo multivalente é imobilizado sobre uma fase sólida como resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. 0 anticorpo multivalente imobilizado é colocado em contacto com uma amostra que contém o antigénio a ser purificado e, posteriormente, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra exceto o antigénio a ser purificado, que está ligado ao anticorpo multivalente imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, como tampão de glicina, pH 5,0, que libertará o antigénio a partir do anticorpo multivalente. 0 anticorpo multivalente também pode ser útil em ensaios de diagnóstico, por exemplo, para detetar a expressão de um antigénio de interesse em células, tecidos ou soro específicos.
Para aplicações diagnósticas, o anticorpo multivalente tipicamente será marcado com uma fração detetável. Numerosos marcadores estão disponíveis, os quais podem ser geralmente agrupados nas seguintes categorias: (a) Radioisótopos, como 3bS, 14C, , 3H e 1311. 0 anticorpo multivalente pode ser marcado com o radioisótopo utilizando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al., Ed. Wiley- Interscience, Nova Iorque, Nova Iorque, Pubs. (1991), por exemplo, e a radioatividade pode ser medida utilizando contagem de cintilação. (b) Marcadores fluorescentes como quelatos de terras raras (quelatos de eurõpio) ou fluoresceína e os seus derivados, rodamina e os seus derivados, dansilo, Lissamina, ficoeritrina e vermelho do Texas estão disponíveis. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados com o anticorpo multivalente utilizando as técnicas divulgadas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada utilizando um fluorímetro. (c) Vários marcadores de enzima-substrato estão disponíveis e o documento de patente U.S. N.° 4.275.149 proporciona uma revisão sobre alguns deles. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogénico que pode ser medida usando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma mudança de cor num substrato, que pode ser medida por espectrofotometria. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou a quimioluminiscência do substrato. As técnicas para quantificar uma alteração na fluorescência são descritas acima. 0 substrato quimioluminiscente torna-se eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida (usando um quimioluminómetro, por exemplo) ou doa energia para um aceitador fluorescente. Exemplos de marcadores enzimãticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana; o documento de Patente U.S. M° 4.737.456), a luciferina, 2,3-diidroftalazinodionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase como peroxidase de rábano (HRPO), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases (por exemplo, glucose oxidase, galactose oxidase, e glucose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e semelhantes. As técnicas para conjugar enzimas a anticorpos são descritas em O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone e H. Van Vunakis), Academic press, Nova Iorque, 73:147-166 (1981).
Exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) peroxidase de rábano (HRPO) com hidrogeno peroxidase como substrato, em que a hidrogeno peroxidase oxida um precursor de corante (por exemplo, ortofenilenodiamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenilo como substrato cromogénico e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogénico (Por exemplo, P-nitrofenil^-D-galactosidase) ou substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidase.
Numerosas outras combinações enzima-substrato estão disponíveis para os peritos na especialidade. Para uma revisão geral destes, vejam-se os documentos de patente U.S. N.°s 4.275.149 e 4.318.980.
Algumas vezes, o marcador é indiretamente conjugado com o anticorpo multivalente. 0 perito na especialidade conhecerá várias técnicas para alcançar este efeito. Por exemplo, 0 anticorpo multivalente pode ser conjugado com biotina e qualquer uma das três grandes categorias de marcadores mencionados acima pode ser conjugada com avidina, ou vice-versa. A biotina liga-se seletivamente à avidina e, portanto, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo multivalente desta maneira indireta. Alternativamente, para alcançar a conjugação indireta do marcador com o anticorpo multivalente, o anticorpo multivalente é conjugado com um pequeno hapteno (por exemplo, digoxina) e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima é conjugado com um anticorpo multivalente anti-hapteno (por exemplo, anticorpo anti-digoxina). Assim, pode ser conseguida a conjugação indireta do marcador com o anticorpo multivalente.
Noutra forma de realização da invenção, o anticorpo multivalente não tem de ser marcado, e a presença do mesmo pode ser detetada utilizando um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo multivalente. 0 anticorpo multivalente da presente invenção pode ser empregue num método de ensaio conhecido, como ensaios de ligação competitivos, ensaios de tipo sandwich diretos e indiretos e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal
Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc . 1987) . 0 anticorpo multivalente pode também ser utilizado para ensaios diagnósticos in vivo. No geral, o anticorpo multivalente é marcado com um radionuclídeo (como ilJTn, 99Tc, 14C, 131I, 125I, 3H, 32P ou 33S) de modo que o antigénio ou células que o expressam se podem localizar utilizando imunocintiografia. F. Utilizações in vivo para o anticorpo multivalente
Contempla-se que o anticorpo multivalente divulgado no presente documento possa ser utilizado para tratar um mamífero, por exemplo, um paciente que padece de, ou é predisposto a, uma doença ou distúrbio que poderia beneficiar-se da anticorpo multivalente.
Quando o anticorpo se liga a um recetor ErbB, como HER2, as condições a serem tratadas com o mesmo incluem tumores benignos ou malignos; leucemias e neoplasias malignas linfoides; outros distúrbios como distúrbios neuronais, gliais, astrocíticos, hipotalâmicos, glandulares, macrofãgicos, epiteliais, estromais, blastocélicos, inflamatórios, angiogénicos e imunológicos. No geral, a doença ou distúrbio a ser tratado com o anticorpo que se liga a um recetor ErbB é cancro.
Exemplos de cancro a serem tratados no presente documento incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemina ou neoplasias malignas linfoides. Exemplos mais particulares de tais cancros incluem cancro de células escamosas, cancro de pulmão incluindo cancro pulmonar de células pequenas, cancro pulmonar de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gástrico ou do estômago incluindo cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro de cólon, cancro colorretal, carcinoma do endométrio ou do útero, carcinoma das glândulas salivares, cancro de rim ou renal, cancro do fígado, cancro de próstata, cancro da vulva, cancro da tiroide, carcinoma hepático bem como cancro da cabeça e pescoço. 0 cancro irá compreender, no geral, células que expressam um antigénio ligado pelo anticorpo, de modo que o anticorpo é capaz de se ligar ao cancro. Numa forma de realização, o cancro pode ser caracterizado por superexpressão do antigénio (por exemplo, superexpressão de um recetor ErbB). Para determinar a expressão do antigénio pelo cancro, estão disponíveis vários ensaios de diagnóstico/prognóstico. Numa forma de realização, a superexpressão do antigénio pode ser analisada por IHC, por exemplo, utilizando o HERCEPTEST® (Dako) onde o antigénio é HER2. No teste de ICH de HER2, secções de tecido incorporadas em parafina a partir de uma biopsia tumoral podem ser submetidas ao ensaio de IHC e podem-lhe ser conferidos critérios de intensidade de coloração da proteína HER2 do seguinte modo:
Pontuação não é observada qualquer coloração ou coloração 0 de membrana em menos de 10 ê das células tumorais.
Pontuação uma coloração ligeira/quase impercetível da 1+ membrana é detetada em mais de 10 ê das células tumorais. As células são apenas coradas em parte da sua membrana.
Pontuação é observada uma coloração fraca a moderada 2+ completa da membrana em mais de 10 ê das células tumorais.
Pontuação é observada uma coloração moderada a forte 3+ completa da membrana em mais de 10 ê das células tumorais.
Aqueles tumores com pontuações 0 ou 1+ para a avaliação da superexpressão de HER2 podem ser caracterizados como não superexpressando HER2, enquanto os tumores com pontuações 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como superexpressando HER2.
Como alternativa, ou adicionalmente, os ensaios FISH como o INFORM™ (vendido por Ventana, Arizona) ou PATHVISION™ (Vysis, Illinois) podem ser levados a cabo em tecido fixado com formalina, incorporado em parafina para determinar a extensão (se existir) da superexpressão do antigénio por parte do tumor.
Numa forma de realização, o cancro será um que expressa (e pode superexpressar) um recetor ErbB selecionado a partir do grupo que consiste em EGFR, ErbB3 e ErbB4. Exemplos de cancros que podem expressar/superexpressar EGFR, ErbB3 ou ErbB4 incluem cancro celular escamoso, cancro de pulmão incluindo cancro pulmonar de células pequenas, cancro pulmonar de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, cancro do peritoneu, cancro hepatocelular, cancro gástrico ou do estômago incluindo cancro gastrointestinal, cancro pancreático, glioblastoma, cancro do colo do útero, cancro ovárico, cancro do fígado, cancro da bexiga, hepatoma, cancro da mama, cancro de cólon, cancro colorretal, carcinoma do endométrio ou do útero, carcinoma das glândulas salivares, cancro de rim ou renal, cancro do fígado, cancro de próstata, cancro da vulva, cancro da tiroide, carcinoma hepático bem como cancro de cabeça e pescoço bem como glioblastomas. 0 cancro a ser tratado no presente documento pode ser um caracterizado por ativação excessiva de um recetor ErbB, por exemplo, EGFR. Tal ativação excessiva pode ser atribuível à superexpressão ou produção aumentada do recetor ErbB ou de um ligando de ErbB. Numa forma de realização da invenção, um ensaio de diagnóstico ou prognóstico será realizado para determinar se o cancro do paciente é caracterizado pela ativação excessiva de um recetor ErbB. Por exemplo, a amplificação do gene ErbB e/ou superexpressão de um recetor ErbB no cancro pode ser determinada. Vários ensaios para determinar tal amplificação/superexpressão estão disponíveis na técnica e incluem os ensaios de IHC, FISH e de antigénios libertados descritos acima. De forma alternativa, ou adicionalmente, os níveis de ligando de ErbB, como TGF-alfa, no tumor ou associados com ele podem ser determinados de acordo com procedimentos conhecidos. Tais ensaios podem detetar proteínas e/ou ácidos nucleicos que o codificam na amostra a ser testada. Numa forma de realização, os níveis de ligando de ErbB no tumor podem ser determinados utilizando imunohistoquímica (IHC); veja-se, por exemplo, Scher et al. Clin. Cancer Research 1:545-550 (1995). Alternativamente, ou adicionalmente, é possível avaliar os níveis de ácidos nucleicos que codificam o ligando de ErbB na amostra a ser testada; por exemplo, através de técnicas de hibridação in situ fluorescente ou FISH, southern blot e de reação em cadeia da polimerase (PCR).
Além disso, a superexpressão ou amplificação do recetor ErbB ou ligando de ErbB pode ser avaliada utilizando um ensaio de diagnóstico in vivo, por exemplo, através da administração de uma molécula (como um anticorpo) que se liga à molécula a ser detetada e é marcado com um marcador detetável (por exemplo, um isótopo radioativo) e rastreando externamente o paciente quanto à localização do marcador.
Quando o anticorpo se liga a um antigénio de superfície de células B, o anticorpo pode ser utilizado para tratar um linfoma de células B (incluindo linfoma não Hodgkin de baixo grau/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau intermédio/folicular; NHL de grau intermédio difuso; NHL de grau elevado imunoblástico; NHL de grau elevado linfoblástico; NHL de grau elevado de células pequenas não clivadas; NHL de doença volumosa; linforna de células do manto; linfoma relacionado com SIDA e macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas e leucemia mieloblástica crónica; e distúrbio linfoproliferativo pós-transplante (PTLD). 0 anticorpo, por exemplo, o anticorpo anti-antigénio de superfície de células B, também pode ser utilizado para tratar uma doença autoimune. Exemplo de distúrbios ou doenças autoimunes incluem, mas não são limitados a, respostas inflamatórias tais como doenças inflamatórias da pele incluindo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); esclerodermia sistémica e esclerose; respostas associadas à doença intestinal inflamatória (tal como doença de Crohn e colite ulcerativa); síndrome do desconforto respiratório (incluindo síndrome do desconforto respiratório em adultos; SDRA); dermatite; meningite; encefalite,* uveíte; colite,* glomerulonef rite ,· condições alérgicas tais como eczema e asma e outras condições patológicas envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas; aterosclerose ,· deficiência de adesão de leucócitos; artrite reumatoide; lúpus eritematoso sistémico (LES); diabetes mellitus (por exemplo, diabetes mellitus do tipo I ou diabetes mellitus dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tiroidite autoimune; encefalomielite alérgica,· síndrome de Sjogren; diabetes de aparição juvenil; e respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T tipicamente encontrados em tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças que envolvem a diapedese leucocitária; distúrbio inflamatório do sistema nervoso central (SNC); síndrome de lesão de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, mas não limitada a crioglobinemia ou anemia positiva de Coombs); miastenia gravis; doenças mediadas por complexos antigénio-anticorpo; doença de membrana basal anti-glomerular; síndrome antifosfolipídica; neurite alérgica; doença de Graves; síndrome miasténica de Lambert-Eaton ; penfigoide bulhoso; pênfigo; poliendocrinopatias autoimunes; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doença de Behcet; arterite de células gigantes; nefrite por complexos imunes; nefropatia por IgA; polineuropatias por IgM; púrpura trombocitopénica imune (ITP) ou trombocitopenia autoimune, etc.
Os anticorpos direcionados contra antigénios de superfície de células B também podem ser utilizados para bloquear uma resposta imunitária contra um antigénio exógeno. Por pantigénio exógenop aqui entende-se uma molécula ou moléculas que não é/são endógenas ou nativas de um mamífero que é exposto a elas. 0 antigénio exógeno pode desencadear uma resposta imunitária, por exemplo, uma resposta mediada por células T e/ou humoral no mamífero. No geral, o antigénio exógeno provocará a produção de anticorpos contra ele. Exemplos de antigénios exógenos contemplados no presente documento incluem agentes terapêuticos imunogénicos, por exemplo, proteínas como anticorpos, particularmente anticorpos que compreendem resíduos de aminoácidos não humanos (por exemplo, anticorpos de roedor, quiméricos/humanizados e anticorpos primatizados); toxinas (opcionalmente conjugadas com uma molécula de direcionamento como um anticorpo, em que a molécula de direcionamento também pode ser imunogénica); vetores virais de terapêutica génica, como retrovirus e adenovirus,* enxertos; agentes infeciosos (por exemplo, bactérias e vírus); aloantigénios (ou seja, um antigénio que ocorre em alguns, mas não todos os membros da mesma espécie) como diferenças nos tipos sanguíneos, antigénios linfocitários humanos (HLA), antigénios de plaquetas, antigénios expressos em órgãos transplantados, componentes sanguíneos, fatores de gravidez (Rh) e hemofílicos (por exemplo, Fator VIII e Fator IX). 0 anticorpo anti-antigénio de superfície de células B também pode ser utilizado para dessensibilizar um mamífero que aguarda um transplante.
Os anticorpos direcionados contra um recetor numa superfamília de recetor de TNF pode ser empregue para ativar ou estimular a apoptose em células cancerosas.
Em determinadas formas de realização, um imunoconjugado que compreende o anticorpo conjugado com um agente citotóxico é administrado ao paciente. Preferentemente, o imunoconjugado e/ou antigénio ao qual está ligado/são internalizados pela célula, resultando numa eficácia terapêutica aumentada do imunoconjugado na morte das células cancerosas ao qual se liga. Numa forma de realização preferida, o agente citotóxico atua sobre ou interfere com o ácido nucleico na célula cancerosa. Exemplos de tais agentes citotóxicos incluem quaisquer dos agentes quimioterapêuticos indicados no presente documento (como um maitansinoide ou uma caliqueamicina), um isótopo radioativo, ou uma ribonuclease ou uma ADN endonuclease. Conforme indicado acima, o anticorpo multivalente também pode ser utilizado para ADEPT. 0 presente pedido contempla a combinação do anticorpo multivalente (ou imunoconjugado do mesmo) com um ou mais agentes terapêuticos, especialmente para o tratamento de cancro. Por exemplo, o anticorpo multivalente pode ser coadministrado com outro anticorpo multivalente (ou anticorpos multivalentes), um anticorpo (ou anticorpos) monovalent.es ou bivalentes, um ou mais agentes quimioterapêuticos (incluindo cocktails de agentes quimioterapêuticos), outro(s) agente(s) citotóxico(s), um ou mais agentes antiangiogénicos, citocinas, e/ou um ou mais agentes inibidores do crescimento. Quando o anticorpo multivalente induz a apoptose, pode ser particularmente desejável combinar o anticorpo multivalente com um ou mais outro(s) agente (s) terapêutico (s) que também induz(em) a apoptose. Por exemplo, os anticorpos pró-apoptóticos (por exemplo, anticorpos bivalentes ou multivalentes) direcionados contra antigénios da superfície de células B (por exemplo, anticorpos anti-CD20 RITUXAN®, ZEVALIN® ou BEXXAR®) podem ser combinados com (1) anticorpos pró-apoptóticos (por exemplo, anticorpos bivalentes ou multivalentes direcionados contra um recetor na superfamília de recetores de TNF, como anticorpos anti-DR4 ou anti-DR5) ou (2) com citocinas na família de citocinas de TNF (por exemplo, Apo2L). Igualmente, anticorpos anti-ErbB (por exemplo, anticorpo anti-HER2 HERCEPTIN®) podem ser combinados com (1) e/ou (2) . De forma alternativa, ou adicionalmente, o paciente pode receber terapêutica de radiação combinada (por exemplo, irradiação com feixe externo ou terapêutica com um agente radioativo marcado, como um anticorpo). Tais terapêuticas combinadas indicadas acima incluem a administração combinada (onde os dois ou mais agentes são incluídos na mesma formulação ou em formulações separadas), e a administração separada, em cujo caso, a administração do anticorpo multivalente pode ocorrer antes, e/ou depois, da administração da terapêutica ou terapêuticas adjuntas. 0 anticorpo multivalente (e agente de terapêutica adjunta) é/são administrados através de quaisquer meios adequados, incluindo administração parentérica, subcutânea, intraperitonal, intrapulmonar e intranasal, e, se desejada para tratamento local, administração intralesional. As infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitonal, ou subcutânea. Adicionalmente, o anticorpo multivalente é adequadamente administrado por infusão de pulsos, particularmente com doses decrescentes do anticorpo multivalente. Preferentemente a dosagem é dada por injeções, mais preferentemente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração é breve ou crónica.
Além da administração da proteína de anticorpo ao paciente, o presente pedido contempla a administração do anticorpo por terapêutica génica. Tal administração de um ácido nucleico que codifica o anticorpo é englobada pela expressão padministrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpop. Veja-se, por exemplo, o documento WO96/07321 publicado a 14 de março de 1996 relacionado com a utilização de terapêutica génica para gerar anticorpos intracelulares.
Existem duas principais abordagens para colocar o ácido nucleico (opcionalmente contido num vetor) dentro das células do paciente; in vivo e ex vivo. Para a administração in vivo o ácido nucleico é administrado diretamente no paciente, normalmente no sítio onde o anticorpo é necessário. Para o tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucleico é introduzido nestas células isoladas e as células modificadas são administradas ao paciente seja diretamente ou, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que são implantadas no paciente (veja-se, por exemplo, os documentos de patente U.S. n.°s 4.892.538 e 5.283.187). Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introduzir ácidos nucleicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo de se o ácido nucleico é transferido para células cultivadas in vitro, ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácidos nucleicos para células de mamífero in vitro incluem a utilização de lipossomas, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, o método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. Um vetor comummente utilizado para a administração ex vivo do gene é um retrovirus. As técnicas de transferência de ácidos nucleicos in vivo atualmente preferidas incluem a transfeção com vetores virais (como adenovirus, vírus herpes simplex I, ou vírus adeno-associados) e sistemas à base de lípidos (lípidos úteis para a transferência mediada por lípidos do gene são DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo), Em algumas situações é desejável proporcionar à fonte de ácidos nucleicos um agente que se dirija às células alvo, como um anticorpo específico para uma proteína da superfície da membrana celular ou para a célula alvo, um ligando para um recetor sobre a célula alvo, etc. Quando são empregues lipossomas, proteínas que se ligam a uma proteína da superfície da membrana celular associada com a endocitose podem ser utilizadas para direcionar e/ou facilitar a captação, por exemplo, proteínas da cãpside ou fragmentos das mesmas, trópicas para um tipo celular particular, anticorpos para proteínas que passam por internalização na ciclagem, e proteínas que direcionam a localização intracelular e potenciam a semivida intracelular. A técnica de endocitose mediada por recetores é descrita, por exemplo, por Wu et al. , J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987); e Wagner et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:3410-3414 (1990). Para uma revisão da marcação génica atualmente conhecida e protocolos de terapêutica génica veja-se Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Veja-se também o documento WO 93/25673 e as referências citadas no mesmo.
Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de anticorpo multivalente dependerá do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e curso da doença, de se o anticorpo multivalente é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapêutica prévia, do historial clínico do paciente e resposta ao anticorpo multivalente, e do julgamento do médico assistente. 0 anticorpo multivalente é adequadamente administrado ao paciente numa vez ou durante uma série de tratamentos.
Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, cerca de 0,1-20 mg/'kg) de anticorpo multivalente é uma dosagem inicial candidata para administração ao paciente, seja, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas de doença. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorizado por técnicas e ensaios convencionais. A composição de anticorpo multivalente será formulada, doseada e administrada de uma forma consistente com a boa prática médica. Fatores para a consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local de administração do agente, o método de administração, o esquema de administração, e outros fatores conhecidos para os clínicos médicos. A 0 quantidade terapeuticamente eficazS do anticorpo multivalente a ser administrada será governada por tais considerações, e é a quantidade mínima necessária para impedir, melhorar ou tratar uma doença ou distúrbio. 0 anticorpo multivalente não tem de ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz dos ditos outros agentes depende da quantidade de anticorpo multivalente presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos anteriormente. Estes são geralmente usados nas mesmas dosagens e vias de administração como acima utilizados ou cerca de 1 a 99 ê das dosagens empregues até então. H. Artigos de fabrico
Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima. 0 artigo de fabrico compreende um recipiente e um rótulo ou folheto informativo no ou associado ao recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. 0 recipiente contém uma composição que é eficaz para o tratamento da condição patológica e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurãvel por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo multivalente. 0 rótulo ou folheto informativo indica que a composição é utilizada para tratar a condição de escolha, como cancro. Além disso, o artigo de fabrico pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo multivalente e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional. 0 artigo de fabrico nesta forma de realização da invenção pode compreender ainda um folheto informativo indicando que a primeira e a segunda composições de anticorpo podem ser usadas para tratar cancro. De forma alternativa, ou adicionalmente, o artigo de fabrico pode compreender além disso um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir além disso outros materiais desejáveis desde um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas. I. Depósito de materiais
As seguintes linhas celulares de hibridoma foram depositadas com a Coleção Americana de Culturas Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EUA (ATCC):
Ti ο α ΐ mn Μ r1 S π Η λ d ΆΤΡΡ Ti ώ f* α Λλ HfiTiOCi i"n 0 a ^ A&Ca w Cl v U v áti e a» A v w ai» Cl v Ci vlv w ϋ ^ w w anticorpo 7C2 (anti-HER2) ATCC HB-12215 17 de outubro de 1996 7F3 (anti-HER2) ATCC HB-12216 17 de outubro de 1996 4D5 (anti-HER2) ATCC CRL 24 de maio de 1990 10463 2C4 (anti-HER2) ATCC HB-12697 8 de abril de 1999 3F11.39.7 (anti-DR5) HB-12456 13 de janeiro de 1998 3H3.14.5 (anti-DR5) HB-12534 2 de junho de 1998 3D5.1.10 (anti-DR5) HB-12536 2 de junho de 1998 3H1.1S.10 (anti-DR5) HB-12535 2 de junho de 1998 4E7.24.3 (anti-DR4) HB-12454 13 de janeiro de 1998 4H6.17.8 (anti-DR4) HB-12455 13 de janeiro de 1998 A invenção será mais completamente compreendida com referência aos Exemplos seguintes. Estes não devem, contudo, ser interpretados como limitando o âmbito desta invenção. EXEMPLO 1
Construção de anticorpos muitivaientes A construção utilizada para gerar um anticorpo anti-HER2 tetravalente, chamado um "anticorpo Octopus" (0ctHER2), está ilustrado na Fig. 5 do presente documento. A cadeia principal deste anticorpo Octopus é a variante 8 do anticorpo monoclonal, humanizado, recombinante 4D5 (rhuMAb 4D5-8) (documento de patente U.S. N.° 5.821.337,
Carter et al.). A cadeia pesada de rhuMAb 4D5-8 foi subclonada no vetor pRK5 (documento EP 307.247, publicado em 15 de março de 1989) . A região VH-CH1 da cadeia pesada foi removida por mutagénese, e três sítios de restrição únicos (BamHI; Nhel; BspEI) foram insertados. Estes sítios foram incorporados em iniciadores de PCR desenhados para amplificar a região VH-CH1 a partir de diferentes anticorpos. Os fragmentos resultantes foram subclonados no vetor para criar a cadeia pesada de Octopus. A coexpressão da cadeia pesada de Octopus com a cadeia leve apropriada num vetor pRK5 em transfeções de células de mamífero resulta no anticorpo Octopus completo (Fig. 4).
As construções de Octopus contendo ligantes flexíveis inseridos entre as regiões Fd em tandem foram também manipuladas. Através de mutagénese, ADN que codifica tanto pgly-serp (ligante flexível 1) ou pgly-ser-gly-serp (SEQ ID NO:10) (ligante flexível 2) foi inserido entre o ADN que codifica as regiões VH-CH1 da cadeia pesada. EXEMPLO 2
Avaliação dos anticorpos Octopus anti-HER2
OctHER2 foi expresso em células 293 transfetadas de forma transiente (Graham et al. J. Gen. Virol. 36:59-72 (1977)) e purificado ao longo de uma coluna de proteína A sepharose. O anticorpo completo tem aproximadamente 245 kDa, em comparação com a massa molecular de 150 kDa do anticorpo parental. A cadeia pesada de Octopus tem 75 kDa (sem hidrato de carbono), e a cadeia leve tem 30 kDa. Ligação a antigénio A ligação de 0ctHER2 ao antigénio, domínio extracelular de HER2 (ECD HER2), foi analisada utilizando um ensaio de ELISA para HER2 (Sias et al. J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)). Placas de noventa e seis poços foram revestidas com o domínio extracelular (ECD) de HER2 (WO90/14357), e incubadas com diluições diferentes de anticorpos anti-HER2. Depois de lavagem para remover o anticorpo não ligado, um anticorpo conjugado com peroxidase secundário foi depois adicionado para detetar o anticorpo anti-HER2 ligado ao ECD. 0 substrato apropriado foi depois adicionado, e os poços foram visualizados e depois quantificados num leitor de placas a 562 nm.
Os resultados de ELISA para OctHER.2, anticorpo anti-HER2 bivalente humano de IgGl rhuMAb 4D5-8 expresso pelas células 293, ou anticorpo anti-HER2 bivalente HERCEPTIN® (comercialmente disponível a partir de Genentech, Inc., South San Francisco, EUA), são mostrados nas Figs, 6A-C. 0ctHER2 liga-se ao ECD de HER2 de forma semelhante a HERCEPTIN® quando analisado num ensaio de ELISA. 0 rhuMAb 4D5-8 expresso por células 293 liga-se de forma idêntica ao HERCEPTIN® em frascos (produzido por células de ovário de hamster chinês (CHO)), indicando que as células 293 não alteram substancialmente a capacidade de ligação a antigénio dos anticorpos.
Análise de ultracentrifugaçao foi utilizada para determinar se o 0ctHER2 era capaz de se ligar ao alvo com todos os quatro sítios de ligação a antigénio. Quantidades diferentes do domínio extracelular (ECD) de HER2 (documento WO90/14357) foram tituladas com o anticorpo Octopus, e com base nestas razões, a massa molecular média dos complexos foi calculada assumindo que o anticorpo Octopus tinha quatro sítios de ligação completamente funcionais, ou três sítios de ligação funcionais. Estes valores teóricos (círculos, assumindo que 0ctHER2 tem quatro sítios de ligação funcionais; e quadrados, assumindo que 0ctHER2 tem três sítios de ligação funcionais) foram comparados com os valores experimentais reais obtidos (triângulos). Os valores experimentais ilustrados na Fig. 7 seguem de forma mais próxima a curva que representa os quatro sítios de ligação, contudo o desvio observado é um indicador de que todos os quatro sítios provavelmente não se ligam com a mesma afinidade.
Função biológica
Ensaios de antiproliferação: 0ctHER2 foi comparado com HERCEPTIN® em ensaios funcionais que medem a inibição do crescimento de linhas de células tumorais que superexpressam HER2. 0 ensaio de inibição do crescimento descrito em Lewis et al. Cancer Immuno. Immunother. 37:255-263 (1993) foi utilizado. Resumidamente, diluições seriadas de 0ctHER2 e HERCEPTIN® foram adicionadas ao meio de células em placas às quais foi depois permitido continuar a crescer durante cinco dias. Depois deste tempo, o meio foi removido e as células foram coradas com cristal violeta e quantificadas por espectrofotometria. 0 cristal violeta é um corante colorimétrico que cora as células, permitindo assim a medição do crescimento celular depois do tratamento.
Nas células que superexpressam HER2 3+ (sobre as quais HERCEPTIN® é muito eficaz), 0ctHER2 foi semelhante a ligeiramente melhor na inibição do crescimento de células SKBR3, (Fig. 8A), contudo, não foi eficaz sobre as células BT474 (Fig. 8B) . De forma interessante, 0ctHER2 inibiu de forma mais eficaz que HERCEPTIN® uma linha celular com superexpressão 2+, MDA 361 (Fig. 8B).
Como mostrado na Fig. 9, as construções de Octopus de ligante flexível (0ctHER2flexl, 0ctHER2flex2) inibiram o crescimento celular de forma mais eficaz do que HERCEPTIN®.
Ensaios de internalização: De modo a avaliar a aplicação do anticorpo Octopus para a terapêutica com imunotoxinas, as suas capacidades de internalização foram avaliadas. Para a terapêutica com anticorpo armado ou imunotoxina, um agente citotóxico é conjugado, ou fusionado, com o anticorpo e a imunotoxina assim produzida liga-se especificamente ao seu alvo celular; a célula assim ligada internaliza o anticorpo, e cataboliza ou degrada o anticorpo libertando a toxina que mata a célula.
Nos ensaios de internalização realizados no presente documento, o anticorpo foi radioiodado, e incubado com as células durante tempos variáveis. Isto foi seguido por medições da quantidade de anticorpo intacto, não ligado no sobrenadante, da quantidade ligada a superfrcie celular, da quantidade internalizada e finalmente, da quantidade catabolizada e degradada.
Os resultados dos ensaios de internalização realizados em relação a uma linha celular com superexpressão 3+ (SKBR3) e uma linha celular com superexpressão 2+ (MDA453) (as linhas sólidas representam superexpressores de HER2 2+, e as linhas descontínuas, superexpressores 3+) são ilustrados nas Figs. 10A-B. Estes resultados indicam que 0ctHER2, surpreendentemente, foi internalizado e catabolizado duas vezes mais rápido que HERCEPTIN® em ambas as linhas celulares. A rápida internalização e catabolismo exibidos pelo anticorpo Octopus são ideais para um anticorpo armado. Em comparação com HERCEPTIN® não ligado, existe muito pouco anticorpo Octopus livre numa célula com superexpressão 2+. Uma vez mais, estes resultados sugerem que o anticorpo Octopus seria um excelente candidato para conjugar agentes citotóxicos para a distribuição no tumor.
Autorradiografia de microscopia eletrónica: Para confirmar que o anticorpo Octopus estava a ser internalizado e degradado nas vesículas adequadas, e não só de forma não específica, autorradiografia de microscopia eletrónica (EM) foi utilizada. 0 anticorpo Octopus foi iodado e incubado com as células da mesma forma que nos resultados de internalização. Os resultados ilustrados nas Figs. 11A-C confirmam que o anticorpo Octopus estava a ser internalizado nas vesículas corretas (endossoma precoce, Fig. 11 B; e lisossoma, Fig. 11 C) . Adicionalmente, a percentagem de internalização observada com 0ctHER2 e HERCEPTIN® nestes ensaios correspondeu com as medições nos ensaios de internalização. EXEMPLO 3
Avaliação dos anticorpos Octopus anti-DR5 DR5 é um membro da superfamília dos recetores de TNF que se liga a Apo2L/'TRAIL (Apo2L) trimérico. Depois que os recetores Apo2L se ligam a Apo2L e se agrupam, domínios de morte na região citosólica dos recetores induzem as caspases a desencadear a apoptose celular. Foram produzidas duas versões de construções Octopus anti-DR5: uma a partir de 16E2, uma anti-DR5 clonada a partir de uma biblioteca de Fv humano de cadeia simples (veja-se o documento W098/51793); o segundo anticorpo Octopus anti-DR5 foi feito a partir do Mab 3H3.14.5 (o anticorpo μ3Η3μ; ATCC HB-12534, documento W099/64461), um MAb anti-DR5 murino que induz a apoptose quando é reticulado. Uma vez que os anticorpos monoclonais anti-recetores de morte podem necessitar de reticulação para desencadear a apoptose, eles são candidatos para a construção do anticorpo Octopus. Os anticorpos Octopus anti-DR5 foram preparados substituindo os domínios variáveis da construção 0ctHER2 descrita acima com os domínios VL e VH de 16E2 ou 3H3.
Os anticorpos Octopus anti-DR5 foram analisados em ensaios de apoptose utilizando coloração com cristal violeta ou alarmBlue. Resumidamente, diluições seriadas do anticorpo Octopus ou ApoL2 foram adicionadas ao meio de células em placas às quais foi depois permitido continuar a crescer durante 24 horas. Depois deste tempo, o meio foi removido e as células foram coradas com cristal violeta, ou alamarBlue foi adicionado ao meio e incubado brevemente com as células. 0 cristal violeta cora as células, enquanto o alarmaBlue deteta atividade metabólica no meio de cultura, Embora estes corantes permitam a medição das células que sobrevivem ao tratamento. A coloração por ambos corantes colorimétricos, cristal violeta e alamarBlue, foi quantificada por espectrofotometria.
Conforme mostrado nas Figs. 12A-E, o Octopus 16E2, surpreendentemente, induz a apoptose com potência comparável a Apo2L em linhas celulares tumorais de pulmão (SK-MES-1; HOP 92) e cólon (HCT116; COLO 205), contudo, não provoca a apoptose numa linha celular de controlo normal (HUMEC). A apoptose induzida pelo Octopus 16E2 é dependente da caspase. 0 Octopus 16E2 anti-DR5 foi também eficaz in vivo na indução da apoptose e redução de urn tumor do cólon, humano COLO205, em ratinhos nus atímicos. Conforme mostrado na Fig. 13A-D, as secções histológicas de tecidos tumorais corados com hematoxilina e eosina a partir de ratinhos tratados com o Octopus 16E2 ou Apo2L induziram níveis semelhantes de células apoptóticas.
Os ratinhos tratados com Octopus 16E2 também demonstraram uma diminuição significativa no volume tumoral, semelhante ao medido para o Apo2L e dois mAbs anti-DR5 bivalentes, 16E2 e 3H3, conforme é mostrado na Fig. 14. Os ratinhos que não receberam quaisquer anticorpos anti-DR5 ou Apo2L (veículo) mostraram um aumento dramático do seu volume tumoral devido ao crescimento descontrolado. A atividade apoptótica do material utilizado nos estudos de ratinhos foi confirmado num ensaio apoptótico in vitro na Fig. 15. 0 Octopus 16E2 anti-DR5 e o Apo2L utilizados no estudo foram comparados com um controlo positivo padrão e um controlo negativo de MAb anti-IgE (E25) num ensaio de apoptose de alamarBlue. A Fig. 16 demonstra que outro Octopus anti-DR5, Octopus 3H3, é capaz de induzir a apoptose de forma semelhante ao Octopus 16Ξ2. Adicionalmente, a Fig. 16 mostra que a atividade apoptótica do anticorpo Octopus não é dependente do lote, jã que vários Octopus 16E2 preparados em diferentes datas retiveram uma função semelhante.
Nas Figs. 17A e B, a atividade apoptótica de ambos os anticorpos Octopus 16E2 e 3H3 é melhor que Apo2L numa linha celular de tumor pulmonar, SK-MES-1 (Fig. 17A), e uma linha tumoral de células T, Jurkat (Fig. 17B) . Os anticorpos Octopus anti-DR5 podem ser mais eficazes no agrupamento de DR5 na superfície das células tumorais do que Apo2L. 0 Octopus 16E2 foi analisado num rastreio de 2 dias e 6 dias frente 3 um painel de linhas celulares tumorais humanas do Instituto Nacional do Cancro (National Cancer Institute, NCI) em comparação com o Apo2L. As Figs. 18A-C ilustram as curvas de resposta à dose de 2 dias que mostram os efeitos do Octopus 16E2 e Apo2L sobre o crescimento de várias linhas celulares de leucemia, cancro pulmonar de células não pequenas, cancro do cólon, cancro do sistema nervoso central (SNC), melanoma, cancro ovárico, cancro renal, cancro de próstata e cancro de mama, enquanto as Figs. 19A-C mostram curvas de resposta à dose a partir dos rastreios de 6 dias. Resultados comparáveis foram observados para Octopus 16E2 e Apo2L contra a maioria das linhas celulares tumorais, indicando novamente que o Octopus anti-DR5 funciona de maneira semelhante a Apo2L. Uma inibição semelhante de linhas celulares de cancro pulmonar e do cólon confirmou os anteriores resultados in vitro e in vivo a partir de ensaios de apoptose comparando Octopus 16E2 e Apo2L nas linhas celulares destes cancros. A capacidade do Octopus 16E2 para matar determinadas linhas celulares tumorais foi inesperada; por exemplo, uma linha celular de cancro do SNC, SF-295 (Fig. 19B), bem como duas linhas celulares de cancro renal, ACHN e RXF393 (Fig. 19C).
Os resultados dos rastreios do painel tumoral do NCI são ilustrados quantitativamente nas Figs. 20A e B (resultados aos 2 dias) e Figs. 21A e B (resultados aos 6 dias) que resumem o efeito de Octopus 16E2 em comparação com Apo2L sobre a inibição do crescimento (GI50), estase (TGI) e toxicidade (CL50) das linhas celulares tumorais tratadas. Novamente, estes resultados sugerem que o Octopus 16E2 pode ser eficaz contra mais tipos de cancro do que anteriormente observado. EXEMPLO 4
Avaliação do anticorpo Octopus anti-CD20
Numa tentativa de melhorar a potência do anticorpo anti-CD20 quimérico C2B8 (RITUXAN®; documento de patente U.S. N.° 5.736.137), uma abordagem a ser investigada é a capacidade do anticorpo para desencadear a apoptose das células tumorais. Foi realizado o ensaio de apoptose em Koopman et al. Blood 84:1415-1420 (1994) . Um anticorpo
Octopus anti-CD20 (OctCD20) foi preparado utilizando os domínios VL e VH de C2B8 na preparação de um anticorpo Octopus anti-CD20, 0 anticorpo OctCD20 foi expresso em células 293 e purificado através de cromatografia de proteína A sepharose como descrito para os exemplos anteriores.
Como mostrado na Fig. 22, o RITUXAN® isoladamente não desencadeia muita apoptose de uma linha de células B de linforma não Hodgkin, Wil-2, a não ser que seja reticulado com uma IgG anti-humana (RITUXAN®-IgG). 0 OctCD20, contudo, é capaz de induzir a apoptose em células Wil-2 independentemente da reticulação. Contudo, o nível de apoptose observado com OctCD20 é menor do que o de RITUXAN® reticulado, sugerindo que a atividade apoptótica de Oct.CD20 poderia ser melhorada, talvez através da utilização dos ligantes flexíveis. EXEMPLO 5
Construção de anticorpos multivalentes adicionais
Foram manipuladas versões dos anticorpos Octopus do Exemplo 2 (anti-HER2), Exemplo 3 (anti-DR5) e Exemplo 4 (anti-CD20) com um domínio de dimerização de região de dobradiça de anticorpo (com a designação "F(ab')2 de Octopus" no presente documento). A construção de F(ab')2 de Octopus anti-HER2 foi manipulada substituindo a região Fc do ADNc de cadeia pesada com uma sequência que codifica um motivo de fecho de leucina que, quando expresso como proteína, dimeriza para unir de forma eficaz os braços de Fab de Octopus (Fig. 23C). 0 F(ab')2 de Octopus pode manter o motivo de fecho de leucina, ou esse motivo pode, por exemplo, ser proteoliticamente removido como desejado. Como ilustrado na Fig. 24, PCR foi utilizada para amplificar os domínios VH/CH1 duplicados e para inserir um sítio de restrição na extremidade do ADNc de cadeia pesada de Octopus (Notl) para permitir a subclonagem em fase num vetor (VG15) contendo um motivo de fecho de leucina. A PCR foi novamente utilizada para adicionar outro sitio de restrição a jusante do codão de terminação da cadeia pesada (Xhol) para permitir a subclonagem no vetor pRK para expressão em células de mamífero. Os domínios VH/CH1 do Mabl6E2 anti-DR5 e Mab anti-CD20 C2B8 foram substituídos na estrutura principal de cadeia pesada de F(ab)'2 de Oct utilizando os sítios de restrição únicos BamHI, Nhel e BspEI.
Anticorpos pPOPoctopusp foram criados ligando em conjunto domínios Fab em repetições em tandem para formar multímeros de Fab lineares. pP0Poct.-3p contém três domínios Fab ligados (Fig. 23D), enquanto pP0Poct-4p tem quatro repetições de Fab (Fig. 23E). As construções POPoct-3 anti-HER2 (rhuMab 4D5), anti-DR5 (16E2) e anti-CD20 (C2B8) foram geradas, bem como as construções POPoct-4 anti-HER2 (rhuMab 4D5) e anti-DR5 (16E2). Os anticorpos POPoct-3 foram manipulados com e sem ligantes flexíveis 1. A Fig. 25 ilustra a construção do ADNc de cadeia pesada de POPoct-3. A PCR foi utilizada para amplificar o domínio VH/CH1 adicionado um sítio 5'-BspEl e um sítio 3'-Notl. Esta sequência foi digerida e juntamente com a cadeia pesada de Octopus digerida com BamHI/BspEI, ligada a um vetor pRK para produzir uma sequência contendo uma cadeia pesada de Octopus para três domínios VH/CH1. 0 sítio BspEI codifica um resíduo de serina e de glicina.
Para manipular o anticorpo POPoct-4 (Fig. 26), foi utilizada oligomutagénese sítio-dirigida para introduzir uma mutação silenciosa, resultando na eliminação do sítio de restrição Nhel entre os domínios VH/CH1 duplicados no ADNc de cadeia pesada de Octopus. Oligomutagénese foi novamente empregue para adicionar um sítio de restrição
Nhel imediatamente a jusante da segunda sequência de VH/CH1. Este ADNc juntamente com a construção de POPoct-3 foram digeridos com endonucleases de restrição BamHl/Nhel, e ligados em conjunto com o vetor pRK para produzir um ADNc de cadeia pesada contendo a sequência para quatro domínios VH/CHI.
As cadeias pesadas de Octopus diferentes foram cotransfetadas de forma transiente com os ADNc de cadeia leve apropriados em células mamíferas 293 para expressar anticorpos contendo três domínios Fab (Fab de POPoct-3) ou quatro domínios Fab (Octopus de comprimento completo; F(ab)'2 de Octopus; Fab de POPoct-4) . Enquanto Mabs de IgG nativos e anticorpos Octopus de comprimento completo foram purificados sobre proteína A sepharose, F(ab)'2 de Octopus e POPoct-3 e -4 foram purificados sobre colunas de proteína G sepharose. 0 F(ab)'2 de Octopus é aproximadamente 200 kDa (Fig. 23F, pista 4) , inferior do que os 240 kDa do anticorpo Octopus de comprimento completo (Fig. 23F, pista 3), mas maior que o Mab de IgG nativo de 150 kDa (Fig. 23F, pistas 1 e 2) . A aproximadamente 140 kDa (Fig. 23F, pista 5), POPoct-3 é ligeiramente menos que o Mab de IgG nativo, enquanto POPoct-4 é ligeiramente maior a 190 kDa. A cadeia pesada do F(ab)'2 de Octopus (Fig. 23G, pista 4) tem aproximadamente o mesmo tamanho que a cadeia pesada do Mab de IgG nativo (Fig. 23G, pistas 1 e 2) a 55 kDa. A cadeia pesada de POPoct-3 (Fig. 23G, pista 5) é semelhante quanto ao tamanho à cadeia pesada de Octopus de comprimento completo (Fig. 23G, pista 3), enquanto a aproximadamente 97 kDa o POPoct-4 tem a cadeia pesada maior.
Exemplo 6
Avaliação de anticorpos muitivalentes anti-HER2
Ensaios de antiproliferação: F(ab)'2 OctHER, POPoct-3 HER2, OctHER2, OctHER2 flex 1, e rhuMAb 4D5 (HERCEPTIN®) foram adicionados à linha celular tumoral com superexpressão de HER2 3+, BT474, a concentrações equimolares e avaliados quanto à sua capacidade de inibir o crescimento celular como medido por coloração de cristal violeta. Os resultados destes ensaios são mostrados na Fig. 27. Embora todos os anticorpos tenham induzido alguma citoestase das células BT474, POPoct-3HEr2 e rhuMab 4D5 mostraram a maior eficácia e inibiram o crescimento de forma equivalente, enquanto que o F(ab)'2 de 0ct.HER2 perdeu potência rapidamente à medida que a sua concentração diminuiu. 0ctHER2 flexl demonstrou uma melhoria ligeira mas consistente em relação a 0ctHER2 (n=6), sugerindo que a flexibilidade melhorada pode resultar num melhor acesso do Fab ao alvo HER2. 0ctHER2, 0ctHER2 flex-1, POPoct-3HER2, POPoct-3HER2 flex-1 e rhuMAb 4D5 (HERCEPTIN®) também foram avaliados a concentrações equimolares noutra linha celular com superexpressão de HER2 3+, SKBR3, em ensaios de citoestase com cristal violeta. Os resultados deste ensaio são ilustrados na Fig. 28. Nesta linha celular, todas as construções de Octopus testadas inibiram o crescimento celular de forma equivalente, e melhor que rhuMab 4D5 (n=4) . Qualquer melhoria na eficácia devido ao ligante flexível entre os braços de Fab de 0ctHER2 ou POPoct-3 foi menos evidente nesta linha celular.
Ensaios de internaiização: POPoct-3HER2 foi comparado com OctHER e HERCEPTIN® nos ensaios de internalização em duas linhas celulares tumorais com superexpressão de HER2 3 + , SKBR3 e BT474, para avaliar a sua candidatura para aplicações em terapêuticas com imunotoxinas. Embora estruturalmente diferente do anticorpo 0ctHER2 de comprimento completo, POPoct-3HER2 foi internalizado e catabolizado de forma idêntica a 0ctHER2 por ambas as linhas celulares (Figs. 29A e B) e ao dobro da taxa de HERCEPTIN®.
Exemplo 7
Avaliação de anticorpos muitivalentes anti-DR5
Ensaios de apoptose: Versões multivalentes do MAb 16E2 anti-DR5 foram avaliadas neste exemplo. Octl DR5, 0ctDR5flex-1, 0ctDR5F(ab)'2, POPoct-3DR5, POPoct-3DR5flex-1 e POPoct-4 DR5 foram adicionados a concentrações equimolares à linha celular de tumor do cólon COLO205 e analisados em ensaios de apoptose de cristal violeta em comparação com o MAb 16E2 (n=4) . Os resultados são mostrados na Figs. 30A e B. Todos os anticorpos Octopus induziram mais apoptose do que o MAb 16E2, com a ordem de eficácia do mais potente para menos: OctDRSflex-1 > OctDRB = POPoct”4 DR5 = P0Poct-3fIex-1DR5 = POPoct-3DR5 > OctDRBF(ab)'2 >MAb 16E2. 0ctDR5flex-1 mostrou uma potência aumentada em comparação com OctDRS, especialmente a baixas concentrações (Fig. 30A), indicando que a flexibilidade entre os braços de Fab melhora a eficácia. P0Poct-3flex-1 DR5 induziu níveis equivalentes de apoptose como OctHER (Fig. 30A) e mostrou uma eficácia semelhante a POPoctl6-3 e POPoctlG-4 (Fig. 30B).
Sinalização celular: Apo2L liga-se aos recetores de morte e desencadeia a apoptose celular através da via de sinalização da caspase. Conforme mostrado nas Figs. 31A e B, os anticorpos Octopus anti-DR5 foram mostrados como induzindo a apoptose através da mesma via de sinalização que Apo2L. Octl6E2 desencadeou níveis semelhantes de apoptose como Apo2L na linha celular de tumor pulmonar SK-MES-1 (Fig. 31A, linhas descontínuas), mas depois da adição de ZVAD, um inibidor de caspase 3 e 9, a apoptose celular desencadeada por ambos Apo2L e Octl6E2 foi inibida (Fig. 31B linhas sólidas). Evidências adicionais de que os anticorpos Octopus anti-DR5 sinalizaram através da mesma via que Apo2L foram obtidas por análises de DISC (Complexo de sinalização induzido por morte) (Fig. 31 B). Células BJAB, uma linha de linfoma de células B que expressa DR5, foram incubadas a duas concentrações diferentes de dois anticorpos Octopus anti-DR5, Octi6E2 e Oct3H3, durante tempos variáveis. A purificação dos complexos de anticorpo-DR5 foi seguida por análise de Western blot para identificar as moléculas de sinalização que foram copurifiçadas com os complexos. Tal como com Apo2L, as moléculas de sinalização caspase 8 e FADD associaram-se com DR5 depois do recetor ser ligado por ambos Octl6E2 e Oct3H3 (Fig. 31 B).
Exemplo 8
Avaliação do anticorpo Octopus anti-CD20
Ensaios de apoptose: Como mostrado na Fig. 22, RITUXAN® não desencadeou a apoptose de forma eficaz in vitro linha celular de linfoma de células B WIL-2 a menos que fosse primeiro reticulado por um anticorpo anti-IgG. 0ct0D2Q foi capaz de induzir a apoptose de células WIL-2 independentemente da reticulação, a níveis mais elevados que o RITUXAN® sozinho, no entanto, ligeiramente mais baixos que o RITUXAN® reticulado com anti-IgG. Quando reticulado com um anticorpo anti-IgG, OctCD20 induziu mais apoptose das células WIL-2 do que o RITUXAN® reticulado (Fig. 32) . Uma vez que uma potencial explicação para a eficácia de RITUXAN® in vivo é que o anticorpo está a ser reticulado pelo complemento ou células que portam FcyR, esta observação sugere que OctOC20 será ainda mais eficaz in vivo. F (ab) ' 2 0ctCD20, POPoct-3CD20 e POPoct-3CD20flex-1 foram testados a várias concentrações em ensaios de apoptose com células WIL-2, e as doses ótimas são mostradas nas curvas de resposta máxima na Fig. 33. Os anticorpos Octopus foram comparados com o anticorpo anti-CD20 1F5 (Clark et al. supra), que funciona de forma semelhante ao RITUXAN® no sentido em que não induz a apoptose a menos que seja reticulado com um anticorpo anti-IgG. Ambos os anticorpos Octopus testados induziram níveis semelhantes (F(ab)'2 OctCD20) ou superiores (POPoct-3CD20, PQPoct-3CD20flex-1) de apoptose do que o IF5 anti-CD20. Adicionalmente, os anticorpos Octopus foram eficazes a concentrações consideravelmente mais baixas do que o anti-CD20 reticulado.
Quando anticorpos anti-CD20 reticulados são adicionados à linha de linfoma de células B WIL-2S, uma adesão homotípica das células é observada. Esta aglomeração de células é uma indicação de que as células foram ativadas mediante CD20. Os anticorpos Octopus anti-CD20 induzem este mesmo fenómeno de adesão homotípica independentemente do reticulante, e como mostrado na Fig. 34 com POPoct-3CD20, a concentrações muito inferiores do que IF5 anti-CD2Q reticulado. A indução da apoptose pelos vários anticorpos anti-CD20 foi adicionalmente avaliada utilizando sangue de um paciente com leucemia linfocítica crónica (CLL). PBLs foram separados utilizando sedimentação com dextrano, lavados e colocados em placas em meio de linfócitos isento de soro tratado durante a noite sem amostra, 1 F5 (20 pg/ml), lF5+reticulado de ratinho anti-IgG (100 pg/ml), F(ab')2 OctCD2 0 a aprox. 0,5 ou 1,0 pg/ml e POPoct-3 CD2 0 a 0,5 pg/rrtl.
Foi realizado um ensaio de apoptose utilizando coloração de anexina e PI. A percentagem de células apoptõticas foi:
Os dados indicam que os anticorpos multivalentes anti-CD20 (especialmente POPoct-3 CD20) potenciam a apoptose de uma forma dependente da dose.
Ensaios de internalízação: OctCD20 foi também avaliado como um candidato para a terapêutica com imunotoxinas em ensaios de internalízação: em três linhas de linfoma de células B, DB, WIL-2 e Ramos, e comparado com RITUXAN®. Como mostrado na Fig. 35, duas vezes mais OctCD20 foi internaiizado pelas células em comparação com RITUXAN®, que não foi internalizado pelas células em níveis apreciáveis. A avidez mais elevada que seria esperada para os anticorpos multivalentes devido ao número aumentado de sítios de ligação é evidente no facto de que mais OctCD20 permanece ligado à superfície celular das células ao longo do tempo em comparação com RITUXAN®.
Lista de sequências substituta <110> Genentech, Inc.
<120> ANTICORPOS MULTIVALENTES E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS <130> EAH/FP7064413
<14 0 > EP <141> 20-03-2001 <150> EP 01920580.6 <151> 20-03-2001 <150> PCT/US01/08928 <151> 20-03-2001 <150> US 60/195.819 <151> 11-04-2000 <160> 13 <170> Patent-In 3.5
< 210 > 1 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 15 10 15
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60
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Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 80 85 90
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 95 100 105
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 215 <210> 2 < 211> 218
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro 15 10 15
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 35 40 45
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75
Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 30 85 90
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 95 100 105
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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lye 200 205 210
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 215
<210> 3 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
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Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lye Glu Tyr Lys
80 85 SO
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 200 205 210
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 215
<210> 4 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <4QG> 4
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 15 10 15
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 215
<210> 5 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 15 10 15
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val 20 25 30
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<210> 6 <211> 215 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6
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<210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> A sequência é sintetizada <400> 10
Gly Ser Gly Ser 1 <21G> 11
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Gly Gly Gly Sesr 1 <210> 12
< 211 > 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221> SITE <222 > 1-4 <223 > Aminoácidos no domínio variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo <400> 12
Glu Vai Gin Leu 1
<210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <221> SITE <222 > 1-4 <223> Aminoácidos no domínio constante de cadeia pesada (CHI) do anticorpo <4QG> 13
Lys Thr His Thr 1
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não ê parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, ο IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 4816567 A, Cabilly [0008] [0092] [0093] [0183] [0193] [0201] • US 5821337 A, Carter [0011] [0074] [0108] [0178] [0315] • US 5530101 A, Queen [0011] • US 5434340 A [0016] • US 5591699 A [0016] • US 5569825 A [0016] [0095] • US 5545806 A [0016] [0095] • US 5545807 A [0016] [0095] [0199] • WO 9902567 A [0018] • WO 9119515 A [0019] • WO 9509917 A [0020] • US 5641870 A, Rinderknecht [0022] [0091] [0204] • WO 0006605 A [0023] • US 5591828 A [0023] • US 5959083 A [0023] • US 6027725 A [0023] • WO 9858965 A [0023] • WO 9413804 A [0023] • WO 9937791 A [0023] • US 5989830 A [0023] • WO 9415642 A [0023] • EP 628078 BI [0023] • WO 9714719 A [0023] • EP 0517024 A [0024] • US 4968603 A [0027] • WO 9422478 A [0028] • US 5824311 A [0028] • US 5677171 A [0029] [0125] • WO 9400136 A [0031] • US 5783186 A [0031] • WO 9877797 A [0031] [0074] • US 5183884 A [0031] [0075] • US 5480968 A [0031] [0075] • EP 599274 A [0031] [0076] • US 5641869 A [0032] [0071] • WO 9701633 A [0034] [0083] • WO 9725428 A [0034] [0067] [0083] • WO 9828426 A [0034] • WO 9846751 A [0034] • WO 9818921 A [0034] • EP 417563 A [0037] • WO 9839361 A [0040] • WO 9832856 A [0043] • WO 9851793 A [0044] [0084] [0128] [0130] [0328] • WO 9841629 A [0044] • WO 9835986 A [0044] • EP 870827 A [0044] • WO 9846643 A [0044] • WO 9902653 A [0044] • WO 9909165 A [0044] • WO 9911791 A [0044] • WO 9904001 A [0047] • WO 9907738 A [0047] • WO 9933980 A [0047] • US 5595721 A, Kaminski [0055] [0078] • US 5736137 A, Anderson [0056] [0078] [0338] • US 5708156 A [0069] • US 4943533 A, Mendelsohn [0073] • WO 9640210 A [0073] • US 5772997 A [0074] • US 5840525 A [0074] • WO 9321319 A [0074] • WO 9700271 A [0074] • US 5968511 A [0075] • WO 9919488 A [0076] • US 5677180 A [0078] • US 5674492 A [0081] • US 5677165 A, deBoer [0081] • US 5182368 A, Ledbetter [0081] • EP 988371 A1 [0082] • US 5763223 A [0083] • WO 9937684 A [0084] [0130] • WO 9914330 A [0085] • EP 404097 A [0091] • WO 9311161 A [0091] • US 5625126 A [0095] • US 5633425 A [0095] • US 5661016 A [0095] • US 5750373 A [0095] • US 5821333 A [0103] [0117] • US 5500362 A [0108] • US 5091178 A [0167] • WO 9616673 A [0178] • US 5837234 A [0178] • WO 9802463 A [0178] • US 5567610 A, Borrebaeck [0195] • US 5229275 A, Goroff [0195] • US 5591669 A [0199] • US 5589369 A [0199] • WO 9805344 A [0200] • WO 9815833 A [0200] • WO 9747314 A [0200] • WO 9744491 A [0200] • WO 9735196 A [0200] • WO 9534648 A [0200] • US 5712089 A [0200] • US 5702892 A [0200] • US 5427908 A [0200] • US 5403484 A [0200] • US 5432018 A [0200] • US 5270170 A [0200] • WO 9206176 A [0200] • WO 9906587 A [0200] • US 5514548 A [0200] • WO 9708320 A [0200] • WO 9316185 A [0204] • US 5571894 A [0204] • US 5587458 A [0204] • WO 9951642 A [0227] • US 5648260 A [0227] • US 5624821 A [0227] • WO 9429351 A [0227] • US 5739277 A [0228] • US 5208020 A [0231] • US 5714586 A [0233] • US 5712374 A [0233] • US 5264586 A [0233] • US 5773001 A [0233] • WO 9321232 A [0234] • WO 9411026 A [0237] [0266] • WO 8101145 A [0240] • WO 8807378 A [0240] • US 4975278 A [0240] • US 4485045 A [0245] • US 4544545 A [0245] • WO 9738731 A [0245] • US 5013556 A [0245] • WO 9013646 A [0249] • US 4965199 A [0256] • EP 73657 A [0262] • US 4419446 A [0264] • US 4601978 A [0264] • DD 266710 [0267] • EP 402226 A [0268] • EP 183070 A [0268] • EP 244234 A [0268] • US 5807715 A [0271] • US 4767704 A [0273] • US 4657866 A [0273] • US 4927762 A [0273] • US 4560655 A [0273] • US 5122469 A [0273] • WO 9003430 A [0273] • WO 8700195 A [0273] • US RE30985 E [0273] • US 3773919 A [0280] • US 4275149 A [0283] [0285] • US 4737456 A [0283] • US 4318980 A [0285] • WO 9607321 A [0307] • US 4892538 A [0308] • US 5283187 A [0308] • WO 9325673 A [0308] • EP 307247 A [0315] • WO 9014357 A [0318] [0320] • WO 9964461 A [0328] • EP 01920580 A [0358] • US 0108928 W [0358] • US 60195819 B [0358]
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Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Um anticorpo isolado que compreende um primeiro e segundo polipéptido de cadeia pesada, pelo menos dois polipéptidos de cadeia leve e quatro sítios de ligação a antigénio, em que os ditos primeiro e segundo polipéptidos de cadeia pesada compreendem VD1- (X)n-VD2- (X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada (VH), VD2 é um segundo domínio VH, Fc é uma região Fc, XI e X2 representam um aminoãcido ou polipéptido e n é 0 ou 1, em que cada dos pelo menos dois polipéptidos de cadeia leve compreende um domínio variável de cadeia leve (VL), em que cada dos ditos quatro sítios de ligação a antigénio é formado por um domínio VH do primeiro ou segundo polipéptido de cadeia pesada e um domínio VL dos pelo menos dois polipéptidos de cadeia leve.
2. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo compreende dois polipéptidos de cadeia leve.
3. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os dois domínios variáveis de cadeia pesada estão fusionados em conjunto.
4. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que X2 do primeiro polipéptido de cadeia pesada e do segundo polipéptido de cadeia pesada compreende um domínio CHI, em que CHI é um domínio constante de cadeia pesada.
5. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 3 ou 4, em que VD1 - (XI) n-VD2 - (X2) n-Fc do primeiro polipéptido de cadeia pesada e do segundo polipéptido de cadeia pesada compreende VH-VH-CH1-Fc.
6. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 4, em que XI compreende um ligante flexível em posição C-terminal em relação a VD1.
7. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 6, em que VD1- (Xl)n-VD2- (X2)n-Fc do primeiro polipéptido de cadeia pesada e do segundo polipéptido de cadeia pesada compreende VH-ligante flexível-CHl-Fc.
8. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os pelo menos dois polipéptidos de cadeia leve compreendem adicionalmente um domínio constante de cadeia leve (domínio CL).
9. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo compreende pelo menos quatro ou mais domínios VL e em que cada domínio VL está opcionalmente fusionado a um domínio CL.
10. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 9, em que os pelo menos dois polipéptidos de cadeia leve compreendem cada um VL-VL-CL.
11. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-10, em que o ligante flexível compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em gly-ser, gly-ser-gly-ser (SEQ ID NO:10), ala-ser e gly-gly-gly-ser (SEQ ID NO:11).
12. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito anticorpo não compreende uma sequência nativa de um anticorpo IgM ou IgA.
13. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o dito anticorpo é internalizado mais rapidamente do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antigénio ao qual os anticorpos se ligam.
14. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os quatro sítios de ligação a antigénio se ligam todos ao mesmo antigénio.
15. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, em que os quatro sítios de ligação a antigénio se ligam a dois ou mais antigénios diferentes.
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