JP4949397B2 - Ｓｐｒ測定用センサー素子 - Google Patents

Description

本発明は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）測定用センサー素子に関する。このセンサーは、人及び動物の生化学診断、環境分析、生化学研究用生体分子相互測定用センサーなどに用いられ、より具体的には、抗原または抗体を定量する免疫センサー、ＤＮＡの配列を同定するセンサー、酵素の基質を定量するセンサー、病原性菌同定用センサーなどに用いられる。

液体試料中の化学物質を測定する方法のひとつとして、分子認識材料を用いる方法が知られている。その分子認識材料を用いる方法のひとつとして抗原抗体反応を利用した免疫センサーがある。

抗体の分子認識特性が高いことと、被測定成分に特異的に結合する抗体を作製する技術が進歩したことから、抗体を用いた免疫センサーはウイルス検出や疾病マーカー、環境汚染物質の測定・迅速診断に用いられるようになっている。

例えば、免疫測定で一般的に用いられているサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫定量法）では、ひとつの抗原の異なる部位に結合しうる複数種の抗体を作成する必要があり、しかもそれらの抗体のひとつには標識分子を結合する必要がある。

また、このサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ法は、１）固相に目的の抗原に特異的に結合する抗体を結合したものを準備し、２）この固相に目的物質を含む溶液を加えて、抗原抗体反応により抗原を固相に結合させ、３）洗浄により余計な蛋白質や固相に結合しなかった抗原を除去した後、４）標識した抗体を加えて固相に結合している抗原と結合させて、５）固定された標識抗体により抗原を定量するものである。

このため、この作業手順分析を行うためには、液体の分注、洗浄、交換作業が必要で、最終的な測定には吸収分光測定装置や蛍光分光測定装置が必要である。従って、ＥＬＩＳＡ法は検査コストが高く、作業も複雑であるという問題を有している。

一方、免疫測定分野では、簡便で安価な方法としてイムノクロマト法が開発されている（例えば、特許文献１参照。）。

イムノクロマト法は以下の作用機序で抗原の存在を検出する測定法である。１）被測定対象の抗原を含む尿、血液、粘膜懸濁液などのサンプルを、金コロイド標識抗体を所定の位置に含有するろ紙の試料滴下部に滴下し、展開させる。２）抗原を含有する試料が展開する際に金コロイド標識抗体と接触し、抗原抗体反応により抗原と金コロイド標識抗体が結合する。３）抗原と結合した金コロイド標識抗体をさらに展開させると、あらかじめろ紙の所定位置に固定しておいた第２抗体と結合して、その部分に金コロイドが集積する。４）金コロイドが集積することによって赤紫色に着色する。金コロイドが集積することで、抗原の存在を検出する。

この方法ではろ紙を使ったクロマトグラフィーを利用しているので測定対象物と挟雑物を分ける分離作用があり、挟雑物の多いサンプルでも測定することができる。また、特別な装置が不要で、目視によって結果を判定できるので、簡便な抗原の測定法として、インフルエンザウイルス検査や、妊娠検査などに使われている。

また、抗体に標識を導入することによって抗体の活性が失われたり、抗原の認識に変化が生じたりした場合や、得られる抗体の量が少ない場合など、微量の測定を迫られる場合は特別な測定法が必要となる。

このような測定法のひとつとして、プラスチックの流路にろ紙を入れた測定チップがある（例えば、非特許文献１参照。）。この測定チップでは、ろ紙の平面内での展開により検査対象成分を挟雑物から分離した後、これを透明なチャンバーに導いて、その透過光強度から対象成分を定量している。

無標識の抗体または抗原を用いて抗原抗体反応や、ＤＮＡのハイブリダイゼーションなどの生体分子相互作用測定を行う方法としては、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance)効果を利用したＳＰＲ測定法があり、この測定法においては、ＳＰＲセンサーが用いられる。

ＳＰＲセンサーは抗原抗体反応を利用した免疫センサーであり、抗原または抗体を金属薄膜に固定してなる。金属薄膜に固定された抗原または抗体は抗原抗体反応により抗体または抗原と結合する。抗原抗体反応により抗原または抗体が抗体または抗原と結合すると屈折率変化が生じる。その屈折率変化を検出することにより抗体または抗原を検出するものである。ＳＰＲセンサーは、検出したい分子に放射性物質や蛍光物質で標識をつける必要がなく、かつ、高い濃度感度が得られるため、生態関連物質の検出手段として用いられてきている（例えば、特許文献２参照。）。

ＳＰＲ測定では、金薄膜上の光の反射部分のエバネッセント光の届く範囲の体積の屈折率が測定されるために、測定に必要なサンプルの体積が少なくて済むという特徴がある。さらにＳＰＲ測定では、ＳＰＲ現象の計測を行う光学系と、抗原抗体反応を行う測定素子を透明な基板を用いて分離することができ、測定素子を取り替えることにより異なる分子の測定を行うこともでき、サンプルによる測定装置の汚染を防ぐこともできる。特にサンプルが毒素を含む場合では毒素の漏洩を防ぐことができる。また、ＳＰＲでは同時に複数のサンプルの測定を行うことができ、測定のスループットを高めることができる。

特公平７−３６０１７号公報 登録特許３２９４６０５号公報 Anal.Chem.2005,77,7901-7907

イムノクロマト法では、二つの抗体が同時に抗原に結合できるように、抗体を作製する必要がある。しかも、その一つには抗体の活性が落ちないように金コロイドを結合させる必要があり、抗体の作製にコストと時間がかかる。

一方、従来のＳＰＲ測定では抗体を１種類用いるだけで済み、感度も高いが、流路構造と、その流路構造にサンプル液を液送する液送装置とが必要であった。さらに、ＳＰＲで屈折率を測定できる領域が非常に狭く、既存の液送装置を用いてこの領域にだけ液送しようとすると、液送に非常に高い圧力が必要であった。このため、ＳＰＲ測定に際しては、本来測定に必要な量以上の量が必要となる問題があり、絶対量感度（所要サンプル量あたりの感度）を高くすることが困難であった。

簡便な測定と高感度測定を両立させるために、本発明は、機械的な液送機構の必要のない、ＳＰＲ測定素子を提供することを目的とする。

即ち、本発明のＳＰＲ測定用センサー素子は、透明基板と、該透明基板上の少なくとも一部に形成された金薄膜と、その少なくとも一部の上に金薄膜が形成された透明基板上に設けられたサンプル親和性薄膜とを有し、前記金薄膜と前記サンプル親和性薄膜がその上に設けられた透明基板は測定領域（領域Ａ）と、該領域Ａを間に介するように設けられた試料導入部（領域Ｂ）と試料吸収部（領域Ｃ）を有し、前記領域Ａ，Ｂ，Ｃのいずれにもそれらの少なくとも一部表面にサンプル親和性薄膜が設けられており、前記領域Ａのサンプル親和性薄膜には前記金薄膜に接する面に分子認識膜を含有するサンプル測定部が設けられており、領域Ｂのサンプル親和性膜上には導入ポートが形成され、領域Ｃのサンプル親和性膜上には該領域Ｃ全体を覆うように吸収パッドが設けられ、サンプル親和性薄膜上で、領域Ｂ内の点と領域Ａ内の点と領域Ｃ内の点が１つの直線にのるように存在することを特徴とする。金薄膜は、透明基板とサンプル親和性膜の間にあっても、またはサンプル親和性膜とサンプル非親和性膜の間にあってもよい。さらに、本発明のＳＰＲ測定用センサー素子は、サンプル親和性膜の厚さが、最大で１０μｍであることが好ましい。

図１Ａは本発明のセンサー素子の１実施態様を示す側面模式図である。 図１Ｂは本発明のセンサー素子の１実施態様を示す平面模式図である。 図２はセンサー素子の領域Ａを含む部分を示す拡大図である。 図３Ａは試料導入部（領域Ｂ）の実施態様におけるサンプル親和性膜上に何も設けず、サンプル親和性膜に直接サンプルを滴下する例である。 図３Ｂは試料導入部（領域Ｂ）の実施態様における底があいたカップまたはチューブをサンプル親和性膜上に設けてサンプル導入ポートとした例である。 図３Ｃは試料導入部（領域Ｂ）の実施態様における液体を保持する機能を有するサンプルパッドをサンプル親和性膜上に設けた例である。 図４Ａは本発明のセンサー素子の他の実施態様を示す簡略化された側面模式図である。 図４Ｂは本発明のセンサー素子の他の実施態様を示す簡略化された平面模式図である。 図５Ａはサンプル親和性膜のパターンを示す。 図５Ｂは抗体固定化部分を示す。

以下に、本発明につき、図面を参照しつつ説明する。

図１Ａおよび図１Ｂは本発明のＳＰＲ測定用センサー素子の簡略化された模式図を示し、図１Ａはその側面図、図１Ｂはその平面図である。図２はその領域Ａを含む部分を示す拡大図である。基板１の少なくとも一部の上に、金薄膜２が形成されている。基板１としては、ガラス、透明プラスチックなどの透明な材料を用いることができる。ＳＰＲ測定においては、基板と金薄膜の界面にＳＰＲ測定に必要な入射角度で光を入射させる必要があり、このような角度で光を入射できる透明材料であればいずれも用いることができるが、プリズムを用いたＳＰＲ測定装置をこのセンサーとともに用いる場合は、基板はこのプリズムと同じ屈折率を有していることが好ましい。

金薄膜２は基板１の全面を覆っていてもよいが、必ずしも全面を覆っている必要はなく、少なくともその一部、即ち、屈折率を測定される領域を含む部分を金薄膜２が覆っていればよい。この金薄膜２は蒸着法、スパッタ法などにより形成することができる。

その少なくとも一部の上に金薄膜２が形成された基板１上にサンプル親和性薄膜３が設けられている。サンプル親和性膜はサンプルが膜内に含浸できる材料からなるものであればよく、サンプルが水溶液の場合、セルロース、ニトロセルロース、アセチルセルロースなどのセルロース系材料、キトサン、ポリカーボネート、ポリスチレン、蛋白質などの高分子からなる繊維状物または多孔性膜を用いることができる。またガラス繊維やガラス多孔質膜を用いることもできる。前記高分子からなる膜は、溶媒、塗布条件を適切に選択することにより、繊維状物を形成することも、多孔質膜とすることもできる。

金薄膜２と前記サンプル親和性薄膜３がその上に設けられた透明基板１はその面内において互いに重ならない領域Ａ，Ｂ，Ｃを有する。即ち、測定領域（領域Ａ）と、該領域Ａを間に介するように設けられた試料導入部（領域Ｂ）と試料吸収部（領域Ｃ）である。前記領域Ａ，Ｂ，Ｃのいずれにもそれらの少なくとも一部表面にサンプル親和性薄膜３が設けられており、領域Ａ，Ｂの境界において領域Ａのサンプル親和性膜と領域Ｂのサンプル親和性膜はつながっており、領域Ａ，Ｃの境界において領域Ａのサンプル親和性膜と領域Ｃのサンプル親和性膜はつながっている。また、領域Ａのサンプル親和性薄膜３で覆われていない部分はサンプルに対して親和性を有していない。即ち、透明基板１や金薄膜２が露出した部分はサンプルに対して親和性がない。したがって、領域Ａに導入されたサンプルはサンプル親和性薄膜に覆われた部分にのみ進入する。また、領域Ａのサンプル親和性膜の表面はサンプルに非親和性の膜で覆われていてもよい。このサンプルに非親和性の膜としては、液体の浸透できない金属膜、固体の高分子膜、またサンプルが水溶性の場合には疎水性の高分子からなるものを例示できる。

サンプル親和性膜３の領域Ａは分子認識膜を含有するサンプル測定部を有する。分子認識膜はサンプル親和性膜に分子認識材料が固定されたものである。分子認識材料としては複合体を形成する分子対の一方の分子を用いることができる。このような複合体としては抗原と抗体の組み合わせを挙げることができる。特に抗体を分子認識材料として用いると、サンプル中に含まれる抗原の測定ができる。

ＳＰＲ法では、金表面から５００ｎｍ以内の部分における屈折率が測定されるため、領域Ａでのサンプル親和性膜３の厚さは１０μｍ以下であることが好ましい。膜が１０μｍより厚くなると測定されないサンプル体積が必要以上に大きくなり、絶対量感度が低下する。

さらに、サンプル親和性膜３の領域Ｂにはサンプル導入ポートが形成される。サンプル導入ポートは、図３Ａのようにサンプル親和性膜上に何も設けず、サンプル親和性膜に直接サンプルを滴下するようにしてもよい。また、図３Ｂのように底があいたカップまたはチューブ６をサンプル親和性膜上に設けてサンプル導入ポートとしてもよい。また、図３Ｃのように、液体を保持する機能を有するサンプルパッド４をサンプル親和性膜上に設けてもよい。図３Ｃでは、サンプル導入ポートとしてサンプルパッドを設けた例を示している。サンプル導入ポートにおいては、サンプルがサンプル親和性膜上あるいはカップまたはチューブ内あるいはサンプルパッド上に滴下される。

さらに、サンプル親和性膜の領域Ｃにはサンプルをサンプル親和性膜から排出させるための吸収パッド５が設けられる。吸収パッド５は簡素化された構成では体積の大きなサンプル親和性膜を用いてもよく、サンプルの液体を保持する機能を有するパッドを設けてもよい。サンプルパッド及びサンプルの液体を保持する機能を有するパッドとしては、例えば、ミリポア社製 ＡＰ２２素材の吸収パッドを用いることができる。

本発明のセンサー素子では、導入ポートから導入したサンプルがサンプル親和性膜内を流れ、領域Ａのサンプル親和性膜を経由して領域Ｃに移動する。したがって、サンプル親和性薄膜上で、領域Ｂ内の点と領域Ａ内の点と領域Ｃ内の点が１つの直線上に存在することが必要である。この直線上のある領域Ｂの点にサンプル液を滴下すると、この直線に沿ってサンプル液が展開（流動）し、領域Ａを経由して領域Ｃにいたる。

領域Ｃでは吸収パッド５によりサンプル液が吸収されてこの直線上にある領域から排出されていくため、領域Ｂから領域Ａに継続的にサンプルが供給され、領域Ａにおいて固定された抗体等の被測定分子と分子複合体を形成する相手の分子と、被測定分子が効率的に反応できる。このことは、特にサンプルが前処理を必要とするものであって、前処理によりサンプル量が減少し、導入ポートからサンプル親和性膜内に入り込むサンプル量が少なくなった場合に有利である。

このセンサー素子による測定に当たっては、このセンサー素子の基板側から光を入射し、基板と金薄膜の界面での金薄膜からの反射光を測定することにより、ＳＰＲ測定を行う。

さらに、領域Ａに複数のサンプル測定部が設けられていてもよい。この複数のサンプル測定部に互いに異なる抗体を固定すると複数の抗原の検出を１回のＳＰＲ測定で行うことができる。

一般に、サンプル親和性膜内部をサンプルが流れる場合、サンプル親和性膜を構成する材料及び構造と溶質の相互作用によって溶質の移動速度が異なり、領域Ａに到達する順番が溶質ごとに異なってくる。この効果を利用すると、それぞれの測定対象分子が同時に検出されるのではなく時間をずらして検出されるので固定化された分子による分子分別機能をより効果的に利用でき、感度の高い検出を行うことができる。また、ＳＰＲ測定では金薄膜近傍の抗体に抗原が接近して流れると、抗原を効率的に捕捉できる。サンプル非親和性膜を設けることにより、サンプル親和性膜内での膜に垂直な方向の流速分布が金薄膜の反対側に偏るのを防ぐことができる利点がある。

以下に図面を参照しつつ、本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

（４μｍセルロース膜を貼った金チップ）
以下の手順により、図１Ａ、図１Ｂに示す構造のセンサー素子を作製した。
１． まず、基板１としてＢＫ７ガラスを用い、ＢＫ７ガラス上に厚さ１ｎｍのチタン膜、その上に厚さ４５ｎｍの金膜からなる薄膜２を基板中心部にスパッタ法で形成した。チタンは金薄膜の基板への接着性を向上させるために使用したものである。これにより、センサー素子の領域Ａに金薄膜が形成されたことになる。
２． アセトンを主成分とし、アルコール類を含む混合溶媒に混合ニトロセルロース（アドバンテック社製）を溶解した溶液を用いスピンコート法で、金薄膜つきガラス基板の全面に、中心部の厚さが４μｍの多孔質膜からなるサンプル親和性膜を形成した。
３． 金薄膜が存在し、ＳＰＲ検出が行える領域Ａを含むように、サンプル親和性膜に抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）をスポット法で固定した。さらに、スーパーブロックＰＢＳ（ピアス社製）を用いて領域Ａの部分にブロッキングを施した。
４． 図１Ａに示すように、抗体を固定した部分と重ならないように、サンプルパッド（ミリポア社製 ＡＰ２２素材）をサンプル親和性膜に固定した。
５． 図１Ａに示すように、吸収パッド（ミリポア社製 ＡＰ２２素材）を領域Ｃに設置した。

こうして得られたセンサー素子のガラス面を、ＳＰＲ測定装置であるハンディーＳＰＲ（ＮＴＴ−ＡＴ社製）のプリズムに屈折率マッティングオイルを用いて密着させた。次に、サンプルパッドに、ヤギＩｇＧを１０μｇ／ｍＬ含む牛乳を滴下したところ、液体が領域Ａに到達した時点で屈折率の増大が見られたが、抗原と抗体の吸着反応による屈折率の増加は見られなかった。一方、同様にして用意したセンサー素子にヒトＩｇＧを１０μｇ／ｍＬ含む牛乳を滴下したところ、ヒトＩｇＧの特異吸着によるＳＰＲ信号の変化が見られた。このセンサー素子によって、ポンプや専用の流路を準備することなく免疫測定ができることがわかった。

本実施例のようにして作成したセンサー素子を保存しておけば、測定の度にセンサー素子をＳＰＲ装置に設置し、サンプルを滴下するだけで、抗原抗体反応による抗原の測定が可能であり、簡便に抗原の検出を行うことができる。

（マルチ抗体）
実施例１と同様の作製手順で図４Ａ、図４Ｂに示すようなセンサー素子を作製した。この素子ではサンプル親和性膜の一部を図５Ａに示すように除去し、サンプル親和性膜の、サンプルが流れる領域を制限した。この狭くなった２箇所に２種類の抗体、抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）と抗ヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社製）をそれぞれ固定化した。

このセンサー素子を、ＳＰＲ測定装置であるＤＫＫ−２０（ＤＫＫ社製）のプリズムに屈折率マッティングオイルを用いて密着させた。

サンプルパッドにヒトＩｇＧとヤギＩｇＧを含む牛乳を滴下し、それぞれの領域ＡのＳＰＲ信号を記録した。このセンサー素子を一回の測定ごとに取り替え、異なる濃度のヒトＩｇＧとヤギＩｇＧを含む牛乳からなるサンプルで測定を繰り返したところ、それぞれの領域Ａで、固定した抗体に特異的な抗原に対応するＳＰＲ信号が得られ、複数種の抗原を同時に、その濃度情報も含め検出できることがわかった。

本発明によれば、機械的な液送機構の必要がなく、簡便に高感度のＳＰＲ測定を行うことができる。また、液体試料中の特定の分子の濃度を簡便かつ迅速に測定することができ、ウイルス検出や疾病マーカー、環境汚染物質の測定・迅速診断に有用である。

Claims (8)

1. 透明基板と、該透明基板上の少なくとも一部に形成された金薄膜と、その少なくとも一部の上に金薄膜が形成された透明基板上に設けられたサンプル親和性薄膜とを有し、前記金薄膜と前記サンプル親和性薄膜がその上に設けられた透明基板は測定領域（領域Ａ）と、該領域Ａを間に介するように設けられた試料導入部（領域Ｂ）と試料吸収部（領域Ｃ）を有し、前記領域Ａ，Ｂ，Ｃのいずれにもそれらの少なくとも一部表面にサンプル親和性薄膜が設けられており、前記領域Ａのサンプル親和性薄膜には前記金薄膜に接する面に分子認識膜を含有するサンプル測定部が設けられており、領域Ｂのサンプル親和性膜上には導入ポートが形成され、領域Ｃのサンプル親和性膜上には該領域Ｃ全体を覆うように吸収パッドが設けられ、サンプル親和性薄膜上で、領域Ｂ内の点と領域Ａ内の点と領域Ｃ内の点が１つの直線にのるように存在することを特徴とする表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果を利用するＳＰＲ測定用センサー素子。
2. 前記領域Ａに複数のサンプル測定部が設けられていることを特徴とする請求項1記載のＳＰＲ測定用センサー素子。
3. 前記分子認識膜が、複合体を形成する分子対の一方の分子を固定してなるものであることを特徴とする請求項１または２記載のＳＰＲ測定用センサー素子。
4. 前記複合体を形成する分子対の一方の分子が抗体であることを特徴とする請求項３記載のＳＰＲ測定用センサー素子。
5. 前記領域Ａのサンプル親和性薄膜の表面がサンプルに対して非親和性の膜で覆われていることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のＳＰＲ測定用センサー素子。
6. 前記測定領域Ａが、サンプル非親和性膜で分割される、又は、サンプル親和性膜が取り除かれることにより分割されることを特徴とする請求項１に記載のＳＰＲ測定用センサー素子。
7. 前記測定領域Ａにおいて、前記領域Ａに接続された前記領域Ｂ又は前記領域Ｃよりも、分割された前記領域Ａが狭いことを特徴とする請求項１に記載のＳＰＲ測定用センサー素子。
8. 請求項１から７記載のＳＰＲ測定用センサー素子であって、サンプル親和性膜の厚さが最大で１０μｍであることを特徴とするＳＰＲ測定用センサー素子。

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